CN103333243B - 一种免疫蛋白Akirin2及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新型天然免疫蛋白Akirin2及其基因和应用。所述天然免疫蛋白Akirin2的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本发明的Akirin2参与到机体对外源嗜水气单胞菌、LPS(脂多糖)和poly(I:C)(聚肌苷酸-聚胞苷酸RNA)入侵所引起的免疫调控中。作为一种新型的免疫蛋白制剂,在水产饲料添加剂和渔药等行业都有应用价值。

Description

一种免疫蛋白Akirin2及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种天然免疫蛋白Akirin2及其基因和应用。

背景技术

天然免疫系统存在于所有多细胞动物中，尤其在低等多细胞动物中发挥重要作用（AkiraS,UematsuS,TakeuchiO.PathogenRecognitionandInnateImmunity.Cell.2006124:783-801）。近几年，随着对免疫机制研究的深入，对天然免疫系统的研究越来越受到广泛关注。在2007年Goto等通过对果蝇细胞进行功能性全基因组的RNAi筛选,获得了一种天然免疫蛋白新成员Akirin。Akirin作为一种新型的天然免疫蛋白，在机体的免疫调控中发挥重要作用。

Akirin蛋白家族是一个结构保守、快速进化的蛋白家族，它参与了细胞内蛋白质质量控制，细胞增殖、分化、凋亡，细胞对病毒的防御及机体免疫应答等重要的生命过程。其缺失或突变将导致异常的免疫应答反应，如自身免疫病、恶性肿瘤及炎症反应等。目前，所研究的Akirin蛋白，其N-端和C-端及其保守，中间由一段低保守的序列相连，而且在氨基端存在细胞核定位信号，大多数物种还存在第二个细胞核定位信号，Akirin蛋白主要在细胞核中发挥其作用，结构上的保守预示着Akirin蛋白家族可能以相同的作用机制参与各种生命活动过程。

目前研究发现Akirin蛋白主要参与调节细胞增殖与分化，细胞的减数分裂，胚胎发育，免疫调控等途径相关。而对于Akirin蛋白的研究主要集中于模式生物中，研究发现Akirin基因的缺失将会导致小鼠、果蝇和蜱胚胎的死亡（GotoA,MatsushitaK,etal..NatImmunol.20089:97-104；delaFuenteJ,Maritz-OlivierC,etal.BMCGenomics.20089:372.）。研究发现Akirin也参与到了小鼠和果蝇的TLR、Toll以及Imd免疫通道中，通过中间介质与NF-κB、REL结合调控免疫因子及抗菌肽的表达，最近也发现了Akirin在节肢动物生命活动当中发挥的重要作用，作为其自身保护性蛋白，已被用做抗原来免疫寄主细胞，从而提高寄主的免疫力抵抗节肢动物如蜱、红螨等的寄生，更重要的是Akirin已发展成为了疫苗，可抗多种寄生虫的寄生。同时研究发现，在线虫中发现了在Akirin基因突变的情况下将导致在减数分裂I期的前期同源染色体将无法正常联会。而鱼类Akirin基因的研究起始于2010年一篇有关在大西洋鲑鱼中发现了八种Akirin蛋白，文章揭示了在鲑鱼中Akirin家族在肌发生过程中发挥多样性的功能，而对于Akirin蛋白的免疫功能并无深入研究。近些年来，随着养殖环境的恶化、养殖密度的增大，鱼类病害不断发生，造成了巨大的经济损失，Akirin在水产养殖业上的应用也是后续要解决的问题。泥鳅作为一种鲤形目的淡水鱼是一种新型且具有代表性的研究对象，为开发具有免疫活性的Akirin蛋白制剂且投入于水产饲料、渔药等行业的应用提供了基础。Akirin虽然具有免疫活性，但是其表达量还是较低的，要想得到大范围的应用，通过基因工程的方法得到具有生物学活性的Akirin也是目前需要解决的一大问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫蛋白Akirin2。

本发明的再一目的是提供编码上述Akirin2的基因akirin2。

本发明的再一目的是提供包含上述Akirin2基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述Akirin2基因的重组质粒。

本发明的再一目的是提供一种制备Akirin2的方法。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的新免疫蛋白Akirin2。本发明的发明人从泥鳅（Paramisgurnusdabryanus）中得到一个新的具有参与机体抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌活性的Akirin2。适合于水产饲料、渔药等行业中使用。

从泥鳅中获得了一种免疫蛋白Akirin2，该蛋白含有184个氨基酸和一个终止密码子，前端22-27位点和75-77位点氨基酸残基为细胞核定位信号序列。其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：

1MACGATLKRTMDFDPLM

18NPASPKRRRCAPMSPSSSSS

38SPQKYLRMEPSPFGTVSSVL

58TTEQILSNIKQEYKRMQKRR

78HLESSFQQTDACCPIESQPH

98TSISSTATIAGTSSGSVSPS

118RREQPLFTLKQVGMICERLL

138KEREEKVREEYDEILTTKLA

158EQYDAFVKFTHDQLMRRFGE

178QPASYVS

本发明还提供了编码上述防御素的基因。本发明通过PCR的方法分离克隆了这一Akirin2基因akirin2，全长1475bp，包含552bpCDS序列，全基因序列如SEQIDNO.2所示：

1TGTGACCGAAGAACTTTCCATCAACACTCTCTCTATCTCTATCGTTCTTTCTCTCCCCGG

61GAGAGAAAGAACGATAGAGATAGAGAGAGTGTTGATGTAGAGTTTTCAGTCCACAGTCAC

121GCTCATCGCTGTAGTTTAACGTTTATTTTGTCGTAGTAGATGTTTTGGTTGAAGAATCGA

181CCTAAGAATTGAATAAAAACGAAGCGATTGAGTCGAGTTCCCTAGAGATCAGAACAGGAC

241TGTCGCTAGCAGAAGGCTCAAACTGGTTACTTTCGCTTGCTACGTATATTACACACACGC

301TTTAGTTAAAATGGCCTGCGGTGCCACTCTGAAACGGACTATGGATTTTGATCCTTTGAT

361GAATCCGGCGTCTCCGAAAAGGAGGAGATGTGCGCCCATGTCCCCGTCCTCCTCCAGTTC

421CTCCCCGCAGAAGTACCTGCGCATGGAGCCGTCGCCCTTCGGCACAGTGTCTTCAGTCCT

481CACCACAGAGCAAATCCTGAGCAACATCAAGCAGGAGTACAAGCGCATGCAGAAGAGAAG

541ACACCTGGAGAGCAGTTTCCAACAGACTGACGCCTGCTGTCCTATTGAATCCCAGCCACA

601CACCTCCATCAGCAGCACAGCCACGATAGCAGGCACCTCCTCTGGATCTGTGTCTCCATC

661CAGACGAGAGCAGCCCTTGTTCACATTGAAACAGGTGGGAATGATCTGTGAACGTCTGCT

721GAAAGAGCGTGAGGAGAAAGTCCGAGAGGAGTACGATGAGATCTTGACCACCAAACTTGC

781AGAACAATATGATGCGTTTGTGAAGTTCACCCATGATCAGTTGATGAGGAGATTCGGGGA

841GCAGCCTGCCAGCTATGTGTCCTGAGTTATCAGATGATGTCAGATCTTCTCTTCTTCTGT

901GAGCTCTTGACACTCAGAATGGGTTCAGCTGGGTTTCCAGTGCTCGGCCTTAGAGTTTGT

961GTGATCAACACTCTCTCTATCTCTATCGTTCTTTCTCTCTCTATTCAGCGGCTCAGTGCT

1021TCCTGCCATCAATGCCCATTAATGGACTTTTGCAAACTATTATTCAAAACTCAGTGGCTC

1081TGTGTTCCTCTTATTGAACCCTGGATATTTATTAGGCTATAACTATGCCTTTTACACAGT

1141TACCTGTCATTTCATTTTACTTTGTTTTTATTTTGTAAAATGACTTTTTGGCAGATGATG

1201TTGATCGTTGGCACATGAGCGTTAAAAGGGTGTTTACTTTGAGACTGATGGTTGTAACTT

1261TGTGTAAATACATCCTGGCATTTAGTTTTCGTGTACAAATCATAGACAGCATTTATTTAG

1321AAGTCTGCTTTCATGGTTTGTATTTATTTTGATTTTATTTTTTTTGTCCTTTTTTTCTCT

1381GCATTATGGTTTTACTGGCTCATATAGTTTAAATGACTTTAATGTTGGGGAAAAATATAC

1441AAATTAAACTGGTTTACATAAAAAAAAAAAAAAAAA

其CDS序列如SEQIDNO.3所示:

1ATGGCCTGCGGTGCCACTCTGAAACGGACTATGGATTTTGATCCTTTGATGAATCCGGCG

61TCTCCGAAAAGGAGGAGATGTGCGCCCATGTCCCCGTCCTCCTCCAGTTCCTCCCCGCAG

121AAGTACCTGCGCATGGAGCCGTCGCCCTTCGGCACAGTGTCTTCAGTCCTCACCACAGAG

181CAAATCCTGAGCAACATCAAGCAGGAGTACAAGCGCATGCAGAAGAGAAGACACCTGGAG

241AGCAGTTTCCAACAGACTGACGCCTGCTGTCCTATTGAATCCCAGCCACACACCTCCATC

301AGCAGCACAGCCACGATAGCAGGCACCTCCTCTGGATCTGTGTCTCCATCCAGACGAGAG

361CAGCCCTTGTTCACATTGAAACAGGTGGGAATGATCTGTGAACGTCTGCTGAAAGAGCGT

421GAGGAGAAAGTCCGAGAGGAGTACGATGAGATCTTGACCACCAAACTTGCAGAACAATAT

481GATGCGTTTGTGAAGTTCACCCATGATCAGTTGATGAGGAGATTCGGGGAGCAGCCTGCC

541AGCTATGTGTCC

将Akirin2基因akirin2的DNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，确定Akirin2是一种新的免疫蛋白，为其编码基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。

本发明还提供了包含上述Akirin2基因akirin2的重组载体，优选为pcDNA3.1(+)-akirin2。将本发明的基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将防御素基因插入到质粒pcDNA3.1(+)上的EcoRI和BamHI限制性酶切位点之间，得到重组真核细胞表达质粒pcDNA3.1(+)-akirin2。

本发明还提供了包含上述Akirin2基因akirin2的表达细胞系，优选为ZF4斑马鱼胚胎细胞系。

本发明还提供了上述Akirin2用于制备蛋白制剂的应用。

本发明还提供了一种制备上述Akirin2的方法，包括以下步骤：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组质粒；

2）转染质粒，通过ZF4斑马鱼胚胎细胞系得到Akirin2。

根据本发明的具体实施方式，实验检测了Akirin2的多种生物学活性，通过QRT-PCR检测了嗜水气单胞菌攻毒活体细胞和脾脏原代细胞后Akirin2的表达情况，以及检测了在Akirin2基因akirin2过表达的情况下免疫因子NF-κB、TNF和干扰素等的表达情况，所以理论上来讲，Akirin2作为一种天然免疫蛋白参与到机体抗外源病原菌的入侵的免疫调控中。

本发明的免疫蛋白Akirin2可以提高机体免疫因子如NF-κB、TNF和干扰素等的表达，参与到机体抗革兰氏阴性菌和抗革兰氏阳性菌的免疫调控当中。作为一种新型的免疫蛋白，在水产饲料添加剂和渔药等行业都有应用价值。

附图说明

图1免疫蛋白Akirin2及其akirin2基因结构图。

图2Akirin2基因akirin2在ZF4斑马鱼胚胎细胞系中表达的RT-PCR分析。

图3Akirin2的亚细胞定位分析

图4本发明通过QRT-PCR检测了akirin2过表达的情况下免疫因子NF-κB、TNF和干扰素等的表达情况。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、鱼、载体及细胞：泥鳅购自于北京水产市场，载体pcDNA3.1(+)和pDsRed2-c1购自于Invitrogen公司，ZF4斑马鱼胚胎细胞系购自于Americantypeculturecollection（ATCC）。

2、酶类及其它生化试剂：DNA限制性内切酶、连接酶购自TakaRa公司，反转录试剂盒及SYBRmix购自TOYOBO公司，大提质粒试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，脂质体Lipofetmiane²⁰⁰⁰购自Invitrogen公司，细胞培养相关试剂购自Invitrogen和Nuck公司。其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1泥鳅Akirin2编码基因akirin2的克隆

利用TRIZON法提取泥鳅鳃部组织RNA并反转为第一链cDNA。根据发表的鱼类Akirin2的序列比对结果找到两个保守氨基酸序列CG/AATLKR和FVKFTH/QDQ，并设计合成了简并引物AK-F和AK-R（引物序列见表1），以泥鳅的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec，55-50℃30sec(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，72℃30s，10个循环，然后进入第二个循环程序：94℃30sec，50℃30sec，72℃30s，28个循环后；72℃10min，琼脂糖电泳检测，得到约480bp的片段，回收后pGEM-TEasy载体相连并转化大肠杆菌JM109，经检测为阳性后送测序。

根据测定序列结果，在NCBI的GenBank中利用BLASTX（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）进行序列比对，初步判断该基因片段是防御素片段，并进行该片段的相似性研究。根据测序得到的核甘酸序列，上游和下游分别设计三条TAIL-PCR特异性引物和两条RACE-PCR特异性引物并将它们分别命名为5’Tail-AK1,5’Tail-AK2,5’Tail-AK3(上游特异性引物)和3’RACE-GSP1,3’RACE-GSP2(下游特异性引物)见表1。通过TAIL-PCR和RACE-PCR分别得到已知基因片段序列的5’端侧翼序列和3’端UTR序列，扩增得到产物回收后测序。

将简并引物得到的核心片段与经TAIL-PCR得到的侧翼序列和经RACE-PCR得到的3’端UTR序列进行拼接得到akirin2全长基因。结果表明，该基因编码区全长552bp（SEQIDNO.1），编码184个氨基酸（SEQIDNO.2）和一个终止密码子。预测的前端22-27位点和75-77位点氨基酸残基序列为细胞核定位信号序列。该编码基因为一个新基因。

表1.Akirin2基因akirin2克隆引物

T/G,R=A/G,N=A/T/G/C;划线部分为酶切位点。

实施例2泥鳅Akirin2的组织分布及攻毒后的表达量差异分析

提取健康泥鳅各组织RNA，包括眼、鳃、肝脏、脾脏、脑、精巢、卵巢、肌肉、肠、皮肤、头肾、心脏，反转为第一链cDNA，通过QRT-PCR分析Akirin2在肾脏中表达量最高，在鳃、脾脏表达量最低。

用嗜水气单胞菌攻毒泥鳅后，分别在6、12、24小时提取鳃、肝脏及脾脏的RNA，通过Q-PCR分析攻毒后Akirin2与健康泥鳅Akirin2的表达量变化及随时间的变化趋势，结果，用嗜水气单胞菌攻毒泥鳅后，鳃、肝脏及脾脏防御素均呈上调表达趋势，鳃随时间逐渐上调表达，肝脏及肾脏在12小时表达量最高随后下降，而在免疫器官鳃中一直持续较高的表达水平。说明泥鳅Akirin2参与到了机体对抗嗜水气单胞菌侵染的过程中，可能与免疫调控密切相关。

实施例3泥鳅Akirin2基因akirin2的亚细胞定位

Akirin2基因akirin2与红色荧光蛋白载体pDsRed2-c1连接在ZF4细胞系中表达。

根据测序及序列分析的结果设计引物Akirin2-F和Akirin1-R（引物序列见表1），以cDNA为模板进行PCR扩增。质粒pDsRed2-c1和基因片断进行双酶切（EcoRI和BamHI）后连接形成载体pDsRed2-c1-akirin2，制备TransI感受态细胞，将重组载体pDsRed2-c1-akirin2热击转化宿主菌。鉴定阳性重组子，提取重组质粒并转染细胞。将重组质粒与空载体pDsRed2-c1同时转染ZF4细胞，采用Lipofetmiane²⁰⁰⁰脂质体转染法，待细胞长到铺板率约90%时，按照质量体积比为1比2的比例转染质粒和脂质体，转染6小时后，吸去脂质体和质粒，加入培养液再培养72小时。瞬时转染72小时后，收集细胞，用于做RT-PCR检测其表达情况。提取细胞总RNA，反转为第一链cDNA，以此为模版用特异性引物能扩增出目的条带，而相同条件下对照组pDsRed2-c1空载体不能扩增出相应条带，而两组模版均能扩增出内参β-actin(图2)。

细胞核通过DAPI染色后在紫外光的激发下显蓝色，而转染的细胞表达的的红色荧光蛋白则在绿光激发下显红色，在两种条件下，则可以推断出红色荧光蛋白和Akirin2融合蛋白的亚细胞定位情况（如图3）。

实施例4泥鳅Akirin2的免疫活性检测

Akirin2基因akirin2与pcDNA3.1(+)连接并在ZF4胚胎细胞系中进行了过表达。

具体步骤同上。

Akirin2在ZF4细胞中过表达，通过QRT-PCR检测ZF4细胞中免疫因子的变化情况，已转染的pcDNA3.1(+)空载体为对照，结果显示了，在Akirin2过表达的情况下，会引起机体的相关免疫因子的表达上调如图4。

Claims (10)

1.一种免疫蛋白Akirin2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1。

2.一种免疫蛋白基因akirin2，其特征在于，编码权利要求1所述的免疫蛋白Akirin2。

3.根据权利要求2所述免疫蛋白基因akirin2，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。

4.包含权利要求2或3所述免疫蛋白基因akirin2的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pcDNA3.1(+)-akirin2和pDsRed2-c1-akirin2，其中，将权利要求2所述的免疫蛋白基因akirin2插入到质粒pcDNA3.1(+)上的EcoRI和BamHI限制性酶切位点之间，得到重组真核细胞表达质粒pcDNA3.1(+)-akirin2；将利要求2所述的免疫蛋白基因akirin2插入质粒pDsRed2-c1后连接形成载体pDsRed2-c1-akirin2。

6.包含权利要求2或3所述Akirin2基因akirin2的重组质粒。

7.根据权利要求6所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达宿主为ZF4斑马鱼胚胎细胞系。

8.一种制备免疫蛋白Akirin2的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组质粒；

2)转染质粒，通过ZF4斑马鱼胚胎细胞系得到Akirin2。

9.权利要求1所述免疫蛋白Akirin2用于制备蛋白制剂的应用。

10.权利要求1所述免疫蛋白Akirin2作为饲料添加剂的应用。