CN101665787B - 一种植物叶片特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新发现的DNA序列，它可以作为启动子调控目的基因特异表达于植物的叶片中。本发明从大豆基因组中克隆了GmSecA基因启动子序列；通过分析GmSecA基因在大豆各个器官中的表达水平，确定GmSecA启动子具有很好的叶片表达特异性；随后在转基因拟南芥中证实，该启动子能够指导GUS报告基因在叶片中特异表达。应用本发明的启动子，构建获得“启动子-待表达目的基因”融合基因，将其转化植物可获得在叶片特异性过表达目的基因的转基因植物。这不仅可以提高目的基因在转基因植物叶片中的表达量、降低生物能耗、利于表达产物的分离，而且可以有目的地改善转基因植物的叶片发育、或赋予其新的功能或特性、改良作物的品质和产量。

Description

一种植物叶片特异性启动子及其应用

【技术领域】：本发明属于植物基因工程领域，具体说是用分子生物学技术获得一种新的植物叶片特异性表达的启动子及其在转基因植物中的应用。

【背景技术】：启动子(promoter)是一段特定的直接与RNA聚合酶及其转录因子相结合、决定基因转录起始与否的DNA序列。一般来说，结构基因的组成可分为三个部分：启动子(promoter)、编码区(coding region)及终止子(terminator)。编码区决定蛋白质的结构，终止子是决定mRNA长度的区域，启动子则是一个基因转录起始的信息提供者，通常位于转录起始点的上游，也是调控基因表达的关键区域。

真核生物基因的表达在四个水平上进行调控：(1)基因结构的活化；(2)转录水平的调控；(3)转录后水平的调控；(4)翻译及翻译后的调控。对于大多数基因，转录水平是主要调控点。从效果来看，是否转录是最经济、有效的基因表达调控方式。对特定基因转录机制的研究一直是基因表达调控研究领域的热点。

基因表达与否，以及表达时间、表达部位需要启动子上的顺式作用元件与相应的转录因子的协同作用。近20年人们在启动子研究方面展开了大量的工作，不仅克隆了数量丰富的启动子，而且对其结构和功能有了一定的认识。从植物中已知的启动子分析，组织特异性及诱导型启动子的顺式作用元件有一定的保守性，这些元件的种类、数量以及彼此之间的顺序与距离都可能影响基因的转录与否或转录程度。如果能发现其中的规律，将会对基因表达的调控取得突破性进展。另外，基因的特异性表达不仅包括在特定时期激活某些基因的表达，还涉及到在其他组织器官或发育时期抑制某些基因的表达，对整体的研究将使人们更好地理解基因表达的调控过程。

获得性实验已经发现大量响应特异性表达模式的顺式作用元件，这些元件是与组成型的、发育的、组织特异性的、激素的、环境调控相关的。例如：已发现的与Myb、AP2/EREBP、bZIP、MADS、WRKY、ARFAux/IAA和Dof等这些转录因子相关的顺式作用元件。对于作为激活子、抑止子、增强子和染色质修饰物的结合区域的特异性顺式作用元件本质的了解，是理解植物的结合转录调控的关键(Venter和Botha，2004)。

深入研究和开发启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且具有广泛的应用价值。利用果实或种子等器官特异性启动子调控基因表达，不仅可提高基因在这些部位的表达量，将生物能耗降到最低，利于表达产物的分离，而且可有目的地提高转基因植物果实或种子的营养或改善其品质。

根据植物中启动子的转录模式可将其分为三类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子能在所有细胞、任何时候进行转录；组织或器官特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中；诱导型启动子平时不启动转录或转录活性很低，但在诱导因子的作用下，转录活性能够显著地提高。

花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子是目前植物基因工程中使用最多的启动子，它具有多种顺式作用元件驱使转基因产生组成型表达，应用非常广泛。但是由于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有不同程度表达，在植物基因工程的应用中逐渐暴露出一些问题。例如外源基因在整株植物中表达，产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡。另外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象(Kumpatla等，1998)。因此，迫切需要寻找更为有效的代替组成型启动子，以更好地调控植物基因表达。

组织或器官特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中，这类启动子中一般同时存在几种控制组织特异性表达的作用元件，其表达特异性由这些元件的种类、数目及相对位置等共同决定。随着植物分子学研究的不断发展，目前在拟南芥、水稻、番茄、咖啡、百合等许多植物中已发现这类组织、器官特异性启动子，如Pyk10启动子(Nitz等，2001)在根中特异表达、RBCS1启动子在叶中特异表达(Marraccini等，2003)、Bp4A启动子花粉特异表达(Albani等，2000)、番茄E8启动子在(Sandhu等，2000)成熟果实中特异表达、LGC1启动子在雄配子细胞中表达(Singh等，2003)。水稻谷蛋白GluB-1基因启动子在种子中特异表达(Takaiwa等，1986)等等。

获得并有效利用这些组织或器官特异性启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且可有目的地调节转基因植物的发育、改善农作物的品质，势必将成为农作物性状改良与新品种培育的强有力工具，具有广泛的应用价值。

【发明内容】：本发明目的是解决现有技术中，因使用组成型启动子，使得外源基因在整株植物中表达，并产生大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内的积累，打破了植物原有的代谢平衡，有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡，以及重复使用同一种组成型启动子可能引起基因沉默或共抑制现象等问题，提供一种新的植物叶片特异性的启动子及其在转基因植物中的应用。

本发明提供了一种新的植物叶片特异性表达的GmSecA基因启动子，其启动子核酸序列如序列表1所示。

本发明同时提供了一种所述的叶片特异性启动子的应用，即：利用获得的叶片特异性表达启动子，构建获得“启动子-目的基因”的融合基因，将其转化植物可获得在叶片特异性过表达目的基因的转基因植物。其中所述的融合基因中的目的基因可以是任何针对基础研究或者农作物品质改良需要的目的基因。

作为具体应用的实例，本发明提供了一种“启动子-GUS报告基因”融合基因的构建和在转基因植物叶片中进行特异表达。操作过程如下：

所述应用中的融合基因“启动子-GUS报告基因”的构建方法，包括如下步骤：

第一、以大豆基因组DNA为模板，用PCR方法扩增GmSecA基因的启动子，回收扩增产物并进行TA克隆；

第二、用Kpn I/Nco I双酶切含有GmSecA基因启动子的TA克隆质粒，回收GmSecA基因启动子片段；

第三、用Kpn I/Nco I双酶切pCAMBIA 1301(购自CAMBIA)质粒，回收大的载体片段(其中含有报告基因GUS的编码序列)；

第四、混合上述第二步得到的GmSecA基因启动子片段和第三步得到的pCAMBIA 1301载体片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA 1301载体上的GmSecA-GUS融合基因的构建。

其中所设计的大豆叶片特异性表达基因GmSecA的启动子的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入Kpn I酶切位点，下游引物引入Nco I酶切位点：

上游引物：5’-GGTACC GGA AAC GGT GGG GGT TTC GGG AAG-3’

下游引物：5’-CCATGG TTC GAA TGA ATT AAG AAT TGC GGA-3’

所述应用中的“启动子-GUS报告基因”在转基因植物叶片中特异表达，操作过程如下：

拟南芥转化的具体力法，采用农杆菌介导的Floral infiltration(Tague，2001)方法，获得的种子经过50mg/L潮霉素抗性筛选，生长正常的抗性植株转土培养；利用组织化学染色的方法(Blume和Griersonl，1997)，检测转基因拟南芥叶片中GUS报告基因的表达特异性。

本发明的优点和积极效果：

本发明利用有效的组织、器官特异性启动子代替组成型启动子，可以获得叶片特异性表达的启动子，并可以构建获得在植物叶片特异表达目的基因的融合基因。利用遗传转化技术将其转入植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得叶片特异性过表达目的基因的转基因植物。这不仅可以提高目的基因在叶片中的表达量、降低生物能耗、利于表达产物的分离，而且可以有目的地改善转基因植物的叶片发育、或赋予其新的功能或特性、并进一步改良作物的品质和产量，本发明具有广泛的应用价值，必将成为农作物性状改良与新品种培育的强有力工具。

【附图说明】：

图1是GmSecA基因的在大豆各个器官中的表达特异性检测结果。

图2是GmSecA启动子-GUS转基因拟南芥T1代植株的PCR鉴定；泳道M：DL2000Marker；泳道1：GmSecA启动子-GUS质粒为模版的PCR的正对照；泳道2～8：GmSecA启动子-GUS转基因拟南芥T1代植株的基因组DNA为模板的PCR产物；泳道9：用野生型拟南芥的基因组DNA为模版的负对照。

图3GmSecA启动子-GUS转基因拟南芥中GUS染色结果，其中，图3a：成熟莲座叶；3b：茎生叶；图3c：花序。

【具体实施方式】：

实施例1：大豆GmSecA基因在叶片中的特异性表达检测

(1)大豆器官特异性半定量RT-PCR样品的取材：

分别选取V2时期的大豆子叶、V5时期大豆的根、茎和叶材料(采集根部材料时，应注意避开根瘤菌的干扰)；R2时期大豆花(包括萼片)材料；R3时期大豆的种荚材料(大豆发育时期的界定参考Fehr等1971方法)。每个样品随机取样3次，液氮速冻后，-70℃冰箱保存备用。

(2)大豆叶片总RNA的提取：

用异硫酸腈胍-酚法，药品的使用、配制以及具体操作步骤参考《分子克隆-实验指南》(第三版(黄培堂等，2002)。

(3)半定量RT-PCR

①内标基因的选择

核糖体18S rRNA在植物的各个器官和各发育时期在总RNA中的含量相对稳定，因此我们选用大豆核糖体18S rRNA基因为作为定量的内标基因。根据GenBank中18S rRNA的基因序列，设计了内标引物SRNA-1(5’-CCT TGC TTG TTG CTT TAC TAAATAG-3’)和SRNA-2(5’-ATG CACCTT TT CGT TTG TTT CGG AG-3’)，扩增的目的片段长度为209bp。

②半定量RT-PCR实验流程

(a)从各样品中提取总RNA后用一定量的DNAase(RNAase free)消化，然后用基因特异引物以总RNA为模板进行PCR反应，经电泳检测后没有发现任何扩增带，说明RNA样品中的基因组DNA已经去除干净；

(b)利用分光光度计将总RNA严格定量为1μg/μL；

(c)取2μg RNA，以Olig(dT)为引物利用Promega的反转录酶ImProm-II TM进行反转录，操作方法参照说明书；

(d)根据已知的基因序列，设计一对目的基因特异引物GSP1(5’-GAT TGA AGG TTG GCCTCA TTC AGC AGA-3’)和GSP1(5’-CTG CAT GAC TCG ACC AGT AAA CTC ATC-3’)。

取1μL反转录产物，稀释至50倍，作为内标基因扩增的PCR模板；其余留做目的基因扩增模板；按如下反应体系和程序进行PCR扩增，扩增长度527bp：

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；4℃保温。本文中给出的结果均经过3次自RNA提取开始独立的重复实验验证。

③半定量RT-PCR结果如图1所示，大豆GmSecA基因在子叶和叶片中有很高的表达水平，在根和茎中几乎没有表达，在花(含萼片)和种荚中有微弱表达。结果说明大豆GmSecA基因在叶片中有很好的特异性表达，GmSecA启动子具有驱动基因在大豆叶片特异性表达的活性。

实施例2：叶片特异性GmSecA启动子克隆

第一、以大豆基因组DNA为模板利用PCR方法扩增1500bp的GmSecA基因启动子，回收扩增产物并进行TA克隆。

(1)PCR扩增目的片段

根据已知的大豆GmSecA基因启动子区的序列设计特异引物，在上游引物中引入Kpn I酶切位点，在下游引物中引入Nco I酶切位点。

上游引物：5’-GGTACC GGA AAC GGT GGG GGT TTC GGG AAG-3’(引入Kpn I切点)

下游引物：5’-CCATGG TTC GAA TGA ATT AAG AAT TGC GGA-3’(引入Nco I切点)

按常规方法提取大豆基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备GmSecA基因启动子片段。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

94℃5分钟；

94℃30秒，60℃1分30秒，30个循环；

72℃10分钟；

4℃保温。

(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定

①目的片段的回收

通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，回收方法采用大连宝生物(TaKaRa)公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤见商品说明书。

②连接

加入下列反应体系的试剂，16℃反应过夜，实现目的片段与pGEM-T-Easy(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)载体的连接。

③转化和阳性克隆的鉴定

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备肠杆菌DH5α感受态细胞，用10μL连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp、X-gal和IPTG的平板上，37℃倒置培养12-14小时。挑选转化平板上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用BglII和EcoR I双酶切，产生3kb的pGEM-T-Easy载体片段和包含GmSecA启动子的1500bp片段。按前面所述的PCR引物和扩增条件，以质粒提取物为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生1500bp的GmSecA启动子片段，即为含有GmSecA启动子的阳性克隆。

④测序验证

经过鉴定的阳性克隆，送交菌穿刺培养物到Sangon(上海生工生物技术有限公司)进行DNA测序，其核酸序列如序列表1所示。

实施例3：利用pCAMBIA 1301载体(含有GUS报告基因)构建“GmSecA启动子-GUS”融合基因

(1)从大肠杆菌中提取载体质粒pCAMBIA 1301(该菌株可从生物公司或CAMBIA购买)，用Kpn I/Nco I双酶切后回收大的载体片段(其中包含有GUS报告基因序列)。

(2)从实施例2所制备的TA克隆中提取质粒，用Kpn I/Nco I双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收(同实施例2)GmSecA启动子片段。

(3)将上述2个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pCAMBIA 1301载体上的“GmSecA启动子-GUS”融合基因构建。

连接体系：

(4)用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同实施例2。

(5)挑选转化平板(Kan抗性)上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用Kpn I和BstE II双酶切质粒DNA产生两个片段，一个是8991bp的pCAMBIA 1301载体片段，另一个是3558bp的“GmSecA启动子-GUS”融合基因。

(6)以质粒为模板进行PCR反应，鉴定质粒中的“GmSecA启动子-GUS”融合基因，扩增片段的大小是1782bp。所用引物如下：

上游引物：5’-GGA AAC GGT GGG GGT TTC GGG AAG-3’

下游引物：5’-TCG CGA TCC AGA CTG AAT GCC-3’

(7)经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序。

(8)从阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌LBA4404，获得工程化农杆菌，用于植物转化。

实施例4：转基因拟南芥的制备

(1)用“GmSecA启动子-GUS”融合基因转化拟南芥，具体转化方法采用农杆菌介导的Floralinfiltration(Tague，2001)方法，获得的种子经过50mg/L潮霉素抗性筛选，生长正常的植株转土培养。

(2)转化植株的PCR检测：分别剪取转基因植株和非转基因植株的一个叶片，参考《分子克隆实验指南(第三版)》(黄培堂等，2002)方法提取叶片基因组DNA，用如下引物进行PCR反应：

上游引物：5’-AAT TGT CAT ATT TGA ATG ACC-3’

下游引物：5’-TCG CGA TCC AGA CTG AAT GCC-3

然后进行琼脂糖凝胶电泳，转基因植株出现635bp的“启动子-GUS”融合基因条带，非转基因植株未出现融合基因条带，证明目的片段已整合到植物基因组中(见图2)。

(3)转基因拟南芥叶片特异表达GUS报告基因的检测

利用组织化学染色(Blume和Grierson，1997)的方法，检测在转基因植物中GmSecA启动子驱动下GUS表达的器官特异性和发育特异性。在转基因植物各个器官、组织或细胞中的蓝色为报告基因GUS组织化学染色，代表着GmSecA启动子在这些部位的表达活性。染色时间为5小时左右，将材料的染色结果扫描成图片后保存。

染色结果如图3：光周期16h光/8h暗条件下，在GmSecA启动子-GUS转基因拟南芥的莲座叶以及茎生叶等绿色组织中都有很强的GUS活性，而在根、花瓣和种荚等非绿色组织中没有GUS 活性(图3)。结果证明：GmSecA启动子可以驱动GUS报告基因，在转基因拟南芥的叶片中特异表达；说明该启动子在转基因植物中具有很好的叶片特异性，可以驱动目的基因在转基因植物的叶片中进行特异表达。

【参考文献】：

黄培堂，等译.《分子克隆实验指南》(第三版)，北京：科学出版社，2002

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序列表SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>一种植物叶片特异性启动子及其应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1500

<212>DNA

<213>Lycopersicon esculentum

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(30)

<223>ggtaccggaa acggtggggg tttcgggaag

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(30)

<223>tccgcaattc ttaattcatt cgaaccatgg

<400>1

ggtaccggaa acggtggggg tttcgggaag tgttgtcatt gtttagggag agtgagcggt     60

tggagatagc atatatagct ggggaggaga actttgcaga gggagtgagt gagtggtgaa    120

attgtcgtta ttcggttctt cttttctctt tctttaatct tgtttttgac tagtaggatt    180

gtgttccgct ttttatatag ttcttgagaa gaaaaacaga cgacgccgtt cgtgctttgg    240

tcttctctgt cttcggctgc tggatcgtgg atgggcctca cccgggaggt ttcggtatag    300

tccagcaagg gggacttctt tttcacaatc cttttttgtt ctttacacca cctttcattg    360

tttattgatt ttgtataagt atttacataa aatgtcttat tgtattttca ccctcataag    420

attattcttt tataggttca tcatcattat ttttatgaag tttaaattct tctcttcaat    480

cattcatttt acacattttc acttatacaa atacatttaa aaaatttaat tatataataa    540

catatgaaaa tactaacaag tcattggttc gagtgatact aagttagata tccttaaaca    600

atatcttgag tttgagtctt atagataaaa aaaatataat ttgaatgaga gattccacta    660

aagataagtc agacgaattc tccgacgaag attaatcatt aaaaaagtta gttgacgctt    720

tgtatccatt tcaagtagtg tagatgataa aaaaaccata agtagattag gagggaggcc    780

ctactaaata gtcaattagg ttttcttcca ttgatcatca ttagcaaaac tcttgaaaaa     840

taatatatat atccaaccca taaatgacat cttgtctaat aaaattagga atgccttctt     900

atttttctat aatttttaaa tcaaaagtat ctttaataaa tatgttaaaa atgttaatta     960

ctactattaa acatgctcca actcatagta caactctcct aaaaaaacta aagtcaacta    1020

gtgaactaaa aacaaatcac acttaaaata aaataaaaaa agaagacatt ttcaatgtgt    1080

ttacaattta cgactatttt ttttgttgaa gtatacaact aattaaattt agaaaataac    1140

aattttattt taaaattgtc atatttgaat gaccttttta atggaatata tatattaaca    1200

aaagtttatt taaaagcgtc agattctgtg gagactgtgc tactacttct acgccccagt    1260

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tttcatttca tttccctatt tcagacacag aaagaaactg gtgtctccgt ttgcagcgtc    1380

actacttgct acaacacgag ccatgaaacc caccttccca atccactcca attcaaattt    1440

ctcactataa accacttctt caaacttccc tccgcaattc ttaattcatt cgaaccatgg    1500

Claims (5)

1.一种植物叶片特异性的启动子，其核酸序列如序列表1所示。

2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所设计的大豆叶片特异性表达基因GmSecA的启动子的PCR扩增引物如下，其中上游引物中引入KpnI酶切位点，下游引物中引入Nco I酶切位点：

上游引物：5’-GGTACCGGAAACGGTGGGGGTTTCGGGAAG-3’

下游引物：5’-CCATGGTTCGAATGAATTAAGAATTGCGGA-3’。

3.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，从大豆基因组DNA中克隆获得叶片特异性表达基因GmSecA的启动子，具体操作步骤如下：

(1)以大豆基因组DNA为模板，用PCR方法扩增GmSecA基因的启动子；

(2)采用大连宝生物(TaKaRa)公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收PCR扩增产物；

(3)将回收的上述扩增产物和pGEM-T-Easy载体，购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合，在连接酶催化下进行连接反应；

(4)将连接产物，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

(5)通过抗性筛选，获得该启动子的阳性克隆。

4.一种权利要求1所述的植物叶片特异性启动子的应用，其特征在于，利用该启动子构建获得“启动子-任意目的基因”融合基因，转化任何植物而获得叶片特异性过表达该目的基因的转基因植物。

5.根据权利要求4所述植物叶片特异性启动子的应用，其特征在于，该启动子在大豆中驱动GmSecA基因在叶片中特异表达；利用该启动子构建获得“GmSecA启动子-GUS”融合基因，在转基因拟南芥中，该启动子能够驱动GUS报告基因在叶片中特异表达。

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