CN111235147A

CN111235147A - 一种氮高效转基因大豆sa-4外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用

Info

Publication number: CN111235147A
Application number: CN202010164246.8A
Authority: CN
Inventors: 王宁宁; 王丹; 靳洁莉; 刘生
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2020-06-05

Abstract

本发明提供了一种氮高效转基因大豆SA‑4外源插入片段的侧翼序列及其应用，属于基因育种技术领域。本发明提供的氮高效转基因大豆事件SA‑4经鉴定插入位点侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。本发明提供了用于检测该旁支序列的引物，如SEQ ID No.3～6所示。本发明提供的侧翼序列及其鉴定适用于氮高效转基因大豆SA‑4(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其制品)的检测。

Description

一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用

技术领域

本发明属于基因育种技术领域，尤其涉及一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用。

背景技术

转基因育种具有性状改良精准、周期短等特点。利用转基因技术进行作物氮素利用效率改良可以改善氮肥过度施用的现状，提高农业的可持续发展能力。

自噬在氮素充分与氮素不足条件下都是植物体进行氮素再动员的主要形式(Guiboileau等，2012)。自噬也是叶片衰老过程中营养物质再动员和早期转运的主要形式之一。在拟南芥中证明很多自噬相关基因ATGs的突变都会导致植物早衰，表现出对氮/碳胁迫更为敏感的表型((Doelling等，2002；Hanaoka等，2002；Yoshimoto等，2004；Thompson等，2005；Xiong等，2005；Chung等，2010)。GmATG8c蛋白是细胞自噬关键蛋白，在自噬体的形成和延展过程中发挥重要的功能(Xia T,Xiao D,Liu D,Chai W,Gong Q,etal.Heterologous expression ofATG8c from soybean confers tolerance to nitrogendeficiency and increases yield in Arabidopsis.PLoS ONE,2012,7:e37217.doi:10.1371)。

大豆个体发育过程中，伴随着种子的生长，叶片与营养体迅速衰老死亡(LindooSJ,Nooden LD.The interrelation of fruit development and leaf senescence in“noka”soybeans.Bot Gaz(Chicago),1976,137:218-223)，称为单次结实性衰老(monocarpic senescence)。这一发育特点导致在大豆种子发育过程中，“源”叶中的营养物质不能得到充分的动员与外运。此外，多种逆境都会造成大豆叶片衰老和产量变化。有实验证明，减缓种子发育过程中植株的衰老可以有效地促进大豆座荚率和胚珠发育、提高大豆的品质和产量(Mosjidis CO'H,Peterson CM,Truelove B,Dute RR.Stimulation of podand ovule growth of soybean,Glycine max(L.)Merr.,by 6-Benzylaminopurine.AnnBot,1993,71:193-199；Nooden LD,Letham DS(1993).Cytokinin metabolism andsignaling in the soybean plant.Aust J Plant Physiol,1993,20:639-653)。有研究发现，携带重组基因GGd1d1d2d2的大豆，其叶片衰老被明显延缓，种子产量大幅度提高(Guiboileau A,Yoshimoto K,Soulay F,BatailléMP,Avice JC,Masclaux-DaubresseC.Autophagy machinery controls nitrogen remobilization at the whole-plantlevel under both limiting and ample nitrate conditions in Arabidopsis.NewPhytol,2012,194(3):732-740)。

为特异性增强种子发育过程中“源”器官的营养动员效率，申请人利用衰老特异性启动子GmSARK(Xu F,Meng T,Li PL,Yu YQ,Cui YJ,Wang YX,Gong Q,Wang NN.A SoybeanDual-Specificity Kinase,GmSARK,and Its Arabidopsis Homolog,AtSARK,RegulateLeaf Senescence through Synergistic Actions of Auxin and Ethylene.PlantPhysiology,2011,157:2131-2153)构建GmSARK:GmATG8c融合基因，将携带GmSARK:GmATG8c融合基因的植物表达载体通过农杆菌介导法转入到大豆基因组中，获得了一个氮高效转基因大豆事件SA-4，并正在进行中间试验阶段的安全评价。对转基因大豆进行转化事件特异性检测，能更好的对转基因大豆进行监管管理，而外源插入片段的侧翼序列，是进行监督管理的一个重要指标。因此需要获得转基因大豆SA-4的侧翼序列，但是现有技术中并未报道有转基因大豆SA-4的侧翼序列。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用，本发明提供的侧翼序列可应用于转基因大豆的检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的侧翼序列的获取方法，包括以下步骤：

1)提取转基因大豆SA-4的基因组DNA，将所述基因组DNA进行基因组重测序，根据重测序结果确定转基因大豆SA-4的T-DNA序列插入到大豆基因组第16号染色体的30500320～30500792碱基之间；

2)提取转基因大豆SA-4的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；

3)将所述步骤2)得到的扩增产物进行测序，将得到的测序结果同phytozome数据库中大豆基因组序列和步骤1)得到的T-DNA序列进行序列比对，得到侧翼序列。

优选的，所述PCR扩增使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3～6所示，所述SEQID No.3～4为扩增SEQ ID No.1的引物，所述SEQ ID No.5～6为扩增SEQ ID No.2的引物。

优选的，所述PCR扩增的程序为94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

优选的，所述PCR扩增使用的体系每25μl包括基因组DNA100 ng，10×buffer 2.5μl，2.5mM dNTPs 2μl，10μM引物各1μl，5U/μl Taq酶0.2μl，ddH₂O补至25μl。

本发明通过基因组重测序结合基因组PCR的方法获得了高氮素利用转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。根据获得上述侧翼序列的引物，可以检测该侧翼序列，进而建立针对氮高效转基因大豆SA-4事件的鉴定方法，通过普通PCR扩增得到了包含载体片段又包含大豆基因组信息的序列，本发明提供的侧翼序列和引物适用于对转基因大豆SA-4(包括亲本、杂种F1和后代)及其制品(包括植株、组织、种子及其他制品)的检测。

附图说明

图1为载体构建示意图；

图2为氮高效转基因大豆SA-4的T₄代植株的PCR检测，其中M，GenStar D2000 plusDNA marker；TL，受体大豆天隆一号阴性对照；1-4，4株转基因植株；-，ddH₂O阴性对照；+，质粒pSARK-8c-3301为模板的阳性对照；

图3为低营养水培处理下T₃代SA-4转基因大豆基本表型，TL：受体大豆天隆一号；SA-4：SA-4转基因大豆单株材料；

图4为T₄代SA-4转基因大豆外源T-DNA左边界特异性PCR检测，M：GenStar D2000plus DNA marker；TL：受体大豆天隆一号阴性对照；1,2,3：3个T₄代SA-4转基因大豆单株；T₂：以1株T₂代SA-4转基因大豆材料为阳性对照；-：ddH₂O阴性对照；

图5为T₄代SA-4转基因大豆外源T-DNA右边界特异性PCR检测，M：GenStar D2000plus DNA marker；TL：受体大豆天隆一号阴性对照；1,2,3：3个T₄代SA-4转基因大豆单株；T₂：以1株T₂代SA-4转基因大豆材料为阳性对照；-：ddH₂O阴性对照。

具体实施方式

本发明提供了一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示，具体如下：

SEQ ID No.1：

TCATTGCCTCCACAAAGTAGAACACCACCGCCAAAAACACAGTTATTCCCCTTCAGTCACCAGAAGTCATCGATGTTGATGGCAATGATGACATTTGGGGATAGGTATGCTTAGCATCAATGAAGGAAGCACTAAATATGAACCATGTGCGATGAAGGAAGTGTCAGACCCCTACATGACAATATTGAATGACATCGACATCGAGATCAATGAAGACAACAACAACAGAAATCAGGGTTAGGTTTGGTATTCAACGAGGGAAAGTATGGTGTGTTGTTTTATGAACAACTAAAATTTGGTTTAACTTTGATTGTTGTTAAGTATAATTTGACATGTTGGGTCACTATATAATGTGATTTACAATTACATTTTCTTGAAGTTTGACTTTCTGGTTAACATATGATGTGGAGTCACCAATGATGCTAGTTTTTTGTTGTTACATTTAGATCTAATTTGTTGGAGGAGAGAGTATTTAGGAAAGAAGGGGGAGTGGTTTGGTGGGTGACGACAATGTTTTTGGCGGTA；

SEQ ID No.2：

TGACGACCAACTACGACGATGGAGGAGTTGCTGAGACTATGGTGCAGAGGGTGCACCACTAGTAGAAATCACCTTCGACGACGCTGAAAGTGGTCAAGGATAAAGGTAACTTGGGAGAAAAAGAGAAATGACAATAAAATATGGAGGATATATCATAATACTATAAATAGAAAATCAATCCAAACATTTTTTTTTACCCTATACATAACTTACATAGTTTGTGCCCGGTAGCCTTAGTCCTAAAATATAAATACAAGTAAACATTTATAAATTAGATTGGTAGTTGAGGTAGGAAAGAGTGAATATTTTTCAGGTCTGAGTGATAACAACTTAACATTTTGGGTGACAAGGATGAATGAAGTTGAGGATCCAA。

在本发明中，所述转基因大豆SA-4优选按照中国专利、申请号为201810553441.2中的方法获得。

3)将所述步骤2)得到的扩增产物进行测序，测序结果同phytozome数据库中大豆基因组序列和步骤1)得到的T-DNA序列进行序列比对，得到侧翼序列。

本发明对提取转基因大豆SA-4的基因组DNA的方法没有特殊限定，采用常规提取大豆基因组DNA的方法即可。

在本发明中，所述PCR扩增使用的引物的核苷酸序列优选如SEQ ID No.3～6所示，所述SEQ ID No.3～4为扩增SEQ ID No.1的引物，所述SEQ ID No.5～6为扩增SEQ ID No.2的引物，具体序列如下：

SEQ ID No.3：TCATTGCCTCCACAAAGTAG；

SEQ ID No.4：CCCGTCACCGAGATTTGAC；

SEQ ID No.5：TTCATCAACAACACTCTACC；

SEQ ID No.6：TTGGATCCTCAACTTCATTC。

在本发明中，所述基因组DNA经SEQ ID No.3～4PCR扩增，得到的扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，具体如下：

AAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTAATTCGGGGGATCTGGATTTTAGTACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGAAATTTTATTGATAGAAGTATTTTACAAATACAAATACATACTAAGGGTTTCTTATATGCTCAACACATGAGCGAAACCCTATAGGAACCCTAATTCCCTTATCTGGGAACTACTCACACATTATTATGGAGAAACTCGA

其中，下划线表示的引物所在位置，加粗表示的是侧翼序列。

在本发明中，所述基因组DNA经SEQ ID No.5～6PCR扩增，得到的扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，具体如下：

TCCAACTGCTGCATTGATGTCTGCTATTTATGAGGAAAATAAGGATCAAGATGGCTTTCTTTACATGACTTACAGTGGAGAGAACACCTTCGGATCCCATTAGGCATAATGCATGTTAACTTCTGTAAATAGGTGACCAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTGTT

在本发明中，所述PCR扩增的程序优选为94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；所述PCR扩增使用的体系每25μl优选包括基因组DNA100 ng，10×buffer 2.5μl，2.5mM dNTPs 2μl，10μM引物各1μl，5U/μl Taq酶0.2μl，ddH₂O补至25μl。

在本发明中，所述扩增产物优选送往上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与phytozome中的大豆基因组序列与已知的T-DNA序列进行比对后，得到侧翼序列。

本发明还提供了上述技术方案所述的侧翼序列在检测转基因大豆中的应用。

特定的转基因事件其旁侧序列是特定的，因此，应用旁侧序列可以特异性的检测转基因事件。可设计用于特异性扩增包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的引物，进行PCR扩增，检测特异条带。可以根据在5’旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段设计下游特异性引物，扩增特异性片段；或可以根据外源插入片段设计上游特异性引物，根据3’旁侧序列设计下游特异性引物，扩增特异性片段。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)氮高效转基因大豆转基因大豆SA-4的获得方式：

大豆衰老特异性表达启动子的克隆

以大豆基因组DNA为模板利用PCR方法扩增1800bp的启动子，回收扩增产物并进行TA克隆。

(1)PCR扩增目的片段

根据大豆衰老特异性表达基因的启动子序列设计特异引物，序列分别为上游引物P1(SEQ ID Mo.9)：5’-AAGCTTCCTTGGTACCTTTCTCAGGGTAGTG-3’和下游引物P2(SEQ IDNo.10)：5’-CCATGGTCATGCTTGCTCTTGCTGTTTTGAT-3’，其中上游引物引入Hind III切点，下游引物引入Nco I切点。

按CTAB法提取大豆基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备基因启动子片段。

表1 PCR反应体系

PCR反应程序：

94℃5分钟；

94℃30秒，58℃110秒，25个循环；

72℃10分钟；

(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定

①目的片段的回收

通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，回收方法采用购自Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤见商品说明书。

②连接

加入下列反应体系的试剂，16℃反应过夜，实现目的片段与pMD-18T载体(购自Takara公司)的连接。

表2连接体系

③转化和阳性克隆的鉴定

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，用10μL连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp的LB平板上，37℃倒置培养12-14小时。挑选转化平板上单克隆菌落，按常规方法提取质粒，用Hind III和Nco I双酶切，产生2.7kb的pMD-18载体片段和启动子的1800bp片段。按前面所述的PCR引物和扩增条件，以质粒提取物为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生1800bp的基因启动子片段，即为含有该启动子序列的阳性克隆。

④测序验证

经过鉴定的阳性克隆，送交菌液到北京六合华大基因科技股份有限公司进行DNA测序，序列与NCBI数据库进行比对分析确认序列无误。

大豆自噬相关基因GmATG8c的克隆

以大豆cDNA为模板利用PCR方法扩增360bp的功能基因，回收扩增产物并进行TA克隆。

(1)PCR扩增目的片段

根据已知的大豆自噬相关基因的序列设计特异引物，序列为上游引物P3(SEQ IDNo.11)：5’-ATTTCGCCATGGCCAAAACCTCCTTCAAGCTTC-3’和下游引物P4(SEQ ID No.12)：5’-CGAGCTGGTCACCTAATGGGATCCGAAGGTGTTCT-3’，在上游引物中引入Nco I酶切位点，在下游引物中引入BstE II酶切位点。

用Trizol法提取拟大豆RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备基因片段。

表3 PCR反应体系

PCR反应程序：

94℃5分钟；

94℃30秒，58℃30秒，25个循环；

72℃10分钟；

(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定

①目的片段的回收

②连接

表4连接体系

③转化和阳性克隆的鉴定

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，用10μL连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp的LB平板上，37℃倒置培养12-14小时。挑选转化平板上单克隆菌落，按常规方法提取质粒，用Nco I和BstP I双酶切，产生2.7kb的pMD-18载体片段和功能基因的360bp片段。按前面所述的PCR引物和扩增条件，以质粒提取物为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生360bp的功能基因片段，即为含有功能基因序列的阳性克隆。

④测序验证

经过鉴定的阳性克隆，送交菌液到北京六合华大基因科技股份有限公司进行DNA测序，其核酸序列在NCBI数据库中进行比对确认无误。

利用pCAMBIA3301载体构建SA融合基因

(1)从相应大肠杆菌工程菌中分别提取载体质粒pCAMBIA3301(从试剂公司购买)，用Hind III/BstE II双酶切并回收大的载体片段。

(2)在启动子的TA克隆中提取质粒，用Hind III/Nco I双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收启动子片段。

(3)从GmATG8c基因的TA克隆中提取质粒，用Nco I/BstE II双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收功能基因片段。

(4)将上述三个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成表达载体SA-pCAMBIA3301的构建。

表5反应体系

(5)用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同实施例1中(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定。

(6)挑选转化平板(Kan抗性)上的单克隆菌落，按常规方法提取质粒，用Hind III和BstP I双酶切质粒DNA产生两个片段，一个是12kb的pCAMBIA3301载体片段，另一个是2.1kb的SA融合基因片段。

(7)以质粒为模板进行PCR反应，方法同实施例1。

(8)经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序。

(9)从阳性克隆中提取质粒，用常规方法将表达载体pSARK-8c-3301通过常规冻融法转化农杆菌LBA4404并用于转化大豆。

2)通过农杆菌介导的大豆子叶节转化法将载体转化至大豆天隆1号(Paz等，2006)。对获得的转基因植株进行草铵膦涂抹(150mg/L)及PCR鉴定得到高产转基因大豆SA-4(图2)。通过在温室及网室低氮试验地种植试验中调查结果显示，转基因大豆SA-4与天隆一号相比在低氮条件下种植，低氮耐受性显著增加；在网室低氮土壤中种植，单株产量增幅为17.94，达到显著水平。

(1)温室实验

将氯气消毒过的T₃代SA-4转基因大豆种子和受体对照天隆一号于灭过菌的营养土中萌发，待初生叶完全展开后挑选发育状态一致苗，小心用水将根系冲洗干净，移栽至盛有10L 1/20Hoagland营养液的水培槽中，每槽处理材料12棵，包括转基因材料和对照各6棵。结果显示，SA-4转基因大豆苗期的低氮耐受性显著高于受体大豆天隆一号，其侧枝和根系的生长较天隆一号更为旺盛(图3)。

(2)网室低氮试验地种植试验

2017年在网室低氮土壤T₄代SA-4转基因材料和受体大豆天隆一号开展低氮耐受性实验。如表6所示，与受体大豆相比，SA-4转基因大豆的营养生长较对照具有明显优势，低氮耐受性显著高于受体大豆对照，单株粒数较受体大豆天隆一号增加14.36％，单株产量较对照增加17.94％，均达到显著性水平(表6)。

表6.网室低氮土壤中T₄代SA-4转基因大豆与天隆一号农艺性状比较

注：*表示转基因大豆材料SA-4与受体对照天隆一号(TL-1)存在显著差异，P<0.05

实施例2

通过基因组重测序技术找到实施例1的转基因大豆材料SA-4的T-DNA插入到16号染色体的30500320-30500792之间，插入方式为正向单拷贝插入(华大深圳基因股份有限公司)。根据插入区间上下游序列和T-DNA上设计引物(如表7)，进行PCR扩增，PCR反应体系(25ul)：DNA模板100ng，10×buffer 2.5μl，2.5mM dNTPs 2μl，10μM引物各1μl，5U/ul Taq酶0.2ul，加ddH2O补至25μl。PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。对扩增序列进行检测可知，左侧侧翼序列与部分T-DNA序列扩增全长为805bp，右侧侧翼序列与部分T-DNA序列扩增全长为820bp，将上述两段PCR产物进行目的片段的回收，回收方法采用购自Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤见商品说明书。回收片段送交测序(上海生工生物技术有限公司)，获得T-DNA上下游的侧翼序列如SEQ ID No.1～2所示。

表7转基因大豆SA-4转化体特异性PCR引物及产物信息

实施例3

实施例2的侧翼序列在检测转基因大豆中的应用。

利用氮高效转基因大豆的侧翼序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)及外源片段T-DNA插入序列设计两对引物，建立了SA-4事件及其衍生产品的定性PCR鉴定方法。根据外源片段中整合位点5’端大豆基因组设计引物SEQ ID NO.3：5’-TCATTGCCTCCACAAAGTAG-3’，根据载体T-DNA的LB区设计引物为SEQ ID NO.4：5’-CCCGTCACCGAGATTTGAC-3’；根据外源片段中整合位点3’端大豆基因组设计引物SEQ ID NO.5：5’-TTCATCAACAACACTCTACC-3’，根据载体T-DNA的RB区设计引物为SEQ ID NO.6：5’-TTGGATCCTCAACTTCATTC-3’。大豆基因组DNA的提取方法、PCR的体系和PCR程序系依实施例2中的方法。用上述两组特异性引物进行PCR扩增时，非转基因植物(TL)无扩增条带，只有转基因植株SA-4不同世代材料的DNA扩增是有特异性的805bp和820bp条带(图4、图5)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，试验说明利用转基因大豆事件SA-4侧翼序列极性PCR检测，可以特异性的检测转基因大豆SA-4的亲本和后代及其制品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南开大学

<120> 一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列、获取方法和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcattgcctc cacaaagtag aacaccaccg ccaaaaacac agttattccc cttcagtcac 60

cagaagtcat cgatgttgat ggcaatgatg acatttgggg ataggtatgc ttagcatcaa 120

tgaaggaagc actaaatatg aaccatgtgc gatgaaggaa gtgtcagacc cctacatgac 180

aatattgaat gacatcgaca tcgagatcaa tgaagacaac aacaacagaa atcagggtta 240

ggtttggtat tcaacgaggg aaagtatggt gtgttgtttt atgaacaact aaaatttggt 300

ttaactttga ttgttgttaa gtataatttg acatgttggg tcactatata atgtgattta 360

caattacatt ttcttgaagt ttgactttct ggttaacata tgatgtggag tcaccaatga 420

tgctagtttt ttgttgttac atttagatct aatttgttgg aggagagagt atttaggaaa 480

gaagggggag tggtttggtg ggtgacgaca atgtttttgg cggta 525

<210> 2

<211> 373

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgacgaccaa ctacgacgat ggaggagttg ctgagactat ggtgcagagg gtgcaccact 60

agtagaaatc accttcgacg acgctgaaag tggtcaagga taaaggtaac ttgggagaaa 120

aagagaaatg acaataaaat atggaggata tatcataata ctataaatag aaaatcaatc 180

caaacatttt tttttaccct atacataact tacatagttt gtgcccggta gccttagtcc 240

taaaatataa atacaagtaa acatttataa attagattgg tagttgaggt aggaaagagt 300

gaatattttt caggtctgag tgataacaac ttaacatttt gggtgacaag gatgaatgaa 360

gttgaggatc caa 373

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcattgcctc cacaaagtag 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccgtcaccg agatttgac 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcatcaaca acactctacc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttggatcctc aacttcattc 20

<210> 7

<211> 805

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcattgcctc cacaaagtag aacaccaccg ccaaaaacac agttattccc cttcagtcac 60

cagaagtcat cgatgttgat ggcaatgatg acatttgggg ataggtatgc ttagcatcaa 120

tgaaggaagc actaaatatg aaccatgtgc gatgaaggaa gtgtcagacc cctacatgac 180

aatattgaat gacatcgaca tcgagatcaa tgaagacaac aacaacagaa atcagggtta 240

ggtttggtat tcaacgaggg aaagtatggt gtgttgtttt atgaacaact aaaatttggt 300

ttaactttga ttgttgttaa gtataatttg acatgttggg tcactatata atgtgattta 360

caattacatt ttcttgaagt ttgactttct ggttaacata tgatgtggag tcaccaatga 420

tgctagtttt ttgttgttac atttagatct aatttgttgg aggagagagt atttaggaaa 480

gaagggggag tggtttggtg ggtgacgaca atgtttttgg cggtaaaaca aattgacgct 540

tagacaactt aataacacat tgcggacgtt tttaatgtac tgaattaacg ccgaattaat 600

tcgggggatc tggattttag tactggattt tggttttagg aattagaaat tttattgata 660

gaagtatttt acaaatacaa atacatacta agggtttctt atatgctcaa cacatgagcg 720

aaaccctata ggaaccctaa ttcccttatc tgggaactac tcacacatta ttatggagaa 780

actcgagtca aatctcggtg acggg 805

<210> 8

<211> 820

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcatcaaca acactctacc tccaactgct gcattgatgt ctgctattta tgaggaaaat 60

aaggatcaag atggctttct ttacatgact tacagtggag agaacacctt cggatcccat 120

taggcataat gcatgttaac ttctgtaaat aggtgaccag ctcgaatttc cccgatcgtt 180

caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 240

tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 300

tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 360

aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 420

tagatcggga attaaactat cagtgtttga cgaccaacta cgacgatgga ggagttgctg 480

agactatggt gcagagggtg caccactagt agaaatcacc ttcgacgacg ctgaaagtgg 540

tcaaggataa aggtaacttg ggagaaaaag agaaatgaca ataaaatatg gaggatatat 600

cataatacta taaatagaaa atcaatccaa acattttttt ttaccctata cataacttac 660

atagtttgtg cccggtagcc ttagtcctaa aatataaata caagtaaaca tttataaatt 720

agattggtag ttgaggtagg aaagagtgaa tatttttcag gtctgagtga taacaactta 780

acattttggg tgacaaggat gaatgaagtt gaggatccaa 820

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aagcttcctt ggtacctttc tcagggtagt g 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccatggtcat gcttgctctt gctgttttga t 31

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atttcgccat ggccaaaacc tccttcaagc ttc 33

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgagctggtc acctaatggg atccgaaggt gttct 35

Claims

1.一种氮高效转基因大豆SA-4外源插入片段的侧翼序列，其特征在于，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示。

2.权利要求1所述的侧翼序列的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取转基因大豆SA-4的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；

2)将所述步骤2)得到的扩增产物进行测序，将得到的测序结果与phytozome数据库中的大豆基因组序列和步骤1)得到的T-DNA序列进行比对，得到侧翼序列。

3.根据权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3～6所示，所述SEQ ID No.3～4为扩增SEQ ID No.1的引物，所述SEQ IDNo.5～6为扩增SEQ ID No.2的引物。

4.根据权利要求2所述的获取方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

5.根据权利要求2或4所述的获取方法，其特征在于，所述PCR扩增使用的体系每25μl包括基因组DNA100 ng，10×buffer 2.5μl，2.5mM dNTPs 2μl，10μM引物各1μl，5U/μl Taq酶0.2μl，ddH₂O补至25μl。

6.权利要求1所述的侧翼序列在检测转基因大豆中的应用。