CN102597004A

CN102597004A - Cd151特异性嵌合抗体及其在癌症治疗中的用途

Info

Publication number: CN102597004A
Application number: CN2010800506032A
Authority: CN
Inventors: J-F·阿欧
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2009-10-09
Filing date: 2010-10-08
Publication date: 2012-07-18
Also published as: IL219034A0; NZ599097A; RU2012113418A; AU2010305360A1; JP2013507114A; KR20120094474A; EP2308897A1; EP2486057A1; WO2011042534A1; MX2012004059A; ZA201202291B; IN2012DN02696A; CA2775634A1; MA33668B1; TN2012000151A1; BR112012008266A2; TW201118168A; AR078572A1; US20120275997A1

Abstract

本发明涉及能够特异性结合人CD151蛋白的新型抗体，尤其是嵌合的和人源化的鼠源单克隆抗体，以及还涉及氨基酸序列和编码这些抗体的核序列。本发明还包括这些抗体作为预防性和/或治疗性癌症治疗的药物的用途，以及在用于诊断和CDC151蛋白过度表达有关的疾病的方法或试剂盒中的用途。最后，本发明包括包含与抗体和/或抗-癌药物结合的、或与毒素和/或放射性元素缀合的这种抗体的产品和/或组合物，及其在预防和/或治疗某些癌症中的用途。

Description

CD151特异性嵌合抗体及其在癌症治疗中的用途

技术领域

本发明涉及新型抗体，尤其是鼠源单克隆抗体，其是嵌合的和人源化的，并且其能够抑制肿瘤生长，并且还涉及氨基酸序列和编码这些抗体的核序列。根据一个具体方面，本发明涉及新型抗体、衍生的化合物或功能片段，其能够抑制肿瘤细胞的增殖。本发明还包括这些抗体作为用于预防性和/或治疗性癌症治疗的药物的用途，以及在癌症诊断方法或试剂盒中的用途。最后，本发明包括包含，例如，与抗-癌药物和/或抗体结合的、或与毒素缀合（conjugate）的这种抗体的产品和/或组合物，及其在预防和/或治疗某些癌症中的用途。

背景技术

CD151，也作PETA-3或SFA-1，是一种属于四次跨膜蛋白（tetraspanin）家族的膜蛋白（Boucheix和Rubinstein，2001，Cell Mol.Life Sci.58，1189-1205；Hemler，2001，J.Cell Biol.155，1103-1107）。在人类中，CD151具有253个氨基酸，并含有4个膜片段和2个胞外结构域EC1（18个氨基酸，序列[40-57]）和EC2（109个氨基酸，序列[113-221]），胞外结构域也作胞外环。然而应注意，在核苷酸序列中，至今已经确定CD151的两个变体，即一个在位置395和409分别具有核苷酸A和C（Fitter等人，1995，Blood 86(4)，1348-1355），而另一个在相同位置具有核苷酸G和T而不是核苷酸A和C（Hasegawa等人，1996，J.Virol.70(5)，3258-3263）。结果，在肽序列中可以观察到突变，即在132和137位置上残基K（Lys）和P（Pro）分别突变为残基R（Arg）和S（Ser）（Fitter等人，1995，Blood86(4)，1348-1355/Hasegawa等人，1996，J.Virol.70(5)，3258-3263）。

CD151过度表达于多种癌症中，比如，例如，肺癌（Tokuhara等人，2001，Clin.Cancer Res.7，4109-4114）、结肠癌（Hashida等人，2003，Br.J.Cancer 89，158-167）、前列腺癌（Ang等人，2004，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.13，1717-1721）或胰腺癌（Gesierich等人，2005，Clin.Cancer Res.11，2840-2852）。

使用不表达CD151的敲除小鼠以及使用抗-CD151抗体和siRNA以便在体外阻断CD151在各种细胞类型中的功能和表达，显示出，CD151参与多种与癌症有关的现象，比如细胞粘附（Nishiuchi等人，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，1939-1944；Winterwood等人，2006，Mol.Biol.Cell 17，2707-2721）、细胞运动性（Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343）、细胞迁移（Yauch等人，1998，Mol.Biol.Cell 9，2751-2765；Testa等人，1999，Cancer Res.59，3812-3820；Penas等人，2000，J.Invest.Dermatol.114，1126-1135；Klosek等人，2005，Biochem.Biophys.Res.Commun.336，408-416）、细胞浸润（Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343；Shiomi等人，2005，Lab.Invest.85，1489-1506；Hong等人，2006，J.Biol.Chem.281，24279-24292）和血管生成（Yanez-Mo等人，1998，J.Cell Biol.141，791-804；Sincock等人，1999，J.Cell Sci.112，833-844；Takeda等人，2007，Blood109，1524-1532）。

四次跨膜蛋白值得注意的性质之一是他们彼此之间以及还和多种其它表面分子形成结合从而形成有结构的大分子复合物的能力。这些复合物中，各四次跨膜蛋白特异性结合一个或更多个表面分子，从而形成由四次跨膜蛋白和伴侣分子组成的一级复合物（primary complex）。四次跨膜蛋白能够组织质膜的特定微区（microdomain），从所述微区可召集其伴侣分子，所述伴侣分子可以是功能缀合的。参与四次跨膜蛋白的系列相互作用已被称为“四次跨膜蛋白网络”或“四次跨膜蛋白网”。

CD151在细胞表面和各种膜蛋白相互作用。尤其是，已经鉴定出了对某些去污剂有抗性的高度稳定的与层粘连蛋白受体整合素相互作用形成的复合物，更特别地与整合素α3β1或α6β4（其优选的配体是层粘连蛋白5）相互作用形成的复合物（Yauch等人，1998，Mol.Biol.Cell 9，2751-2765；Lammerding等人，2003，Proc.Natl.Acad.Sci USA 100，7616-7621）。这种结合涉及CD151的胞外结构域和整合素。位于EC2环中的CD151的序列QRD[194-196]，在这种结合中非常重要，因为该位点的突变引起和某些整合素相互作用的丧失（Kazarov等人，2002，J.CellBiol.158，1299-1309）。CD151/整合素α6β4/c-Met（HGF受体）的功能性三元复合物也已经在肿瘤细胞中得到鉴定（Klosek等人，2005，Biochem.Biophys.Res.Commun.336，408-416）。作为用干扰RNA处理细胞的结果，对CD151表达的抑制导致对由HGF引起的细胞生长和迁移的抑制。

在特定细胞中，CD151和其它四次跨膜蛋白之间的相互作用（对形成四次跨膜蛋白网络是必要的）被认为依赖于CD151的膜和细胞质区，因为已显示，删除EC2环不会破坏CD151和其它四次跨膜蛋白的结合（Berditchevski，2001，J.CellSci.114，4143-4151）。

CD151能够通过调节各种信号途径来调节细胞粘附、迁移和浸润的现象，比如，例如，通过和PI4-激酶结合（调节）磷酸肌醇途径（Yauch等人，1998，Mol.Biol.Cell 9，2751-2765）、通过FAK、Src、p38-MAPK和JNK的磷酸化（调节）c-Jun信号途径（Hong等人，2006，J.Biol.Chem.281，24279-24292）、通过PKC的整合素磷酸化（Zhang等人，2001，J.Biol.Chem.276，25005-25013）以及Rho家族的GTP酶的激活（Shigeta等人，2003，J.Cell Biol.163，165-176）。

细胞之间的同嗜-型相互作用也与细胞运动性的增加和金属蛋白酶MMP-9的表达的增加有关（Hong等人，2006，J.Biol.Chem.281，24279-24292）。这些细胞间CD151-CD151相互作用通过FAK、Src、p38-MAPK和JNK的磷酸化引起c-Jun的激活。

尽管对CD151蛋白的关注，至今已产生两种治疗性目的的抗体，即单克隆抗体50-6和SFA1.2B4。这两种抗体具有可媲美的活性。尽管在动物模型中他们的确在体内抑制转移的形成，但是已经确定其在体内对肿瘤生长无作用。

通过消减免疫用人表皮样癌HEp-3细胞在小鼠中产生针对CD151的单克隆抗体50-6（IgG1同种型）（Testa等人，1999，Cancer Res.59，3812-3820）。

抗体50-6能够在由bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）引起的绒毛膜-尿囊膜新血管形成的模型中在体外抑制人宫颈癌HeLa细胞（经转染从而过表达CD151）和HEp-3细胞的迁移和血管生成。在体内，其在两个鸡胚模型中抑制由接种HEp-3细胞带来的转移（Testa等人，1999，Cancer Res.59，3812-3820）。在这些模型中，通过测量肺提取物中蛋白huPA（人尿激酶型纤溶酶原激活物）的活性来确定抗体50-6的抑制活性。根据作者，此分析反应出在肺中存在人细胞。分析后，通过和对照抗体比较，估计抗体50-6带来的转移（HEp-3细胞散播至鸡胚肺中）的减少在所谓的“自发转移”模型中为74%，其中在接种细胞后注射抗体，而在所谓的“实验性转移”模型中为57%，其中同时接种细胞和抗体。根据作者，体内观察到的抗体50-6的抗-肿瘤性质似乎与抑制细胞生长或细胞毒作用无关，因为抗体在体外没有显示对HEp-3细胞增殖的作用。

在ATCC以参考编号CRL-2696可以获得产生抗体50-6的杂交瘤（最初以参考编号50-6[PTA-227]保藏的杂交瘤）。

用人CD151基因转染的NIH 3T3细胞通过腹膜内途径免疫后在小鼠中产生抗-CD151单克隆抗体SFA1.2B4（IgG1同种型）（Hasegawa等人，1996，J.Virol.70，3258-3263）。抗体SFA1.2B4能够在体外抑制各种人肿瘤系的细胞浸润和运动性（Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343）。其在体内抑制由经转染而过度表达CD151的结肠癌RPMI14788和纤维肉瘤HT1080系引起的肺转移（Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343）。

其它鼠抗-CD151抗体已经描述于文献中，比如，例如，单克隆抗体14A2H1（Ashman等人，1991，Br.J.Haematol.79，263-270；Roberts等人，1995，Br.J.Haematol.89，853-860）、TS151和TS151R（Serru等人，1999，Biochem.J.340，103-111；Geary等人，2001，Tissue Antigens 58，141-153；Charrin等人，J.Biol.Chem.276，14329-14337；Chometon等人，2006，Exp.Cell Res.312，983-985）。

多个实验研究显示了四次跨膜蛋白通过作为转移的抑制因子或促进因子发挥作用在转移形成中的主要作用。因此，转染四次跨膜蛋白比如CD9、CD63或CD82降低癌系的转移潜能。相反，表达四次跨膜蛋白CD151和Co-029似乎产生相反的作用。从而认为这两种四次跨膜蛋白是转移的促进因子。这些结果和显示在多种癌症（乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、……）中的各种临床研究一致，当存在转移时在原发肿瘤中CD9和CD82表达较少，并显示其表达的减少预示着更低的存活率。在肺癌中，相比较只有这两种抗原之一的表达减少时，CD9和CD82表达的组合降低与更大的转移潜能有关。

多个回顾性研究已显示CD151的过度表达与某些癌症（比如肺癌、结肠癌和前列腺癌）的侵袭性相关，并且可能被认为是预后不良的一个因素（Tokuhara等人，2001，Clin.Cancer Res.7，4109-4114；Hashida等人，2003，Br.J.Cancer 89，158-167；Ang等人，2004，Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.13，1717-1721）。在这些情况下，相比较那些患有不表达CD151的肿瘤的患者，在那些患有表达CD151的肿瘤的患者中平均存活实际上是降低的。

由转染相应基因带来的CD151在各种人肿瘤系（HeLa、RPMI14788、A172、HT1080）中的过度表达引起转染细胞运动性、迁移和浸润的增加（Testa等人，1999，Cancer Res.59，3812-3820；Kohno等人，2002，Int.J.Cancer 97，336-343）。在抗-CD151抗体存在时这些现象被抑制。

嵌合（也称为嵌合（chimaeric））抗体应理解为涉及这样的抗体，其含有源自给定物种的抗体的天然可变（轻链和重链）区，所述可变区与来自所述给定物种异源的物种的抗体的恒定轻链和重链区相结合。

根据本发明，使用遗传重组技术可以制备嵌合型抗体、或其片段。例如，嵌合抗体可以通过克隆重组DNA产生，所述重组DNA包含启动子和编码根据本发明的非人类（特别是鼠）单克隆抗体的可变区的序列以及编码人抗体恒定区的序列。这种重组基因编码的本发明的嵌合抗体可以是，例如，鼠-人嵌合体，通过源自鼠DNA可变区确定的这种抗体的特异性，并且通过源自人DNA的恒定区确定的其同种型。对于制备嵌合抗体的方法，可以参考例如文献Verhoeyn等人（BioEssays，8:74，1988）。

发明内容

根据第一方面，本发明涉及一种嵌合抗体、或衍生化合物或功能片段，特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.7或最佳比对之后和序列SEQ ID No.7有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列的轻链，和/或包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.8或9或最佳比对之后和序列SEQ ID No.8或9有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列的重链。

两条重链序列，SEQ ID No.8和9分别对应于人同种型IgG1和IgG4。

因此，本发明的第一实施方式公开了本发明的嵌合抗体c203B6[IgG1]、或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.7的轻链序列，并且其中其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.8的重链序列。

本发明的第二实施方式公开了本发明的嵌合抗体c203B6[IgG4]、或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.7的轻链序列，并且其中其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.9的重链序列。

另一个优选实施方式中，本发明的嵌合抗体、或衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.25或37或最佳比对之后和序列SEQID No.25或37有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列的轻链，和/或包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.26、27、38或44或最佳比对之后和序列SEQ ID No.26、27、38或44有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列的重链。

两条重链序列SEQ ID No.26和38对应于人同种型IgG1，重链序列SEQ IDNo.27对应于人同种型IgG4以及重链序列SEQ ID No.44对应于人同种型IgG2。

因此，本发明的第一实施方式公开了本发明的嵌合抗体c214B2[IgG1]、或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.25的轻链序列，并且其中其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.26的重链序列。

本发明的第二实施方式公开了本发明的嵌合抗体c214B2[IgG4]、或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.25的轻链序列，并且其中其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.27的重链序列。

本发明的第三实施方式公开了本发明的嵌合抗体c214B2[IgG1][TH7]、或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.37的轻链序列，并且其中其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.38的重链序列。

本发明的第四实施方式公开了本发明的嵌合抗体c214B2[IgG2]、或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.25的轻链序列，并且其中其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.44的重链序列。

本发明抗体的“功能片段”应理解为涉及，尤其是，抗体片段，比如Fv、scFv（sc表示“单链”）、Fab、F（ab′）₂、Fab′或scFv-Fc片段或双价抗体（diabody）、或任何半衰期延长的片段。在本说明书中此后将详细描述这种功能片段。

根据本发明的抗体的“衍生化合物”被理解为特别地是指结合蛋白质，其包含肽框架或“骨架”和至少一个原始抗体的CDR以便保持其识别能力。这样的衍生的化合物对本领域技术人员是熟知的，并将在本说明书中的下文更详细地描述。

更优选地，根据本发明，本发明包括抗体，其衍生的化合物或其功能片段，其特别是嵌合的或人源化的，通过遗传重组或通过化学合成获得。

根据优选的实施方式，根据本发明，抗体或一个其衍生的化合物或功能片段特征在于其由单克隆抗体组成。

“单克隆抗体”被理解为由一群来自基本上同质的抗体衍生的抗体。更特别地，除了若干可以天然产生的且可以以最小量存在的可能突变以外，群中的单个抗体是相同的。换句话说，单克隆抗体由只有一个细胞克隆增殖产生的同质抗体组成（例如，杂交瘤、转染了编码同质抗体的DNA分子的真核宿主细胞、转染了编码同质抗体的DNA分子的原核宿主细胞等）并且通常其特征为一类和同类和亚类的重链和仅一种类型的轻链。单克隆抗体是高度特异性的并且针对单一抗原。另外，与通常含有针对不同决定簇或表位的不同抗体的多克隆抗体制备相反，每个单克隆抗体针对单一的抗原表位。

此处必须理解的是本发明不涉及天然形式的抗体，就是说，其不是从其天然环境中取得而是可能通过从天然来源起始的通过纯化而分离或获得，否则通过遗传重组或通过化学合成而获得，并且因此其可以含有如下所述的非天然氨基酸。

定义了IMGT独特的编号系统以便比较可变结构域，不论什么抗原、链类型或物种（Lefranc M.-P.，Immunology Today 18，509(1997)；Lefranc M.-P.，TheImmunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.-P.，Pommié,C.，Ruiz,M.，Giudicelli,V.，Foulquier,E.，Truong,L.，Thouvenin-Contet,V.和Lefranc，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)）。在这一编号系统中，保守的氨基酸总是维持在相同的位置，如半胱氨酸23（第一个CYS）、色氨酸41（保守的TRP）、疏水氨基酸89、半胱氨酸104（第二个CYS）、苯丙氨酸或色氨酸118（J-PHE或TRP）。因此IMGT独特的编号系统提供了骨架区的标准界定（FR1-IMGT：位置1至26、FR2-IMGT：位置39至55、FR3-IMGT：位置66至104以及FR4_IMGT：位置118至128）以及互补决定区或CDRs的标准界定（CDR1-IMGT：位置27至38、CDR2-IMGT：位置56至65以及CDR3-IMGT：位置105至117）。因为“孔”或“空”代表空闲位置，根据IMGT的CDRs的长度成为关键的信息。IMGT系统用于2D图像表示，其然后被称为IMGT珍珠项链（Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.，Immunogenetics，53，857-883(2002)；Kaas,Q.和Lefranc,M.-P.，Current Bioinformatics，2，21-30（2007）），以及用于3D结构被称为IMGT/3D结构-DB（Kaas,Q.，Ruiz,M.和Lefranc,M.-P.，T cell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.，32，D208-D210（2004））。

在本说明书中，术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”和与抗体化合物结合的“蛋白质”或其序列是可以互换的。

此处必须理解的是本发明不涉及天然形式的抗体，就是说，其不是从其天然环境中获得的，而是可以通过从天然来源起始通过纯化而被分离或获得，否则通过遗传重组或通过化学合成而获得，并且因此其可以含有将在下文中描述的非天然的氨基酸。

两条核酸或氨基酸序列之间的“百分比一致性”被本发明理解为是指两个被比较的序列之间一致的核苷酸或氨基酸残基的百分比，其在最好的比对后（最佳比对）获得，该百分比是纯统计学的并且两个序列之间的差异在其整个长度上是随机分布的。两条核酸或氨基酸序列间的比较常规地在他们最佳比对之后通过比较那些序列来进行，所述比较可能通过一段一段地或通过使用“比较窗”的手段进行。用于比较的序列的最佳比对除了可以手工进行外，还可以通过以下方式进行：Smith和Waterman（1981）的局部同源算法（Ad.App.Math.2:482），Neddleman和Wunsch（1970）的局部同源算法（J.Mol.Biol.48:443），Pearson和Lipman（1988）的相似性搜索方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444），或应用那些算法的计算机软件（Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.,Madison,WI、或通过比较软件BLAST N或BLAST P）。

两条核酸或氨基酸序列之间的百分比一致性通过比较两条最佳比对的序列来确定，其中待比较的核酸或氨基酸序列，同用于这两条序列间最佳比对的参考序列相比，可以有增加或删除。百分比一致性通过如下计算：确定两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的相同位置的数目，以相同位置的数目除以比较窗口中位置的总数目并将获得的结果乘以100从而获得这两个序列之间的百分比一致性。

例如，可能使用的BLAST程序“BLAST 2 sequences”（Tatusova等人，“Blast2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”，FEMSMicrobiol Lett.174:247-250）从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上可获得，使用的参数是以那些缺省值给出的（尤其地，参数“开放空位罚分”：5，以及“扩展空位罚分”：2，选择的矩阵是例如程序推荐的“BLOSUM 62”矩阵），比较的两个序列之间的百分比一致性直接由程序计算得出。

由于氨基酸序列具有与参考氨基酸序列至少80%，优选85%、90%、95%和98%的一致性，优选的是具有相对于参考序列的某些改造特别是至少一个氨基酸的删除、添加或置换、截短或延伸的序列。在一个或更多个连续或不连续的氨基酸的置换情况下，优选的是被置换的氨基酸由“等价的”氨基酸替代的置换。本文中的表述“等价的氨基酸”意图表示任何能够被基本结构中的一个氨基酸置换，但不会根本地改变相应抗体的生物学活性的氨基酸，如将在下文中特别是在实施例中描述的。

这些等价的氨基酸可以基于其与被置换的氨基酸的结构同源性而确定或基于可能产生的各种抗体之间的比较性生物学活性的测试结果而确定。

通过非限制性实施例的方式，下面的表1回顾了能够实施而不引起相应的经改造抗体的生物学活性根本改变的置换可能性，当然在相同条件下反向置换是可行的。

表1

原始残基	置换
		Ala(A)	Val、Gly、Pro
Arg(R)	Lys、His
		Asn(N)	Gln
Asp(D)	Glu
		Cys(C)	Ser
Gln(Q)	Asn
		Glu(G)	Asp
Gly(G)	Ala
		His(H)	Arg
Ile(I)	Leu
		Leu(L)	Ile、Val、Met
Lys(K)	Arg
		Met(M)	Leu
Phe(F)	Tyr
		Pro(P)	Ala
Ser(S)	Thr、Cys
		Thr(T)	Ser
Trp(W)	Tyr
		Tyr(Y)	Phe、Trp
Val(V)	Leu、Ala

如此前所示，本发明同样地涉及任何源自本发明抗体的化合物。

更特别地，根据本发明，抗体或一个其衍生的化合物或功能片段，特征在于所述衍生的化合物由结合蛋白质组成，所述结合蛋白质包含肽骨架，在骨架上嫁接了至少一个CDR以便完全或部分保持最初抗体的原位旁（paratopic）识别性质。

还可以在各种免疫球蛋白的蛋白质骨架上或框架上提供本发明中描述的CDRs序列中的一个或多个序列。在这种情况下，蛋白质序列使得其可以重建对嫁接的CDR或CDRs折叠有利的肽骨架，使得它/它们保持其抗原识别的原位旁性质。

以通常的方式，本领域技术人员将知道如何确定在其上嫁接至少一个源自原始抗体的CDR的蛋白质骨架的类型。更特别地，已知为了选择这样的骨架必须满足如下尽可能多的原则（Skerra A.，J.Mol.Recogn.，13，2000，167-187）：

-良好的系统发育保守性；

-已知的三维结构（比如，例如，通过晶体学照相术、NMR光谱或本领域技术人员公知的任何其它技术）；

-尺寸小；

-几乎没有或没有转录后修饰；和/或

-易于生产、表达和纯化。

这种蛋白质骨架的来源可以是，但不限于，选自如下的结构：纤维连接蛋白和优选3型纤维连接蛋白第10结构域、脂质运载蛋白、抗运载蛋白（anticalin）（Skerra A.，J.Biotechnol.，2001，74(4):257–75）、来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）蛋白A的结构域B的蛋白Z、硫氧还蛋白A以及具有“锚蛋白重复”（Kohl等人，PNAS，2003，vol.100，No.4，1700-1705）、“犰狳蛋白重复”、“富亮氨酸重复”或“三角形四肽重复（tetratricopeptide repeat）”型的的重复基序的蛋白质。

还可以提及源自毒素（比如，例如以下源自蝎子、昆虫、植物、软体动物等的毒素）或神经元一氧化氮合成酶的蛋白抑制剂（PIN）的骨架。

作为这样的杂合结构的实例（决不是限制），可以提及的是将抗-CD4抗体的CDR-H1（重链）即13B8.2插入PIN的一个环中，如此获得的新结合蛋白保留了与原始抗体相同的结合性质（Bes等人，BBRC 343，2006，334-344）。还可以提及的是（以举例的方式）将抗-溶菌酶VHH抗体的CDR-H3（重链）嫁接至新致癌菌素的一个环上（Nicaise等人，2004）。

最后如上文中描述的，这样的肽骨架能包含源自原始抗体的1至6个CDR（s）。优选地，但不是必须的，本领域技术人员将选择至少一个源自重链的CDR，已知重链主要负责抗体的特异性。对于本领域技术人员选择相关CDR（s）将是显而易见的，技术人员有目的地实施已知的技术（Bes等人，FEBS letters 508，2001 67-74）。

显然，这些实例决不是限制性的，任何其它对技术人员是已知的或显而易见的结构必须被考虑在本专利申请提供的保护范围内。

因此本发明涉及抗体或一个其衍生的化合物或功能片段，其特征为所述肽骨架选自下列蛋白质：a）系统发育上是非常保守的，b）有很强的结构，c）具有熟知的三维分子结构（organisation），d）尺寸小和/或e）包含可以通过删除和/或插入改造而不改变稳定性性质的区域。

根据优选实施方式，根据本发明，抗体或一个其衍生的化合物或功能片段的特征在于肽骨架选自：i）源自纤维连接蛋白，优选3型纤维结合蛋白第10结构域、脂质运载蛋白、抗运载蛋白、源自金黄色葡萄球菌的蛋白A结构域B的蛋白Z、硫氧还蛋白A的骨架，ii）具有“锚蛋白重复”、“犰狳蛋白重复”、“富含亮氨酸重复”或“三角形四肽重复”型的重复基序的蛋白质以及还有iii）神经元一氧化氮合成酶的蛋白抑制剂（PIN）。

根据本发明的另一个方面，同样提及的是上文所述抗体的功能片段。

更特别地，本发明涉及抗体或一个其衍生的化合物或功能片段，本发明特征在于所述功能片段选自Fv、Fab、(Fab′)₂、Fab′、scFv和scFv-Fc片段和双价抗体和任何其半衰期被延长的片段如聚乙二醇化的片段。

这样的根据本发明的抗体的功能片段由下列组成：例如Fv、scFv（sc代表单链）、Fab、F(ab′)₂、Fab′或scFv-Fc片段或双价抗体，或任何其半衰期通过下列方式延长的片段：化学修饰，例如加成聚亚烷基二醇如聚乙二醇（“聚乙二醇化”）（聚乙二醇化片段被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab′)₂-PEG或Fab′-PEG）（“PEG”来自Poly(Ethylene)Glycol的名称），或者通过并入脂质体、微球或PLGA，所述片段具有至少一个根据本发明的特征性CDRs，并且特别地能够全部，甚至是部分地，展现衍生其的抗体的活性。

优选地，所述功能片段将由下列组成或将含有：衍生其的抗体的可变重链或轻链的部分序列，所述部分序列足以保留与衍生其的抗体相同的结合特异性和足够的亲和力，所述亲和力优选等于衍生其的抗体的至少第1/100，更优选至少第1/10。

这样的功能片段将含有来自衍生其的抗体的序列的至少5个连续的氨基酸，优选10、15、25、50或100个连续的氨基酸。

还优选的是包括至少如下的功能片段：

-包含于SEQ ID No.7中的3个轻链CDRs以及来自序列SEQ ID No.7的112个连续氨基酸，优选115、125、175、200或210个连续氨基酸；和/或

-包含于SEQ ID No.8或9中的3个重链CDRs以及来自序列SEQ ID No.8或9的119个连续氨基酸，优选125、150、200、250或300个连续氨基酸。

还优选包括至少如下的功能片段：

-包含于SEQ ID No.25或37中的3个轻链CDRs以及来自序列SEQ ID No.25或37的108个连续氨基酸，优选115、125、175、200或210个连续氨基酸；和/或

-包含于SEQ ID No.26、27或38中的3个重链CDRs以及来自序列SEQ ID No.26、27或38的120个连续氨基酸，优选125、150、200、250或300个连续氨基酸。

优选地，这些功能片段将是Fv、scFv、Fab、(Fab′)₂、F(ab′)、scFv-Fc型或双价抗体的片段，其通常具有与其获自的抗体相同的固定特异性。根据本发明，本发明的抗体的片段可以通过方法如使用酶如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的消化和/或通过化学还原方法分切割二硫桥而从上文所述抗体开始获得。包括在本发明中的抗体片段还可以通过同样是本领域技术人员熟知的遗传重组技术或通过例如自动肽合成仪（如那些由Applied Biosystems公司提供的等）的方式通过肽合成获得。

根据另一个具体的方面，根据本发明，本发明涉及嵌合抗体或一个其衍生的化合物或功能片段，其特征在于所述抗体还含有源自于小鼠异源物种（特别是来自人）的抗体的恒定轻链和重链区。

根据本发明的另一个方面，人源化抗体或一个其衍生的化合物或功能片段的特征在于源自人抗体的恒定轻链和重链区分别是λ或κ区以及γ-1、γ-2或γ-4区。

根据另一个方面，本发明涉及第一个鼠杂交瘤，其中本发明嵌合单克隆抗体c203B6[IgG1]和c203B6[IgG4]源自所述鼠杂交瘤，特别是2008年2月22日在国家微生物培养物保藏中心（CNCM）（法国巴黎巴斯德研究所）的编号I-3920下保存的鼠源杂交瘤。所述杂交瘤通过融合经免疫的Balb/c小鼠脾细胞和Sp 2O Ag 14骨髓瘤细胞系获得。

最后，根据另一个方面，本发明涉及第二个鼠杂交瘤，其中本发明嵌合单克隆抗体c214B2[IgG1]和c214B2[IgG4]源自所述鼠杂交瘤，特别是2008年2月21日在国家微生物培养物保藏中心（CNCM）（法国巴黎巴斯德研究所）的编号I-3919下保存的鼠源杂交瘤。所述杂交瘤通过融合经免疫的Balb/c小鼠脾细胞和Sp 2OAg 14骨髓瘤细胞系获得。

如下表2，为了清楚，用根据IMGT定义的CDR序列以及嵌合轻和重链，总结了对应于本发明不同抗体的不同氨基酸序列。

表2

根据本发明的抗体还包括抗体的特异性嵌合形式，称为人源化抗体（Hz或hz）。

人源化抗体被理解为是指含有源自非-人源抗体的CDR区的抗体，抗体分子的其它部分源自一个（或多个）人抗体或种系。另外，骨架区段的一些残基（称为FR）可以被改造从而保留结合亲和力（Jones等人，Nature，321:522-525，1986；Verhoeyen等人，Science，239:1534-1536，1988；Riechmann等人，Nature，332:323-327，1988）。

根据本发明的人源化抗体或其片段可以通过本领域技术人员已知的技术制备（比如，例如，那些在文献Singer等人，J.Immun.150:2844-2857，1992；Mountain等人，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10:1-142，1992；或Bebbington等人，Bio/Technology，10:169-175，1992中描述的那些）。这样的根据本发明的人源化抗体优选用于体外诊断方法或用于体内预防性和/或治疗性治疗。其它人源化技术对本领域技术人员来说也是已知的，比如，例如，PDL描述的“CDR嫁接”技术，其是专利EP 0 451 261、EP 0 682 040、EP 0 939 127、EP 0 566 647或也是US5,530,101、US 6,180,370、US 5,585,089和US 5,693,761的主题。还在专利US5,639,641或还在6,054,297、5,886,152和5,877,293中有所提及。

另外，本发明还涉及源自上文所述嵌合抗体的人源化抗体。

优选地，源自人抗体的恒定轻链和重链区分别是λ或κ区以及γ-1、γ-2或γ-4区。

更具体地，如同将通过下述实施例变得更加显而易见，多种本发明抗体的人源化变体由本申请人产生。

在另一个优选实施方式中，本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.46、47、48或49或最佳比对之后和序列SEQ ID No.46、47、48或49有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列的轻链可变结构域，和/或包括含有包含氨基酸序列SEQ IDNo.50、51、52或53或最佳比对之后和序列SEQ ID No.50、51、52或53有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列的重链可变结构域。

本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.46的序列的轻链可变结构域Hz214B2VLVar1，以及选自如下组的重链可变结构域：具有包含氨基酸序列SEQ ID No.50的序列的Hz214B2VHVar1、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.51的序列的Hz214B2VHVar2、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.52的序列的Hz214B2VHVar3、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.53的序列的Hz214B2VHVar4。

本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.47的序列的轻链可变结构域Hz214B2VLVar2，以及选自如下组的重链可变结构域：具有包含氨基酸序列SEQ ID No.50的序列的Hz214B2VHVar1、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.51的序列的Hz214B2VHVar2、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.52的序列的Hz214B2VHVar3、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.53的序列的Hz214B2VHVar4。

本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.48的序列的轻链可变结构域Hz214B2VLVar3，以及选自如下组的重链可变结构域：具有包含氨基酸序列SEQ ID No.50的序列的Hz214B2VHVar1、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.51的序列的Hz214B2VHVar2、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.52的序列的Hz214B2VHVar3、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.53的序列的Hz214B2VHVar4。

本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.49的序列的轻链可变结构域Hz214B2VLVar4，以及选自如下组的重链可变结构域：具有包含氨基酸序列SEQ ID No.50的序列的Hz214B2VHVar1、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.51的序列的Hz214B2VHVar2、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.52的序列的Hz214B2VHVar3、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.53的序列的Hz214B2VHVar4。

本发明的第一个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar1VHVar1或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.46的轻链可变结构域序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.50的重链可变结构域序列。

本发明的第二个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar2VHVar2或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.47的轻链可变结构域序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.51的重链可变结构域序列。

本发明的第三个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar3VHVar3或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.48的轻链可变结构域序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.52的重链可变结构域序列。

本发明的第四个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar4VHVar4或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.49的轻链可变结构域序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.53的重链可变结构域序列。

在另一个实施方式中，本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.62、63、64或65或最佳比对之后和序列SEQ ID No.62、63、64或65有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列的轻链，和/或包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.66、67、68、69、70、71、72或73或最佳比对之后和序列SEQ ID No.66、67、68、69、70、71、72或73有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列的重链。

更具体地，本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段是IgG1，且特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.62、63、64或65或最佳比对之后和序列SEQ ID No.62、63、64或65有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列的轻链，和/或包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.66、67、68或69或最佳比对之后和序列SEQ ID No.66、67、68或69有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列的重链。

本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.62的序列的轻链Hz214B2VLVar1，以及选自如下组的重链：具有包含氨基酸序列SEQ ID No.66的序列的Hz214B2VHVar1（G1）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.67的序列的Hz214B2VHVar2（G1）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.68的序列的Hz214B2VHVar3（G1）、具有包含氨基酸序列SEQ IDNo.69的序列的Hz214B2VHVar4（G1）。

本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.63的序列的轻链Hz214B2VLVar2，以及选自如下组的重链：具有包含氨基酸序列SEQ ID No.66的序列的Hz214B2VHVar1（G1）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.67的序列的Hz214B2VHVar2（G1）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.68的序列的Hz214B2VHVar3（G1）、具有包含氨基酸序列SEQ IDNo.69的序列的Hz214B2VHVar4（G1）。

本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.64的序列的轻链Hz214B2VLVar3，以及选自如下组的重链：具有包含氨基酸序列SEQ ID No.66的序列的Hz214B2VHVar1（G1）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.67的序列的Hz214B2VHVar2（G1）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.68的序列的Hz214B2VHVar3（G1）、具有包含氨基酸序列SEQ IDNo.69的序列的Hz214B2VHVar4（G1）。

本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.65的序列的轻链Hz214B2VLVar4，以及选自如下组的重链：具有包含氨基酸序列SEQ ID No.66的序列的Hz214B2VHVar1（G1）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.67的序列的Hz214B2VHVar2（G1）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.68的序列的Hz214B2VHVar3（G1）、具有包含氨基酸序列SEQ IDNo.69的序列的Hz214B2VHVar4（G1）。

本发明的第一个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar1VHVar1（G1）或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.62的轻链序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.66的重链序列。

本发明的第二个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar2VHVar2（G1）或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.63的轻链序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.67的重链序列。

本发明的第三个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar3VHVar3（G1）或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.64的轻链序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.68的重链序列。

本发明的第四个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar4VHVar4（G1）或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.65的轻链序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.69的重链序列。

本发明的第五个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar3VHVar2（G1）或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.64的轻链序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.67的重链序列。

本发明的第六个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar2VHVar3（G1）或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.63的轻链序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.68的重链序列。

更具体地，本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段是IgG2，且特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.62、63、64或65或最佳比对之后和序列SEQ ID No.62、63、64或65有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列的轻链，和/或包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.70、71、72或73或最佳比对之后和序列SEQ ID No.70、71、72或73有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列的重链。

本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.62的序列的轻链Hz214B2VLVar1，以及选自如下组的重链：具有包含氨基酸序列SEQ ID No.70的序列的Hz214B2VHVar1（G2）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.71的序列的Hz214B2VHVar2（G2）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.72的序列的Hz214B2VHVar3（G2）、具有包含氨基酸序列SEQ IDNo.73的序列的Hz214B2VHVar4（G2）。

本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.63的序列的轻链Hz214B2VLVar2，以及选自如下组的重链：具有包含氨基酸序列SEQ ID No.70的序列的Hz214B2VHVar1（G2）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.71的序列的Hz214B2VHVar2（G2）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.72的序列的Hz214B2VHVar3（G2）、具有包含氨基酸序列SEQ IDNo.73的序列的Hz214B2VHVar4（G2）。

本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.64的序列的轻链Hz214B2VLVar3，以及选自如下组的重链：具有包含氨基酸序列SEQ ID No.70的序列的Hz214B2VHVar1（G2）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.71的序列的Hz214B2VHVar2（G2）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.72的序列的Hz214B2VHVar3（G2）、具有包含氨基酸序列SEQ IDNo.73的序列的Hz214B2VHVar4（G2）。

本发明的人源化抗体、或其衍生化合物或功能片段特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.65的序列的轻链Hz214B2VLVar4，以及选自如下组的重链：具有包含氨基酸序列SEQ ID No.70的序列的Hz214B2VHVar1（G2）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.71的序列的Hz214B2VHVar2（G2）、具有包含氨基酸序列SEQ ID No.72的序列的Hz214B2VHVar3（G2）、具有包含氨基酸序列SEQ IDNo.73的序列的Hz214B2VHVar4（G2）。

本发明的第一个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar1VHVar1（G2）或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.62的轻链序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.70的重链序列。

本发明的第二个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar2VHVar2（G2）或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.63的轻链序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.71的重链序列。

本发明的第三个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar3VHVar3（G2）或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.64的轻链序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.72的重链序列。

本发明的第四个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar4VHVar4（G2）或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.65的轻链序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.73的重链序列。

本发明的第五个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar3VHVar2（G2）或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.64的轻链序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.71的重链序列。

本发明的第六个优选实施方式公开了人源化抗体Hz214B2VLVar2VHVar3（G2）或其衍生化合物或功能片段，其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.63的轻链序列和包含氨基酸序列SEQ ID No.72的重链序列。

如下表3，为了清楚，用根据IMGT定义的CDR序列以及不同的人源化轻和重链，总结了对应于本发明不同抗体的不同氨基酸序列。

表3

IgG4-衍生抗体可进一步经改造，如Angal等人1993所述，以便稳定铰链区，导致表达更同质的抗体（Ser226至Pro的改造）。

在对应于IgG1或IgG2同种型的具体实施方式中，抗体的其它特征在于具有效应因子功能比如ADCC（依赖抗体的细胞的细胞毒性）和/或CDC（依赖补体的细胞毒性）。

免疫球蛋白的重链可被分为三个功能区：Fd区、铰链区和Fc区（可结晶的片段）。所述Fd区包括VH和CH1结构域，Fd区结合轻链形成Fab——抗原-结合片段。所述Fc片段负责免疫球蛋白效应因子功能，其包括，例如，补体固定以及结合效应细胞的同源Fc受体。所述铰链区，发现于IgG、IgA和IgD免疫球蛋白类，作为柔性间隔发挥作用，其允许Fab部分在和Fc区有关的空间内自由移动。铰链结构域是结构多样性的，在免疫球蛋白类和亚类中其在序列和长度方面均不同。

根据晶体照相术研究，免疫球蛋白铰链区可以进一步从结构和功能上再划分为三个区：上铰链、核、和下铰链（Shin等人，Immunological Reviews 130:87，1992）。上铰链包括从CH1羧基端至限制运动的铰链中第一个残基（通常在两条重链间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基）的氨基酸。上铰链区的长度与抗体的节段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫桥。下铰链区连接CH2结构域的氨基末端并包括CH2结构域中的残基。人IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，当通过形成二硫键而二聚化时，其产生被认作是轴的环八肽，从而赋予了柔性。通过免疫球蛋白铰链区多肽序列的结构和柔性所允许的构象变化可影响抗体Fc部分的效应因子功能。

根据本发明的一个具体方面，本发明的嵌合抗体特征在于其包括包含氨基酸序列SEQ ID No.41的铰链区。

更具体地，嵌合抗体c214B2包括具有包含氨基酸序列SEQ ID No.37的序列的轻链以及具有包含氨基酸序列SEQ ID No.38的序列的重链。

此外，如此后的实施例中将出现的，本发明涉及的抗体在这一方面上不同于迄今已知的抗体，即其能够抑制肿瘤细胞的增殖。

如此前所述，CD151蛋白质属于四次跨膜蛋白家族，由于，含有2个胞外结构域EC1（18个氨基酸，序列[40-57]）以及EC2（109个氨基酸，序列[113-221]），胞外结构域也作胞外环。

根据本发明，所用抗体能够结合至少一个位于胞外结构域的表位。优选，所述抗体将自身固定至环EC1和/或EC2。

更具体地，根据本发明优选实施方式，描述了至少一个抗-CD151抗体、或一个其功能片段能够结合至包括在胞外环1（EC1）和/或2（EC2）（优选EC2）中的表位的用途，EC1和EC2分别对应于CD151蛋白的氨基酸40-57和113-221。

EC1环[40-57]含有18个氨基酸并且具有理论重量2002.2Da。

EC2环[113-221]具有N糖基化位点（残基Asn159）和形成3个二硫桥的6个半胱氨酸残基。四次跨膜蛋白的EC2环的结构模型，特别是CD151的结构模型，已经基于四次跨膜蛋白CD81的EC2环的三维结构被提出（Seigneuret等人，2001，J.Biol.Chem.276，40055-40064）。根据这个模型，四次跨膜蛋白具有共同的相对保守的由3个α螺旋和特殊的可变结构域组成的骨架。对于CD151，该骨架被认为由[113-157]和[209-221]区组成，可变结构域被认为由[158-208]区组成。

EC2环的可变结构域被认为更特别地参与CD151与整合素家族蛋白质的特异性相互作用。定向突变实验特别显示[193-208]区，更精确地是三肽QRD[194-196]和位于192的半胱氨酸残基在CD151与某些层粘连蛋白受体整合素比如整合素α3β1或α6β4的结合中的重要性（Kazarov等人，2002，J.Cell Biol.158，1299-1309）。

甚至更优选地，本发明涉及能够结合至EC2区的表位的至少一个抗-CD151抗体或一个其功能片段的用途。

在新的方面，本发明涉及分离的核酸，其特征在于其选自下列核酸：

a）编码此前定义的抗体或一个其衍生的化合物或功能片段的DNA或RNA核酸；

b）与此前a）中定义的核酸互补的核酸；

c）能够在高度严格的条件下与核酸序列SEQ ID No.16-18或34-36、39、40、45或54-61或74-85中至少一个杂交的或与最佳比对后与所述序列具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%一致性的序列杂交的至少18个核苷酸的核酸。

更优选能够在高度严格条件下与选自如下序列的至少一个核酸序列杂交的至少18个核苷酸的核酸：

-源自序列SEQ ID No.16且编码序列SEQ ID No.7的aa112-218片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.17且编码序列SEQ ID No.8的aa119-448片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.18且编码序列SEQ ID No.9的aa119-445片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.34且编码序列SEQ ID No.25的aa108-214片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.35且编码序列SEQ ID No.26的aa120-449片段的序列；以及

-源自序列SEQ ID No.36且编码序列SEQ ID No.27的aa120-446片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.39且编码序列SEQ ID No.37的aa108-214片段的序列；以及

-源自序列SEQ ID No.40且编码序列SEQ ID No.38的aa120-449片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.45且编码序列SEQ ID No.44的aa139-463片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.74且编码序列SEQ ID No.62的aa108-214片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.75且编码序列SEQ ID No.63的aa108-214片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.76且编码序列SEQ ID No.64的aa108-214片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.77且编码序列SEQ ID No.65的aa108-214片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.78且编码序列SEQ ID No.66的aa120-449片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.79且编码序列SEQ ID No.67的aa120-449片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.80且编码序列SEQ ID No.68的aa120-449片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.81且编码序列SEQ ID No.69的aa120-449片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.82且编码序列SEQ ID No.70的aa120-444片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.83且编码序列SEQ ID No.71的aa120-444片段的序列；

-源自序列SEQ ID No.84且编码序列SEQ ID No.72的aa120-444片段的序列；以及

-源自序列SEQ ID No.85且编码序列SEQ ID No.73的aa120-444片段的序列。

如下表4用根据IMGT定义的CDR序列以及嵌合轻和重链，总结了涉及本发明抗体的不同核苷酸序列。

表4

如下表5用根据IMGT定义的CDR序列以及不同人源化轻和重链，总结了涉及本发明抗体的不同核苷酸序列。

表5

术语核酸、核的或核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸序列、核苷酸序列在本说明书中可以互换使用，它们被理解为是指核苷酸的精确串联（改造的或未改造的），使得可以限定核酸的片段或区域（包括或不包括非天然的核苷酸），其可以同等地对应于双链DNA、单链DNA和所述DNA的转录产物。

此处还必须理解的是本发明不涉及天然染色体环境（就是说在天然状态中）中的核苷酸序列。其是已经被分离和/或纯化的序列，就是说其已经被直接或间接地提取了，例如通过拷贝，其环境已经至少被部分改变了。此处其还被理解为是指通过使用例如宿主细胞的遗传重组获得的或通过化学合成获得的分离的核酸。

在最佳比对后与优选的序列具有至少80%，优选85%、90%、95%和98%的百分比一致性的核序列被理解为是指相当于参考核序列具有某些改造如（特别是）删除、截短、延长、嵌合融合和/或置换特别是逐点置换的核序列。其优选是这样的序列：其序列编码与参考序列相同的氨基酸序列，这是由于遗传密码的简并性，或能够优选在高度严格的条件下（特别是下文定义的条件下）与参考序列特异性杂交的互补序列。

在高度严格的条件下杂交的意思是如此选择温度和离子强度的条件而使得可以在两个互补的DNA片段之间维持杂交。通过举例的方式，为了限定上文所述的多核苷酸片段的杂交步骤的高严格条件优选如下：

DNA-DNA或DNA-RNA杂交在两个步骤中进行：（1）在42°C含有5×SSC（1×SSC对应于0.15M氯化钠+0.015M柠檬酸钠的溶液）、50%甲酰胺、7%十二烷基硫酸钠（SDS）、10×Denhardt′s、5%硫酸葡聚糖和1%鲑精DNA的磷酸盐缓冲液（20mM，pH 7.5）中预杂交3小时；（2）在取决于探针大小的温度下（即：对于大小>100个核苷酸的探针为42°C）适当杂交20小时，接着在20°C 2×SSC+2% SDS中洗涤2次，每次20分钟，在20°C 0.1×SSC+0.1% SDS中洗涤1次，每次20分钟。对于大小>100个核苷酸的探针，最后的洗涤在60°C 0.1×SSC+0.1%SDS中进行30分钟。对于上文所述的限定大小的多核苷酸的高度严格条件可以由本领域技术人员为了更大或更小大小的寡核苷酸根据Sambrook等人的教导（1989，Molecular cloning:a laboratory manual.第二版，Cold Spring Harbor）做调整。

本发明还涉及含有根据本发明的核酸的载体。

本发明特别涉及含有根据本发明的核苷酸序列的克隆和/或表达载体。

根据本发明的载体优选包括允许在特定宿主细胞中表达和/或分泌核苷酸序列的元件。那么载体必须包括启动子、转录起始和终止信号还有适当的转录调节区。其必须能够以稳定的方式维持在宿主细胞中并且其可选地可以具有指定经转录的蛋白质分泌的特定信号。这些各种元件将由本领域技术人员进行选择和优化，作为所用细胞宿主的功能。为了这个效果，可以将根据本发明的核苷酸序列插入所选宿主内的自我复制载体或可以是所选宿主的整合载体。

这样的载体用本领域技术人员常规使用的方法制备，可以将获得的克隆通过标准方法如脂质转染、电穿孔、热休克或化学方法引入合适的宿主中。

根据本发明的载体是，例如，质粒或病毒来源的载体。其用于转化宿主细胞从而克隆或表达根据本发明的核苷酸序列。

本发明还包括由根据本发明的载体转化的或含有根据本发明的载体的宿主细胞。

细胞宿主可以选自原核或真核系统，例如细菌细胞，还有酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。还可以使用昆虫细胞或植物细胞。

本发明还涉及含有根据本发明的经转化的细胞的动物，不包括人类。

根据另一个方面，本发明涉及生产根据本发明的抗体或一个其功能片段的方法，其特征在于其包括下列步骤：

a）在合适的培养基中以及在合适的培养条件下培养根据本发明的宿主细胞；和

b）从培养基或从所述培养的细胞中回收由此生产的所述抗体或其功能片段。

根据本发明的转化的细胞可以用于制备根据本发明的重组多肽的方法。用于制备根据本发明的重组形式的多肽的方法，特征在于其采用根据本发明的载体和/或用载体转化的细胞，所述方法本身包括在本发明中。优选地，用根据本发明的载体转化的细胞在能够表达所述多肽的条件下培养，并且回收所述重组肽。

如已经声明的，细胞宿主可以选自原核或真核系统。特别地，可以鉴定根据本发明的核苷酸序列，该核苷酸序列有助于在这样原核或真核系统中的分泌。因此携带这样序列的根据本发明的载体可以有利地用于生产想要分泌的重组蛋白质。事实上，这些相关重组蛋白质的纯化将得到以下事实的帮助：其存在于细胞培养物的上清中而不是在宿主细胞的内部。

还可以通过化学合成制备根据本发明的多肽。这样的制备方法也包括在本发明的主题中。本领域技术人员知道化学合成的方法，通过浓缩片段或通过溶液中的常规合成，例如应用固相的技术（特别参见Steward等人，1984，Solid phasepeptides synthesis，Pierce Chem.Company，Rockford，111，第二版，(1984)）或使用部分固相的技术。通过化学合成获得的多肽（其可以含有相应的非天然氨基酸）也包括在本发明中。

能够用根据本发明的方法获得的抗体或一个其衍生的化合物或功能片段也包括在本发明中。

根据另一个方面，本发明涉及上文所述的抗体，其特征在于其另外是双特异的，也就是说能够特异性结合至除了CD151以外的人蛋白质或人受体。

双特异的或双功能的抗体构成第二代单克隆抗体，其中两个不同的可变区组合在相同的分子中（Hollinger和Bohlen，1999，Cancer and metastasis rev.18：411-419）。其在诊断领域和在治疗领域中的用途已经通过其募集新效应因子功能的能力或靶向肿瘤细胞表面上的多个分子的能力而被证实。这些抗体可以用化学方法获得（Glennie MJ等人1987 J.Immunol.139，2367-2375；Repp R.等人1995 J.Hemat.377-382）或体细胞方法获得（Staerz U.D.和Bevan M.J.1986 PNAS 83，1453-1457；Suresh M.R.等人1986 Method Enzymol.121:210-228），而且，优选地，用遗传工程技术获得，所述遗传工程技术可以强迫进行异源二聚化并因此有助于纯化所求抗体的方法（Merchand等人1998 Nature Biotech.16:677-681）。

这些双特异的抗体可以被构建成完整的IgG、双特异的Fab′2、Fab′PEG或双价抗体或双特异scFv，还可以构建成四价双特异抗体，其中针对每个靶向的抗原（Park等人2000 Mol.Immunol.37(18):1123-30）或其上文所述的片段存在两个固定位点。

除了由于生产和施用双特异抗体不比生产两个特异抗体更繁重的事实产生的经济上的优势，使用这样的双特异抗体具有减少治疗毒性的优势。事实上，使用双特异抗体使得可以减少循环抗体的总量，从而减少可能的毒性。

在本发明的优选实施方式中，双特异抗体是二价（divalent）的或四价的抗体。

最后，本发明涉及上文所述的抗体或一个其衍生的化合物或功能片段作为药物。

本发明还涉及药物组合物，其含有作为活性成分的化合物，所述化合物由根据本发明的抗体或一个其衍生的化合物或功能片段组成。优选地，向所述抗体加入赋形剂和/或可药用载体。

根据另一个实施方式，本发明还涉及上文所述的药物组合物，其另外含有作为同时、分开或错时使用的组合产物的至少一个其它抗体、细胞毒剂/细胞生长抑制剂、细胞毒素或放射性元素。

“同时使用”被理解为施用包含在一个且相同的药物形式中的根据本发明的组合物的两个化合物。

“分开使用”被理解为在相同时间施用包含在分开的药物形式中的根据本发明的组合物的两个化合物。

“错时使用”被理解为相继施用每个包含在分开的药物形式中的根据本发明的组合物的两个化合物。

以常规方式，根据本发明的组合物相当大地增加了癌症治疗的效力。换言之，根据本发明的抗体的治疗作用通过施用细胞毒剂以出乎意料的方式被加强了。根据本发明的组合物所产生的另一个主要的随后优点涉及使用活性成分的更少的有效剂量的可能性，这使得可以避免或减少出现次级效应的风险，特别是细胞毒剂的作用。另外，根据本发明的这种组合物应该使得可以更快地获得预期的治疗作用。

“抗癌治疗剂”或“细胞毒剂”应该被理解为是这样的物质：当向患者施用时，治疗或预防患者中癌症的发展。通过这样试剂的非限制性实例，可以提及的是“烷化”剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄性激素或免疫调节剂。

这样的试剂在，例如，专注于肿瘤学和血液学的页上在“细胞毒剂”（英文为：cytotoxic agents）专栏中的VIDAL中提及；通过参考所述文献的方式提及的这样的细胞毒化合物在此作为优选的细胞毒剂被提及。

“烷化剂”是指能够共价结合至或烷化细胞内任何分子（优选核酸（例如：DNA））的任何物质。作为这样的烷化剂的实例，可以提及的是氮芥比如二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、美法仑盐酸盐、哌泊溴烷、松龙苯芥磷酸氢二钠或雌氮芥；噁唑碱（oxazophorine）比如环磷酰胺、六甲蜜胺、曲磷胺、磺基磷酰胺（sulfofosfamide）或异环磷酰胺；氮丙啶或乙撑亚胺（ethylene-imine）如塞替派（thiotepa）、二乙撑二胺（triethyleneamine）或altetramine（无对应译文）；亚硝基脲如卡莫司汀（carmustine）、链脲菌素（streptozocin）、福莫司汀（fotemustine）或洛莫司汀（lomustine）；烷基磺酸盐如白消安（busulfan）、苏消安（treosulfan）或英丙舒凡（improsulfan）；三氮烯如氮烯唑胺（dacarbazine）；以及还有铂复合物如顺铂（cisplatin）、奥沙利铂（oxaliplatin）或卡铂（carboplatin）。

“抗代谢物”是指通过干扰某些活性（通常是DNA合成）而阻碍细胞生长和/或细胞代谢的物质。以抗代谢物实例的方式，可以提及的是氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、5-氟脱氧尿苷、卡培他滨、阿糖胞苷（cytarabine）、氟达拉滨、阿糖胞苷（cytosine arabinoside）、6-巯基嘌呤（6-MP）、6-硫代鸟嘌呤（6-TG）、氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、吉西他滨、克拉屈滨、脱氧助间型霉素和喷司他丁。

“抗肿瘤抗生素”是指可以防止或抑制DNA、RNA和/或蛋白质合成的化合物。这样的抗肿瘤抗生素的实例包括阿霉素、柔红霉素、去甲氧基柔红霉素、戊柔比星、米托蒽醌、放线菌素D、光神霉素（mithramycin）、普卡霉素（plicamycin）、丝裂霉素C、博来霉素和甲基苄肼。

“有丝分裂抑制剂”防止细胞周期和有丝分裂的正常进行。通常，微管抑制剂或“紫杉烷类”如紫杉醇和多烯紫杉醇能够抑制有丝分裂。长春花生物碱如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨也能够抑制有丝分裂。

“染色质功能抑制剂”或“拓扑异构酶抑制剂”是指抑制染色质重塑蛋白质如拓扑异构酶I和II的正常功能的物质。这样的抑制剂的实例包括：对于拓扑异构酶I，为喜树碱还有其衍生物如伊立替康或拓扑替康，对于拓扑异构酶II，为依托泊苷、依托泊苷磷酸盐和替尼泊苷。

“抗血管生成剂”是指抑制血管生长的任何药物、化合物、物质或试剂。抗血管生成剂的实例包括（没有任何限制性）雷佐生、马立马司他、巴马司他、普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、CGS-27023A、常山酮、COL-3、新伐司他（neovastat）、BMS-275291、沙利度胺（thalidomide）、CDC 501、DMXAA、L-651582、角鲨胺（squalamine）、内皮他丁（endostatin）、SU5416、SU6668、α干扰素、EMD121974、白细胞介素-12、IM862、血管抑素（angiostatin）和vitaxin（无对应译文）。

“抗雌激素”或“抗雌激素剂”是指减少、拮抗或抑制雌激素作用的任何物质。这样的试剂的实例是他莫昔芬（tamoxifen）、托瑞米芬（toremifene）、雷洛昔芬（raloxifene）、屈洛昔芬（droloxifene）、iodoxyfene（无对应译文）、阿纳托唑（anastrozole）、来曲唑（letrozole）和依西美坦（exemestane）。

“抗雄激素”或“抗雄激素剂”是指减少、拮抗或抑制雄激素作用的任何物质。抗雄激素的实例是氟他胺（flutamide）、尼鲁米特（nilutamide）、比卡鲁胺（bicalutamide）、安体舒通（spironolactone）、醋酸环丙氯地孕酮（cyproteroneacetate）、非那司提（finasteride）和西咪替丁（cimitidine）。

免疫调节剂是刺激免疫系统的物质。这样的免疫调节剂的实例包括干扰素、白细胞介素如阿地白介素（aldesleukin）、OCT-43、地尼白介素-毒素连接物（denileukin diflitox）或白细胞介素-2、肿瘤坏死因子如他索纳明（tasonermin）或其它类型的免疫调节剂如香菇多糖（lentinan）、西佐喃（sizofiran）、罗喹美克（roquinimex）、匹多莫德（pidotimod）、培加酶（pegademase）、胸腺喷丁（thymopentin）、聚I:C（poly I:C）或与5-氟尿嘧啶结合的左旋咪唑（levamisole）。

更详细地，本领域技术人员能够参考题目为“Traitéde chimie thérapeutique，Vol.6，Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers，ed.TEC & DOC，2003”的法国治疗化学教师协会出版的手册。

在特别优选的具体实施方式中，根据本发明所述的组合产物形式的组合物的特征在于所述细胞毒剂为化学结合至所述抗体上以同时使用。

在特别优选的具体实施方式中，根据本发明所述的组合物的特征在于所述细胞毒剂/细胞生长抑制剂选自纺锤体抑制剂或稳定剂，优选为长春瑞滨和/或长春氟宁和/或长春新碱。

为了有助于根据本发明的所述细胞毒剂和所述抗体之间的结合，可能尤其是在要结合的两个化合物（例如聚（亚烷基）二醇如聚乙二醇、或还有氨基酸）之间引入间隔分子，或在另一个实施方式中是使用所述细胞毒剂的活性衍生物，其中引入了能够与根据本发明所述的抗体反应的官能团。这些结合技术是本领域技术人员已知的，在本说明书中不详细说明。

根据另一个方面，本发明涉及组合物，其特征在于一个，至少，所述抗体或一个其衍生的化合物或功能片段与细胞毒素和/或放射性元素缀合。

优选地，所述毒素或所述放射性元素能够防止肿瘤细胞的生长或增殖，特别是完全使所述肿瘤细胞失活。

还优选的是所述毒素是肠细菌毒素，特别是假单胞菌（Pseudomonas）外毒素A。

优选与抗体缀合的应用在治疗中的放射性元素（或放射性同位素）是发射γ射线的放射性同位素，优选是碘¹³¹、钇⁹⁰、金¹⁹⁹、钯¹⁰⁰、铜⁶⁷、铋²¹⁷和锑²¹¹。发射β射线和α射线的放射性同位素也可以用于治疗中。

根据本发明，毒素或放射性元素与至少一个抗体或其功能片段缀合被理解为是指可以将所述毒素或所述放射性元素结合至所述至少一个抗体上的任何方式，特别通过两个化合物之间的共价结合（引入连接分子或不引入连接分子）。

在允许化学（共价）、静电或非共价连接所有或一些缀合元素的试剂中，非常特别，可以提及的是苯醌、碳化二亚胺和更特别可以提及的是EDC（1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]-碳化二亚胺盐酸化物）、二马来酰亚胺（dimaleimide）、二硫代双硝基苯甲酸（DTNB）、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸盐（SATA）、具有一个或多个基团，带有一个或多个与紫外（UV）反应的叠氮苯基基团的被称为“桥连”剂的试剂和非常优选地N-[-4-(叠氮水杨酰基氨基)丁基]-3’-(2’-吡啶基二硫代)丙酰胺（APDP）、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸盐（SPDP）和6-肼基-尼克酰胺（HYNIC）。

另一种形式的结合，对放射性元素而言非常特别，可以由使用双功能离子螯合剂组成。

在这些螯合剂中可以提及的是源自EDTA（乙二铵四乙酸）或DTPA（二乙烯三胺五乙酸）的螯合剂，其已经被开发用于结合金属特别是放射性金属和免疫球蛋白。因此，DTPA和其衍生物可以被碳链上的不同基团置换从而增加配体-金属复合物的稳定性和刚性（Krejcarek等人(1977)；Brechbiel等人(1991)；Gansow(1991)；美国专利4,831,175）。

例如，DTPA（二乙烯三胺五乙酸）及其衍生物（其已经长时间非常广泛地以其游离形式或是与金属离子结合的复合物形式用于医药和生物中）具有与金属离子形成稳定的螯合物和结合至治疗或诊断目的的蛋白质上的显著的特征，如用于形成癌症治疗中的放射免疫缀合物的抗体（Meases等人(1984)；Gansow等人(1990)）。

还优选，所述至少一个形成根据本发明的所述缀合物的抗体选自其功能性片段，特别是缺少Fc成分的片段如scFv片段。

另外本发明包括用于预防或治疗癌症的根据本发明的抗体或组合物、或其在用于预防或治疗癌症，优选治疗癌症，中的用途。

以相同的方式，本发明包括根据本发明的抗体或组合物在制备意图用于预防或治疗癌症的药物中的用途。

本发明还涉及抗体或一个其衍生的化合物或功能片段（优选人源化的片段）和/或根据本发明的组合物在制备或用作意图用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的用途。以常规方式，本发明涉及抗体或一个其衍生的化合物或功能片段（优选人源化的片段）和/或根据本发明的组合物在制备意图用于预防或治疗癌症的药物中的用途。

在可以预防和/或治疗的癌症中，优选的是前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、多发性骨髓瘤或卵巢癌、胰腺癌或任何其它癌症。

优选地，所述癌症是选自前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌和/或胰腺癌的癌症。

根据另一个方面，本发明涉及根据本发明的抗体在用于与CD151表达水平相关疾病的诊断方法（优选地在体外）中的用途。更特别地，本发明涉及用于具有CD151蛋白过度表达或低表达的疾病的体外诊断方法，其从疑似有CD151蛋白异常存在的生物样品中开始，所述方法由下列组成：使所述生物样品与根据本发明的抗体接触，对于所述抗体，适当时，可能是被标记的。

优选地，在所述诊断方法中与CD151蛋白相关的所述疾病将是癌症。

所述抗体或一个其功能片段可以是免疫缀合物或经标记的抗体的形式从而获得可检测的和/或可定量的信号。

根据本发明标记的抗体或其功能片段包括，例如，被称为免疫缀合物的抗体（其可以与，例如，酶或分子缀合，其中酶比如过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰-胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖-6磷酸脱氢酶，其中分子比如生物素、地高辛或5-溴-脱氧尿苷）。荧光标记还可以与根据本发明的抗体或其功能片段缀合并且特别包括荧光素及其衍生物、荧光染料、罗丹明及其衍生物、GFP（绿色荧光蛋白）、丹酰（dansyl）、伞形酮等。在这样的缀合物中，本发明的抗体或其功能片段可以用本领域技术人员已知的方法制备。它们可以直接结合至酶或荧光标记上，或通过间隔基团或连接基团如聚醛，例如戊二醛、乙二胺四乙酸（EDTA）或二乙烯三胺五乙酸（DPTA）的方式结合，或在结合剂如那些此前提及的治疗性缀合物存在下结合。含有荧光素-型标记的缀合物可以通过与异硫氰酸盐/酯的反应来制备。

其它缀合物还可以包括化学发光标记如鲁米诺和二氧丁烷（dioxetane）、生物发光标记如荧光素酶和虫荧光素，或还有放射性标记如碘¹²³、碘¹²⁵、碘¹²⁶、碘¹³³、溴⁷⁷、锝^99m、铟¹¹¹、铟^113m、镓⁶⁷、镓⁶⁸、钌⁹⁵、钌⁹⁷、钌¹⁰³、钌¹⁰⁵、汞¹⁰⁷、汞²⁰³、铼^99m、铼¹⁰¹、铼¹⁰⁵、钪⁴⁷、碲^121m、碲^122m、碲^125m、铥¹⁶⁵、铥¹⁶⁷、铥¹⁶⁸、氟¹⁸、钇¹⁹⁹、碘¹³¹。本领域技术人员已知的存在用于将放射性同位素结合至抗体（直接结合或通过螯合剂如此前提及的EDTA或DTPA结合）的方法，可以用于诊断中的放射性元素。因此还可以提及的是其通过氯胺T技术用[I¹²⁵]Na标记（Hunter W.M.和Greenwood F.C.(1962)Nature 194:495）或还可以通过Crockford等人的技术用锝^99m标记（US专利4 424 200）或如Hnatowich所述通过DTPA固定而用锝^99m标记（US专利4 479 930）。

本发明还涉及根据本发明的抗体在制备意图用于特异性靶向表达或过度表达CD151蛋白的细胞中的生物活性化合物的药物中的用途。

生物活性化合物此处被理解为是指能够改变（特别是抑制）细胞活性，特别是其生长、其增殖或基因转录或翻译，的任何化合物。

本发明还涉及体内诊断试剂，所述试剂含有根据本发明的抗体或一个其功能片段，所述抗体或片段优选是经标记的，特别是经放射性标记的，及其在医疗成像中特别是在与通过细胞表达或过度表达CD151蛋白相关的癌症检测中的用途。

本发明还涉及组合产物形式的组合物或作为药物的根据本发明的抗-CD151/毒素或放射性元素的缀合物。

优选地，向组合产物形式的所述组合物或向所述的根据本发明的缀合物中将加入赋形剂和/或可药用载体。

在本说明书中，可药用载体被理解为是指包括在药物组合物中的化合物或化合物的组合，其不产生继发反应（secondary reaction）并且可以例如有助于活性化合物的施用从而增加其在身体内的寿命或效力、增加其在溶液中的可溶性或改善其保存。这样的可药用载体是熟知的，并且可以由本领域技术人员根据所选活性化合物的性质和施用方式为函数进行调整。

优选地，那些化合物将通过全身途径特别是静脉内途径，通过肌肉内、皮内、腹膜内或皮下途径，或通过口服途径施用。更优选地，含有根据本发明的抗体的组合物将在时间交错的多个时期施用。

其最佳的施用模式、剂量方案和盖伦形式可以根据原则确定，所述原则通常在为患者确立合适的治疗中考虑，比如，例如患者的年龄或体重、他或她的整体情况的严重程度、治疗的耐受性以及建立的继发效应（secondary effect）。

因此本发明涉及抗体或一个其功能片段在制备意图用于特异性靶向表达或过度表达CD151的细胞中的生物活性化合物的药物中的用途。

本发明的其它特征和优点将出现在有实施例和附图的说明书其余部分中，附图的图例在下文中给出。

附图说明

图1显示CD151蛋白的核苷酸和蛋白质序列（分别是SEQ ID No.37和SEQ IDNo.38），在其序列上显示了EC1和EC2环。

图2是说明四次跨膜蛋白结构的图，CD151蛋白属于所述的四次跨膜蛋白，并且非常特别的是两个胞外环EC1和EC2。

图3A-3E说明CD151分子在患有前列腺癌的患者中的表达。各字母对应着一个患者的研究，且对于各患者，上部图板对应着邻近肿瘤的正常组织而下部图板对应着肿瘤组织。

图4A-4C说明CD151分子在患有肺癌的患者中的表达。各字母对应着一个患者的研究，且对于各患者，上部图板对应着邻近肿瘤的正常组织而下部图板对应着肿瘤组织。

图5A-5D显示通过流式细胞术，通过鼠抗体203B6在NIH 3T3-CD151、PC3和A549细胞表面上识别CD151的分析。

图6A-6D显示通过流式细胞术，通过鼠抗体214B2在NIH 3T3-CD151、PC3和A549细胞表面上识别CD151的分析。

图7代表小鼠214B2的V-和J-区与最接近的小鼠种系基因之间针对重链和轻链的比对。

图8说明具有不同优先等级的214B2轻链的人源化：#1是高度优先（推测对靶识别、CDR描述和整个3D结构有高度影响）；#2是中度优先；以及#3是低度优先（推测对靶识别、CDR描述和整个3D结构有低度影响）。

图9说明具有不同优先等级的214B2重链的人源化：#1是高度优先（推测对靶识别、CDR描述和整个3D结构有高度影响）；#2是中度优先；以及#3是低度优先（推测对靶识别、CDR描述和整个3D结构有低度影响）。

图10说明通过蛋白质印迹（western blot）的嵌合抗体c203B6[IgG1]和c214B2[IgG1]的特异性研究。

图11A-11B说明通过其各自的嵌合形式：c203B6[IgG1]（A）；c214B2[IgG1]（B），鼠单抗203B6和214B2对重组EC2的结合的抑制。

图12A-12B：用A：c214B2[IgG1]和B：c203B6[IgG1]，嵌合抗体至PC3细胞的结合。

图13说明c214B2[IgG1]单抗对PC3（一种雄激素-非依赖性前列腺细胞系）的肿瘤生长的体内活性。

图14是单抗214B2的不同形式对PC3细胞粘附的作用的显微分析。

图15A-15B说明使用ATP分析，单抗214B2的不同形式对PC3细胞粘附的作用的分析。用PC3标准曲线确定各孔中粘附的细胞的数目，从0至200 000细胞/孔。结果显示如下：未处理的细胞用作参考（100%）而处理的细胞显示为参考的%。

图16说明214B2重链可变结构域与人种系hIGHV1-2*02和IGHJ6*01的氨基酸序列比对。214B2 VH氨基酸序列和所选人受体（acceptor）框架序列比对，对214B2和人种系之间不同的各残基给出优先等级。残基根据其优先等级进行回复突变，其中1编码最高的优先，而4最低。Var1至Var4序列对应着214B2 VH结构域的实施的人源化变体，回复突变的残基以粗体表示。变体1（Var1）不携带回复突变并代表最人（化）的变体。

图17说明214B2轻链与人种系IGKV1D-39*01和IGKJ2*01的氨基酸序列比对。214B2 VL氨基酸序列和所选人受体（acceptor）框架序列比对。VL Var1至Var3序列对应着214B2 VL结构域的实施的人源化变体，回复突变的残基以粗体表示。变体1（Var1）不携带回复突变并代表最人（化）的变体。变体2有13个回复突变，是最鼠（化）的变体。变体3携带5个回复突变。

图18说明通过嵌合241B2和人源化214B2的不同变体，鼠抗体m24B2的交叉阻断。使用重组的人抗原CD151胞外环2（EC2）通过ELISA评价214B2的人源化变体（hz214B2）交叉阻断母源抗体m214B2的活性。人源化变体的活性和嵌合214B2比较。VH变体2和3的所有组合显示出和嵌合抗体的活性相似的强活性。

图19说明通过交叉阻断生物素化抗体m24B2，人源化抗体hz214B2的流式细胞术分析。在EC2 ELISA中交叉阻断母源抗体的214B2的人源化变体进一步在流式细胞术中进行评价。生物素化抗体m214B2用于检测PC3细胞上的人CD151。用不同浓度的214B2的人源化变体阻断这种结合。嵌合214B2抗体用作参考。人源化变体3和4（Hz214B2VHVar3VLVar3和Hz214B2VHVar4VLVar4）显示最强的交叉阻断活性（B）。

图20说明抗体c214B2（G1）、c214B2（G2）、Hz214B2VHVar3VLVar3（G1）和Hz214B2VHVar4VLVar4（G1）的亲和性的BIACore分析。A，Hz214B2VHVar3VLVar3（G1）、Hz214B2VHVar4VLVar4（G1）和c214B2（G1）抗体的BIACore传感图。B，抗体-EC2复合物的亲和性常数和半衰期。

图21说明嵌合c214B2单抗的各种同种型对PC3异种移植物模型的体内活性，其中A：c214B2[IgG4]和[IgG1]（TH7）以及B：c214B2[IgG2]。

具体实施方式

实施例1：CD151分子表达的研究

通过免疫组织化学（IHC），在获自患有前列腺癌或肺癌的患者的人组织样品中研究CD151蛋白的表达。对于这些患者，与肿瘤相邻的正常组织的玻片是可以获得的，因此被包括进去从而校正肿瘤组织相对于正常组织中的表达水平。

对于这些实验，使用了商业上可以获得的“组织矩阵”型玻片。去石蜡化后，在含有胃蛋白酶（Labvision ref.AP-9007-005）的酶溶液的帮助下在30°C进行抗原的暴露。这一步骤后是通过将切片在0.3%的过氧化氢（Sigma）水溶液中孵育而去除内源性过氧化物酶的步骤。然后用Ultra-V-Block（Labvision，ref.TA-125-UB）溶液进行非特异性位点的饱和，并使用商业上可以获得的鼠抗-CD151抗体（Serotech，Ref.MCA 1856）（以5μg/ml的终浓度使用）进行标记。鼠IgG1同种型对照抗体（DakoCytomation，Ref.X0931）被用作阴性实验对照。使用Envision DualLink visualisation系统（DakoCytomation，Ref.K4061）进行标记显影，DAB过氧化物酶底物的参考是来自DakoCytomation的S3309。

显现在图3A-3E中的结果表明许多发生前列腺肿瘤的患者显示出CD151分子的过表达。这一过表达对于被研究患者中的20%可以是非常显著的（患者A和C）或是中度的（患者A和D）。需要注意的是除了内皮细胞的水平，对应的正常前列腺组织不表达CD151或只表达很少，且其表达时，似乎限于腺体型结构。患者E展现不表达CD151的肿瘤的实例。

在肺癌的情况下（图4A-4C），在正常肺组织的某些细胞中观察到中度的（患者A）至显著的（患者B）的表达。但是，肿瘤组织显示出非常高密度的强标记的细胞（患者A和B）。患者C展现不表达CD151的肿瘤的实例。

实施例2：抗体的产生和选择

使用在其表面上表达人CD151的20×10⁶ NIH 3T3细胞通过皮下途径免疫BALB/c小鼠，那些细胞已经通过用CD151基因转染产生。第一次免疫在弗氏完全佐剂存在时进行，接下来2次在弗氏不完全佐剂存在时进行。在融合前三天，通过腹膜内途径进行10×10⁶ NIH 3T3-CD151细胞的最后加强注射。然后使用K

hler和Milstein所述的常规技术以1/1的比例将小鼠脾细胞与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合。

然后通过ELISA筛选从融合产生的杂交瘤分泌到上清中的抗体识别CD151重组胞外环EC2的能力，以及通过流式细胞术筛选上述抗体识别人PC3前列腺癌肿瘤系表面上表达的CD151的能力。

对于ELISA，用PBS中5μg/ml的重组胞外环EC2在+4°C将96-孔板敏感化1夜。用PBS洗涤后，在37°C用PBS中的0.5%的明胶溶液将孔饱和1小时，然后再用PBS洗涤。无需稀释评价杂交瘤培养物上清（在37°C孵育1小时）。固定至固定化的EC2环的抗体通过相继用过氧化物酶-缀合的羊抗-鼠IgG多克隆抗体（Jackson/USA，稀释至1/5000，37°C 1小时）然后用过氧化物酶底物（TMB，Interchim/France，环境温度下10分钟）孵育进行检测。反应通过加入1M的硫酸停止并在450nm测定光密度（OD）。

流式细胞术分析在96-孔板中进行。将未经稀释的杂交瘤上清加入至事先引入孔中的100000个PC3细胞中。在+4°C孵育20分钟接着洗涤之后，加入Alexa488-标记的羊抗-鼠IgG多克隆抗体（Molecular Probes，稀释至1/500）。在+4°C进一步孵育20分钟后，通过细胞荧光计的帮助测定荧光强度（MFI）。

在该筛选的结尾，选择了下列2个杂交瘤（选择原则：对于ELISA，OD>0.5以及对于流式细胞术，MFI>50）：203B6和214B2。该2个杂交瘤获得的结果显示在下面的表6中：

表6

克隆后，扩增各所选杂交瘤中的一个克隆。使用鼠抗体同种型试剂盒（SBAclonotyping system，Southern Biotech）确定各培养物上清中产生的抗体的同种型，然后最终的鉴定，在之前所述的条件下，通过ELISA（胞外环EC2）和通过流式细胞术，在鼠系NIH 3T3和稳定转染子NIH 3T3-CD151上，然后在人肺癌肿瘤系A549、前列腺癌肿瘤系DU145和胰腺癌肿瘤系BxPC3上进行。对于ELISA，上清的抗体浓度调整至5μg/ml，并且对于流式细胞术上清的抗体浓度调整至10μg/ml。获得的结果显示在下面的表7中：

表7

图5A-5D和6A-6D显示了通过流式细胞术的NIH 3T3-CD151、PC3和A549细胞的识别谱，所述谱是对于鼠抗体203B6和214B2获得的。这些谱与用抗-CD151抗体50-6（ATCC CRL-2696）获得的谱是相当的，并且证明了这些抗体对于CD151的特异性。

然后将所述杂交瘤保藏在CNCM，国家微生物培养物保藏中心，巴斯德研究所，25 Rue du Docteur Roux，75724 PARIS Cedex 15。

实施例3：克隆并生产嵌合和人源化抗体

设计嵌合和人源化形式的鼠203B6和214B2单抗：它们对应着相关鼠抗体的轻和重链可变结构域，遗传融合至人Ckappa和IgG1、IgG2和IgG4之一的恒定结构域。相似地，下述人源化形式以人IgG1/kappa或IgG4/kappa分子生产。通过使用HEK293/EBNA系统，用pCEP4表达载体（InVitrogen，US）瞬时转染来生产所有重组单抗。

通过全基因合成（Genecust，Luxembourg）合成对应着203B6和214B2单抗轻和重链的可变结构域（嵌合或人源化的）的整个核苷酸序列。将它们亚克隆至携带有人IgG1、人IgG2或人IgG4免疫球蛋白轻[Ckappa]或重[CH1-铰链-CH2-CH3]链恒定结构域的整个编码序列的pCEP4载体（InVitrogen，US）。根据如实验手册（Sambrook和Russel，2001）中所述的常规分子生物学技术或根据供应商的说明书进行所有克隆步骤。使用Big Dye terminator cycle测序试剂盒（Applied Biosystems，US）通过核苷酸测序对各遗传构建物进行全部验证，并使用3100遗传分析仪（Applied Biosystems，US）进行分析。

适于悬浮的HEK293 EBNA细胞（InVitrogen，US）在轨道摇床上（110rpm转速），在250ml烧瓶中，在补充有6mM谷氨酰胺的50ml无血清培养基Excell 293（SAFC Biosciences）中，进行例行生长。使用水中制备的终浓度为1mg/ml混合的的线性25kDa聚乙烯亚胺（PEI）（Polysciences）和质粒DNA（对于比例为1:1的重链质粒对轻链质粒，终浓度为1.25μg/ml）用2.10⁶细胞/ml进行瞬时转染。转染后4小时的时候，用一体积新鲜培养基稀释培养物获得10⁶细胞/ml的终细胞密度。基于细胞活力和单抗生产监测培养过程。通常，培养物维持4至5天。使用常规色谱方法在Protein A树脂（GE Healthcare，US）上纯化单抗。

在适合功能评价的水平上生产所有不同单抗。

实施例4：鼠抗-CD151抗体214B2可变结构域的人源化

通过使用IMGT文库和工具（http://imgt.cines.fr）对来自鼠214B2抗体的重链和轻链可变结构域VH和VL进行免疫遗传分析。下述人源化策略基于独特的IMGT编号方案（Lefranc，1997）。首先，通过使用DomainGapAlign工具，通过对IMGT LIGMDB数据库进行BLAST搜索，确定各结构域的所选鼠种系。与重排的214B2 V-区和IGKJ2*01产生97.9%一致性的鼠IGKV6-20*01种系与214B2J-区完全一致（图7）。对于重链，214B2 V-区与鼠IGHVS 130*01种系最同源（约96%一致性，图7），以及对于J-区，鼠IGHJ4*01对应着最接近的J种系基因（94%一致性，一个趋异性残基，图7）。多样性D-种系基因对应着鼠IGHD5-1*01，其实质上对应着CDR3。

作为鼠214B2单抗人源化的实例，通过CDR-嫁接的常规策略如下述。各重链和轻链单独被人源化，并用其各自的嵌合或人源化对应物（counterpart）通过共表达进行评价。

-214B2轻链VL的人源化

确定了对应着Asn1的非典型残基，其存在于一些鼠种系V-基因中，但从不在人中存在。由于其位于接近CDR1，如在所选人V-基因中发现的其变为Glu的改造可能是要警惕的并且必须进行评价（图8）。否则，寻找最适合用于嫁接鼠214B2轻链CDRs的人种系确定了两个潜在命中。第一个对应着显示出与鼠IGKV6-20*01最接近的同源性程度的人V-区，其是人IGKV3-7*02种系等位基因（68.4%一致性）。无论如何，其CDR1比214B2的CDR1长一个氨基酸，因此这些CDR锚最终不最适合CDR1嫁接（见图8）。第二个人供体种系可以是IGKV1D-39*01；其与鼠IGKV6-20*01是64%一致的，但是CDR长度一致（6:3，图8）。评价214B2 VL和所选人V-基因之间各趋异性残基的假定重要性的原则包括但不限于：位于游标区中、位置接近CDR锚、出现在相同人种系群的另一个等位基因中相同的位置。

对于IGKV6-20*01 V-基因，游标区中的一个残基与m214B2和mIGKV6-20*02相比是不同的（A84），在第一个实例中其必须高度优先考虑，并且作为鼠是保守的（#1，图8）。否则，两个重要残基对应着CDR1和CDR2的锚V39和N66，在第一个实例中它们也排为高度优先等级，并且作为鼠是保守的。三个残基排为中度优先残基进行考虑，由于它们的位置接近CDR锚（K24、Y68和H103，图8）。其余的氨基酸（排为#3等级）似乎对人源化重链的整个构象和CD151识别有弱的影响，它们可以轻易被其人对应物置换。

对于IGKV1D-39*01 V-基因，游标区中的一个残基与m214B2和mIGKV6-20*02相比是不同的（A84），在第一个实例中其必须高度优先考虑，并且作为鼠是保守的（#1，图8）。否则，两个重要残基对应着CDR1和CDR2的锚V39和N66，在第一个实例中它们也排为高度优先等级，并且作为鼠是保守的。五个残基排为中度优先残基进行考虑，由于它们的位置接近CDR锚（K24、S40、Y68和H103；图8）或接近CDR1（V3，图8）。其余的氨基酸（排为#3等级）似乎对人源化重链的整个构象和CD151识别有弱的影响，它们可以轻易被其人对应物置换。

对于J-区，人IGKJ2*01基因含有一个与m214B2和mIGKJ2*01相比的趋异性残基（G）。由于该区实质上对应着FR4，在第一个实例中其将被全部人源化（图8）。

IMGT-CDR3序列（GQTYSFPYT）本身将被嫁接而没有序列改造。

-214B2重链的人源化

寻找最适合用于嫁接鼠214B2重链CDRs的人种系确定了对应着人IGHV1-2*02 V-基因等位基因的一个优选命中。其与鼠IGHVS130*01种系基因是66%一致的，CDR长度一致。214B2_VH和IGHV1-2*02之间在其FR中有28个位置趋异（图9）。紧密相关的人IGHV1-46*03种系可能也是合适的，其产生相同量的趋异性残基，相似地28个中的18个位于FR3。评价这28个趋异性残基中的各趋异性残基的假定重要性的原则包括但不限于：位于游标区中、位置接近CDR锚、出现在相同人种系群的另一个等位基因中相同的位置。

对于IGHV1-2*02 V-基因，游标区中的5个残基与m214B2和mIGHVS130*01相比是不同的（I53、E55、A76、L78、V80），在第一个实例中其必须高度优先考虑，并且作为鼠是保守的（#1，图9）。否则，N68和E69排为中度优先残基进行考虑，由于它们的位置接近CDR2锚（图9）。其余的21个氨基酸似乎对人源化重链的整个构象和CD151识别有弱的影响，它们可以轻易被其人对应物置换。

对于IGHV1-46*03 V-基因，游标区中的7个残基与m214B2和mIGHVS130*01相比是不同的（I53、E55、N66、A76、L78、V80、A87），在第一个实例中其必须高度优先考虑，并且作为鼠是保守的（#1，图9）。否则，N68和E69排为中度优先残基进行考虑，由于它们的位置接近CDR2锚（图9）。其余的19个氨基酸似乎对人源化重链的整个构象和CD151识别有弱的影响，它们可以轻易被其人对应物置换。

对于J-区，人IGHJ6*01基因含有3个与m214B2和mIGHJ4*01相比的趋异性残基。由于该区实质上对应着FR4，在第一个实例中其将被全部人源化（图9）。

实质上对应着CDR3的序列的多样性D-基因（ARARSFYYAMDC）本身将被嫁接而没有序列改造。

所有上述氨基酸是要考虑的重要位置。在人源化方法期间，对于各个这些位置将考虑人相对于小鼠残基的所有组合。人源化形式的选择将基于其人化的程度以及保守的功能性体外和体内性质。

实施例5：通过蛋白质印迹的抗体特异性

首先通过蛋白质印迹评价嵌合抗体c214B2[IgG1]和c203B6[IgG1]的特异性。简要而言，纯化的重组大胞外环EC2（2-8μg）和HT-29细胞裂解物（10-50μg）加载至12%丙烯酰胺凝胶（BioRad）。电泳后在非还原条件下，蛋白质转移至硝酸纤维膜，其进一步用纯化的嵌合抗体c214B2[IgG1]和c203B6[IgG1]在0.5μg/ml下进行孵育，然后用过氧化物酶-缀合的兔多克隆抗-人Ig（GE Healthcare）孵育。通过化学发光检测蛋白质。通过蛋白质印迹，c214B2[IgG1]和c203B6[IgG1]均能够识别全长CD151（图10）。此外，它们还显示出对于大胞外环是特异性的，如通过其对重组EC2环的反应性所评价的（图10）。

实施例6：通过ELISA的竞争实验

通过ELISA进一步进行交叉-竞争实验来评价嵌合抗体c214B2[IgG1]和c203B6[IgG1]抑制其相应的鼠形式对重组EC2环结合的能力。简要而言，在4°C用PBS中5μg/ml重组EC2过夜包被96-孔ELISA板。存在或不存在提高浓度的其相应的嵌合抗体形式（范围从0.01至20μg/ml），鼠单抗203B6和214B2在80ng/ml时在37°C下进一步孵育1小时。对于对照实验，不加鼠抗体。在PBS中以1/5000稀释加入辣根过氧化物酶-缀合的多克隆羊抗-鼠IgG，并37°C孵育1小时。用过氧化物酶底物TMB在室温孵育10分钟后，用1M硫酸停止反应并在450nm测定光密度。图11A-11B显示嵌合抗体c214B2[IgG1]和c203B6[IgG1]能够分别替换其214B2和203B6的鼠形式。通过使用GraphPad Prism软件计算的IC₅₀值，对于c214B2[IgG1]和c203B6[IgG1]分别为0.69μg/ml和0.71μg/ml。

实施例7：嵌合抗体对前列腺癌细胞的结合

通过流式细胞术评估嵌合抗体c203B6[IgG1]和c214B2[IgG1]对前列腺癌细胞PC3的结合。简要而言，在4°C下，在含有1%BSA和0.01%叠氮钠的PBS缓冲液中，存在各种浓度的c203B6[IgG1]或c214B2[IgG1]时，以1.10⁵细胞/100μl孵育20分钟PC3细胞。细胞进一步洗涤，并用Alexa488-缀合的羊抗-人抗体（Molecular Probes，在PBS中以1/500稀释）在4°C孵育20分钟。在用Facscalibur血细胞计数器（BectonDickinson）分析之前，标记的细胞经洗涤、离心并重悬于之前的缓冲液（150μl）中。加入碘化丙碇仅对活细胞进行分析。嵌合抗体c203B6[IgG1]和c214B2[IgG1]对表达于PC3细胞表面的CD151的结合根据抗体浓度的函数而增加（图12A-12B）。对于c214B2[IgG1]和c203B6[IgG1]，分别在2.5μg/ml和5μg/ml时达到平台，表明这些抗体对PC3细胞的结合是高度特异性的。

实施例8：嵌合抗体c214B2]IgG1]抗前列腺PC3异种移植模型上的CD151的抗肿瘤活性

之前已经使用组织矩阵分析在前列腺组织上显示出CD151的过度-表达。为了确定前列腺癌细胞是否将响应靶向-CD151的治疗，在PC3异种移植模型中体内测试了针对CD151的嵌合c214B2[IgG1]。PC3细胞系是ATCC提供的雄激素-非依赖性细胞系并生长于补充有10% FCS的F12K培养基中。五百万个PC3细胞s.c.植入至6周龄雄性瑞士小鼠。植入5天后，测量肿瘤，在用c214B2[IgG1]嵌合抗体开始i.p.注射之前，小鼠随机分成两个6只小鼠的组。作为负荷剂量注射2mg/剂量的c214B2，然后以1mg/剂量进行每周两次的注射。每周两次评价并用下式计算肿瘤体积：π/6×长度×宽度×高度。图13中所示的结果证明c214B2[IgG1]（图中作c214B2）体内显著抑制PC3细胞的肿瘤生长。此结果显示靶向CD151能够高效治疗癌症。

实施例9：TH7铰链突变体的工程化

技术人员知道，铰链区强烈参与免疫球蛋白的可变结构域的柔性（见Brekke等人，1995；Roux等人，1997）。214B2单抗的嵌合过程期间，小鼠恒定结构域IGHG1被等价的人来源的IGHG1部分替换。由于对应的铰链区的氨基酸序列高度趋异性，人IgG1铰链区经工程化加入一个Cys残基并使其长度缩短两个氨基酸以便类似于鼠IgG1铰链。

如下显示鼠和人野生型IgG1铰链区以及改造的HT7铰链区的比较（根据对C结构域的IMGT独特编号）：

小鼠IgG1铰链区 PRDCGCKP-CI-CT（SEQ ID No.43）

人IgG1铰链区 PKSCDKTHTCPPCP（SEQ ID No.42）

工程改造的TH7铰链区 PKSCDC-H-CPPCP(SEQ ID No.41）

（下划线是进入人IgG1铰链区的三个改造）

实施例10：生产嵌合214B2单抗和工程化的铰链单抗形式

通过使用HEK293/EBNA系统，用pCEP4表达载体（InVitrogen，US）瞬时转染来生产含有嵌合或工程化的铰链区的所有单抗形式。

通过全基因合成（Geneart，德国）合成对应着鼠-源可变结构域214B2 VH和VL的整个核苷酸序列。将它们亚克隆至携带有人IgG1免疫球蛋白恒定结构域[CH1-铰链-CH2-CH3]的整个编码序列的pCEP4载体（InVitrogen，US）。通过用携带有所需改造的等价部分交换{Nhe1I-Bcl1}限制性片段进行铰链区的改造，通过全基因合成（Geneart，GE）分别合成各{Nhe1-Bcl1}片段。根据如实验手册（Sambrook和Russel，2001）中所述的常规分子生物学技术或根据供应商的说明书进行所有克隆步骤。使用Big Dye terminator cycle测序试剂盒（Applied Biosystems，US）通过核苷酸测序对各遗传构建物进行全部验证，并使用3100遗传分析仪（AppliedBiosystems，US）进行分析。

适于悬浮的HEK293 EBNA细胞（InVitrogen，US）在轨道摇床上（110rpm转速），在250ml烧瓶中，在补充有6mM谷氨酰胺的50ml无血清培养基Excell 293（SAFC Biosciences）中，进行常规生长。使用水中制备的终浓度为1mg/ml混合的的线性25kDa聚乙烯亚胺（PEI）（Polysciences）和质粒DNA（对于比例为1:1的重链质粒对轻链质粒，终浓度为1.25μg/ml）用2.10⁶细胞/ml进行瞬时转染。转染后4小时的时候，用一体积新鲜培养基稀释培养物获得10⁶细胞/ml的终细胞密度。基于细胞活力和单抗生产监测培养过程。通常，培养物维持4至5天。使用常规色谱方法在Protein A树脂（GE Healthcare，US）上纯化单抗。

在适合功能评价的水平上生产c214B2[TH7]IgG1单抗。生产水平通常为15至30mg/l之间的纯化单抗。

实施例11：细胞粘附分析

-第一个分析

用胰蛋白酶使PC3前列腺癌细胞从皿上脱离，用无血清F12k培养基洗涤3次并重悬于相同的培养基中。以1μg/ml，将细胞（100.000细胞/孔）置于包被有层粘连蛋白1的96-孔板。以10μg/ml的终浓度同时加入待测试的抗-CD151单抗的如下形式：鼠IgG1单抗m214B2、未改造的嵌合IgG1抗体形式称为c214B2以及带有TH7改造的嵌合IgG1抗体形式称为cTH7-214B2。鼠和人IgG1抗体用作同种型对照抗体。终条件如下：100.000细胞/孔和10μg/ml抗体。在37°C孵育1小时，弹去板，并用无血清F12k培养基洗涤两次。分析前，100μl无血清F12k培养基分至各孔。为了评价抗体对细胞粘附的作用，在相衬显微镜下拍摄孔（图14）。然后使用ATP分析确定粘附的细胞的数目（图15A）。

鼠214B2和嵌合TH7-214B2抗体能够改变细胞-细胞的相互作用（图14）并能够等价地增加PC3细胞粘附（图15A），而214B2未改造的嵌合形式（c214B2）没有观察到作用，其和人IgG1同种型对照抗体是相当的。

- 第二个分析

用胰蛋白酶使PC3前列腺癌细胞从皿上脱离，用无血清F12k培养基洗涤3次并重悬于相同的培养基中。以1μg/ml，将细胞（100000细胞/孔）置于包被有层粘连蛋白1的96-孔板。同时，以0.4μg/ml的终浓度同时加入待测试的抗-CD151单抗的如下形式：鼠IgG1单抗m214B2以及嵌合IgG1-TH7、IgG4-TH7和IgG2抗体形式。在37°C孵育1小时，弹去板，并用无血清F12k培养基洗涤两次。分析前，100μl无血清F12k培养基分至各孔。为了评价不同抗体对细胞粘附的作用，使用ATP分析确定粘附的细胞的数目。

214B2的不同嵌合形式能够改变细胞-细胞的相互作用并增加PC3细胞粘附（图15B）。嵌合形式c214B2[IgG1-TH7]、c214B2[IgG4-TH7]和c214B2[IgG2]诱导的作用与鼠形式m214B2诱导的作用是相当的。与未处理的细胞和用不同对照抗体hIgG1、hIgG2和hIgG4处理的细胞相比，这些嵌合抗体诱导PC3细胞粘附增加了约40%。

实施例12：214B2单抗的人源化

- 一般过程

通过采用CDR-嫁接的整体规则进行214B2抗-CD151抗体的人源化。通过采用IMGT独特编号方案以及IMGT文库和工具进行CDR和框架（FR）区的免疫遗传分析和界定（Lefranc，1997-www.imgt.org）。

通过用人源化抗体交叉阻断母源抗体来评价人源化变体对母源抗体表位的亲和性。母源抗体浓度保持恒定并且人源化抗体系列稀释。嵌合抗体在这些实验中用作阳性对照和作为参考。通过其在ELISA和流式细胞术分析中的亲和性评价人源化抗体。在基于ELISA的分析中，重组表达并通过六个组氨酸标签纯化人CD151的第二胞外结构域（EC2）。纯化的EC2蛋白质用于包被的ELISA板，并且用HRP缀合的抗-鼠IgG抗体通过检测鼠的母源抗体来间接测量人源化抗-CD151抗体的结合。使用人前列腺癌细胞系PC3通过流式细胞术评价人源化抗-CD151抗体至CD151的结合。通过交叉阻断生物素化的母源鼠抗-CD151抗体来确定亲和性。使用荧光素缀合的链霉亲和素检测生物素化抗体。通过BIACore分析测量亲和常数（Kd）。

这些分析用于确定重组人源化版本的抗-CD151抗体的特征。用人IgG1/k恒定结构域结构化（format）可变结构域，且所述可变结构域克隆至哺乳动物表达载体pCEP。重组IgG₁/kappa-衍生抗体瞬时表达于HEK293细胞中。过滤表达培养物上清，用蛋白质A琼脂糖纯化抗体。纯化的抗体重新缓冲于PBS中，通过ELISA确定抗体浓度。

-214B2重链的人源化

寻找最适合用于嫁接鼠214B2重链CDRs的人种系确定了对应着人IGHV1-2*02 V-基因等位基因的一个优选命中。其与鼠IGHVS130*01种系基因是66%一致的，CDR长度一致。214B2_VH和IGHV1-2*02之间在其框架中有28个位置趋异。评价这28个趋异性残基中的各趋异性残基的假定重要性的原则包括但不限于：位于游标区中、位置接近CDR锚、出现在相同人种系群的另一个等位基因中相同的位置。

对于IGHV1-2*02V-基因，游标区中的5个残基与m214B2和mIGHVS130*01相比是不同的（I53、E55、A76、L78、V80），在第一个实例中它们高度优先考虑，并且作为鼠是保守的（图16）。否则，N67也排为高度优先残基进行考虑，由于其位置接近CDR2锚。

对于J-区，人IGHJ6*01基因含有3个与m214B2和mIGHJ4*01相比的趋异性残基。由于该区实质上对应着FR4，在第一个实例中其将被全部人源化。没有改造地嫁接实质上对应着CDR3的序列的多样性D-基因（ARARSFYYAMDC）。

-214B2轻链VL的人源化

寻找最适合用于嫁接鼠214B2轻链CDR的人种系确定了两个潜在命中。

确定了对应着Asn1的非典型残基，其存在于一些鼠种系V-基因中，但从不在人中存在。由于其位于接近CDR1，如在所选人V-基因中发现的其变为Glu的改造可能是要警惕的并且必须进行评价。

第一个对应着显示出与人IGKV3D-7*01种系等位基因最接近的同源性程度的人V-区。无论如何，其CDR1比214B2的CDR1长一个氨基酸，因此所述CDR最终不最适合CDR嫁接。因此选择人种系IGKV1D-39*01；其和鼠种系等位基因IGKV6-20*01是64%一致的，且CDR长度一致。评价214B2 VL和所选人V-基因之间趋异性残基的各趋异性残基的假定重要性的原则包括但不限于：位于游标区中、位置接近CDR锚、出现在相同人种系群的另一个等位基因中相同的位置。

对于IGKV1D-39*01V-基因，游标区中的一个残基与m214B2和mIGKV6-20*02相比是不同的（A84），在第一个实例中其必须高度优先考虑，并且作为鼠是保守的。否则，两个重要残基对应着CDR1和CDR2的锚V39和N66；在第一个实例中它们也排为高度优先等级，并且作为鼠是保守的。五个残基排为中度优先残基进行考虑，由于它们的位置接近CDR锚（K24、S40、Y68和H103）或接近CDR1（V3）。其余的氨基酸（排为#3等级）似乎对人源化重链的整个构象和CD151识别有弱的影响，它们可以轻易被其人对应物置换。

对于J-区，人IGKJ2*01基因含有一个与m214B2和mIGKJ2*01相比的趋异性残基（G）。由于该区实质上对应着FR4，在第一个实例中其将被全部人源化。

IMGT-CDR3序列（GQTYSFPYT）本身将被嫁接而没有序列改造。

第一系列的实验中，通过ELISA测试人源化抗体。VH的各变体1、变体2和变体3与VL的三个不同变体组合。和VH变体1的所有构建物不显示和鼠抗体竞争的能力（图17，A）。这是框架中结构性残基对于此抗体识别其抗原是重要的第一个指示。和嵌合抗体相比，VL Var1与VH Var2或VH Var3的组合显示更低的阻断母源抗体的能力。因此不再评价这些变体。包括抗体Hz214B2VHVar4VLVar4的所有其它变体显示和嵌合抗体相似的阻断活性（图18，B、C和D）。

结合至EC2用作结合至整个抗原CD151的模型。通过流式细胞术评价细胞表面上结合至抗原的亲和性。对于抗体Hz214B2VHVar4VLVar4确定最高水平的交叉阻断活性。这些结果说明需要相对大量的回复突变来维持抗体214B2的结合性质。

针对Hz214B2VHVar4VLVar4，计算框架中人残基的百分比：226个残基中其含有22个非-人残基，这等于90.3%的“发展性指数”（germinality index）。

使用人CD151的胞外环2（EC2）通过BIACore分析确定嵌合抗体和两个人源化变体的亲和性（图20）。

实施例13：嵌合c214B2单抗的各种同种型对PC3异种移植模型的体内活性

为了评价214B2 Ab的各种嵌合构建物，用来自雄激素-非依赖性前列腺癌细胞系PC3（ATCC CRL1435）的5.10⁶细胞灌注无胸腺小鼠。灌注5天后，肿瘤达到包括68至108mm3之间的体积（π/6×长度×宽度×高度）并且小鼠随机分到6只动物的组中。i.p.注射待测试的载体或抗体。在D5天，处理的小鼠接受每只小鼠2mg的负荷剂量，在D12天再次注射。每周评价两次肿瘤体积。

图21A和21B中所示的结果证明所有待测试的嵌合形式在PC3异种移植模型中表现出同样显著的体内作用。

Claims

1.嵌合抗体、或衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.7、25或37的序列的轻链，和/或含有包含氨基酸序列SEQ ID No.8、9、26、27、38或44的序列的重链。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗体，其特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.7的序列的轻链，以及含有包含氨基酸序列SEQ ID No.8的序列的重链。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗体，其特征在于其是IgG1。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗体，其特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.7的序列的轻链，以及含有包含氨基酸序列SEQ ID No.9的序列的重链。

5.根据权利要求4所述的嵌合抗体，其特征在于其是IgG4。

6.根据权利要求1所述的嵌合抗体，其特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.25或37的序列的轻链，以及含有包含氨基酸序列SEQ ID No.26或38的序列的重链。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗体，其特征在于其是IgG1。

8.根据权利要求7所述的嵌合抗体，其特征在于其包括包含氨基酸序列SEQID No.41的铰链区。

9.根据权利要求8所述的嵌合抗体，其特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.37的序列的轻链，以及含有包含氨基酸序列SEQ ID No.38的序列的重链。

10.根据权利要求1所述的嵌合抗体，其特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.25的序列的轻链，以及含有包含氨基酸序列SEQ ID No.27的序列的重链。

11.根据权利要求10所述的嵌合抗体，其特征在于其是IgG4。

12.根据权利要求1所述的嵌合抗体，其特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.25的序列的轻链，以及含有包含氨基酸序列SEQ ID No.44的序列的重链。

13.根据权利要求12所述的嵌合抗体，其特征在于其是IgG2。

14.源自如权利要求1所述的嵌合抗体的人源化抗体、或衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.46、47、48或49的序列的轻链可变结构域，和/或含有包含氨基酸序列SEQ ID No.50、51、52或53的序列的重链可变结构域。

15.根据权利要求14所述的人源化抗体、或衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.62、63、64或65的序列的轻链，和/或含有包含氨基酸序列SEQ ID No.66、67、68或69的序列的重链。

16.根据权利要求15所述的人源化抗体，其特征在于其是IgG1。

17.根据权利要求14所述的人源化抗体、或衍生化合物或功能片段，其特征在于其包括含有包含氨基酸序列SEQ ID No.62、63、64或65的序列的轻链，和/或含有包含氨基酸序列SEQ ID No.70、71、72或73的序列的重链。

18.根据权利要求15所述的人源化抗体，其特征在于其是IgG2。

19.分离的核酸，其特征在于其选自如下核酸：

a）编码如权利要求1至18中一项所述的抗体或一个其衍生的化合物或功能片段的DNA或RNA核酸；

b）与a）中定义的核酸互补的核酸；

c）能够与核酸序列SEQ ID No.16-18或34-36、39、40、45或54-61或74-85中的至少一个序列在高度严格条件下杂交的至少18个核苷酸的核酸。

20.包含如权利要求19所述的核酸的载体。

21.包含如权利要求20所述的载体的细胞宿主。

22.包含如权利要求21所述的细胞的除了人类以外的转基因动物。

23.组合物，其包含作为活性成分的由根据权利要求1至18中的一项所述的抗体或一个其衍生化合物或功能片段组成的化合物。

24.根据权利要求23所述的组合物，其特征在于其另外含有作为同时、分开或错时使用的组合产物的抗体、细胞毒剂/细胞生长抑制剂、细胞毒素或放射性元素。

25.根据权利要求23或24中一项所述的组合物作为药物。

26.根据权利要求1至18中一项所述的抗体或一个其衍生化合物或功能片段和/或根据权利要求23至25中任一项所述的组合物在制备意图用于预防或治疗癌症的药物中的用途。

27.根据权利要求26所述的用途，其特征在于所述癌症是选自前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌或胰腺癌的癌症。