TW202031687A - 一種融合蛋白及其用途 - Google Patents

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丁曉然
繆仕偉
談彬
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Abstract

本申請涉及一種融合蛋白、與其相關的免疫綴合物、核酸分子、載體、組成物、細胞和製備方法，以及它們在製備藥物中的用途。本申請所述的融合蛋白能夠用於治療腫瘤和/或自體免疫疾病。

Description

一種融合蛋白及其用途
本申請涉及生物醫藥領域，具體的涉及一種多特異性融合蛋白，還涉及其在治療腫瘤和/或自體免疫疾病中的用途。
目前，在腫瘤治療領域，存在施用靶向藥物和免疫治療兩大方法。這兩種治療方法可能有相互作用，導致更強的細胞毒性作用，穩定而持續地緩解腫瘤。然而，靶向藥物和免疫治療之間的相互作用是非常複雜的，種類、劑量、順序、劑型等各種因素都可能會影響聯合治療的整體抗腫瘤效果和毒性特徵。
CD47蛋白是一種跨膜糖蛋白，屬於免疫球蛋白超家族成員，除正常組織細胞表達CD47以外，許多腫瘤細胞過度表達CD47。腫瘤細胞表面的CD47與巨噬細胞表面的SIRP α相結合會阻止巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬，這被視為腫瘤逃避機體免疫監視的一種機制。阻斷CD47蛋白和SIRP α的相互作用，可抑制腫瘤增長。
然而，現有的用於阻斷CD47蛋白和SIRP α相互作用的試劑識別活性有限，其與CD47蛋白的親和力往往不足，對腫瘤的抑制能力有限。同時，現有靶向CD47的抗體類藥物存在引起貧血反應或者血小板 減少的副作用。亟待獲得同時特異性靶向CD47蛋白和相關腫瘤抗原的有效療法。
本申請提供了一種融合蛋白，其包含特異性結合腫瘤相關抗原的第一結合域和特異性結合CD47蛋白的第二結合域。本申請還提供包含該融合蛋白的免疫綴合物；編碼該融合蛋白的核酸分子；能夠包含和/或表達該融合蛋白的載體、組成物和細胞；以及製備該融合蛋白的方法。本申請的融合蛋白、免疫綴合物、核酸分子、載體、組成物和細胞具有以下一種或多種性質：1)能夠同時特異性結合CD47蛋白和腫瘤相關抗原；2)能夠特異性阻斷CD47蛋白與SIRP α的相互作用；3)能夠有效抑制腫瘤或腫瘤細胞的生長和/或增殖。
一方面，本申請提供了一種融合蛋白，其包含：特異性結合腫瘤相關抗原的第一結合域；以及特異性結合CD47蛋白的第二結合域；其中，該第二結合域包含人SIRP α變體1的突變體，該突變體與SEQ ID NO：50所示的序列相比，在第33位至第149位中的一個或多個位置包含胺基酸殘基的取代、缺失或添加。
在某些實施方式中，該突變體在選自下組的一個或多個胺基酸殘基處包含胺基酸取代：R22、I29、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109和V132。
在某些實施方式中，該突變體在選自下組的胺基酸殘基處包含胺基酸取代：(1)I61、V63、E77、E84、V93、L96、K98、N100 和V132；(2)I61、E77、Q82、K83和E84；(3)I61、V63、K83、E84和V132；(4)I61、E77、E84、R107和V132；(5)I61、V63、E77、K83、E84和N100；(6)I61、E77、Q82、K83、E84和R107；(7)I61、E77、Q82、E84、V93、L96、N100、R107、G109和V132；(8)I61、E77、Q82、K83、E84和V132；(9)I61；(10)I61、D95、L96、G109和V132；(11)I61、D95、L96、K98、G109和V132；(12)I61、E77、E84、V93、R107和V132；(13)E77、L96、N100、G109和V132；(14)I61、V63、Q82、E84、D95、L96、N100和V132；(15)I61、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100和V132；(16)I61、E77、Q82、K83、E84和V93；(17)I61、V63、E77、K83、E84、D95、L96、K98和N100；(18)I61、V63、E77、K83、D95、L96、K98、N100和G109；(19)I61、E77、Q82、E84、V93、D95、L96、K98和N100；和，(20)I61、V63、E77、Q82和E84。
在某些實施方式中，該突變體包含選自下組的一個或多個胺基酸取代：R22C、I29L、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、D96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/H和V132L/R/I/S。
在某些實施方式中，該突變體包含選自下組的胺基酸取代：(1)I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100G和V132L；(2)I61V、E77N、Q82S、K83R和E84H；(3)I61F、V63I、K83R、E84K和V132I；(4)I61L、E77Q、E84D、R107N和V132I；(5)I61L、V63I、E77K、K83R、E84D和N100G；(6)I61V、E77H、 Q82R、K83R、E84H和R107S；(7)I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109R和V132R；(8)I61L、E77M、Q82G、K83R、E84D和V132L；(9)I61L；(10)I61F、D95H、L96S、G109H和V132S；(11)I61F、D95H、L96S、K98R、G109H和V132S；(12)I61L、E77Q、E84D、V93A、R107N和V132I；(13)E77K、L96S、N100K、G109H和V132L；(14)I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100D和V132I；(15)I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100D和V132L；(16)I61V、E77N、Q82S、K83R、E84H和V93A；(17)I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98R和N100E；(18)I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100D和G109R；(19)I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R和N100G；和，(20)I61L、V63I、E77N、Q82G和E84G。
在某些實施方式中，該突變體包含如SEQ ID NO：51-70中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一結合域包含抗體或其抗原結合片段或變體。在某些實施方式中，該抗體選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。在某些實施方式中，該抗原結合片段選自下組：Fab，Fab’，F(ab')2，F(ab)2，dAb，分離的互補決定區CDR，Fv和scFv。
在某些實施方式中，該抗體或其抗原結合片段的該變體選自下組：
a)在該抗體或該其抗原結合片段中經過取代、缺失或添加一個或多個胺基酸的蛋白質或多肽；和
b)與該抗體或該其抗原結合片段具有至少90%序列同源性的蛋白質或多肽。
在某些實施方式中，該腫瘤相關抗原包括與非實體瘤和/或實體瘤相關的腫瘤相關抗原。在某些實施方式中，該腫瘤相關抗原選自以下組：CD38、AXL和Trop2。
在某些實施方式中，該第一結合域包含CD38抗體或其抗原結合片段或變體。在某些實施方式中，該CD38為人CD38。
在某些實施方式中，該抗體包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1-3，該HCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。在某些實施方式中，該抗體重鏈或其片段包含重鏈可變區VH，且該重鏈可變區VH包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：8。在某些實施方式中，該抗體重鏈或其片段包含重鏈恆定區，且該重鏈恆定區包含IgG。在某些實施方式中，該IgG選自下組：IgG1和IgG4。在某些實施方式中，該抗體重鏈包含選自下組所示的胺基酸序列中的任一項：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21。
在某些實施方式中，該抗體包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1-3，該LCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。在某些實施方式中，該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈可變區VL，且該輕鏈可變區VL包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：7。在某些實施方式中，該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈恆定區，其該輕鏈恆定區包含Ig κ。在某些實施方式中，該抗體輕鏈包含選自下組所示的胺基酸序列中的任一項：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
在某些實施方式中，該第一結合域包含AXL抗體或其抗原結合片段或變體。在某些實施方式中，該AXL為人AXL。
在某些實施方式中，該抗體包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1-3，該HCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。在某些實施方式中，該抗體重鏈或其片段包含重鏈可變區VH，且該重鏈可變區VH包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：29。在某些實施方式中，該抗體重鏈或其片段包含重鏈恆定區，且該重鏈恆定區包含IgG。在某些實施方式中，該IgG選自下組：IgG1和IgG4。在某些實施方式中，該抗體重鏈包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：34。
在某些實施方式中，該抗體包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1-3，該LCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。在某些實施方式中，該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈可變區VL，且該輕鏈可變區VL包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：28。在某些實施方式中，該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈恆定區，其該輕鏈恆定區包含Ig κ。在某些實施方式中，該抗體輕鏈包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：32。
在某些實施方式中，該第一結合域包含Trop2抗體或其抗原結合片段或變體。在某些實施方式中，該Trop2為人Trop2。
在某些實施方式中，該抗體包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1-3，該HCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41。在某些實施方式中，該抗體重鏈或其片段包含重鏈可變區VH，且該重鏈可變區VH包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：43。在某些實施方式中，該抗體重鏈或其片 段包含重鏈恆定區，且該重鏈恆定區包含IgG。在某些實施方式中，該IgG選自下組：IgG1和IgG4。在某些實施方式中，該抗體重鏈包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：48。在某些實施方式中，該抗體包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1-3，該LCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38。在某些實施方式中，該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈可變區VL，且該輕鏈可變區VL包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：42。在某些實施方式中，該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈恆定區，其該輕鏈恆定區包含Ig κ。在某些實施方式中，該抗體輕鏈包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO：46。
在某些實施方式中，該第一結合域位於該第二結合域的N端。在某些實施方式中，該融合蛋白還包含連接子，該連接子位於該第一結合域的C端且位於該第二結合域的N端。在某些實施方式中，該連接子包含如SEQ ID NO：73-74中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該的融合蛋白包含至少2個該第二結合域。在某些實施方式中，該每個該第二結合域分別位於該第一結合域的C端。
另一方面，本申請提供了一種免疫綴合物，其包含該的融合蛋白。
另一方面，本申請提供了一個或多個分離的核酸分子，其編碼該融合蛋白或者該免疫綴合物。
另一方面，本申請提供了一個或多個載體，其包含該核酸分子。
另一方面，本申請提供了一種組成物，其包含該融合蛋白，該免疫綴合物，或該的核酸分子，以及視需要地藥學上可接受的賦形劑。
另一方面，本申請提供了一種細胞，其包含該融合蛋白，該免疫綴合物，該核酸分子，或該載體。
另一方面，本申請提供了製備該融合蛋白的方法，其包括在使得該融合蛋白能夠表達的條件下培養該細胞。
另一方面，本申請提供了該融合蛋白，該免疫綴合物，該核酸分子，該載體，該組成物，或該細胞在製備藥物中的用途，其中該藥物用於治療腫瘤或自體免疫疾病。
在某些實施方式中，該腫瘤包括非實體瘤和實體瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤包括多發性骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、神經膠質瘤、生殖細胞瘤、肉瘤、間皮瘤、胎盤瘤、腦癌、骨癌、皮膚癌、鼻咽癌、肺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、腸癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌和睾丸癌。
在某些實施方式中，該自體免疫疾病包括慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進、胰島素依賴型糖尿病、重症肌無力、慢性潰瘍性結腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血腎炎綜合征(goodpasture syndrome)、尋常天皰瘡、類天皰瘡、原發性膽汁性肝硬變、多發性腦脊髓硬化症、急性特發性多神經炎、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、硬皮病和結節性多動脈炎。
另一方面，本申請提供了該融合蛋白，該免疫綴合物，該核酸分子，該載體，該組成物，或該的細胞，其治療腫瘤或自體免疫疾病。
另一方面，本申請提供了一種阻斷CD47蛋白與SIRP α相互作用的方法，其包括向有需要的受試者施用有效量的該融合蛋白，該免疫綴合物，該核酸分子，該載體，該組成物，或該細胞。
另一方面，本申請提供了一種抑制腫瘤或腫瘤細胞生長和/或增殖的方法，其包括向有需要的受試者施用有效量的該融合蛋白，該免疫綴合物，該核酸分子，該載體，該組成物，或該細胞。
本領域技術人員能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如本領域技術人員將認識到的，本申請的內容使得本領域技術人員能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下：
第1圖顯示的是本申請所述融合蛋白的結構示例。
第2圖和第3圖顯示的是本申請所述融合蛋白的生物學活性。
第4A圖和第4B圖顯示的是本申請所述融合蛋白的生物學活性。
第5圖顯示的是檢測本申請所述融合蛋白與CD38和CD47之間相互作用的方法原理示意圖。
第6圖顯示的是本申請所述融合蛋白的生物學活性。
第7圖顯示的是檢測本申請所述融合蛋白與CD38和CD47之間相互作用的方法原理示意圖。
第8圖和第9圖顯示的是本申請所述融合蛋白的生物學活性。
第10圖顯示的是本申請所述融合蛋白對CD47蛋白與SIRP α相互作用的阻斷。
第11A圖和第11B圖、第12A圖和第12B圖以及第13A圖和第13B圖顯示的是本申請的融合蛋白與相應抗原的結合活性。
第14圖顯示不同治療組小鼠的腫瘤成像結果。
第15圖顯示不同治療組小鼠的腫瘤平均熒光強度。
第16圖顯示不同治療組小鼠的生存率。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
在本申請中，術語“融合蛋白”通常指由兩個或更多個蛋白或多肽融合得到的蛋白。融合蛋白可藉由重組DNA技術人工製備。例如，編碼該兩個或更多個蛋白或多肽的基因或核酸分子可彼此連接而形成融合 基因或融合的核酸分子，該融合基因或融合的核酸分子可編碼該融合蛋白。該融合基因的翻譯可以產生單一多肽，其可以具有融合前的該兩個或更多個蛋白或多肽中至少一個、甚至每一個的性質。
在本發明中，術語“特異性結合”通常是指兩分子間的非隨機結合反應，如抗體和產生該抗體的抗原間的反應。一個某抗原特異性抗體是指以親和力(KD)
Figure 108141186-A0101-12-0011-150
10-5M(如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M等)結合該抗原，其中KD指解離率與結合率的比值(koff/kon)，其可以採用本領域技術人員熟悉的方法進行測定。
在本申請中，術語“結合域”通常是可以特異性結合和/或識別靶標(例如抗原)上的特定表位的結構域。在本申請中，術語“結構域”通常是指蛋白質亞基結構中明顯分開的緊密球狀結構區域。例如，多肽鏈首先可以是在某些區域相鄰的胺基酸殘基形成有規則的二級結構，然後，又可以由相鄰的二級結構片段組裝在一起形成超二級結構，在此基礎上多肽鏈可以折疊成近似於球狀的三級結構。對於較大的蛋白質分子或亞基，多肽鏈往往可以由兩個或多個在空間上可明顯區分的、相對獨立的區域性結構締合而成三級結構，這種相對獨立的區域性結構可以稱為結構域。
在本申請中，術語“第一結合域”和“第二結合域”中的該“第一”、“第二”可以只是為了在描述上進行區分。
在本申請中，術語“CD47蛋白”通常是指整聯蛋白相關蛋白(IAP)，其為一種屬於免疫球蛋白超家族的多次跨膜受體。例如，CD47蛋白可與膜整合素(membrane integrins)結合，並與其配體凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)和信號調節蛋白α(signal-regulatory protein alpha,SIRP α)結合。CD47蛋白廣泛表達於細胞膜表面。在本申請中，該CD47蛋白可包括人CD47的任何變體、同種型和物種同系物。人CD47蛋 白的胺基酸序列在GenBank中作為CEJ95640.1列出。該CD47蛋白可以由細胞天然表達或在用CD47基因轉染的細胞上表達。
在本申請中，術語“SIRP α”通常是指來自SIRP家族的調節性膜糖蛋白，其可作為CD47蛋白的配體。在本申請中，該SIRP α可包括人SIRP α。例如，SIRP α變體1和SIRP α變體2。該SIRP α變體2與該SIRP α變體1有13個胺基酸不同，並且其胺基酸序列在GenBank中作為CAA71403.1列出。在本申請中，術語“SIRP α變體1”通常是指胺基酸序列作為NCBI RefSeq NP_542970.1列出(殘基31-504構成成熟型)的SIRP α蛋白，此時SIRP α變體1的胺基酸序列如SEQ ID NO：50所示。
在本申請中，術語“變體”通常是指與不具備任何突變/修飾的蛋白質具有序列同源性的蛋白質性分子，其保留至少一部分生物活性蛋白的治療和/或生物活性。例如，變體蛋白質相較於參照生物活性蛋白可共享至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列同一性。在一些實施方案中，“變體”可以包括經有意地修飾(例如藉由定點誘變、編碼基因的合成、插入或偶然藉由突變)的蛋白質。
術語“抗體”通常是指包含一個或多個基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的多肽的蛋白質。例如，免疫球蛋白基因可以包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恆定區基因，以及無數的免疫球蛋白可變區基因。例如，輕鏈可被分類為κ或λ，其可以分別定義免疫球蛋白類型：Ig κ和Ig λ。重鏈可被分類為γ、μ、α、δ或ε，其依次分別定義免疫球蛋白類別：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。例如，抗體可具有包含四聚體的結構單元，每個四聚體可由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一條“輕”鏈(約25kD)和一條“重鏈”(約50-70kD)，每 個成員的N末端可以界定約100至110個或更多個胺基酸的可變區，其主要負責抗原識別。例如，術語“輕鏈可變區(VL)”和“重鏈可變區(VH)”通常分別指輕鏈和重鏈的可變區區域。抗體可作為完整免疫球蛋白存在或作為藉由用各種肽酶消化或從頭表達產生的許多充分表徵的片段存在。
在本發明中，術語“抗原結合片段”通常是指全長抗體的一個或多個部分，該部分基本上保持結合抗體所結合的相同抗原(例如，CD38)的能力，能夠與全長抗體競爭對抗原的特異性結合。通常參見，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.，第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，並且將其全文藉由引用併入本申請。可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體的酶促或化學斷裂產生抗原結合片段。在一些情況下，抗原結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、(Fab)2、Fd、Fv、dAb和互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(例如，scFv)、嵌合抗體、雙抗體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結合能力的抗體的至少一部分。可使用本領域技術人員已知的常規技術(例如，重組DNA技術或酶促或化學斷裂法)從給定的抗體獲得抗體的抗原結合片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就特異性篩選抗體的抗原結合片段。例如，胃蛋白酶可以消化鉸鏈區中二硫鍵以下的抗體以產生F(ab')2。
在本申請中，術語“Fab”通常指由VL、VH、CL和CH1結構域組成的抗體片段。
在本申請中，術語“Fab'”通常是指與Fab片段相比在CH1結構域的羧基末端具有幾個額外的殘基的抗體片段。例如，Fab'可包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。
在本申請中，術語“F(ab)2”通常是指由半胱胺酸相連接的成對的Fab片段所得到的抗原結合片段。
在本申請中，術語“dAb片段”通常是指由VH結構域組成的抗體片段(Ward等人，Nature 341：544-546(1989))。
在本申請中，術語“互補決定區CDR”通常是指輕鏈可變區(VL)與重鏈可變區(VH)的3個高變區(HVR)，該部位因在空間結構上可與抗原決定簇形成精密的互補，故高變區又稱互補性決定區。
在本申請中，術語“Fv片段”通常是指由抗體的單臂的VL和VH結構域組成的抗體片段。
在本申請中，術語“scFv”通常是指是由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區藉由短肽連接子(linker)連接而成的分子，又稱為單鏈抗體。
在本申請中，術語“單株抗體”通常是指一群基本同源的抗體，包含於該群的各個抗體除了可能的以微量存在的天然發生的突變之外可以是相同的。單株抗體是高度特異性的，直接針對單個抗原性位點。此外，與包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多株抗體製備物相反，每個單株抗體針對抗原上的單一決定簇修飾語"單株"不是被解釋為需要藉由任何特殊方法產生抗體。例如，該單株抗體可以藉由融合瘤技術製備或者藉由使用重組DNA方法在細菌、真核動物或植物細胞中產生單株抗體，也可以得自噬菌體抗體文庫，使用例如Clackson et al.,Nature,352：624-628(1991)和Marks et al.,Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述的技術進行。
在本申請中，術語“嵌合抗體”通常是指這樣的抗體，其中每個重鏈或輕鏈胺基酸序列的一部分與來自特定物種的抗體中相應胺基酸序列同源，或者屬於特定的類別，而該鏈的其餘區段則與另一物種中的相應序列同源。例如，輕鏈和重鏈的可變區均來自一個動物物種(如小鼠、大鼠等)的抗體的可變區，而恆定部分則與來自另一物種(如人)的抗體序列同源。例如，為獲得嵌合抗體，可利用非人源的B細胞或融合瘤細胞 產生可變區，而與其組合的恆定區則來自人。該可變區具有易於製備的優點，並且其特異性不受與其組合的恆定區的來源的影響。同時，由於嵌合抗體的恆定區可來源於人類，因此嵌合抗體在注射時抗體引發免疫應答的可能性會低於使用恆定區為非人來源的抗體。
在本申請中，術語“人源化抗體”通常是指將衍生自非人物種(例如小鼠或大鼠)的抗體、免疫球蛋白結合蛋白和多肽對人體的免疫原性降低，同時仍保留原始抗體的抗原結合特性的改造抗體。例如，可以使用遺傳工程技術製備人源化抗體，可以使用CDR移植(Jones et al.,Nature 321：522(1986))及其變體；包括“重塑”(reshaping)，(Verhoeyen,et al.,1988 Science 239：1534-1536；Riechmann,et al.,1988 Nature 332：323-337；Tempest,et al.,Bio/Technol 19919：266-271)，“高度加成”(hyperchimerization)，(Queen,et al.,1989 Proc Natl Acad Sci USA 86：10029-10033；Co,et al.,1991 Proc Natl Acad Sci USA 88：2869-2873；Co,et al.,1992 J Immunol 148：1149-1154)和“貼面”(veneering)，(Mark,et al.,“Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies.”In：Metcalf B W,Dalton B J,eds.Cellular adhesion：molecular definition to therapeutic potential.New York：Plenum Press,1994：291-312)等技術手段，對非人源的結合域進行人源化。如果其他區域，例如鉸鏈區和恆定區結構域也源自非人來源，則這些區域也可以被人源化。
在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指由基因工程改造的抗體基因缺失動物中表達編碼人類抗體的基因得到的抗體。例如，可以將人類抗體基因藉由轉基因或轉染色體技術，將編碼人類抗體的基因全部轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達的人類抗體
如本申請中所用，術語“序列同源性”通常是指兩個或多個多核苷酸序列之間或兩個或多個多肽序列之間的序列相似性或可交換性。當使用程序(例如Emboss Needle或BestFit)來測定兩個不同胺基酸序列之間的序列同一性、相似性或同源性時，可以使用默認設置，或者可以選擇合適的評分矩陣(諸如blosum45或blosum80)來最優化同一性、相似性或同源性得分。在一些實施方案中，同源的多核苷酸是在嚴格條件下雜交的那些序列，並且相較於那些序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、甚至100%的序列同一性。當對準具有相當長度的序列時，同源的多肽具有至少80%，或至少90%，或至少95%，或至少97%，或至少98%的序列同一性，或具有至少99%的序列同一性。
在本申請中，術語“CD38”、“CD38蛋白”和“CD38抗原”在本申請中可互換使用，並且包括人CD38的任何變體、同種型和物種同系物，其可以由細胞天然表達或在用CD38基因轉染的細胞上表達。本領域公認的CD38的同義詞包括ADP核糖基環化酶1、cADPr水解酶1、Cd38-rs1、環狀ADP-核糖水解酶1、I-19和NIM-R5抗原。CD38可以在骨髓瘤細胞表面高度表達。
在本申請中，術語“AXL”、“AXL蛋白”和“AXL抗原”在本申請中可以互換使用，通常是指屬於酪胺酸激酶家族的一種蛋白，該家族可以由共同的配體Gas6。在本申請中，，AXL的高表達與腫瘤形成可以由較大的關聯，AXL可以當作癌細胞惡化的標識物。在本申請中，該AXL可以為人AXL，其胺基酸序列在GenBank中作為AAH32229列出。
在本申請中，術語“Trop2”通常是指腫瘤相關鈣信號轉導2(tumor-associated calcium signal transducer 2)，可以被稱為TACSTD2、 EGP-1、GA733-1或GP50等。Trop2在細胞中可以定位於細胞膜，其陽性染色著色部位可主要在細胞膜上。在正常組織中，Trop2的表達量很低，但在腫瘤細胞中過表達，因此可以作為腫瘤治療的靶點。在本申請中，該Trop2可以為人Trop2，其胺基酸序列在GenBank中作為NP_002344列出。
通常情況下，在多肽鏈中，胺基與多肽鏈中的另一個羧基相連可以使其成為一個鏈，但是在蛋白質的兩個末端，分別剩餘沒有成肽鍵的胺基酸殘基，分別是攜帶游離的胺基的多肽鏈末端和攜帶羧基的多肽鏈末端。在本申請中，術語“N端”通常是指胺基酸殘基攜帶游離的胺基的多肽鏈的末端。在本申請中，術語“C端”通常是指胺基酸殘基攜帶游離的羧基的多肽鏈的末端。
在本申請中，術語“核酸分子”通常是指從其天然環境中分離的或人工合成的任何長度的分離形式的核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。
在本申請中，術語“免疫綴合物”通常是指綴合了一個或多個異源分子(包括但不限於細胞毒素)的具有免疫功能的多肽分子。在本申請中，“綴合”和“連接”、“融合”在本申請中可以互換使用，並且通常是指將兩個或更多個化學元素、序列或組分連接在一起，例如藉由包括化學綴合或重組手段。該異源分子可以是細胞毒素、化療藥物等。例如，將本申請所述的融合蛋白綴合一個或多個異源分子(例如，細胞毒素)可以得到該免疫綴合物。
在本發明中，術語“載體”指的是，可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中並使蛋白獲得表達的一種核酸運載工具。載體可藉由轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內表達得以表達。舉例來說，載體包括：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體如酵母 人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。載體還有可能包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。
在本申請中，術語“腫瘤”通常是指哺乳動物中的機體(例如，細胞或其組成部分)在各種致瘤因子作用下，局部組織細胞增生所形成的贅生物。在本申請中，腫瘤可以包括實體瘤和非實體瘤。實體瘤可以包括神經膠質瘤、生殖細胞瘤、肉瘤、間皮瘤、胎盤瘤、腦癌、骨癌、皮膚癌、鼻咽癌、肺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、腸癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌和睾丸癌。在申請中，非實體瘤可以包括多發性骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤。
在本申請中，術語“淋巴瘤”通常是指一種淋巴系統的惡性腫瘤。淋巴瘤的發生可以是由於淋巴結細胞或淋巴細胞開始無法控制地繁殖，並產生具有異常能力，可以侵入整個身體其他組織的癌細胞。患者體徵和症狀可以包括淋巴結腫大、發熱、盜汗、消瘦或瘙癢，並持續感到疲倦。淋巴瘤有多種亞型，其中兩種主要的類型可以為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在本申請中，術語“霍奇金淋巴瘤”(Hodgkin's lymphoma，HL)通常是指一種由淋巴細胞類白細胞產生的一種淋巴瘤。約有一半的霍奇金淋巴瘤病例是由Epstein-Barr病毒引起的。在本申請中，術語“非霍 奇金淋巴瘤”(Non-Hodgkin lymphoma，NHL)通常是指除了霍奇金淋巴瘤外其他類型的淋巴瘤。
在本申請中，術語“白血病”通常是指一種造血系統惡性增殖性疾病，通常指因白血病細胞大量增殖、累積所引起的一類疾病。純株性白血病細胞因為增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，並浸潤其他非造血組織和器官，同時抑制正常造血功能。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染發熱以及肝、脾、淋巴結腫大和骨骼疼痛。
在本申請中，術語“多發性骨髓瘤”通常是指一種漿細胞不正常增生致使侵犯骨髓的一種惡性腫瘤。多發性骨髓瘤導致癌細胞可以在骨髓中聚集，使得健康的血細胞被排除。癌細胞產生可導致併發症的異常蛋白質而不是正常的抗體。多發性骨髓瘤的發病率可以在老年人群中增加。其化學治療方案細胞增殖速率低和藥物抗藥性強，限制了其化療效果。超過90%的多發性骨髓瘤患者有化療抗藥性。
在本申請中，術語“Raji細胞”通常是指能產生Epstein-Barr病毒株的連續的人類細胞系。病毒將轉化臍帶淋巴細胞並且在Raji細胞中誘導早期抗原。Raji細胞可以被廣泛用作轉染宿主，也可以被用於瞭解造血細胞和其他細胞惡性腫瘤。此外，Raji細胞具有和表達某些補體成分的幾種受體以及免疫球蛋白G的Fc受體，因而還可以被用於檢測免疫複合物。
在本申請中，術語“自體免疫疾病”通常是指機體對自身抗原發生免疫反應而導致自身組織損害所引起的疾病。自體免疫疾病可以分為兩大類，即器官特異性自身免疫病和系統性自身免疫病。器官特異性自身免疫病可以是指組織器官的病理損害和功能障礙僅限於抗體或致敏淋巴 細胞所針對的某一器官，可包括慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進、胰島素依賴型糖尿病、重症肌無力、慢性潰瘍性結腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血腎炎綜合症(goodpasture syndrome)、尋常天皰瘡、類天皰瘡、原發性膽汁性肝硬變、多發性腦脊髓硬化症和急性特發性多神經炎。系統性自體免疫病可以是由於抗原抗體複合物廣泛沉積於血管壁等原因導致全身的多器官損害，可以是由於免疫損傷導致血管壁及間質的纖維素樣壞死性炎及隨後產生多器官的膠原纖維增生所致，系統性自體免疫病可以包括系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、硬皮病和結節性多動脈炎。
在本申請中，術語“ADCC”是抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)，通常是指是指具有殺傷活性的細胞藉由其表面表達的Fc受體(FcR)識別包被於靶抗原上的Fc段，由此免疫系統的效應細胞主動溶解其膜表面抗原已被特異性抗體結合的靶細胞。
在本申請中，術語“包含”通常是指包括明確指定的特徵，但不排除其他要素。
在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
融合蛋白
一方面，本申請提供一種融合蛋白，該融合蛋白可包含第一結合域以及第二結合域。該第一結合域可以特異性結合腫瘤相關抗原；該 第二結合域可以特異性結合CD47蛋白，該第二結合域可以包含人SIRP α變體1的突變體，該突變體與SEQ ID NO：50所示的序列相比，在第33位至第149位中的一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)位置包含胺基酸殘基的取代、缺失或添加。本申請所述的融合蛋白能夠同時特異性結合腫瘤相關抗原和CD47蛋白，從而起到治療腫瘤和/或自體免疫疾病的作用。
在本申請中，術語“第一結合域”通常是指可以特異性結合腫瘤相關抗原的結構域。術語“第二結合域”通常是指可以特異性結合CD47蛋白的結構域。
在本申請中，該腫瘤相關抗原可以包括與非實體瘤和/或實體瘤相關的腫瘤相關抗原。例如，該腫瘤相關抗原可以選自以下組：CD38、AXL和Trop2。
特異性結合CD47的第二結合域
在本申請中，該突變體(例如特異性結合CD47蛋白的人SIRP α變體1的突變體)在選自下組的一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸殘基處包含胺基酸取代：R22、I29、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109和V132。
在本申請中，該胺基酸取代中胺基酸殘基的位置是以SEQ ID NO：50所示胺基酸序列為基準確定的殘基編號。
在本申請中，“胺基酸取代Xn”是指在相應於SEQ ID NO：50所示胺基酸序列中第n位的殘基X處發生胺基酸取代，其中n為正整 數，X為任意胺基酸殘基的縮寫。例如，“胺基酸取代I61”表示在相應於SEQ ID NO：50所示胺基酸序列中第61位的殘基I處發生胺基酸取代。
本申請中，該胺基酸取代可以為非保守取代。該非保守取代可包括以非保守的形式改變目標蛋白或多肽中的胺基酸殘基，例如將具有某種側鏈大小或某種特性(例如，親水性)的胺基酸殘基變為具有不同側鏈大小或不同特性(例如，疏水性)的胺基酸殘基。
本申請中，該胺基酸取代也可以為保守取代。該保守取代可包括以保守的形式改變目標蛋白或多肽中的胺基酸殘基，例如將具有某種側鏈大小或某種特性(例如，親水性)的胺基酸殘基變為具有相同或相似側鏈大小或者相同或相似特性(例如，仍為親水性)的胺基酸殘基。這樣的保守取代通常不會對所產生的蛋白質的結構或功能帶來很大影響。在本申請中，作為該融合蛋白或其片段的胺基酸序列變體可包括不顯著改變蛋白質結構或其功能(例如，阻斷CD47與特異性結合CD47蛋白的人SIRP α變體1的突變體)的保守胺基酸取代。
作為示例，下述各組中每組內各胺基酸間的相互取代在本申請中可被認為是保守取代：具有非極性側鏈的胺基酸組：丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸。不帶電荷、具有極性側鏈的胺基酸組：甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸，半胱胺酸，酪胺酸，天冬醯胺和穀胺醯胺。帶負電荷、具有極性側鏈的胺基酸組：天冬胺酸和谷胺酸。帶正電荷的鹼性胺基酸：賴胺酸、精胺酸和組胺酸。帶苯基的胺基酸：苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸。
在本申請中，該突變體可以在選自下組的胺基酸殘基處包含胺基酸取代：(1)I61、V63、E77、E84、V93、L96、K98、N100和V132；(2)I61、E77、Q82、K83和E84；(3)I61、V63、K83、E84和V132； (4)I61、E77、E84、R107和V132；(5)I61、V63、E77、K83、E84和N100；(6)I61、E77、Q82、K83、E84和R107；(7)I61、E77、Q82、E84、V93、L96、N100、R107、G109和V132；(8)I61、E77、Q82、K83、E84和V132；(9)I61；(10)I61、D95、L96、G109和V132；(11)I61、D95、L96、K98、G109和V132；(12)I61、E77、E84、V93、R107和V132；(13)E77、L96、N100、G109和V132；(14)I61、V63、Q82、E84、D95、L96、N100和V132；(15)I61、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100和V132；(16)I61、E77、Q82、K83、E84和V93；(17)I61、V63、E77、K83、E84、D95、L96、K98和N100；(18)I61、V63、E77、K83、D95、L96、K98、N100和G109；(19)I61、E77、Q82、E84、V93、D95、L96、K98和N100；和，(20)I61、V63、E77、Q82和E84。
在本申請中，該突變體可以包含選自下組的一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸取代：R22C、I29L、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、D96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/H和V132L/R/I/S。
在本申請中，胺基酸取代“XnY/Z”是指相應於SEQ ID NO：50所示胺基酸序列中第n位的殘基X被取代為胺基酸殘基Y或者胺基酸殘基Z，其中n為正整數，X、Y和Z分別獨立地為任意胺基酸殘基的縮寫，且X不同於Y或Z。例如，胺基酸取代“I61L/V/F”是指相應於SEQ ID NO：50所示胺基酸序列中第61位的殘基I被取代為胺基酸殘基L、V或F。
在本申請中，該突變體可以包含選自下組的胺基酸取代：(1)I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100G和V132L；(2)I61V、E77N、Q82S、K83R和E84H；(3)I61F、V63I、K83R、E84K和V132I；(4)I61L、E77Q、E84D、R107N和V132I；(5)I61L、V63I、E77K、K83R、E84I和N100G；(6)I61V、E77H、Q82R、K83R、E84H和R107S；(7)I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109R和V132R；(8)I61L、E77M、Q82G、K83R、E84D和V132L；(9)I61L；(10)I61F、D95H、L96S、G109H和V132S；(11)I61F、D95H、L96S、K98R、G109H和V132S；(12)I61L、E77Q、E84D、V93A、R107N和V132I；(13)E77K、L96S、N100K、G109H和V132L；(14)I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100D和V132I；(15)I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100D和V132L；(16)I61V、E77N、Q82S、K83R、E84H和V93A；(17)I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98R和N100E；(18)I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100D和G109R；(19)I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R和N100G；和，(20)I61L、V63I、E77N、Q82G和E84G。
在本申請中，在人SIRP α變體1(如SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列，即人SIRP α的胺基酸序列中的第33-149位殘基)的基礎上，分別包含以上(1)-(20)的胺基酸取代組的SIRP α變體1的突變體可依次被命名為M1、M5、M12、M35、M37、M41、M57、M67、M81、M82、M84、M91、M99、M102、M111、M122、M126、M130、M135和M145。該SIRP α變體1的突變體可依次包含如SEQ ID NO：51-SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該SIRP α變體1的突變體是M91，該SIRP α變體1的突變體包含如SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。
特異性結合腫瘤相關抗原的第一結合域
在本申請中，該第一結合域可以包含抗體或其抗原結合片段或變體。例如，該抗體可以選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。例如，該抗原結合片段選自下組：Fab，Fab'，(Fab')2，F(ab)2，dAb，分離的互補決定區CDR，Fv和scFv。
在本申請中，該抗體或其抗原結合片段的該變體可以在該抗體或該其抗原結合片段中經過取代、缺失或添加一個或多個(例如，1-2個、1-3個、1-4個、1-5個、1-6個、1-7個、1-8個、1-9個、1-10個或更多個)胺基酸的蛋白質或多肽。或者該抗體或其抗原結合片段的該變體可以與該抗體或該其抗原結合片段具有至少90%(例如，例如，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%)序列同源性的蛋白質或多肽。
特異性結合CD38的第一結合域
本申請所述的抗體或其抗原結合片段或變體，可藉由與CD38蛋白特異性結合而殺傷腫瘤細胞和/或抑制腫瘤生長。例如，該腫瘤可以包括CD38陽性的腫瘤。如，該CD38陽性的腫瘤可以選自以下組：骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。又例如，該腫瘤選自以下組：非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。該腫瘤的細胞可以選自下組：Raji細胞、Daudi細胞、Ramos細胞和RPMI8226細胞。在本申請中，該抗體、其抗原結合片段或變體可以殺傷多發性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤 細胞或抑制多發性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤生長。
本申請所述的CD38蛋白可為人CD38蛋白或其功能片段。例如，該CD38蛋白可以不為小鼠CD38蛋白，或者可以不為大鼠CD38蛋白。在某些實施方式中，本申請所述的抗體、其抗原結合片段或變體基本上不結合小鼠CD38蛋白或大鼠CD38蛋白。
本申請所述的抗體、其抗原結合片段或變體，可以與對照抗體競爭結合該CD38蛋白。該對照抗體可以包含輕鏈可變區和重鏈可變區。例如，該對照抗體的輕鏈可變區可包含LCDR1-3，該LCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。該對照抗體的重鏈可變區可包含HCDR1-3，該HCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
例如，該對照抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：7，且該對照抗體的重鏈可變區的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：8。又例如，該對照抗體的輕鏈可包含選自下組所示的胺基酸序列中的任一項：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20；且該對照抗體的重鏈可包含選自下組所示的胺基酸序列中的任一項：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21。例如，該對照抗體的輕鏈可包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，且該對照抗體的重鏈可包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。例如，該對照抗體的輕鏈可包含如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，且該對照抗體的重鏈可包含如SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。例如，該對照抗體的輕鏈可包含如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，且該對照抗體的重鏈可包含如SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。例如，該對照抗體的輕鏈可包含如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，且該對照抗體的重鏈可包含如SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列。
本申請所述的抗體、其抗原結合片段或變體可包含抗體輕鏈或其片段。例如，該抗體輕鏈或其片段可包括Ig κ恆定區，例如可包含人Ig κ恆定區。
例如，該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR1，且該LCDR1可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：1。該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR2，且該LCDR2可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：2。該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR3，且該LCDR3可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：3。
本申請所述抗體的輕鏈或其片段可包含輕鏈可變區VL，且該輕鏈可變區VL的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：7。在某些實施方式中，該抗體輕鏈或其片段可包含選自下組所示的胺基酸序列中的任一項：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
本申請所述的抗體或其抗原結合片段可包含抗體重鏈或其片段。例如，該抗體重鏈或其片段還包含人恆定區。其中，該人恆定區可包括人IgG恆定區。其中，該IgG恆定區可包含人IgG1恆定區或IgG4。
例如，該抗體重鏈或其片段可包含HCDR1，且該HCDR1可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：4。該抗體重鏈或其片段可包含HCDR2，且該HCDR2可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：5。又例如，該抗體重鏈或其片段可包含HCDR3，且該HCDR3可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：6。
該抗體重鏈或其片段可包含重鏈可變區VH，且該重鏈可變區VH可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：8。在某些實施方式中，該抗 體重鏈可包含選自下組所示的胺基酸序列中的任一項：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段中LCDR1的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：1；LCDR2的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：2；LCDR3的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：3；且HCDR1的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：4或；HCDR2的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：5；HCDR3的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：6。例如，該抗體或其抗原結合片段可包括抗體SG003或與其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗體。在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：7；且其中重鏈可包含重鏈可變區，該重鏈可變區的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：8。例如，該抗體或其抗原結合片段可包括抗體SG003或與其具有相同的輕鏈可變區及重鏈可變區的抗體。在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段可包含輕鏈和重鏈，該輕鏈的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示且該重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示。例如，該抗體或其抗原結合片段可包括抗體SG003或與其具有相同的輕鏈及重鏈胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體可以為SG003。抗體SG003的LCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示；HCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示；輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示；重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示。
本申請所述的抗體或其抗原結合片段或變體，還可以在SG003的輕鏈和/或重鏈的胺基酸序列中包含一個或多個隨機突變(例如，一個或多個、如一個或數個胺基酸取代)。例如，該抗體、其抗原結合片段或變體可在SG003的輕鏈可變區的框架區L-FR1-4的一個或多個位點包含一個或多個隨機突變(例如，一個或多個，如一個或數個胺基酸取代)，和/或在SG003的重鏈可變區的框架區H-FR1-4的一個或多個位點包含一個或多個隨機突變(例如，一個或多個，如一個或數個胺基酸取代)。例如，發生隨機突變後，該的抗體或其抗原結合片段或變體的輕鏈可包含包含選自下組所示的胺基酸序列中的任一項：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20；和/或該的抗體或其抗原結合片段或變體的重鏈可包含選自下組所示的胺基酸序列中的任一項：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21。發生隨機突變後的CD38抗體或其抗原結合片段或變體，仍具有特異性結合人CD38蛋白的能力。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈的胺基酸序列包括SEQ ID NO：11；並且其重鏈的胺基酸序列包括SEQ ID NO：13；或者本申請所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈的胺基酸序列包括SEQ ID NO：16；並且其重鏈的胺基酸序列包括SEQ ID NO：17；或者，本申請所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈的胺基酸序列包括SEQ ID NO：18；並且其重鏈的胺基酸序列包括SEQ ID NO：19；或者，本申請所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈的胺基酸序列包括SEQ ID NO：20；並且其重鏈的胺基酸序列包括SEQ ID NO：21。
特異性結合AXL的第一結合域
本申請所述的抗體或其抗原結合片段或變體，可藉由與AXL特異性結合而殺傷腫瘤細胞和/或抑制腫瘤生長。例如，該AXL可以為人AXL。
本申請所述的抗體、其抗原結合片段或變體，可以與對照抗體競爭結合該AXL蛋白。該對照抗體可以包含輕鏈可變區和重鏈可變區。例如，該對照抗體的輕鏈可變區可包含LCDR1-3，該LCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。該對照抗體的重鏈可變區可包含HCDR1-3，該HCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。
例如，該對照抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：28，且該對照抗體的重鏈可變區的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：29。又例如，該對照抗體的輕鏈的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：32；且該對照抗體的重鏈的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：34。
本申請所述的抗體、其抗原結合片段或變體可包含抗體輕鏈或其片段。例如，該抗體輕鏈或其片段可包括Ig κ恆定區，例如可包含人Ig κ恆定區。
例如，該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR1，且該LCDR1可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：22。該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR2，且該LCDR2可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：23。該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR3，且該LCDR3可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：24。
本申請所述抗體的輕鏈或其片段可包含輕鏈可變區VL，且該輕鏈可變區VL的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：28。在某些實施方式中，該抗體輕鏈或其片段的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：32。
本申請所述的抗體或其抗原結合片段可包含抗體重鏈或其片段。例如，該抗體重鏈或其片段還包含人恆定區。其中，該人恆定區可包括人IgG恆定區。其中，該IgG恆定區可包含人IgG1恆定區或IgG4。
例如，該抗體重鏈或其片段可包含HCDR1，且該HCDR1可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：25。該抗體重鏈或其片段可包含HCDR2，且該HCDR2可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：26。又例如，該抗體重鏈或其片段可包含HCDR3，且該HCDR3可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：27。
該抗體重鏈或其片段可包含重鏈可變區VH，且該重鏈可變區VH的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：29。在某些實施方式中，該抗體重鏈或其片段的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：34。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段中LCDR1的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：22或其變體；LCDR2的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：23或其變體；LCDR3的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：24或其變體；且HCDR1的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：25或其變體；HCDR2的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：26或其變體；HCDR3的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：27或其變體。例如，該抗體或其抗原結合片段可包括抗體C6G12或與其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗體。在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：28或其變體；且其中重鏈可包含重鏈可變區，該重鏈可變區的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：29或其變體。例如，該抗體或其抗原結合片段可包括抗體C6G12或與其具有相同的輕鏈可變區及重鏈可變區的抗體。在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段可包含輕鏈和重鏈，該輕鏈的輕鏈胺基酸 序列如SEQ ID NO：32所示且該重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：34所示。例如，該抗體或其抗原結合片段可包括抗體C6G12或與其具有相同的輕鏈及重鏈胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體可以為C6G12。抗體C6G12的LCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示；VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：28所示；HCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示；VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：29所示；輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：32所示；重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：34所示。
特異性結合Trop2的第一結合域
本申請所述的抗體或其抗原結合片段或變體，可藉由與Trop2特異性結合而殺傷腫瘤細胞和/或抑制腫瘤生長。例如，該Trop2可以為人Trop2。
本申請所述的抗體、其抗原結合片段或變體，可以與對照抗體競爭結合該Trop2蛋白。該對照抗體可以包含輕鏈可變區和重鏈可變區。例如，該對照抗體的輕鏈可變區可包含LCDR1-3，該LCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38。該對照抗體的重鏈可變區可包含HCDR1-3，該HCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41。
例如，該對照抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：42，且該對照抗體的重鏈可變區的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：43。又例如，該對照抗體的輕鏈可包的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：46；且該對照抗體的重鏈的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：48。例如，該對照抗 體的輕鏈可包含如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列，且該對照抗體的重鏈可包含如SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列。
本申請所述的抗體、其抗原結合片段或變體可包含抗體輕鏈或其片段。例如，該抗體輕鏈或其片段可包括Ig κ恆定區，例如可包含人Ig κ恆定區。
例如，該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR1，且該LCDR1可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：36。該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR2，且該LCDR2可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：37。該抗體輕鏈或其片段可包含LCDR3，且該LCDR3可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：38。
本申請所述抗體的輕鏈或其片段可包含輕鏈可變區VL，且該輕鏈可變區VL可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：42。在某些實施方式中，該抗體輕鏈或其片段的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：46。
本申請所述的抗體或其抗原結合片段可包含抗體重鏈或其片段。例如，該抗體重鏈或其片段還包含人恆定區。其中，該人恆定區可包括人IgG恆定區。其中，該IgG恆定區可包含人IgG1恆定區或IgG4。
例如，該抗體重鏈或其片段可包含HCDR1，且該HCDR1可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：39。該抗體重鏈或其片段可包含HCDR2，且該HCDR2可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：40。又例如，該抗體重鏈或其片段可包含HCDR3，且該HCDR3可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：41。
該抗體重鏈或其片段可包含重鏈可變區VH，且該重鏈可變區VH可包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：43。在某些實施方式中，該抗體重鏈或其片段的胺基酸序列可以為：SEQ ID NO：48。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段中LCDR1的胺基酸序列可包括SEQ ID NQ：36或其變體；LCDR2的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：37或其變體；LCDR3的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：38或其變體；且HCDR1的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：39或其變體；HCDR2的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：40或其變體；HCDR3的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：41或其變體。例如，該抗體或其抗原結合片段可包括抗體SG701或與其具有相同的LCDR1-3及HCDR1-3的抗體。在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：42或其變體；且其中重鏈可包含重鏈可變區，該重鏈可變區的胺基酸序列可包括SEQ ID NO：43或其變體。例如，該抗體或其抗原結合片段可包括抗體SG701或與其具有相同的輕鏈可變區及重鏈可變區的抗體。在某些實施方式中，本申請所述的抗體或其抗原結合片段可包含輕鏈和重鏈，該輕鏈的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：46所示且該重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：48所示。例如，該抗體或其抗原結合片段可包括抗體SG701或與其具有相同的輕鏈及重鏈胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請所述的抗體可以為SG701。抗體SG701的LCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示；VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：42所示；HCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示；VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：43所示；輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：46所示；重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：48所示。
第一結合域和第二結合域的連接
在本申請中，該第一結合域可以位於該第二結合域的N端。例如，該第一結合域的C端可以藉由連接子間接連接於該第二結合域的N端。在某些情形中，該第一結合域的C端也可以直接(例如，在框內)連接於第二結合域的N端。
在本申請中，該融合蛋白還可以包含連接子，該連接子可以位於該第一結合域的C端且位於該第二結合域的N端。例如，在該融合蛋白中，第一結合域的C端可以連接連接子的N端，連接子的C端可以連接第二結合域的N端。例如，在該融合蛋白中，從N端到C端，可以依次包含第一結合域、連接子和第二結合域。
在本申請中，該連接子可以包含如SEQ ID NO：73-74中任一項所示的胺基酸序列。
在某些情形中，該融合蛋白可以包含至少2個(例如，至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、或更多)該第二結合域。在本申請中，該每個該第二結合域可以分別位於該第一結合域的C端。在本申請中，該2個以上的第二結合域可以分別直接或間接連接於該第一結合域的C端。
在本申請中，該融合蛋白可以包含特異性結合CD38抗原的第一結合域，以及特異性結合CD47蛋白的第二結合域，其中該第一結合域可以包含特異性結合CD38抗原的抗體或其抗原結合片段或變體，第二結合域可以包含人SIRP α變體1的突變體，特異性結合CD38抗原的抗體或其抗原結合片段或變體的C端可以直接或者間接連接人SIRP α變體1的突變體的N端。例如，該第二結合域可以包含至少2個人SIRP α變體1的突變體，且2個人SIRP α變體1的突變體的N端分別連接特異性結合CD38抗原的抗體或其抗原結合片段或變體的C端。
例如，如第1圖所示，該融合蛋白(SG3847L1)的第一結合域可以包含SG003，第二結合域可以包含2個SIRP α變體1的突變體M91，採用的連接子1的序列如SEQ ID NO：73所示，2個M91的N端分別藉由連接子1連接於SG003的2條重鏈的C端，在該融合蛋白中，M91連接SG003重鏈的C端可以得到第二多肽鏈，SG003的輕鏈可以命名為第一多肽鏈。SG3847L1的該第二多肽鏈和該第一多肽鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：11所示。
例如，如第1圖所示，該融合蛋白(SG3847L2)的第一結合域可以包含SG003，第二結合域可以包含2個SIRP α變體1的突變體M91，採用的連接子2的序列如SEQ ID NO：74所示，2個M91的N端分別藉由連接子2連接於SG003的2條重鏈的C端，在該融合蛋白中，M91連接SG003重鏈的C端可以得到第二多肽鏈，SG003的輕鏈可以命名為第一多肽鏈。SG3847L2的該第二多肽鏈和該第一多肽鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：11所示。
在本申請中，該融合蛋白可以包含特異性結合Trop2抗原的第一結合域，以及特異性結合CD47蛋白的第二結合域，其中該第一結合域可以包含特異性結合Trop2抗原的抗體或其抗原結合片段或變體，第二結合域可以包含人SIRP α變體1的突變體，特異性結合Trop2抗原的抗體或其抗原結合片段或變體的C端可以直接或者間接連接人SIRP α變體1的突變體的N端。在本申請中，該第二結合域可以包含至少2個人SIRP α變體1的突變體，且2個人SIRP α變體1的突變體的N端分別連接特異性結合AXL抗原的抗體或其抗原結合片段或變體的C端。
例如，如第1圖所示，該融合蛋白(SGTrop247)的第一結合域可以包含抗體SG701，第二結合域可以包含2個SIRP α變體1的突 變體M91，採用的連接子的序列如SEQ ID NO：74所示，2個M91的N端分別藉由連接子連接於SG701的2條重鏈的C端，在該融合蛋白中，M91連接SG701重鏈的C端可以得到第二多肽鏈，SG701的輕鏈可以命名為第一多肽鏈。SGTrop247的該第二多肽鏈和該第一多肽鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：46所示。
在本申請中，該融合蛋白可以包含特異性結合AXL抗原的第一結合域，以及特異性結合CD47蛋白的第二結合域，其中該第一結合域可以包含特異性結合AXL抗原的抗體或其抗原結合片段或變體，第二結合域可以包含人SIRP α變體1的突變體，特異性結合AXL抗原的抗體或其抗原結合片段或變體的C端可以直接或者間接連接人SIRP α變體1的突變體的N端。在本申請中，該第二結合域可以包含至少2個人SIRP α變體1的突變體，且2個人SIRP α變體1的突變體的N端分別連接特異性結合AXL抗原的抗體或其抗原結合片段或變體的C端。
例如，如第1圖所示，該融合蛋白(SGAXL47)的第一結合域可以包含抗體C6G12，第二結合域可以包含2個SIRP α變體1的突變體M91，採用的連接子的序列如SEQ ID NO：74所示，2個M91的N端分別藉由連接子連接於C6G12的2條重鏈的C端，在該融合蛋白中，M91連接C6G12重鏈的C端可以得到第二多肽鏈，C6G12的輕鏈可以命名為第一多肽鏈。SGAXL47的該第二多肽鏈和該第一多肽鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：32所示。
核酸分子、載體和細胞及製備方法
另一方面，本申請提供一個或多個分離的核酸分子，其編碼該的融合蛋白或者該的免疫綴合物。例如，該一種或多種核酸分子中的每一個核酸分子可以編碼完整的該抗體或其抗原結合片段，也可以編碼其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、輕鏈或重鏈中的一種或多種)。
本申請所述的核酸分子可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的，(ii)藉由選殖重組產生的，(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。
重組DNA和分子選殖技術包括由Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor,(1989)(Maniatis)和由T.J.Silhavy,M.L.Bennan和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1984)以及由Ausubel,F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology,pub.by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)描述的那些技術。簡而言之，可從基因組DNA片段、cDNA和RNA製備該核酸，所有這些核酸可直接從細胞中提取或藉由各種擴增方法(包括但不限於PCR和RT-PCR)重組產生。
核酸的直接化學合成通常涉及將3'-封閉的和5'-封閉的核苷酸單體依次添加至生長中的核苷酸聚合物鏈的末端5'-羥基，其中每次添加 藉由親核攻擊所添加的單體的3'-位上的生長鏈的末端5'-羥基來實現，該單體通常是磷衍生物，諸如磷酸三酯、亞磷醯胺等。參見，例如，Matteuci等，Tet.Lett.521：719(1980)；屬於Caruthers等的美國專利第4,500,707號；和屬於Southern等的美國專利第5,436,327號和第5,700,637號；在另一方面，本申請提供了包含本申請的分離的多核苷酸的載體。該載體可以是任何線性核酸、質粒、噬菌粒、黏粒、RNA載體、病毒載體等。病毒載體的非限制性實例可包括逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒。在一些實施方案中，該載體是表達載體，例如，噬菌體展示載體。
另一方面，本申請提供一個或多個載體，其包含該核酸分子。例如，該載體可以包含本申請該的一種或多種核酸分子。每種載體中可包含一種或多種該核酸分子。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為本領域技術人員所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。在某些實施方式中，該表達控制序列為可調的元件。該表達控制序列的具體結構可根據物種或細胞類型的功能而變化，但通常包含分別參與轉錄和翻譯起始的5’非轉錄序列和5’及3’非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非轉錄表達控制序列可包含啟動子區，啟動子區可包含用於轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。該表達控制序列還可包括增強子序列或上游活化子序列。在本申請中，適當的啟動子可包括，例如用於SP6、T3和T7聚合酶的啟動子、人U6RNA啟動子、CMV啟動 子及其人工雜合啟動子(如CMV)，其中啟動子的某部分可與其他細胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因啟動子的某部分融合，其可包含或不包含另外的內含子。本申請所述的一種或多種核酸分子可以與該表達控制元件可操作地連接。
該載體可以包括，例如質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。在某些實施方式中，該載體可以為表達載體。
該載體還可含有一個或多個選擇標記基因，其在表達後賦予可用於選擇或以其它方式鑒定攜帶載體的宿主細胞的一個或多個表型性狀。用於真核細胞的合適的選擇標記的非限制性實例包括二氫葉酸還原酶和新黴素抗性。
另一方面，本申請提供一種細胞，該細胞包含該融合蛋白，該免疫綴合物，該核酸分子，或該載體。該細胞可以是宿主細胞。例如，該細胞可以包括如下許多細胞類型，如大腸桿菌或枯草菌等原核細胞，如酵母細胞或曲黴菌等真菌細胞，如S2果蠅細胞或Sf9等昆蟲細胞，或者如纖維原細胞，CHO細胞，COS細胞，NSO細胞，HeLa細胞，BHK細胞，HEK 293細胞或人細胞的動物細胞。
例如，可藉由多種已建立的技術將該載體穩定地或瞬時引入宿主細胞。例如，一種方法涉及氯化鈣處理，其中藉由鈣沉澱引入載體。也可以按照類似方法使用其它鹽，例如磷酸鈣。另外，可以用電穿孔(即，施加電流以增加細胞對核酸的滲透性)。轉化方法的其它實例包括顯微注 射、DEAE葡聚糖介導的轉化和在乙酸鋰存在下的熱休克。脂質複合物、脂質體和樹狀聚合物也可用於轉染宿主細胞。
在將異源序列引入宿主細胞中時，可實施多種方法來鑒定已向其中引入了載體的宿主細胞。一種示例性選擇方法包括將單個細胞繼代培養以形成單個菌落，然後測試所需蛋白質產物的表達。另一種方法需要基於藉由載體內包含的選擇標記基因的表達賦予的表型性狀選擇含有異源序列的宿主細胞。
例如，將本申請的各種異源序列引入宿主細胞可藉由方法諸如PCR、Southern印跡或Northern印跡雜交來確認。例如，可從所得宿主細胞製備核酸，並且可使用對目標序列是特異的引物，藉由PCR擴增特定目標序列。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯醯胺凝膠電泳或毛細管電泳，然後用溴化乙錠、SYBR Green溶液等染色，或用UV檢測來檢測DNA。或者，可在雜交反應中使用對目標序列是特異的核酸探針。特定基因序列的表達可以藉由與PCR、Northern印跡雜交或藉由使用與編碼的基因產物反應的抗體的免疫測定的反轉錄檢測相應的mRNA來確定。示例性免疫測定包括但不限於ELISA、放射免疫測定和夾心免疫測定。
此外，將本申請的各種異源序列引入宿主細胞可以藉由異源序列編碼的酶(例如，酶促標誌物)的酶促活性來確認實。可藉由本領域已知的多種方法測定酶。通常，酶促活性可藉由產物的形成或正在研究的酶促反應的受質的轉化來確定。該反應可在體外或體內進行。
另一方面，本申請提供一種製備該的融合蛋白的方法，其可以包括在使得該融合蛋白能夠表達的條件下培養該細胞。例如，可藉由使 用適當的培養基、適當的溫度和培養時間等，這些方法是本領域普通技術人員所瞭解的。
在某些情形中，該方法還可包括分離和/或純化該融合蛋白的步驟。例如，可以採用蛋白G-瓊脂糖或蛋白A-瓊脂糖進行親和層析，還可藉由凝膠電泳和/或高效液相色譜等來純化和分離本申請所述的融合蛋白。
免疫綴合物、組成物和應用
另一方面，本申請提供一種免疫綴合物，其包含該融合蛋白。例如，該免疫綴合物可以為融合蛋白-藥物綴合物(ADC)，其中本申請所述的融合蛋白與一種或多種治療劑綴合，該治療劑包括但不限於細胞毒性劑、放射性毒性劑(例如，放射性同位素)和/或免疫抑制劑(例如，藉由抑制免疫應答等途徑殺傷細胞的任何藥劑)等。在某些實施方式中，該治療劑可以為能夠治療腫瘤相關的疾病或病症的治療劑。
該綴合可藉由肽連接子(例如，可切割連接子)或其它方式進行，例如，該連接子可以為酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定連接子等。
另一方面，本申請提供一種組成物，該組成物包含該融合蛋白，該免疫綴合物，或該核酸分子，以及視需要地藥學上可接受的賦形劑。
例如，該藥學上可接受的賦形劑可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金屬複合物和/或非離子表面活性劑等。
在本申請中，可按照本領域的常規技術手段將該組成物與藥學上可接受的載體或稀釋劑以及任何其他已知的輔劑和賦形劑配製在一起，例如按照Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第十九版，Gennaro編輯，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1995中公開的技術進行操作。
在本申請中，該組成物可被配製用於口服給藥，靜脈內給藥，肌肉內給藥，在腫瘤部位的原位給藥，吸入，直腸給藥，陰道給藥，經皮給藥或藉由皮下儲存庫給藥。
例如，該組成物可以用於抑制腫瘤生長。例如，本申請的組成物可以抑制或延緩疾病的發展或進展，可以減小腫瘤大小(甚至基本消除腫瘤)，和/或可以減輕和/或穩定疾病狀態。
例如，本申請所述的組成物可以為適於口服給藥的形式，如片劑，膠囊劑，丸劑，粉劑，緩釋製劑，溶液劑，混懸劑，或者用於腸胃外注射，如無菌溶液劑，混懸劑或乳劑，或者用於軟膏或乳膏局部給藥或作為栓劑直腸給藥。該組成物可以是適合精確劑量單次給藥的單位劑量形式。該組成物可以進一步包含常規的藥物載體或賦形劑。此外，該組成物可以包括其他藥物或藥劑，載體，佐劑等。
本申請所述的組成物可以包含治療有效量的該融合蛋白。該治療有效量是能夠預防和/或治療(至少部分治療)患有或具有發展風險的受試者中的病症或病症(例如腫瘤)和/或其任何併發症而所需的劑量。該劑量的具體量/濃度可以根據施用方法和患者需要而變化，並且可以基於例如患者體積，黏度和/或體重等來確定。例如，合適的劑量可以是約0.1mg 或1mg/kg/天至約50mg/kg/天；有時，劑量可能會更高。應當理解的是，基於特定患者，製劑和/或疾病的狀況，本領域技術人員(例如，醫生或藥劑師)可以方便地調整這些特定劑量。
在本申請中，術語“治療”或“醫治”或“緩解”或“改善”在本申請中可互換使用，並且是指獲得有益或所需的結果(包括但不限於治療益處和/或預防益處)的方法。在本申請中，治療益處通常是指根除或減輕所治療的潛在病症的嚴重性。此外，藉由根除、減輕嚴重性或減少與潛在病症相關的一種或多種生理症狀的發生率，以使得在受試者中觀察到改善(儘管受試者仍然可能受到潛在病症折磨)來實現治療益處。對於預防益處，可向處於發展特定疾病的風險中的受試者，或報告疾病的一種或多種生理症狀的受試者施用組成物，即使可能尚未進行該疾病的診斷。
另一方面，本申請提供了該合蛋白，該免疫綴合物，該酸分子，該體，該組成物，或該細胞在製備藥物中的用途，其中該藥物可以用於治療腫瘤或自體免疫疾病。
另一方面，本申請所述的融合蛋白、免疫綴合物、核酸分子、載體、組成物或細胞可以用於治療該腫瘤或自體免疫疾病。
另一方面，本申請提供了治療腫瘤或自體免疫疾病的方法，該方法包括向受試者施用本申請所述的融合蛋白、免疫綴合物、核酸分子、載體、組成物或細胞。
另一方面，本申請提供了一種阻斷CD47蛋白與SIRP α相互作用的方法，該方法可包括施用(例如，向有需要的受試者或細胞或生物學樣品施用)本申請所述的融合蛋白或組成物。
另一方面，本申請提供了一種抑制腫瘤或腫瘤細胞生長和/或增殖的方法，該方法可包括使本申請所述的融合蛋白或組成物與該腫瘤或腫瘤細胞接觸。例如，該接觸可在體外發生。
在某些實施方式中，該腫瘤可以包括非實體瘤和實體瘤。
在某些實施方式中，該腫瘤可以包括多發性骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、神經膠質瘤、生殖細胞瘤、肉瘤、間皮瘤、胎盤瘤、腦癌、骨癌、皮膚癌、鼻咽癌、肺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、腸癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌和舉丸癌。
在某些實施方式中，該自體免疫疾病可以包括慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進、胰島素依賴型糖尿病、重症肌無力、慢性潰瘍性結腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血腎炎綜合症(goodpasture syndrome)、尋常天皰瘡、類天皰瘡、原發性膽汁性肝硬變、多發性腦脊髓硬化症、急性特發性多神經炎、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、硬皮病和結節性多動脈炎。
另一方面，本申請提供了該融合蛋白，該免疫綴合物，該酸分子，該載體，該組成物，或該細胞，其可以治療腫瘤或自體免疫疾病。
另一方面，本申請提供了一種可以阻斷CD47蛋白與SIRP α相互作用的方法，其可以包括向有需要的受試者施用有效量的該合蛋白，該免疫綴合物，該核酸分子，該載體，該組成物，或該細胞。
在本申請中，術語“受試者”通常是指人或非人動物，包括但不限於貓、狗、馬、豬、牛、綿羊、山羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
另一方面，本申請提供了一種可以抑制腫瘤或腫瘤細胞生長和/或增殖的方法，其可以包括向有需要的受試者施用有效量的該合蛋白，該免疫綴合物，該酸分子，該體，該組成物，或該細胞。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的融合蛋白、製備方法和用途等，而不用於限制本申請發明的範圍。
實施例
實施例1.不同連接子選擇對活性的影響
1.1 採用不同連接子製備融合蛋白
參照如第1圖所示的融合蛋白結構，以抗CD38人源化抗體SG003、SIRP α變體1的突變體M91(SEQ ID：NO 62)為例，從N端到C端，選用不同的連接子，依次連接SG003、連接子和2個M91，其中2個M91的N端分別和SG003的重鏈的C端連接，研究不同的連接子對融合蛋白生物學活性的影響。
抗體SG003的LCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示；編碼VL的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；抗體SG003的HCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示；編碼VH的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。抗體SG003的輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示；編碼其的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。抗體SG003的重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示；編碼其的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。
選擇連接子1(SEQ ID：NO 73)，構建的融合蛋白命名為SG3847L1，該SG3847L1由第一多肽鏈和第二多肽鏈構成，第一多肽鏈即SG003的輕鏈，其胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示，第二多肽鏈即SG003的重鏈和M91藉由連接子1連接得到的多肽鏈，其胺基酸序列如SEQ ID NO：75所示。
選擇連接子2(SEQ ID：NO 74)，構建的融合蛋白命名為SG3847L2，該SG3847L2由第一多肽鏈和第二多肽鏈構成，第一多肽鏈即SG003的輕鏈，其胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示，第二多肽鏈即SG003的重鏈和M91藉由連接子2連接得到的多肽鏈，其胺基酸序列如SEQ ID NO：76所示。
1.2 分別與雙抗原的結合活性分析
(1)以SG003為對照，ELISA評價融合蛋白和CD38結合活性。
將靶抗原CD38-His(1μg/ml)包被ELISA板條，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；加入不同濃度的SG003抗體、SG3847L1或SG3847L2融合蛋白，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG二抗(Goat Anti human IgG HRP，Thermo Fisher Scientific)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次；每孔加入100μl TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1~2min；隨後每孔加入100μl 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析融合蛋白與靶抗原CD38結合能力。
如第2圖所示，SG3847L1、SG3847L2和SG003抗體相比，與靶抗原CD38的結合力相似，SG3847L1、SG3847L2和SG003的EC50值分別為0.175nM、0.149nM和0.133nM。
(2)以SS002M91為對照，ELISA評價融合蛋白和CD47結合活性。
將M91和IgG1-FC(序列如SEQ ID NO：71所示)融合得到SS002M91，SS002M91胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示。
將靶抗原CD47-His(1μg/ml)包被ELISA板條，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；加入不同濃度的SS002M91、SG3847L1或SG3847L2，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG二抗(Goat Anti human IgG HRP，Thermo Fisher Scientific)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次；每孔加入100μl TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1~2min；隨後每孔加入100μl 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析融合蛋白與靶抗原CD47結合能力。
如第3圖所示，SG3847L1、SG3847L2和SS002M91相比，與靶抗原CD47的結合力相似，SG3847L1、SG3847L2和SS002M91的EC50值分別為0.114nM，0.091nM和0.072nM。
(3)分別以SG003和SS002M91為對照，評價融合蛋白分別與CD38和CD47抗原的結合活性。
使用經工程改造以表達人CD38或人CD47的CHO-S細胞系評價融合蛋白結合細胞表面抗原的能力。收集對數生長期細胞，調整細胞密度到5×106個細胞/mL，冰上預冷。含2%FBS預冷的生理鹽水將SG003、SS002M91、陰性對照抗體(IgG1)、SG3847L1或SG3847L2稀釋成不同濃度。
取100μl細胞，加入等體積前述稀釋抗體或融合蛋白，4℃避光反應30min。結束後，洗滌細胞兩次。用稀釋的PE標記山羊抗人IgG-Fc二抗(PE-Goat anti-human IgG Fc Secondary Antibody，eBioscience)100μL重懸細胞，4℃避光反應30min。反應結束後，洗滌細胞兩次。用400μl 1%多聚甲醛重懸細胞。流式細胞儀(BD Calibur)分析融合蛋白與細胞表面CD38或CD47的結合能力。
如第4A圖和第4B圖所示，“1”、“2、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”和“9”分別是指20μ gml-1 IgG1、20μ gml-1SG003、20μ gml-1 SS002M91、20μ gml-1 SG3847L1、10μ gml-1 SG3847L1、5μ gml-1 SG3847L1、20μ gml-1 SG3847L2、10μ gml-1 SG3847L2和5μ gml-1 SG3847L2。結果顯示，融合蛋白SG3847L1和SG3847L2能特異性識別細胞表面表達的CD38或CD47抗原。
1.3 與兩個抗原同時結合的活性分析
(1)參考第5圖的原理，以抗CD38人源化抗體SG003為對照，ELISA分析融合蛋白SG3847L1和SG3847L2同時結合兩抗原CD38和CD47的生物學活性。
將靶抗原CD38-His(1μg/ml)包被ELISA板條，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；加入不同濃度的SG003抗體、SG3847L1或SG3847L2融合蛋白，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入生物素標記CD47(Biotin-Fc-CD47)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次；加入辣根過氧化物酶標記的親和素(Streptavidin-HRP嘉暄生物)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次；每孔加入100μl TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1~2min；隨後每孔加入100μl 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析融合蛋白與靶抗原CD38、CD47同時結合的能力。
如第6圖所示，融合蛋白SG3847L1、SG3847L2和SG003抗體相比，可與靶抗原CD38和CD47同時結合，SG3847L1和SG3847L2的EC50值分別為0.020nM和0.024nM。
(2)參考第7圖的原理，以SG003和SS002M91為對照，評價融合蛋白SG3847L1、SG3847L2同時結合細胞表面兩抗原CD38和CD47的生物學活性。
使用經工程改造以表達人CD38的CHO-S細胞系評價融合蛋白同時結合細胞表面雙抗原的能力。收集對數生長期細胞，調整細胞密度到5×106個細胞/mL，冰上預冷。含2%FBS預冷的生理鹽水將SG003抗體、SS002M91融合蛋白、陰性對照抗體(IgG1)、SG3847L1或SG3847L2稀釋。取100μl細胞，加入等體積前述稀釋抗體或融合蛋白及CD47-FITC(嘉暄生物)，4℃避光反應30min。結束後，洗滌細胞兩次。用稀釋的PE標記山羊抗人IgG-Fc二抗(PE-Goat anti-human IgG Fc Secondary Antibody，eBioscience)即Fc-PE 100μL重懸細胞，4℃避光反應30min。反應結束後，洗滌細胞兩次。用400μl 1%多聚甲醛重懸細胞。流式細胞儀(BD Calibur)分析融合蛋白與細胞表面CD38和CD47同時結合的能力。
如第8圖所示，融合蛋白SG3847L1、SG3847L2能同時識別細胞表面的CD38和CD47抗原，並且SG3847L2同時識別雙抗原的能力更高。
1.4 殺傷CD38陽性細胞的ADCC活性分析
首先將實驗所需靶細胞(Raji細胞)調整密度至2×105個細胞/mL重懸在ADCC緩衝液(無酚紅MEM培養液+1%FBS)中，並加入96孔板(50μL/孔)。隨後向每孔中加入100μL不同濃度的SG003、SG3847L1和SG3847L2，混勻後在37℃，5%CO2培養箱中孵育30min。再將實驗所需效應細胞NK92MI-CD16a(華博生物)調整密度至1.2×106個細胞/mL，加入有靶細胞的孔中，使得靶細胞：效應細胞=1：6。混勻後在37℃，5%CO2培養箱中孵育6h後，去掉96孔板內原液100μL/孔，加入LDH檢測試劑盒(Cytotoxicity Detection Kit，Roche)中LDH反應混合物100μL/孔，37℃反應10min。再加入終止液50μL/孔，輕微混勻。酶標儀測定OD492nm，同時測定OD650nm作為背景值。實驗中同時設置如下對照組，其中對照1為ADCC緩衝液，對照2為靶細胞+ADCC緩衝液，對照3為靶細胞+裂解液+ADCC緩衝液，對照4為靶細胞+效應細胞+ADCC緩衝液。特異性殺傷率%=((實驗組-對照4)/(對照3-對照2))×100%。量效曲線採用GraphPad Prism Version 5進行數據分析。
如第9圖所示，使用Raji靶細胞和NK92MI-CD16a效應細胞檢測時，融合蛋白SG3847L1、SG3847L2顯示出了更好的ADCC作用。SG003、SG3847L1和SG3847L2的EC50值分別為0.067nM、0.014nM和0.013nM。
1.5 阻斷CD47蛋白與SIRPa相互作用活性分析
以SS002M91為對照，評價融合蛋白SG3847L1、SG3847L2阻斷CD47蛋白與SIRPa相互作用的生物學活性。
將SIRP α-His包被酶聯板，1μg/ml，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；使用10%的胎牛血分別梯度稀釋SS002M91、SG3847L1或SG3847L2，並在樣品中加入Biotin-Fc-CD47至終濃度2μg/ml，37℃預孵育30min，作為一抗；PBST洗滌酶聯板後，加入一抗，37℃孵育1小時；PBST洗5遍，加入辣根過氧化物酶標記的親和素(Streptavidin-HRP，嘉暄生物)，37℃孵育30分鐘；PBST洗5遍，每孔加入100μl TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1-5min；每孔加入100μl 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析SS002M91、SG3847L1、SG3847L2對CD47/SIRP α的阻斷作用。
從第10圖中可以看出，SG3847L1、SG3847L2與SS002M91一樣，可以競爭性阻斷CD47與其配體SIRP α的結合。SG3847L1的IC50值為46.8nM，SG3847L2的IC50值為78.8nM，SS002M91的IC50值為45.7nM。
實施例2 採用不同靶點抗體與人SIRP α變體1的突變體組合
參照如第1圖的融合蛋白結構以及實施例1的結果，選用抗AXL抗體(C6G12)和抗Trop2(SG701)抗體為例，研究不同靶點抗體融合蛋白生物學活性的影響，採用的連接子為連接子2。
抗體C6G12的LCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示；VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：28所示；HCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示；VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：29所示；輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：32所示；重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：34所示。
抗體SG701的LCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示；VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：42所示；HCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示；VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：43所示；輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：46所示；重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：48所示。
以抗AXL抗體(C6G12)、SIRP α變體1的突變體M91和連接子2(SEQ ID：NO 74)製備融合蛋白，從N端到C端，依次連接C6G12、連接子和2個M91其中2個M91的N端分別和C6G12的重鏈的C端連接，得到的融合蛋白命名為SGAXL47。SGAXL47的該第二多肽鏈和該第一多肽鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：32所示。
以抗Trop抗體(SG701)、SIRP α變體1的突變體M91和連接子2(SEQ ID：NO 74)製備融合蛋白，從N端到C端，依次連接SG701、連接子和2個M91，其中2個M91的N端分別和SG701的重鏈的C端連接，得到的融合蛋白命名為SGTrop247。SGTrop247的該第二 多肽鏈和該第一多肽鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：46所示。
採用常規分子生物學技術，將SGAXL47和SGTrop247融合蛋白的表達基因構建真核表達載體，轉染CHO-S細胞後，收穫上清，經過Protein A親和純化，獲得目的蛋白，合理評價其生物學活性。
2.1 與雙抗原結合的活性分析
(1)以抗不同抗原的人源化抗體為對照，ELISA評價相應融合蛋白和相關抗原的結合活性。
將靶抗原包被ELISA板條，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；加入不同濃度的抗體或融合蛋白，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG二抗(Goat Anti human IgG HRP，Thermo Fisher Scientific)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次；每孔加入100μl TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1~2min；隨後每孔加入100μl 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析融合蛋白與相關靶抗原結合能力。
如第11A圖所示，SGAXL47和C6G12相比，對AXL抗原的結合能力接近。如第11B圖所示，SGTrop247和SG701相比，對Trop2抗原的結合能力接近。說明在融合蛋白中採用不同靶點的抗體，並不影響該抗體與Trop2抗原的結合力。
(2)以SS002M91為對照，ELISA評價融合蛋白和CD47的結合活性。
將靶抗原CD47包被ELISA板條，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；加入不同濃度的融合蛋白SS002M91或融合蛋白，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG二抗(Goat Anti human IgG HRP，Thermo Fisher Scientific)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次；每孔加入100μl TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1~2min；隨後每孔加入100μl 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析融合蛋白與CD47結合能力。
如第12A圖所示，SGAXL47和SS002M91相比，對CD47抗原的結合能力接近。如第12B圖所示，SGTrop247和SS002M91相比，對CD47抗原的結合能力接近。說明在融合蛋白中採用不同靶點的抗體，並不影響該抗體與其CD47抗原的結合力。
2.2.同時結合兩個抗原的活性分析
以抗不同抗原的人源化抗體為對照，ELISA分析融合蛋白同時結合雙抗原的生物學活性。
將靶抗原包被ELISA板條，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；加入不同濃度的抗體或融合蛋白，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入生物素標記CD47(Biotin-Fc-CD47)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次；加入辣根過氧化物酶標記的親和素(Streptavidin-HRP，嘉暄生物)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次；每孔加入100μl TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1~2min；隨後每孔加入100μl 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析融合蛋白與相關抗原和CD47同時結合的能力。
第13A圖顯示，SGAXL47和C6G12分別對AXL和CD47雙抗原的結合情況，第13B圖顯示，SGTrop247和SS002M91分別對Trop2和CD47雙抗原的結合情況。第13圖結果顯示融合蛋白替換不同抗體，並不影響其與雙抗原同時結合。
實施例3 融合蛋白體內抑制腫瘤活性
CB17 SCID小鼠尾靜脈接種Raji-Luc細胞建立腫瘤模型，評價融合蛋白SG3847L1抑制腫瘤活性的效果。
選擇雌性，5~8週齡的CB17 SCID小鼠(購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司)進行試驗。Raji-Luc細胞為北京百奧賽圖基因生物技術有限公司在Raji細胞的基礎上，轉入熒光素報告基因後獲得的穩定細胞系。Raji-Luc細胞復蘇培養至所需數量後，收集對數期生長細胞懸浮至2.5×107個/mL濃度，以0.2mL/隻的數量藉由尾靜脈接種CB17 SCID小鼠，接種後於第0天、第7天用小動物成像儀觀察腫瘤生長情況及體重，並於第7天挑選腫瘤成像信號適中的30隻小鼠，隨機分配到5個組中，每組6隻。然後開始對動物進行給藥1次，設生理鹽水對照組、實驗組(SG003，100ug/kg)、實驗組(SS002M91,50ug/kg)、聯合給藥組(SG003+SS002M91,100ug/kg+50ug/kg)、實驗組(SG3847L1,120ug/kg)，觀察小鼠體重、腫瘤生長情況。
結果顯示，SG003抗體、SS002M91融合蛋白以及SG3847L1融合蛋白均可為實驗動物所耐受。各組給藥動物和生理鹽水對照組比較，有明顯腫瘤生長抑制效果(參見第14圖)；從第15圖可以看出，給藥後第七天，SG003抗體治療組、SS002M91融合蛋白治療組、SG003抗體和 SS002M91融合蛋白聯合給藥治療組以及SG3847L1融合蛋白治療組的平均熒光強度分別為1.60E+07(標準誤：1.02E+07)、2.42E+07(標準誤：6.70E+06)、4.61E+06(標準誤：7.57E+05)、5.97E+05(標準誤：1.10E+05)，均顯著低於對照組平均熒光強度8.04E+08(標準誤1.15E+08)。同時SG3847L1融合蛋白治療組對腫瘤生長抑制效果顯著優於SG003抗體和SS002M91融合蛋白聯合用藥組。
此外，從第16圖可以看出，其中圖中“G1生理鹽水”、“G2 SG003”、“G3 SS002M91”、“G4 SG003+SS002M91”和“G5 SG3847L1”分別表示“生理鹽水組”、“SG003抗體治療組”、“SS002M91融合蛋白治療組”、“SG003和SS002M91聯合治療組”和“SG3847L1融合蛋白治療組”，生理鹽水組的中位生存期是11天，SG003抗體治療組和SS002M91融合蛋白治療組的中位生存期分別是22天和21天，說明SG003和SS002M91顯著延長了小鼠生存期。截止分組後23天，SG003和SS002M91聯合治療組以及SG3847L1融合蛋白治療組的小鼠均未出現死亡。說明，與SG003和SS002M91單獨治療相比，SG003和SS002M91聯合治療組以及SG3847L1單獨治療組均延長了小鼠生存期。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附權利要求的範圍。目前本申請所列舉的實施方式的多種變化對本領域普通技術人員來說是顯而易見的，且保留在所附的權利要求和其等同方案的範圍內。
<110> 杭州尚健生物技術有限公司；尚健單抗(北京)生物技術有限公司
<120> 一種融合蛋白及其用途
<130> 0070-PA-014TW
<160> 78
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的LCDR1
<400> 1
Figure 108141186-A0101-12-0058-1
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的LCDR2
<400> 2
Figure 108141186-A0101-12-0058-2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的LCDR3
<400> 3
Figure 108141186-A0101-12-0058-3
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的HCDR1
<400> 4
Figure 108141186-A0101-12-0059-7
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的HCDR2
<400> 5
Figure 108141186-A0101-12-0059-4
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的HCDR3
<400> 6
Figure 108141186-A0101-12-0059-5
<210> 7
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的VL
<400> 7
Figure 108141186-A0101-12-0059-6
Figure 108141186-A0101-12-0060-8
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的VH
<400> 8
Figure 108141186-A0101-12-0060-9
Figure 108141186-A0101-12-0061-10
<210> 9
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 編碼SG003的VL核苷酸
<400> 9
Figure 108141186-A0101-12-0061-11
<210> 10
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 編碼SG003的VH核苷酸
<400> 10
Figure 108141186-A0101-12-0061-12
<210> 11
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003輕鏈
<400> 11
Figure 108141186-A0101-12-0062-13
Figure 108141186-A0101-12-0063-14
<210> 12
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003輕鏈 核苷酸
<400> 12
Figure 108141186-A0101-12-0063-15
<210> 13
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003重鏈
<400> 13
Figure 108141186-A0101-12-0063-16
Figure 108141186-A0101-12-0064-17
Figure 108141186-A0101-12-0065-18
<210> 14
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003重鏈 核苷酸
<400> 14
Figure 108141186-A0101-12-0066-19
<210> 15
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD38蛋白結合表位
<400> 15
Figure 108141186-A0101-12-0067-20
<210> 16
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的突變後的輕鏈1
<400> 16
Figure 108141186-A0101-12-0067-21
Figure 108141186-A0101-12-0068-22
<210> 17
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的突變後的重鏈1
<400> 17
Figure 108141186-A0101-12-0068-23
Figure 108141186-A0101-12-0069-24
Figure 108141186-A0101-12-0070-25
<210> 18
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的突變後的輕鏈2
<400> 18
Figure 108141186-A0101-12-0070-26
Figure 108141186-A0101-12-0071-27
<210> 19
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的突變後的重鏈2
<400> 19
Figure 108141186-A0101-12-0071-28
Figure 108141186-A0101-12-0072-29
Figure 108141186-A0101-12-0073-30
<210> 20
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的突變後的輕鏈3
<400> 20
Figure 108141186-A0101-12-0074-31
Figure 108141186-A0101-12-0075-32
<210> 21
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG003的突變後的重鏈3
<400> 21
Figure 108141186-A0101-12-0075-33
Figure 108141186-A0101-12-0076-34
Figure 108141186-A0101-12-0077-35
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C6G12的LCDR1
<400> 22
Figure 108141186-A0101-12-0077-36
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C6G12的LCDR2
<400> 23
Figure 108141186-A0101-12-0077-37
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C6G12的LCDR3
<400> 24
Figure 108141186-A0101-12-0077-38
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C6G12的HCDR1
<400> 25
Figure 108141186-A0101-12-0078-42
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C6G12的HCDR2
<400> 26
Figure 108141186-A0101-12-0078-41
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C6G12的HCDR3
<400> 27
Figure 108141186-A0101-12-0078-40
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C6G12的VL
<400> 28
Figure 108141186-A0101-12-0078-39
Figure 108141186-A0101-12-0079-43
<210> 29
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C6G12的VH
<400> 29
Figure 108141186-A0101-12-0079-44
Figure 108141186-A0101-12-0080-45
<210> 30
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 編碼C6G12的VL核苷酸
<400> 30
Figure 108141186-A0101-12-0080-46
<210> 31
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 編碼C6G12的VH核苷酸
<400> 31
Figure 108141186-A0101-12-0080-47
<210> 32
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C6G12輕鏈
<400> 32
Figure 108141186-A0101-12-0081-48
Figure 108141186-A0101-12-0082-49
<210> 33
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C6G12輕鏈 核苷酸
<400> 33
Figure 108141186-A0101-12-0082-50
<210> 34
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C6G12重鏈
<400> 34
Figure 108141186-A0101-12-0082-51
Figure 108141186-A0101-12-0083-52
Figure 108141186-A0101-12-0084-53
<210> 35
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> C6G12重鏈 核苷酸
<400> 35
Figure 108141186-A0101-12-0085-54
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG701的LCDR1
<400> 36
Figure 108141186-A0101-12-0086-55
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG701的LCDR2
<400> 37
Figure 108141186-A0101-12-0086-56
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG701的LCDR3
<400> 38
Figure 108141186-A0101-12-0086-57
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG701的HCDR1
<400> 39
Figure 108141186-A0101-12-0086-58
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG701的HCDR2
<400> 40
Figure 108141186-A0101-12-0086-59
Figure 108141186-A0101-12-0087-60
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG701的HCDR3
<400> 41
Figure 108141186-A0101-12-0087-61
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG701的VL
<400> 42
Figure 108141186-A0101-12-0087-62
Figure 108141186-A0101-12-0088-64
<210> 43
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG701的VH
<400> 43
Figure 108141186-A0101-12-0088-63
<210> 44
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 編碼SG701的VL核苷酸
<400> 44
Figure 108141186-A0101-12-0089-65
<210> 45
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 編碼SG701的VH核苷酸
<400> 45
Figure 108141186-A0101-12-0089-66
<210> 46
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG701輕鏈
<400> 46
Figure 108141186-A0101-12-0089-67
Figure 108141186-A0101-12-0090-68
<210> 47
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG701輕鏈 核苷酸
<400> 47
Figure 108141186-A0101-12-0090-69
Figure 108141186-A0101-12-0091-70
<210> 48
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG701重鏈
<400> 48
Figure 108141186-A0101-12-0091-71
Figure 108141186-A0101-12-0092-72
Figure 108141186-A0101-12-0093-73
<210> 49
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG701重鏈 核苷酸
<400> 49
Figure 108141186-A0101-12-0093-75
Figure 108141186-A0101-12-0094-76
<210> 50
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人SIRP α變體1的截短結構域
<400> 50
Figure 108141186-A0101-12-0094-77
Figure 108141186-A0101-12-0095-78
<210> 51
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M1
<400> 51
Figure 108141186-A0101-12-0095-79
<210> 52
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M5
<400> 52
Figure 108141186-A0101-12-0096-81
<210> 53
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M12
<400> 53
Figure 108141186-A0101-12-0096-80
Figure 108141186-A0101-12-0097-82
<210> 54
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M35
<400> 54
Figure 108141186-A0101-12-0097-83
Figure 108141186-A0101-12-0098-85
<210> 55
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M37
<400> 55
Figure 108141186-A0101-12-0098-84
<210> 56
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M41
<400> 56
Figure 108141186-A0101-12-0099-86
<210> 57
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M57
<400> 57
Figure 108141186-A0101-12-0099-87
Figure 108141186-A0101-12-0100-89
<210> 58
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M67
<400> 58
Figure 108141186-A0101-12-0100-88
Figure 108141186-A0101-12-0101-90
<210> 59
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M81
<400> 59
Figure 108141186-A0101-12-0101-91
<210> 60
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M82
<400> 60
Figure 108141186-A0101-12-0102-93
<210> 61
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M84
<400> 61
Figure 108141186-A0101-12-0102-92
Figure 108141186-A0101-12-0103-94
<210> 62
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M91
<400> 62
Figure 108141186-A0101-12-0103-95
Figure 108141186-A0101-12-0104-97
<210> 63
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M99
<400> 63
Figure 108141186-A0101-12-0104-96
<210> 64
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M102
<400> 64
Figure 108141186-A0101-12-0105-98
<210> 65
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M111
<400> 65
Figure 108141186-A0101-12-0105-99
Figure 108141186-A0101-12-0106-101
<210> 66
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M122
<400> 66
Figure 108141186-A0101-12-0106-100
Figure 108141186-A0101-12-0107-104
<210> 67
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M126
<400> 67
Figure 108141186-A0101-12-0107-103
<210> 68
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M130
<400> 68
Figure 108141186-A0101-12-0107-105
Figure 108141186-A0101-12-0108-107
<210> 69
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M135
<400> 69
Figure 108141186-A0101-12-0108-106
Figure 108141186-A0101-12-0109-108
<210> 70
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> M145
<400> 70
Figure 108141186-A0101-12-0109-109
<210> 71
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG1-FC
<400> 71
Figure 108141186-A0101-12-0110-111
Figure 108141186-A0101-12-0111-112
<210> 72
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SS002M91
<400> 72
Figure 108141186-A0101-12-0111-113
Figure 108141186-A0101-12-0112-114
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 連接子1
<400> 73
Figure 108141186-A0101-12-0113-117
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 連接子2
<400> 74
Figure 108141186-A0101-12-0113-116
<210> 75
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG3847L1的第二多肽鏈
<400> 75
Figure 108141186-A0101-12-0113-115
Figure 108141186-A0101-12-0114-118
Figure 108141186-A0101-12-0115-119
Figure 108141186-A0101-12-0116-120
<210> 76
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SG3847L2的第二多肽鏈
<400> 76
Figure 108141186-A0101-12-0116-121
Figure 108141186-A0101-12-0117-122
Figure 108141186-A0101-12-0118-123
<210> 77
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SGAXL47的第二多肽鏈
<400> 77
Figure 108141186-A0101-12-0119-124
Figure 108141186-A0101-12-0120-125
Figure 108141186-A0101-12-0121-126
<210> 78
<211> 581
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SGTrop247第二多肽鏈
<400> 78
Figure 108141186-A0101-12-0121-127
Figure 108141186-A0101-12-0122-128
Figure 108141186-A0101-12-0123-129
Figure 108141186-A0101-12-0124-130

Claims (61)

  1. 一種融合蛋白，其包含：特異性結合腫瘤相關抗原的第一結合域；以及特異性結合CD47蛋白的第二結合域；其中，該第二結合域包含人SIRP α變體1的突變體，該突變體與SEQ ID NO：50所示的序列相比，在第33位至第149位中的一個或多個位置包含胺基酸殘基的取代、缺失或添加。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的融合蛋白，其中該突變體在選自下組的一個或多個胺基酸殘基處包含胺基酸取代：R22、I29、I61、V63、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、D96、K98、N100、R107、G109和V132。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的融合蛋白，其中該突變體在選自下組的胺基酸殘基處包含胺基酸取代：
    (1)I61、V63、E77、E84、V93、L96、K98、N100和V132；
    (2)I61、E77、Q82、K83和E84；
    (3)I61、V63、K83、E84和V132；
    (4)I61、E77、E84、R107和V132；
    (5)I61、V63、E77、K83、E84和N100；
    (6)I61、E77、Q82、K83、E84和R107；
    (7)I61、E77、Q82、E84、V93、L96、N100、R107、G109和V132；
    (8)I61、E77、Q82、K83、E84和V132；
    (9)I61；
    (10)I61、D95、L96、G109和V132；
    (11)I61、D95、L96、K98、G109和V132；
    (12)I61、E77、E84、V93、R107和V132；
    (13)E77、L96、N100、G109和V132；
    (14)I61、V63、Q82、E84、D95、L96、N100和V132；
    (15)I61、E77、Q82、K83、E84、V93、D95、L96、K98、N100和V132；
    (16)I61、E77、Q82、K83、E84和V93；
    (17)I61、V63、E77、K83、E84、D95、L96、K98和N100；
    (18)I61、V63、E77、K83、D95、L96、K98、N100和G109；
    (19)I61、E77、Q82、E84、V93、D95、L96、K98和N100；和，
    (20)I61、V63、E77、Q82和E84。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含選自下組的一個或多個胺基酸取代：R22C、I29L、I61L/V/F、V63I、E77I/N/Q/K/H/M/R/N/V/L、Q82S/R/G/N、K83R、E84K/H/D/R/G、V93L/A、D95H/R/E、D96S/T、K98R、N100G/K/D/E、R107N/S、G109R/H和V132L/R/I/S。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的融合蛋白，其中該突變體包含選自下組的胺基酸取代：
    (1)I61L、V63I、E77I、E84K、V93L、L96S、K98R、N100G和V132L；
    (2)I61V、E77N、Q82S、K83R和E84H；
    (3)I61F、V63I、K83R、E84K和V132I；
    (4)I61L、E77Q、E84D、R107N和V132I；
    (5)I61L、V63I、E77K、K83R、E84D和N100G；
    (6)I61V、E77H、Q82R、K83R、E84H和R107S；
    (7)I61L、E77I、Q82G、E84R、V93L、L96T、N100G、R107S、G109R和V132R；
    (8)I61L、E77M、Q82G、K83R、E84D和V132L；
    (9)I61L；
    (10)I61F、D95H、L96S、G109H和V132S；
    (11)I61F、D95H、L96S、K98R、G109H和V132S；
    (12)I61L、E77Q、E84D、V93A、R107N和V132I；
    (13)E77K、L96S、N100K、G109H和V132L；
    (14)I61L、V63I、Q82G、E84G、D95R、L96S、N100D和V132I；
    (15)I61L、E77R、Q82N、K83R、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R、N100D和V132L；
    (16)I61V、E77N、Q82S、K83R、E84H和V93A；
    (17)I61V、V63I、E77V、K83R、E84D、D95E、L96T、K98R和N100E；
    (18)I61L、V63I、E77V、K83R、D95E、L96S、K98R、N100D和G109R；
    (19)I61V、E77L、Q82G、E84G、V93L、D95E、L96T、K98R和N100G；和，
    (20)I61L、V63I、E77N、Q82G和E84G。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的融合蛋白，其中該突變體包含如SEQ ID NO：51-70中任一項所示的胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含抗體或其抗原結合片段或變體。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的融合蛋白，其中所該抗體選自下組：單株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。
  9. 如申請專利範圍第7或8項所述的融合蛋白，其中該抗原結合片段選自下組：Fab，Fab’，F(ab')2，F(ab)2，dAb，分離的互補決定區CDR，Fv和scFv。
  10. 如申請專利範圍第7至9項中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體或其抗原結合片段的所述變體選自下組：
    a)在該抗體或所述其抗原結合片段中經過取代、缺失或添加一個或多個胺基酸的蛋白質或多肽；和
    b)與該抗體或所述其抗原結合片段具有至少90%序列同源性的蛋白質或多肽。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項所述的融合蛋白，其中該腫瘤相關抗原包括與非實體瘤和/或實體瘤相關的腫瘤相關抗原。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述的融合蛋白，其中該腫瘤相關抗原選自以下組：CD38、AXL和Trop2。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含CD38抗體或其抗原結合片段或變體。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的融合蛋白，其中該CD38為人CD38。
  15. 如申請專利範圍第7至14項中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體包含抗體重鏈或其片段，所述抗體重鏈或其片段包含HCDR1-3，所述HCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的融合蛋白，其中該抗體重 鏈或其片段包含重鏈可變區VH，且所述重鏈可變區VH包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：8。
  17. 如申請專利範圍第15或16項所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈或其片段包含重鏈恆定區，且所述重鏈恆定區包含IgG。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的融合蛋白，其中該IgG選自下組：IgG1和IgG4。
  19. 如申請專利範圍第15至18項中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈包含選自下組所示的胺基酸序列中的任一項：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：21。
  20. 如申請專利範圍第7至19項中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1-3，該LCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
  21. 如申請專利範圍第20項所述的融合蛋白，其中該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈可變區VL，且該輕鏈可變區VL包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：7。
  22. 如申請專利範圍第20或21項所述的融合蛋白，其中該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈恆定區，其所述輕鏈恆定區包含Ig κ。
  23. 如申請專利範圍第20至22項中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體輕鏈包含選自下組所示的胺基酸序列中的任一項：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20。
  24. 如申請專利範圍第12項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含AXL抗體或其抗原結合片段或變體。
  25. 如申請專利範圍第24項所述的融合蛋白，其中該AXL為 人AXL。
  26. 如申請專利範圍第24或25項所述的融合蛋白，其中該抗體包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1-3，該HCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。
  27. 如申請專利範圍第26項所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈或其片段包含重鏈可變區VH，且該重鏈可變區VH包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：29。
  28. 如申請專利範圍第26或27項所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈或其片段包含重鏈恆定區，且該重鏈恆定區包含IgG。
  29. 如申請專利範圍第28項所述的融合蛋白，其中該IgG選自下組：IgG1和IgG4。
  30. 如申請專利範圍第24至29項中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：34。
  31. 如申請專利範圍第24至30項中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1-3，該LCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。
  32. 如申請專利範圍第31項所述的融合蛋白，其中該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈可變區VL，且該輕鏈可變區VL包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：28。
  33. 如申請專利範圍第31或32項所述的融合蛋白，其中該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈恆定區，其該輕鏈恆定區包含Ig κ。
  34. 如申請專利範圍第31至33項中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體輕鏈包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：32。
  35. 如申請專利範圍第12項所述的融合蛋白，其中該第一結合域包含Trop2抗體或其抗原結合片段或變體。
  36. 如申請專利範圍第35項所述的融合蛋白，其中該Trop2為人Trop2。
  37. 如申請專利範圍第35或36項所述的融合蛋白，其中該抗體包含抗體重鏈或其片段，該抗體重鏈或其片段包含HCDR1-3，該HCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41。
  38. 如申請專利範圍第37項所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈或其片段包含重鏈可變區VH，且該重鏈可變區VH包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：43。
  39. 如申請專利範圍第37或38項所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈或其片段包含重鏈恆定區，且該重鏈恆定區包含IgG。
  40. 如申請專利範圍第39項所述的融合蛋白，其中該IgG選自下組：IgG1和IgG4。
  41. 如申請專利範圍第37至40項中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體重鏈包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：48。
  42. 如申請專利範圍第35至41項中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體包含抗體輕鏈或其片段，該抗體輕鏈或其片段包含LCDR1-3，所述LCDR1-3的胺基酸序列依次為SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38。
  43. 如申請專利範圍第42項所述的融合蛋白，其中該抗體輕鏈或其片段包含輕鏈可變區VL，且該輕鏈可變區VL包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：42。
  44. 如申請專利範圍第42或43項所述的融合蛋白，其中該抗 體輕鏈或其片段包含輕鏈恆定區，其該輕鏈恆定區包含Ig κ。
  45. 如申請專利範圍第42至44項中任一項所述的融合蛋白，其中該抗體輕鏈包含如下的胺基酸序列：SEQ ID NO：46。
  46. 如申請專利範圍第1至45項中任一項所述的融合蛋白，其中該第一結合域位於所述第二結合域的N端。
  47. 如申請專利範圍第1至46項中任一項所述的融合蛋白，其中該融合蛋白還包含連接子，該連接子位於所述第一結合域的C端且位於該第二結合域的N端。
  48. 如申請專利範圍第47項所述的融合蛋白，其中該連接子包含如SEQ ID NO：73-74中任一項所示的胺基酸序列。
  49. 如申請專利範圍第1至48項中任一項所述的融合蛋白，其包含至少2個該第二結合域。
  50. 如申請專利範圍第49項所述的融合蛋白，其中該每個該第二結合域分別位於該第一結合域的C端。
  51. 一種免疫綴合物，其包含如申請專利範圍第1至50項中任一項所述的融合蛋白。
  52. 一個或多個分離的核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1至50項中任一項所述的融合蛋白或者如申請專利範圍第51項所述的免疫綴合物。
  53. 一個或多個載體，其包含如申請專利範圍第52項所述的核酸分子。
  54. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第1至50項中任一項所述的融合蛋白，如申請專利範圍第51項所述的免疫綴合物，或如申請專利範圍第52項所述的核酸分子，以及視需要地藥學上可接受的賦形劑。
  55. 一種細胞，其包含如申請專利範圍第1至50項中任一項所述的融合蛋白，如申請專利範圍第51項所述的免疫綴合物，如申請專利範圍第52項所述的核酸分子，或如申請專利範圍第53項所述的載體。
  56. 一種製備如申請專利範圍第1至50項中任一項所述的融合蛋白的方法，其包括在使得該融合蛋白能夠表達的條件下培養如申請專利範圍第55項所述的細胞。
  57. 一種如申請專利範圍第1至50項中任一項所述的融合蛋白、如申請專利範圍第51項所述的免疫綴合物、如申請專利範圍第52項所述的核酸分子、如申請專利範圍第53項所述的載體、如申請專利範圍第54項所述的組成物、或如申請專利範圍第55項所述的細胞在製備藥物中的用途，其中該藥物用於治療腫瘤或自體免疫疾病。
  58. 如申請專利範圍第57項所述的用途，其中該腫瘤包括非實體瘤和實體瘤。
  59. 如申請專利範圍第57項所述的用途，其中該腫瘤包括多發性骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、神經膠質瘤、生殖細胞瘤、肉瘤、間皮瘤、胎盤瘤、腦癌、骨癌、皮膚癌、鼻咽癌、肺癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、腸癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌和睾丸癌。
  60. 如申請專利範圍第57項所述的用途，其中該自體免疫疾病包括慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進、胰島素依賴型糖尿病、重症肌無力、慢性潰瘍性結腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、肺出血腎炎綜合症、尋常天皰瘡、類天皰瘡、原發性膽汁性肝硬變、多發性腦脊髓硬化症、急性特發性多神經炎、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、硬皮病和結節性多動脈炎。
  61. 一種阻斷CD47蛋白與SIRP α相互作用的方法，其包括向有需要的受試者施用有效量的如申請專利範圍第1至50項中任一項所述的融合蛋白，如申請專利範圍第51項所述的免疫綴合物，如申請專利範圍第項52所述的核酸分子，如申請專利範圍第53項所述的載體，如申請專利範圍第54項所述的組成物，或如申請專利範圍第55項所述的細胞。
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