CN111334600A - 一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用 - Google Patents

一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用 Download PDF

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Abstract

提供了一种高氮素利用转基因大豆8c‑ox‑2外源插入片段的侧翼序列及其应用，属于基因育种技术领域。本发明提供的氮高效转基因大豆事件8c‑ox‑2经鉴定插入位点侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。本发明提供用于检测该旁支序列的引物，如SEQ ID No.3～6所示。本发明提供的侧翼序列及其鉴定适用于氮高效转基因大豆8c‑ox‑2(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其制品)的检测。

Description

一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序 列、获取方法和应用
技术领域
本发明属于基因育种技术领域，尤其涉及一种高氮素利用转基因大豆 8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用。
背景技术
转基因育种具有性状改良精准、周期短等特点。利用转基因技术进行作物氮素利用效率改良可以改善氮肥过度施用的现状，提高农业的可持续发展能力。细胞自噬是营养物质再动员的主要形式。在拟南芥中证明很多自噬相关基因ATGs的突变都会导致植物早衰，表现出对氮/碳胁迫更为敏感的表型 ((Doelling等，2002；Hanaoka等，2002；Yoshimoto等，2004；Thompson 等，2005；Xiong等，2005；Chung等，2010)。GmATG8c蛋白是细胞自噬关键蛋白，在自噬体的形成和延展过程中发挥重要的功能(Xia T,Xiao D, Liu D,Chai W,GongQ,et al.Heterologous expression ofATG8c from soybean confers tolerance tonitrogen deficiency and increases yield inArabidopsis.PLoS ONE,2012,7:e37217.doi:10.1371)。
将含有携带大豆自噬关键基因表达盒35S:GmATG8c的植物表达载体通过农杆菌介导法转入到大豆基因组中，获得了一个氮高效转基因大豆事件 8c-ox-2(徐伟,刘生,游翔,梅圆圆,王丹,王宁宁.过表达GmATG8c基因提高大豆的低氮耐受性和产量.植物生理学报，2017，2(1)，241-247)，并正在进行中间试验阶段的安全评价。对转基因大豆进行转化事件特异性检测，能更好的对转基因大豆进行监管管理，而外源插入片段的侧翼序列，是进行监督管理的一个重要指标。因此需要获得转基因大豆8c-ox-2的侧翼序列，但是现有技术中并未报道有转基因大豆8c-ox-2的侧翼序列。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2 外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用，本发明提供的侧翼序列可应用于转基因大豆的检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。
本发明还提供了上述技术方案所述的侧翼序列的获取方法，包括以下步骤：
1)提取转基因大豆8c-ox-2的基因组DNA，对所述基因组DNA进行基因组重测序，根据重测序结果确定转基因大豆8c-ox-2的T-DNA序列插入到大豆基因组第15号染色体上2779776～2781294碱基之间；
2)提取转基因大豆8c-ox-2的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)将所述步骤2)得到的扩增产物进行测序，将得到的测序结果同 phytozome数据库中大豆基因组序列和步骤1)得到的T-DNA序列进行序列比对，得到侧翼序列。
优选的，所述PCR扩增使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3～6所示，所述SEQID No.3～4为扩增SEQ ID No.1的引物，所述SEQ ID No.5～6 为扩增SEQ ID No.2的引物。
优选的，所述PCR扩增的程序为94℃5min；94℃30s，58℃30s， 72℃30s，35个循环；72℃10min。
优选的，所述PCR扩增使用的体系每25μl包括基因组DNA 100ng， 10×buffer 2.5μl，2.5mM dNTPs 2μl，10μM引物各1μl，5U/μl Taq酶0.2μl， ddH2O补至25μl。
本发明还提供了上述引物在检测转基因大豆中的应用。
本发明通过基因组重测序结合基因组PCR的方法获得了高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列，所述侧翼序列的核苷酸序列如 SEQ ID No.1～2所示。根据获得上述侧翼序列的引物，可以检测该侧翼序列，进而建立针对氮高效转基因大豆8c-ox-2事件的鉴定方法，通过普通PCR扩增得到了包含载体片段又包含大豆基因组信息的序列，本发明提供的侧翼序列和引物适用于对转基因大豆8c-ox-2(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其他制品)的检测。
附图说明
图1为载体构建示意图；
图2为氮高效转基因大豆8c-ox-2的T2代植株的PCR检测，其中M， GenStar D2000plus DNA marker；TL，受体大豆天隆一号阴性对照；1-6，6 株转基因植株；-，ddH2O阴性对照；+，质粒pCAMBIA3301-GmATG8c为模板的阳性对照；
图3为温室石英砂低氮条件下8c-ox-2株系耐低氮表型分析；
图4为T5代转基因大豆8c-ox-2外源T-DNA左边界序列特异性PCR检测，其中M：GenStar D2000 plus DNA marker；TL：受体大豆天隆一号阴性对照；1，2，3，4，5：5株T5代8c-ox-2转基因植株；+：:1株T2代8c-ox-2 转基因植株；-：ddH2O阴性对照；
图5为T5代转基因大豆8c-ox-2外源T-DNA右边界序列特异性PCR检测，其中M：GenStar D2000 plus DNA marker；TL：受体大豆天隆一号阴性对照；1，2，3，4，5：5株T5代8c-ox-2转基因植株；+：:1株T2代8c-ox-2 转基因植株；-：ddH2O阴性对照。
具体实施方式
本发明提供了一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示，具体如下：
SEQ ID No.1：
AGAGCTTGAAGTGGGTTTAACGTGGAAAGTGGAATCCACCTTTGC CTATGCGAAACGTCGGAGTTGAAATGACAAAGAAAAGGATAAAAGCG AACCCCCATAAAAATTGTTTCGGCTATTGTAACATG；
SEQ ID No.2：
TTACTTTCTATCTGAAAAGGGTGGCCAGTAAAAGCAGGGGGAGAA ATTGTAAATGACCTTTTCCCTGAAGCCTTATCATGCTTTTTTCTCAGAAA GATTTTCAGTCTTATCAGTTCTTAGTTCTTACCATTGTATTGGCTTTTCCA TTTGAACTAATCTGATTGGATTTTCTCATTTGTTGTTCCTGCCAATTAAA TTGTTGTAATGGCATGTTTAGTTTTTGCTAGCTTTGTCTTTAATGTAGTT GGGTAGTTGGTACTGTAAATTTAACTCTCTGCTATTGTGATTTTGCTTAC TGGTTTTGCATATGGTTCCCATGGTTATTAAAACGAGGAAATGAAAATA ATGTGGTCCTAGAAGA。
在本发明中，所述转基因大豆8c-ox-2优选按照发表的方法获得(徐伟, 刘生,游翔,梅圆圆,王丹,王宁宁.过表达GmATG8c基因提高大豆的低氮耐受性和产量.植物生理学报，2017，2(1)，241-247)。
本发明还提供了上述技术方案所述的侧翼序列的获取方法，包括以下步骤：
1)提取转基因大豆8c-ox-2的基因组DNA，对所述基因组DNA进行基因组重测序，根据重测序结果确定转基因大豆8c-ox-2的T-DNA序列插入到大豆基因组第15号染色体上2779776-2781294碱基之间；
2)提取转基因大豆8c-ox-2的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)将所述步骤2)得到的扩增产物进行测序，将得到的测序结果同phytozome数据库中大豆基因组序列和已知的T-DNA序列进行序列比对，得到侧翼序列。
本发明对提取转基因大豆8c-ox-2的基因组DNA的方法没有特殊限定，采用常规提取大豆基因组DNA的方法即可。
在本发明中，所述PCR扩增使用的引物的核苷酸序列优选如SEQ ID No.3～6所示，所述SEQ ID No.3～4为扩增SEQ ID No.1的引物，所述SEQ ID No.5～6为扩增SEQ ID No.2的引物，具体序列如下：
SEQ ID No.3：AGAGCTTGAAGTGGGTTTAACGTG；
SEQ ID No.4：TCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAG；
SEQ ID No.5：TATGGCTTTCTTTACATGACTTACAGTG；
SEQ ID No.6：TCTTCTAGGACCACATTATTTTCATTTC。
在本发明中，所述基因组DNA经SEQ ID No.3～4PCR扩增，得到的扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，具体如下：
AGAGCTTGAAGTGGGTTTAACGTGGAAAGTGGAATCCACCTT TGCCTATGCGAAACGTCGGAGTTGAAATGACAAAGAAAAGGATAA AAGCGAACCCCCATAAAAATTGTTTCGGCTATTGTAACATGATTGA CGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATT AACGCCGAATTAATTCGGGGGATCTGGATTTTAGTACTGGATTTTGGTT TTAGGAATTAGAAATTTTATTGATAGAAGTATTTTACAAATACAAATACA TACTAAGGGTTTCTTATATGCTCAACACATGAGCGAAACCCTATAGGAA CCCTAATTCCCTTATCTGGGAACTACTCACACAT TATTATGGA。其中，下划线表示的引物所在位置，加粗表示的是侧翼序列。
在本发明中，所述基因组DNA经SEQ ID No.5～6PCR扩增，得到的扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，具体如下：
TATGGCTTTCTTTACATGACTTACAGTGGAGAGAACACCTTCGGAT CCCATTAGGCATAATGCATGTTAACTTCTGTAAATAGGTGACCAGCTCG AATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGA ATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACG TTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGG GTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAA CAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCT ATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTGTTTTTACTTTCTATCTG AAAAGGGTGGCCAGTAAAAGCAGGGGGAGAAATTGTAAATGACCT TTTCCCTGAAGCCTTATCATGCTTTTTTCTCAGAAAGATTTTCAGT CTTATCAGTTCTTAGTTCTTACCATTGTATTGGCTTTTCCATTTGAA CTAATCTGATTGGATTTTCTCATTTGTTGTTCCTGCCAATTAAATTG TTGTAATGGCATGTTTAGTTTTTGCTAGCTTTGTCTTTAATGTAGTT GGGTAGTTGGTACTGTAAATTTAACTCTCTGCTATTGTGATTTTGC TTACTGGTTTTGCATATGGTTCCCATGGTTATTAAAACGAGGAAATGAAAATAATGTGGTCCTAGAAGA。其中，下划线表示的引物所在位置，加粗表示的是侧翼序列。
在本发明中，所述PCR扩增的程序优选为94℃5min；94℃30s，58℃ 30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；所述PCR扩增使用的体系每25μl 优选包括基因组DNA100ng，10×buffer 2.5μl，2.5mM dNTPs 2μl，10μM引物各1μl，5U/μl Taq酶0.2μl，ddH2O补至25μl。
在本发明中，所述扩增产物优选送往上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与phytozome中的大豆基因组序列与已知的T-DNA序列进行比对后，得到侧翼序列。
本发明还提供了上述技术方案所述的侧翼序列在检测转基因大豆中的应用。
特定的转基因事件其旁侧序列是特定的，因此，应用旁侧序列可以特异性的检测转基因事件。可设计用于特异性扩增包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的引物，进行PCR扩增，检测特异条带。可以根据在5’旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段；或可以根据外源插入片段设计上游特异性引物，根据3’旁侧序列设计下游特异性引物，扩增特异性片段。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
转基因大豆8c-ox-2的获得方式：以GmATG8c基因的cDNA为模板，通过TA克隆连接到pMD18-T中，经Nco I和BstE II双酶切后回收GmATG8c 片段，连接到同样经Nco I和BstEII双酶切的载体pCAMBIA3301，完成终载体pCAMBIA-GmATG8c的构建。在完成构建的终载体中，利用CaMV 35S 启动子驱动GmATG8c基因的表达；筛选标记基因为bar。
以大豆cDNA为模板利用PCR方法扩增360bp的GmATG8c基因，回收扩增产物并进行TA克隆。
(1)PCR扩增目的片段
根据已知的大豆自噬相关基因GmATG8c的序列设计特异引物，在上游引物中引入Nco I酶切位点，在下游引物中引入BstEII酶切位点。
上游引物(SEQ ID No.9)：
5’-ATTTCGCCATGGCCAAAACCTCCTTCAAGCTTC-3’(引入Nco I切点)；
下游引物(SEQ ID No.10)：
5’-GATTTGGGTCACCTATTTACAGAAGTTAACATGCATTATGC-3’(引入BstE II切点)。
用Trizol法提取拟大豆RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备GmATG8c基因片段。
表1 PCR反应体系
Figure BDA0002406829970000071
PCR反应程序：
94℃5分钟；
94℃30秒，58℃30秒，30个循环；
72℃10分钟；
(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定
①目的片段的回收
通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，回收方法采用大连宝生物(TaKaRa)公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤见商品说明书。
②连接
加入下列反应体系的试剂，16℃反应过夜，实现目的片段与pMD-18T 载体(购自Takara公司)的连接。
表2连接体系
Figure BDA0002406829970000072
Figure BDA0002406829970000081
③转化和阳性克隆的鉴定
按常规的CaCl2诱导和转化方法，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，用 10μL连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp的LB平板上， 37℃倒置培养12-14小时。挑选转化平板上单克隆菌落，按常规方法提取质粒，用Nco I和BstP I双酶切，产生2.7kb的pMD-18载体片段和GmATG8c 基因的360bp片段。按前面所述的PCR引物和扩增条件，以质粒提取物为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生360bp的GmATG8c基因片段，即为含有GmATG8c基因序列的阳性克隆。
④测序验证
经过鉴定的阳性克隆，送交菌液到Sangon(上海生工生物技术有限公司) 进行DNA测序，测序结果与NCBI数据库中基因序列进行比对。
利用pCAMBIA 3301载体(含有CaMV 35S启动子)构建由CaMV 35S 启动子驱动基因GmATG8c表达的双元表达载体。
(1)从大肠杆菌中提取载体pCAMBIA 3301质粒(该菌株可从生物公司或CAMBIA购买)，用Nco I/BstE II双酶切后回收大的载体片段(其中包含有CaMV 35S启动子序列)。
(2)从GmATG8c的TA克隆中提取质粒，用Nco I/BstE II双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收GmATG8c基因片段。
(3)将上述2个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pCAMBIA 3301载体上的由CaMV35S启动子驱动基因GmATG8c表达的双元表达载体的构建。
表3连接体系
Figure BDA0002406829970000082
(4)用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同GmATG8c 的TA克隆获得中所述。
(5)挑选转化平板(Kan抗性)上的单克隆菌落，按常规方法提取质粒，用Nco I和BstE II双酶切质粒DNA产生两个片段，一个是12kb的 pCAMBIA 1301载体片段，另一个是360bp的GmATG8c基因片段。
(6)以质粒为模板进行PCR反应，方法同TA克隆的获得中所述。
(7)经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序。质粒最终构建图谱如图1所示。
2)将构建好的载体pCAMBIA3301-GmATG8c通过常规冻融法转入农杆菌LBA4404中。通过农杆菌介导的大豆子叶节转化法(Paz MM,Martinez JC, KalvigAB,Fonger TM,WangK.Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived frommature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation.PlantCell Rep,2006,25(3): 206-213)将载体转化至大豆天隆1号。对获得的转基因植株进行草铵膦(150 mg/L)涂抹及PCR鉴定(图2)得到高产转基因大豆8c-ox-2。通过在温室及中间试验田间调查结果显示，转基因大豆8c-ox-2与天隆一号相比在不施氮肥的田间种植，产量增幅达14.8％，达到显著水平。
(1)温室低氮处理实验：
将转基因大豆和受体对照的种子置于蛭石/营养土中萌发，18天后移栽至石英砂中，无营养纯水浇灌，3天后开始低氮(1mM N)处理。从第一对真叶的黄化程度分析转基因大豆材料的氮素利用情况。
对转基因大豆株系8c-ox-2的T2代材料进行石英砂培低氮处理实验，低氮处理第3天时，受体对照TL(天隆一号)的第一对真叶已经开始变黄，而8c-ox-2转基因材料的第一对真叶叶片仍为绿色；低氮处理第5天时，TL 的第一对真叶进一步变黄，而8c-ox-2转基因材料的第一对真叶叶片仍然保持绿色。上述结果表明转基因大豆株系8c-ox-2的幼苗对低氮胁迫的耐受性较受体对照TL增强，氮利用效率较TL增加(图3)。
(2)中间试验田间种植
在汉川转基因基地选择土壤氮素含量一般的地块，对T5代8c-ox-2转基因材料开展氮肥利用效率试验。试验地土壤中全氮含量为1.27mg/g，氮素养分级别为三级。间苗后一周，对试验材料设置正常施氮肥(N+)和不施氮肥 (N-)处理。在对照地块行间正常施氮肥、磷肥和钾肥，施用量为尿素20 斤/亩，过磷酸钙25斤/亩，氯化钾5斤/亩；处理地块不施氮肥，仅施磷肥和钾肥(N-)，施用量为过磷酸钙25斤/亩、氯化钾5斤/亩，不施尿素。大豆成熟后对各小区材料考种，统计小区产量并折算成理论亩产。所有处理均设置三个重复。
种植方式为厢宽2m，行距0.4m，小区面积4m2。考种数据显示，在正常施氮肥(N+)和未施氮肥(N-)条件下，T5代转基因大豆8c-ox-2与受体对照TL的株高、主茎节数、有效分枝数、单株有效荚数和单株粒数无显著差异，但百粒重显著高于受体对照TL(表4)。T5代转基因大豆8c-ox-2 在叶形、花色、荚皮色、种脐色和熟期方面与受体大豆无差异。
正常施氮肥(N+)条件下，T5代转基因大豆8c-ox-2与受体对照TL的理论亩产无显著差异；未施氮肥(N-)条件下，T5代转基因大豆8c-ox-2的理论亩产(189.35kg)较受体对照TL(164.98kg)高14.8％，且统计分析显示存在显著差异；未施氮肥(N-)条件下T5代转基因大豆8c-ox-2的理论亩产与正常施氮肥(N+)条件下TL的理论亩产相当，无显著差异。上述结果表明，T5代转基因大豆8c-ox-2在未施氮肥条件下不减产，具有很好的氮高效利用功能性状。
表4 T5代8c-ox-2在正常施氮肥和未施氮肥条件下的农艺性状与理论亩产
Figure BDA0002406829970000101
注：*表示N+或N-条件下转基因大豆材料8c-ox-2与受体对照TL(天隆一号)存在显著差异，P<0.05
实施例2
通过基因组重测序技术找到实施例1转基因大豆材料8c-ox-2的T-DNA 插入到15号染色体的2779776-2781294之间，插入方式为正向单拷贝插入 (实验由深圳华大基因股份有限公司完成)。根据插入区间上下游序列和 T-DNA上设计引物(如表5)。
表5表转基因大豆8c-ox-2转化体检测PCR引物及产物信息
Figure BDA0002406829970000111
经PCR扩增获得部分T-DNA序列和左右侧翼序列的全长片段，PCR 反应体系(25μl)：DNA模板100ng，10×buffer 2.5μl，2.5mM dNTPs 2μl， 10μM引物各1μl，5U/μl Taq酶0.2μl，加ddH2O补至25μl。PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。 T-DNA左、右边界与部分T-DNA序列的扩增片段长度分别为374bp和740bp(图4、图5)。将PCR扩增片段送交测序(上海生工生物技术有限公司) 后，分析测序结果获得T-DNA上下游的侧翼序列，侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。
实施例3
实施例2的侧翼序列在检测转基因大豆中的应用。
利用氮高效转基因大豆的侧翼序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)及外源片段T-DNA插入序列设计两对引物，建立了8c-ox-2事件及其衍生产品的定性PCR鉴定方法。根据外源片段中整合位点5’端大豆基因组设计引物SEQ ID NO.3：5’-AGAGCTTGAAGTGGGTTTAACGTG-3’，根据载体T-DNA的LB区设计引物为SEQ ID NO.4：TCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAG；根据外源片段中整合位点3’端大豆基因组设计引物SEQID NO.5：5’- TATGGCTTTCTTTACATGACTTACAGTG-3’，根据载体T-DNA的RB区设计引物为SEQID NO.6：TCTTCTAGGACCACATTATTTTCATTTC。大豆基因组DNA的提取方法、PCR的体系和PCR程序系依实施例2中的方法。用上述两组特异性引物进行PCR扩增时，非转基因植物(TL)无扩增条带，只有转基因植株8c-ox-2不同世代材料的DNA扩增是有特异性的374bp和 740bp条带(图4、图5)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示，试验说明利用转基因大豆事件8c-ox-2侧翼序列极性PCR检测，可以特异性的检测转基因大豆8c-ox-2的亲本和后代及其制品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南开大学
中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 128
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagcttgaa gtgggtttaa cgtggaaagt ggaatccacc tttgcctatg cgaaacgtcg 60
gagttgaaat gacaaagaaa aggataaaag cgaaccccca taaaaattgt ttcggctatt 120
gtaacatg 128
<210> 2
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttactttcta tctgaaaagg gtggccagta aaagcagggg gagaaattgt aaatgacctt 60
ttccctgaag ccttatcatg cttttttctc agaaagattt tcagtcttat cagttcttag 120
ttcttaccat tgtattggct tttccatttg aactaatctg attggatttt ctcatttgtt 180
gttcctgcca attaaattgt tgtaatggca tgtttagttt ttgctagctt tgtctttaat 240
gtagttgggt agttggtact gtaaatttaa ctctctgcta ttgtgatttt gcttactggt 300
tttgcatatg gttcccatgg ttattaaaac gaggaaatga aaataatgtg gtcctagaag 360
a 361
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agagcttgaa gtgggtttaa cgtg 24
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccataataa tgtgtgagta gttcccag 28
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatggctttc tttacatgac ttacagtg 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcttctagga ccacattatt ttcatttc 28
<210> 7
<211> 374
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agagcttgaa gtgggtttaa cgtggaaagt ggaatccacc tttgcctatg cgaaacgtcg 60
gagttgaaat gacaaagaaa aggataaaag cgaaccccca taaaaattgt ttcggctatt 120
gtaacatgat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt aatgtactga 180
attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac tggattttgg ttttaggaat 240
tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg gtttcttata 300
tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg gaactactca 360
cacattatta tgga 374
<210> 8
<211> 740
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tatggctttc tttacatgac ttacagtgga gagaacacct tcggatccca ttaggcataa 60
tgcatgttaa cttctgtaaa taggtgacca gctcgaattt ccccgatcgt tcaaacattt 120
ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat 180
ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga 240
gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa 300
tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcggg 360
aattaaacta tcagtgtttt tactttctat ctgaaaaggg tggccagtaa aagcaggggg 420
agaaattgta aatgaccttt tccctgaagc cttatcatgc ttttttctca gaaagatttt 480
cagtcttatc agttcttagt tcttaccatt gtattggctt ttccatttga actaatctga 540
ttggattttc tcatttgttg ttcctgccaa ttaaattgtt gtaatggcat gtttagtttt 600
tgctagcttt gtctttaatg tagttgggta gttggtactg taaatttaac tctctgctat 660
tgtgattttg cttactggtt ttgcatatgg ttcccatggt tattaaaacg aggaaatgaa 720
aataatgtgg tcctagaaga 740
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atttcgccat ggccaaaacc tccttcaagc ttc 33
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatttgggtc acctatttac agaagttaac atgcattatg c 41

Claims (6)

1.一种高氮素利用转基因大豆8c-ox-2外源插入片段的侧翼序列，其特征在于，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。
2.权利要求1所述的侧翼序列的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取转基因大豆8c-ox-2的基因组DNA，对所述基因组DNA进行基因组重测序，根据重测序结果确定转基因大豆8c-ox-2的T-DNA序列插入到大豆基因组第15号染色体上2779776～2781294碱基之间；
2)提取转基因大豆8c-ox-2的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)将所述步骤2)得到的扩增产物进行测序，将得到的测序结果同phytozome数据库中大豆基因组序列和步骤1)得到的T-DNA序列进行序列比对，得到侧翼序列。
3.根据权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3～6所示，所述SEQ ID No.3～4为扩增SEQ ID No.1的引物，所述SEQ IDNo.5～6为扩增SEQ ID No.2的引物。
4.根据权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
5.根据权利要求2或4所述的获取方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的体系每25μl包括基因组DNA100 ng，10×buffer 2.5μl，2.5mM dNTPs2μl，10μM引物各1μl，5U/μl Taq酶0.2μl，ddH2O补至25μl。
6.权利要求3中所述的引物在检测转基因大豆中的应用。
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