TWI793451B

TWI793451B - 個人化癌症免疫治療

Info

Publication number: TWI793451B
Application number: TW109132637A
Authority: TW
Inventors: 蔡博宇; 陳光裕; 黃信璁; 徐慰婷
Original assignee: 納維再生科技股份有限公司
Priority date: 2019-09-20
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2023-02-21
Also published as: WO2021055973A2; TW202126697A; CN114502781A; EP4031696A4; EP4031696A2; US20210101993A1; WO2021055973A3

Abstract

本發明係關於一種獲得特異性結合於腫瘤樣本及針對腫瘤樣本之抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含：向個體投與自體樹突狀細胞；自該個體獲取免疫細胞及腫瘤樣本；建構該等免疫細胞之抗體庫；及篩選該抗體庫以獲得特異性結合於該腫瘤樣本及針對該腫瘤樣本之該抗體或其片段。本發明亦係關於一種用於改造免疫細胞、特異性結合於腫瘤樣本及針對腫瘤樣本之抗體或其抗原結合片段之方法及其用途。

Description

個人化癌症免疫治療

本發明係關於一種癌症免疫治療之領域。特定言之，本發明係關於獲得用於個人化癌症免疫治療之抗體之方法。

精準醫學及免疫治療目前為癌症研究之最熱領域中之兩者。免疫治療旨在刺激(或恢復)患者自身的免疫系統以對抗癌症。已經批准用於患者使用之一種類型之個人化免疫治療為嵌合抗原受體(CAR)-T細胞療法，一種新穎之免疫腫瘤學治療模式。

需要可實現針對癌症之更有效個人化癌症免疫治療之技術。

本發明提供一種獲得患有腫瘤之個體中特異性結合於該腫瘤且針對該腫瘤之抗體或其抗原結合片段之方法，其包含：自該個體獲取腫瘤樣本；向該個體投與樹突狀細胞以引發抗腫瘤免疫反應；採集該個體之免疫細胞；建構該等免疫細胞之抗體庫；及篩選該抗體庫以獲得特異性結合於該腫瘤及針對該腫瘤之該抗體或其片段。

在一個實施例中，個體經歷手術切除或同時化學治療及放射治療。

在一個實施例中，個體在投與樹突狀細胞之前經歷手術切除或同時化學治療及放射治療。

在一個實施例中，腫瘤樣本在投與樹突狀細胞之前獲得。

在一個實施例中，樹突狀細胞為自體的或異體的；較佳為自體的。在本發明之另一實施例中，在個體經歷放射治療、化學治療或手術之前或之後自個體採集自體樹突狀細胞。在另一其他實施例中，自體樹突狀細胞來源於在個體接受放射治療、化學治療或手術之前或之後自個體採集之單核球。

在本發明之一個實施例中，向個體投與樹突狀細胞超過一次。在一個實施例中，以一定時間間隔投與樹突狀細胞超過兩次。在一個實施例中，投與樹突狀細胞兩次。在另一實施例中，時間間隔為一週一次。在一個實施例中，一週投與樹突狀細胞兩次。

在一個實施例中，該方法包含：自個體獲取腫瘤樣本；一週向該個體投與樹突狀細胞兩次以在該個體經歷手術切除或同時化學治療及放射治療之後引發抗腫瘤免疫反應；採集該個體之免疫細胞；建構該等免疫細胞之抗體庫；及篩選該抗體庫以獲得特異性結合於該腫瘤樣本且針對該腫瘤樣本之該抗體或其片段。

在本發明之一個實施例中，以10⁴ 個細胞/公斤體重至10⁸ 個細胞/公斤體重之劑量向個體投與樹突狀細胞。在另一實施例中，以10⁴ 個細胞/公斤體重至10⁶ 個細胞/公斤體重之劑量向個體投與樹突狀細胞。

在一個實施例中，本文所描述之免疫細胞來源於周邊血液單核細胞(PBMC)。

在本發明之一個實施例中，本文所描述之免疫細胞為作為組合抗體基因庫建構之主要部分之B細胞。

在本發明之一個實施例中，抗體庫由噬菌體呈現建構。

在本發明之一個實施例中，該方法還包含根據腫瘤樣本建立原發腫瘤細胞系且用該原發腫瘤細胞系篩選抗體庫。

在本發明之一個實施例中，由基於細胞之篩選來篩選抗體庫。

在本發明之一個實施例中，抗體或其片段為單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體或scFv抗體或其片段。

在本發明之一個實施例中，抗體為抗碳酸酐酶IX (CAIX)抗體。

在本發明之一個實施例中，腫瘤為鱗狀細胞癌、肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、包括胃腸癌之胃癌(gastric/stomach cancer)、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer )、膀胱癌、尿道癌、肝腫瘤(hepatoma)、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney/renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤、腦癌、頭頸癌或其相關轉移癌。

本發明亦提供一種用於改造特異性結合於腫瘤樣本及針對腫瘤樣本之免疫細胞之方法，其包含：根據上文所提及之方法獲得特異性結合於腫瘤樣本且針對腫瘤樣本之抗體或其抗原結合片段；提供免疫細胞；及將該抗體或其抗原結合片段在該等免疫細胞之表面上表現。

在本發明之一個實施例中，免疫細胞為嵌合抗體免疫細胞。

本發明亦提供一種特異性結合於腫瘤樣本且針對該腫瘤樣本之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區之互補決定區(CDR)及輕鏈可變區之互補決定區，其中該重鏈可變區之互補決定區包含CDRH1、CDRH2及CDRH3區，且該輕鏈可變區之互補決定區包含CDRL1、CDRL2及CDRL3區，且其中：該CDRH1區包含SEQ ID NO: 1 (SYAMQ)之胺基酸序列；該CDRH2區包含選自由SEQ ID NO: 2 (GMSDDGSWTDYGAAVKG)及SEQ ID NO: 3 (GVSDDGSWTGYGAAVQG)組成之群之胺基酸序列：；該CDRH3區包含選自由SEQ ID NO: 4 (GAGTGYCDNRSFGCASTIDA)及SEQ ID NO: 5 (GAGTGYCNNRGFGCASTIDA)組成之群之胺基酸序列；且該CDRL1區包含SEQ ID NO: 6 (SGSSGSYG)之胺基酸序列；該CDRL2區包含選自由SEQ ID NO: 7 (HNDKRPS)及SEQ ID NO: 8 (YNDKRPS)組成之群之胺基酸序列；該CDRL3區包含SEQ ID NO: 9(GSADRSGAGI)之胺基酸序列。

在本發明之一個實施例中，抗體或其抗原結合片段為哺乳動物抗體。

在本發明之一個實施例中， CDRH1區包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列；CDRH2區包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列；CDRH3區包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列；且 CDRL1區包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列；CDRL2區包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列；CDRL3區包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。

在本發明之一個實施例中， CDRH1區包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列；CDRH2區包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列；CDRH3區包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列；且 CDRL1區包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列；CDRL2區包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列；CDRL3區包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。

在本發明之一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO: 10 (AVTLDESGGGLHTPGGGLSLVCRASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGMSDDGSWTDYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKGAGTGYCDNRSFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之胺基酸序列之重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 11 (ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYHNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVL)之胺基酸序列之輕鏈可變區。

在本發明之一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO: 12 (AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCRASGFTMTSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGVSDDGSWTGYGAAVQGRATISRDNGQSTVRLLLNNLRAEDTATYYCVKGAGTGYCNNRGFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之胺基酸序列之重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 13 (ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVL)之胺基酸序列之輕鏈可變區。

在本發明之一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 14 (ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYHNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVLGQSSRSSGGGGSSGGGGSAVTLDESGGGLHTPGGGLSLVCRASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGMSDDGSWTDYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKGAGTGYCDNRSFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)及SEQ ID NO: 15 (ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVLGQSSRSSAVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCRASGFTMTSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGVSDDGSWTGYGAAVQGRATISRDNGQSTVRLLLNNLRAEDTATYYCVKGAGTGYCNNRGFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)。

在本發明之一個實施例中，抗體或其抗原結合片段在免疫細胞表面上表現。

本發明提供一種醫藥組合物，其包含治療有效量之上文所提及之抗體或其抗原結合片段及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。

本發明提供上文所提及之醫藥組合物的用途，其用於製造用以治療有需要之個體之腫瘤的藥物。

在本發明之一個實施例中，經靜脈內、腹膜內、動脈內、鞘內、膀胱內或瘤內投與所述藥物。

本發明提供一種用於治療有需要之個體之腫瘤的方法，其包含投與上文所提及之醫藥組合物。

在本發明之一個實施例中，其中經靜脈內、腹膜內、動脈內、鞘內、膀胱內或瘤內進行投與。

為促進對本發明技術之理解，下文定義多個術語及片語。其他定義在整個實施方式中闡述。

另外，如本文所使用，除非上下文另外明確規定，否則術語「或」為包括性的「或」運算子，且等效於術語「及/或」。除非上下文另外明確規定，否則術語「基於」不為排他性的且允許基於未描述之額外因素。另外，在整個說明書中，「一(a/an)」及「該」之含義包括複數個參考物。「在……中」之含義包括「在……中」及「在……上」。

如本文所使用，術語「特異性結合」意謂抗體在很大程度上不會與其他表位交叉反應。

如本文所使用，術語「表位」係指抗體結合之抗原上之位點。

如本文所用，術語「抗體」係指屬於多株、單株、嵌合及人源化抗體類別之單鏈、雙鏈及多鏈蛋白質及多肽；其亦包括此等抗體之合成及基因改造變異體。「抗體片段」包括Fab、Fab'、F(ab')₂ 及Fv片段，以及具有針對一或多個所需目標表位之特異性之抗體的任何部分。

如本文所使用，術語「單株抗體」係指獲自實質上均質抗體群體之抗體。換言之，單株抗體由產生自單一細胞系(例如融合瘤細胞、經針對均勻抗體進行編碼之DNA分子轉染之真核宿主細胞，或經針對均勻抗體進行編碼之DNA分子轉染之原核宿主細胞)之生長之均質抗體組成。此等抗體係針對單一表位，且因此具有高度特異性。

如本文所使用，術語「人源化抗體」係指一種重組蛋白，其中將來自一個物種(例如鼠或雞)之抗體CDR自該物種抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區轉移至人類重鏈可變域及輕鏈可變域(構架區)中。該抗體分子之恆定域係源於該等人類抗體之恆定域。在一些情況下，人源化抗體之構架區之特定性殘基(尤其接觸或接近CDR序列之彼等特定殘基)可經修飾，例如可經來源鼠、嚙齒動物、類人猴或其他抗體之對應殘基置換。人源化抗體可由多種方法實現，包括(a)僅將非人類CDR移植至人類構架及恆定區上，而保留或不保留關鍵構架殘基，或(b)藉由置換表面殘基移植整個非人類可變域，但其用類似人類之部分「遮蓋」。適用於實踐本發明之此類方法包括揭示於Padlan, Mol. Immunol., 31(3):169-217 (1994)中之方法。

如本文所使用，術語「嵌合抗體」係指含有抗體重鏈及抗體輕鏈兩者之可變域之重組蛋白，其包括來源於一個物種之抗體(較佳為嚙齒動物抗體或雞抗體，更佳為鼠抗體)之互補決定區(CDR)，然而抗體分子之恆定域係源於人類抗體之彼等恆定域。

如本文所使用，術語「互補決定區」(CDR)係指重鏈及輕鏈多肽之可變區內所發現之非連續抗原組合位點。CDR已由Kabat等人，J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)；Kabat等人，U.S. Dept. of Health and Human Services，「Sequences of proteins of immunological interest」 (1991)；由Chothia等人，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；及MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)描述，其中當彼此比較時，定義包括胺基酸殘基之重疊或子集。

如應用於多肽，術語「實質類似性」或「實質上類似」意謂當諸如藉由程式GAP或BESTFIT使用預設空位權重進行最佳比對時，兩個肽序列具有至少95%之序列一致性，甚至更佳至少98%或99%之序列一致性。較佳地，不相同之殘基位置因保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有類似化學特性(例如電荷或疏水性)之側鏈(R基團)之另一胺基酸殘基取代的胺基酸取代。一般而言，保守胺基酸取代實質上不會改變蛋白質之功能特性。在兩個或更多個胺基酸序列彼此因保守取代而不同之情況下，可上調序列一致性百分比或相似度以針對保守取代性質加以校正。進行此調節之方式為熟習此項技術者所熟知。含有具類似化學特性之側鏈之胺基酸基團之實例包括(1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂族羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含醯胺側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；(4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及(7)含硫側鏈為半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳保守胺基酸取代群組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。或者，保守置換為Gonnet等人(1992) Science 256: 1443-1445中揭示之PAM250對數似然矩陣中具有正值之任何變化，其以引用之方式併入本文中。「適度保守」置換為在PAM250對數似然矩陣中具有非負值之任何變化。

如本文所使用，術語「樣本」涵蓋自個體、個體或患者獲得之多種樣本類型且可用於診斷或監測分析中。該定義涵蓋生物來源之血液及其他液態樣本；固態組織樣本，諸如生檢檢體或組織培養物或源自其之細胞，及其後代。

如本文所使用，術語「治療(treatment/treating)」及其類似術語涵蓋哺乳動物(尤其人類)之疾病之任何治療，且包括：(a)預防可能易患該疾病但尚未診斷出患有該疾病之個體出現疾病；(b)抑制該疾病，亦即阻滯其發展；及(c)緩解該疾病，亦即促使該疾病消退。

如本文中可互換地使用，術語「個體」、「個體」、「宿主」及「患者」係指哺乳動物，其包括但不限於鼠(大鼠、小鼠)、非人類靈長類動物、人類、犬科動物、貓科動物、有蹄動物(例如馬科動物、牛科動物、綿羊、豬科動物、山羊)等。

如本文所使用，術語「治療有效量」或「有效量」係指當為了治療疾病向哺乳動物或其他個體投與時足以實現對該疾病之該治療之抗體的量。

本發明提供一種獲得在患有腫瘤之個體中特異性結合於腫瘤且針對腫瘤之抗體或其抗原結合片段之方法，其包含：自該個體獲取腫瘤樣本；向該個體投與樹突狀細胞以引發抗腫瘤免疫反應；採集該個體之免疫細胞；建構該等免疫細胞之抗體庫；及篩選該抗體庫以獲得特異性結合於該腫瘤及針對該腫瘤之該抗體或其片段。

在一個實施例中，獲取腫瘤樣本以建立特異性原發腫瘤細胞系。在一個實施例中，本文所描述之免疫細胞來源於周邊血液單核細胞(PBMC)。

咸信(但不意欲受任何理論限制)樹突狀細胞為哺乳動物免疫系統之抗原呈現細胞，將細胞表面上之抗原呈現至免疫系統之T細胞。在採集免疫細胞之前投與自體樹突狀細胞提高篩選之特異性及有效性，促進獲得特異性結合於腫瘤樣本且針對腫瘤樣本之強大抗體。自體樹突狀細胞可來源於個體之單核球或經由增殖提供。較佳地，樹突狀細胞來源於個體之PBMC；更佳地，直接來源於周邊血液。

在較佳實施例中，個體為哺乳動物。例示性哺乳動物包括人類、豬、綿羊、山羊、馬、小鼠、犬、貓、母牛等。

臨床上，腫瘤患者通常經歷放射治療、化學治療或手術。為了收集有效樹突狀細胞，樹突狀細胞較佳在個體經歷放射治療、化學治療或手術之前自個體收集。放射治療、化學治療或手術與收集之間的持續時間可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，較佳7天。

樹突狀細胞之投與可進行超過一次；較佳地，以一定時間間隔向個體投與樹突狀細胞兩次。投與之間的間隔可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，較佳7天。

在另一態樣中，以足以展示抗原呈現之量向個體投與樹突狀細胞。較佳地，以10⁴ 個細胞/公斤體重至10⁶ 個細胞/公斤體重之劑量向個體投與樹突狀細胞。

在個體接受放射治療、化學治療或手術之情況下，較佳在個體經歷放射治療、化學治療或手術之後向個體投與樹突狀細胞。

所採集之免疫細胞可來自淋巴或血液，較佳來自周邊血液。較佳地，免疫細胞在投與樹突狀細胞1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，較佳7天之後採集。

根據本發明之免疫細胞之實例包括但不限於淋巴球、嗜中性白血球、單核球及巨噬細胞。較佳地，免疫細胞為淋巴球。淋巴球之實例包括但不限於T細胞、B細胞及NK細胞。較佳地，免疫細胞為B細胞。

可改變建構免疫細胞之抗體庫之方式。建構之實例包括但不限於噬菌體呈現、活體外顯示、酵母呈現、哺乳動物呈現及細菌呈現；較佳地，抗體庫藉由噬菌體呈現建構。

腫瘤樣本可直接由個體提供或經處理。較佳地，該方法進一步包含自腫瘤樣本建立原發腫瘤細胞系且用該原發腫瘤細胞系篩選抗體庫。此外，較佳由基於細胞之篩選來篩選抗體庫。

抗體或其片段可為單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體或scFv抗體或其片段，較佳scFv抗體。

在本發明之一個實施例中，根據本發明篩選抗碳酸酐酶IX (CAIX)抗體。

可用抗體或其醫藥組合物治療之腫瘤包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴惡性腫瘤。此類癌症之更多特定實例包括鱗狀細胞癌(上皮鱗狀細胞癌)；包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌之肺癌；腹膜癌；肝細胞癌；包括胃腸癌之胃癌(gastric/stomach cancer)；胰臟癌；神經膠母細胞瘤；子宮頸癌；卵巢癌；肝癌(liver cancer)；膀胱癌；尿道癌；肝腫瘤(hepatoma)；乳癌；結腸癌；直腸癌；結腸直腸癌；子宮內膜癌或子宮癌；唾液腺癌；腎癌(kidney/renal cancer)；前列腺癌；外陰癌；甲狀腺癌；肝癌(hepatic carcinoma)；肛門癌；陰莖癌；黑色素瘤；多發性骨髓瘤及B細胞淋巴瘤、腦癌以及頭頸癌，及相關轉移癌。

本發明亦提供一種用於改造特異性結合於腫瘤樣本及針對腫瘤樣本之免疫細胞之方法，其包含：根據上文所提及之方法獲得特異性結合於腫瘤樣本且針對腫瘤樣本之抗體或其抗原結合片段；提供免疫細胞；及將該抗體或其抗原結合片段在該等免疫細胞上表現。

較佳地，免疫細胞為嵌合抗體免疫細胞。在本發明之一個實施例中，嵌合抗體包含抗原識別域、鉸鏈區、跨膜域及胞內T細胞信號傳導域。抗體或其抗原結合片段作為抗原識別域。

本發明亦提供一種特異性結合於腫瘤樣本且針對該腫瘤樣本之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區之互補決定區(CDR)及輕鏈可變區之互補決定區，其中該重鏈可變區之互補決定區包含CDRH1、CDRH2及CDRH3區，且該輕鏈可變區之互補決定區包含CDRL1、CDRL2及CDRL3區，且其中：該CDRH1區包含SEQ ID NO: 1 (SYAMQ)之胺基酸序列；該CDRH2區包含選自由SEQ ID NO: 2 (GMSDDGSWTDYGAAVKG)及SEQ ID NO: 3 (GVSDDGSWTGYGAAVQG)組成之群之胺基酸序列；該CDRH3區包含選自由SEQ ID NO: 4 (GAGTGYCDNRSFGCASTIDA)及SEQ ID NO: 5 (GAGTGYCNNRGFGCASTIDA)組成之群之胺基酸序列；且該CDRL1區包含SEQ ID NO: 6 (SGSSGSYG)之胺基酸序列；該CDRL2區包含選自由SEQ ID NO: 7 (HNDKRPS)及SEQ ID NO: 8 (YNDKRPS)組成之群之胺基酸序列；該CDRL3區包含SEQ ID NO: 9(GSADRSGAGI)之胺基酸序列。

特定言之，抗體或其抗原結合片段為抗CAIX L3A，其中： CDRH1區包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列；CDRH2區包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列；CDRH3區包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列；且 CDRL1區包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列；CDRL2區包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列；CDRL3區包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。

特定言之，抗體或其抗原結合片段為抗CAIX S1C，其中： CDRH1區包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列；CDRH2區包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列；CDRH3區包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列；且 CDRL1區包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列；CDRL2區包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列；CDRL3區包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。

較佳地，抗CAIX L3A包含：包含SEQ ID NO: 10 (AVTLDESGGGLHTPGGGLSLVCRASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGMSDDGSWTDYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKGAGTGYCDNRSFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之胺基酸序列之重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 11 (ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYHNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVL)之胺基酸序列之輕鏈可變區。

較佳地，抗CAIX S1C包含：包含SEQ ID NO: 12 (AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCRASGFTMTSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGVSDDGSWTGYGAAVQGRATISRDNGQSTVRLLLNNLRAEDTATYYCVKGAGTGYCNNRGFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之胺基酸序列之重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 13 (ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVL)之胺基酸序列之輕鏈可變區。

更佳地，抗CAIX L3A包含SEQ ID NO: 14 (ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYHNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVLGQSSRSSGGGGSSGGGGSAVTLDESGGGLHTPGGGLSLVCRASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGMSDDGSWTDYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKGAGTGYCDNRSFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之胺基酸序列。

更佳地，抗CAIX S1C包含SEQ ID NO: 15 (ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVLGQSSRSSAVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCRASGFTMTSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGVSDDGSWTGYGAAVQGRATISRDNGQSTVRLLLNNLRAEDTATYYCVKGAGTGYCNNRGFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之胺基酸序列。

在本發明之一個較佳實施例中，抗體或其抗原結合片段與治療劑結合。在本發明之一個較佳實施例中，抗體或其抗原結合片段表現在細胞表面上。更佳地，細胞為免疫細胞，又更佳地，NK-細胞。

本發明提供一種醫藥組合物，其包含治療有效量之上文所提及之抗體或其抗原結合片段及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。本發明之醫藥組合物係用適合之載劑、賦形劑及可提供經改良之轉移、傳遞、耐受性及其類似物之其他藥劑調配。多種適當調配物可見於所有藥劑師已知之處方集中：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa。此等調配物包括例如粉劑、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含有囊泡之脂質(陽離子或陰離子)、DNA結合物、無水吸收糊劑、水包油及油包水乳劑、乳液卡波蠟(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠及含有卡波蠟之半固體混合物。

向患者投與之抗體劑量可視患者之年齡及體型、目標疾病、病狀、投與途徑及其類似因素而變化。較佳劑量通常根據體重或體表面積計算。當本發明之抗體用於治療成人患者之腫瘤時，經靜脈內投與本發明之抗體係為有利的。視病狀之嚴重程度而定，可調整治療之頻率及持續時間。投與抗體之有效劑量及時程可憑經驗確定；例如，患者進展可由週期性評估監測，且相應地調整劑量。此外，可利用此項技術中熟知之方法來進行物種間之劑量的調整。

各種傳遞系統為已知的且可用於投與本發明之醫藥組合物，例如脂質體膠囊化、微粒、微膠囊、能夠表現突變病毒之重組細胞、受體介導之胞吞作用(參見例如Wu等人，1987，J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。引入方法包括但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、動脈內、鞘內、膀胱內或瘤內、硬膜外及口服途徑。該組合物可藉由任何便利途徑投與，例如藉由輸注或推注注射、藉由經上皮或黏膜皮膚襯裡(例如口腔黏膜、直腸黏膜及腸黏膜等)吸收且可與其他生物學活性劑一起投與。投與可為全身性投與或局部投與。較佳地，藥物係經靜脈內、腹膜內、動脈內、鞘內、膀胱內或瘤內投與。

提供以下實例以輔助熟習此項技術者實踐本發明。實例實例 1 ：抗 CAIX Ab 之表現、純化結合分析

獲取K562細胞用於陰性選擇；同時，獲取CAIX過度表現K562細胞用於陽性選擇。根據經CAIX Ag免疫之雞建立抗體噬菌體庫。

基於先前報導(Andris - Widhopf J 、 Rader C 、 Steinberger P 等人 Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display . J Immunol Methods 2000 ； 242 : 159 - 81 )建立抗體庫。簡言之，將最終免疫之後自雞採集之脾臟立即置放於Trizol (Gibco BRL., USA)中以供均質化。使用SuperScript RT套組(Invitrogen, USA)將10 μg RNA逆轉錄成第一股cDNA。使用雞特異性引子擴增之後，對重鏈及輕鏈可變(VH及VL)區之PCR產物進行第二輪PCR以形成具有短或長連接子之全長scFv片段，其進一步用Sfi I消化且選殖至pComb3X載體中。藉由電穿孔(來自BioRad之MicroPulser)將重組噬菌體DNA轉換為大腸桿菌ER2738菌株。重組噬菌體之產生藉由添加野生型VCS-M13協助者噬菌體起始，隨後用4%聚乙二醇8000及3% NaCl (w/v)使其沈澱，且最終再懸浮於含有1%牛血清白蛋白(BSA)之1×磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。隨後，在4℃下用含1% BSA之PBS阻斷scFv抗體庫中重組噬菌體(50μ l)之10¹² 至10¹³ 空斑形成單元(pfu)持續1小時，且隨後與10⁶ 個K562細胞(100μ l)一起在室溫下培育30分鐘兩次(陰性選擇)。收集未結合噬菌體上清液之後，將上清液與CAIX過度表現K562細胞一起在4℃下培育1小時(陽性選擇)。隨後用PBS洗滌細胞5~8次。結合之噬菌體用0.2 M甘胺酸-HCl (pH 2.2)溶離，用1 M Tris-HCl緩衝液中和，且隨後用於感染大腸桿菌ER2738菌株。如上文所描述沈澱且回收經擴增之噬菌體用於下一輪選擇。

建構具有短連接子及長連接子之庫，如表1中所示。示出各篩選之後的溶離效價(表1)。三輪篩選之後，CAIX結合噬菌體變異體大量富集。此等結果表明非特異性結合噬菌體在篩選過程中移除且具有特異性結合親和力之純系富集。序列經證實屬於雞免疫球蛋白生殖系基因。表1

長鏈連接子庫
	第1輪	第2輪	第3輪
溶離	2*10^4	1*10^6	4*10^6
擴增	2.2*10^13	2.8*10^13
短鏈連接子庫
	第1輪	第2輪	第3輪
溶離	7*10^4	1*10^6	5*10^6
擴增	2*10^13	3.8*10^12

為檢查其結合反應性，將50μ l候選噬菌體與K562或CAIX過度表現K562細胞一起在室溫下在150 rpm震盪下在ELISA板孔中培育2小時。在用PBS洗滌3次之後，與HRP-結合抗M13抗體(1:5,000)一起在室溫下培育2小時來偵測結合之scFv。在用PBS洗滌6次之後，將四甲基聯苯胺(TMB)受質溶液(Sigma, USA)添加至各孔中用於顯色。用2 N H₂ SO₄ 停止反應且在450 nm至540 nm下使用ELISA板讀取器(BioTek Synergy HT)量測光密度。基於細胞之ELISA之結果展示於圖1中。相比於K562細胞，候選scFv對CAIX過度表現K562細胞具有較高結合活性。

使用抗HA抗體偵測候選噬菌體純系之結合活性。對1 × 10⁵ 個K562或K562-CAIX細胞及20 μl候選噬菌體純系進行流式細胞術分析技術。細胞表面染色之結果展示於圖2A至2C中。除抗CAIX L1B scFv以外，所有scFv均可特異性結合於CAIX過度表現細胞。

在該等抗體中，獲得抗CAIX L3A(長3A)及S1C (短1C)。實例 2 ：活 體內分析中之抗甲狀腺癌細胞 Ab

用於獲得特異性結合於腫瘤樣本及針對腫瘤樣本之抗體或其抗原結合片段之方法之示意圖展示於圖3中。

自患有甲狀腺癌之患者採集樹突狀細胞。在患者經受手術切除術或同時化學治療及放射治療之後，患者接受自體DC細胞之1×10⁴ ~1×10⁶ 個細胞/公斤體重之腋淋巴結(ALN)注射兩次(在第1週及第2週)。手術切除樣本用於建立腫瘤細胞系，且在第3週採集之周邊血液用於建立Ab噬菌體庫。

甲狀腺癌細胞(KYL之細胞)自患者建立且在具有5% CO₂ 之潮濕空氣中於37℃下在補充有1.5% PLUS™ Human Plate Lysate (CPMPASS, CPS-PLS5-BAG)及2%青黴素-鏈黴素(Life technologies，15140)之RPMI1640培養基(HyUNK，SH30027)中培養。

基於細胞之篩選方案如實例1中所提及。

根據實例1進行噬菌體效價，且結果展示於表2中。表2：

	篩選1	擴增1	篩選2	擴增2	篩選3
長鏈連接子	1.3*10^2	4*10^11	1.5*10^5	7.0*10^11	3.7*10^5
短鏈連接子	1.2*10^2	2*10^10	1.1*10^5	1.0*10^12	1.22*10^6

噬菌體擴增及基於細胞之ELISA之方案與實例1中之彼等方案相同。結果展示於圖4中。純系D及F對甲狀腺癌細胞具有高結合活性。

雖然已結合上文所闡述之特定實施例來描述本發明，但其許多替代方案及其修改及變化對於一般技術者而言將顯而易知。所有此類替代方案、修改及變化被視為落入本發明之範疇內。

圖1示出K562-CAIX之基於細胞之ELISA的結果。

圖2A至2C示出細胞表面染色之結果。2A：未染色的對照抗體(抗CAIX)；scFv L6。2B：長1B、3A、2F、3C抗體。2C：短1C、1F、1G、2B抗體。

圖3示出獲得特異性結合於腫瘤樣本且針對腫瘤樣本之抗體或其抗原結合片段之方法的示意圖。

圖4示出KYL之細胞的基於細胞之ELISA之結果。

<110> 納維再生科技股份有限公司(NAVI BIO-THERAPEUTICS,INC.)

<120> 個人化癌症免疫治療

<140> TW 109132637

<141> 2020-09-21

<150> US 62/903,416

<151> 2019-09-20

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<170> PatentIn版本3.5

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Claims

一種獲得特異性結合於患有腫瘤個體中之該腫瘤及針對該腫瘤之抗體或其抗原結合片段之方法，其包含：自該個體獲取腫瘤樣本；向該個體投與樹突狀細胞以引發抗腫瘤免疫反應；採集該個體之免疫細胞；建構該等免疫細胞之抗體庫；及篩選該抗體庫以獲得特異性結合於該腫瘤及針對該腫瘤之該抗體或其片段。
如請求項1之方法，其中該個體經歷手術切除或同時化學治療及放射治療。
如請求項1之方法，其中該個體在投與該等樹突狀細胞之前經歷手術切除或同時化學治療及放射線治療。
如請求項1之方法，其中該腫瘤樣本係在投與該等樹突狀細胞之前獲得。
如請求項1之方法，其中該等樹突狀細胞為自體的。
如請求項5之方法，其中該等自體樹突狀細胞係在該個體經歷放射治療、化學治療或手術之前或之後採集自該個體。
如請求項1之方法，其中向該個體投與該等樹突狀細胞超過一次。
如請求項1之方法，其中以一定時間間隔投與該等樹突狀細胞超過兩次。
如請求項1之方法，其中投與該等樹突狀細胞兩次。
如請求項8之方法，其中該時間間隔為一週一次。
如請求項1之方法，其中一週投與該等樹突狀細胞兩次。
如請求項1之方法，其包含以下各者：自該個體獲取腫瘤樣本；在該個體經歷手術切除或同時化學治療及放射治療之後，一週向該個體投與樹突狀細胞兩次以引發抗腫瘤免疫反應；採集該個體之免疫細胞；建構該等免疫細胞之抗體庫；及篩選該抗體庫以獲得特異性結合於該腫瘤樣本及針對該腫瘤樣本之該抗體或其片段。
如請求項1之方法，其中以10⁴ 個細胞/公斤體重至10⁸ 個細胞/公斤體重之劑量向該個體投與該等樹突狀細胞。
如請求項1之方法，其中該等免疫細胞為B細胞。
如請求項1之方法，其進一步包含根據該腫瘤樣本建立原發腫瘤細胞系且用該原發腫瘤細胞系篩選該抗體庫。
如請求項1之方法，其中該抗體或其片段為單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體或scFv抗體或其片段。
如請求項1之方法，其中該腫瘤為鱗狀細胞癌、肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、包括胃腸癌之胃癌(gastric/stomach cancer)、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、尿道癌、肝腫瘤(hepatoma)、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney/renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤、腦癌、頭頸癌或其相關轉移癌。
一種用於改造特異性結合於腫瘤樣本及針對腫瘤樣本之免疫細胞之方法，其包含：根據如請求項1至17中任一項之方法獲得特異性結合於腫瘤樣本及針對腫瘤樣本之抗體或其抗原結合片段；提供免疫細胞；及將該抗體或其抗原結合片段在該等免疫細胞上表現。
一種特異性結合於腫瘤樣本及針對腫瘤樣本之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區之互補決定區(CDR)及輕鏈可變區之互補決定區，其中該重鏈可變區之該互補決定區包含CDRH1、CDRH2及CDRH3區，且該輕鏈可變區之該互補決定區包含CDRL1、CDRL2及CDRL3區，且其中：該CDRH1區包含SEQ ID NO: 1(SYAMQ)之胺基酸序列；該CDRH2區包含選自由SEQ ID NO: 2 (GMSDDGSWTDYGAAVKG)及SEQ ID NO: 3 (GVSDDGSWTGYGAAVQG)組成之群之胺基酸序列；該CDRH3區包含選自由SEQ ID NO: 4 (GAGTGYCDNRSFGCASTIDA)及SEQ ID NO: 5 (GAGTGYCNNRGFGCASTIDA)組成之群之胺基酸序列；且該CDRL1區包含SEQ ID NO: 6 (SGSSGSYG)之胺基酸序列；該CDRL2區包含選自由SEQ ID NO: 7 (HNDKRPS)及SEQ ID NO: 8 (YNDKRPS)組成之群之胺基酸序列；該CDRL3區包含SEQ ID NO: 9(GSADRSGAGI)之胺基酸序列。
如請求項19之抗體或其抗原結合片段，其中該CDRH1區包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列；該CDRH2區包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列；該CDRH3區包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列；且該CDRL1區包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列；該CDRL2區包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列；該CDRL3區包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列；或該CDRH1區包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列；該CDRH2區包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列；該CDRH3區包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列；且該CDRL1區包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列；該CDRL2區包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列；該CDRL3區包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列。
如請求項19之抗體或其抗原結合片段，其包含包含SEQ ID NO: 10 (AVTLDESGGGLHTPGGGLSLVCRASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGMSDDGSWTDYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKGAGTGYCDNRSFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之胺基酸序列之重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 11 (ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYHNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVL)之胺基酸序列之輕鏈可變區；或包含SEQ ID NO: 12 (AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCRASGFTMTSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGVSDDGSWTGYGAAVQGRATISRDNGQSTVRLLLNNLRAEDTATYYCVKGAGTGYCNNRGFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)之胺基酸序列之重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 13 (ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVL)之胺基酸序列之輕鏈可變區。
如請求項19之抗體或其抗原結合片段，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO: 14 (ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYHNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVLGQSSRSSGGGGSSGGGGSAVTLDESGGGLHTPGGGLSLVCRASGFTFSSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGMSDDGSWTDYGAAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKGAGTGYCDNRSFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)及SEQ ID NO: 15 (ALTQPSSVSANLGETVEITCSGSSGSYGWYQQKSPGSAPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYYCGSADRSGAGIFGAGTTLTVLGQSSRSSAVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCRASGFTMTSYAMQWVRQAPGKGLEWVAGVSDDGSWTGYGAAVQGRATISRDNGQSTVRLLLNNLRAEDTATYYCVKGAGTGYCNNRGFGCASTIDAWGHGTEVIVSS)。
如請求項19之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段為單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體或scFv抗體或其片段。
如請求項19之抗體或其抗原結合片段，其表現在免疫細胞表面上。
一種醫藥組合物之用途，其係用在製造用於治療有需要個體之腫瘤的藥物；其中該醫藥組合物包含治療有效量之如請求項19至24中任一項之抗體或其抗原結合片段及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
如請求項25之用途，其中該藥物係經靜脈內、腹膜內、動脈內、鞘內、膀胱內或瘤內投與。
如請求項25之用途，其中該腫瘤為鱗狀細胞癌、肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、包括胃腸癌之胃癌(gastric/stomach cancer)、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、尿道癌、肝腫瘤(hepatoma)、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney/renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤、腦癌、頭頸癌或其相關轉移癌。