CN114213551A - 一种高表达重组生物蛋白api及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高表达重组生物蛋白API及其制备方法和应用，涉及毕赤酵母基因工程表达技术领域。本发明将溶菌酶‑抗菌肽融合表达基因进行优化，优化后API融合基因如SEQ ID NO.1所示，制备的融合蛋白对宿主菌株无毒害，更容易表达，实现了中试生产水平高表达，表达量最高达到10g/L，发酵液无需特殊处理，通过简单载体(脱脂米糠或活性炭)吸附，干燥后就可直接添加到动物饲料中，在每吨动物饲料中添加0.2～1.0L(按发酵液算)就可以起到替抗促生长作用，生产成本不高，具有实际的商业应用价值。

Description

一种高表达重组生物蛋白API及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及毕赤酵母基因工程表达技术领域，具体涉及一种高表达重组生物蛋白API及其制备方法和应用。
背景技术
为了发展畜牧业，我国从20世纪80年代开始在养殖业中广泛使用抗生素，但长期使用抗生素严重影响动物、人类、生态的健康发展。在畜牧业中使用抗生素可增加肠道病原菌的耐药性，导致肠道微生物紊乱。畜禽饲喂抗生素后，可导致畜产品中抗生素超标，导致人们食用后使人体产生耐药菌株、过敏致癌和致突变等作用。此外，抗生素还可打破环境中的微生物平衡，加速超级细菌产生的速度。因此，针对在畜牧业中使用抗生素产生的严重危害，2020年农业农村部第194公告中发布开始全面禁止使用除中草药外的促生长药物饲料添加剂，即抗生素禁止在饲料中添加。
自抗生素禁止在饲料中添加以来，从生态环境可持续性发展出发，开发绿色无公害、无毒副作用、无药物残留且能促进动物生长的饲料添加剂成为畜牧业研究目标。目前在畜禽养殖生产中推广较多的抗生素替代品主要有抗菌肽、酸化剂、微生物制剂、中草药和中药提取物等。
其中，抗菌肽是由基因编码并在核糖体上合成的一类蛋白质，是动物体内的天然防御系统组成部分，是一种天然的抗菌药物，其具有抗菌活性广谱、高效且无毒副作用的特点，是符合第194公告的饲料添加剂。鲢鱼抗菌肽(PI)作为抗菌肽的一种，也引起了众多研究者的重视，它是从受伤鲶鱼上皮粘液层细胞分泌的粘液中提取的一种广谱抗菌肽，包含19个氨基酸，分子量为2kDa。研究表明，PI具有强力广谱抗菌(对G-、G+、真菌均有抑制作用)且无溶血活性；其最小抑菌浓度可达1μg/mL，与BuforinⅠ(最小抑菌浓度为4～8μg/mL)、Magainin 2(最小抑菌浓度为12～100μg/mL)等相比具有更强的杀菌效果；PI(200μg/mL)对人红细胞溶血为0.2％，而同浓度的蜂毒抗菌肽Melittin为99.2％。到目前为止，关于PI及同系物的结构、生物学功能、作用机制等方面取得了一定的研究进展。
目前抗菌肽的获得主要有3种方式，即天然资源提取、人工固相合成和基因工程表达。天然PI需要经表皮受伤诱导才能在体内产生，直接分离纯化产量有限；人工合成时存在成本高和结构变异等问题，影响抗菌活性的发挥。基因工程表达是未来PI开发应用最有可能采用的方式，但在实际应用中仍然存在以下技术难题：抗菌肽通常只有几十个氨基酸，分子量小，产物分离鉴定困难。
为解决基因工程表达中所遇的上述难题，根据欧阳萍等(2010)对人溶菌酶和抗菌肽tachyplesins进行的原核融合表达以及Xue mei Lu等(2010)对人溶菌酶和抗菌肽cecropin进行原核融合表达，我们也尝试利用溶菌酶与PI串联起来进行融合表达，进而提高产物分子量，从而克服因为分子量小导致的产物分离鉴定困难的技术问题。在公开号为CN104630259A的专利申请《利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法》中，我们就公开了溶菌酶-抗菌肽PI融合蛋白表达的处理方式，该申请中，我们公开了所使用的人溶酶菌氨基酸序列，设计出hLY-PI融合基因，顺利获得了hLY-PI融合蛋白，该融合蛋白经肠激酶酶切后具有较强的抑菌活性，一定程度上提高了PI的表达量，使得该技术具有大规模发酵的潜力。
虽然该技术在一定程度提高了表达量，但由于基因诱导发酵，存在一定的随机性，目前发酵液中只能达到50～100mg/L的产物表达量。一般而言，抗菌肽(蛋白)类产品，每克蛋白生产成本在70元以内，才具备在动物饲料中应用的可能，而50～100mg/L的产物表达量很难将每克蛋白生产成本控制在70元以内。而抗菌肽在畜牧生产中应用，通常添加量需要达到克级以上/吨配合饲料，才有可能发挥替抗促生长的作用，虽然上述技术使得大规模发酵成为可能，但要付出较为昂贵的成本，昂贵的产品要应用于动物饲料中还是不太现实。因此，进一步提高融合蛋白的产量，将每克蛋白生产成本控制在70元以内，才能实现抗菌肽融合蛋白在饲料中的商业应用。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提供一种高表达重组生物蛋白API及其制备方法和应用，在现有溶菌酶-抗菌肽PI融合蛋白表达的基础上，通过优化蛋白及基因序列，从而解决现有技术无法实现抗菌肽融合蛋白在饲料中的商业应用技术问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种高表达重组生物蛋白API，该生物蛋白API的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：HHHHH HKVYD RCEFA RILKK SGMDG YRGVS LANWV CLAKW ESNFNTKATNYNPGS QSTDY GIFQI NSRYW CNDGK TPKAV NACHI SCKVL LDDDL SQDIECAKRV VRDPQGIKAW VAWKA HCQNK DVSQY IRGCK LDDDD KKGRG KQGGKVRAKA KTRSS。
一种高表达重组生物蛋白API的制备方法，包括如下步骤：
(1)将溶菌酶-抗菌肽融合表达基因进行优化，优化后的基因为API融合基因，所述API融合基因如SEQ ID NO.2所示，并在API融合基因后面通过XbaI限制性内切酶位点加入了一段增强子序列，所述增强子序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)通过XhoI和XbaI限制性内切酶位点将API融合基因与增强子序列的合成片段连接到pPICZαA载体中，然后将构建的API-pPICZαA载体转入毕赤酵母X-33，再进行阳性转化子筛选；
(3)基因诱导表达：对筛选得到的转化子先后采用BMGY和BMMY培养基摇瓶表达方式筛选高表达转化子，再将筛选得到的高表达转化子转入发酵罐无机盐基础培养基BSM中进行增值和发酵诱导表达培养，增值培养过程在BSM中加20g/L甘油，诱导发酵培养过程在BSM中加3.0％甲醇；诱导发酵条件为：DO值控制在30％，pH控制在5.0～6.0，发酵温度控制在29～30℃，诱导试剂为甲醇，诱导72～75h。
SEQ ID NO.2：CATCA TCATC ATCAT CATAA GGTCT ATGAT CGGTG CGAGT TCGCCAGAAT TCTGA AAAAG TCTGG AATGG ACGGC TATAG GGGAG TCAGC CTGGC GAACT GGGTATGTTTGGCCA AGTGG GAAAG TAATT TTAAC ACAAA AGCTA CAAAC TACAA TCCTG GAAGCCAAAGCACTG ATTAT GGAAT ATTTC AAATT AATAG CCGAT ACTGG TGTAA TGACG GCAAG ACACC CAAAGCAGTT AATGC CTGTC ACATA TCCTG CAAAG TTTTG CTGGA CGATG ACCTC AGTCA AGATA TAGAATGTGC AAAGA GGGTT GTCAG AGATC CACAAGGCATT AAAGC ATGGG TGGCA TGGAA AGCTC ATTGTCAGAA CAAAG ATGTC TCGCAGTACA TTCGG GGTTG CAAAC TGGAT GATGA TGATA AAAAA GGAAGAGGAA AACAA GGAGG AAAAG TTAGA GCTAA AGCTA AGACT AGATC ATCAT AA。
SEQ ID NO.3：TCTAG AGTTC TCGAT CTTTA AAATC GTTAG CTCGC CAGTT AGCGAGGTCT GTCCC CACAC GACAG ATAAT CGGGT GCAAC TCCCG CCCCT CTTCC GAGGG TCGTC GGAACCAATA AAATA TATGG AGTTC CGCGT TACAT AACTT ACGGT AAATG GCCCG CCTGGC TGACCGCCCA ACGAC CCCCG CCCAT TGACG TCAAT AATGA CGTAT GTTCC CATAG TAACG CCAAT AGGGACTTTC CATTG ACGTC AATGG GTGGA GTATT TACGG TAAAC TGCCC ACTTG GCAGT ACATC AAGTGTATCA TATGC CAAGT ACGCC CCCTA TTGAC GTCAA TGACG GTAAA TGGCC CGCCT GGCAT TATGCCCAGT ACATG ACCTT ATGGG ACTTT CCTAC TTGGC AGTAC ATCAA CGTAT TAGTC ATCGC TATTACCATG GTGAT GCGGT TTTGG CAGTA CATCA ATGGG CGTGG ATAGC GGTTT GACTC ACGGG GATTTCCAAG TCTCC ACCCC ATTGA CGTCA ATGGG AGTTT GTTTT GGCAC CAAAA TCAAC GGGAC TTTCCAAAAT GTCGT AACAA CTCCG CCCCA TTGAC GCAAA TGGGC GGTAG GTCTA GA。
作为优选地，所述步骤(1)筛选高表达转化子具体操作为：将PCR鉴定后的所有阳性转化子分别接种到10mL YPD培养基中，在30℃、250r/min培养14-16h；取1mL YPD培养菌液接种到100mL BMGY培养基中，在30℃、250r/min培养14-18h，当OD600到达2-6时，停止培养；在4℃、2 500r/min，离心5min收集酵母菌体，用100mL BMMY培养基重悬菌体，在30℃、250r/min振荡培养；每24h添加0.5mL的甲醇，共诱导表达4天；然后取上清进行SDS-PAGE电泳；根据目的蛋白条带强弱筛选高表达转化子。
作为优选地，所述步骤(2)采用的无机盐基础培养基(BSM)各组分为：4g/L(NH4)2SO4、0.3g/L CaSO4、12g/L K2SO4、13g/L MgSO4·7H2O、27.2g/L KH2PO4、4.4ml/L PTM1。
一种高表达重组生物蛋白API在断奶仔猪的饲料或药物上的应用。
综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及益效果：
1.本发明融合蛋白API自身对宿主菌株无毒害，更容易表达，实现了中试生产水平高表达，表达量最高达到10g/L，无需特殊后处理，发酵液通过常用载体(脱脂米糠或活性炭)吸附，在每吨动物饲料中添加克级API蛋白就可以起到替抗促生长作用，生产成本不高，具有实际商业应用价值；
2.本发明在发酵培养上，采用简单的无机盐培养基代替有机培养基，成本更低，表达产物杂蛋白少，目标蛋白占总蛋白＞2/3；
3.本发明在发酵生产中，全程无抗生素添加，不存在抗生素残留。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合各实施例、对照例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本申请优化得到API融合表达基因(如SEQ ID NO.1所示)，并改变了发酵方式，经过多批次发酵，表达量稳定，表达产物API产量>0.87g/L，加了增强子表达基因(如SEQ IDNO.2所示)之后，更是稳定在10g/L左右，具备商业应用价值。
以下结合各实施例和对比例对本发明内容进行说明。
实施例1
本实施例利用API融合基因(如SEQ ID NO.2所示)进行诱导发酵，具体操作如下：
(1)通过XhoI和XbaI限制性内切酶位点将API融合基因连接到pPICZαA载体中，然后将该载体转入毕赤酵母X-33，再进行转化子筛选；在三角瓶中用BMGY和BMMY培养基对转化子进行表达，筛选出高表达转化子。
(2)基因诱导表达：将步骤1筛选到的高表达转化子接种到YPD培养基中，在30℃、250r/min培养至OD600＝10左右时，将其按10％接种量接种至BSM基础培养基中(无机基础发酵培养基的各组分为：4g/L(NH4)2SO4、0.3g/L CaSO4、12g/L K2SO4、13g/L MgSO4·7H2O、27.2g/L KH2PO4、4.4ml/L PTM1)，同时加入20g/L甘油让菌体增值培养，具体条件为：温度29℃，pH 5.5，溶氧20％～30％，转数400-600r/min，使转数与DO关联，菌体持续生长20h左右；菌体饥饿培养半小时后，加甲醇诱导表达，具体诱导表达条件为：温度29℃，pH 5.5，溶氧20％～30％，转数600-800r/min，使转数与DO关联，采用连续补料方式添加诱导剂甲醇，采用联动方式用氨水自动调节pH，诱导72～75h。最终发酵液中，API融合蛋白表达量为0.87g/L。
实施例2
本实施例利用API融合基因(如SEQ ID NO.1所示)与增强子序列(如SEQ ID NO.3所示)合成的合成片段进行诱导发酵，具体操作如下：
(1)通过XhoI和XbaI限制性内切酶位点将API融合基因与增强子序列合成的合成片段连接到pPICZαA载体中，然后将该载体转入毕赤酵母X-33，再进行转化子筛选；在三角瓶中用BMGY和BMMY培养基对转化子进行表达，筛选出高表达转化子。
(2)基因诱导表达：将步骤1筛选到的高表达转化子接种到YPD培养基中，在30℃、250r/min培养至OD600＝10左右时，将其按10％接种量接种至BSM基础培养基中(无机基础发酵培养基的各组分为：4g/L(NH4)2SO4、0.3g/L CaSO4、12g/L K2SO4、13g/L MgSO4·7H2O、27.2g/L KH2PO4、4.4ml/L PTM1)，同时加入20g/L甘油让菌体增值培养，具体条件为：温度29℃，pH 5.5，溶氧20％～30％，转数400-600r/min，使转数与DO关联，菌体持续生长20h左右；菌体饥饿培养半小时后，加甲醇诱导表达，具体诱导表达条件为：温度29℃，pH 5.5，溶氧20％～30％，转数600-800r/min，使转数与DO关联，采用连续补料方式添加诱导剂甲醇，采用联动方式用氨水自动调节pH，诱导72～75h。最终发酵液中，API融合蛋白表达量为9.8g/L。
对比例1
本对比例采用公开号为CN104630259A的专利申请《利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法》所述hLY-PI基因进行诱导发酵，具体操作如下：
(1)通过XhoI和XbaI限制性内切酶位点将hLY-PI基因连接到pPICZαA载体中，然后将该载体转入毕赤酵母X-33，再进行转化子筛选；在三角瓶中用BMGY和BMMY培养基对转化子进行表达，筛选出高表达转化子。
(2)基因诱导表达：将步骤1筛选到的高表达转化子接种到YPD培养基中，在30℃、250r/min培养至OD600＝10左右时，将其按10％接种量接种至BSM基础培养基中(无机基础发酵培养基的各组分为：4g/L(NH4)2SO4、0.3g/L CaSO4、12g/L K2SO4、13g/L MgSO4·7H2O、27.2g/L KH2PO4、4.4ml/L PTM1)，同时加入20g/L甘油让菌体增值培养，具体条件为：温度29℃，pH 5.5，溶氧20％～30％，转数400-600r/min，使转数与DO关联，菌体持续生长20h左右；菌体饥饿培养半小时后，加甲醇诱导表达，具体诱导表达条件为：温度29℃，pH 5.5，溶氧20％～30％，转数600-800r/min，使转数与DO关联，采用连续补料方式添加诱导剂甲醇，采用联动方式用氨水自动调节pH，诱导72～75h。最终发酵液中，hLY-PI融合蛋白表达量为0.04g/L。
对比例2
本对比例采用公开号为CN104630259A的专利申请《利用毕赤酵母表达人溶菌酶-抗菌肽Parasin I融合蛋白的方法》所述hLY-PI基因与增强子序列(如SEQ ID NO.3所示)合成的合成片段并进行诱导发酵，具体操作如下：
(1)通过XhoI和XbaI限制性内切酶位点将hLY-PI基因与增强子序列合成的合成片段连接到pPICZαA载体中，然后将该载体转入毕赤酵母X-33，再进行转化子筛选；在三角瓶中用BMGY和BMMY培养基对转化子进行表达，筛选出高表达转化子。
(2)基因诱导表达：将步骤1筛选到的高表达转化子接种到YPD培养基中，在30℃、250r/min培养至OD600＝10左右时，将其按10％接种量接种至BSM基础培养基中(无机基础发酵培养基的各组分为：4g/L(NH4)2SO4、0.3g/L CaSO4、12g/L K2SO4、13g/L MgSO4·7H2O、27.2g/L KH2PO4、4.4ml/L PTM1)，同时加入20g/L甘油让菌体增值培养，具体条件为：温度29℃，pH 5.5，溶氧20％～30％，转数400-600r/min，使转数与DO关联，菌体持续生长20h左右；菌体饥饿培养半小时后，加甲醇诱导表达，具体诱导表达条件为：温度29℃，pH 5.5，溶氧20％～30％，转数600-800r/min，使转数与DO关联，采用连续补料方式添加诱导剂甲醇，采用联动方式用氨水自动调节pH，诱导72～75h。最终发酵液中，hLY-PI融合蛋白表达量为0.18g/L。
生物蛋白API在断奶仔猪应用效果试验
使用实施例1的发酵液在断奶仔猪应用效果试验如下：
1、试验对象以及试验方法设计
选择体重8.49kg左右的DLY(杜×长×大)三元杂交仔猪36头，按照体重一致原则，随机分成2个处理组：空白对照组、API组，每个处理组6个重复，每个重复3头猪，空白对照组(CON)饲喂基础饲粮(BD)、API组在每吨BD饲粮中添加0.5L的发酵液(含API蛋白5g)，试验为期42d。试验基础饲粮(BD)采用试验猪场相应阶段饲粮(试验饲粮配制参照NRC(2012)猪营养需要量标准并结合生产实践按体重阶段进行基础饲粮配制，不含抗生素)其组成及营养水平见表1。
表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)(％)
Figure BDA0003504671100000071
仔猪预混料1为每千克饲粮提供：锌，100mg；锰，4mg；铁，100mg；铜，6mg；碘，0.14mg；硒，0.3mg；氯化胆碱，500mg；VA，16450IU；VD3，4700IU；VE，35.25IU；VK3,4.7mg；VB14.7mg；VB2，11.75mg；VB6，7.05mg；VB12，0.047mg；烟酸，47mg；泛酸，23.5mg；叶酸，2.35mg；生物素，0.19mg。
仔猪预混料2为每千克饲粮提供：锌，80mg；锰，3mg；铁，100mg；铜，5mg；碘，0.14mg；硒，0.25mg；氯化胆碱，400mg；VA，10500IU；VD3，3000IU；VE，22.5IU；VK3，3mg；VB1，3mg；VB2，7.5mg；VB6，4.5mg；VB12，0.03mg；烟酸，30mg；泛酸，15mg；叶酸，1.5mg；生物素，0.12mg。
2、API对断奶仔猪增重的影响
饲粮添加生物蛋白API对断奶仔猪增重的影响见表2，由表可知：在试验各个阶段，添加API对仔猪42d的末重和22-42d以及全期1-42d的日增重均显著优于对照组。
表2 生物蛋白API对断奶仔猪增重的影响
Figure BDA0003504671100000072
Figure BDA0003504671100000081
注：数据为平均数±标准误(n＝6)。
3、API对断奶仔猪采食量、料肉比的影响
饲粮添加生物蛋白API对断奶仔猪采食量、料肉比的影响见表3。由表可知：饲粮中生物蛋白API添加对断奶仔猪不同阶段ADFI均有提高，1-42d ADFI生物蛋白API添加组显著高于对照组。
表3 生物蛋白API和hLY-PI对断奶仔猪采食量、料肉比的影响
Figure BDA0003504671100000082
注：数据为平均数±标准误(n＝6)。
4、API对断奶仔猪腹泻指数的影响
饲粮添加生物蛋白API对断奶仔猪腹泻指数的影响见表4。由表可知：本试验条件下，各个试验组断奶仔猪腹泻发生率均较低，但饲粮中生物蛋白API添加在一定程度上改善了断奶仔猪腹泻。
表4 生物蛋白API对断奶仔猪腹泻指数的影响
Figure BDA0003504671100000083
Figure BDA0003504671100000091
注：数据为平均数±标准误(n＝6)。
5、API对断奶仔猪养分消化率的影响
饲粮添加生物蛋白API对断奶仔猪养分消化率的影响见表5，由表可知：饲粮添加API对断奶仔猪的营养物质表观消化率有明显改善作用，与空白对照组相比，生物蛋白API添加显著提高了断奶仔猪粗蛋白、总能和干物质的消化率。生物蛋白API添加也一定程度提高了断奶仔猪粗脂肪和粗灰分的消化率。
表5 生物蛋白API对断奶仔猪养分消化率的影响
Figure BDA0003504671100000092
注：数据为平均数±标准误(n＝6)。
6、API对断奶仔猪血清抗氧化能力的影响
饲粮添加生物蛋白API对断奶仔猪血清抗氧化能力的影响见表6，由表可知：生物蛋白API添加提高了断奶仔猪机体抗氧化能力。与空白对照组相比，API组显著提高了仔猪血清T-AOC活性(P<0.05)。生物蛋白API添加对仔猪血清MDA、T-SOD、GSH-Px活性影响虽未达到显著水平(P>0.05)，但API组在数值上均优于空白对照组。
表6 生物蛋白API对断奶仔猪血清抗氧化能力的影响
Figure BDA0003504671100000093
注：数据为平均数±标准误(n＝6)。
7、API对断奶仔猪血清免疫功能的影响
饲粮添加生物蛋白API对断奶仔猪血清免疫功能的影响见表7，由表可知：与CON组相比，生物蛋白API添加在一定程度上提高了断奶仔猪血清IGG、IGM浓度(P>0.05)。同时API添加显著提高了仔猪血清TNF-α和IL-6水平(P<0.05)。断奶仔猪处于正常生理条件下，提高血清TNF-α和IL-6水平，预示着增强了仔猪机体免疫能力。
表7 生物蛋白API对断奶仔猪血清免疫功能的影响
Figure BDA0003504671100000101
注：数据为平均数±标准误(n＝6)。
8、API对断奶仔猪粪便中主要菌群门类的影响
饲粮添加生物蛋白API对断奶仔猪粪便中主要菌群门类相对丰度的影响见表8，由表可知，日粮添加API显著增加unidentified_Bacteria(未知菌门)、Cyanobacteria(蓝藻菌门)的相对丰度(P<0.05)，API组仔猪粪便Proteobacteria(变形菌门)的相对丰度较CON组显著下降(P<0.05)。
表8 生物蛋白API对断奶仔猪粪便中主要菌群门类的相对丰度(％)
Figure BDA0003504671100000102
注：数据为平均数±标准误(n＝6)。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Figure IDA0003504671150000011
Figure IDA0003504671150000021

Claims (5)

1.一种高表达重组生物蛋白API，其特征在于，该生物蛋白API的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的高表达重组生物蛋白API的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将溶菌酶-抗菌肽融合表达基因进行优化，优化后的基因为API融合基因，所述API融合基因如SEQ ID NO.2所示，并在API融合基因后面通过XbaI限制性内切酶位点加入了一段增强子序列，所述增强子序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)通过XhoI和XbaI限制性内切酶位点将API融合基因与增强子序列的合成片段连接到pPICZαA载体中，然后将构建的API-pPICZαA载体转入毕赤酵母X-33，再进行阳性转化子筛选；
(3)基因诱导表达：对筛选得到的阳性转化子先后采用BMGY和BMMY培养基摇瓶表达方式筛选高表达转化子，再将筛选得到的高表达转化子转入发酵罐无机盐基础培养基BSM中进行增值和发酵诱导表达培养，增值培养过程在BSM中加20g/L甘油，诱导发酵培养过程在BSM中加3.0％甲醇；诱导发酵条件为：DO值控制在30％，pH控制在5.0～6.0，发酵温度控制在29～30℃，诱导试剂为甲醇，诱导72～75h。
3.如权利要求2所述的高表达重组生物蛋白API的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)筛选高表达转化子具体操作为：将PCR鉴定后的所有阳性转化子分别接种到10mL YPD培养基中，在30℃、250r/min培养14-16h；取1mL YPD培养菌液接种到100mL BMGY培养基中，在30℃、250r/min培养14-18h，当OD600到达2-6时，停止培养；在4℃、2 500r/min，离心5min收集酵母菌体，用100mL BMMY培养基重悬菌体，在30℃、250r/min振荡培养；每24h添加0.5mL的甲醇，共诱导表达4天；然后取上清进行SDS-PAGE电泳；根据目的蛋白条带强弱筛选高表达转化子。
4.如权利要求2所述的高表达重组生物蛋白API的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)采用的无机盐基础培养基(BSM)各组分为：4g/L(NH4)2SO4、0.3g/L CaSO4、12g/L K2SO4、13g/L MgSO4·7H2O、27.2g/L KH2PO4、4.4ml/L PTM1。
5.一种如权利要求1所述的高表达重组生物蛋白API在断奶仔猪的饲料或药物上的应用。
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