CN104387468A - 一种聚乙烯醚醇胺双水相萃取螺旋藻藻蓝蛋白的分离技术 - Google Patents

一种聚乙烯醚醇胺双水相萃取螺旋藻藻蓝蛋白的分离技术 Download PDF

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Abstract

一种聚乙烯醚醇胺双水相萃取螺旋藻藻蓝蛋白的分离技术，属于生化分离工程技术领域。本发明步骤为：聚乙烯醚醇胺的制备；双水相萃取藻蓝蛋白；藻蓝蛋白水溶液经浓缩和冷冻干燥后获得藻蓝蛋白粉；蛋白回收率可达75～87％。该方法简单，对螺旋藻破壁液直接使用聚乙烯醚醇胺进行富集分离，简化了纯化过程的步骤，选择性高，分离得到的藻蓝蛋白的光谱纯度达到A620/A280>2.4。原料可采用螺旋藻鲜藻或干藻粉，从而提供了一种解决螺旋藻资源高值规模化利用的技术方法。

Description

一种聚乙烯醚醇胺双水相萃取螺旋藻藻蓝蛋白的分离技术
技术领域
本发明提供一种聚乙烯醚醇胺的制备方法，用于从螺旋藻破壁液中双水相萃取藻蓝蛋白。属于生化分离工程技术领域。
背景技术
螺旋藻藻蓝蛋白存在于螺旋藻的藻胆体中。藻胆体是红藻和蓝藻所特有的一种超分子捕光色素复合体。藻蓝蛋白色泽呈明亮的蓝色，颜色鲜艳，是食品、高级眼影、唇膏的首选纯天然色素。藻蓝蛋白还可以调节和合成人体代谢所需要的多种重要酶，具有明显的抗氧化、抗炎症作用，调节人体免疫系统，增强免疫系统功能。高纯度的藻蓝蛋白带有很强的荧光，制成的纯天然荧光试剂，用于临床医学诊断，免疫化学及生物医学工程等研究领域。
在我国，每年的螺旋藻全国总产量已达到7000吨。螺旋藻产量的三分之一用于直接出口，其它螺旋藻多以藻粉、微藻藻片和灌注胶囊的形式当作保健品使用。螺旋藻的规模化开发和利用处于初级加工阶段，还没有深加工产品。螺旋藻中藻蓝蛋白的提取还处于实验室研究阶段，没有适合于工业化生产的好的工艺方法。目前，市场上销售的高纯度的藻蓝蛋白商品都是从国外进口，价格昂贵，在应用上受到限制。
因此，开发简便、快速的螺旋藻藻蓝蛋白的提取过程，提高螺旋藻藻蓝蛋白产品纯度是目前螺旋藻藻蓝蛋白的规模化开发利用中亟待解决的关键问题。聚合物双水相分离蛋白质具有生物相容性高，操作条件温和，易于进行连续化操作等优点。已报道的有关制备藻类藻蓝蛋白的双水相萃取分离藻蓝蛋白的专利技术，例如中国专利CN103880950A采用价格昂贵的离子液体组成聚合物-水相，增加生产成本，CN102993297A、CN101891809A等采用市售的PEG组成聚合物-水相，分离藻蓝蛋白的选择性差，需要与盐析等其它提取手段联合使用才能得到高纯度产品，过程繁琐。
本发明提供一种对藻蓝蛋白具有特异性萃取能力的聚乙烯醚醇胺，可通过双水相萃取方式从螺旋藻破壁液中直接分离纯化藻蓝蛋白，无需与盐析等其它提取手段联合使用，就能得到高纯度藻蓝蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚乙烯醚醇胺的制备方法，用于双水相萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白，获得高纯度的藻蓝蛋白，应用于天然色素、保健食品和新药的研究开发。
本发明所要解决的技术问题是提供一种聚乙烯醚醇胺的制备方法，用于从螺旋藻破壁液中萃取分离藻蓝蛋白。其方法简单，快捷，成本低，分离藻蓝蛋白具有较高的纯度，原料既可采用新鲜螺旋藻也可采用螺旋藻干粉，从而提供了一种解决螺旋藻藻蓝蛋白资源规模化利用的方法。
本发明的技术方案：一种聚乙烯醚醇胺双水相萃取螺旋藻藻蓝蛋白的分离技术，步骤为：
(1)聚乙烯醚醇胺的制备；(2)从螺旋藻破壁清液两相萃取藻蓝蛋白；(3)藻蓝蛋白水溶液经浓缩和冷冻干燥后获得藻蓝蛋白粉。
所述的方案，步骤1中，在圆底烧瓶中放入聚乙二醇，恒压漏斗中装入三溴化磷，三溴化磷与聚乙二醇的重量比为1:2～3，在磁力搅拌下将三溴化磷缓慢滴入圆底烧瓶中，滴加时间为0.5小时，滴加完毕后，升温至60～90℃反应5～8小时，在反应混合物中缓慢滴入去离子水，直至烧瓶中的黄色蒸气消除，然后在反应混合物中加入500～1000ml二氯甲烷，转移至分液漏斗中，用250ml的25％碳酸钠水溶液洗涤三次，收集下层液体，将下层溶液蒸馏去除二氯甲烷后得到溴代聚乙烯醚。在溴代聚乙烯醚中，加入醇胺，醇胺与溴代聚乙烯醚之间重量比为1:2～5，在70～90℃下反应4～6小时，然后升温至120～140℃反应12～16小时，将反应物中在80～100℃下真空蒸馏1小时，加入500～1000ml无水乙醇，过滤获得聚乙烯醚醇胺。
所述的方案，步骤2中，螺旋藻破壁清液的制备：采用水或磷酸缓冲液作提取剂，磷酸缓冲液的浓度为25～100mmol/L，藻粉或鲜藻与提取液的固液比为1:50～1:150，搅拌均匀后，置于-10℃～-20℃下冷冻一定时间后，37℃溶解，如此反复冻融4-6次，融化后离心获得的破壁清液，破壁清液中蛋白质浓度为1.0～5.6mg/ml，藻蓝蛋白纯度为0.5～0.72。
所述的方案，步骤2中，在螺旋藻破壁清液中加入聚乙烯醚醇胺和无机盐，聚乙烯醚醇胺:无机盐:破壁清液的重量比为0.05～0.35:0.25～0.4:1，震荡混合2分钟，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相；将含藻蓝蛋白的上相经截留分子量为30000道尔顿的超滤膜过滤，去除聚乙烯醚醇胺和无机盐，获得藻蓝蛋白水溶液，纯度为2.4～4.2，蛋白浓度为4.15～6.6mg/ml。
所述的方案，步骤3中，将藻蓝蛋白水溶液在60℃下真空浓缩至原体积三分之一，冷冻干燥后得到藻蓝蛋白粉末。
本发明的有益效果：本发明与现有技术相比，主要具有以下优点：1.聚乙烯醚醇胺对藻蓝蛋白的选择性高，适合不同规模和场地的工业化生产要求；2.聚乙烯醚醇胺可直接从螺旋藻破壁清液中萃取获得高纯度的藻蓝蛋白，无需其它提取手段配合，生产成本低；3.制备藻蓝蛋白的原料可以是螺旋藻鲜藻或者干藻粉，有效地解决螺旋藻资料的利用和高值化问题。
具体实施方式
实施实例1
(1)螺旋藻破壁清液的制备
取产于江苏东台市赐百年生物工程有限公司的钝顶螺旋藻干粉，用去离子水作提取剂，藻粉与去离子水的固液比为1:55，置于-20℃下冷冻3小时后，37℃融解，如此反复冻融4次，融化后的蓝藻破壁液用离心机在6000转/min下离心10分钟，取上清液为破壁清液，清液中蛋白质浓度为1.2mg/ml，藻蓝蛋白纯度A620/A280为0.75mg/ml。
(2)聚乙烯醚醇胺的制备
在1000ml的圆底烧瓶中放入100g聚乙二醇PEG-500(购自海安石油化工厂)，PEG-500的平均分子量为500，恒压漏斗中装入50g三溴化磷(购自淮安市鑫鑫化工有限公司)，在磁力搅拌下将三溴化磷缓慢滴入圆底烧瓶中，滴加时间为0.5小时，滴加完毕后，升温至60℃反应5小时，在反应混合物中缓慢滴入去离子水，直至烧瓶中的黄色蒸气消除，加入500ml二氯甲烷(购自淄博市临淄天德精细化工研究所)，将反应混合物转移至分液漏斗中，用250ml的25％碳酸钠(购自协成化工原料)水溶液洗涤三次，收集下层液体蒸馏去除二氯甲烷，获得溴代聚乙烯醚。在溴代聚乙烯醚中，加入一乙醇胺(购自苏州凯奇化工)，一乙醇胺与溴代聚乙烯醚之间重量比为1:2，在70℃下反应4小时，然后升温至120℃反应12小时，将反应物中在80℃下真空蒸馏1小时，加入500ml无水乙醇，过滤获得聚乙烯醚醇胺。
(3)两相萃取
在10g螺旋藻破壁清液中加入1.2g聚乙烯醚醇胺和2.5g无水硫酸钠(购自南京大唐化工有限责任公司)，震荡混合2分钟，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相，上相经截留分子量为30000道尔顿的超滤膜(颇尔过滤器有限公司)过滤，去除聚乙烯醚醇胺和硫酸钠，获得藻蓝蛋白水溶液，纯度为2.5，蛋白浓度为4.15mg/ml。
(4)冷冻干燥获得藻蓝蛋白粉
将前述步骤(3)中获得的藻蓝蛋白水溶液在60℃下真空浓缩至原体积三分之一，冷冻干燥后得到藻蓝蛋白粉产品。产品中藻蓝蛋白纯度A620/A280为2.5，蛋白回收率为80％。
实施例2
(1)螺旋藻破壁液的制备
取产于江苏大丰赐百年生物科技有限公司的新鲜螺旋藻，用100mmol/L磷酸缓冲液作提取剂，螺旋藻与去离子水的固液比为1:80，置于-10℃下冷冻4小时后，37℃融解，如此反复冻融5次。融化后的蓝藻破壁液用离心机在6000转/min下离心10分钟，取上清液为破壁清液，清液中蛋白质浓度为3.1mg/ml，藻蓝蛋白纯度A620/A280为0.55。
(2)聚乙烯醚醇胺的制备
在1000ml的圆底烧瓶中放入100g聚乙二醇PEG-2000(购自海安石油化工厂)，PEG-3000的平均分子量为2000，恒压漏斗中装入35g三溴化磷(购自淮安市鑫鑫化工有限公司)，在磁力搅拌下将三溴化磷缓慢滴入圆底烧瓶中，滴加时间为0.5小时，滴加完毕后，升温至80℃反应7小时，在反应混合物中缓慢滴入去离子水，直至烧瓶中的黄色蒸气消除，然后在反应混合物中加入800ml二氯甲烷(购自淄博市临淄天德精细化工研究所)，转移至分液漏斗中，用250ml的25％碳酸钠(购自协成化工原料)水溶液洗涤三次，收集下层液体，将下层溶液蒸馏去除二氯甲烷后得到溴代聚乙烯醚。在溴代聚乙烯醚中，加入二乙醇胺(购自苏州凯奇化工)，醇胺与溴代聚乙烯醚之间重量比为1:4，在80℃下反应5小时，然后升温至130℃反应14小时，将反应物中在90℃下真空蒸馏1小时，加入800ml无水乙醇，过滤获得聚乙烯醚醇胺。
(3)两相萃取
在10g螺旋藻破壁清液中加入2g聚乙烯醚醇胺和2.5g无水硫酸镁(购自南京大唐化工有限责任公司)，震荡混合2分钟，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相，将上相经截留分子量为30000道尔顿的超滤膜(颇尔过滤器有限公司)过滤，去除聚乙烯醚醇胺和硫酸镁，获得藻蓝蛋白水溶液，纯度为4.1，蛋白浓度为5.8mg/ml。
(5)冷冻干燥获得藻蓝蛋白粉
将前述步骤(3)中获得的藻蓝蛋白水溶液在60℃下真空浓缩至原体积三分之一，冷冻干燥后得到藻蓝蛋白粉产品。产品中藻蓝蛋白纯度A620/A280为4.2，蛋白回收率75％。
实施例3
(1)螺旋藻破壁液的制备
取产于云南丽江程海源螺旋藻基地的螺旋藻粉，用50mmol/L磷酸缓冲液作提取剂，螺旋藻与去离子水的固液比为1:100，置于-20℃下冷冻5小时后，37℃融解，如此反复冻融5次。融化后的蓝藻破壁液用离心机在6000转/min下离心10分钟，取上清液为破壁清液，清液中的藻蓝蛋白纯度A620/A280为0.72，破壁液蛋白质浓度为4.6mg/ml mg/ml。
(2)聚乙烯醚醇胺的制备
在2000ml的圆底烧瓶中，放入100g聚乙二醇PEG-4000(购自海安石油化工厂)，PEG-4000的平均分子量为4000g每摩尔，恒压漏斗中装入35g三溴化磷(购自淮安市鑫鑫化工有限公司)，在磁力搅拌下将三溴化磷缓慢滴入圆底烧瓶中，滴加时间为0.5小时，滴加完毕后，升温至90℃反应8小时，在反应混合物中缓慢滴入去离子水，直至烧瓶中的黄色蒸气消除，然后在反应混合物中加入1000ml二氯甲烷(购自淄博市临淄天德精细化工研究所)，转移至分液漏斗中，用250ml的25％碳酸钠水溶液洗涤三次，收集下层液体，将下层溶液蒸馏去除二氯甲烷后得到溴代聚乙烯醚。在溴代聚乙烯醚中，加入一乙醇胺(购自苏州凯奇化工)，一乙醇胺与溴代聚乙烯醚之间重量比为1:5，在90℃下反应6小时，然后升温至140℃反应16小时，将反应物中在100℃下真空蒸馏1小时，加入1000ml无水乙醇，过滤获得聚乙烯醚醇胺。
(3)双水相萃取
在10g螺旋藻破壁清液中加入3.5g聚乙烯醚醇胺和4g无水硫酸铵(购自南京大唐化工有限责任公司)，震荡混合2分钟，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相，将上相经截留分子量为30000道尔顿的超滤膜(颇尔过滤器有限公司)过滤，去除聚乙烯醚醇胺和硫酸铵，获得藻蓝蛋白水溶液，纯度为3.5，蛋白浓度为6.6mg/ml。
(4)冷冻干燥获得藻蓝蛋白粉
将前述步骤(3)中获得的藻蓝蛋白水溶液在60℃下真空浓缩至原体积三分之一，冷冻干燥后得到藻蓝蛋白粉产品。产品中藻蓝蛋白纯度A620/A280为3.5，蛋白回收率85％。

Claims (4)

1.一种聚乙烯醚醇胺双水相萃取螺旋藻藻蓝蛋白的分离技术，其特征在于步骤为：聚乙烯醚醇胺的制备；双水相萃取藻蓝蛋白；藻蓝蛋白水溶液经浓缩和冷冻干燥后获得藻蓝蛋白粉。
(1)聚乙烯醚醇胺的制备：在圆底烧瓶中放入聚乙二醇，恒压漏斗中装入三溴化磷，三溴化磷与聚乙二醇的重量比为1:2～3，在磁力搅拌下将三溴化磷缓慢滴入圆底烧瓶中，滴加时间为0.5小时，滴加完毕后，升温至60～90℃反应5～8小时，在反应混合物中缓慢滴入去离子水，直至烧瓶中的黄色蒸气消除，然后在反应混合物中加入500～1000ml二氯甲烷，转移至分液漏斗中，用250ml的25％碳酸钠水溶液洗涤三次，收集下层液体，将下层溶液蒸馏去除二氯甲烷后得到溴代聚乙烯醚。在溴代聚乙烯醚中，加入醇胺，醇胺与溴代聚乙烯醚之间重量比为1:2～5，在70～90℃下反应4～6小时，然后升温至120～140℃反应12～16小时，将反应物中在80～100℃下真空蒸馏1小时，加入500～1000ml无水乙醇，过滤获得聚乙烯醚醇胺。
(2)双水相萃取：在螺旋藻破壁清液中加入聚乙烯醚醇胺和无机盐，聚乙烯醚醇胺:无机盐:破壁清液的重量比为0.05～0.35:0.25～0.4:1，震荡混合2分钟，静置分相，藻蓝蛋白富集于上相。
(3)将上述含藻蓝蛋白的上相经截留分子量为30000道尔顿的超滤膜过滤，去除聚乙烯醚醇胺和无机盐，获得藻蓝蛋白水溶液，纯度为2.4～4.2，蛋白浓度为4.15～6.6mg/ml。
(4)将藻蓝蛋白水溶液在60℃下真空浓缩至原体积三分之一，冷冻干燥后得到藻蓝蛋白粉末。
2.根据权利要求1所述的聚乙烯醚醇胺的制备方法，其特征在于采用的聚乙二醇的平均分子量可以为500、1000、2000、3000、4000。
3.根据权利要求1所述的聚乙烯醚醇胺的制备方法，其特征在于采用的醇胺可以为一乙醇胺、二乙醇胺。
4.根据权利要求1所述的两相萃取方法，其特征在于，用于成相的无机盐可以为无水硫酸钠、无水硫酸镁、无水硫酸铵、无水氯化钠、无水磷酸钾。
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