CN102212530A - 一种大豆自噬相关基因的克隆及其应用 - Google Patents

Abstract

一种大豆自噬相关基因的克隆及其应用。该基因核酸序列如序列表1所示，它是大豆细胞自噬相关基因GmATG8c，在大豆细胞中自噬体的形成过程中起重要作用。本发明克隆了大豆中的ATG8c基因，构建出由CaMV35S启动子驱动该GmATG8c基因表达的双元表达载体，并采用花苞浸泡法转化模式植物拟南芥。得到的转基因植株营养生长更旺盛，同时植株产量得到明显提高，而且转基因拟南芥对低氮胁迫的耐受性更强。说明该GmATG8c基因有应用于大豆新品种选育的潜力，本发明为获得高产高效的转基因大豆提供了基因资源，具有重要应用价值。

Description

一种大豆自噬相关基因的克隆及其应用

【技术领域】：

本发明属于植物基因工程领域，具体说是用分子生物学技术获得一种大豆自噬相关基因，该基因的转基因植株具有高产高效并耐低氮的性状。

【背景技术】：

随着世界人口的不断增加，人们对粮食的需求量也不断增加，但可耕种土地面积有限，因此，提高农作物产量是避免爆发粮食危机的重要途径。通常提高作物产量所采用的手段主要是增加化肥的施用，这不仅增加成本更污染环境。因此，选育出能够高效利用土壤中有限营养而高产的作物新品种对解决粮食危机具有重大意义。

获得可以高效利用氮素营养的作物品种的途径包括利用经典遗传学方法选育优异的营养高效品种和利用现代分子生物学方法培育转基因新材料的方法。优异品种的选育周期长，见效慢；相比之下，转基因技术更直接而快速。因此，利用基因工程技术，改造农作物对土壤中养分的吸收和转运能力以及利用效率已经成为新世纪国际上农业科学研究的焦点课题。

氮素是植物营养三要素之一。农作物生长过程中需要从土壤中吸收大量氮，氮素的供应直接控制着农作物的品质和产量。大豆是全世界范围广泛栽培的主要农作物之一，也是我国重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物，同时又是我国供需矛盾最为突出的农产品。大豆是需肥较多的作物，虽然大豆是固氮植物，但其生长所需的氮素只有三分之一来自固氮，另外三分之二来自土壤和肥料。氮肥既是提高大豆植株光合效率的保障，又是种子干物质积累和成熟的限制因子之一，提高茎叶中的氮素含量对于大豆高产具有重要意义。

氮肥对于灌浆期的高氮需求是不足的，粮食产量不仅仅依赖于在开花前的氮吸收，也依赖于种子成熟阶段氮的再利用(Kichey等，2007)。植物对氮素的利用通过吸收、同化、转运和再动员几个步骤来完成(Masclaux-Daubresse等，2010)，提高氮再利用的效率具有从植物的营养器官重新利用氮来灌浆的的优势，这将有助于植物氮经济及减少开花后的外源氮需求，营养的回收再利用效率是作物产量的决定因素之一。

细胞自噬是一种较新发现的、可以响应营养缺乏等胁迫、并参与营养再动员的一个重要过程。Yoshimoto等(2004)发现氮饥饿能迅速引发植物自噬基因的表达，而自噬相关基因的突变会导致植物对营养胁迫耐受性的降低(Xiong等，2005；Thompson等，2005；Phillips等，2008)。通过在酵母中的研究发现，细胞自噬的过程包括自噬体的成核、延展、自噬体与液泡或溶酶体的融合、自噬体内物质的降解等几个步骤(Klionsky，2005)，在自噬体的成核及延展过程中，一个基因ATG8起着关键作用。在拟南芥中已发现大部分酵母自噬相关基因的同源基因。但目前为止，还没有对大豆自噬相关基因的研究报道，也没有报道研究植物自噬基因与植物产量的联系。

Hinchee等(1988)和McCabe(1988)获得转基因大豆后，相继有成功转化大豆的报道，但还没有在高效利用氮素而产生高产效果的转基因大豆获得，这方面的基因克隆较少。在理论研究方 面，Martin等(2006)在玉米中过表达谷氨酰胺合成酶(GS)，使得转基因植株GS活性提高，并提高了产量；Taylor等(2010)研究发现，过表达AtPPDK的转基因拟南芥可以延缓衰老，并提高了种子单粒重及含氮量。因为大豆的转化效率低、操作流程繁琐，通过大规模获得转基因大豆来筛选有高产高效价值的转基因作物不易实现，而模式植物拟南芥的转化相对比较简单，同时拟南芥的生长周期相对较短，更易进行高产高效性状的分析，因此，克隆大豆中的潜在高产高效基因并转化拟南芥，在转基因拟南芥中完成筛选成为一种评价有育种价值的基因有效手段，为进一步获得高产高效的转基因大豆提供依据。

总之，获得大豆高产高效基因对于提高作物对营养的高效利用效率及作物产量，解决粮食危机并减少由化肥施用引起的环境污染具有重要意义，而克隆潜在的高产高效基因并转化模式植物拟南芥，在模式植物拟南芥中进行功能分析来筛选高产高效基因则是寻找大豆高产高效基因的有效手段。

【发明内容】：

本发明目的是通过在模式植物拟南芥中的功能分析，筛选到潜在的大豆高产高效基因，既避免了通过多种基因分别转化大豆来筛选基因的复杂流程，同时也为进一步获得高产高效的转基因大豆提供了依据。本发明第一次克隆了大豆自噬相关基因，并证明该基因具有转基因作物育种价值，将该基因转入农作物中，有潜力获得可以高效利用土壤中有限的营养而提高产量的转基因作物新品种。

本发明在NCBI中寻找拟南芥AtATG8c基因在大豆中的同源基因(GenBank：AK246026.1，目前只已知序列信息，无相关功能研究等)，该基因全长799bp，本发明选择该基因的开放读码框(ORF)序列命名为GmATG8c(大豆自噬相关基因)，长度为360bp。该基因核酸序列选自：

(a)如序列表1所示的核酸序列；

(b)在(a)限定的核酸序列中至少具有85％以上的同源性的核酸序列。

作为具体应用的实例，本发明提供了一种大豆自噬相关基因GmATG8c的克隆方法，具体操作步骤如下：

第一、以大豆cDNA为模板，用PCR方法扩增大豆自噬相关基因GmATG8c；

第二、回收PCR扩增产物；

第三、将上述第二步回收的扩增产物，与pMD-18T载体(购自Takara公司)在连接酶催化下进行连接反应；

第四、将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

第五、通过抗性筛选，获得该GmATG8c基因的阳性TA克隆。

本发明同时提供了一种该GmATG8c基因的应用，即：利用获得的自噬相关基因GmATG8c，构建获得由CaMV35S启动子驱动基因GmATG8c表达的构建(即“CaMV35S启动子-GmATG8c”)，并进行植物转化，从而获得基因组中含有可在植物中组成型表达含有以上所述核酸序列基因的转基因植株。操作过程如下：

所述应用中的双元表达载体“CaMV35S启动子-GmATG8c”的构建方法，包括如下步骤：

第一、用Nco I/BstP I双酶切含有基因GmATG8c的TA克隆质粒，回收GmATG8c基因片段；

第二、用NcoI/BstPI双酶切pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司)质粒，回收大的载体片段(其中含有CaMV35S启动子的编码序列)；

第三、混合上述第一步得到的GmATG8c基因片段和第二步得到的pCAMBIA 1301载体片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA 1301载体上的“CaMV35S启动子-GmATG8c”构建。

其中所设计的GmATG8c基因的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入了Nco I酶切位点，下游引物引入了BstP I酶切位点：

上游引物：5’-ATTTCGCCATGGCCAAAACCTCCTTCAAGCTTC-3’

下游引物：5’-GATTTGGGTCACCTATTTACAGAAGTTAACATGCATTATGC-3’。

所述应用中的“CaMV35S启动子-GmATG8c”构建在转基因植株中组成型表达，操作过程如下：

拟南芥转化的具体方法，采用农杆菌介导的花苞浸泡法(Clough与Bent，1998)，获得的种子经过30mg/L潮霉素抗性筛选，生长正常的抗性植株转土培养；采用基因组PCR的方法检测基因GmATG8c的表达。

作为具体应用的实例，本发明提供了一种在转基因拟南芥中筛选高产高效基因的方法。操作过程如下：

第一、分别将野生型与转基因拟南芥种子消毒后铺于1/2MS培养基中，长日照(16h光照/8h黑暗)22℃垂直板培养9天；

第二、选取生长状态一致的野生型与转基因拟南芥幼苗移至营养土中长日照(16h光照/8h黑暗)22℃培养；

第三、持续观察野生型与转基因拟南芥的表型并记录；

第四、待植物种子完全成熟后，分别单株收获种子，称量出单株产量，并比较野生型与转基因植株产量差别。

本发明的优点和积极效果：

目前植物高产高效基因研究较少，而大豆中的自噬相关基因目前还没有研究报道，本发明第一次克隆出大豆自噬相关基因GmATG8c，构建出由CaMV 35S启动子驱动基因GmATG8c表达的双元表达载体，并通过转化模式植物拟南芥及在转基因拟南芥中的功能分析发现，在相同培养条件下，35S-GmATG8c转基因拟南芥营养生长较野生型旺盛，莲座更大，生物量提高，说明转基因植株对土壤中营养的利用效率提高；同时转基因拟南芥单株产量明显提高，暗示大豆自噬相关基因GmATG8c为潜在的大豆高产高效基因，具有重大育种价值，因此，本发明获得了一个具有应用于高产高效大豆育种潜力的基因GmATG8c，这为后续在大豆中过表达自噬相关基因GmATG8c，获得具有高产高效性状潜力的转基因大豆新品种提供了基础，将该基因转入作物中，可能获得可以高效利用土壤中有限营养并提高产量的转基因作物新品种，这将有助于解决粮食危机，降低农业生产成本，并减少由施用化肥引起的环境污染，因此，本发明具有重要应用价值。

【附图说明】：

图1是35S-GmATG8c转基因拟南芥植株的PCR鉴定；泳道M：plus2000 Marker；泳道1～15：各潮霉素抗性拟南芥植株的基因组DNA为模板的PCR产物；泳道16：野生型拟南芥植株的基因组DNA为模板的PCR产物；泳道17：35S-GmATG8c质粒为模板的PCR的正对照；泳道18：H₂O为模板的PCR的负对照。

图2是35S-GmATG8c转基因拟南芥与野生型对照组拟南芥在4周苗龄时的莲座表型图；上排为35S-GmATG8c转基因拟南芥；下排为野生型对照组拟南芥。

图3是35S-GmATG8c转基因拟南芥与野生型对照组拟南芥对低氮胁迫的耐受性比较图，A是缺氮培养24天的野生型拟南芥，B是缺氮培养24天的35S-GmATG8c转基因拟南芥。

【具体实施方式】：

实施例1：大豆自噬相关基因GmATG8c的克隆

第一、以大豆cDNA为模板利用PCR方法扩增360bp的GmATG8c基因，回收扩增产物并进行TA克隆。

(1)PCR扩增目的片段

根据已知的大豆自噬相关基因GmATG8c的序列设计特异引物，在上游引物中引入NcoI酶切位点，在下游引物中引入BstPI酶切位点。

上游引物：5’-ATTTCGCCATGGCCAAAACCTCCTTCAAGCTTC-3’(引入NcoI切点)

下游引物：5’-GATTTGGGTCACCTATTTACAGAAGTTAACATGCATTATGC-3’(引入BstPI切点)

用Trizol法提取拟大豆RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备GmATG8c基因片段。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

94℃5分钟；

94℃30秒，58℃30秒，30个循环；

72℃10分钟；

(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定

①目的片段的回收

通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，回收方法采用大连宝生物(TaKaRa)公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤见商品说明书。

②连接

加入下列反应体系的试剂，16℃反应过夜，实现目的片段与pMD-18T载体(购自Takara公司)的连接。

③转化和阳性克隆的鉴定

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，用10μL连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp的LB平板上，37℃倒置培养12-14小时。挑选转化平板上单克隆菌落，按常规方法提取质粒，用Nco I和BstP I双酶切，产生2.7kb的pMD-18载体片段和GmATG8c基因的360bp片段。按前面所述的PCR引物和扩增条件，以质粒提取物为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生360bp的GmATG8c基因片段，即为含有GmATG8c基因序列的阳性克隆。

④测序验证

经过鉴定的阳性克隆，送交菌液到Sangon(上海生工生物技术有限公司)进行DNA测序，其核酸序列如序列表1所示。

实施例2：利用pCAMBIA 1301载体(含有CaMV35S启动子)构建由CaMV35S启动子驱动基因GmATG8c表达的双元表达载体。

(1)从大肠杆菌中提取载体pCAMBIA 1301质粒(该菌株可从生物公司或CAMBIA购买)，用Nco I/BstP I双酶切后回收大的载体片段(其中包含有CaMV35S启动子序列)。

(2)从实施例1所制备的TA克隆中提取质粒，用Nco I/BstP I双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收(同实施例1)GmATG8c基因片段。

(3)将上述2个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pCAMBIA 1301载体上的由CaMV35S启动子驱动基因GmATG8c表达的双元表达载体的构建。

连接体系：

(4)用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同实施例1。

(5)挑选转化平板(Kan抗性)上的单克隆菌落，按常规方法提取质粒，用Nco I和BstP I双酶切质粒DNA产生两个片段，一个是12kb的pCAMBIA 1301载体片段，另一个是360bp的GmATG8c基因片段。

(6)以质粒为模板进行PCR反应，方法同实施例1。

(7)经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序。

(8)从阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌GV3101，获得工程化农杆菌，用于植物转化。

实施例3：转基因拟南芥的制备

(1)用实施例2构建的由CaMV 35S启动子驱动基因GmATG8c表达的双元表达载体转化拟南芥，具体转化方法采用农杆菌介导的花苞浸泡法(Clough与Bent，1998)，获得的种子经过30mg/L潮霉素抗性筛选，生长正常的植株转土培养。

(2)转基因植株的PCR检测：分别剪取转基因植株和野生型植株的叶片，参考《分子克隆实验指南(第三版)》(黄培堂等，2002)方法提取叶片基因组DNA，用如下引物进行PCR反应，反应体系如同实施例1：

上游引物：5’-ATTTCGCCATGGCCAAAACCTCCTTCAAGCTTC-3’

下游引物：5’-GATTTGGGTCACCTATTTACAGAAGTTAACATGCATTATGC-3’

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，转基因植株出现360bp的GmATG8c基因条带，非转基因植株未出现该基因条带，证明目的片段已整合到植物基因组中(见图1)。

实施例4：转基因拟南芥中GmATG8c基因功能分析

(1)通过实施例3获得的转基因拟南芥各株系单株收获种子，分别用30mg/L潮霉素抗性筛选，选取抗性分离比为3∶1的株系，分别单独转土培养，仍单株收获种子，分别将获得的种子用30mg/L潮霉素抗性筛选，所铺种子全部正常生长的株系为纯合株系；

(2)分别将野生型与纯合转基因拟南芥种子消毒后铺于1/2MS培养基中，长日照(16h光照/8h黑暗)22℃垂直板培养9天；

(3)选取生长状态一致的野生型与转基因拟南芥幼苗移至营养土中长日照(16h光照/8h黑暗)22℃培养；

(4)持续观察并记录野生型与转基因拟南芥的表型，即莲座生长情况(见图2：4周大苗龄的野生型与转基因拟南芥的莲座大小对比)。

结果显示：35S-GmATG8c转基因拟南芥的莲座较野生型更大，证明其营养生长更旺盛，这暗示在相同培养条件下，35S-GmATG8c转基因拟南芥的营养利用效率提高。

(5)待植物种子完全成熟后，分别单株收获种子，称量出单株产量，并比较野生型与各株系 转基因植株产量差别(见表1)。

表1  35S-GmATG8c转基因拟南芥单株产量统计

结果显示：4个代表性35S-GmATG8c转基因拟南芥株系的单株产量相比于野生型对照组拟南芥都不同程度的提高，其中35S-GmATG8c-4转基因株系单株产量提高率达到22.2％，这证明35S-GmATG8c转基因拟南芥具有高产的性状，这是非常重要的农艺性状，说明基因GmATG8c具有应用于高产高效的转基因大豆育种的潜力。

实施例5：35S-GmATG8c转基因拟南芥对低氮胁迫的耐受性实验

(1)分别将野生型与纯合转基因拟南芥种子消毒后铺于1/2MS培养基中，长日照(16h光照/8h黑暗)22℃垂直板培养5天；

(2)选取生长状态一致的野生型与转基因拟南芥幼苗移至缺氮的1/2MS培养基中长日照(16h光照/8h黑暗)22℃水平放置培养；

(3)持续观察野生型与转基因拟南芥在缺氮培养基中的表型并记录(见图3)。

结果显示：野生型与转基因拟南芥在缺氮培养基中培养24天后，即经过氮素饥饿处理24天后，35S-GmATG8c转基因拟南芥与野生型拟南芥相比，植株更大，同时新生真叶数更多并且新生真叶更绿、生长状况更好，这说明35S-GmATG8c转基因拟南芥对低氮胁迫的耐受性较野生型拟南芥更强。

【参考文献】：

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序列表SEQUENCE LISTING

<110>  南开大学

<120>  一种大豆自噬相关基因及其克隆和应用

<130>  1

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  360

<212>  DNA

<213>  Glycine max

<220>

<221>  primer_bind

<222>  (1)..(25)

<220>

<221>  primer_bind

<222>  (336)..(360)

<400>  1

 

atggccaaaa cctccttcaa gcttcagcat cctttggaga gaaggcaggc tgaagcttct     60

cgcattagag agaaatatcc tgatagaata cctgtgattg tggagaaagc tgaaagaagt    120

gacattccag acattgataa gaaaaaatac cttgtccctg ctgatttgac tgttggccag    180

tttgtttatg ttgttcgcaa aaggattaag ctcagtgcag agaaggctat ttttgttttc    240

atcaacaaca ctctacctcc aactgctgca ttgatgtctg ctatttatga ggaaaataag    300

gatcaagatg gctttcttta catgacttac agtggagaga acaccttcgg atcccattag    360

Claims (5)

1.一种大豆自噬相关基因GmATG8c，其核酸序列选自：

（a）如序列表1所示的核酸序列；

（b）在（a）限定的核酸序列中至少具有85%以上的同源性的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所设计的基因PCR扩增引物如下，其中上游引物中引入了Nco I酶切位点，下游引物中引入了BstP I酶切位点： 

上游引物：5’- ATTTCG CCATGG CCAAAACCTCCTTCAAGCTTC -3’

下游引物：5’- GATTTG GGTCACC TATTTACAGAAGTTAACATGCATTATGC -3’ 。

3.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，从大豆cDNA中克隆获得该GmATG8c基因，具体操作步骤如下：

（1）以大豆cDNA为模板，用PCR方法扩增GmATG8c基因；

（2）回收PCR扩增产物； 

（3）将上述（2）步回收的扩增产物，与pMD-18T载体在连接酶催化下进行连接反应；

（4）将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

（5） 通过抗性筛选，获得该GmATG8c基因的阳性TA克隆。

4.一种权利要求1所述的大豆自噬相关基因的应用，其特征在于，利用获得的大豆自噬相关基因GmATG8c，构建获得由CaMV 35S启动子驱动该GmATG8c基因表达的双元表达载体，进行植物转化，从而获得基因组中含有可在植物中组成型表达含有以上所述核酸序列基因的转基因植株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将CaMV 35S启动子驱动该基因表达的构建转化模式植物拟南芥，已获得该基因组成型异源表达的转基因植株，转基因植株表现出高效利用营养的能力，在全营养培养条件下，35S-GmATG8c过表达植株莲座增大，同时植株产量明显提高，具有高产高效特性；在缺氮培养条件下，35S-GmATG8c转基因拟南芥对低氮胁迫的耐受性更强。

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