KR20120094474A - 씨디151에 특이적 키메라 항체들 및 암의 치료에서 그들의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 CD151 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는, 키메라 (chimeric) 및 인간화 (humanized)된 새로운 항체들, 특히 마우스 기원의 모노클론 항체들, 또한 이들 항체들을 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암의 예방적 및/또는 치료적 처치를 위한 약제들로서 또한 CD151 단백질의 과다발현과 연관된 질환들을 위한 암 진단 방법들 또는 키트들에서 이들 항체들의 용도를 포함한다. 마지막으로, 본 발명은 항체들 및/또는 항암 제제들과 연관되거나 독소들 및/또는 방사성원소들과 결합된 이러한 항체들을 포함하는 산물들 및/또는 조성물들, 또한 소정의 암들의 예방 및/또는 치료에서의 그들의 용도를 포함한다.

Description

씨디151에 특이적 키메라 항체들 및 암의 치료에서 그들의 용도 {Chimeric antibodies specific for CD151 and use thereof in the treatment of cancer}

본 발명은 종양 성장을 억제할 수 있는, 키메라 (chimeric) 및 인간화 (humanized)된 새로운 항체들, 특히 마우스 기원의 모노클론 항체들, 또한 이들 항체들을 코딩하는 아미노산 및 핵산 서열들에 관한 것이다. 상세한 관점에 따르면, 본 발명은 종양 세포들의 증식을 억제할 수 있는 새로운 항체들, 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암의 예방적 및/또는 치료적 처치를 위한 약제들로서, 또한 암 진단 방법들 또는 키트들에서 이들 항체들의 용도를 포함한다. 마지막으로, 본 발명은 예를 들어 항-암 제제들 및/또는 항체들과 연관되거나 독소들과 결합된 이러한 항체들을 포함하는 산물들 및/또는 조성물들, 또한 소정의 암들의 예방 및/또는 치료에서의 그들의 용도를 포함한다.

CD151은 PETA-3 또는 SFA-1라고도 명명되는 테트라스패닌 패밀리 (tetraspanin family)에 속하는 막 단백질 (membrane protein)이다 (Boucheix and Rubinstein, 2001, Cell Mol. Life Sci. 58, 1189-1205; Hemler, 2001, J. Cell Biol. 155, 1103-1107). 인간에서, CD151은 253개의 아미노산들을 가지고 4가지 막 단편들 또한 세포외 고리 (extracellular loop)라고도 명명되는 2가지 세포외 도메인들 EC1 (18개의 아미노산들, [40 - 57번] 서열) 및 EC2 (109개의 아미노산들, [113 - 221번] 서열)을 포함한다. 그러나, 뉴클레오타이드 서열에서는 CD151의 두 가지 변이체들, 즉 395번 및 409번 위치에서 각각 뉴클레오타이드 A 및 C를 가지는 것 [Fitter et al., 1995, Blood 86(4), 1348-1355]과 이와 동일한 위치들에서 뉴클레오타이드 A 및 C 대신에 뉴클레오타이드 G 및 T를 가지는 다른 것 [Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70(5), 3258-3263]이 지금까지 확인되었던 점이 주목된다. 그 결과, 펩타이드 서열에서 돌연변이, 즉 132번 및 137번 위치들에서 각각 K (Lys) 및 P (Pro) 잔기들이 R (Arg) 및 S (Ser) 잔기들로의 돌연변이가 관찰될 수 있다 [Fitter et al., 1995, Blood 86(4), 1348-1355 / Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70(5), 3258-3263].

CD151은, 예를 들어 폐 [Tokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114], 결장 [Hashida et al., 2003, Br. J. Cancer 89, 158-167], 전립선 [Ang et al., 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721] 또는 췌장 [Gesierich et al., 2005, Clin. Cancer Res. 11, 2840-2852]에서의 암과 같은 수많은 암들에서 과다발현 된다 (overexpressed).

다양한 세포의 유형들에서 시험관내 (in vitro) CD151의 기능성과 발현을 방해하기 위하여 CD151을 발현하지 않는 녹-아웃 (knock-out) 마우스 또한 항-CD151 항체 및 siRNA를 사용한 것은 CD151이 세포 부착 (cell adhesion) (Nishiuchi et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1939-1944; Winterwood et al., 2006, Mol. Biol. Cell 17, 2707-2721), 세포 운동 (cell motility) (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343), 세포 이동 (cell migration) (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765; Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820; Penas et al., 2000, J. Invest. Dermatol. 114, 1126-1135; Klosek et al., 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416), 세포 침습 (cell invasion) (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343; Shiomi et al., 2005, Lab. Invest. 85, 1489-1506; Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292) 및 혈관형성 (angiogenesis) (Yanez-Mo et al., 1998, J. Cell Biol. 141, 791-804; Sincock et al., 1999, J. Cell Sci. 112, 833-844; Takeda et al., 2007, Blood 109, 1524-1532)과 같은 암과 관련된 많은 현상들에 관여하는 점을 밝혀주었다.

테트라스패닌 (tetraspanins)의 주목할만한 특성의 하나는 구조화된 마크로분자 복합체들 (macromolecular complexes)를 형성하도록 그들 간의 결합 또한 많은 다른 표면 분자들 (surface molecules)과의 연결들을 형성하는 그들의 능력이다. 이들 복합체 내에서, 각 테트라스패닌은 하나 이상의 표면 분자와 특이적으로 연결되어 테트라스패닌 및 파트너 분자로 구성된 일차적인 복합체들을 형성한다. 테트라스패닌은 미세도메인들 (microdomains)로부터 그들의 파트너 분자들을 채용할 수 있는 세포질 막 (plasma membrane)의 특정한 미세도메인들을 구성할 수 있고, 이는 기능적으로 결합될 수 있다. 테트라스패닌이 관여하는 한 벌의 상호작용은 "테트라스패닌의 연결망 (network of tetraspanins)" 또는 "테트라스패닌 웹 (tetraspanin web)"이라고 명명되어 왔다.

CD151은 세포의 표면 상에서 다양한 막 단백질들과 상호작용한다. 상세하게는, 라미닌 수용체 인테그린 (laminin receptor integrins), 보다 상세하게는 바람직한 리간드가 라미닌 5이기도 한 인테그린들 α3β1 또는 α6β4과 형성하는, 소정의 계면활성제들의 작용에 저항하는 매우 안정한 복합체들이 밝혀져 왔다 (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765; Lammerding et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci USA 100, 7616-7621). 본 연결은 CD151 및 인테그린들의 세포외 도메인들이 관여하고 있다. EC2 루프에 위치하는 CD151의 QRD [194 - 196번] 서열은 이 부위의 돌연변이가 일정 인테그린과 상호작용의 소실을 초래하기 때문에 이 연결에 있어서 매우 중요하다 (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309). 더우기 CD151/인테그린 α6β4/c-Met (HGF 수용체)의 기능적 삼차 복합체들도 종양 세포들에서 확인되어 왔다 (Klosek et al ., 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416). 세포를 간섭 RNA로 처리한 결과로서 CD151 발현의 저해는 HGF에 의해 초래되는 세포 성장 및 이동의 저해를 가져온다.

특정한 세포 내에서, 테트라스패닌의 연결망을 형성하는 데 필요한 CD151 및 다른 테트라스패닌들 간의 상호작용은, EC2 루프의 소실이 CD151의 다른 테트라스패닌들과의 연결을 파괴하지 못하는 것으로 관찰되었기 때문에, CD151의 막과 세포질 부위들에 의존적인 것으로 여겨진다 (Berditchevski, 2001, J. Cell Sci. 114, 4143-4151).

CD151은, 예를 들어 PI4-키나제와의 연관성을 통한 포스포이노시타이드 경로 (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765), FAK, Src, p38-MAPK 및 JNK 인산화를 통한 c-Jun 신호전달 경로 (Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292), PKC에 의한 인테그린의 인산화 (Zhang et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 25005-25013) 및 Rho 패밀리의 GTPase 활성화 (Shigeta et al., 2003, J. Cell Biol. 163, 165-176)와 같은 다양한 신호전달 경로들 (signalling pathways)의 조정에 의해 세포 부착, 이동 및 침습 현상을 조절할 수 있다.

세포들 간의 호모친화성 (homophilic-type)의 상호작용들도 역시 세포 이동및 금속단백분해효소 MMP-9의 발현에서 증가와 관련이 있다 (Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292). 이들 세포 간 CD151-CD151 상호작용은 FAK, Src, p38-MAPK 및 JNK 의 인산화를 통한 c-Jun의 활성화를 유발한다.

본 CD151 단백질에서의 흥미로운 점에도 불구하고, 두 가지 치료적 목적을 가진 항체들, 즉 모노클론 항체들 50-6 및 SFA1.2B4만이 지금까지 생산되었다. 이들 2개 항체들은 비교가능한 활성을 가진다. 그들은 동물 모델들에서 생체내 (in vivo) 전이 형성 (formation of metastasis)을 분명하게 저해하지만, 생체내 종양 성장에는 전혀 효과가 없는 것으로 확립되어 왔다.

CD151에게로 유도되는 모노클론 항체 50-6 (IgG1 이소형)은 인간 표피모양 암종 (human epidermoid carcinoma) HEp-3 세포들을 사용한 차감된 면역화 (subtractive immunisations)에 의해 마우스에서 생성되었다 (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820).

항체 50-6 은 CD151를 과다발현 하도록 형질전환된 인간 자궁경부 암종 HeLa 세포들 및 HEp-3 세포들의 이동 또한 bFGF (기본 섬유아세포 성장인자)에 의해 유발되는 융모막-요막 신생혈관생성 (chorio-allantoic membrane neovascularisation)의 모델에서 혈관형성을 시험관내에서 저해할 수 있다. 생체 내에서 이것은 2가지의 닭 배아 모델들에서 HEp-3 세포들의 접종에 의해 발생되는 전이 (metastases)를 억제한다 (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820). 이들 모델들에서, 항체 50-6의 저해 활성은 폐 추출물들에서 단백질 huPA (인간 유로키나제-유형의 플라스미노겐 활성인자) 활성을 측정하여 결정된다. 저자들에 따르면, 본 분석법은 폐들에서 인간 세포들의 존재를 반영해준다. 분석한 이후에 항체 50-6에 의해 발생되는 전이 (닭 배아의 폐 내로 HEp-3 세포들의 전염)의 감소는 대조군 항체와 비교하여, 세포들의 접종에 이어서 항체가 접종되는 소위 "자발적인 전이 (spontaneous metastasis)" 모델에서 74%, 또한 세포와 항체가 함께 접종되는 소위 "실험적인 전이 (experimental metastasis)"에서 57%가 되는 것으로 평가된다. 저자들에 따르면, 생체내에서 관찰되는 항체 50-6의 항-종양 특성들은 항체가 HEp-3 세포들의 시험관내 증식에 전혀 효과를 보이지 않았기 때문에 세포증식억제 (cytostatic) 또는 세포독성 효과와 관련되는 것으로 여겨지지 않는다.

항체 50-6을 생산하는 하이브리도마는 참조번호 CRL-2696 (처음에 참조번호 50-6 [PTA-227] 하에 기탁된 하이브리도마) 하에서 ATCC에서 입수가능하다.

항-CD151 모노클론 항체 SFA1.2B4 (IgG1 이소형)는 인간 CD151 유전자에 의해 형질전환된 NIH 3T3 세포들을 사용하여 복강내 경로로 면역접종한 이후 마우스에서 생성되었다 (Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70, 3258-3263). 항체 SFA1.2B4는 다양한 인간 종양 계열들의 시험관내 세포 침습 및 운동성을 저해할 수 있다 (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343). 이것은 결장암 RPMI14788 및 CD151을 과다발현 하도록 형질전환된 섬유육종 (fibrosarcoma) HT1080 계열들에 의해 초래되는 생체내 (in vivo) 폐 전이들을 저해한다 (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343).

기타 다른 마우스 항-CD151 항체들이, 예를 들어 모노클론 항체들 14A2H1 (Ashman et al., 1991, Br. J. Haematol. 79, 263-270; Roberts et al., 1995, Br. J. Haematol. 89, 853-860), TS151 및 TS151R (Serru et al., 1999, Biochem. J. 340, 103-111; Geary et al., 2001, Tissue Antigens 58, 141-153; Charrin et al., J. Biol. Chem. 276, 14329-14337; Chometon et al., 2006, Exp. Cell Res. 312, 983-985)와 같이 문헌에 기재되어 왔다.

몇 가지 실험적 연구들은 전이의 억제인자들 (suppressors)로서 또는 촉진인자들 (promoters)로서 작용하는 전이들의 형성에 있어서 테트라스패닌들의 주요한 역할을 보여주었다. 따라서, CD9, CD63 또는 CD82와 같은 테트라스패닌들의 형질전환 (transfection)은 암 계열들 (cancer lines)의 전이 능력을 감소시킨다. 대조적으로, 테트라스패닌들 CD151 및 Co-029의 발현은 정반대 효과를 생성시키는 것으로 보인다. 따라서 이들 2가지의 테트라스패닌들은 전이과정의 촉진인자들라고 사료된다. 이들 결과는 많은 암들 (유방, 폐, 식도, 위, 간, 췌장, 결장, 전립선, 흑색종, ...)에서 전이과정이 존재할 때 CD9 및 CD82가 일차 종양들에서 덜 발현되고, 그들의 발현 감소는 더 낮은 생존율을 예측하도록 하는 점을 보여주는 다양한 임상적 연구들과 일치한다. 폐암에서, CD9 및 CD82의 발현의 동시적 감소는 이들 항원들 중 하나만의 발현이 감소될 때보다 더 큰 전이적 잠재력 (metastatic potenital)과 상호관련이 있었다.

여러 가지 과거의 연구들은 CD151의 과다발현이 폐, 직장 및 전립선 암들과 같은 소정의 암들의 공격성과 연관되고, 이것이 나쁜 예후에 대한 요인으로서 고려될 수 있는 점을 보여주었다 (Tokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114; Hashida et al., 2003, Br. J. Cancer 89, 158-167; Ang et al., 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721). 이들 사례에서는, 사실상 CD151을 발현하지 않는 종양들을 가진 환자들과 비교하여 CD151을 발현하는 종양들을 가진 환자들에서 평균 생존율이 감소된다.

다양한 인간 종양 계열들 (HeLa, RPMI14788, A172, HT1080)에서 해당되는 유전자의 형질감염에 의해 발생되는 CD151의 과다발현이 감염된 세포의 운동, 이동 및 침습의 증가를 유발한다 (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820; Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343). 이들 현상들은 항-CD151 항체들의 존재 시 저해된다.

키메라 (chimeric) (키메라 (chimearic)이라고도 쓰여짐) 항체는 주어진 종으로부터 나온 항체로부터 유래한 자연적인 가변 (경쇄 및 중쇄) 부위를 상기 주어진 종에 이종유래 종으로부터 나온 항체의 불변 경쇄 및 중쇄 부위들과 연결하여 포함하는 항체를 말하는 것으로서 이해된다.

본 발명에 따르면 키메라-유형의 항체들, 또는 그들의 단편들은 유전적 재조합 기법들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 프로모터 및 비-인간, 특히 마우스의 본 발명에 따른 모노클론 항체의 가변 부위를 코딩하는 서열 및 인간 항체의 불변 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA를 클로닝하여 생산될 수 있다. 이러한 재조합 유전자에 의해 인코드되는 본 발명의 키메라 항체는 예를 들어 마우스-인간 키메라일 수 있고, 해당 항체의 특이도는 마우스 DNA로부터 유래한 가변 부위에 의해 결정되고 그의 이소형은 인간 DNA로부터 유래한 불변 부위에 의해 결정된다. 키메라 항체들을 제조하는 방법을 위해서는, 예를 들어 참고문헌이 베르호인 등 (Verhoeyn et al., BioEssays, 8: 74, 1988) 서류에 작성될 수 있다.

첫 번째 관점에 따르면, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지거나 최적의 정렬 이후에 서열번호 7의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 경쇄, 및/또는 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지거나 최적의 정렬 이후에 서열번호 8 또는 9의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키메라 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편에 관한 것이다.

두 가지의 중쇄 서열들, 서열번호 8 및 9는 인간 이소형 IgG1 및 IgG4에 각각 해당하고 있다.

그 결과, 본 발명의 첫 번째 구현예는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 본 발명의 키메라 항체 c203B6[IgG1], 또는 그의 유도된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 두 번째 구현예는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고, 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 본 발명의 키메라 항체 c203B6[IgG4], 또는 그의 유도된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키메라 항체, 유도된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 25 또는 37의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지거나 최적의 정렬 이후에 서열번호 25 또는 37의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 경쇄, 및/또는 서열번호 26, 27, 38 또는 44의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지거나 최적의 정렬 이후에 서열번호 26, 27, 38 또는 44의 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

서열번호 26 및 38의 두 가지의 중쇄 서열들은 인간 이소형 IgG1에 해당하고 있고, 서열번호 27의 중쇄 서열은 인간 이소형 IgG4에 해당하고 있고 또한 서열번호 44의 중쇄 서열은 인간 이소형 IgG2에 해당하고 있다.

그 결과, 본 발명의 첫 번째 구현예는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 본 발명의 키메라 항체 c214B2[IgG1], 또는 그의 유도된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 두 번째 구현예는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고, 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 본 발명의 키메라 항체 c214B2[IgG4], 또는 그의 유도된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 세 번째 구현예는 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 본 발명의 키메라 항체 c214B2[IgG1][TH7], 또는 그의 유도된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 네 번째 구현예는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하고, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 본 발명의 키메라 항체 c214B2[IgG2], 또는 그의 유도된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명에 따른 항체의 "기능적 단편 (functional fragment)"은, 특히 Fv, scFv (sc는 "단일 사슬 (single chain)"을 의미함), Fab, F(ab')₂, Fab' 또는 scFv-Fc 단편들 또는 다이아체들 (diabodies), 또는 반감기가 연장될 수 있었던 단편이라면 모두와 같은 항체 단편을 말하는 것으로 이해된다. 이러한 기능적 단편들은 하기 본 명세서에서의 기술내용 (description)에 자세하게 기재될 것이다.

본 발명에 따른 항체의 "유도체 화합물 (derivative compound)"은, 특히 펩타이드 구조틀 (framework) 또는 "스캐폴드 (scaffold)" 또한 그의 인식 능력을 보존하도록 고유 항체의 적어도 하나의 CDRs를 포함하는 결합 단백질을 말하는 것으로 이해된다. 이러한 유도체 화합물들은 당업자에게 잘 알려져 있고 하기 본 명세서에서의 기술내용에 보다 자세하게 기술될 것이다.

더욱 바람직하게, 본 발명은 특히 유전적 재조합에 의해 또는 화학적 합성에 의해 획득되고, 키메라 또는 인간화된 본 발명에 따른 항체들, 그들의 유도체 화합물들 또는 그들의 기능적 단편들을 포함한다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나는 모노클론 항체로 구성되는 것을 특징으로 한다.

"모노클론 항체 (monoclonal antibody)"는 실질적으로 균질한 (substantially homogeneous) 항체들의 집단으로부터 유래한 항체로서 이해될 것이다. 더욱 특히나, 집단의 개별 항체들은 자연적으로 생산될 수 있고 최소량으로 존재할 수 있는 일부 가능한 돌연변이들을 제외하고는 일치한다. 달리 말하면, 모노클론 항체는 단 하나의 세포 클론 (예를 들어, 하이브리도마, 균질한 항체를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 진핵성 숙주세포, 균질한 항체를 코딩하는 DNA 분자로 형질전환된 원핵성 숙주세포 등등)의 증식으로부터 나오는 균질한 항체로 구성되고, 보통은 한 가지의 동일한 클래스 및 서브클래스의 중쇄들 또한 단 한 가지 유형의 경쇄들에 의해 특성이 결정된다. 모노클론 항체는 매우 특이적이고 단일 항원에게로 유도된다. 또한, 통상적으로 서로 다른 결정기 또는 에피토프에게로 유도되는 서로 다른 항체들을 포함하는 폴리클론 항체 산물들과는 대조적으로, 각 모노클론 항체는 항원의 단일 에피토프에게로 유도된다.

본 명세서에서는, 본 발명이 자연적 형태에서의 항체들에 관한 것이 아니고, 즉 그들은 자연 환경으로부터 가져온 것이라기보다는 그들을 분리하거나 천연의 출처로부터 시작하는 정제법에 의해 획득하거나 이외에도 유전적 재조합에 의해 또는 화학적 합성에 의해 획득하는 것이 가능하였던 것이고, 따라서 그들은 하기 본 명세서에서 기술될 바와 같이 비-자연적인 아미노산들을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

독특한 IMGT 번호매김 시스템 (IMGT numbering system)은 어떤 항원, 사슬 유형 또는 종이라도 가변 도메인을 비교할 수 있도록 정의되었다 [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., Pommie C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. 본 번호매김 시스템에서, 보존되는 아미노산은 23번 시스테인 (1st-CYS), 41번 트립토판 (보존되는 TRP), 89번 소수성 아미노산, 104번 시스테인 (2nd-CYS), 118번 페닐알라닌 또는 트립토판 (J-PHE 또는 TRP)과 같이 항상 동일한 위치를 보유한다. 독특한 IMGT 번호매김 시스템은 따라서 스캐폴드 부위 (FR1-IMGT: 1 내지 26번 위치, FR2-IMGT: 39 내지 55번 위치, FR3-IMGT: 66 내지 104번 위치 및 FR4_IMGT: 118 내지 128번 위치) 또한 상보성 결정 부위 (complementarity determining regions) 또는 CDRs (CDR1-IMGT: 27 내지 38번 위치, CDR2-IMGT: 56 내지 65번 위치 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117번 위치)의 표준화된 구획을 제공한다. "구멍 (holes)" 또는 "공간 (spaces)"은 채워지지 않은 위치를 나타내고, IMGT에 따른 CDRs의 길이는 결정적인 정보가 된다. IMGT 시스템은 IMGT 진주목걸이 (IMGT pearl necklace)라고도 명명되는 [Ruiz, M. and Lefranc, M. P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M. P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] 2차원 그래픽 전시 및 IMGT/3D 구조-DB라고 명명되는 3차원 구조 [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M. P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]에서 사용된다.

본 발명의 기술내용에서, 항체 화합물들 또는 그들의 서열들과 연관된 용어들 " 폴리펩타이드 (polypeptides)", "폴리펩타이드 서열 (polypeptide sequences)", "펩타이드 (peptides)" 및 "단백질 (proteins)"은 상호교환이 가능하다.

본 명세서에서는, 본 발명이 자연적 형태에서의 항체들에 관한 것이 아니고, 즉 그들은 자연 환경으로부터 가져온 것이라기보다는 그들을 분리하거나 천연의 출처로부터 시작하는 정제법에 의해 획득하거나 이외에도 유전적 재조합에 의해 또는 화학적 합성에 의해 획득하는 것이 가능하였던 것이고, 따라서 그들은 하기 본 명세서에서 기술될 바와 같이 비-자연적인 아미노산들을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 "일치도 퍼센트 (percentage identity)"는 최고의 배열 (최적의 배열)에 따라 획득되어 비교되는 두 개의 서열들 간에 일치하는 뉴클레오타이드들 또는 아미노산 잔기들의 퍼센트를 말하는 것으로 본 발명에 의해 이해되고, 이 퍼센트는 순수하게 통계적이고 이 두 서열들 간의 차이는 그들 길이 전체를 통하여 무작위적으로 분포한다. 두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 서열 비교들은 통상적으로 그들을 최적으로 배열한 이후 이들 서열들을 비교하여 수행되고, 이것은 상기 비교가 분절마다 또는 "비교창 (comparison window)"에 의해 수행되는 것이 가능하다. 비교를 위한 서열들의 최적의 배열은 수동적으로 수행되는 것 이외에도 스미스 및 워터맨의 로칼 상동성 알고리즘 [Smith and Waterman (1981), local homology algorithm; Ad. App. Math. 2:482]에 의해, 네들만 및 운쉬의 로칼 상동성 알고리즘 [Neddleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443]에 의해, 피어슨 및 립만의 유사도 조사 방법 (similarity search method)에 의해 [Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], 또는 이들 알고리즘들을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어에 의해 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지, 유전학 컴퓨터 그룹, 575 Science Dr., Madison, WI에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 또는 비교 소프트웨어 BLAST N 또는 BLAST P 에 의해) 수행될 수 있다.

두 개의 핵산 또는 아미노산 서열들 간 일치도 퍼센트는 비교될 핵산 또는 아미노산 서열이 이들 두 서열들 간 최적의 배열을 위한 기준 서열에 대해 부가 (addition) 또는 결실 (deletion)을 포함할 수 있는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교하여 결정된다. 일치도 퍼센트는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 두 개 서열들 간에 일치하는 동일한 위치들의 수를 결정하고, 동일한 위치의 수를 비교창에서의 위치들의 전체 수로 나누어 획득된 결과를 두 개 서열들 간 일치도 퍼센트를 얻기 위하여 100으로 곱하여 계산된다.

예를 들어, 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 상에서 입수가능한 BLAST 프로그램 "BLAST 2 서열들"이 사용될 수 있고, 사용되는 매개변수들은 디폴트로 주어지는 것이고 (특히, 매개변수 "오픈 갭 페널티 (open gap penalty)"의 경우: 5, 및 "연장 갭 페널티 (extension gap penalty)": 2; 선택된 매트릭스는, 예를 들어 프로그램에 의해 제시되는 "BLOSUM 62" 매트릭스일 수 있음), 비교를 위한 두 개 서열들 간 일치도 퍼센트는 프로그램에 의해 직접적으로 계산될 수 있다.

기준 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 아미노산 서열로는, 기준 서열에 대해 일정한 변형 (modification), 특히 적어도 하나의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 (substituiton), 절단 (truncation) 또는 연장 (extension)을 가지는 것에 선호도가 주어진다. 하나 이상의 연속적 (consecutive) 또는 비-연속적 아미노산(들)의 치환의 사례에서, 선호도는 치환된 아미노산이 "동등한 (equivalent)" 아미노산에 의해 대체되는 치환에 주어진다. 용어 표현 "동등한 아미노산"은 본 명세서에서 하기 특히 실시예에서 정의될 바와 같은 해당되는 항체의 생물학적 활성을 근본적으로 변형시키지 않지만, 기본 구조의 아미노산 하나가 치환될 수 있는 아미노산이라면 모두를 가르키려고 의도된다.

이들 동등한 아미노산들은 치환되어진 아미노산들과의 구조적 상동성을 기초로 하거나 또는 생산될 수 있는 다양한 항체들 간의 비교 생물학적 활성의 결과를 기초로 하여 결정될 수 있다.

비-제한적인 예에 의하여, 하기 표 1은 해당되는 변형된 항체의 생물학적 활성의 근본적인 변형을 유발하지 않고도 수행될 수 있는 치환 가능성, 동일한 조건들 하에서 과정이 실행될 수 있는 역 치환 (reverse substituiton)을 고려한다.

상기 본 명세서에서 표시된 바와 같이, 본 발명은 마찬가지로 본 발명에 따른 항체로부터 유래한 화합물이라면 모두를 지향한다.

더욱 특별하게, 본 발명에 따른 항체, 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나는 상기 유도체 화합물이 초기 항체의 파라토프 인식 (paratopic recognition) 특성을 전부 또는 부분적으로 보존하도록 적어도 하나의 CDR이 이식된 펩타이드 스캐폴드를 포함하는 결합 단백질로 구성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 기술된 CDRs의 서열들 중에서 하나 이상의 서열도 역시 면역글로불린의 다양한 단백질 스캐폴드- 또는 구조틀- 상에서 제공될 수 있다. 이 경우에, 단백질 서열은 이식된 CDR 또는 CDRs의 접힘에 유리한 펩타이드 골격을 재생산하는 것이 가능하도록 하여, 그/그들이 항원 인식의 파라토프 특성을 보존하도록 허용한다.

일반적인 방식으로, 당업자는 고유 항체로부터 유래한 CDRs의 적어도 하나를 이식한 단백질 스캐폴드의 유형을 결정하는 방법을 숙주하고 있을 것이다. 더욱 특별하게, 선택되기 위해서는 이러한 스캐폴드들은 하기에 나열된 바와 같은 판단기준을 가장 많이 만족시켜야 하는 것으로 알려져 있다 (Skerra A., J. Mol. Recogn. 13, 2000, 167-187):

- 좋은 계통유전학적 보존;

- 기지의 삼차원 구조 [예를 들어, 결정학 (crystallography), NMR 스펙트로스코피 (NMR spectroscopy) 또는 당업자가 숙지하고 있는 기타 다른 기법과 같음];

- 작은 크기;

- 전사후 변형 (post-transcriptional modification)이 아주 적거나 없음; 및/또는

- 생산, 발현 및 정제의 용이성.

이러한 단백질 스캐폴드의 기원은, 이에 제한되는 것은 아니지만 피브로넥틴 (fibronectin) 및 바람직하게는 제 3형 피브로넥틴의 10번째 도메인으로부터 유래한 스캐폴드, 리포칼린 (lipocalin), 안티칼린 (anticalin) (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4): 257-75), 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 단백질 A의 도메인 B로부터 유래한 단백질 Z, 티오레독신 A (thioredoxin A), 또한 "안킬린 반복서열 (ankylin repeat)"(Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), "아마딜로 반복서열 (amadillo repeat)", "루이신-풍부 반복서열 (leucine-rich repeat)", 또는 "테트라트리코펩타이드 반복서열 (tetratricopeptide repeat)" 유형의 반복된 모티프들을 가지는 단백질들:로부터 선택되는 구조일 수 있다.

또한, 예를 들어 전갈, 곤충, 식물, 연체동물 등으로부터 유래한 다음의 독소들 또는 신경성 NO 합성효소의 단백질 저해제들 (PIN)과 같은 독소들로부터 유래한 스캐폴드들이 언급될 수 있다.

이러한 하이브리드 구조들의 예로서 - 이에 제한되는 것은 아니지만 - 항-CD4 항체, 즉 13B8.2의 CDR-H1 (중쇄)의 PIN 루프의 하나 내로의 삽입이 고유 항체와 동일한 결합 특성을 유지하면서 이에 의해 획득되는 새로운 결합 단백질 (Bes et al ., BBRC 343, 2006, 334-344)로서 언급될 수 있다. 또한, 본 기술내용을 통해 네오카지노스타틴 (neocarzinostatin) (Nicaise et al ., 2004)의 루프들의 하나 상에 항-리소자임 VHH 항체의 CDR-H3 (중쇄)를 이식하는 것이 언급될 수 있다.

마지막으로 상기 본 명세서에 기술된 바와 같이, 이러한 펩타이드 스캐폴드들은 고유 항체로부터 유래한 1개부터 6개까지 범위 CDR(s)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 반드시 필요한 것은 아니지만, 당업자라면 중쇄로부터 유래한 적어도 하나의 CDR을 선택할 것이고 후자는 항체의 특이성을 근본적으로 부여하는 것으로 알려져 있다. 적절한 CDR(s)의 선택은 당업자에게 자명할 것이고, 후자는 목적에 맞는 기지의 기술을 사용할 것이다 (Bes et al., FEBS letters 508, 2001, 67-74).

자명하게, 이들 예들은 제한되지 않고, 당업자가 숙지하고 있거나 당업자에게 자명한 기타 다른 구조는 본 특허 출원에 의해 부여받는 보호범위 내에 속하는 것으로 고려되어야 한다.

따라서, 본 발명은 상기 펩타이드 스캐폴드가 a) 계통유전학적으로 잘 보존되고, b) 건강한 구조물로 이루어지며, c) 잘 알려진 삼차원 분자적 조직을 가지고, d) 크기가 작으며 및/또는 e) 안정성 특성들에 변화를 주지않고도 결실 및/또는 삽입에 의해 변형될 수 있는 부위들을 포함하는 단백질들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체, 또는 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나에 관한 것이다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 항체, 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나는 펩타이드 스캐폴드가 i) 피브로넥틴, 바람직하게는 제 3형 피브로넥틴의 10번째 도메인, 리포칼린, 안티칼린, 스태필로코커스 아우레우스의 단백질 A의 도메인 B로부터 유래한 단백질 Z, 티오레독신 A로부터 유래한 스캐폴드들, ii) "안킬린 반복서열", "아마딜로 반복서열", "루이신-풍부 반복서열", 또는 "테트라트리코펩타이드 반복서열" 유형의 반복된 모티프들을 가지는 단백질들, 또한 iii) 신경성 NO 합성효소 (PIN)의 단백질 저해제들로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 마찬가지로 상기 본 명세서에서 기술된 항체의 기능적 단편들이 언급된다.

더욱 특별하게, 본 발명은 상기 기능적 단편이 Fv, Fab, F(ab')₂, Fab', scFv 단편들 또는 다이아체들, 또는 폴리에틸렌 글리콜화된 (pegylated) 단편들과 같은 반감기가 연장될 수 있었던 단편이라면 모두로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체, 또는 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나를 지향한다.

본 발명에 따른 항체들의 이러한 기능적 단편들은, 예를 들어 Fv, scFv (sc는 "단일 사슬"을 의미함), Fab, F(ab')₂, Fab' 또는 scFv-Fc 단편들 또는 다이아체들, 또는 화학적 변형, 예로 폴리(에틸렌)글리콜과 같은 폴리(알킬렌)글리콜의 첨가 ["PEG화 (PEGylation)"][Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')₂-PEG 또는 Fab'-PEG 라고도 명명되는 PEG화된 단편들]에 의해 ("PEG"는 폴리(에틸렌)글리콜 (Poly(Ethylene)Glycol) 명명법으로부터 나옴), 또는 리포좀 (liposome), 미세구 (microsphere) 또는 PLGA의 도입에 의해 반감기가 연장될 수 있었던 단편이라면 모두로 구성되고, 본 발명에 따른 특징적인 CDRs의 적어도 하나를 가지고, 특히 항체가 유래한 항체의 활성을 부분적일지라도 일반적으로 나타낼 수 있다.

바람직하게, 상기 기능적 단편들은 그들이 유래한 항체의 가변성 중쇄 또는 경쇄의 부분적 서열로 구성되거나 이를 포함할 것이며, 상기 부분적 서열은 그들이 유래한 항체와 동일한 결합 특이도 (binding specificity) 및 그들이 유래한 항체와의 적절한 친화도 (affinity), 바람직하게는 적어도 100분의 1, 더욱 바람직하게는 적어도 10분의 1에 해당하는 친화도를 보유하는 데 충분하다.

이러한 기능적 단편은 그들이 유래한 항체의 서열로부터 적어도 5개의 연속적 아미노산, 바람직하게는 10, 15, 25, 50 또는 100개의 연속적 아미노산들을 포함할 것이다.

적어도 다음을 포함하는 기능적 단편들이 역시 바람직하다:

- 서열번호 7에 포함되는 경쇄의 3가지 CDRs 및 서열번호 7의 서열로부터 나온 112개의 연속적 아미노산들, 바람직하게는 115, 125, 175, 200 또는 210개의 연속적 아미노산들; 및/또는

- 서열번호 8 또는 9에 포함되는 중쇄의 3가지 CDRs 및 서열번호 8 또는 9의 서열로부터 나온 119개의 연속적 아미노산들, 바람직하게는 125, 150, 200, 250 또는 300개의 연속적 아미노산들.

적어도 다음을 포함하는 기능적 단편들이 역시 바람직하다:

- 서열번호 25 또는 37에 포함되는 경쇄의 3가지 CDRs 및 서열번호 25 또는 37의 서열로부터 나온 108개의 연속적 아미노산들, 바람직하게는 115, 125, 175, 200 또는 210개의 연속적 아미노산들; 및/또는

- 서열번호 26, 27 또는 38에 포함되는 중쇄의 3가지 CDRs 및 서열번호 26, 27 또는 38의 서열로부터 나온 120개의 연속적 아미노산들, 바람직하게는 125, 150, 200, 250 또는 300개의 연속적 아미노산들.

바람직하게, 이들 기능적 단편들은 Fv, scFv, Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc 유형의 단편들 또는 다이아체들일 것이고, 이들은 일반적으로 그들이 획득된 항체와 동일한 고정 특이도 (fixing specificity)를 갖는다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 항체 단편들은 상기 본 명세서에 기술된 바와 같이 항체들로부터 시작하여 펩신 (pepsin) 또는 파파인 (papain)과 같은 효소들을 사용하는 소화와 같은 방법들에 의해 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 결합의 절단에 의해 획득될 수 있다. 본 발명에 포함된 항체 단편들은 또한 당업자에게 마찬가지로 잘 알려져 있는 유전적 재조합 기법들에 의해 또는, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템사 (Applied Biosystems) 등의 회사가 공급하는 것과 같은 자동 펩타이드 합성기들에 의한 펩타이드 합성에 의해 획득될 수 있다.

또 다른 상세한 관점에 따르면, 본 발명은 상기 항체가 마우스에 이종유래 (heterologous) 종으로부터, 특히 사람으로부터 나온 항체로부터 유래한 불변성 경쇄 및 중쇄 부위들도 역시 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 키메라 항체, 또는 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나에 관한 것이다.

본 발명의 보다 또 다른 관점에 따르면, 인간화 항체 (humanized antibody), 또는 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나는 인간 항체로부터 유래한 불변성 경쇄 및 중쇄 부위들이 각각 람다 또는 카파 부위 또한 감마-1, 감마-2 또는 감마-4 부위인 것을 특징으로 한다.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 (chimeric) 모노클론 항체들 c203B6[IgG1] 및 c203B6[IgG4]가 유래한 첫 번째 마우스 하이브리도마, 특히 국립 미생물배양 수집기관 (CNCN)(프랑스 파리, 파스퇴르연구소)에 2008년 2월 22일자에 수탁번호 제 I-3920호로 기탁된 바 있는 마우스 기원의 하이브리도마에 관한 것이다. 상기 하이브리도마는 면역화된 Balb/c 마우스 비장세포들 및 Sp 2O Ag 14 마이엘로마 세포주들의 융합에 의해 획득되었다.

마지막으로 또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 모노클론 항체들 c214B2[IgG1] 및 c214B2[IgG4]가 유래한 두 번째 마우스 하이브리도마, 특히 국립 미생물배양 수집기관 (CNCN)(프랑스 파리, 파스퇴르연구소)에 2008년 2월 21일자에 수탁번호 제 I-3919호로 기탁된 바 있는 마우스 기원의 하이브리도마에 관한 것이다. 상기 하이브리도마는 면역화된 Balb/c 마우스 비장세포들 및 Sp 2O Ag 14 마이엘로마 세포주들의 융합에 의해 획득되었다.

하기 본 명세서에서 표 2는 본 발명에 따른 서로 다른 항체들에 해당하는 서로 다른 아미노산 서열들을, 정보를 위해 IMGT에 따라 정의된 CDR 서열들 또한 키메라 경쇄들 및 중쇄들과 함께 정리하고 있다.

본 발명에 따른 항체들은 인간화 항체들 (Hz 또는 hz)라고 명명된 항체들의 특이적 키메라 형태도 역시 포함한다.

인간화 항체는 비-인간 기원의 항체로부터 유래한 CDR 부위들, 하나 (또는 그 이상)의 인간 항체/항체들 또는 배아계열(들) (germline(s))로부터 유래한 항체 분자의 기타 다른 부분들을 포함하는 항체를 말하는 것으로 이해된다. 또한, 골격의 일정 분절들의 잔기들 (FR이라고 명명됨)은 결합 친화도를 보존하도록 변형될 수 있다 (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al ., Nature, 332:323-327, 1988).

본 발명에 따른 인간화 항체들 또는 그들의 단편들은 당업자가 숙지하고 있는 기법들에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; 또는 Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992의 문헌들에 기술되어 있는 것들과 같음). 본 발명에 따른 이러한 인간화 항체들은 시험관내 진단 방법들 또는 생체내 예방적 및/또는 치료적 처치에 사용하는 데 바람직하다. 다른 인간화 (humanization) 기법들도 역시, 예를 들어 PDL에 의해 기술된 "CDR 이식 (CDR Grafting)"의 기법과 같은 선행기술의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이는 유럽특허 제 EP 0 451 261호, 제 EP　0　682 040호, 제 EP 0 939 127호, 제 EP 0 566 647호 또는 미국특허 제 US 5,530,101호, 제 US 6,180,370호, 제 US　5,585,089호 및 제 US 5,693,761호의 특허들의 주요 쟁점이 되고 있다. 또한 미국특허 제 US　5,639,641호 또는 제 US 6,054,297호, 제 US 5,886,152호 및 제 US 5,877,293호의 특허들도 역시 언급될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 명세서에서 기술된 키메라 항체들로부터 유래한 인간화 항체들도 역시 지향한다.

바람직하게는, 인간 항체로부터 유래한 불변성 경쇄 및 중쇄 부위들은 각각 람다 또는 카파 부위 또한 감마-1, 감마-2 또는 감마-4 부위이다.

보다 상세하게는, 다음의 실시예들을 고려하여 더욱 명확해질 바와 같이, 본 발명에 따른 항체들의 여러 가지 인간화 변이체 (variant)가 본 출원에 의해 생성되었다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 46, 47, 48 또는 49의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지거나, 최적의 정렬 이후에 서열번호 46, 47, 48 또는 49와 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 경쇄 가변 도메인, 및/또는 서열번호 50, 51, 52 또는 53의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지거나, 최적의 정렬 이후에 서열번호 50, 51, 52 또는 53와 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인 Hz214B2VLVar1, 또한 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar1, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar2, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar3, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인 Hz214B2VLVar2, 또한 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar1, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar2, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar3, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인 Hz214B2VLVar3, 또한 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar1, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar2, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar3, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인 Hz214B2VLVar4, 또한 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar1, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar2, 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar3, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 첫 번째 바람직한 구현예는 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 인간화 항체 Hz214B2VLVar1VHVar1, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 두 번째 바람직한 구현예는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 인간화 항체 Hz214B2VLVar2VHVar2, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 세 번째 바람직한 구현예는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 인간화 항체 Hz214B2VLVar3VHVar3, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 네 번째 바람직한 구현예는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는, 인간화 항체 Hz214B2VLVar4VHVar4, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 62, 63, 64 또는 65의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지거나, 최적의 정렬 이후에 서열번호 62, 63, 64 또는 65와 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 경쇄, 및/또는 서열번호 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 또는 73의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지거나, 최적의 정렬 이후에 서열번호 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 또는 73와 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게, 본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 IgG1이고, 서열번호 62, 63, 64 또는 65의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지거나, 최적의 정렬 이후에 서열번호 62, 63, 64 또는 65와 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 경쇄를 포함하고, 및/또는 서열번호 66, 67, 68, 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지거나, 최적의 정렬 이후에 서열번호 66, 67, 68, 또는 69와 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 Hz214B2VLVar1, 또한 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar1(G1), 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar2(G1), 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar3(G1), 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar4(G1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 Hz214B2VLVar2, 또한 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar1(G1), 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar2(G1), 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar3(G1), 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar4(G1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 Hz214B2VLVar3, 또한 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar1(G1), 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar2(G1), 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar3(G1), 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar4(G1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 Hz214B2VLVar4, 또한 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar1(G1), 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar2(G1), 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar3(G1), 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar4(G1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 첫 번째 바람직한 구현예는 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 인간화 항체 Hz214B2VLVar1VHVar1(G1), 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 두 번째 바람직한 구현예는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 인간화 항체 Hz214B2VLVar2VHVar2(G1), 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 세 번째 바람직한 구현예는 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 인간화 항체 Hz214B2VLVar3VHVar3(G1), 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 네 번째 바람직한 구현예는 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 인간화 항체 Hz214B2VLVar4VHVar4(G1), 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 다섯 번째 바람직한 구현예는 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 인간화 항체 Hz214B2VLVar3VHVar2(G1), 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 여섯 번째 바람직한 구현예는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는 인간화 항체 Hz214B2VLVar2VHVar3(G1), 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

보다 상세하게, 본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 IgG2이고, 서열번호 62, 63, 64 또는 65의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지거나, 최적의 정렬 이후에 서열번호 62, 63, 64 또는 65와 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 경쇄를 포함하고, 및/또는 서열번호 70, 71, 72 또는 73의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지거나, 최적의 정렬 이후에 서열번호 70, 71, 72 또는 73와 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 Hz214B2VLVar1, 또한 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar1(G2), 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar2(G2), 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar3(G2), 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar4(G2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 Hz214B2VLVar2, 또한 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar1(G2), 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar2(G2), 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar3(G2), 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar4(G2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 Hz214B2VLVar3, 또한 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar1(G2), 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar2(G2), 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar3(G2), 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar4(G2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편은 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 Hz214B2VLVar4, 또한 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar1(G2), 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar2(G2), 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar3(G2), 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 Hz214B2VHVar4(G2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 첫 번째 바람직한 구현예는 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 인간화 항체 Hz214B2VLVar1VHVar1(G2), 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 두 번째 바람직한 구현예는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 인간화 항체 Hz214B2VLVar2VHVar2(G2), 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 세 번째 바람직한 구현예는 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 인간화 항체 Hz214B2VLVar3VHVar3(G2), 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 네 번째 바람직한 구현예는 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 인간화 항체 Hz214B2VLVar4VHVar4(G2), 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 다섯 번째 바람직한 구현예는 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 인간화 항체 Hz214B2VLVar3VHVar2(G2), 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

본 발명의 여섯 번째 바람직한 구현예는 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열을 포함하는, 인간화 항체 Hz214B2VLVar2VHVar3(G2), 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편을 기재하고 있다.

하기 본 명세서에서 표 3는 본 발명에 따른 서로 다른 항체들에 해당하는 서로 다른 아미노산 서열들을, 정보를 위해 IMGT에 따라 정의된 CDR 서열들 또한 서로 다른 인간화 경쇄들 및 중쇄들과 함께 정리하고 있다.

IgG4-유래 항체들은 더 균질한 항체들의 발현을 유도하는 힌지 부위 (hinge region)를 안정화하도록 앤갈 등 (Angal et al ., 1993)에 의해 기술된 바와 같이 좀 더 변형될 수 있다 (226번 Ser의 Pro로의 변형).

IgG1 또는 IgG2 이소형들에 해당하는 구현예에서, 항체의 추가적인 특징은 ADCC (항체 의존성 세포성 세포독성, Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) 및/또는 CDC (보체 의존성 세포독성, Complement Dependent Cytotoxicity)와 같은 효과기 기능들 (effector functions)을 가지는 것이다.

면역글로불린들의 중쇄들은 세 가지의 기능적 부위들로 나뉠 수 있다: Fd 부위, 힌지 부위 (hinge region), 및 Fc 부위 (결정화가능한 단편). Fd 부위는 VH 및 CH1 도메인들을 포함하고, 경쇄와 조합으로 Fab - 항원-결합 단편을 형성한다. Fc 단편은 면역글로불린 효과기 기능들을 부여하고, 이는 예를 들어 보체 고정 및 효과기 세포들의 인지 (cognate) Fc 수용체에 결합을 포함한다. 힌지 부위는 IgG, IgA, 및 IgD 면역글로불린 클래스들에서 발견되고, Fab 부분이 Fc 부위에 비하여 공간에서 자유롭게 이동하도록 허용하는 유연한 공간자 (flexible spacer)로서 작용한다. 힌지 도메인들은 구조적으로 다양하고, 면역글로불린 클래스들 및 서브클래스들 중에서 서열 및 길이 둘 다가 변화한다.

결정분석학적 연구들에 따르면, 면역글로불린 힌지 부위는 세 가지의 부위들로 구조적으로 또한 기능적으로 좀 더 세분화될 수 있다: 상부 힌지 (upper hinge), 중심 (core), 및 하부 힌지 (lower hinge) (Shin et al., Immunological Reviews 130: 87). 상부 힌지는 CH1의 카복실 말단으로부터 운동을 제한하는 힌지에서 첫 번째 잔기까지, 일반적으로 두 개의 중쇄들 사이에 사슬간 디설파이드 결합을 형성하는 첫 번째 시스테인 잔기까지의 아미노산들을 포함한다. 상부 힌지 부위의 길이는 항체의 분절적 유연성 (segmental flexibility)과 상호관련이 있다. 중심 힌지 부위는 중쇄-간 디설파이드 결합들을 포함한다. 하부 힌지 부위는 CH2 도메인의 아미노 말단을 연결시키고 CH2 도메인에 있는 잔기들을 포함한다. 인간 IgG1의 중심 힌지 부위는 Cys-Pro-Pro-Cys 서열을 포함하고, 디설파이드 결합 형성에 의해 이중합될 때 축 (pivot)으로서 작용하여 유연성을 부여하는 것으로 여겨지고 고리형 옥타펩타이드를 만든다. 면역글로불린 힌지 부위 폴리펩타이드 서열의 구조 및 유연성에 의해 허용되는 입체형태적 변화들은 항체의 Fc 부분의 효과기 기능들에 영향을 줄 수 있다.

본 발명의 상세한 관점에 따르면, 본 발명에 따른 키메라 항체는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는, 키메라 항체 c214B2는 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 중쇄를 포함한다.

또한, 하기 본 명세서의 실시예들에서 나타날 바와 같이 본 발명에 관한 항체는 종양 세포들의 증식을 저해할 수 있는 점에서 지금까지 기지의 항체들과는 다르다.

상기 본 명세서에서 진술되었던 바와 같이, CD151 단백질은 테트라스패닌 패밀리에 속하고, 이로 인해 세포외 루프 (extracellular loops)라고도 말하는 2가지의 세포외 도메인들 EC1 (18개 아미노산들, [40 - 47번] 서열) 및 EC2 (109개 아미노산들, [113 - 221번] 서열)을 포함한다.

본 발명에 따르면, 사용된 항체들은 세포외 도메인에 위치하는 적어도 하나의 에피토프에 결합할 수 있다. 바람직하게, 상기 항체는 EC1 및/또는 EC2 루프들에 스스로 고정될 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 각각 CD151 단백질의 아미노산들 40 - 47번 및 113 - 221번에 해당하는 세포외 루프 1 (EC1) 및/또는 2 (EC2), 바람직하게는 EC2에 포함되는 에피토프에 결합할 수 있는 적어도 하나의 항-CD151 항체, 또는 그의 기능적 단편들의 하나의 용도가 기술된다.

EC1 루프 [40 - 57번]는 18개 아미노산들을 포함하고 2002.2 Da의 이론적인 무게를 가진다.

EC2 루프 [113 - 221번]는 N-당화 (N-glycosylation) 부위 (159번 Asn 잔기) 및 3개의 디설파이드 결합들을 형성하는 6개의 시스테인 잔기들을 가진다. 테트라스패닌, 특히 CD151의 EC2 루프의 구조적인 모델은 테트라스패닌 CD81의 EC2 루프의 삼차원 구조를 기초로 하여 제안되어 왔다 (Seigneuret et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 40055-40064). 본 모델에 따르면, 테트라스패닌은 3α 헬릭스들로 구성되는 공통적이면서 상대적으로 보존되는 스캐폴드 및 특이적 가변 도메인을 가진다. CD151의 경우, 본 스캐폴드는 [113 - 157번] 및 [209 - 221번] 부위들로 구성되는 것으로 생각되고, 가변 도메인은 [158 - 208번] 부위로 구성되는 것으로 생각된다.

EC2 루프의 가변 도메인은 보다 특히 인테그린 패밀리의 단백질들과 CD151의 특이적 상호작용에 관여하는 것으로 생각된다. 유도돌연변이화 (directed mutagenesis) 실험들은 특히 인테그린 α3β1 또는 α6β4과 같은 소정의 라미닌 수용체 인테그린들과 CD151을 연관시켜서, 부위 [193 - 208번] 보다 정확하게는 트리펩타이드 QRD [194 - 196번] 또한 192번 위치에서 시스테인 잔기의 중요성을 보여주었다 (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309).

보다 더 바람직하게, 본 발명은 EC2 부위의 에피토프에 결합할 수 있는 적어도 하나의 항-CD151 항체, 또는 그의 기능적 단편들의 하나의 용도를 지향한다.

새로운 관점에서, 본 발명은 다음의 핵산들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산에 관한 것이다:

a) 상기 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 항체, 또는 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나를 코딩하는 DNA 또는 RNA 핵산;

b) 상기 본 명세서의 a)에서 정의된 바와 같은 핵산에 상보적인 핵산;

c) 서열번호 16 내지 18, 또는 34 내지 36, 39, 40, 45 또는 54 내지 61 또는 74 내지 85의 핵산 서열들의 적어도 하나와 또는 최적의 정렬 이후에 상기 서열들과 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도를 가지는 서열과 높은 엄격도의 조건들 하에서 혼성화할 수 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드들의 핵산.

더욱 바람직하게는, 다음의 서열들의 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 핵산 서열들과 높은 엄격도의 조건들 하에서 혼성화할 수 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드들의 핵산이다:

- 서열번호 16의 서열로부터 기원하고 서열번호 7 서열의 112 - 218번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 17의 서열로부터 기원하고 서열번호 8 서열의 119 - 448번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 18의 서열로부터 기원하고 서열번호 9 서열의 119 - 445번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 34의 서열로부터 기원하고 서열번호 25 서열의 108 - 214번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 35의 서열로부터 기원하고 서열번호 26 서열의 120 - 449번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 36의 서열로부터 기원하고 서열번호 27 서열의 120 - 446번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 39의 서열로부터 기원하고 서열번호 37 서열의 108 - 214번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 40의 서열로부터 기원하고 서열번호 38 서열의 120 - 449번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 45의 서열로부터 기원하고 서열번호 44 서열의 139 - 463번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 74의 서열로부터 기원하고 서열번호 62 서열의 108 - 214번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 75의 서열로부터 기원하고 서열번호 63 서열의 108 - 214번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 76의 서열로부터 기원하고 서열번호 64 서열의 108 - 214번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 77의 서열로부터 기원하고 서열번호 65 서열의 108 - 214번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 78의 서열로부터 기원하고 서열번호 66 서열의 120 - 449번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 79의 서열로부터 기원하고 서열번호 67 서열의 120 - 449번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 80의 서열로부터 기원하고 서열번호 68 서열의 120 - 449번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 81의 서열로부터 기원하고 서열번호 69 서열의 120 - 449번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 82의 서열로부터 기원하고 서열번호 70 서열의 120 - 444번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 83의 서열로부터 기원하고 서열번호 71 서열의 120 - 444번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 84의 서열로부터 기원하고 서열번호 72 서열의 120 - 444번 aa 단편을 인코딩하는 서열;

- 서열번호 85의 서열로부터 기원하고 서열번호 73 서열의 120 - 444번 aa 단편을 인코딩하는 서열.

하기 본 명세서에서 표 4는 본 발명에 따른 항체들에 관한 서로 다른 뉴클레오타이드 서열들을, IMGT에 따라 정의된 CDR 서열들 또한 키메라 경쇄들 및 중쇄들과 함께 정리하고 있다.

하기 본 명세서에서 표 5는 본 발명에 따른 항체들에 관한 서로 다른 뉴클레오타이드 서열들을, IMGT에 따라 정의된 CDR 서열들 또한 서로 다른 인간화 경쇄들 및 중쇄들과 함께 정리하고 있다.

본 발명의 기술내용에서 상호 교환적으로 사용될 용어들, 핵산 (nucleic acid), 핵의 (nucleic) 또는 핵산 서열 (nucleic acid sequence), 폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide), 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide), 폴리뉴클레오타이드 서열 (polynucleotide sequence), 뉴클레오타이드 서열 (nucleotide sequence)은, 변형되어 있는지 상관없이 핵산의 단편 또는 부위를 정의할 수 있는 비-자연적 뉴클레오타이드들을 포함하거나 포함하지 않는, 뉴클레오타이드들의 명확한 공연쇄 (concatenation)를 말하는 것으로 이해되고, 이는 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA 또한 상기 DNAs의 전사 산물들에 동등하게 해당될 수 있다.

본 명세서에서는 본 발명이 그들의 자연적 염색체 환경, 즉 자연적 상태에서의 뉴클레오타이드 서열들에 관한 것이 아니라는 점도 역시 이해되어야 한다. 그들은 분리되었던 및/또는 정제되었던 서열들이고, 즉 그들은 예를 들어 복제에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 추출되었으며, 그들의 환경은 적어도 부분적으로는 변형되었던 것이다. 또한 본 명세서에서, 그들은 예를 들어 숙주세포들을 사용하는 유전적 재조합에 의해 획득되거나 또는 화학적 합성에 의해 획득되는 분리된 핵산들을 말하는 것으로도 이해된다.

바람직한 서열과 최적의 배열 이후에 적어도 80%, 바람직하게는 85%, 90%, 95% 및 98%의 일치도 퍼센트를 가지는 핵산 서열들은 기준 핵산 서열들에 대하여 특히 결실 (deletion), 절단 (truncation), 연장 (extension), 키메라 융합 (chimeric fusion) 및/또는 치환 (substitution), 특히 점 치환 (pointwise substitution)과 같은 소정의 변형들을 가지는 핵산 서열들을 가르키는 것으로 이해된다. 바람직하게, 그들은 서열들이 유전적 암호의 반복성 (degeneracy)으로 인해 기준 서열과 동일한 아미노산 서열들을 코딩하는 서열이거나, 기준 서열들과 특이적으로 혼성화할 수 있는 상보적인 서열들, 바람직하게는 특히 하기 본 명세서에서 정의된 바와 같은 높은 엄격도의 조건들 하에서 혼성화할 수 있는 것들이다.

높은 엄격도의 조건들 하에서의 혼성화 (hybridization)는 온도 및 이온 강도에 대한 조건들이 선택되어 그들이 DNA의 두 개 상보적인 단편들 간에 혼성화를 유지하도록 허용하는 것을 의미한다. 설명에 의하여, 상기 본 명세서에서 기술된 폴리뉴클레오타이드 단편들을 정의할 목적으로 한 혼성화 단계의 높은 엄격도 조건들은 다음과 같은 것이 유리하다.

DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화는 두 단계로 수행된다: (1) 5 x SSC (1 x SSC 는 0.15 M NaCl + 0.015 M 소듐 사이트레이트의 용액에 해당한다), 50% 포름아마이드, 7% 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 10 x 덴하르트 (Denhardt'), 5% 덱스트란 설페이트, 1% 연어정자 DNA를 포함하는 포스페이트 완충용액에 넣어 42℃로 3시간 동안 전혼성화 (prehybridization); (2) 탐침 크기에 의존적인 온도에서 (예로, > 100개 뉴클레오타이드들의 탐침 크기의 경우 42℃) 20시간 동안 적절한 혼성화, 이어서 2 x SSC + 2% SDS에 넣어 20분 동안 20℃로 2번 세척, 0.1 x SSC + 0.1% SDS에 넣어 20분 동안 20℃로 1번 세척. 최종 세척은 > 100개의 뉴클레오타이드의 탐침 크기의 경우 0.1 x SSC + 0.1% SDS에 넣어 30분 동안 60℃로 수행된다. 정해진 크기의 폴리뉴클레오타이드를 위한 상기 본 명세서에서 기술된 높은 엄격도는 샘브룩 등의 가르침에 따라 더 크거나 더 작은 크기의 올리고뉴클레오타이드들의 경우에도 당업자에 의해 적응될 수 있다 (Sambrook et al., 1989, 분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼 제 2판, 콜드 스프링 하버).

또한 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 특히 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열들을 포함하는 클로닝 및/또는 발현 벡터들를 지향한다.

본 발명에 따른 벡터들은 바람직하게 특정한 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열들의 발현 및/또는 분비를 허용하는 요소들 (elements)를 포함한다. 다음으로 벡터는 프로모터, 해독 개시 및 종결 신호들 또한 적절한 전사 조절 부위들도 포함해야 한다. 이것은 숙주세포에서 안정한 방식으로 유지될 수 있어야 하고, 임의적으로 해독된 단백질의 분비를 결정하는 (specifying) 특정한 신호를 가질 수 있다. 이들 다양한 요소들은 당업자에 의해 사용된 세포 숙주의 기능으로서 선택되고 최적화될 것이다. 이러한 효과를 위해, 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열들은 선택된 숙주 내에서 자가-복제하는 (self-replicating) 벡터 내로 삽입될 수 있거나 선택된 숙주의 통합 벡터들 (integrative vector)이 될 수 있다.

이러한 벡터들은 당업자에 의해 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있고 그 결과 얻은 클론들은 리포펙션 (lipofection), 전기천공법 (electroporation), 열 충격 (heat shock) 또는 화학적 방법들과 같은 표준 방법들에 의해 적합한 숙주 내로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터들은, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 기원의 벡터들이다. 그들은 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열들을 클론하거나 발현하도록 숙주 세포들을 형질전환하는 데 유용하다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환되거나 이를 포함하는 숙주 세포들도 포함한다.

세포 숙주는 원핵성 또는 진핵성 시스템들, 예를 들어 박테리아 세포들 뿐만 아니라 효모 세포들 또는 동물 세포들, 특히 포유동물 세포들로부터 선택될 수 있다. 곤충 세포들 또는 식물 세포들도 역시 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 인간들을 제외한, 본 발명에 따른 형질전환된 세포를 포함하는 동물들에 관한 것이다.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편들의 하나를 생산하는 방법에 관한 것이다:

a) 적합한 배양 배지 및 적합한 배양 조건들 하에서 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양; 및

b) 상기 배양 배지로부터 또는 상기 배양된 세포들로부터 생산된 상기 항체, 또는 그의 기능적 단편의 회수.

본 발명에 따른 형질전환된 세포들은 본 발명에 따른 재조합 폴리펩타이드들의 제조 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 재조합 형태로 제조 방법들은 벡터 및/또는 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포를 사용하는 것을 특징으로 하고, 그들 자체도 본 발명에 포함된다. 바람직하게, 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포는 상기 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건들 하에서 배양되고, 상기 재조합 펩타이드는 회수된다.

진술되었던 바와 같이, 세포 숙주는 원핵성 또는 진핵성 시스템들로부터 선택될 수 있다. 상세하게는, 이러한 원핵성 또는 진핵성 시스템에서 분비를 용이하게 하는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열들을 확인하는 것이 가능하다. 따라서, 이러한 서열을 보유하는 본 발명에 따른 벡터는 분비될 것을 의도하는 재조합 단백질의 생산에서 유리하게 사용될 수 있다. 따라서. 관심있는 이들 재조합 단백질들의 정제는 그들이 숙주 세포들의 내부에 보다는 오히려 세포 배양의 상청액에 존재하는 사실에 의해 용이해질 것이다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드들을 화학적 합성에 의해 제조하는 것도 역시 가능하다. 이러한 제조 방법도 역시 본 발명의 주요 쟁점에 포함된다. 당업자라면 단편들의 응축 (condensation) 수단에 의한 또는 용액에서의 통상적인 합성에 의한 화학적 합성의 방법들, 예를 들어 고체 상들을 사용하는 기법들 (특히 Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd Ed., (1984)를 참고하라) 또는 부분적 고체 상들을 사용하는 기법들을 숙지하고 있다. 해당하는 비-자연적인 아미노산들을 포함할 수 있는 화학적 합성에 의해 획득되는 폴리펩타이드들도 역시 본 발명에 포함된다.

본 발명에 따른 방법에 의해 획득될 수 있는 항체들, 또는 그들의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나도 또한 본 발명에 포함될 수 있다.

보다 또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 상기 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 추가적으로 이중특이적이고, 즉 CD151 이외에도 인간 단백질 또는 인간 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체에 관한 것이다.

이중특이적 (bispecific), 또는 이중기능적 (bifunctional) 항체들은 두 개의 서로 다른 가변 부위들이 동일한 분자에 결합되는 2세대 모노클론 항체들을 구성한다 (Hollinger and Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev. 18: 411-419). 그들의 유용성은 새로운 효과기 기능들을 채용하거나 또는 종양 세포들의 표면에 다수의 분자들을 표적시키는 그들의 능력에 의해 진단 분야 및 치료적 분야 둘 다에서 발휘되어 왔다. 이들 항체들은 화학적 방법들 (Glennie M J et al. 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al. 1995 J. Hemat. 377-382) 또는 체세포 방법 (Staerz U.D. and Bevan M.J. 1986 PNAS 83, 1453-1457; Suresh M. R. et al. 1986 Method Enzymol. 121: 210-228)뿐만 아니라, 바람직하게는 이종이중합 (heterodimerization)를 허용하고 이에 의해 추척하는 항체를 정제하는 방법을 용이하게 하는 유전적 조작 기법들에 의해 획득될 수 있다 (Merchand et al. 1998 Nature Biotech. 16: 677-681).

이들 이중특이적 항체들은 완전한 IgGs로서, 이중특이적 Fab'2s로서, Fab'PEGs로서 또는 다이아체들로서 또는 이중특이적 scFvs로서 뿐만 아니라 두 개의 고정 부위들이 각각의 표적된 항원 또는 그의 단편들을 위해 존재하는 사가 (tetravalent) 이중특이적 항체로서 상기 본 명세서에 기술된 바와 같이 제작될 수 있다 (Park et al., 2000, Mol. Immunol. 37(18): 1123-30).

경제적인 장점 이외에도 이중특이적 항체의 생산 및 투여가 두 개의 특이적 항체들의 생산보다 어렵지 않은 사실로 인해, 이러한 이중특이적 항체들의 사용은 치료의 독성을 감소시키는 장점을 가진다. 이중 특이적 항체의 사용은 사실상 순환하는 항체들의 전반적인 양 또한 그 결과, 가능한 독성을 감소시키는 것을 가능하게 만든다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 이중특이적 항체는 이가 (divalent) 또는 사가 (tetravalent) 항체이다.

마지막으로, 본 발명은 상기 본 명세서에서 기술되는 바와 같이 약제로서의 항체, 또는 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나를 지향한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나로 구성되는 화합물을 활성 성분으로서 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 항체에는 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체가 첨가될 수 있다.

또한 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 또한 상기 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 추가적으로 동시적, 개별적 또는 시간차 사용을 위한 조합 산물로서 적어도 하나의 다른 항체, 세포독성/세포증식 억제제, 세포 독소 또는 방사성원소를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

"동시적 사용 (simutaneous use)"는 하나 및 동일한 약제학적 형태에 포함되는 본 발명에 따른 조성물의 두 가지의 화합물들의 투여로서 이해된다.

"개별적 사용 (separate use)"은 별도의 약제학적 형태에 포함되는 본 발명에 따른 조성물의 두 가지의 화합물들의 일시적 (at the same time) 투여로서 이해된다.

"시간차 사용 (time-staggered use)"은 각각 별도의 약제학적 형태에 포함되는 본 발명에 따른 조성물의 두 가지의 화합물들의 연속적인 투여로서 이해된다.

일반적인 방식으로, 본 발명에 따른 조성물은 암 치료의 효능을 상당히 증가시킨다. 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 항체의 치료적 효과는 세포 독성 제제의 투여에 의해 예측되지 못하는 방식으로 강화된다. 본 발명에 따른 조성물에 의해 생산되는 또 다른 주요한 연속적 장점은 더 낮은 유효량의 활성 성분을 사용할 수 있는 가능성이 관한 것이고, 이는 출현할 수 있는 이차적인 효과들, 특히 세포독성 제제의 효과의 위험성을 회피하거나 감소시키는 것을 허용한다. 더우기, 본 발명에 따른 본 조성물은 당연히 기대되는 치료적 효과를 더욱 신속하게 달성하는 것을 허용한다.

"항-암 치료제들 (anti-cancer therapeutic agents)" 또는 세포독성 제제들 (cytotoxic agents)"은, 환자에게 투여될 때 환자에서 암의 발생을 치료하거나 예방하는 물질들로서 이해되어야 한다. 이러한 제제들의 비-제한적인 예로는, "알킬화 (alkylating)" 제제들, 항대사물질들 (antimetabolites), 항-종양 항생제 (anti-tumour antibiotics), 세포분열 저해제들 (mitotic inhibitors), 크로마틴 기능 저해제들 (chromatin function inhibitors), 항-혈관형성 제제들 (anti-angiogenesis agents), 항-에스트로겐들 (anti-ostrogens), 항-안드로겐들 (anti-androgens) 또는 면역조절인자들 (immunomodulators)가 언급될 수 있다.

이러한 제제들은 예를 들어 VIDAL에서 종양학 및 혈액학에 할애된 페이지의 "세포독성 (cytotoxiques)" (영어: 세포 독성 제제들) 란에서 언급되고; 본 서류에 참고문헌에 의해 언급되는 이러한 세포독성 화합물들은 여기에서 바람직한 세포독성 제제들로서 언급된다.

"알킬화제 (alkylating agents)"은 세포 내에서 분자라면 모두, 바람직하게는 핵산 (예로: DNA)에 공유적으로 결합하거나 이를 알킬화할 수 있는 물질이라면 모두를 말한다. 이러한 알킬화제들의 예들로는 메크로에타민 ( mechlorethamine), 클로암부실 (chlorambucil), 멜팔란 염산 (melphalan hydrochloride), 피포브로만 (pipobroman), 프레드니무스틴 디소듐 포스페이트 (prednimustine disodium phosphate) 또는 에스트라무스틴 (estramustine)과 같은 질소 머스타드; 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide), 알트레타민 (altretamine), 트로포스파마이드 (trofosfamide), 설포포스파마이드 (sulfofosfamide) 또는 이포스파마이드 (ifosfamide)과 같은 옥사조포린 (oxazophorines); 아지리딘 (aziridies) 또는 티오테파 (thiotepa), 트리에틸렌아민 (triethyleneamine) 또는 알테트라아민 (altetramine)과 같은 에틸렌-이민 (ethylene-imines); 카무스틴 (carmustine), 스트렙토조신 (streptozocin), 포테무스틴 (fotemustine) 또는 로무스틴 (lomustine)과 같은 니트로소우레아 (nitrosourea); 부설판 (busulfan), 트레오설판 (treosulfan) 또는 임프로설판 (improsulfan)과 같은 알킬 설포네이트 (alkyl sulfonates); 다카바진 (dacarbazine)과 같은 트리아젠 (triazenes); 또한 시스플라틴 (cisplatin), 옥사리플라틴 (oxaliplatin) 또는 카보플라틴 (carboplatin)과 같은 백금 복합체들이 언급될 수 있다.

"항대사물질 (antimetabolites)"은 소정의 활성들, 일반적으로 DNA 합성을 방해하여 세포 성장 및/또는 세포 대사를 차단하는 물질들을 말한다. 항대사물질들의 예로는 메토트렉세이트 (methotrexate), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 플로스우리딘 (floxuridine), 5-플루오로데옥시우리딘 (5-fluorodeoxyuridine), 카페시타빈 (capecitabine), 사이타라빈 (cytarabine), 플루다라빈 (fludarabine), 사이토신 아라비노사이드 (cytosine arabinoside), 6-머캅토퓨린 (6-mercaptopurine, 6-MP), 6-티오구아닌 (6-thioguanine, 6-TG), 클로로데옥시아데닌 (chlorodeoxyadenosine), 5-아자사이티딘 (5-azacytidine), 젬시타빈 (gemcitabine), 클라드리빈 (cladribine), 데옥시코포르마이신 (deoxycoformycin) 및 펜토스타딘 (pentostatin)이 언급될 수 있다.

"항-종양 항생제 (anti-tumour antibiotics)"는 DNA, RNA 및/또는 단백질의 합성을 방해하거나 저해할 수 있는 화합물들을 말한다. 이러한 항-종양 항생제의 예들로는 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 발루비신 (valrubicin), 미토크산트론 (mitocantrone), 닥티노마이신 (dactinomycin), 미스라마이신 (mithramycin), 플리카마이신 (plicamycin), 미토마이신 C (mitomycin C), 블레오마이신 (bleomycin) 및 프로카바진 (procarbazine)을 포함한다.

"세포분열 억제제 (mitotic inhibitors)"는 세포 주기 (cell cycle) 및 세포 분열 (mitosis)의 정상적인 진행을 막는다. 일반적으로 파크리탁셀 (paclitaxel) 및 독세탁셀 (docetaxel)과 같은 미세소관 저해제들 (microtubule inhibitors) 또는 "탁셀류 (taxoids)"는 세포 분열을 저해할 수 있다. 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (ncristine), 빈데신 (vindesine) 및 비노렐빈 (vinorelbine)과 같은 빈카 알칼로이드류 (vinca alkaloids)도 역시 세포 분열을 저해할 수 있다.

"크로마틴 기능 저해제 (chromatin function inhibitors)" 또는 "토포이소머라제 저해제 (topoisomerase inhibitors)"는 토포이소머라제 I 및 Ⅱ와 같은 크로마틴 리모델링 단백질들의 정상적인 기능을 저해하는 물질들을 말한다. 이러한 저해제들의 예들로는 토포이소머라제 I의 경우 캄프톤테신 (camptothecin) 및 이리노테칸 (irinotecan) 또는 토포테칸 (topotecan)과 같은 그의 유도체들도 포함하고, 토포이소머라제 Ⅱ의 경우 에토포사이드 (etoposide), 에티포사이드 포스페이트 (etiposide phosphate) 및 테니포사이드 (teniposide)를 포함한다.

"항-혈관형성 제제 (anti-angiogenesis agents)"는 혈관들의 성장을 저해하는 약물, 화합물, 물질 또는 제제라면 모두를 말한다. 항-혈관형성 제제들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 라족신 (razoxin), 마리마스탯 (marimastat), 바티마스탯 (batimastat), 프리노마스탯 (prinomastat), 태노마스탯 (tanomastat), 일로마스탯 (ilomastat), CGS-27023A, 할로푸지논 (halofuginone), COL-3, 네오바스탯 (neovastat), BMS-275291, 탈리도마이드 (thalidomide), CDC　501, DMXAA, L-651582, 스쿠알라민 (squalamine), 엔도스타틴 (endostatin), SU5416, SU6668, 인터페론-알파 (terferon-alpha), EMD121974, 인터루킨-2 (interleukin-12), IM862, 안지오스타틴 (angiostatin) 및 비탁신 (vitaxin)을 포함한다.

"항-에스트로겐 (anti-ostrogens)" 또는 "항-에스트로겐 제제 (anti-oestrogen agents)"는 에스트로겐의 작용을 감소시키거나 길항하거나 저해하는 물질이라면 모두를 말한다. 이러한 제제들의 예들로는 태목시펜 (tamoxifen), 토레미펜 (toremifene), 라록시펜 (raloxifene), 드로록시펜 (droloxifene), 이오독시펜 (iodoxyfene), 아나스트로졸 (anastrozole), 레트로졸 (letrozole) 및 엑세메스탄 (exemestane)을 들 수 있다.

"항-안드로겐 (anti-androgens)" 또는 "항-안드로겐 제제 (anti-androgen agents)"는 안드로겐의 작용을 감소시키거나 길항하거나 저해하는 물질이라면 모두를 말한다. 항-안드로겐들의 예들로는 플루타마이드 (flutamide), 닐루타마이드 (nilutamide), 비칼루카마이드 (bicalutamide), 스피로노락톤 (spironolactone), 사이프로테론 아세테이트 (cyproterone acetate), 피나스테라이드 (finasteride) 및 시미티딘 (cimitidine)을 들 수 있다.

면역조절인자 (immunomodulators)는 면역계를 자극하는 물질들이다. 이러한 면역조절인자들의 예들로는 인터페론들 (interferons), 알데스루킨 (aldesleukin), OCT-43, 데니루킨 디플리톡스 (denileukin diflitox) 또는 인터루킨-2 (interleukin-2)와 같은 인터루킨들 (interleukins), 태소너민 (tasonermin)과 같은 종양괴사인자들 (tumour necrosis factors), 또는 렌티난 (lentinan), 시조피란 (sizofiran), 로퀴니멕스 (roquinimex), 피도티모드 (pidotimod), 페가데마제 (pegademase), 티모펜틴 (thymopentin), 폴리 I:C, 또는 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil)과 조합된 레바미졸 (levamosole)과 같은 다른 유형들의 면역조절인자들을 포함한다.

좀 더 자세한 사항을 위해, 당업자라면 프랑스 치료화학의 교사협회 (French Association of Teachers of Therapeutic Chemistry)에서 발행한 "화학적 치료의 특성, 제 6권, 항종양 약제 및 암의 치료에 대한 전망, TEC & DOC, 2003"이라는 제목의 매뉴얼을 참조할 수 있을 것이다.

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조합 산물 형태로의 상기 조성물은 상기 세포독성 제제가 동시적 사용을 위해 상기 항체에 화학적으로 결합되는 것을 특징으로 한다.

특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 조성물은 상기 세포독성/세포증식 억제제가 방추체 저해제 (spindle inhibitor) 또는 안정화제 제제들 (stabiliser agents), 바람직하게는 비노렐빈 (vinorelbine) 및/또는 빈플루닌 (vinflunine) 및/또는 빈크리스틴 (vincristine)으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

상기 세포독성 제제 및 본 발명에 따른 상기 항체 간의 결합을 용이하게 하기 위하여, 특히 결합될 두 가지 화합물들 간에 공간자 분자들 (spacer molecules) 예로 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리(알킬렌)글리콜류, 또는 아미노산들도 역시 도입하는 것이 가능하거나, 또 다른 구현예에서 본 발명에 따른 상기 항체와 반응할 수 있는 기능들이 도입되었던 상기 세포독성 제제들의 활성 유도체들을 사용하는 것이 가능할 것이다. 이들 결합 기법들은 당업자에게 알려져 있고 본 기술내용에서는 자세하게 기재되지 않을 것이다.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 상기 항체들의 적어도 하나, 그들의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나가 세포 독소 및/또는 방사성원소와 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 독소 또는 상기 방사성원소는 종양 세포의 성장 또는 증식을 방해할 수 있고, 특히 상기 종양 세포를 전적으로 불활성화할 수 있다.

또한 바람직하게 상기 독소는 장내세균 (enterobacterial) 독소, 특히 슈도모나스 엑소톡신 A (Pseudomonas exotoxin A)일 수 있다.

치료에 사용된 방사성원소들 (또는 방사성 동위원소들)은 바람직하게 항체와 결합된, 감마선들을 방출하는 방사성 동위원소들이고, 바람직하게는 요오드 (iodide)¹³¹, 이트륨 (yttrium)⁹⁰, 금¹⁹⁹, 팔라듐 (palladium)¹⁰⁰, 구리⁶⁷, 비스무스 (bismuth)²¹⁷ 및 안티몬 (antimony)²¹¹이다. 베타선 및 알파선들을 방출하는 방사성 동위원소들도 역시 치료법에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 적어도 하나의 항체, 또는 그의 기능적 단편과 결합된 독소 또는 방사성원소는 상기 독소 또는 상기 방사성원소를 상기 적어도 하나의 항체에, 특히 연결 분자 (linking molecule)의 도입이 있거나 없이 두 가지 화합물들 간의 공유 결합에 의해 결합 가능하게 허용하는 수단이라면 모두를 말하는 것으로 이해된다.

결합체의 요소들 모두 또는 일부의 화학적 (공유적), 정전기적 또는 비-공유적 결합을 허용하는 제제들 중에서, 매우 특히, 벤조퀴논 (benzoquinone), 카보디이미드 (carbodiimide), 더욱 특히 EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]-카보디이미드 하이드로크로라이드), 디말레이미드 (dimaleimide), 디티오비스-니트로-벤조산 (DTNB), N-숙시니미딜 S-아세틸 티오아세테이트 (SATA), 하나 이상의 페닐아자이드 그룹과 함께 자외선 (UV)과 반응하는 하나 이상의 그룹들을 가지는 "결합 (bridging)" 제제들로서 명명되는 제제들, 또한 매우 바람직하게는 N-[4-(아지도살리실아미노)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아마이드 (APDP), N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 6-하이드라진-니코틴아미드 (HYNIC)가 언급될 수 있다.

매우 특별하게 방사성원소들을 위한 또 다른 형태의 결합은 이중기능적 이온 킬레이트인자 (bifunctional ion chelator)를 사용하는 것으로 구성될 수 있다.

이들 킬레이트제들 (chelators) 중에는, 결합 금속들 특히 방사성 금속들 및 면역글로불린들을 결합시키기 위해 개발되었던 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 DTPA (디에틸렌트리아미노펜타아세트산)으로부터 유래한 킬레이트제들이 언급될 수 있다. 따라서, DTPA 및 그의 유도체들은 리간드-금속 복합체의 안정성 및 경도 (rigidity)를 증가시키도록 탄소 사슬 위에서 서로 다른 그룹들로 치환될 수 있다 (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); 미국특허 제 US 4,831,175호).

예를 들어, TPA (디에틸렌트리아미노펜타아세트산) 및 그의 유도체들은 의약품 및 생물학에서 그의 자유형 형태 또는 금속 이온과 복합체의 형태로 오래 동안 아주 널리 사용되어 왔으며, 금속 이온들과 안정한 킬레이트들을 형성하고 또한 암 치료법에서 방사성 면역결합체들 (radioimmunoconjugates)의 개발을 위한 항체들과 같은 치료적 또는 진단적 흥미가 있는 단백질들에 결합하는 주목할만한 특징을 가진다 (Meases et al., (1984); Gansow et al. (1990)).

또한 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 결합체를 형성하는 상기 적어도 하나의 항체는 그의 기능적 단편들, 특히 scFv 단편들과 같은 Fc 성분이 결여된 단편들로부터 선택된다.

본 발명은 추가적으로 암의 예방 또는 치료를 위한, 또는 암의 예방 또는 치료 바람직하게는 암의 치료에 사용되는 그의 용도들을 위한 본 발명에 따른 항체 또는 조성물을 포함한다.

동일한 방식으로, 본 발명은 암의 예방 또는 치료를 위해 의도된 약제의 제조에 사용되는 본 발명에 따른 항체 또는 조성물의 용도를 포함한다.

또한 본 발명은 종양 세포의 증식을 저해하려고 의도된 약제의 제조에 있어서 항체, 또는 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나, 바람직하게는 인간화된 것들 및/또는 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다. 일반적인 방식으로, 본 발명은 암의 예방 또는 치료 목적을 위해 의도된 약제의 제조에 있어서 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나, 바람직하게는 인간화된 것들 및/또는 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다.

예방되고 및/또는 치료될 수 있는 암들 중에는, 전립선암 (prostate cancer), 골육종 (osteosarcoma), 폐암 (lung cancer), 유방암 (breast cancer), 자궁내막암 (endometrial cancer), 결장암 (colon cancer), 다발성 골수종 (multiple myeloma) 또는 난소암 (ovarian cancer), 췌장암 (pancreatic cancer) 또는 기타 다른 암인 것이 바람직하다.

바람직하게, 상기 암은 전립선암, 폐암, 결장암, 유방암 및/또는 췌장암으로부터 선택된 암이다.

보다 또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 CD151의 발현 수준과 연관된 질환들을 위한 바람직하게는 시험관내 진단 방법에 있어서 본 발명에 따른 항체의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 CD151 단백질의 비정상적 존재가 의심되는 상기 생물학적 시료로부터 시작하여 CD151 단백질의 과다발현 (overexpression) 또는 과소발현 (underexpression)을 가지는 질환들을 시험관내에서 진단하는 방법을 지향하고, 상기 방법은 상기 생물학적 시료를 본 발명에 따른 항체와 접촉하도록 나두는 것으로 구성되고 상기 항체는 적절한 경우 표지되는 것이 가능하다.

바람직하게, 상기 진단 방법에 있어서 CD151 단백질과 연관된 질환들은 암들이 될 것이다.

상기 항체, 또는 그의 기능적 단편들의 하나는 검출가능한 (detectable) 및/또는 정량가능한 (quantifiable) 신호를 획득하도록 표지된 면역결합체 또는 항체의 형태일 수 있다.

본 발명에 따라 표지된 항체들 또는 그들의 기능적 단편들은, 예를 들어 퍼옥시다제 (peroxidae), 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase), α-D-갈락토시다제 (α-D-galactosidase), 글루코스 옥시다제 (glucose oxidase), 글루코스 아밀라제 (glucose amylase), 카보닉 안하이드라제 (carbonic anhydrase) 아세틸-콜린에스터라제 (acetyl-cholinesterase), 라이소자임 (lysozyme), 말레이트 디하이드로게나제 (malate dehydrogenase) 또는 글루코스-6 포스페이트 디하이드로게나제 (glucose-6 phosphate dehydrogenase)와 같은 효소들, 또는 바이오틴 (biotin), 디옥시게닌 (digoxigenin) 또는 5-브로모-데옥시우리딘 (5-bromo-deoxyuridine)과 같은 분자와 결합될 수 있는 면역결합체들로도 명명되는 항체들을 포함한다. 형광 표지들도 역시 본 발명에 따른 항체들, 또는 그들의 기능적 단편들과 결합될 수 있고, 특히 플루오레신 (fluorescein) 및 그의 유도체들, 플루오로크롬 (fluorochrome), 로다민 (rhodamine) 및 그의 유도체들, GFP (녹색 형광 단백질, Green Fluorescent Protein), 단실 (dansyl), 엄벨리페론 (umbelliferone) 등이 포함된다. 이러한 결합체들에서, 본 발명의 항체들 또는 그들의 기능적 단편들은 당업자에게 알려져 있는 방법들에 의해 제조될 수 있다. 그들은 효소들 또는 형광 표지들에 직접적으로, 또는 폴리알데하이드 (polyaldehyde), 예로 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 또는 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DPTA)와 같은 공간자 그룹 (spacer group) 또는 연결 그룹 (linking group)에 의해, 또는 상기 본 명세서에서 치료적 결합체들로 언급된 것들과 같은 결합 제제들의 존재 시 결합될 수 있다. 플루오레신-유형의 표지들을 포함하는 결합체들은 이소티오시아네이트 (isothiocyanate)와의 반응에 의해 제조될 수 있다.

또한 기타 다른 결합체들로는 루미놀 (luminol) 및 디옥세탄 (dioxetanes)과 같은 화학발광 표지들, 루시페라제 (luciferase) 및 루시페린 (luciferin)과 같은 생물발광 표지들, 또는 요오드 (iodide)¹²³, 요오드¹²⁵, 요오드¹²⁶, 요오드¹³³, 브로민 (bromine)⁷⁷, 테크네티움 (technetium)^99m, 인디움 (indium)¹¹¹, 인디움^{113 m}, 갈륨 (gallium)⁶⁷, 갈륨⁶⁸, 루테늄 (ruthenium)⁹⁵, 루테늄⁹⁷, 루테늄¹⁰³, 루테늄¹⁰⁵, 수은 (mercury)¹⁰⁷, 수은²⁰³, 레늄 (rhenium)^99m, 레늄¹⁰¹, 레늄¹⁰⁵, 스캔듐 (scandium)⁴⁷, 텔륨 (tellium)^121m, 텔륨^{122 m}, 텔륨^{125 m}, 툴륨 (thulium)¹⁶⁵, 툴륨¹⁶⁷, 툴륨¹⁶⁸, 플루오린 (fluorine)¹⁸, 이트리움 (yttrium)¹⁹⁹, 요오드¹³¹와 같은 방사성 표지들을 포함할 수 있다. 당업자에게 알려진 방사성 동위원소들을 항체들에 직접적으로 또는 상기 본 명세서에서 언급된 EDTA 또는 DTPA와 같은 킬레이팅 제제를 통해 결합시키는 방법들은 진단학에서 방사성 요소들로서 사용될 수 있다. 따라서 클로라민 T 기법 [Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194: 495]에 의한 [I¹²⁵]Na를 사용한 표지 (labelling), 크록포드 등의 기법 (Crockford et al., 미국 특허 제 US 4 424 200호)에 의한 테크네티움^{99 m}을 사용한 표지, 또는 나토위치 (Hnatowich, 미국 특허 제 US 4 479 930호)에 의해 기술된 바 있는 DTPA를 통해 고정되는 표지가 언급될 수 있다.

본 발명은 또한 생물학적으로 활성을 가진 화합물의 CD151 단백질을 발현하거나 과다발현하는 세포에 특이적 표적화 (specific targeting)가 의도된 약물의 제조에 있어서 본 발명에 따른 항체의 용도에 관한 것이다.

본 명세서에서 생물학적으로 활성을 가진 화합물은 세포들의 활성, 특히 그들의 성장, 그들의 증식, 또는 유전자들의 전사 또는 해독을 변형시킬 수 있는, 특히 저해할 수 있는 화합물이라면 모두를 말하는 것으로 이해된다.

본 발명은 바람직하게 표지된 특히 방사성 표지된 본 발명에 따른 항체, 또는 그의 기능적 단편들의 하나를 포함하는 생체내 진단 반응액 (diagnostic reagent), 또한 의학적 영상촬영 (medical imaging)에 있어서 특히 세포에 의한 CD151 단백질의 발현 또는 과다발현과 연관된 암의 검출에 있어서 그의 용도에도 역시 관한 것이다.

본 발명은 또한 약제로서의 본 발명에 따른 조합 산물의 형태로의 조성물 또는 항-CD151/독소 또는 방사성원소 결합체에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 조합 산물의 형태로의 조성물 또는 상기 결합체에는 부형제 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체가 첨가될 것이다.

본 발명의 기술내용에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는 이차적인 반응들을 유발하지 않고, 예를 들어 활성을 가진 화합물(들)의 투여를 용이하게 하거나 신체에서 그의 유효 기간 또는 효능을 증가시키거나 용액에서 그의 수용성을 증가시키거나 그의 보관을 향상시키도록 허용하는, 약제학적 조성물에 포함되는 화합물 또는 화합물들의 조합을 말하는 것으로 이해된다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 담체들은 잘 알려져 있고, 선택된 활성을 가진 화합물(들)의 특성의 기능 및 투여의 방식로서 당업자에 의해 응용될 것이다.

바람직하게는, 이들 화합물은 전신적 경로 (systemic route), 특히 정맥내 경로에 의해, 근육내, 피내, 복강내 또는 피하적 경로에 의해 또는 경구적 경로에 의해 투여될 것이다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체들을 포함하는 조성물은 시간차가 있는 다수의 횟수들로 투여될 것이다.

그들의 투여, 용량 섭생들 및 생약 형태들의 최적의 방식들은, 예를 들어 환자의 연령 또는 체중, 그의 또는 그녀의 일반적인 병폐의 중증도, 치료의 내성 및 확립된 이차적인 효과들와 같은 환자에게 적합한 치료를 확립하는 데 일반적으로 고려되는 판단기준에 따라 결정될 수 있다.

따라서 본 발명은 CD151을 발현하거나 과다발현하는 세포들에서 생물학적으로 활성을 가진 화합물을 특이적으로 표적하도록 의도된 약제의 제조에 있어서, 항체, 또는 그의 기능적 단편들의 하나의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 기타 다른 특징들 및 장점들은 실시예들 및 하기 본 명세서에서 설명이 주어진 도면들과 함께 본 기술내용의 나머지 부분에서 나타날 것이다.
도 1은 CD151 서열 상에 EC1 및 EC2 루프들이 존재하는 것을 보여주는 CD151 단백질의 뉴클레오타이드 및 단백질 서열들 (각각 서열번호 37 및 서열번호 38)을 나타낸 것이다.
도 2는 CD151 단백질이 속하는 테트라스패닌들의 구조, 또한 특히 두 가지의 세포외 루프들 EC1 및 EC2를 도시하는 도면을 나타낸 것이다.
도 3A 내지 3E 는 전립선암으로 고생하는 환자들에서 CD151 분자의 발현을 나타낸 것이다. 각 문자는 한 명의 환자의 연구에 해당하고, 각 환자의 경우에 상부 패널은 종양에 인접한 정상 조직에 해당하며 하부 패널은 종양 조직에 해당한다.
도 4A 내지 4E 는 폐암으로 고생하는 환자들에서 CD151 분자의 발현을 나타낸 것이다. 각 문자는 한 명의 환자의 연구에 해당하고, 각 환자의 경우에 상부 패널은 종양에 인접한 정상 조직에 해당하며 하부 패널은 종양 조직에 해당한다.
도 5A 내지 5D는 마우스 항체 203B6에 의한 CD151의 인식 분석을 NIH 3T3-CD151, PC3 및 A549 세포들의 표면 상에서 유동세포측정법 (flow cytometry)을 사용하여 나타낸 것이다.
도 6A 내지 6D는 마우스 항체 214B2에 의한 CD151의 인식 분석을 NIH 3T3-CD151, PC3 및 A549 세포들의 표면 상에서 유동세포측정법을 사용하여 나타낸 것이다.
도 7은 마우스 214B2 V- 및 J- 부위들 간의 정렬 또한 중쇄 및 경쇄의 가장 근접한 (closest) 마우스 배아계열 유전자들을 나타낸 것이다.
도 8은 214B2 경쇄의 인간화를 서로 다른 우선도 순위 (priority rank)로 나타낸 것이다. #1는 높은 우선도 (표적 인식, CDR 표현 및 전반적인 3D 구조에 주는 잠재적인 높은 임팩트)이고; #2는 중간 우선도이고; 또한 #3은 낮은 우선도 (표적 인식, CDR 표현 및 전반적인 3D 구조에 주는 잠재적인 낮은 임팩트)이다.
도 9는 214B2 중쇄의 인간화를 서로 다른 우선도 순위로 나타낸 것이다. #1는 높은 우선도 (표적 인식, CDR 표현 및 전반적인 3D 구조에 주는 잠재적인 높은 임팩트)이고; #2는 중간 우선도이고; 또한 #3은 낮은 우선도 (표적 인식, CDR 표현 및 전반적인 3D 구조에 주는 잠재적인 낮은 임팩트)이다.
도 10은 키메라 항체들 c203B6[IgG1] 및 c214B2[IgG1]의 웨스턴 블럿에 의한 특이도 연구를 나타낸 것이다.
도 11A 내지 11B는 마우스 Mabs 203B6 및 214B2의 재조합 EC2에 결합의 그들의 키메라 형태들: c203B6[IgG1] (A); c214B2[IgG1] (B)에 의한 저해를 나타낸 것이다.
도 13은 c214B2[IgG1]의 안드로겐-비의존성 전립선 세포암, PC3의 종양 성장에 미치는 시험관내 활성을 나타낸 것이다.
도 14는 Mab 214B2의 서로 다른 형태들의 PC3 세포 부착에 미치는 효과를 현미경적 분석으로 나타낸 것이다.
도 15A 내지 15B는 Mab 214B2의 서로 다른 형태들의 PC3 세포 부착에 미치는 효과를 ATP 검정법을 사용한 분석으로 나타낸 것이다. 각 웰에서 부착된 세포들의 수는 0개으로부터 200,000개 세포/웰까지 범위의 PC3 표준 곡선을 사용하여 결정되었다. 결과들은 다음과 같이 표현된다: 미처리된 세포가 대조군 (100%)으로 고려되고 처리된 세포들은 대조군의 %로서 표현된다.
도 16은 214B2 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열들 정렬을 인간 배아계열 hIGHV1-2*02 및 IGHJ6*01과 함께 나타낸 것이다. 214B2 VH 아미노산 서열은 선택된 인간 수여자 구조틀 서열들과 함께 정렬되고, 214B2 및 인간 배아계열 사이에 서로 다른 각 잔기에는 우선도 순위가 주어진다. 잔기들은 1은 가장 높은 우선도, 또한 4는 가장 낮은 우선도를 인코드하는 그들의 우선도 순위에 따라 역 돌연변이된다. Var1 내지 Var4 서열들은 굵게 표시된 역 돌연변이된 잔기들을 가진 214B2 VH 도메인의 조작된 인간화 변이체들에 해당한다. 변이체 1 (Var1)는 역 돌연변이되지 않고 가장 인간화된 (most human) 변이체를 나타낸다.
도 17은 214B2 경쇄의 아미노산 서열들 정렬을 인간 배아계열 IGKV1D-39*01 및 IGKJ2*01과 함께 나타낸 것이다. 214B2 VL 아미노산 서열은 선택된 인간 수여자 구조틀 서열들과 함께 정렬된다. Var1 내지 Var3 서열들은 굵게 표시된 역 돌연변이된 잔기들을 가진 214B2 VL 도메인의 조작된 인간화 변이체들에 해당한다. 변이체 1 (Var1)는 역 돌연변이되지 않고 가장 마우스화된 (most murine) 변이체를 나타낸다. 변이체 3은 5개의 역 돌연변이들을 보유한다.
도 18은 키메라 214B2 및 인간화 214B2의 서로 다른 변이체들에 의한 마우스 항체 m24B2의 교차 차단 (cross blocking)을 나타낸 것이다. 부모 항체 m214B2를 교차 차단하는 214B2의 인간화 변이체들 (hz214B2)의 활성은 인간 항원 CD151의 재조합 세포외 루프 2 (EC2)를 사용하여 엘라이자 (ELISA)에 의해 평가되었다. 인간화 변이체들의 활성은 키메라 214B2와 비교되었다. VH 변이체 2 및 3의 모든 조합들이 키메라 항체의 활성과 유사한 강한 활성을 보여주었다.
도 19는 바이오틴화 항체 m24B2를 교차 차단하여 인간화 항체들 hz214B2의 유동세포측정법 분석을 나타낸 것이다. EC2에서 부모 항체를 교차 차단하였던 214B2의 인간화 변이체들은 유동세포측정법으로 좀 더 평가되었다. 바이오틴화 항체 m24B2는 PC3 세포들 상에서 인간 CD151를 검출하는 데 사용되었다. 본 결합은 서로 다른 농도들의 214B2의 인간화 변이체들로 차단되었다. 키메라 214B2 항체가 비교군 (reverence)으로서 사용되었다. 인간화 변이체들 3 및 4 (Hz214B2VHVar3VLVar3 및 Hz214B2VHVar4VLVar4)는 가장 강한 교차 차단 활성 (B)을 보여주었다.
도 20은 항체들 c214B2 (G1), c214B2 (G2), Hz214B2VHVar3VLVar3 (G1) 및 Hz214B2VHVar4VLVar4 (G1)의 친화도의 BIA코아 (BIACore) 분석법을 나타낸 것이다. A는 항체들 Hz214B2VHVar3VLVar3 (G1), Hz214B2VHVar4VLVar4 (G1) 및 c214B2 (G1)의 BIA코아 센서그램 (sensorgram)이다. B는 항체-EC2 복합체의 친화도 상수 및 반감기이다.
도 21은 PC3 이종이식 모델 상에서 다양한 이소형들의 키메라 c214B2 Mab의 시험관내 활성을 나타낸 것이다. A는 c214B2[IgG4] 및 [IgG1](TH7) 또한 B는 c214B2[IgG2]이다.

실시예 1: CD151 분자의 발현 연구

CD151 단백질의 발현이 전립선암 또는 폐암으로 고생하는 환자들로부터 획득된 인간 조직들의 시료들에서 면역조직화학법 (immunohistochemistry, IHC)에 의해 조사되었다. 이들 환자들의 경우, 종양에 인접하는 정상 조직들의 슬라이드들이 사용가능하였고 따라서 이들은 정상 조직들 대비 종양 조직들에서의 발현 수준을 측정하도록 포함되었다.

이들 실험들의 경우, "조직 어레이 (Tissue array)" 유형의 시판되는 슬라이드들이 사용된다. 파라핀을 제거 (deparaffinsation)한 이후, 항원 탈피 (unmasking)가 펩신을 포함하는 효소 용액 (랩비전사 (Labvison) 참조번호 AP-9007-005)으로 30℃에서 수행된다. 본 단계는 물에 넣은 0.3% 과산화수소 (시그마사) 용액에 절편들을 배양하여 내인성 퍼옥시다제들의 제거 단계로 이어진다. 다음으로 비-특이적 부위의 포화가 울트라-V-블록 (Ultra-V-Block), (랩비전사, 참조번호 TA-125-UB) 용액을 사용하여 수행되고 또한 표지화 (labelling)가 5μg/ml의 최종 농도에서 사용되는 시판되는 마우스 항-CD151 항체 (세로테크사 (Serotech), 참조번호 MCA 1856)를 사용하여 수행된다. 마우스 IgG1 이소형 대조군 항체 (다코사이토메이션사 (DakoCytomation), 참조번호 X0931)는 음성 실험 대조군으로서 사용된다. 표지 영상화 (labelling visualization)는 인비전 듀얼 링크 (Envision Dual Link) 영상화 시스템 (다코사이토메이션사, 참조번호 K4061)를 사용하여 수행되고 또한 DAB 퍼옥시다제 기질의 기준은 다코사이토메이션사으로부터 나온 S3309이다.

도 3A 내지 3B에서 표현된 결과들은 전립선암을 발생시킨 많은 환자들이 CD151 분자의 과다발현을 나타내는 것을 보여준다. 본 과다발현은 연구된 환자들의 20%에게 매우 유의하거나 (환자들 A 및 C) 또는 적당 (moderate) 할 수 있다 (환자들 A 및 D). 자궁내막 세포들에서의 수준을 제외하고는 이에 해당하는 정상 전립선 조직들은 CD151을 발현하지 않거나 단지 조금만 발현하고, 발현되는 경우라도 샘 유형 (glandular type) 구조들에 제한되는 것으로 여겨지는 점이 주목된다. 환자 E는 CD151을 발현하지 않는 종양의 예를 보여준다.

폐암 (도 4A 내지 4C)의 경우에서는, 적당한 (환자 A) 내지 현저한 (환자 B) 발현이 정상 폐 조직의 소정의 세포들에서 관찰된다. 그러나, 종양 조직은 조밀하게 표지된 세포들의 매우 높은 밀도를 보여준다 (환자들 A 및 B). 환자 C는 CD151을 발현하지 않는 종양의 예를 보여준다.

실시예 2: 항체들의 생성 및 선별

BALB/c 마우스는 표면 상에 인간 CD151을 발현하는 20 x 10⁶개의 NIH 3T3 세포들을 사용하는 피하적 경로에 의해 면역화되었고, 이들 세포들은 이미 CD151 유전자로의 형질전환 (transfection)에 의해 생성되었던 것이다. 첫 번째 면역접종은 프런드 완전 아쥬반트 (Freund's complete adjuvant)의 존재 하에서, 다음의 2번은 프런드 불완전 아쥬반트의 존재 하에서 수행되었다. 융합 이전에 3일 동안, 10 x 10⁶개의 NIH 3T3-CD151 세포들의 최종 추가자극 (booster) 주사가 복강내 경로로 수행되었다. 다음으로 마우스 비장 세포들은 SP2/0-Ag14 마이엘로마 세포들과 1/1의 비율로 코흘러 및 밀스타인 (Kohler and Mistein)에 의해 기술된 통상적인 기법들을 사용하여 융합되었다.

다음으로 융합으로부터 생겨난 하이브리도마들로부터 나온 상청액들 내로 분비된 항체들은 CD151의 재조합 세포외 루프 EC2를 인식하는 능력에 대해 엘라이자 (ELISA)에 의해, 또한 인간 PC3 전립선암 종양 계열의 표면 상에서 발현되는 CD151은 유동 세포측정법에 의해 검색되었다.

엘라이자의 경우, 96-웰 플레이트들은 하룻 밤 동안 +4℃에서 PBS에 5μg/ml 농도로 녹인 재조합 세포외 루프 EC2를 사용하여 감작되었다 (sensitized). PBS로 세척한 이후에, 웰들은 PBS에 녹인 0.5% 젤라틴 용액으로 1시간 동안 37℃에서 포화시켰고, 다음으로 PBS로 다시 세척되었다. 하이브리도마 배양 상청액들은 희석하지 않고 평가되었다 (37℃에서 1시간 동안 배양). 고정된 (immobilised) EC2 루프에 고정된 항체는 퍼옥시다제-결합된 염소 항-마우스 IgG 폴리클론 항체 (잭슨사 (Jackson)/미국, 1/5000까지의 희석, 37℃에서 1시간) 또한 다음으로 퍼옥시다제 기질 (TMB, 인터킴사 (Interchim)/프랑스, 상온에서 10분)과의 연속적인 배양에 의해 검출된다. 반응은 1 M 황산의 첨가에 의해 정지되고 광학 밀도 (OD)는 450 nm 에서 측정된다.

유동세포측정법 (flow cytometry)은 96-웰 플레이트들 상에서 수행된다. 미희석된 하이브리도마 상청액들은 웰 내에 미리 도입되었던 100,000개의 PC3 세포들에 첨가된다. +4℃에서 20분 동안 배양한 이후 세척이 어어지고, 알렉사488 (Alexa488)-표지된 염소 항-마우스 IgG 폴리클론 항체 (몰레큘라 프로브사 (Molecular Probes), 1/500까지의 희석)이 첨가된다. 형광 강도 (fluorescence intensity, MFI)는 +4℃에서 20분 동안 좀 더 배양한 이후 세포형광측정기 (cytofluorimeter)의 조력으로 결정된다.

검색 과정의 마지막에는, 다음의 3가지 하이브리도마들이 선별되었다 (선택의 판단기준: 엘라이자의 경우 OD > 0.5 또한 유동세포측정법의 경우 MFI > 50): 203B6, 및 214B2. 이들 2가지의 하이브리도마들에 대해 획득된 결과들은 하기 표 6에 나타나 있다.

클로닝 이후, 각 선별된 하이브리도마의 클론은 증폭되었다. 생산된 항체들의 이소형들은 마우스 항체 이소형 결정 (isotyping) 키트 (SBA 클론타이핑 시스템, 서던 바이오테크사 (Southern Biotech))를 사용하여 각 배양 상청액에 대해 결정되었고, 다음으로 최종 특성분석 (characterization)이 엘라이자에 의해 (세포외 루프 EC2) 또한 유동세포측정법에 의해 마우스 계열 NIH 3T3 및 안정한 형질전환체 NIH 3T3-CD151 상에서, 또한 다음으로 폐암 A549, 전립선암 DU145 및 췌장암 BxPC3의 인간 종양 계열들 상에서, 이전에 기술된 조건들 하에서 수행되었다. 상청액들의 항체 농도는 엘라이자의 경우 5 μg/ml로 조절되고 유동세포측정법 분석의 경우 10 μg/ml로 조절된다. 획득된 결과들은 하기 표 7에 나타나 있다.

도 5A 내지 5D 또한 도 6A 내지 6B는 유동세포측정법에 의한 NIH 3T3-CD151, PC3 및 A549 세포들의 인식 프로파일들을 보여주고 있으며, 이들은 항체 203B6, 및 214B2에 대해 획득된 것이다. 이들 프로파일들은 항-CD151 항체 50-6 (ATCC CRL-2696)을 사용하여 획득된 것들과 비교가능하고 이들 항체들의 CD151에 대한 특이도를 보여준다.

다음으로 하이브리도마들은 75724 파리 시덱스 15, 닥테르 루 거리 25, 파스퇴르 연구소, 국립 미생물배양 수집기관, CNCM에 기탁되었다.

실시예 3: 키메라 및 인간화 항체들의 클로닝 및 생산

마우스 203B6 및 214B2 Mab의 키메라 및 인간화 형식들 (formats)이 설계되었다: 그들은 인간 C카파 (Ckappa) 또한 IgG1, IgG2 및 IgG4 중 하나의 불변 도메인들에 유전적으로 융합된, 관심 있는 마우스 항체들의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들에 해당한다. 유사하게, 하기 기술된 인간화 형태들은 인간 IgG1/카파 또는 IgG4/카파 분자들로서 생산되었다. 모든 재조합 Mabs는 pCEP4 발현 벡터 (인비트로겐사 (InVitrogen), 미국)를 가진 HEK293/EBNA 시스템을 사용하여 일시적 형질전환 시 생산된다.

203B6 및 214B2 Mab 경쇄 및 중쇄들 (키메라 또는 인간화)의 가변 도메인들에 해당하는 뉴클레오타이드 서열들 전부는 글로벌 유전자 합성 (Global gene synthesis)(진큐스트사 (Genecust), 룩셈부르그)에 의해 합성되었다. 그들은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 면역글로불린의 경쇄 [C카파] 또는 중쇄 [CH1-힌지-CH2-CH3] 둘 중 하나의 불변 도메인의 코딩 서열 전부를 보유하는 pCEP4 벡터 (인비트로겐사, 미국) 내로 서브클론되었다. 모든 클로닝 단계들은 실험실 매뉴얼 (Sambrook and Russel, 2001)에 기술된 바와 같이 통상적인 분자생물학 기법들, 또는 공급자의 안내서들에 따라서 수행되었다. 각 유전적 제작물은 빅 다이 종결인자 순환 서열결정 키트 (Big Dye terminator cycle sequencing kit) (어플라이드 바이오시스템사 (Applied Biosystems), 미국)를 사용하는 뉴클레오타이드 서열결정 (sequencing)에 의해 전적으로 검증되었고 또한 3100 유전적 분석기기 (3100 Genetic Analyzer) (어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 사용하여 분석되었다.

현탁배양-적응된 HEK293 EBNA 세포들 (인비트로겐사, 미국)은 6 mM 글루타민이 보충된 무혈청 배지 Excell 293 (SAFC 바이오사이언스사) 50 mL을 넣은 250 mL의 플라스크로 궤도 진탕기 (orbital shaker) 상에서 (110 rpm의 회전 속도) 일상적으로 배양되었다. 일시적 형질전환 (transient transfection)은 1 mg/mL의 최종 농도의 혼합된 플라스미드 DNA를 물에 녹여 제조된 직선상 25 kDa 폴리에틸렌이민 (PEI) (폴리사이언스사 (Polysciences))를 사용하는 2.10⁶개 세포/mL을 가지고 수행되었다 (1 : 1의 중쇄 대비 경쇄 플라스미드 비율의 경우 1.25 μg/mL의 최종 농도).

형질전환 4시간 이후에, 배양은 10⁶개 세포/mL의 최종 세포 밀도에 도달하도록 한 부피 (one volume)의 신선한 배양 배지로 희석되었다. 배양 공정은 세포 생존도 및 Mab 생산을 근거로 하여 감시되었다. 전형적으로, 배양액들은 4 내지 5일 동안 유지되었다. Mabs는 프로테인 A 레진 (GE 헬스케어사 (GE Healthcare), 미국) 상에서 통상적인 크로마토그래피 접근법을 사용하여 정제되었다.

서로 다른 Mabs 모두는 기능적 평가들에 적합한 수준들로 생산된다.

실시예 4: 마우스 항- CD151 항체 214B2 가변 도메인들의 인간화

마우스 214B2 항체로부터 나온 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들 VH 및 VL이 IMGT 라이브러리들 및 도구들 (http://imgt.cines.fr)을 사용하여 면역유전학적 분석에 착수되었다. 하기 기술된 인간화 전략은 독특한 IMGT 번호매김 방식에 근거하고 있다 (Lefranc, 1997). 먼저, 각 도메인을 위한 선택된 마우스 배아계열들이 도메인갭얼라인 (DomainGap Align) 도구를 사용하여, IMGT LIGM DB 데이타베이스에 대한 BLAST 추적에 의하여 확인되었다. 마우스 IGKV6-20*01 배아계열은 재배열된 214B2 V-부위와 97.9% 일치도를 수득하였고 또한 IGKJ2*01은 214B2 J-부위와 전적으로 일치하였다 (도 7). 중쇄에 관하여, 214B2 V-부위는 마우스 IGHVS30*01 배아계열에 가장 동종유래성 (homologous)이고 (약 96% 일치도, 도 7) 또한 J-부위에 관하여, 마우스 IGHJ4*01은 가장 근접한 J 배아계열 유전자에 해당한다 (94% 일치도, 하나의 분지 (divergent) 잔기, 도 7). 다양성 (diversity) D-배아계열 유전자는 마우스 IGHD5-1*01에 해당하고, 이것은 필수적으로 CDR3에 해당한다.

마우스 214B2 Mab 인간화의 예로서, CDR-이식 (CDR-grafting)에 의한 통상적인 전략이 하기에 기술된다. 각 중쇄 및 경쇄는 개별적으로 인간화되고 그의 각각의 키메라 또는 인간화 상대편과의 공동-발현에 의해 평가된다.

- 214B2 경쇄 VL 의 인간화

1번 Asn에 해당하는 비전형적인 잔기가 확인되었고, 이것은 일정 마우스 배아계열 V-유전자들에는 존재하지만 인간에서는 전혀 존재하지 않는다. 이것이 CDR1에 인접하여 위치하기 때문에, 선택된 인간 V-유전자들에서 발견되는 바와 같이 Glu로의 그의 변형은 유의해야 하고 평가되어야 한다 (도 8). 그렇지 못한 경우라면, 마우스 214B2 경쇄 CDRs를 이식하는 데 가장 적합한 인간 배아계열의 추적이 두 가지의 가능성 있는 사실들 (hits)을 확인시켜주었다. 첫 번째는 마우스 IGKV6-20*01과 가장 근접한 정도의 상동성 (homology)을 보여주는 인간 V-부위에 해당하고, 이것은 인간 IGKV3-7*02 배아계열 대립유전자이다 (68.4% 일치도). 그럼에도 불구하고, 그의 CDR1은 하나의 214B2보다 하나의 아미노산이 더 길고 따라서 이들 CDRs 고정물들 (anchors)은 궁극적으로 CDR1 이식에 가장 적합하지는 않다 (도 8을 참조하라). 두 번째의 인간 공여자 배아계열은 IGKV1D-39*01일 수 있고; 이것은 마우스 IGKV6-20*01에 64% 일치하지만 CDR 길이들은 일치한다 (6 : 3, 도 8). 214B2 VL 및 선택된 인간 V-유전자 사이에 각 분지된 잔기들의 잠재적인 중요성을 평가하는 판단기준은, 이에 제한되는 것은 아니지만 버니어 영역 (Vernier zone)에서 정착, CDR 고정물들에 근접한 위치, 동일한 인간 배아계열 그룹의 또 다른 대립유전자의 동일한 자리에서의 존재:를 포함한다.

IGKV6-20*01 V-유전자를 관하여, 버니어 영역 내에 있는 하나의 잔기는 m214B2 및 mIGKV6-20*01 둘 다와 비교하여 서로 다르고 (A84), 이것은 높은 우선도로 고려되어야 하며 첫 번째 경우에서 (#1, 도 8) 마우스와 같이 보존되어야 한다. 그렇지 못한 경우라면, 두 개의 중요한 잔기들은 CDR1 및 CDR2 고정물들 V39 및 N66에 해당하고, 마찬가지로 그들은 높은 우선도로서 순위가 매겨지고 첫 번째 경우에서 마우스와 같이 보존된다. 3개의 잔기들이 CDR 고정물들에 근접한 그들의 자리 (K24, Y68 및 H103, 도 8) 때문에 고려될 중간 우선도 잔기들로서 순위가 매겨진다. 남아있는 아미노산들 (#3으로서 순위가 매겨짐)은 인간화 중쇄의 전반적인 입체형태 및 CD151 인식에 약한 임팩트를 가지는 것 같고, 그들은 쉽게 그들의 인간 상대편에 의해 대체될 수 있다.

IGKV1D-39*01 V-유전자에 관하여, 버니어 영역 내에 있는 하나의 잔기는 m214B2 및 mIGKV6-20*01 둘 다와 비교하여 서로 다르고 (A84), 이것은 높은 우선도로 고려되어야 하며 첫 번째 경우에서 (#1, 도 8) 마우스와 같이 보존되어야 한다. 그렇지 못한 경우라면, 두 개의 중요한 잔기들은 CDR1 및 CDR2 고정물들 V39 및 N66에 해당하고, 마찬가지로 그들은 높은 우선도로서 순위가 매겨지고 첫 번째 경우에서 마우스와 같이 보존된다. 5개의 잔기들이 CDR 고정물들에 근접한 그들의 자리 (K24, S40, Y68 및 H103, 도 8) 또는 CDR1에 인접한 자리 (V3, 도 8) 때문에 고려될 중간 우선도 잔기들로서 순위가 매겨진다. 남아있는 아미노산들 (#3으로서 순위가 매겨짐)은 인간화 중쇄의 전반적인 입체형태 및 CD151 인식에 약한 임팩트를 가지는 것 같고, 그들은 쉽게 그들의 인간 상대편에 의해 대체될 수 있다.

J-부위에 관하여, 인간 IGKJ2*01 유전자는 m214B2 및 mIGKJ2*01 둘 다와 비교하여 1개의 분지된 잔기 (G)를 포함한다. 본 부위는 필수적으로 FR4에 해당하기 때문에, 이것은 첫 번째 경우에 전적으로 인간화될 것이다 (도 8).

IMGT-CDR3 서열 (GQTYSFPYT)은 서열 변형이 없이도 이식될 것이다.

- 214B2 중쇄의 인간화

마우스 214B2 중쇄 CDRs를 이식하는 데 가장 적합한 인간 배아계열의 추적은 인간 IGHV1-2*02 V-유전자의 대립유전자에 해당하는 하나의 선호적 사실을 확인시켜 주었다. 이것은 마우스 IGHVS130*01 배아계열 유전자와 66% 일치하고, CDR 길이들도 일치한다. 28개의 자리들이 그들의 FRs에서 214B2_VH 및 IGHV1-2*02 사이에 분지되어 있다 (divergent) (도 9). 매우 연관된 인간 IGHV1-46*03 배아계열도 마찬가지로 적합할 수 있고, 이것은 동일한 양의 분지된 잔기들을 수득하였고, 유사하게 28개 중 15개가 FR3에 위치하고 있다. 이들 28개의 각 분지된 잔기들의 잠재적인 중요성을 평가하는 판단기준은, 이에 제한되는 것은 아니지만 버니어 영역에서 정착, CDR 고정물들에 근접한 위치, 동일한 인간 배아계열 그룹의 또 다른 대립유전자의 동일한 자리에서의 존재:를 포함한다.

IGHV1-2*02 V-유전자를 관하여, 버니어 영역 내에 있는 5개의 잔기들이 m214B2 및 mIGHVS130*01 둘 다와 비교하여 서로 다르고 (I53, E55, A76, L78, V80), 이것은 높은 우선도로 고려되어야 하며 첫 번째 경우에서 (#1, 도 9) 마우스와 같이 보존되어야 한다. 그렇지 못한 경우라면, N68 및 E69가 CDR2 고정물에 근접한 그들의 자리 때문에 고려될 중간 우선도 잔기들로서 순위가 매겨진다 (도 9). 21개의 남아있는 아미노산들은 인간화 중쇄의 전반적인 입체형태 및 CD151 인식에 약한 임팩트를 가지는 것 같고, 그들은 쉽게 그들의 인간 상대편에 의해 대체될 수 있다.

IGHV1-46*03 V-유전자를 관하여, 버니어 영역 내에 있는 7개의 잔기들이 m214B2 및 mIGHVS130*01 둘 다와 비교하여 서로 다르고 (I53, E55, N66, A76, L78, V80, A87), 이것은 높은 우선도로 고려되어야 하며 첫 번째 경우에서 (#1, 도 9) 마우스와 같이 보존되어야 한다. 그렇지 못한 경우라면, N68 및 E69가 CDR2 고정물에 근접한 그들의 자리 때문에 고려될 중간 우선도 잔기들로서 순위가 매겨진다 (도 9). 19개의 남아있는 아미노산들은 인간화 중쇄의 전반적인 입체형태 및 CD151 인식에 약한 임팩트를 가지는 것 같고, 그들은 쉽게 그들의 인간 상대편에 의해 대체될 수 있다.

J-부위에 관하여, 인간 IGHJ6*01 유전자는 m214B2 및 mIGHJ4*01 둘 다와 비교하여 3개의 분지된 잔기들을 포함한다. 본 부위는 필수적으로 FR4에 해당하기 때문에, 이것은 첫 번째 경우에 전적으로 인간화될 수 있다 (도 9).

CDR3 (ARARSFYYAMDC)의 서열에 필수적으로 해당하는 다양성 D-유전자는 변형이 없이도 이식될 것이다.

상기에 기술된 아미노산들 모두는 고려해야 할 중요한 위치들이다. 이들 위치들의 각각에 대한 인간 대비 마우스 잔기의 모든 조합들이 인간화 공정 동안 고려될 것이다. 인간화된 형태들의 선택은 그들의 인간성 (humanness)의 정도에 근거할 것이고 시험관내 및 생체내 기능적 특성들을 보존할 것이다.

실시예 5: 웨스턴 블럿에 의한 항체 특이도

먼저 키메라 항체들 c214B2[IgG1] 및 c203B6[IgG1]의 특이도가 웨스턴 블럿에 의해 평가되었다. 간략하게, 정제된 재조합 큰 세포외 루프 EC2 (2 내지 8 μg) 및 HT-29 세포 용출물 (10 내지 50 μg)이 12% 아크릴아마이드 젤들 (바이오래드사 (BioRad)) 상에 로딩되었다. 비환원 조건들 하에서 전기영동 이후에, 단백질들은 니트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane)에 트랜스퍼되었고, 이는 좀 더 나아가 정제된 키메라 항체들 c214B2[IgG1] 및 c203B6[IgG1]를 사용하여 0.5 μg/mL 농도로 배양된 다음, 퍼옥시다제-결합된 토끼 폴리클론 항-인간 Ig (GE 헬스케어사)로 배양되었다. 단백질들은 화학발광 (chemiluminescence)에 의해 검출되었다. c214B2[IgG1] 및 c203B6[IgG1] 둘 다는 웨스턴 블럿에 의해 전장 (full length)의 CD151을 인식할 수 있었다 (도 10). 더우기, 그들은 재조합 EC2 루프에 대한 그들의 반응도 (reactivity)에 의해 평가된 바와 같이 큰 세포외 루프에 대해 특이적인 것도 역시 보여주었다 (도 10).

실시예 6: 엘라이자에 의한 경쟁 실험들

교차-경쟁 (cross-competition) 실험들이 좀 더 나아가 키메라 항체들 c214B2[IgG1] 및 c203B6[IgG1]가 재조합 EC2 루프에 해당하는 마우스 형태들의 결합을 저해하는 능력을 평가하도록 엘라이자 (ELISA)에 의해 수행되었다. 간략하게, 96-웰 엘라이자 플레이트들이 PBS에 녹인 5 μg/mL 농도의 재조합 EC2로 하룻밤 동안 4℃에서 코팅되었다. 좀 더 나아가 마우스 Mabs 203B6 및 214B2가 80 ng/mL 농도로 해당하는 키메라 항체 형태들의 부재 시 또는 이들의 0.01로부터 20 μg/mL까지 범위로 증가하는 농도들의 존재 시 1시간 동안 37℃에서 배양되었다. 대조군 실험들의 경우는, 마우스 항체가 첨가되지 않았다. 고추냉이 퍼옥시다제-결합된 폴리클론 염소 항-마우스 IgG가 PBS에서 1/5000로 희석하여 첨가되었고 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 퍼옥시다제 기질 TMB로 상온에서 10분 동안 배양 이후에, 반응은 1M 황산으로 정지되었고 광학 밀도가 450 nm에서 측정되었다. 도 11A 내지 11B는 키메라 항체들 c214B2[IgG1] 및 c203B6[IgG1]이 각각 그들의 마우스 형태들 214B2 및 203B6을 대체할 수 있는 것을 보여주고 있다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (GraphPad Prism software)를 사용하여 계산된 IC₅₀값은 c214B2[IgG1] 및 c203B6[IgG1]의 경우 각각 0.69 μg/mL 및 0.71 μg/mL이었다.

실시예 7: 전립선암 세포들에 키메라 항체들의 결합

키메라 항체들 c214B2[IgG1] 및 c203B6[IgG1]의 전립선암 세포들 PC3에 결합은 유동세포측정법 (flow cytometry)에 의해 평가되었다. 간략하게, PC3 세포들은 1% BSA 및 0.01% 소듐 아자이드를 포함하는 PBS 완충용액에서 1.10⁵ 세포/100 μL 농도로, 다양한 농도들의 c214B2[IgG1] 및 c203B6[IgG1]의 조재 시 20분 동안 4℃에서 배양되었다. 좀 더 나아가 세포들은 세척되었고 알렉사488-결합된 염소 항-인간 항체 (몰레큘라 프로브사, PBS에서 1/500 희석)와 20분 동안 4℃에서 배양되었다. 표지된 세포들은 세척되었고, 원심분리되었으며 또한 이전의 완충용액 (150 μL)으로 팩스칼리버 세포측정기 (Facscalibur cytometer) (벡튼 디킨슨사 (Becton Dickinson))로의 분석 이전에 재현탁되었다. 프로피디움 요오드가 분석들을 수행하도록 살아있는 세포들에만 첨가되었다. PC3 세포들의 표면에서 발현되는 CD151에 키메라 항체들 c214B2[IgG1] 및 c203B6[IgG1]의 결합은 항체 농도의 함수로서 증가하였다 (도 12A 내지 12B). 정점 (plateau)에는 c214B2[IgG1] 및 c203B6[IgG1]의 경우 각각 2.5 μg/mL 및 5 μg/mL 농도에서 도달하였고, PC3 세포들에 이들 항체들의 결합이 매우 특이적인 것을 가르켰다.

실시예 8: 전립선 PC3 이종이식 모델 상에서 CD151 에 대한 키메라 항체 c214B2[IgG1]의 항종양 활성

종양 조직에서 CD151의 과다-발현은 조직 어레이 분석법을 사용하여 전립선 조직 상에서 이전에 관찰된 바 있었다. 전립선암 세포들이 표적된-CD151 치료법에 반응하는지 여부를 결정하기 위하여, CD151에게 유도되는 키메라 c214B2[IgG1]가 생체내 PC3 이종이식 모델에서 테스트되었다. PC3 세포 계열은 ATCC에 의해 공급되는 안드로겐-비의존성 세포 계열이고 10% FCS가 보충된 F12K 배지에서 배양된다. 5백만 개의 PC3 세포들이 6주 된 수컷 스위스 마우스에 피하적으로 이식되었다. 이식 5일 이후에, 종양들은 측정가능하였고, 마우스는 c214B2[IgG1] 키메라 항체를 복강내 주사를 시작하기 이전에 6마리로 된 2그룹으로 무작위로 나뉘었다. c214B2의 2 mg/용량이 로딩 용량으로 주입된 다음 1 mg/용량으로 주 당 두 번 처리되었다. 종양 부피는 주 당 두 번 평가되었고 다음의 공식으로 계산되었다: π/6 x 길이 x 너비 x 높이. 도 13에 표현된 결과들은 본 도면에서 c214B2라고 명명되는 c214B2[IgG1]가 PC3 세포들의 생체내 종양 성장의 유의하게 억제하였던 것을 보여주었다. 본 결과들은 CD151를 표적하는 것이 암의 효율적인 치료법이 될 수 있는 점을 보여주고 있다

실시예 9: TH7 힌지 돌연변이의 유전자조작

힌지 부위 (hinge region)가 면역글로불린들의 가변 도메인의 유연성에 강력하게 관여하는 점은 당업자에게 잘 알려져 있다 (Brekke et al., 1995; Roux et al., 1997을 참조하라). 214B2 Mab의 키메라화 (chimerization) 공정 동안, 마우스 불변 도메인 IGHG1은 인간 기원의 동등한 IGHG1 부분에 의해 대체되었다. 이에 해당하는 힌지 부위들의 아미노산 서열들은 매우 분지되었기 (highly divergent) 때문에, 인간 IgG1 힌지 부위는 하나의 Cys 잔기의 첨가 및 2개 아미노산들의 길이 단축에 의해 마우스 IgG1 힌지를 모방하도록 조작되었다.

하기는 마우스 및 인간 야생형 IgG1 힌지 부위들 또한 변형된 TH7 힌지 부위의 비교를 보여주고 있다 (C-도메인들의 경우 독특한 IMGT 번호매김에 따름):

마우스 IgGl 힌지 부위 PRDCGCKP-CI-CT (서열번호 43)

인간 IgGl 힌지 부위 PKSCDKTHTCPPCP (서열번호 43)

조작된 TH7 힌지 부위 PKSCDC -H-CPPCP (서열번호 41)

(인간 IgG1 힌지 부위에 도입된 3개의 변형들은 밑줄을 침)

실시예 10: 키메라 214B2 Mab 및 유전자조작된 힌지 Mab 형식의 생산

키메라 또는 유전자조작된 (engineered) 힌지 부위들을 포함하는 모든 Mab 형태들은 pCEP4 발현 벡터 (인비트로겐사, 미국)를 가진 HEK293/EBNA 시스템을 사용하여 일시적 형질전환 시 생산되었다.

마우스-유래한 가변 도메인들 214B2 VH 및 VL은 글로벌 유전자 합성 (진아트사 (Geneart), 독일)에 의해 합성되었다. 그들은 인간 IgG1 면역글로불린의 불변 도메인 [CH1-힌지-CH2-CH3]의 코딩 서열 전부를 보유하는 pCEP4 벡터 (인비트로겐사, 미국) 내에 서브클론되었다. 힌지 부위의 변형은 원하는 변형들을 보유하는 동등한 부분에 의해 {Nhel-Bcll} 제한효소 단편을 교환하여 수행되었고, 각각의 {Nhel-Bcll} 단편은 글로벌 유전자 합성 (진아트사, 독일)에 의해 합성되었다. 모든 클로닝 단계들은 실험실 매뉴얼 (Sambrook and Russel, 2001)에 기술된 바와 같이 통상적인 분자생물학 기법들 또는 공급자의 안내서들에 따라서 수행되었다. 각 유전적 제작물은 빅 다이 종결인자 순환 서열결정 키트 (어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 사용하는 뉴클레오타이드 서열결정 (sequencing)에 의해 전적으로 검증되었고 또한 3100 유전적 분석기기 (어플라이드 바이오시스템사, 미국)를 사용하여 분석되었다.

현탁배양-적응된 HEK293 EBNA 세포들 (인비트로겐사, 미국)은 6 mM 글루타민이 보충된 무혈청 배지 Excell 293 (SAFC 바이오사이언스사) 50 mL을 넣은 250 mL의 플라스크로 궤도 진탕기 상에서 (110 rpm의 회전 속도) 일상적으로 배양되었다. 일시적 형질전환은 1 mg/mL의 최종 농도로 혼합된 플라스미드 DNA를 물에 녹여 제조된 직선상 25 kDa 폴리에틸렌이민 (PEI) (폴리사이언스사 (Polysciences))를 사용하는 2.10⁶개 세포/mL을 가지고 수행되었다 (1 : 1의 중쇄 대비 경쇄 플라스미드 비율의 경우 1.25 μg/mL의 최종 농도). 형질전환 4시간 이후에, 배양은 10⁶개 세포/mL의 최종 세포 밀도에 도달하도록 한 부피 (one volume)의 신선한 배양 배지로 희석되었다. 배양 공정은 세포 생존도 및 Mab 생산을 근거로 하여 감시되었다. 전형적으로, 배양액들은 4 내지 5일 동안 유지되었다. Mabs는 프로테인 A 레진 (GE 헬스케어사, 미국) 상에서 통상적인 크로마토그래피 접근법을 사용하여 정제되었다.

c214B2[TH7]IgG1 Mab는 기능적 평가들에 적합한 수준들로 생산되었다. 생산도 수준들은 전형적으로 정제된 Mab의 15 및 30 mg/L 사이의 범위이었다.

실시예 11: 세포 부착 검정법들

- 첫 번째 검정법

PC3 전립선암 세포들은 트립신을 사용하여 탈착되었고, 무혈청 F12k 배지로 3번 세척되었으며 동일한 배지로 재현탁되었다. 세포들 (100,000개 세포/웰)은 아미닌 1을 사용하여 1 μg/mL 농도로 코팅된 96-웰 플레이트들 상에 도말되었다. 테스트될 항-CD151 Mab의 다음의 형식들이 10 μg/mL의 최종 농도로 동시에 첨가되었다: 마우스 IgGl Mab m214B2, c214B2라고 명명된 미변형된 키메라 IgGl 항체 형태, 및 cTH7-214B2라고 명명된 TH7 변형을 가진 키메라 항체 형태. 마우스 및 인간 IgGl 항체들은 이소형 대조군 항체들로서 사용되었다. 최종의 조건들은 다음과 같았다: 100,000 세포/웰 및 10 μg/mL 농도에서의 항체들. 37℃에서 1시간 동안 배양 이후에, 플레이트들은 털어내었고 무혈청 F12k 배지로 두 번 세척되었다. 분석 이전에, 100 μL의 무혈청 F12k 배지가 각 웰에 배분되었다. 세포 부착에 미치는 항체들의 효과를 평가하기 위하여, 웰들을 위상차 현미경 하에서 사진을 찍었다 (도 14). 다음으로 부착된 세포들의 수가 ATP 검정법을 사용하여 결정되었다 (도 15A).

- 두 번째 검정법

PC3 전립선암 세포들은 트립신을 사용하여 탈착되었고, 무혈청 F12k 배지로 3번 세척되었으며 동일한 배지로 재현탁되었다. 세포들 (100,000개 세포/웰)은 아미닌 1을 사용하여 1 μg/mL 농도로 코팅된 96-웰 플레이트들 상에 도말되었다. 동시적으로, 테스트될 항-CD151 Mab의 다음의 형식들이 0.4 μg/mL의 최종 농도로 동시에 첨가되었다: 마우스 IgGl Mab m214B2 및 키메라 IgG1-TH7, IgG4-TH7 및 IgG2 항체 형태들. 37℃에서 1시간 동안 배양 이후에, 플레이트들은 털어내었고 무혈청 F12k 배지로 두 번 세척되었다. 분석 이전에, 100 μL의 무혈청 F12k 배지가 각 웰에 배분되었다. 세포 부착에 미치는 항체들의 효과를 평가하기 위하여, 부착된 세포들의 수가 ATP 검정법을 사용하여 결정되었다.

214B2의 서로 다른 키메라 형태들은 세포-대-세포 상호작용들을 변형시키고 PC3 세포 부착을 증가시킬 수 있다 (도 15B). 키메라 형태들 c214B2[IgGl-TH7], c214B2[IgG4-TH7] 및 c214B2[IgG2]에 의해 유도되는 효과는 마우스 형태 m214B2에 의해 유도되는 효과와 비교가능하였다. 이들 키메라 항체들은 미처리된 세포들 또한 서로 다른 대조군 항체들 hlgGl, hIgG2 및 hIgG4로 처리된 세포들과 비교하여 대략 40%의 PC3 세포 부착의 증가를 유도하였다.

실시예 12: 214B2 Mab 의 인간화

- 일반적인 절차

214B2 항-CD151 항체의 인간화는 CDR-이식의 보편적인 규칙들을 적용하여 수행되었다. 면역유전학적 분석 또한 CDR 및 구조틀 (FR) 부위들의 정의는 독특한 IMGT 번호매김 방식뿐만 아니라 IMGT 라이브러리들 및 도구들 (Lefranc, 1997 - www.imgt.org)을 적용하여 수행되었다.

인간화 변이체들의 부모 항체의 에피토프에 대한 친화도는 인간화 항체를 사용하여 부모 항체를 교차 차단하여 평가되었다. 부모 항체 농도는 일정하게 유지되었고 인간화 항체는 일련으로 희석되었다. 키메라 항체는 양성 대조군으로서 또한 기준으로서 이들 실험에서 사용되었다. 인간화 항체들은 엘라이자 및 유동세포측정 검정법에서 친화도에 의해 평가되었다. 엘라이자에 기초한 검정법에서, 인간 CD151의 두 번째 세포외 도메인 (EC2)는 재조합으로 발현되었고 6개 히스티딘 태그에 의해 정제되었다. 정제된 EC2 단백질은 엘라이자 플레이트들을 코팅하는 데 사용되었고 또한 인간화 항-CD151 항체들의 결합은 HRP 결합된 항-마우스 IgG 항체들을 사용하여 마우스 부모 항체를 검출하여 간접적으로 측정되었다. 인간화 항-CD151 항체들의 CD151에 대한 결합은 인간 전립선암 세포주 PC3를 사용하는 유동세포측정법에 의해 평가되었다. 친화도는 바이오틴화 부모 마우스 항-CD151 항체를 교차 차단하여 결정되었다. 바이오틴화 항체는 플루오레신 결합된 스트렙트아비딘 (streptavidin)을 사용하여 검출되었다. 친화도 상수 (Kd)는 BIA 코아 분석에 의해 측정되었다.

이들 검정법들은 항-CD151 항체들의 재조합 인간화 버전들을 특성분석하는 데 사용되었다. 가변 도메인들은 인간 IgG1/k 불변 도메인들로 형식화되었고 (formatted) 포유동물 발현 벡터 pCEP 내에 클론되었다. 재조합 IgG1/k-유래 항체들은 HEK293 세포들에서 일시적으로 발현되었다. 발현 배양 상청액들은 여과되었고 항체들은 프로테인 A 세파로스 (Protein A sepharose)를 사용하여 정제되었다. 정제된 항체들은 PBS에 넣어 재완충되었고 항체들의 농도들은 엘라이자에 의해 결정되었다.

- 214B2 중쇄의 인간화

마우스 214B2 중쇄 CDRs를 이식하는 데 가장 적합한 인간 배아계열의 추적은 인간 IGHV1-2*02 V-유전자의 대립유전자에 해당하는 하나의 선호적 사실을 확인시켜 주었다. 이것은 마우스 IGHVS130*01 배아계열 유전자와 66% 일치하고, CDR 길이들도 일치한다. 28개의 자리들이 그들의 구조틀들에서 214B2_VH 및 IGHV1-2*02 사이에 분지되어 있다 (divergent) (도 9). 이들 28개의 각 분지된 잔기들의 잠재적인 중요성을 평가하는 판단기준은, 이에 제한되는 것은 아니지만 버니어 영역에서 정착, CDR 고정물들에 근접한 위치, 동일한 인간 배아계열 그룹의 또 다른 대립유전자의 동일한 자리에서의 존재:를 포함한다.

IGHV1-2*02 V-유전자를 관하여, 버니어 영역 내에 있는 5개의 잔기들이 m214B2 및 mIGHVS130*01 둘 다와 비교하여 서로 다르고 (I53, E55, A76, L78, V80), 이것은 높은 우선도로 고려되어야 하며 첫 번째 경우에서 마우스와 같이 보존되어야 한다 (도 16). 그렇지 못한 경우라면, N67이 CDR2 고정물에 근접한 그들의 자리 때문에 고려될 높은 우선도 잔기들로서 순위가 매겨진다.

J-부위에 관하여, 인간 IGHJ6*01 유전자는 m214B2 및 mIGHJ4*01 둘 다와 비교하여 3개의 분지된 잔기들을 포함한다. 본 부위는 필수적으로 FR4에 해당하기 때문에, 이것은 첫 번째 경우에서 전적으로 인간화될 수 있다. CDR3 (ARARSFYYAMDC)의 서열에 필수적으로 해당하는 다양성 D-유전자는 변형이 없이도 이식되었다.

- 214B2 경쇄 VL 의 인간화

마우스 214B2 경쇄 CDRs를 이식하는 데 가장 적합한 인간 배아계열의 추적은 두 가지의 잠재적인 사실을 확인시켜 주었다.

1번 Asn에 해당하는 비전형적인 잔기가 확인되고, 이것은 일정 마우스 배아계열 V-유전자들에는 존재하지만 인간에서는 전혀 존재하지 않는다. 이것이 CDR1에 인접하여 위치하기 때문에, 선택된 인간 V-유전자들에서 발견되는 바와 같이 Glu로의 그의 변형은 유의해야 하고 평가되어야 한다.

첫 번째는 마우스 IGKV3D-7*01 배아계열 대립유전자와 가장 근접한 정도의 상동성을 보여주는 인간 V-부위에 해당한다. 그럼에도 불구하고, 그의 CDR1은 하나의 214B2보다 하나의 아미노산이 더 길고 따라서 이들 CDR은 궁극적으로 CDR 이식에 최고로 적합하지는 않다. 따라서, 인간 배아계열 IGKV1D-39*01이 선택되고; 이것은 마우스 배아계열 대립유전자 IGKV6-20*01과 64% 일치하고 CDR 길이들도 일치한다. 214B2 VL 및 선택된 인간 V-유전자 사이에 각 분지된 잔기들의 잠재적인 중요성을 평가하는 판단기준은, 이에 제한되는 것은 아니지만 버니어 영역에서 정착, CDR 고정물들에 근접한 위치, 동일한 인간 배아계열 그룹의 또 다른 대립유전자의 동일한 자리에서의 존재:를 포함한다.

IGKV1D-39*01 V-유전자에 관하여, 버니어 영역 내에 있는 하나의 잔기는 m214B2 및 mIGKV6-20*01 둘 다와 비교하여 서로 다르고 (A84), 이것은 높은 우선도로 고려되어야 하며 첫 번째 경우에서 마우스와 같이 보존되어야 한다. 그렇지 못한 경우라면, 두 개의 중요한 잔기들은 CDR1 및 CDR2 고정물들 V39 및 N66에 해당하고, 마찬가지로 그들은 높은 우선도로서 순위가 매겨지고 첫 번째 경우에서 마우스와 같이 보존된다. 5개의 잔기들이 CDR 고정물들에 근접한 그들의 자리 (K24, S40, Y68 및 H103) 또는 CDR1에 인접한 자리 (V3) 때문에 고려될 중간 우선도 잔기들로서 순위가 매겨진다. 남아있는 아미노산들 (#3으로서 순위가 매겨짐)은 인간화 중쇄의 전반적인 입체형태 및 CD151 인식에 약한 임팩트를 가지는 것 같고, 그들은 쉽게 그들의 인간 상대편에 의해 대체될 수 있다.

J-부위에 관하여, 인간 IGKJ2*01 유전자는 m214B2 및 mIGKJ2*01 둘 다와 비교하여 1개의 분지된 잔기 (G)를 포함한다. 본 부위는 필수적으로 FR4에 해당하기 때문에, 이것은 첫 번째 경우에 전적으로 인간화되었다.

IMGT-CDR3 서열 (GQTYSFPYT)은 서열 변형이 없이도 이식되었다.

첫 번째 일련의 실험들에서, 인간화 항체들은 엘라이자에 의해 테스트되었다. VH의 변이체 1, 변이체 2 및 변이체 3 각각은 VL의 세 가지의 서로 다른 변이체들과 조합되었다 VH 변이체 1을 가진 모든 제작물들은 마우스 항체와 경쟁하는 능력을 전혀 보여주지 않는다 (도 17A). 이것은 구조틀들에서 구조적 잔기들이 본 항체가 그의 항원을 인식하는 데 중요한 점을 처음 가르키는 것이다. VH Var2 또는 VH Var3 둘 중 하나와 VL Var1의 조합은 키메라 항체와 비교하여 부모 항체를 차단하는 보다 더 낮은 능력을 보여주었다. 따라서 이들 변이체들은 좀 더 평가되지 않았다. 항체 Hz214B2VHVar4VLVar4를 포함하는 다른 변이체들 모두는 키메라 항체와 유사한 차단 활성들을 보여주고 있다 (도 18B, 18C 및 18D).

EC2에 대한 결합은 전항원 CD151에 결합하는 모델로서 사용되었다. 세포 표면 상의 항원에 대한 친화도는 유동세포측정법에 의해 평가되었다. 교차 차단 활성의 가장 높은 수준은 항체 Hz214B2VHVar4VLVar4 경우에서 결정되었다. 이들 결과들은 비교적 많은 역 돌연변이들이 항체 214B2의 결합 특성들을 유지하는 데 요구되는 것을 가르킨다.

구조틀에서 인간 잔기들의 퍼센트가 Hz214B2VHVar4VLVar4 경우에 계산되었다: 이것은 226개의 잔기들 중에서 22개의 비-인간 잔기들을 포함하고 있고, 이는 90.3%의 《배아도 지수 (germinality index)》와 동등하다.

키메라 항체 및 두 가지 인간화 변이체들의 친화도는 인간 CD151의 세포외 루프2 (EC2)를 사용하는 BIA코아 분석에 의해 결정되었다 (도 20).

실시예 13: PC3 이종이식 모델 상에서 다양한 유형들의 키메라 c214B2 Mab 의 생체내 활성

214B2 Ab의 다양한 키메라 제작물들을 평가하기 위하여, 안드로겐-비의존성 전립선암 세포 계열 PC3 (ATCC CRL1435)로부터 나온 5 x 10⁶개의 세포들이 누드 마우스에 이식되었다. 이식 5일 이후에, 종양들은 68 및 108 mm² (π/6 x 길이 x 너비 x 높이) 사이에 포함되는 부피들에 도달하였고 또한 마우스는 6마리 동물들의 그룹들로 나뉘었다. 테스트될 운반체 또는 항체 둘 중 하나가 복강내로 주사되었다. 처리된 마우스는 D5에 마우스 당 2 mg의 로딩 용량을 수여받았고 또한 D12에 추가적으로 주사되었다. 종양 부피는 주 당 두 번 평가되었다.

도 21A 및 21B에 표현된 결과들은 테스트된 키메라 형태들 모두가 PC3 이종이식 모델에 미치는 동일하고 유의한 생체내 효과를 나타내었던 점을 보여주었다.

COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES CNCM03919 20080221 COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES CNCM03920 20080222

SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> New chimeric antibodies and their uses for the treatment of cancer <130> D28060 <150> EP 09305964.0 <151> 2009-10-09 <150> US 61/266,020 <151> 2009-12-02 <160> 85 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> mus musculus <400> 1 Ala Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> mus musculus <400> 2 Glu Ala Ser 1 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Gln Gln Ser Arg Lys Ala Pro Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> mus musculus <400> 4 Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Thr 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> mus musculus <400> 5 Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 6 Ala Thr Pro Arg Ile Gly Thr Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chimeric anti-CD151 antibody light chain derived from the murine 203B6 monoclonal antibody <400> 7 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 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derived from the murine 214B2 monoclonal antibody <400> 38 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Val Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Ser Met His Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asn Asn Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Val Asp Leu Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Arg Ser Phe Tyr Tyr Ala Met Asp Cys Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 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ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gctga 645 <210> 40 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA coding the (TH7) chimeric anti-CD151 antibody heavy chain derived from the murine 214B2 monoclonal antibody <400> 40 caggtgcagc tgcagcagcc cggcagcgtg ctggtgagac ctggcgcctc cgtgaagctg 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc agcagcagca tgcactgggc caagcagcgg 120 ccaggccagg gactggaatg gatcggcgag atccacccca acagcggcaa caccaacaac 180 aacgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgtggaca ccagcagctc caccgcctac 240 gtggacctga gcagcctgtc cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc cagagccaga 300 tccttctact acgctatgga ctgctggggc cagggcacca gcgtgaccgt gtccagcgcc 360 agcaccaagg gcccaagcgt gttcccgcta gccccgtctt caaagagtac ctcaggcgga 420 actgccgctc ttggttgcct tgtgaaggac tattttcctg agcccgtgac ggtcagctgg 480 aactctggcg cactgactag cggcgtacac acattccctg cggtgctcca aagttccggg 540 ctgtactcac tgtcctccgt tgtgaccgtt ccatctagtt ccctcgggac acagacatac 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agcagggagg agatgaccaa gaaccaggtg 1140 tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac ccaagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc acccccccaa tgctggacag cgacggcagc 1260 ttcttcctgt acagcaagct gacagtggac aagagcagat ggcagcaggg caacgtgttc 1320 agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagag cctgagcctg 1380 tccccaggc 1389 <210> 46 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> hz214B2 Light Chain Variable domain Var1 <400> 46 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Thr Tyr Ser Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 47 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 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gtggtggacg tgtcccacga ggaccccgag gtgcagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggagcagt ttaacagcac cttccgggtg 900 gtgtccgtgc tgaccgtggt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgtaag 960 gtctccaaca agggcctgcc agcccccatc gaaaagacca tcagcaagac caagggacag 1020 ccaagagagc cacaggtcta caccctgccc cccagcaggg aggagatgac caagaaccag 1080 gtgtccctga cctgtctggt gaagggcttc tacccaagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc caatgctgga cagcgacggc 1200 agcttcttcc tgtacagcaa gctgacagtg gacaagagca gatggcagca gggcaacgtg 1260 ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 1320 ctgtccccag gc 1332 <210> 83 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hz214B2 Heavy Chain Full length IgG2 Var 2 <400> 83 caggtgcagc tggtgcagtc cggcgctgaa gtgaagaaac ccggcgcttc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc tccagctcca tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacagg gcctggaatg gatgggcgag attcacccca actccggcaa caccaacaac 180 gcccagaaat tccagggcag 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cccagcaggg aggagatgac caagaaccag 1080 gtgtccctga cctgtctggt gaagggcttc tacccaagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc caatgctgga cagcgacggc 1200 agcttcttcc tgtacagcaa gctgacagtg gacaagagca gatggcagca gggcaacgtg 1260 ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 1320 ctgtccccag gc 1332 <210> 84 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hz214B2 Heavy Chain Full length IgG2 Var 3 <400> 84 caggtgcagc tggtgcagtc cggcgctgaa gtgaagaaac ccggcgcttc cgtgaagctg 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc tccagctcca tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacagg gcctggaatg gatgggcgag attcacccca actccggcaa caccaacaac 180 gcccagaaat tccagggcag agccaccctg accgtggaca cctccatctc caccgcctac 240 gtggaactgt cccggctgcg gagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagagcccgg 300 tccttctact acgccatgga ctgctggggc cagggcacct ctgtgaccgt gtcctccgcc 360 tccaccaagg gcccttccgt gttcccgcta gcgccctgct ccagaagcac cagcgagagc 420 acagccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 480 aacagcggag ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 540 ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg ccaagcagca acttcggcac ccagacctac 600 acctgtaacg tggaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaccgt ggagaggaag 660 tgctgtgtgg agtgcccccc ctgcccagcc cccccagtgg ccggacccag cgtgttcctg 720 ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacctgtgtg 780 gtggtggacg tgtcccacga ggaccccgag gtgcagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggagcagt ttaacagcac cttccgggtg 900 gtgtccgtgc tgaccgtggt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgtaag 960 gtctccaaca agggcctgcc agcccccatc gaaaagacca tcagcaagac caagggacag 1020 ccaagagagc cacaggtcta caccctgccc cccagcaggg aggagatgac caagaaccag 1080 gtgtccctga cctgtctggt gaagggcttc tacccaagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc caatgctgga cagcgacggc 1200 agcttcttcc tgtacagcaa gctgacagtg gacaagagca gatggcagca gggcaacgtg 1260 ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 1320 ctgtccccag gc 1332 <210> 85 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hz214B2 Heavy Chain Full length IgG2 Var 4 <400> 85 caggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaagctg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctcctcca tgcactgggt gcggcaggca 120 ccaggtcagg gcctggagtg gatgggcgag atccacccca actccggaaa caccaacaac 180 aacgagaagt tcaagggccg ggccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240 gtggagctga gccggctgcg gagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagagcccgg 300 agcttctact acgcaatgga ctgctggggc cagggcacca gcgtgaccgt gagcagcgcc 360 tccaccaagg gcccttccgt gttcccgcta gcgccctgct ccagaagcac cagcgagagc 420 acagccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcctgg 480 aacagcggag ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 540 ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg ccaagcagca acttcggcac ccagacctac 600 acctgtaacg tggaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaccgt ggagaggaag 660 tgctgtgtgg agtgcccccc ctgcccagcc cccccagtgg ccggacccag cgtgttcctg 720 ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacctgtgtg 780 gtggtggacg tgtcccacga ggaccccgag gtgcagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggagcagt ttaacagcac cttccgggtg 900 gtgtccgtgc tgaccgtggt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgtaag 960 gtctccaaca agggcctgcc agcccccatc gaaaagacca tcagcaagac caagggacag 1020 ccaagagagc cacaggtcta caccctgccc cccagcaggg aggagatgac caagaaccag 1080 gtgtccctga cctgtctggt gaagggcttc tacccaagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc caatgctgga cagcgacggc 1200 agcttcttcc tgtacagcaa gctgacagtg gacaagagca gatggcagca gggcaacgtg 1260 ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 1320 ctgtccccag gc 1332

Claims (27)

1. 서열번호 7, 25 또는 37의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 및/또는 서열번호 8, 9, 26, 27, 38 또는 44의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키메라 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편.
2. 제 1항에 있어서,
   서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
3. 제 2항에 있어서,
   IgG1인 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
4. 제 1항에 있어서,
   서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
5. 제 4항에 있어서,
   IgG4인 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
6. 제 1항에 있어서,
   서열번호 25 또는 37의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 및 서열번호 26 또는 38의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
7. 제 6항에 있어서,
   IgG1인 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
8. 제 7항에 있어서,
   서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
9. 제 8항에 있어서,
   서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
10. 제 1항에 있어서,
    서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
11. 제 10항에 있어서,
    IgG4인 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
12. 제 1항에 있어서,
    서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 및 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
13. 제 12항에 있어서,
    IgG2인 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
14. 서열번호 46, 47, 48 또는 49의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 가변 도메인 및/또는 서열번호 50, 51, 52 또는 53의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하고, 제 1항에 따른 키메라 항체로부터 유래하는, 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편.
15. 제 14항에 있어서,
    서열번호 62, 63, 64 또는 65의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 및/또는 서열번호 66, 67, 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편.
16. 제 15항에 있어서,
    IgG1인 것을 특징으로 하는 인간화 항체.
17. 제 14항에 있어서,
    서열번호 62, 63, 64 또는 65의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 경쇄 및/또는 서열번호 70, 71, 72 또는 73의 아미노산 서열을 포함하는 서열을 가지는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간화 항체, 또는 유래된 화합물 또는 기능적 단편.
18. 제 15항에 있어서,
    IgG2인 것을 특징으로 하는 인간화 항체.
19. 다음의 핵산
    a) 제 1항 내지 제 18항의 어느 한 항에 따른 항체, 그의 유도체 화합물들 또는 기능적 단편들의 하나를 코딩하는 DNA 또는 RNA 핵산;
    b) a)에서 정의되는 바와 같은 핵산에 상보적인 핵산;
    c) 서열번호 16 내지 18, 또는 34 내지 36, 39, 40, 45 또는 54 내지 61 또는 74 내지 85의 핵산 서열들의 적어도 하나와 높은 엄격도의 조건들 하에서 혼성화할 수 있는 적어도 18개 뉴클레오타이드들의 핵산:
    으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 분리된 핵산.
20. 제 19항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
21. 제 20항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
22. 제 21항에 따른 세포를 포함하는, 인간을 제외한 트랜스유전자 동물.
23. 제 1항 내지 제 18항의 어느 한 항에 따른 항체, 또는 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편들의 하나로 이루어진 화합물을 활성 성분으로서 포함하는, 조성물.
24. 제 23항에 있어서,
    추가적으로 항체, 세포독성/세포증식억제 제제, 세포 독소 또는 방사성원소를 동시적, 개별적 또는 시간차 사용을 위한 조합 산물로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서,
    약제로서의 조성물.
26. 암의 예방 또는 치료를 목적으로 한 약제의 제조에 있어서, 제 1항 내지 제 18항의 어느 한 항에 따른 항체, 그의 유래된 화합물 또는 기능적 단편들의 하나 및/또는 제 23항 내지 제 25항의 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
27. 제 26항에 있어서,
    상기 암은 전립선암, 폐암, 결장암, 유방암 또는 췌장암으로부터 선택되는 암인 것을 특징으로 하는, 용도.

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