CN101880666B - 一种植物叶脉特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

一种植物叶脉特异性启动子及其应用。该启动子核酸序列如序列表1所示，它可以驱动目的基因在植物叶脉中特异性表达。本发明克隆了VS启动子序列，并通过检测“VS启动子-GUS”融合基因在转基因拟南芥各个器官中的表达水平，证明VS启动子在拟南芥中具有独特的叶脉特异性活性；同时，以“VS启动子-GUS”融合基因转化微型番茄Micro-Tom，进一步证实“VS启动子-GUS”融合基因也只在转基因番茄的叶脉中特异性表达。应用本发明的启动子，构建获得“启动子-待表达目的基因”的融合基因，进行植物转化可获得在叶脉特异性表达目的基因的转基因植物。该启动子不仅可以用于研究植物维管组织分化和物质运输机理等，更在植物基因工程技术的研究和应用中具有重要价值。

Description

一种植物叶脉特异性启动子及其应用

【技术领域】：

本发明属于植物基因工程领域，具体说是用分子生物学技术获得一种新的植物叶脉特异性启动子及其在转基因植物中的应用。

【背景技术】：

启动子(promoter)是一段特定的直接与RNA聚合酶及转录因子相结合、决定基因转录起始与否的DNA序列。一般来说，结构基因由三部分组成：启动子(promoter)、编码区(coding region)及终止子(terminator)。编码区决定蛋白质的结构，终止子决定mRNA的长度。启动子包含核心启动子区域和调控区域，核心启动子区域产生基础水平的转录，调控区域能够对不同的发育和环境信号作出应答，对基因的表达水平做出相应的调节。

真核生物基因的表达与否、以及表达的时空变化，需要启动子上的顺式作用元件与相应的转录因子的协同作用。近年来人们在启动子方面展开了大量的研究工作，不仅从不同植物基因组中克隆了大量的启动子，而且对其结构和功能也有了一定的认识。根据植物中启动子启动转录的模式可将其分为三类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动了几乎能在所有细胞、任何发育阶段启动基因转录；组织或器官特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中；诱导型启动子只有在诱导因子的作用下才具有起始转录的活性。通过对已知的植物启动子进行分析，发现具有相同或相似的组织特异性以及具有相近诱导型的启动子的顺式作用元件之间有一定的保守性，这些元件的种类、数量以及彼此之间的顺序与距离都可能影响基因的转录与否或转录程度(路静等，2004)。

花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子是目前植物基因工程中使用最多的组成型启动子，它具有多种顺式作用元件驱使目的基因产生组成型表达。但是由于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有不同程度表达，在植物基因工程的应用中逐渐暴露出一些问题。例如外源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡。另外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象(Kumpatla等，1998)。因此，迫切需要寻找更为有效的特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控目的基因在转基因植物中的表达模式。

组织或器官特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中，并往往表现出受发育调节的特性，因此可以用来契合研究目的进行有针对性地、特异、高效地调控目的基因的表达，这为其在基因工程技术中的应用带来了广阔前景。随着植物分子生物学研究的不断发展，目前在拟南芥、水稻、番茄、咖啡、百合等许多植物中已发现这类组织、器官特异性启动子，如Pyk10启动子在根中特异表达(Nitz等，2001)、RBCS1启动子在叶中特异表达(Marraccini等，2003)、Bp4A启动子在花粉特异表达(Albani等，2000)、番茄E8启动子在成熟果实中特异表达(Sandhu等，2000)、LGC1启动子在雄配子细胞中表达(Singh等，2003)、水稻谷蛋白GluB-1基因启动子在种子中特异表达(Takaiwa等，1986)等等。

叶脉由贯穿在叶肉内的维管组织组成，是叶的输导和支持结构。它为植物叶片提供水分和无机盐、输出光合产物；又支撑着叶片，使之伸展于空间，保证叶的生理功能顺利进行。维管组织由木质部和韧皮部组成，韧皮部主要运输植物体内糖等光合产物，因而成为许多植物病虫害的侵害目标。有针对性地在植物易受侵害的韧皮部高效表达抗病或抗虫基因，可以使转基因植物具有病虫害抗性。

总之，获得并有效利用组织或器官特异性启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等相关的基础理论问题，更可以有目的地调节转基因植物的发育、改善农作物的品质和产量，势必将成为农作物性状改良与新品种培育的强有力工具，具有广泛的应用价值。

【发明内容】：

本发明目的是解决现有技术中，因使用组成型启动子，使外源基因在整株植物中表达并产生大量异源蛋白质或代谢产物积累在植物体内，打破了植物原有的代谢平衡，因有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡，以及重复使用同一种组成型启动子可能引起基因沉默或共抑制现象等问题；同时也有别于叶片特异性启动子的全叶片活性，针对于研究植物维管组织分化和物质运输机理等需要以及依据例如许多植物病虫害的主要侵害目标是叶脉韧皮部、需要进行有针对性的抗病虫害目的基因表达等植物基因工程技术研究的需要，提供一种新的植物叶脉特异性启动子及其在转基因植物中的应用。

本发明提供了一种新的、1107bp的植物叶脉特异性启动子，该启动子是由原长2390bp的启动子截短后获得，长2390bp的原启动子可以驱动报告基因在拟南芥黄化苗、根、子叶、真叶、花和种荚等器官中表达(Tsuchisaka，2004)，但在本发明所述位置截短为1107bp以后，表现出叶脉特异性活性，因此我们将该截短的启动子命名为叶脉特异性启动子(vein-specific promoter)，简称VS启动子。该启动子核酸序列选自：

(a)如序列表1所示的核酸序列；

(b)在(a)限定的核酸序列中至少具有85％以上的同源性的核酸序列。

作为具体应用的实例，本发明提供了一种VS启动子的克隆方法，具体操作步骤如下：

第一、以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR方法扩增VS启动子；

第二、回收PCR扩增产物；

第三、将上述第二步回收的扩增产物，与pGEM-T-Easy载体(购自Promega公司)在连接酶催化下进行连接反应；

第四、将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

第五、通过抗性筛选，获得该启动子的阳性TA克隆。

本发明同时提供了一种叶脉特异性启动子的应用，即：利用获得的叶脉特异性启动子，构建获得“VS启动子-目的基因”的融合基因，进行植物转化，从而获得基因组中含有以上所述启动子核酸序列的、可在叶脉特异性表达目的基因的转基因植物。其中所述的融合基因中的目的基因可以是任何针对基础研究、转化技术或者农作物性状改良需要的目的基因。

作为具体应用的实例，本发明提供了一种“VS启动子-GUS报告基因”融合基因的构建及其在转基因植物叶脉中的特异表达。操作过程如下：

所述应用中的融合基因“VS启动子-GUS报告基因”的构建方法，包括如下步骤：

第一、用BamHI/NcoI双酶切含有VS启动子的TA克隆质粒，回收VS启动子片段；

第二、用BamHI/NcoI双酶切pCAMBIA 1301(购自CAMBIA公司)质粒，回收大的载体片段(其中含有报告基因GUS的编码序列)；

第三、混合上述第一步得到的VS启动子片段和第二步得到的pCAMBIA 1301载体片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA 1301载体上的“VS启动子-GUS”融合基因的构建。

其中所设计的拟南芥叶脉特异性表达的VS启动子的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入了BamHI酶切位点，下游引物引入了Nco I酶切位点：

上游引物：5’-ACGGATCCGAACTAGGTCTAGTCACGTGGT-3’

下游引物：5’-ACCCATGGGCTGTGTCAATTCTCACTTCTT-3’

所述应用中的“VS启动子-GUS报告基因”在转基因植物叶脉中特异表达，操作过程如下：

拟南芥转化的具体方法，采用农杆菌介导的Floral infiltration(Tague，2001)方法，获得的种子经过50mg/L潮霉素抗性筛选，生长正常的抗性植株转土培养；微型番茄Micro-Tom转化的具体方法，采用农杆菌介导的遗传转化方法(Meissner，1997)，转化芽经过10mg/L潮霉素抗性筛选后诱导生根，随后将抗性苗移土培养至开花结果；利用组织化学染色的方法(Blume和Grierson1，1997)，检测转基因拟南芥和微型番茄Micro-Tom中GUS报告基因表达的叶脉特异性。

本发明的优点和积极效果：

本发明利用有效的叶脉特异性启动子代替组成型启动子，可以用于构建在植物叶脉特异性表达目的基因的融合基因。利用遗传转化技术将其转入植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得叶脉特异性表达目的基因的转基因植物。这种新的叶脉特异性表达启动子不仅对于研究植物维管组织分化和物质运输机制有重要意义，也为植物基因工程技术的研究和应用提供有重要价值的启动子和元件。本发明具有广泛的应用价值，必将成为农作物性状改良与新品种培育的强有力工具。

【附图说明】：

图1是VS启动子-GUS转基因拟南芥植株的PCR鉴定；泳道M：plus2000Marker；泳道1：H₂O为模板的PCR的负对照；泳道2：VS启动子-GUS质粒为模板的PCR的正对照；泳道3：用野生型拟南芥的基因组DNA为模板的负对照；泳道4-10：VS启动子-GUS转基因拟南芥植株的基因组DNA为模板的PCR产物。

图2是VS启动子-GUS转基因拟南芥植株的GUS染色结果，其中，图a：成熟莲座叶；b：成熟的叶片；c：主茎；d：发育的种荚。

图3是VS启动子-GUS转基因微型番茄Micro-Tom叶片的GUS染色结果。

【具体实施方式】：

实施例1：叶脉特异性的VS启动子克隆

第一、以拟南芥基因组DNA为模板利用PCR方法扩增1107bp的VS启动子，回收扩增产物并进行TA克隆。

(1)PCR扩增目的片段

根据已知的拟南芥VS启动子区的序列设计特异引物，在上游引物中引入BamHI酶切位点，在下游引物中引入Nco I酶切位点。

上游引物：5’-ACGGATCCGAACTAGGTCTAGTCACGTGGT-3’(引入BamHI切点)

下游引物：5’-ACCCATGGGCTGTGTCAATTCTCACTTCTT-3’(引入Nco I切点)

按常规方法提取拟南芥基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备VS启动子片段。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

94℃5分钟；

94℃30秒，60℃1分30秒，30个循环；

72℃10分钟；

4℃保温。

(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定

①目的片段的回收

通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，回收方法采用大连宝生物(TaKaRa)公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤见商品说明书。

②连接

加入下列反应体系的试剂，16℃反应过夜，实现目的片段与pGEM-T-Easy(购自Promega公司)载体的连接。

③转化和阳性克隆的鉴定

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，用10μL连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp、X-gal和IPTG的平板上，37℃倒置培养12-14小时。挑选转化平板上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用BamH I和Nco I双酶切，产生3kb的pGEM-T-Easy载体片段和包含VS启动子的1107bp片段。按前面所述的PCR引物和扩增条件，以质粒提取物为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生1107bp的VS启动子片段，即为含有VS启动子序列的阳性克隆。

④测序验证

经过鉴定的阳性克隆，送交菌穿刺培养物到Sangon(上海生工生物技术有限公司)进行DNA测序，其核酸序列如序列表1所示。

实施例2：利用pCAMBIA1301载体(含有GUS报告基因)构建“VS启动子-GUS”融合基因

(1)从大肠杆菌中提取载体pCAMBIA 1301质粒(该菌株可从生物公司或CAMBIA购买)，用BamH I/Nco I双酶切后回收大的载体片段(其中包含有GUS报告基因序列)。

(2)从实施例1所制备的TA克隆中提取质粒，用BamH I/Nco I双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收(同实施例1)VS启动子片段。

(3)将上述2个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pCAMBIA 1301载体上的“VS启动子-GUS”融合基因构建。

连接体系：

(4)用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同实施例1。

(5)挑选转化平板(Kan抗性)上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用BamH I和BstE II双酶切质粒DNA产生两个片段，一个是8728bp的pCAMBIA 1301载体片段，另一个是3430bp的“VS启动子-GUS”融合基因。

(6)以质粒为模板进行PCR反应，鉴定质粒中的“VS启动子-GUS”融合基因，扩增片段的大小是1390bp。所用引物如下：

上游引物：5’-ACGGATCCGAACTAGGTCTAGTCACGTGGT-3’

下游引物：5’-TCGCGATCCAGACTGAATGCC-3’

(7)经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序。

(8)从阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌LBA4404，获得工程化农杆菌，用于植物转化。

实施例3：转基因拟南芥的制备

(1)用实施例2构建的“VS启动子-GUS”融合基因转化拟南芥，具体转化方法采用农杆菌介导的Floral infiltration(Tague，2001)方法，获得的种子经过50mg/L潮霉素抗性筛选，生长正常的植株转土培养。

(2)转基因植株的PCR检测：分别剪取转基因植株和野生型植株的叶片，参考《分子克隆实验指南(第三版)》(黄培堂等，2002)方法提取叶片基因组DNA，用如下引物进行PCR反应，反应体系如同实施例1：

上游引物：5’-ACGGATCCGAACTAGGTCTAGTCACGTGGT-3’

下游引物：5’-TCGCGATCCAGACTGAATGCC-3’

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，转基因植株出现1390bp的“启动子-GUS”融合基因条带，非转基因植株未出现融合基因条带，证明目的片段已整合到植物基因组中(见图1)。

(3)转基因拟南芥叶脉特异性表达GUS报告基因的检测

利用组织化学染色(Blume和Grierson，1997)的方法，检测在转基因植物中VS启动子驱动下GUS表达的器官特异性和发育特异性。在转基因植物各个器官、组织或细胞中的蓝色为报告基因GUS的组织化学染色，代表着VS启动子在这些部位具有表达活性。染色时间为5小时左右，将材料的染色结果扫描成图片后保存。

染色结果如图2：光周期16h光/8h暗条件下，在“VS启动子-GUS”转基因拟南芥的成熟叶叶脉中都有很强的GUS活性，而在叶肉、主茎、花以及种荚中则没有GUS表达(图2)。结果证明：VS启动子可以驱动GUS报告基因在转基因拟南芥的叶脉中特异性表达；说明该启动子在转基因植物中具有很好的叶脉特异性，可以驱动目的基因在转基因植物的叶脉中进行特异表达。

实施例4：转基因微型番茄Micro-Tom的制备

(1)用实施例2构建的“VS启动子-GUS”融合基因转化微型番茄Micro-Tom，具体转化方法采用农杆菌介导的遗传转化方法(Meissner，1997)，转化芽经过10mg/L潮霉素抗性筛选后诱导生根，将生根较好的植株移土培养至开花结实，从而获得转基因番茄植株；

(2)转基因植株的PCR检测：叶片基因组DNA的提取、所用引物以及反应体系同实施例3。

(3)转基因微型番茄叶脉特异表达GUS报告基因的检测

利用组织化学染色(Blume和Grierson，1997)的方法，检测在转基因微型番茄中VS启动子驱动下GUS表达的器官特异性和发育特异性(同实施例3)。

染色结果如图3：光周期16h光/8h暗条件下，在“VS启动子-GUS”转基因微型番茄的叶脉中都有很强的GUS活性，而在叶肉和其他器官中没有GUS活性(图3)。该实验结果也进一步证明了VS启动子在转基因植物中具有很好的叶脉特异性，可以驱动目的基因在转基因植物的叶脉中进行特异表达。该启动子在研究植物维管组织分化和物质运输机理、以及利用基因工程技术进行农作物性状改良与新品种培育，例如依据许多植物病虫害的主要侵害目标是叶脉韧皮部而进行有针对性的抗病虫害目的基因表达等植物基因工程技术的研究和应用中具有重要价值。

【参考文献】：

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序列表

序列表SEQUENCELISTING

<110>南开大学

<120>一种植物叶脉特异性启动子及其应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1107

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thalina(L.)Heynh.)

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)...(22)

<223>gaactaggtc tagtcacgtg gt

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)...(22)

<223>aagaagtgag aattgacaca gc

<400>1

gaactaggtc tagtcacgtg gtcgacgcgt gagagtttcc ggcgtgaact gcaagtaaaa    60

tcacgtagag catgtgattg acttgaccaa agagtccaaa cccaccaact acaaaaaaaa    120

atcaagatat aaataactaa ctctcactag tcactaatat aatttttcat tacaattcat    180

atatgatcta ctaacaattg ttgtggttat acaaacaaaa aatttatttt tcgtaagacg    240

gaaattttga aatcaaattc ctcaacactc aaatgaatat tcagtagtag tttatcaatg    300

actagattag atatttctta acgccagtca aattttggaa ttatgtggag gacgtacgtt    360

tatacatgtg cagactacaa cataccaaat gttttattaa accaaattac aatgttgcaa    420

attggtctat tcttttgaat aatctgatac attttatctc ataactttctt cctttttatt   480

tgaattcaat caaataatat tctccacatc cccaaccttc tttttttttt tgcatgacta    540

agtagtttaa ggtcaacatt tttcataaga agttgcttag aaatagcctt gggttcaaat    600

aaaatacaca tgattttccc gtttccacc aataaatccc aatggatttt actactgaaa     660

cggaaatcaa tgcgaaacta ttggagtaag accaatttat tcatcttaat ctaccaaatt    720

cggatacgat atgtttaata caagggagat tgatgctagc aaaacacaac catcttaatt    780

tttttttttt ttttttaatt agaaattccc ttcccaaatg gtaattcaat cgtaacaaaa    840

gtacgttttg aaatattgtt ttggatggag attttttcct tggttcgctt gttacttttc    900

acttgtttca tcaaatccta actcctttta ttttggaccc cacatcaact ttatttggtc    960

tcctcaaggt ttctgtttca actcctatat aaaagcaaat aactcatacg ttaattagta    1020

cacaccacaa aaacttgtca taagatcaat atcgataccc ccaaaaaaaa aaaaaaacag    1080

ctacaaagaa gtgagaattg acacagc    1107

Claims (5)

1.一种植物叶脉特异性启动子VS，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的植物叶脉特异性启动子VS，其特征在于，所设计的VS启动子的PCR扩增引物如下，其中上游引物中引入了BamHI酶切位点，下游引物中引入了Nco I酶切位点：

上游引物：5’-ACGGATCCGAACTAGGTCTAGTCACGTGGT-3’

下游引物：5’-ACCCATGGGCTGTGTCAATTCTCACTTCTT-3’。

3.根据权利要求2所述的植物叶脉特异性启动子VS，其特征在于，从拟南芥基因组DNA中克隆获得VS启动子，具体操作步骤如下：

(1)以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR方法扩增VS启动子；

(2)回收PCR扩增产物；

(3)将上述(2)步回收的扩增产物，与pGEM-T-Easy载体在连接酶催化下进行连接反应；

(4)将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

(5)通过抗性筛选，获得该启动子的阳性TA克隆。

4.一种权利要求1所述的植物叶脉特异性启动子VS的应用，其特征在于，利用该启动子构建获得“VS启动子-目的基因”的融合基因，将其转化植物，从而获得基因组中含有权利要求1所述启动子核酸序列的、可在叶脉特异性表达相应目的基因的转基因植物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用该启动子构建获得“VS启动子-GUS”融合基因，在转基因拟南芥中驱动GUS报告基因在叶脉中特异性表达；在转基因微型番茄Micro-Tom中，该启动子也能驱动GUS报告基因在叶脉中特异性表达。

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