CN102027014A

CN102027014A - 用于治疗癌症的新抗体

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Publication number: CN102027014A
Application number: CN2009801169974A
Authority: CN
Inventors: J-F·奥乌
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2009-04-08
Publication date: 2011-04-20
Also published as: EP2268671A1; CO6311009A2; AU2009245587A1; FR2929946A1; CL2009000862A1; AR071304A1; NZ588887A; ZA201007751B; FR2929946B1; MX2010011147A; GEP20135826B; BRPI0909016A2; US20120284810A1; CA2720904A1; IL208595A0; KR20110010708A; US8198413B2; RU2010145063A; US20140193329A1; JP2011517565A

Abstract

本发明涉及可以特异性结合至人CD151蛋白的新抗体，特别是鼠源的单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体以及编码所述抗体的氨基酸和核酸序列。本发明涉及所述抗体作为用于预防性和/或治疗性治疗癌症的药物的用途以及所述抗体在用于诊断与过表达CD151蛋白相关疾病的方法或试剂盒中的用途。本发明还涉及含有与抗癌抗体和/或试剂结合的这样的抗体或与毒素和/或放射性元素偶联的这样的抗体的产物和/或组合物，以及其用于预防和/或治疗某些癌症的用途。

Description

用于治疗癌症的新抗体

背景技术

本发明涉及新抗体，特别是鼠源的单克隆抗体，其为嵌合的和人源化的，并且能够抑制肿瘤的生长，还涉及编码这些抗体的氨基酸和核酸序列。根据特别的方面，本发明涉及新抗体、衍生的化合物或功能性片段，它们能够抑制肿瘤细胞的增殖。本发明还包括这些抗体作为用于预防性和/或治疗性治疗癌症的药物的用途以及在癌症诊断方法或试剂盒中的用途。最后，本发明包括含有与例如抗癌试剂和/或抗体有关的这样的抗体或与毒素偶联的这样的抗体的产品和/或组合物，以及其在预防和/或治疗某些癌症中的用途。

CD151，还称为PETA-3或SFA-1，是属于四旋蛋白(tetraspanin)家族的膜蛋白(Boucheix和Rubinstein，2001，Cell Mol.Life Sci.58，1189-1205；Hemler，2001，J.Cell Biol.155，1103-1107)。在人类中，CD151具有253个氨基酸且包括4个膜片段和2个细胞外结构域EC1(18个氨基酸，序列[40-57])和EC2(109个氨基酸，序列[113-221])，其还称为细胞外环。但是需要注意的是，在核苷酸序列中，迄今已经有两个CD151的变体被鉴定，即分别在位置395和409上具有核苷酸A和C的一个[Fitter等人，1995，Blood 86(4)，1348-1355]，以及在相同的位置上具有核苷酸G和T而不是核苷酸A和C的另一个[Hasegawa等人，1996，J.Virol.70(5)，3258-3263]。结果是在肽序列中可以观察到突变，即分别在位置132和137上的残基K(Lys)和P(Pro)至残基R(Arg)和S(Ser)的突变[Fitter等人，1995，Blood 86(4)，1348-1355/Hasegawa等人，1996，J.Virol.70(5)，3258-3263]。

CD151在许多癌症中如例如肺癌[Tokuhara等人，2001，Clin.Cancer Res.7，4109-4114]、结肠癌[Hashida等人，2003，Br.J.Cancer 89，158-167]、前列腺癌[Ang等人，2004，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.13，1717-1721]或胰腺癌[Gesierich等人，2005，Clin.Cancer Res.11，2840-2852]中过表达。

使用不表达CD151的敲除小鼠以及使用抗CD151抗体和siRNA从而在体外阻断CD151在各种类型细胞中的功能和表达已经显示CD151参与一些与癌症相关的现象，如细胞粘附(Nishiuchi等人，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，1939-1944；Winterwood等人，2006，Mol.Biol.Cell 17，2707-2721)、细胞运动性(Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343)、细胞迁移(Yauch等人，1998，Mol.Biol.Cell 9，2751-2765；Testa等人，1999，Cancer Res.59，3812-3820；Penas等人，2000，J.Invest.Dermatol.114，1126-1135；Klosek等人，2005，Biochem.Biophys.Res.Commun.336，408-416)、细胞侵入(Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343；Shiomi等人，2005，Lab.Invest.85，1489-1506；Hong等人，2006，J.Biol.Chem.281，24279-24292)和血管发生(Yanez-Mo等人，1998，J.Cell Biol.141，791-804；Sincock等人，1999，J.Cell Sci.112，833-844；Takeda等人，2007，Blood 109，1524-1532)。

四旋蛋白的一个显著性质是其自我之间形成连接以及还与大量的其它表面分子形成连接从而形成有结构的大分子复合物的能力。在这些复合物中，每个四旋蛋白与一个或多个表面分子特异性结合，因此形成由四旋蛋白和伴侣分子组成的一级复合物。四旋蛋白能够构成质膜的特殊微结构域，其可以自微结构域募集其伴侣分子，所述伴侣分子可以是功能上偶联的。一套涉及四旋蛋白的相互作用被称为“四旋蛋白网络”或“四旋蛋白网”。

CD151在细胞表面上与各种膜蛋白相互作用。特别地，已经鉴定了高度稳定的与层粘连蛋白受体整合素的复合物，更特别地与整合素α3β1或α6β4(其优选的配体是层粘连蛋白5)的复合物，其对某些去污剂有抗性(Yauch等人，1998，Mol.Biol.Cell 9，2751-2765；Lammerding等人，2003，Proc.Natl.Acad.Sci USA 100，7616-7621)。这种连接涉及CD151的细胞外结构域和整合素。位于EC2环中的CD151的序列QRD[194-196]是非常重要的，其原因在于由于该位点突变引起的连接造成某些整合素的相互作用的缺失(Kazarov等人，2002，J.Cell Biol.158，1299-1309)。另外已经在肿瘤细胞中鉴定了CD151/整合素α6β4/c-Met(HGF受体)的功能性三元复合物(Klosek等人，2005，Biochem.Biophys.Res.Commun.336，408-416)。用干扰RNA处理细胞引起的CD151表达的抑制引起对由HGF引起的细胞生长和迁移的抑制。

在特定细胞中的CD151和其它四旋蛋白之间的相互作用(对于形成四旋蛋白网络是必须的)被认为依赖于CD151的膜和细胞质区，因为已经显示EC2环的删除不破坏CD151和其它四旋蛋白的连接(Berditchevski，2001，J.Cell Sci.114，4143-4151)。

CD151能够通过调节各种信号途径如例如经过与PI4激酶的连接的磷酸肌醇途径(Yauch等人，1998，Mol.Biol.Cell 9，2751-2765)，经过FAK、Src、p38-MAPK和JNK的磷酸化的c-Jun信号途径(Hong等人，2006，J.Biol.Chem.281，24279-24292)，由PKC磷酸化整合素(Zhang等人，2001，J.Biol.Chem.276，25005-25013)以及Rho家族的GTPase的激活(Shigeta等人，2003，J.Cell Biol.163，165-176)调节细胞粘附、迁移和侵入的现象。

细胞间嗜同性类型的相互作用也是细胞运动性增加和金属蛋白酶MMP-9表达增加的原因(Hong等人，2006，J.Biol.Chem.281，24279-24292)。这些细胞间CD151-CD151相互作用通过FAK、Src、p38-MAPK和JNK的磷酸化带来c-Jun的激活。

尽管对CD151蛋白有兴趣，至今产生了两个治疗目的的抗体，即单克隆抗体50-6和SFA1.2B4。这两个抗体有相当的活性。虽然它们在动物模型中确实抑制转移的体内形成，但是已经确定其在体内对肿瘤生长无作用。

针对CD151的单克隆抗体50-6(IgG1同种型)通过用人表皮样癌HEp-3细胞的消减免疫法在小鼠中产生(Testa等人，1999，Cancer Res.59，3812-3820)。

抗体50-6能够在由bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)引起的绒毛膜尿囊膜新血管形成的模型中在体外抑制人宫颈癌HeLa细胞(经转染从而过表达CD151)和HEp-3细胞的迁移和血管生成。在体内其可以抑制由两个鸡胚模型中接种HEp-3细胞带来的转移(Testa等人，1999，Cancer Res.59，3812-3820)。在这些模型中，抗体50-6的抑制活性通过测定肺提取物中的蛋白huPA(人尿激酶型纤溶酶原激活剂)的活性而确定。根据作者，这一分析反应了人细胞在肺中的存在。分析后，由抗体50-6带来的转移(HEp-3细胞向鸡胚肺中的扩散)的减少通过与对照抗体比较，在所谓的“自发转移”模型中被估计为74％(其中先接种细胞，接着注射抗体)，在所谓的“实验转移”模型中被估计为57％(其中细胞和抗体一起接种)。根据作者，在体内观察到的抗体50-6的抗肿瘤性质似乎与细胞抑制或细胞毒效应无关，因为抗体对HEp-3细胞的体外增殖未显示出有效应。

产生抗体50-6的杂交瘤可以在ATCC获得，编号为CRL-2696(杂交瘤最初在编号50-6[PTA-227]下保存)。

抗CD151单克隆抗体SFA1.2B4(IgG1同种型)在通过腹腔内途径用转染了人CD151基因的NIH 3T3细胞免疫后在小鼠中产生(Hasegawa等人，1996，J.Virol.70，3258-3263)。抗体SFA1.2B4能够在体外抑制各种人肿瘤细胞系的细胞侵入和迁移(Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343)。其在体内抑制经转染而过表达CD151的结肠癌RPMI14788和纤维肉瘤HT1080细胞系引起的肺转移(Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343)。

其它鼠抗CD151抗体已经在文献中有描述，如例如单克隆抗体14A2H1(Ashman等人，1991，Br.J.Haematol.79，263-270；Roberts等人，1995，Br.J.Haematol.89，853-860)、TS151和TS151R(Serru等人，1999，Biochem.J.340，103-111；Geary等人，2001，Tissue Antigens 58，141-153；Charrin等人，J.Biol.Chem.276，14329-14337；Chometon等人，2006，Exp.Cell Res.312，983-985)。对那些各种的抗体没有体内抗肿瘤活性的描述。

几个实验研究显示了四旋蛋白通过作为转移的抑制子或促进子起作用在转移的形成中有主要作用。因此，转染四旋蛋白如CD9、CD63或CD82减少了癌系的转移潜能。相反，表达四旋蛋白CD151和Co-029似乎产生相反的效果。因此这两种四旋蛋白被认为是转移的促进子。这些结果与各种临床研究一致，所述研究显示：在许多癌症中(乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤，...)，当有转移时，CD9和CD82在原发肿瘤中表达较低，并且其表达的降低预测了较低的存活率。在肺癌中，与当只有这两种抗原中的一种表达降低时相比，CD9和CD82表达的联合降低与更大的转移潜能相关。

几个以往的研究显示过表达CD151与某些癌症如肺癌、结肠癌和前列腺癌的侵占性相关，并且其可以被认为是不良预后的一个因素(Tokuhara等人，2001，Clin.Cancer Res.7，4109-4114；Hashida等人，2003，Br.J.Cancer 89，158-167；Ang等人，2004，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.13，1717-1721)。在这些病例中，与那些具有不表达CD151的肿瘤的患者相比，事实上在那些具有表达CD151的肿瘤的患者中平均存活率降低。

通过转染相应基因而产生的CD151在各种人肿瘤系(HeLa、RPMI14788、A172、HT1080)中的过表达造成经转染细胞的运动性、迁移和侵入的增加(Testa等人，1999，Cancer Res.59，3812-3820；Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343)。这些现象在存在抗CD151抗体时得到抑制。

根据第一个方面，本发明涉及分离的抗体，或一个其衍生的化合物或功能性片段，其能够与CD151蛋白结合，所述抗体的特征在于其含有至少一个选自序列SEQ ID No.1-6，17-22，33-35，43-48，59-63，69-73，79-81或85-89的CDR的CDR或至少一个其序列与序列SEQ ID No.1-6，17-22，33-35，43-48，59-63，69-73，79-81或85-89(在最佳比对后)具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性的CDR。

根据本发明的抗体的“功能性片段”被理解为特别地是指抗体片段如Fv，scFv(sc代表“单链”)，Fab，F(ab′)₂，Fab′或scFv-Fc片段或双特异抗体(diabody)或任何其半衰期增加的片段。这样的功能性片段将在本说明书的下文中详细描述。

根据本发明的抗体的“衍生的化合物”被理解为特别地是指结合蛋白质，其含有肽框架或“骨架”和至少一个原始抗体的CDR以便保持其识别能力。这样的衍生的化合物对本领域技术人员是熟知的，并将在本说明书中的下文更详细地描述。

更优选地，根据本发明，本发明包括抗体，其衍生的化合物或其功能性片段，其特别是嵌合的或人源化的，通过遗传重组或通过化学合成获得。

根据优选的具体实施方案，根据本发明，抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段的特征在于其由单克隆抗体组成。

“单克隆抗体”被理解为由一群基本上同质的抗体衍生的抗体。更特别地，除了几个可能的可以天然产生的突变和可以以最小量存在的突变以外，一群中的单个抗体是相同的。换句话说，单克隆抗体由只有一个细胞克隆增殖产生的同质抗体组成(例如，杂交瘤、转染了编码同质抗体的DNA分子的真核宿主细胞、转染了编码同质抗体的DNA分子的原核宿主细胞等)并且通常其特征为一类和同类和亚类的重链和仅一种类型的轻链。单克隆抗体是高度特异性的并且针对单一抗原。另外，与通常含有不同的针对不同决定簇或表位的抗体的多克隆抗体制备相反，每个单克隆抗体针对抗原的单一表位。

本文中必须理解的是本发明不涉及天然形式的抗体，就是说，其不是从其天然环境中取得而是可能通过从天然来源起始的纯化而分离或获得，否则通过遗传重组或通过化学合成而获得，并且因此其可以含有非天然的氨基酸如下文所述。

更特别地，根据本发明的第一个具体实施方案，描述了第一个抗体，其特征在于其含有：

i)含有至少一个选自CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR的轻链，其中

-CDR-L1选自序列SEQ ID No.1或59的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.1或59具有至少80％同一性的序列；

-CDR-L2选自SEQ ID No.2或60的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.2或60具有至少80％同一性的序列；

-CDR-L3是序列SEQ ID No.3的或至少一个在最佳比对后与SEQ ID No.3具有至少80％同一性的序列；和/或

ii)含有至少一个选自CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR的重链，其中

-CDR-H1选自序列SEQ ID No.4或61的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.4或61具有至少80％同一性的序列；

-CDR-H2选自序列SEQ ID No.5或62的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.5或62具有至少80％同一性的序列；

-CDR-H3选自序列SEQ ID No.6或63的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.6或63具有至少80％同一性的序列。

根据本发明的第二个具体实施方案，描述了第二个抗体，其特征在于其含有：

i)含有至少一个选自CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR的轻链，其中

-CDR-L1选自序列SEQ ID No.17或69的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.17或69具有至少80％同一性的序列；

-CDR-L2选自序列SEQ ID No.18或70的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.18或70具有至少80％同一性的序列；

-CDR-L3是序列SEQ ID No.19或至少一个在最佳比对后与SEQ ID No.19具有至少80％同一性的序列；和/或

ii)含有至少一个选自CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR的重链，其中

-CDR-H1选自序列SEQ ID No.20或71的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.20或71具有至少80％同一性的序列；

-CDR-H2选自序列SEQ ID No.21或72的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.21或72具有至少80％同一性的序列；

-CDR-H3选自序列SEQ ID No.22或73的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.22或73具有至少80％同一性的序列。

根据本发明的进一步的第三个具体实施方案，描述了第三个抗体，其特征在于其含有：

i)含有至少一个选自CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR的轻链，其中

-CDR-L1选自序列SEQ ID No.33或79的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.33或79具有至少80％同一性的序列；

-CDR-L3的序列是SEQ ID No.3或至少一个在最佳比对后与SEQ ID No.3具有至少80％同一性的序列；和/或

ii)含有至少一个选自CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR的重链，其中

-CDR-H2选自序列SEQ ID No.34或80的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.34或80具有至少80％同一性的序列；

-CDR-H3选自序列SEQ ID No.35或81的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.35或81具有至少80％同一性的序列。

最后，根据本发明的最后的具体实施方案，描述了第四个抗体，其特征在于其含有：

i)含有至少一个选自CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR的轻链，其中

-CDR-L1选自序列SEQ ID No.43或85的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.43或85具有至少80％同一性的序列；

-CDR-L2选自序列SEQ ID No.44或86的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.44或86具有至少80％同一性的序列；

-CDR-L3的序列是SEQ ID No.45或至少一个在最佳比对后与SEQ ID No.45具有至少80％同一性的序列；和/或

ii)含有至少一个选自CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR的重链，其中

-CDR-H1选自序列SEQ ID No.46或87的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.46或87具有至少80％同一性的序列；

-CDR-H2选自序列SEQ ID No.47或88的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.47或88具有至少80％同一性的序列；

-CDR-H3选自序列SEQ ID No.48或89的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.48或89具有至少80％同一性的序列。

以通常的方式在此回顾：CDR区或CDR被理解为表示免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。有3个重链CDR和3个轻链CDR。本文中使用的术语CDR或CDRs是指，根据特别的情况，那些区中的一个或那些区中的多个或实际上全部(其含有大多数氨基酸残基)负责抗体对抗原或其识别的表位的结合亲和力。

根据第一个方法，CDR可以根据IMGT系统定义。定义了IMGT独特的编号系统以便比较可变结构域，不论什么抗原、链类型或物种[Lefranc M.-P.，Immunology Today 18，509(1997)；Lefranc M.-P.，The Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.-P.，Pommié，C.，Ruiz，M.，Giudicelli，V.，Foulquier，E.，Truong，L.，Thouvenin-Contet，V.and Lefranc，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)]。在这一编号系统中，保守的氨基酸总是维持在相同的位置，如半胱氨酸23(第一个CYS)、色氨酸41(保守的TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104(第二个CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或TRP)。因此IMGT独特的编号系统提供了标准的骨架区(FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：位置39至55，FR3-IMGT：位置66至104和FR4_IMGT：位置118至128)以及互补决定区或CDR(CDR1-IMGT：位置27至38，CDR2-IMGT：位置56至65和CDR3-IMGT：位置105至117)的界定。因为“孔”或“空”代表空闲位置，根据IMGT的CDR的长度成为关键的信息。IMGT系统用于2D图像表示，其然后被称为IMGT珍珠项链[Ruiz，M.和Lefranc，M.-P.，Immunogenetics，53，857-883(2002)；Kaas，Q.和Lefranc，M.-P.，Current Bioinformatics，2，21-30(2007)]，用于3D结构被称为IMGT/3D结构-DB[Kaas，Q.，Ruiz，M.和Lefranc，M.-P.，T cell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.，32，D208-D210(2004)]。

根据该第一方法，根据本发明的第一个抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和/或重链，所述轻链含有至少一个分别选自序列SEQ ID Nos.1、2和3的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.1、2和3具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性；所述重链含有至少一个分别选自序列SEQ ID Nos.4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.4、5和6具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

为了更清楚，提及的蛋白质序列如下：

SEQ ID No.1：ASVEYYGTSL

SEQ ID No.2：EAS

SEQ ID No.3：QQSRKAPYT

SEQ ID No.4：GFTFSTYT

SEQ ID No.5：ISSGGGTT

SEQ ID No.6：ATPRIGTGFAY

更特别地，以优选的方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.1、2和3的三个CDR(根据IMGT定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.1、2和3具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

以同样优选的方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有重链，所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.4、5和6的三个CDR(根据IMGT定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.4、5和6具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

根据该相同的方法，根据本发明的第二个抗体，或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和/或重链，所述轻链含有至少一个分别选自序列SEQ ID Nos.17、18和19的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.17、18和19具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性；所述重链含有至少一个分别选自序列SEQ ID Nos.20、21和22的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.20、21和22具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

为了更清楚，提及的蛋白质序列如下：

SEQ ID No.17：ATPRIGTGFAY

SEQ ID No.18：SAS

SEQ ID No.19：QQYSSNPT

SEQ ID No.20：GFTLSTSGMG

SEQ ID No.21：IYWDDDK

SEQ ID No.22：ARRDHYGDYSYAMDY

更特别地，以优选的方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.17、18和19的三个CDR(根据IMGT定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.17、18和19具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

以相同的优选方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有重链，所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.20、21和22的三个CDR(根据IMGT定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.20、21和22具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

还根据该相同的方法，根据本发明的第三个抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和/或重链，所述轻链含有至少一个分别选自序列SEQ ID No.33、2和3的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.33、2和3具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性；所述重链含有至少一个分别选自序列SEQ ID No.4、34和35的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.4、34和35具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

为了更清楚，提及的蛋白质序列如下：

SEQ ID No.33：ASVDYYGTSL

SEQ ID No.34：ISSGGVTT

SEQ ID No.35：TSPRTGTGFAY

更特别地，以优选的方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.33、2和3的三个CDR(根据IMGT定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.33、2和3具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

以相同的优选方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有重链，所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.4、34和35的三个CDR(根据IMGT定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.4、34和35具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

最后，还根据该相同的方法，根据本发明的第四个和最后的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和/或重链，所述轻链含有至少一个分别选自序列SEQ ID Nos.43、44和45的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.43、44和45具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性；所述重链含有至少一个分别选自序列SEQ ID Nos.46、47和48的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.46、47和48具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

为了更清楚，提及的蛋白质序列如下：

SEQ ID No.43：ENVGTY

SEQ ID No.44：GAS

SEQ ID No.45：GQTYSFPYT

SEQ ID No.46：GYTFTSSS

SEQ ID No.47：IHPNSGNT

SEQ ID No.48：ARARSFYYAMDC

更特别地，以优选的方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.43、44和45的三个CDR(根据IMGT定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.43、44和45具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

以相同的优选方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有重链，所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.46、47和48的三个CDR(根据IMGT定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.46、47和48具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

根据第二个方法，CDR可以根据Kabat等人的常规方法定义(Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，第五版本，U.S.Department of Health and Human Services，NIH，1991，和以后版本)。

根据该第一个方法，根据本发明的第一个抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和/或重链，所述轻链含有至少一个分别选自序列SEQ ID Nos.59、60和3的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.59、60和3具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性；所述重链含有至少一个分别选自序列SEQ ID Nos.61、62和63的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.61、62和63具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

为了更清楚，提及的蛋白质序列如下：

SEQ ID No.59：RASASVEYYGTSLMH

SEQ ID No.60：EASNVES

SEQ ID No.61：STYTMS

SEQ ID No.62：YISSGGGTTYYPDTVKG

SEQ ID No.63：PRIGTGFAY

更特别地，以优选的方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.59、60和3的三个CDR(根据Kabat定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.59、60和3具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

以相同的优选方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有重链，所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.61、62和63的三个CDR(根据Kabat定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.61、62和63具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

根据该相同的方法，根据本发明的第二个抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和/或重链，所述轻链含有至少一个分别选自序列SEQ ID Nos.69、70和19的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.69、70和19具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性；所述重链含有至少一个分别选自序列SEQ ID Nos.71、72和73的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.71、72和73具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

为了更清楚，提及的蛋白质序列如下：

SEQ ID No.69：KASQNVGIAVA

SEQ ID No.70：SASNRYT

SEQ ID No.71：STSGMGVS

SEQ ID No.72：HIYWDDDKRYNPSLKS

SEQ ID No.73：RDHYGDYSYAMDY

更特别地，以优选的方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.69、70和19的三个CDR(根据Kabat定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.69、70和19具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

以相同的优选方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有重链，所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.71、72和73的三个CDR(根据Kabat定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.71、72和73具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

还根据该相同的方法，根据本发明的第三个抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和/或重链，所述轻链含有至少一个分别选自序列SEQ ID Nos.79、60和3的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.79、60和3具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性；所述重链含有至少一个分别选自序列SEQ ID Nos.61、80和81的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.100、101和102具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

为更清楚，提及的蛋白质序列如下：

SEQ ID No.79：ASVDYYGTSL

SEQ ID No.80：YISSGGVTTYYPDTIKG

SEQ ID No.81：PRTGTGFAY

更特别地，以优选的方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.79、60和3的三个CDR(根据Kabat定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.79、60和3具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

以相同的优选方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有重链，所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.61、80和81的三个CDR(根据Kabat定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.61、80和81具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

最后，还根据该相同的方法，根据本发明的第四个和最后的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和/或重链，所述轻链含有至少一个分别选自SEQ ID No.85、86和45的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.85、86和45具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性；所述重链含有至少一个分别选自SEQ ID Nos.87、88和89的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.87、88和89具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

为了更清楚，提及的蛋白质序列如下：

SEQ ID No.85：KASENVGTYVS

SEQ ID No.86：GASNRYTGVPD

SEQ ID No.87：TSSSMH

SEQ ID No.88：EIHPNSGNTNNNEKFKG

SEQ ID No.89：ARSFYYAMDC

更特别地，以优选的方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.85、86和45的三个CDR(根据Kabat定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.85、86和45具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

以相同的优选方式，根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有重链，所述重链含有分别为序列SEQ ID No.87、88和89的三个CDR(根据Kabat定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.87、88和89具有至少80％，优选85％，90％，95％和98％的同一性。

在本说明书中，术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”和“与抗体化合物结合的蛋白质或其序列”是可以互换的。

本文中必须理解的是本发明不涉及天然形式的抗体，就是说，其不是从其天然环境中获得的，而是可以通过从天然来源起始的纯化而被分离或获得，否则通过遗传重组或通过化学合成而获得，并且因此其可以含有将在下文中描述的非天然的氨基酸。

两个核酸或氨基酸序列之间的“百分比同一性”被本发明理解为是指两个被比较的序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比，其在最好比对后获得(最佳比对)，该百分比是纯统计学的并且两个序列之间的差别在其整个长度上是随机分布的。两个核酸或氨基酸序列之间的序列比较在其被最佳比对后通过比较那些序列而常规进行，可能的是所述比较一个片段接一个片段地进行或通过“比较窗口”的方法进行。用于比较的序列的最佳比对除了可以手工进行外，还可以通过以下方式进行：Smith和Waterman(1981)的局部同源算法[Ad.App.Math.2：482]，Neddleman和Wunsch(1970)的局部同源算法[J.Mol.Biol.48：443]，Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444]，或应用那些算法的计算机软件(the Wisconsin Genetics软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI，或通过比较软件BLASTN或BLAST P)。

两个核酸或氨基酸序列之间的百分比同一性通过比较两个最佳比对序列而确定，其中所述比对序列中待比较的核酸或氨基酸序列可以含有相对于那两个序列之间最佳比对的参考序列的添加或删除。百分比同一性通过确定两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的相同位置的数目而计算，以相同位置的数目除以比较窗口中位置的总数目并将获得的结果乘以100从而获得这两个序列之间的百分比同一性。

例如，可能使用的BLAST程序“BLAST 2 sequences”(Tatusova等人，“Blast 2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)可以从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上获得，使用的参数是以那些缺省值给出的(特别是参数“开放空隙罚分”：5，和“延伸空隙罚分”：2；选择的阵距是例如程序所建议的“BLOSUM 62”阵距)，比较的两个序列之间的百分比同一性直接由程序计算得出。

由于氨基酸序列具有与参考氨基酸序列至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性，优选的是具有相对于参考序列的某些修饰特别是至少一个氨基酸的删除、添加或置换、截短或延伸的序列。在一个或多个连续或不连续的氨基酸的置换情况下，优选的是被置换的氨基酸由“同等的”氨基酸替代的置换。本文中的表述“同等的氨基酸”是指任何能够被基本结构中的一个氨基酸置换，但不会根本地改变相应抗体的生物学活性的氨基酸，如将在下文中特别是在实施例中描述的。

这些同等的氨基酸可以基于其与被置换的氨基酸的结构同源性而确定或基于各种可以产生的抗体之间的比较性生物学活性的测试结果而确定。

通过非限制性实施例的方式，下面的表1回顾了能够实施而不引起相应的经修饰抗体的生物学活性根本改变的置换可能性，在相同条件下当然可行的反向置换。

表1

原始残基	置换残基
		Ala(A)	Val，Gly，Pro
Arg(R)	Lys，His
		Asn(N)	Gln
Asp(D)	Glu
		Cys(C)	Ser
Gln(Q)	Asn
		Glu(G)	Asp
Gly(G)	Ala
		His(H)	Arg
Ile(I)	Leu
		Leu(L)	Ile，Val，Met
Lys(K)	Arg
		Met(M)	Leu
Phe(F)	Tyr
		Pro(P)	Ala
Ser(S)	Thr，Cys
		Thr(T)	Ser
Trp(W)	Tyr
		Tyr(Y)	Phe，Trp
Val(V)	Leu，Ala

作为现有技术被本领域技术人员认识到的是6个CDR之间的最大可变性(长度和组成)定位于重链的3个CDR中，更特别地，在该重链的CDR-H3中。因此，显然根据本发明的抗体的优选特征性CDR将是重链的3个CDR，甚至更优选地，是对应于CDR-H3的CDR。

在特定的具体实施方案中，根据本发明，本发明涉及鼠抗体，或一个其衍生的化合物或功能性片段。

根据本发明的另一个具体实施方案，所述第一个抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和重链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.1、2和3的三个CDR(根据IMGT定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.1、2和3具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性；所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.4、5和6的三个CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.4、5和6具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性。

根据本发明的另一个具体实施方案，所述第一个抗体，或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和重链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.59、60和3的三个CDR(根据Kabat定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.59、60和3具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性；所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.61、62和63的三个CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.61、62和63具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性。

根据另一个具体实施方案，根据本发明，抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链，所述轻链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.7的序列或在最佳比对后与序列SEQ ID No.7具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性，和/或其含有重链，所述重链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.8的序列或在最佳比对后与序列SEQ ID No.8具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性。

为了更清楚，提及的蛋白质序列如下：

SEQ ID No.7：

DIVLSQSPASLALSLGQRATISCRASASVEYYGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYEASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDLAIYFCQQSRKAPYTFGGGTKLEIK

SEQ ID No.8：

EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYTMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLKSEDTAMYYCATPRIGTGFAYWGQGTLVTVSA

根据本发明的另一个具体实施方案，所述第二个抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和重链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.17、18和19的三个CDR(根据IMGT定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.17、18和19具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性；所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.20、21和22的三个CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.20、21和22具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性。

根据本发明的另一个具体实施方案，所述第二个抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和重链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.69、70和19的三个CDR(根据Kabat定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.69、70和19具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性；所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.71、72和73的三个CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.71、72和73具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性。

根据另一个具体实施方案，根据本发明，抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链，所述轻链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.23的序列或在最佳比对后与序列SEQ ID No.23具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性；和/或含有重链，所述重链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.24的序列，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.24具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性。

为了更清楚，提及的蛋白质序列如下：

SEQ ID No.23：

DIVMTQSQKFMSTSEGDRVSITCKASQNVGIAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYFCQQYSSNPTFGAGTKLELK

SEQ ID No.24：

QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFTLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCARRDHYGDYSYAMDYWGQGTSVTVSS

根据本发明的另一个具体实施方案，所述第三个抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和重链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.33、2和3的三个CDR(根据IMGT定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.33、2和3具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性；所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.4、34和35的三个CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.4、34和35具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性。

根据本发明的另一个具体实施方案，所述第三个抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和重链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.79、60和3的三个CDR(根据Kabat定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.79、60和3具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性；所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.61、80和81的三个CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID No.61、80和81具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性。

根据本发明的另一个具体实施方案，根据本发明，抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链，所述轻链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.36的序列或在最佳比对后与序列SEQ ID No.36具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性；和/或含有重链，所述重链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.37的序列或在最佳比对后与序列SEQ ID No.37具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性。

为了更清楚，提及的蛋白质序列如下：

SEQ ID No.36：

DIVLTQSPASLALSLGQRATISCRASASVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYEASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDLAIYFCQQSRKAPYTFGGGTKLEIK

SEQ ID No.37：

EVKLVESGGDLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYTMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGVTTYYPDTIKGRFTISRDNAKNTLFLQMNSLKSEDTAMYYCTSPRTGTGFAYWGQGTLVTVSA

根据本发明的另一个具体实施方案，所述第四个抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和重链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.43、44和45的三个CDR(根据IMGT定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.43、44和45具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性；所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.46、47和48的三个CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.46、47和48具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性。

根据本发明的另一个具体实施方案，所述第四个抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链和重链，所述轻链含有分别为序列SEQ ID Nos.85、86和45的三个CDR(根据Kabat定义)，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.85、86和45具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性；所述重链含有分别为序列SEQ ID Nos.87、88和89的三个CDR，或在最佳比对后与序列SEQ ID Nos.87、88和89具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性。

根据本发明的另一个具体实施方案，根据本发明，抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段含有轻链，所述轻链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.49的序列或在最佳比对后与序列SEQ ID No.49具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性；和/或含有重链，所述重链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.50的序列或在最佳比对后与序列SEQ ID No.50具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的同一性。

为了更清楚，提及的蛋白质序列如下：

SEQ ID No.49：

NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQTYSFPYTFGGGTKLEIK

SEQ ID No.50：

QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKASGYTFTSSSMHWAKQRPGQGLEWIGEIHPNSGNTNNNEKFKGKATLTVDTSSSTAYVDLSSLSSEDSAVYYCARARSFYYAMDCWGQGTSVTVSS

如上文指出的，本发明同样针对任何从根据本发明的抗体衍生的化合物。

更特别地，根据本发明，抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段的特征在于所述衍生的化合物由结合蛋白质组成，所述结合蛋白质含有肽骨架，在骨架上移植了至少一个CDR以便完全或部分保持最初抗体的原位旁(paratopic)识别性质。

还可以在各种免疫球蛋白的蛋白质骨架上或框架上提供本发明中描述的CDR序列中的一个或多个序列。在这种情况下，蛋白质序列使得其可以重建对移植的CDR或CDRs折叠有利的肽骨架，使得它/它们保持其抗原识别的原位旁性质。

以通常的方式，本领域技术人员将知道如何确定蛋白质骨架的类型，在所述骨架上需要移植至少一个源自原始抗体的CDR。更特别地，已知为了选择，这样的骨架必须满足最多数目以下列出的标准(Skerra A.，J.Mol.Recogn.13，2000，167-187)：

-良好的种族发育(phylogenetic)保守性；

-已知的三维结构(如例如，通过结晶照相术、NMR光谱学或任何其它本领域技术人员已知的技术)；

-小的尺寸；

-很少的转录后修饰或无转录后修饰；和/或

-容易产生、表达和纯化。

这样的蛋白质骨架的来源可以是但不限于选自以下的结构：纤维结合蛋白和优选地3型纤维结合蛋白的第10个结构域、载脂蛋白、抗运载蛋白(anticalin)(Skerra A.，J.Biotechnol.，2001，74(4)：257-75)、源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A结构域B的蛋白Z、硫氧还蛋白A以及具有“锚蛋白重复”的重复基序的蛋白质(Kohl等人，PNAS，2003，vol.100，No.4，1700-1705)、“犰狳重复”、“富含亮氨酸重复”或“三十四肽重复(tetratricopeptide repeat)”型。

还可以提及源自毒素(如例如以下源自蝎子、昆虫、植物、贝类等的毒素)或神经元一氧化氮合成酶的蛋白抑制剂(PIN)的骨架。

作为这样的杂合结构的例子(决不是限制)，可以提及的是将抗CD4抗体的CDR-H1(重链)即13B8.2插入PIN的一个环中，因此获得的新结合蛋白保留了原始抗体的相同结合性质(Bes等人，BBRC 343，2006，334-344)。还可以提及的是(以举例的方式)将抗溶菌酶VHH抗体的CDR-H3(重链)移植至新抑癌蛋白的一个环上(Nicaise等人，2004)。

最后如上文中描述的，这样的肽骨架可以含有源自原始抗体的1至6个CDR。优选地，但不是必须的，本领域技术人员将选择至少一个源自重链的CDR，后者已知主要负责抗体的特异性。相关CDR的选择将对本领域技术人员是显而易见的，后者有目的的实施已知的技术(Bes等人，FEBS letters 508，2001 67-74)。

显然，这些例子决不是限制性的，任何其它对技术人员是已知的或显然的结构必须被考虑在本专利申请提供的保护范围内。

因此本发明涉及抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段，其特征为所述肽骨架选自下列蛋白质：a)种族发育上是非常保守的，b)有很强的结构，c)具有熟知的三维分子结构，d)有小的尺寸和/或e)含有可以通过删除和/或插入修饰而不改变稳定性性质的区域。

根据优选的具体实施方案，根据本发明，抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段的特征在于肽骨架选自：i)源自纤维结合蛋白，优选3型纤维结合蛋白的第10结构域、载脂蛋白、抗运载蛋白、源自金黄色葡萄球菌的蛋白A结构域B的蛋白Z、硫氧还蛋白A的骨架，ii)具有“锚蛋白重复”、“犰狳重复”“富含亮氨酸重复”或“三十四肽重复”型的重复基序的蛋白质以及还有iii)神经元一氧化氮合成酶的蛋白抑制剂(PIN)。

根据本发明的另一个方面，同样提及的是上文所述抗体的功能性片段。

更特别地，本发明针对抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段，本发明的特征在于所述功能性片段选自Fv、Fab，(Fab′)₂、Fab′、scFv和scFv-Fc片段和双特异抗体和任何其半衰期被延长的片段如聚乙二醇化的片段。

这样的根据本发明的抗体的功能性片段由下列组成：例如Fv、scFv(sc代表单链)、Fab、F(ab′)₂、Fab′或scFv-Fc片段或双特异抗体，或任何其半衰期通过下列方式延长的片段：化学修饰，所述修饰例如加入聚亚烷基二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化修饰(PEGylation)”)(聚乙二醇化片段被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab′)₂-PEG或Fab′-PEG)(来自指定聚乙二醇的“PEG”)，或者通过掺入至脂质体、微球或PLGA，所述片段具有至少一个根据本发明的特征性CDR，并且特别地能够通常(甚至是部分地)发挥衍生其的抗体的活性。

优选地，所述功能性片段将由下列组成或将含有：衍生其的抗体的可变重链或轻链的部分序列，所述部分序列足以保留与衍生其的抗体相同的结合特异性和足够的亲和力，所述亲和力优选等于衍生其的抗体的至少1/第100，更优选至少1/第10。

这样的功能性片段将含有至少5个连续的氨基酸，优选10、15、25、50或100个连续的来自衍生其的抗体序列的氨基酸。

优选地，这些功能性片段将是Fv、scFv、Fab、F(ab′)₂、F(ab′)、scFv-Fc型或双特异抗体的片段，其通常具有与其获自的抗体相同的固定特异性。根据本发明，本发明的抗体的片段可以通过方法如使用酶如胃蛋白酶或番木瓜蛋白酶的消化和/或通过化学还原方法分裂二硫桥而从上文所述抗体开始获得。包括在本发明中的抗体片段还可以通过同样是本领域技术人员熟知的遗传重组技术或通过例如自动肽合成仪(如那些由Applied Biosystems公司提供的肽合成仪等)通过肽合成获得。

根据另一个特别的方面，根据本发明，本发明涉及嵌合抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段，其特征在于所述抗体还含有源自与小鼠异源物种(特别是人)的抗体的恒定轻链和重链区。

根据本发明的另一个方面，人源化抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段的特征在于源自人抗体的恒定轻链和重链区分别是λ或κ区和γ-1、γ-2或γ-4区。

根据另一个方面，本发明涉及能够分泌根据本发明的单克隆抗体的第一个鼠杂交瘤，特别是2008年2月22日在国家微生物培养物保藏中心(CNCM)(法国巴黎巴斯德研究所)的I-3920号下保存的鼠源杂交瘤。所述杂交瘤通过融合经免疫的Balb/c小鼠脾细胞和Sp 2O Ag 14骨髓瘤细胞系获得。所述2008年2月22日在CNCM的号I-3920下保存的杂交瘤分泌单克隆抗体(在本文被称为203B6)或一个其衍生的化合物或功能性片段。

根据另一个方面，本发明涉及能够分泌根据本发明的单克隆抗体的第二个鼠杂交瘤，特别是2008年2月22日在国家微生物培养物保藏中心(CNCM)(法国巴黎巴斯德研究所)的号I-3921下保存的鼠源杂交瘤。所述杂交瘤通过融合经免疫的Balb/c小鼠脾细胞和Sp 2O Ag 14骨髓瘤细胞系获得。所述2008年2月22日在CNCM的号I-3921下保存的杂交瘤分泌单克隆抗体(在本文被称为205H8)或一个其衍生的化合物或功能性片段。

根据另一个方面，本发明涉及能够分泌根据本发明的单克隆抗体的第三个鼠杂交瘤，特别是2008年2月21日在国家微生物培养物保藏中心(CNCM)(法国巴黎巴斯德研究所)的号I-3918下保存的鼠源杂交瘤。所述杂交瘤通过融合经免疫的Balb/c小鼠脾细胞和Sp 2O Ag 14骨髓瘤细胞系获得。所述2008年2月21日在CNCM的号I-3918下保存的杂交瘤分泌单克隆抗体(在本文被称为211F3)或一个其衍生的化合物或功能性片段。

最后，根据另一个方面，本发明涉及能够分泌根据本发明的单克隆抗体的第四个鼠杂交瘤，特别是2008年2月21日在国家微生物培养物保藏中心(CNCM)(法国巴黎巴斯德研究所)的号I-3919下保存的鼠源杂交瘤。所述杂交瘤通过融合经免疫的Balb/c小鼠脾细胞和Sp 2O Ag 14骨髓瘤细胞系获得。所述2008年2月21日在CNCM的号I-3919下保存的杂交瘤分泌单克隆抗体(在本文被称为214B2)或一个其衍生的化合物或功能性片段。

为了更清楚，下文的表2总结了对应于不同的根据本发明的抗体的不同氨基酸序列，根据IMGT定义的CDR序列用黑体表示，那些根据Kabat定义的用斜体表示。

表2

根据本发明的抗体还包括嵌合的或人源化的抗体。

嵌合(也称为嵌合(chimaeric))抗体被理解为是指含有天然可变(轻链和重链)区(源自给定物种的抗体)的抗体，所述可变区与来自所述给定物种异源的物种的抗体的恒定轻链和重链区相结合。

根据本发明，嵌合型抗体或其片段可以使用遗传重组技术制备。例如嵌合抗体可以通过克隆重组DNA产生，所述重组DNA含有启动子和编码非人类(特别是鼠)的根据本发明的单克隆抗体的可变区的序列和编码人抗体恒定区的序列。用这样的重组基因编码的本发明的嵌合抗体可以是例如鼠-人嵌合体，该抗体的特异性通过源自鼠DNA的可变区确定，并且其同种型通过源自人DNA的恒定区确定。对于制备嵌合抗体的方法，可以参考例如文献Verhoeyn等人(BioEssays，8：74，1988)。

人源化抗体被理解为是指含有源自非人源抗体的CDR区的抗体，抗体分子的其它部分源自一个(或多个)人抗体/多个抗体或种系。另外，骨架区段的一些残基(称为FR)可以被修饰从而保留结合亲和力(Jones等人，Nature，321：522-525，1986；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536，1988；Riechmann等人，Nature，332：323-327，1988)。

根据本发明的人源化抗体或其片段可以通过本领域技术人员已知的技术制备(如例如那些在文献Singer等人，J.Immun.150：2844-2857，1992；Mountain等人，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10：1-142，1992；或Bebbington等人，Bio/Technology，10：169-175，1992中描述的那些)。这样的根据本发明的人源化抗体优选用于体外诊断方法或用于体内预防性和/或治疗性治疗。其它人源化技术对本领域技术人员来说也是已知的，如例如PDL描述的“CDR移植”技术，其是专利EP 0 451 261、EP 0 682 040、EP 0 939 127，EP 0 566 647或也是US 5,530,101、US 6,180,370、US5,585,089和US 5,693,761的主题。还提及的是专利US 5,639,641或还是6,054,297，5,886,152和5,877,293。

另外，本发明还针对源自上文所述的鼠和嵌合抗体的人源化抗体。

优选地，源自人抗体的恒定轻链和重链区分别是λ或κ区和γ-1、γ-2或γ-4区。

在对应于IgG1同种型的具体实施方案中，抗体的另外特征在于具有效应器功能如ADCC(依赖抗体的细胞的细胞毒性)和/或CDC(依赖补体的细胞毒性)。

另外，将从下文的实施例中出现的，本发明涉及的抗体与至今已知的抗体不同之处在于其能够抑制肿瘤细胞的增殖。

如上文陈述的，CD151蛋白属于四旋蛋白家族，由于其含有2个细胞外结构域EC1(18个氨基酸，序列[40-57])和EC2(109个氨基酸，序列[113-221])，也被称为细胞外环。

根据本发明，使用的抗体能够结合至至少一个定位于细胞外结构域中的表位。优选地，所述抗体将其自身固定在环EC1和/或EC2上。

更特别地，根据本发明的优选的具体实施方案，描述了至少一个抗CD151抗体或一个其功能性片段的用途，所述抗体或其片段能够结合至包括在细胞外环1(EC1)和/或2(EC2)(优选EC2)中的表位，EC1和EC2分别对应于CD151蛋白的氨基酸40-57和113-221。

EC1环[40-57]含有18个氨基酸并且具有理论重量2002.2Da。

EC2环[113-221]具有N糖基化位点(残基Asn159)和6个形成3个二硫桥的半胱氨酸残基。四旋蛋白的EC2环的结构模型，特别是CD151的结构模型，已经基于四旋蛋白CD81的EC2环的三维结构被提出(Seigneuret等人，2001，J.Biol.Chem.276，40055-40064)。根据这个模型，四旋蛋白具有共同的相对保守的由3个α螺旋和特殊可变结构域组成的骨架。对于CD151，该骨架被认为由[113-157]和[209-221]区组成，可变结构域被认为由[158-208]区组成。

EC2环的可变结构域被认为更特别地参与CD151与整合素家族蛋白质的特异性相互作用。定向突变实验特别显示[193-208]区，更精确地是三肽QRD[194-196]和位于192的半胱氨酸残基在CD151与某些层粘连蛋白受体整合素如整合素α3β1或α6β4的结合中的重要性(Kazarov等人，2002，J.Cell Biol.158，1299-1309)。

甚至更优选地，本发明针对能够结合至EC2区的表位的至少一个抗CD151抗体或一个其功能性片段。

在新的方面，本发明涉及分离的核酸，其特征在于其选自下列核酸：

a)编码上文定义的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段的DNA或RNA核酸；

b)与上文a)中定义的核酸互补的核酸；

c)能够在高度严谨的条件下与核酸序列SEQ ID No.9-16，25-32，38-42，51-58，64-68，74-78，82-84，90-94，98-100或104-106中至少一个杂交的或与最佳比对后与所述序列具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列杂交的至少18个核苷酸的核酸。

下文表3总结了与根据本发明的抗体相关的不同核苷酸序列，根据IMGT定义的CDR序列以黑体表示，根据Kabat定义的以斜体表示。

表3

可以在本发明中交换使用的术语核酸、核的或核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸序列、核苷酸序列，它们被理解为是指精确串联的核苷酸(修饰的或未修饰的)，使得可以定义核酸的片段或区域(包括或不包括非天然的核苷酸)，其可以同等地对应于双链DNA、单链DNA和所述DNA的转录产物。

在本文中还必须理解的是本发明不涉及天然染色体环境(就是说在天然状态中)中的核苷酸序列。其是已经被分离和/或纯化的序列，就是说其已经被直接或间接地提取了，例如通过拷贝，其环境已经至少被部分改变了。在本文中其还被理解为是指通过使用例如宿主细胞的遗传重组获得的或通过化学合成获得的分离的核酸。

在最佳比对后与优选的序列具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％的百分比同一性的核序列被理解为是指相当于参考核序列具有某些修饰如(特别是)删除、截短、延伸、嵌合融合和/或置换特别是逐点置换的核序列。其优选是这样的序列：其序列编码与参考序列相同的氨基酸序列，这是由于遗传密码的简并性，或能够优选在高度严谨的条件下(特别是下文定义的条件下)与参考序列特异性杂交的互补序列。

在高度严谨的条件下杂交的意思是如此选择温度和离子强度的条件而使得可以在两个互补的DNA片段之间维持杂交。通过举例的方式，为了限定上文所述的多核苷酸片段的杂交步骤的高严谨条件有利地如下：

DNA-DNA或DNA-RNA杂交在两个步骤中进行：1)在42℃含有5x SSC(1x SSC对应于0.15M氯化钠+0.015M柠檬酸钠的溶液)、50％甲酰胺、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、10x Denhardt′s、5％硫酸葡聚糖和1％鲑精DNA的磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7.5)中预杂交3小时；2)在取决于探针大小的温度下(即：对于大小＞100个核苷酸的探针为42℃)适当杂交20小时，接着在20℃2x SSC+2％SDS中洗涤2次，每次20分钟，在20℃0.1x SSC+0.1％SDS中洗涤1次，每次20分钟。对于大小＞100个核苷酸的探针，最后的洗涤在60℃0.1x SSC+0.1％SDS中进行30分钟。对于上文所述的限定大小的多核苷酸的高度严谨条件可以由本领域技术人员为了较大或较小大小的寡核苷酸根据Sambrook等人的教导(1989，Molecular cloning：a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor)做调整。

本发明还涉及含有根据本发明的核酸的载体。

本发明特别针对含有根据本发明的核苷酸序列的克隆和/或表达载体。

根据本发明的载体优选含有允许在特定宿主细胞中表达和/或分泌核苷酸序列的元件。那么载体必须含有启动子、转录起始和终止信号还有适当的转录调节区。其必须能够以稳定的方式在宿主细胞中维持并且其可选地可以具有指定经转录蛋白质分泌的特定信号。这些各种元件将由本领域技术人员进行选择和优化，作为使用的细胞宿主的功能。为了这个效果，可以将根据本发明的核苷酸序列插入被选择宿主内的自我复制载体或可以是被选择宿主的整合载体。

这样的载体用本领域技术人员常规使用的方法制备，可以将获得的克隆通过标准方法如脂质转染、电穿孔、热休克或化学方法引入合适的宿主中。

根据本发明的载体是例如质粒或病毒来源的载体。其用于转化宿主细胞从而克隆或表达根据本发明的核苷酸序列。

本发明还包括用根据本发明的载体转化的宿主细胞或含有根据本发明的载体的宿主细胞。

细胞宿主可以选自原核或真核系统，例如细菌细胞，还有酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。还可以使用昆虫细胞或植物细胞。

本发明还涉及含有根据本发明的经转化细胞的动物，不包括人类。

根据另一个方面，本发明涉及产生根据本发明的抗体或一个其功能性片段的方法，其特征在于其含有下列步骤：

a)在合适的培养基中以及在合适的培养条件下培养根据本发明的宿主细胞；和

b)从培养基或从所述培养的细胞中回收由此产生的所述抗体或其功能性片段。

根据本发明的经转化的细胞可以用于制备根据本发明的重组多肽的方法。用于制备根据本发明的重组形式的多肽的方法，特征在于其应用载体和/或用根据本发明的载体转化的细胞，所述方法本身包括在本发明中。优选地，用根据本发明的载体转化的细胞在能够表达所述多肽的条件下培养，并且回收所述重组肽。

如已经声明的，细胞宿主可以选自原核或真核系统。特别地，可以鉴定根据本发明的核苷酸序列，该核苷酸序列促进在这样原核或真核系统中的分泌。因此携带这样序列的根据本发明的载体可以有利地用于产生重组蛋白质，该重组蛋白质是想要将其分泌出来的。事实上，这些目的重组蛋白质的纯化将得到以下事实的帮助：其存在于细胞培养物的上清中而不是在宿主细胞的内部。

还可以通过化学合成制备根据本发明的多肽。这样的制备方法也包括在本发明的主题中。本领域技术人员知道化学合成的方法，通过浓缩片段或通过溶液中的常规合成，例如应用固相的技术(特别参见Steward等人，1984，Solid phase peptides synthesis，Pierce Chem.Company，Rockford，111，2nd Ed.，(1984))或使用部分固相的技术。用化学合成获得的多肽(其可以含有相应的非天然氨基酸)也包括在本发明中。

能够用根据本发明的方法获得的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段也包括在本发明中。

根据另一个方面，本发明涉及上文所述的抗体，其特征在于其另外是双特异的，也就是说能够特异性结合至除了CD151以外的人蛋白质或人受体上。

双特异的或双功能的抗体构成第二代单克隆抗体，其中两个不同的可变区组合在相同的分子中(Hollinger和Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev.18：411-419)。其在诊断领域和在治疗领域中的用途已经通过其募集新效应器功能的能力或靶向肿瘤细胞表面上的多个分子的能力而被证实。这些抗体可以用化学方法(Glennie MJ等人1987 J.Immunol.139，2367-2375；Repp R.等人1995 J.Hemat.377-382)或体细胞方法(Staerz U.D.和Bevan M.J.1986 PNAS 83，1453-1457；Suresh M.R.等人1986 Method Enzymol.121：210-228)获得，而且，优选地，用遗传工程技术获得，所述遗传工程技术可以强迫进行异源二聚化并因此促进纯化所求抗体的方法(Merchand等人1998 Nature Biotech.16：677-681)。

这些双特异的抗体可以被构建为完整的IgG、双特异的Fab′2、Fab′PEG或双抗体或双特异scFv，还可以是四价双特异抗体，其中两个固定位点为了每个靶向的抗原存在(Park等人2000 Mol.Immunol.37(18)：1123-30)，或其上文所述的片段。

除了经济上的优势，由于产生和给予双特异抗体比产生两个特异抗体更不繁重的事实，使用这样的双特异抗体具有减少治疗毒性的优点。事实上使用双特异抗体可以减少循环抗体的总量，因此减少可能的毒性。

在优选的本发明的具体实施方案中，双特异抗体是二价的或四价的抗体。

最后，本发明针对上文所述的作为药物的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段。

本发明还涉及药物组合物，其含有作为活性成分的化合物，所述化合物由根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段组成。优选地，向所述抗体加入赋形剂和/或药学上可接受的载体。

根据另一个具体实施方案，本发明还涉及上文所述的药物组合物，其另外含有作为同时、分开或时间交错使用的组合产物的至少一个其它抗体、细胞毒剂/细胞生长抑制剂、细胞毒素或放射性元素。

“同时使用”被理解为给予包括在一个和相同的药物形式中的根据本发明的组合物的两个化合物。

“分开使用”被理解为在相同时间给予包括在分开的药物形式中的根据本发明的组合物的两个化合物。

“时间交错使用”被理解为相继给予每个包括在分开的药物形式中的根据本发明的组合物的两个化合物。

以通常的方式，根据本发明的组合物相当大地增加了癌症治疗的效力。换句话说，根据本发明的抗体的治疗效果通过给予细胞毒剂以出乎意料的方式被加强了。另一个主要的根据本发明的组合物所产生的随后优点涉及使用较低活性成分的有效剂量的可能性，这可以避免或减少出现次级效应的风险，特别是细胞毒剂的效应。另外，根据本发明的该组合物应该可以更快地获得预期的治疗效果。

“抗癌治疗剂”或“细胞毒剂”应该被理解为是这样的物质：当给予患者时，治疗或预防患者中癌症的发展。通过这样试剂的非限制性例子的方式，可以提及的是“烷化”剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄性激素或免疫调节剂。

这样的试剂在例如专心于肿瘤学和血液学的页码上在“Cytotoxiques”(英文为：细胞毒剂)专栏中的VIDAL中提及；以参考所述文献的方式提及的这样的细胞毒化合物在此作为优选的细胞毒剂提及。

“烷化剂”是指任何能够共价结合至或烷化任何分子(优选是细胞内的核酸(例如：DNA))的物质。作为这样的烷化剂的例子，可以提及的是氮芥如二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、美法仑盐酸盐、哌泊溴烷、松龙苯芥磷酸氢二钠或雌氮芥；oxazophorines如环磷酰胺、六甲蜜胺、曲磷胺、磺基磷酰胺(sulfofosfamide)或异环磷酰胺；氮丙啶或乙撑亚胺(ethylene-imines)如塞替派(thiotepa)、二乙撑二胺(triethyleneamine)或altetramine；亚硝基脲如卡莫司汀(carmustine)、链脲菌素(streptozocin)、福莫司汀(fotemustine)或洛莫司汀(lomustine)；烷基磺酸盐如白消安(busulfan)、苏消安(treosulfan)或英丙舒凡(improsulfan)；三氮烯如氮烯唑胺(dacarbazine)；以及还有铂复合物如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)或卡铂(carboplatin)。

“抗代谢物”是指通过干扰某些活性，通常是DNA合成而阻碍细胞生长和/或细胞代谢的物质。以抗代谢物例子的方式，可以提及的是氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、5-氟脱氧尿苷、卡培他滨、阿糖胞苷(cytarabine)、氟达拉滨、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-硫代鸟嘌呤(6-TG)、氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、吉西他滨、克拉屈滨、脱氧助间型霉素和喷司他丁。

“抗肿瘤抗生素”是指可以防止或抑制DNA、RNA和/或蛋白质合成的化合物。这样的抗肿瘤抗生素的例子包括阿霉素、柔红霉素、去甲氧基柔红霉素、戊柔比星、米托蒽醌、放线菌素D、光神霉素(mithramycin)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素C、博来霉素和甲基苄肼。

“有丝分裂抑制剂”防止细胞周期和有丝分裂的正常进行。通常，微管抑制剂或“紫杉烷类”如紫杉醇和多烯紫杉醇能够抑制有丝分裂。长春花生物碱如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨也能够抑制有丝分裂。

“染色质功能抑制剂”或“拓扑异构酶抑制剂”是指抑制染色质重塑蛋白质如拓扑异构酶I和II的正常功能的物质。这样的抑制剂的例子包括：对于拓扑异构酶I为喜树碱还有其衍生物如伊立替康或拓扑替康，对于拓扑异构酶II为依托泊苷、依托泊苷磷酸盐和替尼泊苷。

“抗血管生成剂”是指任何抑制血管生长的药物、化合物、物质或试剂。抗血管生成剂的例子包括(没有任何限制性)雷佐生、马立马司他、巴马司他、普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、CGS-27023A、常山酮、COL-3、新伐司他(neovastat)、BMS-275291、沙利度胺(thalidomide)、CDC 501、DMXAA、L-651582、角鲨胺(squalamine)、内皮他丁(endostatin)、SU5416、SU6668、α干扰素、EMD121974、白细胞介素-12、IM862、血管抑素(angiostatin)和vitaxin。

“抗雌激素”或“抗雌激素剂”是指任何减少、拮抗或抑制雌激素作用的物质。这样的制剂的例子是他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、iodoxyfene、阿纳托唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)和依西美坦(exemestane)。

“抗雄激素”或“抗雄激素剂”是指任何减少、拮抗或抑制雄激素作用的物质。抗雄激素的例子是氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、卡比鲁胺(bicalutamide)、安体舒通(spironolactone)、醋酸环丙氯地孕酮(cyproterone acetate)、非那司提(finasteride)和西咪替丁(cimitidine)。

免疫调节剂是刺激免疫系统的物质。这样的免疫调节剂的例子包括干扰素、白细胞介素如阿地白介素(aldesleukin)、OCT-43、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diflitox)或白细胞介素-2、肿瘤坏死因子如他索纳明(tasonermin)或其它类型的免疫调节剂如香菇多糖(lentinan)、西佐喃(sizofiran)、罗喹美克(roquinimex)、匹多莫德(pidotimod)、培加酶(pegademase)、胸腺喷丁(thymopentin)、聚I:C(poly I:C)或与5-氟尿嘧啶结合的左旋咪唑(levamisole)。

更详细地，本领域技术人员能够参考题目为“Traitéde chimie thérapeutique，Vol.6，Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers，ed.TEC&DOC，2003”的法国治疗化学教师协会出版的手册。

在特别优选的具体实施方式中，所述根据本发明组合产物形式的组合物的特征在于所述细胞毒剂为化学结合至所述抗体上同时使用的。

在特别优选的具体实施方式中，所述根据本发明的组合物的特征在于所述细胞毒剂/细胞生长抑制剂选自纺锤体抑制剂或稳定器试剂，优选为长春瑞滨和/或长春氟宁和/或长春新碱。

为了促进所述细胞毒剂和所述根据本发明的抗体之间的结合，特别可能的是在需要结合的两个化合物(例如聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇或还有氨基酸)之间引入间隔分子，或在另一个具体实施方式中是使用所述细胞毒剂的活性衍生物，其中引入了能够与所述根据本发明的抗体反应的功能。这些结合技术是本领域技术人员知道的，在本说明书中不详细说明。

根据另一个方面，本发明涉及组合物，其特征在于至少一个所述抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段与细胞毒素和/或放射性元素偶合。

优选地，所述毒素或所述放射性元素能够防止肿瘤细胞的生长或增殖，特别是完全使所述肿瘤细胞失活。

还优选的是所述毒素是肠细菌毒素，特别是假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A。

优选与抗体偶合的应用在治疗中的放射性元素(或放射性同位素)是发射γ射线的放射性同位素，优选是碘¹³¹、钇⁹⁰、金¹⁹⁹、钯¹⁰⁰、铜⁶⁷、铋²¹⁷和锑²¹¹。发射β射线和α射线的放射性同位素也可以用于治疗中。

根据本发明，毒素或放射性元素与至少一个抗体或其功能性片段偶合被理解为是指任何可以将所述毒素或所述放射性元素结合至所述至少一个抗体上的方法，特别通过两个化合物之间的共价结合(引入连接分子或不引入连接分子)。

在允许化学(共价)、静电或非共价连接所有或一些偶合元素的试剂中，非常特别可以提及的是苯醌、碳化二亚胺和更特别可以提及的是EDC(1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]-碳化二亚胺盐酸化物)、二马来酰亚胺(dimaleimide)、二硫代双硝基苯甲酸(DTNB)，N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸盐(SATA)、具有一个或多个基团，带有一个或多个与紫外(UV)反应的叠氮苯基基团的被称为“桥连”剂的试剂和非常优选地N-[-4-(叠氮水杨酰基氨基)丁基]-3’-(2’-吡啶基二硫代)丙酰胺(APDP)、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸盐(SPDP)和6-肼基-尼克酰胺(HYNIC)。

另一种形式的结合，对放射性元素而言非常特别，可以由使用双功能离子螯合剂组成。

在这些螯合剂中可以提及的是源自EDTA(乙二铵四乙酸)或DTPA(二乙烯三胺五乙酸)的螯合剂，其已经被开发为结合金属特别是放射性金属和免疫球蛋白。因此，DTPA和其衍生物可以被碳链上的不同基团置换从而增加配体-金属复合物的稳定性和刚性(Krejcarek等人(1977)；Brechbiel等人(1991)；Gansow(1991)；美国专利4,831,175)。

例如，DTPA(二乙烯三胺五乙酸)和其衍生物(其已经长时间非常广泛地以其游离形式或是与金属离子的复合物形式用于医药和生物中)具有与金属离子形成稳定的螯合物和结合至治疗或诊断目的的蛋白质上的显著的特征，如用于形成癌症治疗中的放射免疫偶合物的抗体(Meases等人(1984)；Gansow等人(1990))。

还优选，所述至少一个形成所述根据本发明的偶合物的抗体选自其功能性片段，特别是缺少Fc成分的片段如scFv片段。

另外本发明包括根据本发明的组合物在制备预期用于预防或治疗癌症的药物中的用途。

本发明还涉及抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段，优选人源化的片段，和/或根据本发明的组合物在制备预期用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的用途。以通常的方式，本发明涉及抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段，优选人源化的片段，和/或根据本发明的组合物在制备预期用于预防或治疗癌症的药物中的用途。

在可以预防和/或治疗的癌症中，优选的是前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、多发性骨髓瘤或卵巢癌、胰腺癌或任何其它的癌症。

优选地，所述癌症是选自前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌和/或胰腺癌。

根据另一个方面，本发明涉及根据本发明的抗体在用于与CD151表达水平相关疾病的诊断方法(优选地在体外)中的用途。更特别地，本发明针对用于具有CD151蛋白过表达或低表达的疾病的体外诊断方法，其从被怀疑有CD151蛋白异常存在的生物样品中开始，所述方法由下列组成：放置所述生物样品与根据本发明的抗体接触，可能的是所述抗体在合适的地方被标记。

优选地，与所述诊断方法中的CD151蛋白相关的所述疾病将是癌症。

所述抗体或一个其功能性片段可以是免疫偶合物或经标记的抗体的形式从而获得可检测的和/或可定量的信号。

根据本发明标记的抗体或其功能性片段包括例如被称为免疫偶合物的抗体(其可以与例如酶或分子偶合，其中酶如过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖-6磷酸脱氢酶，其中分子如生物素、地高辛或5-溴-脱氧尿苷)。荧光标记还可以与根据本发明的抗体或其功能性片段偶合并且特别包括荧光素和其衍生物、荧光染料、罗丹明和其衍生物、GFP(绿色荧光蛋白)、丹酰(dansyl)、伞形酮等。在这样的偶合物中，本发明的抗体或其功能性片段可以用本领域技术人员已知的方法制备。它们可以直接结合至酶或荧光标记上，或通过间隔基团或连接基团如聚醛例如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)或二乙烯三胺五乙酸(DPTA)的方式结合，或在结合剂如那些上文所述的治疗性偶合物存在下结合。含有荧光素型标记的偶合物可以通过与异硫氰酸盐的反应来制备。

其它偶合物还可以包括化学发光标记如鲁米诺和二氧丁烷(dioxetane)、生物发光标记如荧光素酶和虫荧光素，或还有放射性标记如碘¹²³、碘¹²⁵、碘¹²⁶、碘¹³³、溴⁷⁷、锝^99m、铟¹¹¹、铟^113m、镓⁶⁷、镓⁶⁸、钌⁹⁵、钌⁹⁷、钌¹⁰³、钌¹⁰⁵、汞¹⁰⁷、汞²⁰³、铼^99m、铼¹⁰¹、铼¹⁰⁵、钪⁴⁷、碲^121m、碲^122m、碲^125m、铥¹⁶⁵、铥¹⁶⁷、铥¹⁶⁸、氟¹⁸、钇¹⁹⁹、碘¹³¹。本领域技术人员已知的对于将放射性同位素结合至抗体(直接结合或通过螯合剂如上文所述的EDTA或DTPA结合)而存在的方法，可以用于诊断中的放射性元素。因此还可以提及的是其通过氯胺T技术[Hunter W.M.和Greenwood F.C.(1962)Nature 194：495]用[I¹²⁵]Na标记或还可以通过Crockford等人的技术(US patent4 424 200)或通过DTPA如Hnatowich(US patent 4 479 930)所述的固定而用锝^99m标记。

本发明还涉及根据本发明的抗体在制备预期用于特异性靶向表达或过表达CD151蛋白的细胞中的生物活性化合物的药物。

生物活性化合物在本文被理解为是指任何能够修饰(特别是抑制)细胞活性特别是其生长、其增殖或基因转录或翻译的化合物。

本发明还涉及体内诊断试剂，所述试剂含有根据本发明的抗体或一个其功能性片段，所述抗体或片段优选是经标记的，特别是经放射性标记的，和其在医疗成像中特别是在与细胞表达或过表达CD151蛋白相关的癌症检测中的用途。

本发明还涉及组合产物形式的组合物或作为药物的根据本发明的抗CD151/毒素或放射性的偶合物。

优选地，以组合产物形式向所述的组合物或向所述的根据本发明的偶合物加入赋形剂和/或药学上可接受的载体。

在本说明书中，药学上可接受的载体被理解为是指包括在药物组合物中的化合物或化合物的组合，其不产生副反应并且可以例如促进活性化合物的给药从而增加其在体内的寿命或效力，增加其在溶液中的可溶性或改善其储存。这样的药学上可接受的载体是熟知的并且可以由本领域技术人员根据所选活性化合物的性质功能和给药方式进行改造。

优选地，那些化合物将通过全身途径特别是静脉内途径，通过肌肉内、皮内、腹膜内或皮下途径或通过口服途径给予。更优选地，含有根据本发明的抗体的组合物将在时间交错的多个时期给予。

其最佳的给药方式、剂量方案和盖伦形式可以根据标准确定，所述标准为建立对于患者如例如年龄或患者的体重、他的或她的一般情况的严重程度、治疗的耐受性和建立的次级效应的合适治疗中通常考虑到的标准。

因此本发明涉及抗体或一个其功能性片段在制备预期用于特异性靶向表达或过表达CD151的细胞中的生物活性化合物的药物制备中的用途。

本发明的其它特征和优点将出现在有实施例和附图的说明书剩余部分中，附图的图例在下文中给出。

附图说明

图1显示CD151蛋白的核苷酸和蛋白质序列，在其序列上显示了EC1和EC2环。

图2是说明四旋蛋白结构的图，CD151蛋白属于所述的四旋蛋白，并且非常特别的是两个细胞外环EC1和EC2。

图3显示根据本发明的抗体203B6的各自的重链和轻链的序列。根据IMGT系统定义的CDR以下划线和黑体显示，而根据Kabat定义的CDR以线框显示。

图4显示根据本发明的抗体205H8的各自的重链和轻链的序列。根据IMGT系统定义的CDR以下划线和黑体显示，而根据Kabat定义的CDR以线框显示。

图5显示根据本发明的抗体211F3的各自的重链和轻链的序列。根据IMGT系统定义的CDR以下划线和黑体显示，而根据Kabat定义的CDR以线框显示。

图6显示根据本发明的抗体214B2的各自的重链和轻链的序列。根据IMGT系统定义的CDR以下划线和黑体显示，而根据Kabat定义的CDR以线框显示。

图7A-7E说明CD151分子在患有前列腺癌患者中的表达。每个字母对应于对一个患者的研究，对于每个患者，上面的图板对应于与肿瘤相邻的正常组织，下面的图板对应于肿瘤组织。

图8说明CD151分子在患有肺癌患者中的表达。每个字母对应于对一个患者的研究，对于每个患者，上面的图板对应于与肿瘤相邻的正常组织，下面的图板对应于肿瘤组织。

图9显示了通过流式细胞术对NIH 3T3-CD151、PC3和A549细胞表面上的鼠抗体203B6识别CD151的分析。

图10显示了通过流式细胞术对NIH 3T3-CD151、PC3和A549细胞表面上的鼠抗体205H8识别CD151的分析。

图11显示了通过流式细胞术对NIH 3T3-CD151、PC3和A549细胞表面上的鼠抗体211F3识别CD151的分析。

图12显示了通过流式细胞术对NIH 3T3-CD151、PC3和A549细胞表面上的鼠抗体214B2识别CD151的分析。

图13显示了通过Western印迹进行的抗体203B6、205H8、211F3和214B2的特异性评估的结果。

图14说明抗CD151单克隆抗体在PC3前列腺肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性。PC3细胞通过皮下途径移植进入Swiss裸鼠(n＝6)中。移植细胞后五天，所述小鼠通过腹膜内途径接受测试下抗体的2毫克/小鼠的攻击剂量，接着每周两次给予所述抗体的1毫克/小鼠的剂量。肿瘤体积通过公式π/6x长度x宽度x厚度来确定。

图15显示(A)在还原条件下SDS-PAGE电泳后用放射自显影法对用碘125放射性标记的203B6和214B2抗体的分析，和(B)通过分子筛色谱法对用碘125放射性标记的203B6和214B2抗体的分析。

图16说明将放射性标记的203B6抗体固定在PC3细胞上的研究：用(A)饱和曲线和(B)斯可恰图(Scatchard plot)确定平衡亲和常数。

图17说明将放射性标记的214B2抗体固定在PC3细胞上的研究：用(A)饱和曲线和(B)斯可恰图(Scatchard plot)确定平衡亲和常数。

图18显示了用(A)血小板凝集和(B)血小板激活(释放血清素)的抗CD151抗体对血小板功能的影响。

图19显示了抗CD151抗体对NCI-H441细胞的体内肿瘤生长的影响。

图20说明了在缺乏PMA或存在PMA时培养的THP-1细胞的表型A)和分化标记物B)。C)抗CD151抗体(214B2和203B6)对在缺乏PMA或存在PMA时培养的THP-1细胞分泌TNF的影响。抗体9G4被用作同种型对照和LPS作为阳性激活对照。

图21显示了抗体214B2和203B6对抗原呈递的影响。A)多克隆增殖对照，B)抗原特异性增殖。

具体实施方式

实施例1：CD151分子表达的研究

CD151蛋白的表达通过获自患有前列腺癌或肺癌的患者的人组织样品中的免疫组织化学(IHC)来进行研究。对于这些患者，与肿瘤相邻的正常组织的载玻片是可以获得的，因此被包括进去从而校正肿瘤组织相对于正常组织中的表达水平。

为了这些实验，使用了商业上可以获得的“组织阵列”型载玻片。去石蜡化后，在含有胃蛋白酶(Labvision ref.AP-9007-005)的酶溶液的帮助下在30℃进行抗原的暴露。这一步骤后是通过将切片在0.3％的过氧化氢(Sigma)水溶液中孵育而去除内源性过氧化物酶的步骤。然后用Ultra-V-Block(Labvision，ref.TA-125-UB)溶液进行非特异性位点的饱和，并使用商业上可以获得的鼠抗CD151抗体(Serotech，Ref.MCA 1856)(以5微克/毫升的终浓度使用)进行标记。鼠IgG同种型对照抗体(DakoCytomation，Ref.X0931)被用作阴性实验对照。使用Envision Dual Link visualisation system(DakoCytomation，Ref.K4061)进行标记显影，DAB过氧化物酶底物的参考是来自DakoCytomation的S3309。

显现在图7中的结果表明许多发生前列腺肿瘤的患者显示出CD151分子的过表达。这一过表达对于被研究患者中的20％可以是非常显著的(患者A和C)或是中度的(患者A和D)。需要注意的是除了内皮细胞的水平，对应的正常前列腺组织不表达CD151或只表达很少，在其表达的地方，似乎限于腺体型结构。患者E展现不表达CD151的肿瘤的例子。

在肺癌的情况下(图8)，在某些正常肺组织的细胞中观察到中度的(患者A)至显著的(患者B)的表达。但是，肿瘤组织显示出非常高密度的强标记的细胞(患者A和B)。患者C展现不表达CD151的肿瘤的例子。

实施例2：抗体的产生和选择

BALB/c通过使用在其表面上表达人CD151的20x10⁶ NIH 3T3细胞的皮下途径被免疫，那些细胞已经通过用CD151基因转染产生。第一次免疫在弗氏完全佐剂存在时进行，接下来2次在弗氏不完全佐剂存在时进行。在融合前三天，通过腹膜内途径进行10x10⁶ NIH 3T3-CD151细胞的最后加强注射。然后使用

和Milstein所述的常规技术以1/1的比例将小鼠脾细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合。

然后通过ELISA筛选分泌进入融合产生的杂交瘤的上清中的抗体识别CD151重组细胞外环EC2的能力，以及通过流式细胞术筛选上述抗体识别人PC3前列腺癌肿瘤系表面上表达的CD151的能力。

对于ELISA，用磷酸盐缓冲溶液中5微克/毫升的重组细胞外环EC2在+4℃将96孔板敏感化1夜。用磷酸盐缓冲溶液洗涤后，在37℃用磷酸盐缓冲溶液中的0.5％的明胶溶液将孔饱和1小时，然后再用磷酸盐缓冲溶液洗涤。无需稀释评估杂交瘤培养物上清(在37℃孵育1小时)。固定至固定的EC2环的抗体通过相继用偶合了过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(Jackson/USA，稀释至1/5000，37℃1小时)然后用过氧化物酶底物(TMB，Interchim/France，环境温度下10分钟)孵育进行检测。反应通过加入1M的硫酸停止并在450nm测定光密度(OD)。

流式细胞术分析在96孔板中进行。将未稀释的杂交瘤上清加入至事先引入孔中的100000个PC3细胞中。在+4℃孵育20分钟接着洗涤之后，加入标记了Alexa488的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(Molecular Probes，稀释至1/500)。在+4℃进一步孵育20分钟后，通过细胞荧光计的帮助测定荧光强度(MFI)。

在该筛选的结尾，选择了下列4个杂交瘤(选择标准：ELISA为OD＞0.5，流式细胞术为MFI＞50)：203B6、205H8、211F3和214B2。该4个杂交瘤获得的结果显示在下面的表4中：

表4

克隆后，扩增每个所选杂交瘤中的一个克隆。每个培养物上清中产生的抗体的同种型使用鼠抗体同种型测定试剂盒(SBA clonotyping system，Southern Biotech)确定，然后最终的鉴定通过ELISA(细胞外环EC2)和通过在鼠系NIH 3T3和稳定转染子NIH 3T3-CD151上，然后在人肺癌肿瘤系A549、前列腺癌肿瘤系DU145和前列腺癌肿瘤系BxPC3上进行的流式细胞术在之前所述的条件下进行。对于ELISA，上清的抗体浓度调整至5微克/毫升，并且对于流式细胞术上清的抗体浓度调整至10微克/毫升。获得的结果显示在下面的表5中：

表5

图9、10、11和12显示了通过流式细胞术的NIH 3T3-CD151、PC3和A549细胞的识别图谱，所述图谱是对于抗体203B6、205H8、211F3和214B2获得的。这些图谱与用抗CD151抗体50-6(ATCC CRL-2696)获得的图谱是可比较的，并且证明了这些抗体对于CD151的特异性。

然后将所述杂交瘤保藏在CNCM，国家微生物培养物保藏中心，巴斯德研究所，25 Rue du Docteur Roux，75724 PARIS Cedex 15。

实施例3：抗体的特异性

用Western印迹评估203B6、205H8、211F3和214B2抗体的特异性。

将CD151的EC2环克隆进入用于在大肠杆菌(Escherichia coli)周质中以可溶形式表达的载体pET22b中。产生的蛋白质包括人CD151肽序列的氨基酸130至221，向所述肽序列的C末端位置加入多组氨酸尾从而帮助纯化。重组的EC2蛋白通过在螯合琼脂糖HP支持上的固定的金属亲和色谱(IMAC)(GE Healthcare)进行纯化。

将增加量的重组CD151 EC2蛋白(1，2，4和8微克)和HT-29细胞裂解物(10，20和50微克总蛋白质)置于4-12％的丙烯酰胺凝胶上(BioRad)。电泳后(非还原条件)，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。然后在用化学发光显影前，将转移膜用纯化的203B6、205H8、211F3和214B2抗体(0.5微克/毫升)孵育，然后用偶联至过氧化物酶的兔抗小鼠Ig多克隆抗体(GE Healthcare)孵育。

通过Western印迹，203B6、205H8、211F3和214B2抗体识别完全CD151蛋白和重组的EC2环(图13)。抗体205H8在分析的条件下对于完全CD151蛋白具有较小的反应性。与对于抗体203B6、211F3和214B2观察到的信号相比，发现对于抗体205H8获得的信号较弱。这一差别在重组EC2蛋白的识别中没有观察到。

实施例4：抗CD151抗体在PC3异种移植模型中的抗肿瘤活性。

材料和方法

通过在人组织阵列系列上的免疫组织化学方法已经观察到的前列腺癌肿瘤组织中CD151的过表达，计划了在PC3前列腺癌细胞异种移植物上的抗CD151抗体的评估。PC3系是获自ATCC并在F12K培养基(Invitrogen Corporation，Scotland，United Kingdom)、10％胎牛血清(Invitrogen Corporation)中培养的依赖雄激素的前列腺系。细胞在移植前两天进行分裂以便其处于指数生长期。将5百万PC3细胞皮下移植进入6周大的雄性Swiss裸鼠中。在移植后5天，测定肿瘤体积，将小鼠随机化以便形成统计学上无差别的组，通过腹膜内注射攻击剂量的2毫克抗体每只小鼠开始治疗。然后用1毫克抗体每只小鼠的剂量处理动物，一周处理两次，一周测定肿瘤两次。对照组的动物给予磷酸盐缓冲溶液注射。根据公式π/6x长度x宽度x高度计算肿瘤的体积。使用曼-怀二氏检验(Mann-Whitney test)对每个测定进行统计学分析。

结果

图14中显示的结果表明抗体203B6、214B2和211F3展示了对PC3细胞的体内肿瘤生长的显著抑制。抗体205H8(同时是抑制剂)显示了在这模型中更适度的抗肿瘤活性。

实施例5：将抗CD151抗体固定至PC3细胞的研究

首先通过使用氯胺T的方法用碘125标记抗CD151抗体203B6和214B2。在标记后，通过PD-10柱(GE Healthcare)上的分子筛色谱纯化抗体从而去除游离的碘125。纯化后，通过二氧化硅薄层层析、Superdex 200柱(GE Healthcare)上的分析分子筛色谱以及通过SDS-PAGE电泳后的放射自显影术测定经放射性标记的抗体的放射化学纯度。图15显示2个抗体的重链(～50kDa)和轻链(～25kDa)以等同的方式被标记(15A)并且证实纯化后没有游离的碘125(15B)。使用伽马计数器(Wallace Wizard 1480，Perkin Elmer)测定被放射性标记的抗体的特异性活性。

用碘125-[¹²⁵I]-203B6和[¹²⁵I]-214B2放射性标记的203B6和214B2抗体的物理化学特征整理在下文的表6中：

表6

抗体	[¹²⁵I]-203B6	[¹²⁵I]-214B2
			标记效率(％)	85.5	78.1
特异性活性(mCi/mg)	10.6	12.7
			放射化学纯度(％)	99.7	99.5
碘原子/抗体	0.73	0.87

然后2个放射性标记的抗体对于其细胞表面上的CD151靶向的亲和力用PC3前列腺癌细胞进行测定。抗体的解离常数K_D通过斯可恰方法进行测定。将PC3细胞(1x10⁶细胞/50微升的含有0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液缓冲液)在4℃存在6纳克/毫升至27微克/毫升(包括在内)之间的被放射性标记的增加的抗体浓度下孵育1小时(最终体积：150微升)。孵育后，使用伽马计数器测定与细胞结合(固定的放射性被标记的抗体)的总的放射性。对于每个测试浓度，在存在多余的非放射性标记的抗体(x100)时测定非特异性的固定。特异性固定通过从总的放射性中减去非特异性放射性进行计算。图16A和17A中分别显示了抗体[¹²⁵I]-203B6和[¹²⁵I]-214B2的饱和曲线。在使用Prism软件处理数据后获得的斯可恰曲线(图16B和17B)允许将要被测定的2个抗体的解离常数K_D(斜率＝-1/K_D)

-203B6 K_D＝12.85±0.99nM

-214B2 K_D＝6.38±0.45nM

实施例6：抗CD151抗体对血小板功能的影响

凝集是血小板在血凝固过程中的基本功能，例如应对血管损伤。这一现象通常通过血小板的激活进行，其包括暴露在它们的表面上的某些蛋白质和分泌它们的储存颗粒的内容物(α颗粒和致密颗粒)。考虑到CD151表达在血小板上的事实(Goschnick和Jackson，2007，Mini-Rev.Med.Chem.7：1236-1247)，抗CD151抗体对血小板功能的影响使用血小板凝集和激活测试在体外进行评估。

为了这一研究，使用柠檬酸三钠作为抗凝剂从禁食供体中取得血样。在20℃100g离心10分钟可以获得富含血小板的血浆(PRP)，而血小板稀少的血浆(PPP)通过在20℃1500g离心10分钟获得。在调整至300000血小板/立方毫米后，根据Born氏原理(透射光的改变)在37℃500rpm搅拌下在10个供体的PRP中测定血小板凝集。对于凝血酶和ADP(阳性对照)测定时间为5分钟，对于被测试的抗体测定时间为15分钟。使用带有荧光检测的HPLC通过测定血清素(5-羟色胺或5-HT)的分泌在10个供体的PPP中测定血小板的激活。在10微克/毫升的浓度下测定抗体对血小板功能的影响。使用的几个对照抗体是：作为阳性对照抗体的PM6/248(抗CD41，整合素α_IIb)和14A2.H1(抗CD151)，和作为同种型对照的9G4(IgG1)。

对每个供体评估由各种测试化合物引起的血小板凝集，作为由凝血酶引起的凝集的百分比，由凝血酶引起的凝集作为参考(100％)。图18A显示了对每个测试化合物获得的平均凝集值。ADP和抗体PM6/248是具有引起效果的试剂但是比凝血酶更少地有力，产生可比较的凝集，分别为30.1±10.5％和47.6±12.7％。获得在值中的变化是止血中常规地观察到的，且由个体间的差异引起。如预期的，9G4抗体不引起血小板凝集：该抗体允许需要限定的检测阈值(5nM)。由抗CD151抗体203B6和214B2引起的凝集分别为7.3±3.2％和4.9±1.6％，是相对低的并且与检测阈值接近。由这2个抗体引起的凝集比由对照抗体14A2.H1引起的凝集更少。

图18B显示了在各种测试化合物存在时由血小板释放的血清素的平均值(以nM计)。对这一血小板激活测试获得的结果与上面所述的那些是可比较的。9G4抗体不引起血小板激活，而凝血酶产生非常显著的血清素的释放(～430nM)。释放的血清素的量在存在ADP、PM6/248和14A2.H1时较少(平均值分别为72.6nM、34.6nM和21.6nM)，但是这些化合物可以被归类为血小板激活剂。由抗CD151抗体203B6和214B2引起的血清素释放是非常低的：事实上，对这2个抗体测定的平均值比对照抗CD151抗体14A2.H1的平均值分别低2.4和3.6倍。

总之，2个测试证实抗整合素α_IIb对照抗体PM6/248和抗CD151对照抗体14A2.H1能够产生体外血小板凝集以及能够引起血小板激活(Roberts等人，1995，Br.J.Haematol.89：853-860；Hornby等人，1991，Br.J.Haematol.79：277-285)。与14A2.H1抗体相反，抗CD151抗体203B6和214B2引起非常低水平的血小板凝集和激活，其在人的临床方面不显著。

实施例7：抗CD151抗体在体内NCI-H441肿瘤生长中的活性的研究

在RPMI 1640培养基中培养获自ATCC的NCI-H441细胞，向培养基中加入了10％胎牛血清和1％L-谷氨酰胺。在移植前2天使细胞分裂以便在移植当天获得处于指数生长期的细胞。在无胸腺的裸鼠的皮下位置移植1千万个NCI-H441细胞。移植后5天，测定肿瘤，将带有相当大小肿瘤的动物分配至6组中。通过腹膜内途径用2毫克/小鼠的抗体攻击剂量处理小鼠，然后用每只小鼠1毫克抗体的剂量处理，一周两次。一周评估两次肿瘤体积并使用公式π/6X长度X宽度X高度计算。在每次测定时使用曼-怀二氏检验进行数据的特异分析。

图19中显示的结果证明抗体203B6和214B2能够显著地(p＜0.05)抑制NCI-H441细胞的体内生长。

实施例8：对两个抗CD151抗体在巨噬细胞功能中活性的评估

对CD151在血细胞上表达的评估显示这一分子在淋巴细胞和单核细胞上显著表达。为了排除任何可能的毒性问题，测试了214B2和203B6抗体对巨噬细胞激活的潜在效应。考虑到TNFα的分泌是巨噬细胞激活的标记的事实，来自THP-1细胞(在存在或缺乏测试的抗体时培养)培养物上清的TNFα浓度用ELISA进行评估。THP-1细胞系是在存在PMA或1α，25-二羟维生素D3型试剂时能够分化成为巨噬细胞系的单核细胞白血病系。这一激活过程伴随非常显著的TNFα的分泌。为了评估抗体，在存在或缺乏PMA(250nM)时将THP-1细胞接种到6孔板中72小时。所述孵育时期后，回收一些细胞从而通过显微镜观察或通过FACS分析CD14/CD11b标记物来检查在存在PMA时的分化。将测试的抗体(241B2和203B6)加入其它孔中经过另外的24小时时间。在相同的条件下使用9G4抗体作为同种型对照。LPS(1微克/毫升)用作阳性实验对照。然后在通过ELISA测试方法分析培养物上清的TNFα含量前，取出培养物上清，离心并存储在-80℃。

显示在图20A中的结果表明，在缺乏PMA时，THP-1细胞是不粘连的、折光的和圆的。在存在PMA时，这些细胞变得粘连，这明确地表明单核细胞向巨噬细胞的分化。FACS分析(图20B)显示在缺乏PMA时，20％以下的THP-1细胞表达CD11b或CD14。由PMA引起的细胞分化如预期的与细胞中CD11b表达的显著增加是相关的，所述增加为9至65％的改变。CD14的表达也大量增加，阳性细胞数目的改变为20至37％。应用的评估模型的可靠性已经被这一数据证实，在这一测试中进行了抗CD151抗体的评估。图20C显示当在缺乏分化诱导剂时培养THP-1细胞时，没有观察到TNFα的产生。相反，观察到非常显著的TNFα的产生(100至200皮克/毫升)。如预期的，作为阳性实验对照引入的LPS也产生高水平细胞因子的分泌，在存在或缺乏分化诱导剂时也是这样的情况。

无论细胞分化的状态，被评估的抗CD151抗体中没有一个引起TNFα的分泌。

实施例9：对两个抗CD151抗体关于抗原呈递功能的评估

考虑到CD151分子广泛在抗原呈递细胞上表达的事实，进行了研究从而检查针对CD151的治疗对抗原呈递功能的潜在影响。进行的实验由下列组成：当将破伤风类毒素蛋白质引入外周血单核细胞时，监测TT抗原的特异性淋巴细胞增殖。在这一安排下，蛋白质应该被抗原呈递细胞加工并被与MHC分子结合的那些相同细胞展示。向CD4+或CD8+淋巴细胞的这个抗原呈递将引起抗原特异性克隆的增殖。因此任何对抗原呈递的影响将在调节淋巴细胞增殖中显示其作用。为了这一实验，通过在Ficoll梯度上离心全血分离外周血单核细胞。将已经用磷酸盐缓冲溶液洗涤两次的细胞计数并以0.25x10⁶细胞/毫升的浓度重悬于加入了10％胎牛血清和1％谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。在存在抗原和测试的抗体时，将100微升的细胞悬浮液接种到96孔板的每个孔中。在10微克/毫升的最终浓度下评估214B2和203B6抗体。以相同的最终浓度引入作为实验同种型对照的9G4抗体。PHA(在孔中为2.5微克/毫升)是淋巴细胞增殖的多克隆激活剂，被用作阳性增殖对照。破伤风类毒素(TT)被选择作为测试抗原并以100微克/毫升的最终浓度使用。将板在37℃孵育96小时，在这一时间的末尾向每孔加入0.25μCi的³H-胸腺嘧啶脱氧核苷，经过另外的24小时的时间。孵育后，在过滤器上收集细胞并评估放射性。

图21A中显示的结果表明，如预期的，用作阳性对照的PHA引起非常显著的淋巴细胞增殖。信号的强度与细胞增殖的多克隆激活很一致。包括在实验中的作为同种型对照的9G4在缺乏或存在PHA时对细胞增殖没有影响。相似地，两个测试的抗CD151抗体在两种情况下都不改变增殖。TT抗原引起部分淋巴细胞群体的显著增殖(图21B)。在存在9G4或两个测试的抗CD151抗体时对这一增殖没有影响，这表明在实验条件下，抗原呈递不受测试的化合物的影响。

Claims

1.能够结合至CD151蛋白的分离的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段，其特征在于其含有：

i)含有至少一个选自CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR的轻链，其中

-CDR-L2选自序列SEQ ID No.2或60的CDR，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.2或60具有至少80％同一性的序列；

-CDR-L3的序列是SEQ ID No.3，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.3具有至少80％同一性的序列；和/或

ii)含有至少一个选自CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR的重链，其中

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于其含有轻链和/或重链，所述轻链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.7的序列，所述重链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.8的序列。

3.2008年2月22日在I-3920号下保藏在法国巴黎巴斯德研究所国家微生物培养物保藏中心CNCM的鼠杂交瘤。

4.能够结合至CD151蛋白的分离的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段，其特征在于其含有：

i)含有至少一个选自CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR的轻链，其中

-CDR-L3的序列是SEQ ID No.19，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.19具有至少80％同一性的序列；和/或

ii)含有至少一个选自CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR的重链，其中

5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于其含有轻链和/或重链，所述轻链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.23的序列，所述重链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.24的序列。

6.2008年2月22日在I-3921号下保藏在法国巴黎巴斯德研究所国家微生物培养物保藏中心CNCM的鼠杂交瘤。

7.能够结合至CD151蛋白的分离的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段，其特征在于其含有：

i)含有至少一个选自CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR的轻链，其中

-CDR-L3是序列SEQ ID No.3的，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.3具有至少80％同一性的序列；和/或

ii)含有至少一个选自CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR的重链，其中

8.根据权利要求7所述的抗体，其特征在于其含有轻链和/或重链，所述轻链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.36的序列，所述重链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.37的序列。

9.2008年2月21日在I-3918号下保藏在法国巴黎巴斯德研究所国家微生物培养物保藏中心CNCM的鼠杂交瘤。

10.能够结合至CD151蛋白的分离的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段，其特征在于其含有：

i)含有至少一个选自CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR的轻链，其中

-CDR-L3是序列SEQ ID No.45的，或至少一个在最佳比对后与序列SEQ ID No.45具有至少80％同一性的序列；和/或

ii)含有至少一个选自CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR的重链，其中

11.根据权利要求10所述的抗体，其特征在于其含有轻链和/或重链，所述轻链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.49的序列，所述重链具有含有氨基酸序列SEQ ID No.50的序列。

12.2008年2月21日在I-3919号下保藏在法国巴黎巴斯德研究所国家微生物培养物保藏中心CNCM的鼠杂交瘤。

13.分离的核酸，其特征在于其选自下列核酸：

a)编码根据权利要求1、2、4、5、7、8、10或11中一项所述的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段的DNA或RNA核酸；

b)与a)中定义的核酸互补的核酸；

c)能够与核酸序列SEQ ID No.9-16、25-32、38-42、51-58、64-68、74-78、82-84、90-94、98-100或104-106中的至少一个或与在最佳比对后与所述序列具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列在高度严谨条件下杂交的至少18个核苷酸的核酸。

14.含有根据权利要求13所述的核酸的载体。

15.含有根据权利要求14所述的载体的细胞宿主。

16.含有根据权利要求15所述的细胞的除了人类以外的转基因动物。

17.产生根据权利要求1、2、4、5、7、8、10或11中的一项所述的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段的方法，其特征在于其含有下列步骤：

a)在合适的培养基中和在合适的培养条件下培养根据权利要求15所述的细胞；和

b)回收从培养基中或从所述培养的细胞中因此产生的所述抗体或其功能性片段。

18.能够通过根据权利要求17所述的方法获得的抗体或一个其衍生的化合物或功能性片段。

19.组合物，其含有作为活性成分的化合物，所述化合物由根据权利要求1、2、4、5、7、8、10、11或18中的一项所述的抗体或一个其功能性片段或通过根据权利要求3、6、9或12所述的杂交瘤产生的抗体或一个其功能性片段组成。

20.根据权利要求19所述的组合物，其特征在于其另外含有作为同时、分开或时间交错使用的组合产物的抗体、细胞毒剂/细胞生长抑制剂、细胞毒素或放射性元素。

21.根据权利要求19或20中的一项所述的作为药物的组合物。

22.根据权利要求1、2、4、5、7、8、10、11或18中的一项所述的抗体或一个其功能性片段或通过根据权利要求3、6、9或12所述的杂交瘤产生的抗体或一个其功能性片段和/或根据权利要求19至21中的任一项所述的组合物在制备预期用于预防或治疗癌症的药物中的用途。

23.根据权利要求22所述的用途，其特征在于所述癌症是选自前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌或胰腺癌的癌症。

24.具有过表达或低表达CD151蛋白的疾病的体外诊断方法，所述方法从被怀疑有CD151蛋白异常存在的生物样品开始，其特征在于将所述生物样品与根据权利要求1、2、4、5、7、8、10、11或18中的一项所述的抗体或通过根据权利要求3、6、9或12所述的杂交瘤产生的抗体接触，所述抗体可以在适当的地方被标记。