CN103114094A - 一种文昌鱼细胞核内蛋白及其表达基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种文昌鱼细胞核内蛋白及其表达基因与应用，文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；该文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述的表达基因有助于从理论上提高对免疫系统构成和免疫应答机制的认识，为在基因水平生产开发新的海水养殖抗寄生虫疫苗奠定基础。

Description

一种文昌鱼细胞核内蛋白及其表达基因与应用

技术领域

本发明涉及一种文昌鱼细胞核内蛋白及其表达基因与应用，特别是一种海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白Akirin及其表达基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

NF-κB是一个重要的转录因子，其在免疫调控、炎症反应、应激反应及细胞凋亡中起着重要作用，因此一直是研究的热点（Brian et al.,2009）。作为转录因子，NF-κB如何在庞大的kB结合位点中特异的识别结合所需的靶基因，仍然是NF-κB信号通路研究的热点和难点。入核后的NF-κB需要多个辅助因子包括Akirin,Nurr1,SIRT6等共激活因子，协助NF-κB共同调节靶基因的表达(Wang et al.,2010)。所以了解这些辅助转录因子的调节机制可以帮助我们更好的认识NF-κB信号通路。

Akirin是2008年发现的一个在昆虫和脊椎动物都高度保守的核内蛋白。最早在果蝇的Imd信号通路中发现，可以协助NF-κB调节靶基因表达。果蝇中的Akirin可以参与应答革兰氏阴性菌的Imd信号通路，也同时可以参与肌肉发生，而小鼠中具有Akirin的两个同源基因（Akirin1/2），Akirin1被证明与肌肉的发生有关，而Akirin2则和果蝇中的Akirin一样，参与NF-κB的信号通路。目前关于Akirin的各项功能机制都研究甚少。

以上研究都暗示了Akirin在功能上的保守性。正因为此保守性，Akirin目前正被很多研究学者研究开发成一种广谱性的疫苗去抗寄生虫的感染，尤其是针对蜱虫等对人畜、养殖产业伤害较大的寄生虫感染。我国拥有漫长的海岸线，海水养殖业的发展对于国民经济的可持续发展具有重要意义。然而，多年来病害严重地妨碍着海水养殖业的迅速发展。由于文昌鱼既具有脊椎动物的基本特征，又具有许多无脊椎动物的特征。研究文昌鱼的免疫防御机制和对病原感染应答的规律，能够为阐明海水养殖动物免疫防御机制提供资料，为开发海水养殖的病害控制新方法提供思路，为养殖水产动物病害的免疫防治技术提供理论依据。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种文昌鱼细胞核内蛋白及其表达基因与应用。

术语说明

1.PCR技术：链式聚合酶反应，利用DNA聚合酶，模板，引物以及dNTP进行体外扩增特定DNA片段的技术。

2.CDD分析软件：NCBI网站上提供的一种用来推测和分析特定氨基酸序列形成的结构域信息的软件。

3.原位杂交：运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。

4.实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。

本发明技术方案如下：

一种海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

一种海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，插入了SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。该重组载体由质粒pcDNA3.1载体插入SEQ ID NO.1所示核苷酸序列获得，该表达载体购自美国Clontech公司。

一种重组细胞，转入了上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列或上述重组载体。该重组细胞由人胚肾细胞系HEK293T转入了上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列或上述重组载体获得。

上述在文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因在生产开发新的海水养殖抗寄生虫疫苗中的应用。

本发明的文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因是从青岛沙子口取材的成年文昌鱼（Branchiostoma belcheri tsingtauense）的总RNA中，用TIANGEN的第一链反转试剂盒反转出第一链cDNA当做模板，用佛罗里达文昌鱼同源序列设计引物，利用PCR技术从青岛文昌鱼转录组中克隆获得的。经对该基因的核苷酸序列进行测定，测序结果表明所获DNA片段含有801个核苷酸，开放阅读框架为660个核苷酸，该开放阅读框架即是编码细胞核内蛋白Akirin基因Akirin，共编码219个氨基酸，命名为AmphiAkirin。该细胞核内蛋白AmphiAkirin不具备已知的功能域，无DNA和RNA结合位点，具有两个入核信号肽，是文昌鱼Akirin基因家族尚未报道的一条基因序列。

有益效果

1、本发明获得的海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因可以表达细胞核内蛋白AmphiAkirin，有助于从理论上提高对免疫系统构成和免疫应答机制的认识，为在基因水平生产开发新的海水养殖抗寄生虫疫苗奠定基础。

2、本发明所述的细胞核内蛋白AmphiAkirin在成体文昌鱼各组织中广泛分布以及在细菌冲击成体文昌鱼后表达出现上调，从而暗示了其在先天免疫中发挥作用的可能。可以为海水养殖的病害控制提供新的方法和思路，尤其是在防治细菌类的浸染方面提供理论依据。

3、本发明所述的细胞核内蛋白AmphiAkirin可以激活NF-κB信号通路，可以为病害的免疫防治技术提供理论依据和基因来源。

附图说明

图1、青岛文昌鱼Branchiostoma belcheri tsingtauense成体总RNA的电泳图；

其中：1、DNA分子量标记(marker)，2、3、4、5青岛文昌鱼成体总RNA

图2、通过PCR扩增克隆的编码细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因片段的电泳图；

其中：1、扩增的DNA片段；2、DNA分子量标记(marker)；

图3、成体原位杂交技术检测AmphiAkirin在各组织中的分布；

A：AmphiAkirin在文昌鱼成体中的分布；B：AmphiAkirin在神经管中的分布；C：AmphiAkirin在鳃、肝盲囊等消化道部位的分布；D：对照。

图4、实时荧光定量PCR技术分析细菌免疫冲击后细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达量的柱状图；

A：大肠杆菌刺激下，AmphiAkirin在表皮中的表达量；B金黄色葡萄球刺激，AmphiAkirin在表皮中的表达量；

图5、双荧光素酶报告基因检测细胞核内蛋白AmphiAkirin激活NF-κB报告基因表达量的柱状图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

青岛文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin编码基因的克隆：

1.1青岛文昌鱼总RNA的提取以及第一链cDNA的合成（提取合成步骤参照Takara和TIANGEN公司的相关试剂盒说明书）。

1）将100mg新鲜组织（文昌鱼成体）剪碎放入预1.5mlep管中。

2）加入1mlTrizol（购自Invitrogen公司）试剂，用研磨杵快速研磨组织至无大的组织块，室温静置5min，使组织充分裂解。此时样品可放入-80℃长期保存。

3)每1mlTrizol试剂加入0.2ml的三氯甲烷（氯仿），加盖封严，剧烈震荡15s，室温静置15分钟。

4）4℃，1000g,离心15min。此时样品分为三层：下层的红色有机相，中间层及上层水相，RNA即留在上层水相中。

5）将上层水相转移如一干净的离心管中。

6）在水相中按0.5ml异丙醇/1mlTrinzol加入异丙醇，混匀，室温放置5min-10min。

7）4℃，12000g,离心10min,弃上清。RNA沉淀在管底呈凝胶状。

8)按1ml75%乙醇（DEPC水配制）/1mlTrizol试剂加入75%乙醇，温和振荡，悬浮沉淀。

9)4℃，8000g，离心5min，弃上清。

10)室温晾干或真空干燥5-10min。

11)用50μlDEPC水货TE缓冲液溶解RNA，进行下一步实验或在-70℃冰箱。

12)得到的成体文昌鱼总RNA经1wt％琼脂糖凝胶电泳检测，没有发生降解，结果如图1所示。

cDNA第一链反转录：

以成体文昌鱼总RNA为模板反转录cDNA第一链，按以下顺序及量加入200μlEP管中：25mM MgCL₂，4μl；10×buffer，2μl；dNTP，2μl；RNase inhibitor，0.5μl；AMV反转录酶0.6μl；OligoT primer，1μl；模板，8μl；ddH₂O 2μl；共20μl，42℃，50分钟。

1.2引物设计与合成

根据数据库中已有的佛罗里达文昌鱼（Branchiostoma floridae）的细胞核内蛋白AmphiAkirin基因序列设计两条特异性引物：

AmphiAkirin-F:5'CAAAATGGCGTGTGCTACTCTG3′和

AmphiAkirin-R:5'CTCTGTTGTTCCCTCTACTGGTG3′；

上述引物由上海博尚生物技术公司合成；

1.3利用PCR进行基因序列扩增

1）以AmphiAkirin-F和AmphiAkirin-R为引物，以第一链cDNA为模板，做PCR扩增。PCR反应条件为：95℃，5分钟；然后95℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟，35个循环后，72℃，延伸10分钟。

2）对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约1400bp的DNA片段。然后用TIANGEN公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。结果如图2所示。

实施例2

基因序列测定

2.1．DNA片段与克隆载体连接

将回收DNA片段连接到Transgene公司的pEASY-T3载体上。

连接反应体系为：连接载体酶混合物1μl,外源DNA片段4μl，手指轻弹离心管，混匀样品，离心2秒钟，把样品集中在管底，37℃连接5分钟。

2.2．按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

2.3．按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组载体pEASY-T3转至大肠杆菌DH5α感受态。

2.4．转化的大肠杆菌DH5α涂于含100μg/L氨苄青霉素的麦康凯琼脂培养基，37℃过夜培养，挑选白色转化子作为模板，用T7和SP6作为引物，通过菌落PCR验证白色转化子中质粒是否含有PCR扩增的DNA片段；T7和SP6的引物序列如下：

T7：TAATACGACTCACTATAGGG

SP6:ATTTAGGTGACACTATAG

2.5.将质粒含有PCR扩增的DNA片段的转化子送上海博尚生物技术公司测序，获得文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的序列1334bp。序列如SEQ ID NO.1所示。通过NCBI网站的blastX软件分析发现其中含有一个1188bp的编码细胞核内蛋白AmphiAkirin的开放阅读框架，共编码396个氨基酸。

实施例3

检测AmphiAkirin在各组织中的分布

1）将文昌鱼成鱼横向切成不大于1cm长度的组织段。

2）立即投入4%多聚甲醛溶液内（PBS新配制），室温下固定3-4h或4℃过夜。

3）用PBS冲洗，经梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片。

4）切成10μm薄片粘附于涂有粘附剂的载玻片上，在40℃恒温箱内过夜干燥切片，用新鲜的二甲苯脱蜡2×10min，梯度酒精复水100％、95％、70％、50％、30％各级酒精1×5min，ddH₂O漂洗2×5min，以封闭内源性生物素。

5）将组织切片在PBS（pH7.4）中培育2×5min。

6）在含0.3%Triton X-100的PBS中培育15min；PBS洗涤2×5min。

7）在5-20μg/ml无RNase的蛋白激酶K的TE溶液中，37℃培育15-30min，以增加切片的通透性。

8）在含100mM甘氨酸的PBS中培育2×5min（通透性处理是原位杂交操作中最关键的步骤之一，除上述方法外，还可用溶解在0.2M HCl中，含量为0.1%的胃蛋白酶（Pepsin）37℃条件下处理20-30min）。

9）PBS清洗2×5min。

10）4%多聚甲醛的PBS溶液于4℃后固定组织片5min。

11）PBS清洗组织片2×5min。

12）将切片置于新配制的含有0.25%(V/V)乙酸酐（Acetic anhydride）的0.1M三乙醇胺（Triethanolamine）缓冲液（pH 8.0）的容器中，震荡培育2×5min，以进行乙酰化。

13）在预杂交液中，37℃培育1-2h.

14）去除预杂交液。

15）沥干后用杂交缓冲液漂洗，并沿组织周边擦干，沿组织周围划圈，防止反应液外溢。每张切片滴加30μL探针杂交液（内含5-10ng非同位素标记cRNA探针）。

16）置42℃湿盒内过夜。

17）弃去杂交液，用4×SSC（20×SSC成分为:NaCl 3M，柠檬酸钠：0.34M）42℃震荡洗涤15-30min。

18）37℃分别用2×SSC，1×SSC震荡清洗组织片3×15min。

19）在含有20μg/ml RNase A的NTE缓冲液中消化清除未结合的探针30min。

20）52℃在含50%甲酰胺的2×SSC液中震荡清洗3×15min。

21）37℃在2×SSC液中震荡清洗15min。

22）37℃在1×SSC液中震荡清洗15min。

23）用大量的0.1×SSC在37℃震荡清洗组织片2×30min。

24）用摇床在缓冲液-1（pH7.5，Tris-HCl 100mM，NaCl 150mM）中清洗组织片2×10min。

25）以封闭液（0.1%Triton X-100，2%正常绵羊血清，缓冲液-1）覆盖组织片30min。

26）弃去封闭液，用抗体液（封闭液，抗地高辛抗体）覆盖经封闭后的组织片2h。

27）在缓冲液-2（pH7.5，Tris-HCl 100mM，NaCl 100mM，MgCl₂50mM）中培育2×10min。

28）在缓冲液-3（pH9.5，Tris-HCl 100mM，NaCl 100mM，MgCl₂50mM）中培育2×10min。

29）沥干后用杂交缓冲液漂洗，并沿切片上的组织周边擦干，用油性笔沿组织周围划圈，防止反应液外溢，每张切片约200μL显色液，在黑暗条件下显色2-24h。

30）当显色到合适程度，用缓冲液-4培育组织片以终止着色反应。

31）短时间浸入蒸馏水中终止反应。

32）用自来水洗2×10min.

33）80％、95％、100％各级酒精1×10min，二甲苯2×10min，中性光学树胶封片。

34）光镜观察并照相。

实施例4

实时荧光定量PCR技术分析细菌免疫冲击后细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达量

4.1免疫冲击

将成体文昌鱼（Branchiostoma belcheri tsingtauense）培养在10⁷大肠杆菌（E.coli）或金黄色葡萄球菌（S.aureus）中。等量PBS作为对照。第0、2、4、8、12、24小时取适量文昌鱼进行组织分离。

4.2组织进行RNA提取和cDNA第一链反转。具体步骤同1.1。

4.3实时荧光定量PCR分析

将10μl SYBR Premix Ex Taq（2×），0.4ul PCR Forward Primer(10μM；AmphiAkiri-qPCR-F：5'ACTTTCGCCGACCCACG 3')，0.4ul PCR Reverse Primer(10M；AmphiAkirin-qPCR-R：5'GTCTCGCCAAATCGCCTCT 3')，2μl DNA template（成体文昌鱼免疫冲击前后各组织cDNA）和6.8μl Sterilized ddH2O混匀。微离心。按照如下程序运行real-time PCR：95°C 30s，1个循环→95°C 5s，60°C 30s，40个循环→95°C 15s，60°C 1min，95°C 15s，1个循环。用匹配的荧光定量PCR仪的仪器进行分析。

实施例5

双荧光素酶报告基因检测细胞核内蛋白AmphiAkirin激活NF-κB报告基因

5.1重组真核细胞表达载体（pcDNA3.1-AmphiAkirin）构建

1)利用小剂量质粒提取试剂盒，按照说明书的步骤，从含有重组质粒pEASY-T3的转化子中提取重组质粒pEASY-T3-AmphiAkirin.

2)根据测序结果设计两条特异性引物：

pcDNA3.1-AmphiAkirin-F：5'CGGAATTCATGGCGTGTGCTACT 3'，和

pcDNA3.1-AmphiAkirin-R：5’CGGGATCCTTATGATACATAGCTGGC3’，

上述引物由上海博尚生物技术公司合成。

3)利用PCR进行基因序列扩增，以pcDNA3.1-AmphiAkirin-F和pcDNA3.1-AmphiAkirin-R为引物，以重组质粒pEASY-T3-AmphiAkirin为模板，做PCR扩增。PCR反应条件为：95℃，5分钟；95℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟，35个循环后，72℃，延伸10分钟。

4)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约700bp的DNA片段。

5)用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ对回收片段和质粒pcDNA3.1进行双酶切。酶切反应体系如下：酶切缓冲液2μl；内切酶BamHI1μl；内切酶EcoRⅠ1μl；回收DNA片段10μl；补加ddH2O至20μl。酶切缓冲液2μl内切酶BamHI1μl内切酶XhoI1μl；pcDNA3.16μl；补加ddH2O至20μl。放在37℃水浴中反应2个小时。对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用TIANGEN公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

6)将经过双酶切的细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因连接到pcDNA3.1载体上。

连接反应体系：连接酶Buffer 4μ；载体pcDNA3.15μl；AmphiAkirin基因片段10μl，T4连接酶1μl，补加ddH2O至20μl。盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上转2秒，把样品集中在管底，16℃摇床中连接过夜。

7)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态；

8)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组载体pcDNA3.1转至大肠杆菌DH5α感受态；

9)将转化后的大肠杆菌DH5α涂于含100μg/mL卡纳青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。

10)在平板上挑取单菌落，接于5mL含100μg/mL卡纳青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；

11)收集3mL菌液，12000g离心2min，得到菌体，用试剂盒提取重组质粒pcDNA3.1-AmphiAkirin。置于-20℃保存。

5.2重组质粒的转染

1)铺板：转染前一天，将消化液和培养液从冰箱中取出，37℃解冻和预热，吸出培养液，缓缓加入约1．5ml的消化液，置于37℃消化2-5min，期间在显微镜下观察，消化至细胞收缩变圆、部分脱落即可加入两吸管消化液终止消化，用吸管轻轻吹洗培养瓶有细胞的一面，以使细胞脱落干净，将细胞悬液转移至10ml离心管内，密封，1000rpm离心3min，上清，加入约2ml培养液，吹打均匀，期间用培养液再清洗一下培养瓶，吸取10μl到细胞计数板上，在显微镜下计数，并且计算细胞的密度，根据实验需要将细胞接种于24、12或6孔板中。

2)转染：铺板过后大约24h，细胞完全贴壁，且密度达到大约70%或80％的时候，即可以进行转染，根据转染所需浓度的不同，在50-100μl稀释液中加入0.8~2μg的质粒，并加入2~6μl的Lipofectamine2000，轻轻地吹打均匀，在室温下放置5min，将质粒稀释液和脂质体稀释液混合，轻柔吹打均匀，室温下放置20min，吸去细胞培养板中每个孔中的细胞培养液，沿孔壁加入0.5ml～2ml的无血清培养液，将混合液加入到每个加了无血清培养液的孔中，轻柔晃动，使之混合，放在37℃的二氧化碳培养箱中培养6~8h后将无血清培养液更换成完全培养液。

5.3双荧光素酶报告基因检测

1)细胞的裂解：48孔板每孔加入50ul 1×Passive Lysis Buffer，室温振荡裂解15min。

2)按试剂盒说明配制Luciferase Assay Reagent II(LAR II)和Stop&Glo Reagent反应液。

3)按仪器操作说明设定检测时的参数。

4)取10μl细胞裂解液加到流式细胞管底部，加入30μl Luciferase Assay Reagent II(LARII)，用移液器吹打均匀后测定RLU-1(relative light unit 1)。

5)再加入30μl Stop&Glo Reagent，用移液器吹打均匀后测定RLU-2(relative light unit 2)。

6)结果处理：RLU-1／RLU-2。

5.结果分析

利用Trizol法提取青岛文昌鱼（Branchiostoma belcheri tsingtauense）成体总RNA提取(图1)。通过PCR扩增克隆的编码的AmphiAkirin基因片段(图2)。经过测序获得编码细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因的核酸序列。细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因全长为801个核苷酸,开放阅读框架为660个核苷酸，该开放阅读框架即是编码细胞核内蛋白Akirin基因Akirin，共编码219个氨基酸信使。利用生物信息学软件分析，不具备已知的功能域，无DNA和RNA结合位点，具有两个入核信号肽，是文昌鱼Akirin基因家族尚未报道的一条基因序列。通过成体原位杂交发现AmphiAkirin主要分布于表皮，神经管以及消化道内（图3）。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌病冲击后，AmphiAkirin的表达量都有显著上调。相比昆虫类Akirin只参与革兰氏阴性菌的刺激，文昌鱼Akirin和脊椎动物的Akirin更类似，且均参与了革兰氏阳性菌和阴性菌的刺激（图4）。细胞核内蛋白AmphiAkirin能显著激活NF-κB报告基因的上调，揭示了细胞核内蛋白AmphiAkirin可以参与NF-κB信号通路（图5）。

Claims (7)

1.一种海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因，核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.一种海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种重组载体，插入了SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，该重组载体由pcDNA3.1载体插入SEQ IDNO.1所示核苷酸序列获得。

5.一种重组细胞，转入了上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列或权利要求3所述的重组载体。

6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，该重组细胞由人胚肾细胞系HEK293T转入了上述SEQ ID No.1所示核苷酸序列或权利要求3所述重组载体获得。

7.权利要求1所述文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad6/7的表达基因、权利要求3所述重组载体或权利要求5所述的重组细胞在生产开发新的海水养殖抗寄生虫疫苗中的应用。

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