FR2929946A1

FR2929946A1 - Nouveaux anticorps anti-cd151 et leur utilisation pour le traitement du cancer

Info

Publication number: FR2929946A1
Application number: FR0801985A
Authority: FR
Inventors: Jean Francois Haeuw
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2008-04-11
Publication date: 2009-10-16
Anticipated expiration: 2028-04-11
Also published as: AR071304A1; AU2009245587B2; WO2009136070A1; NZ588887A; CN102027014A; US8697855B2; AU2009245587A1; RU2010145063A; BRPI0909016A2; CL2009000862A1; SA109300216B1; TW201002347A; ZA201007751B; CA2720904A1; MA32288B1; US20100150902A1; UA105630C2; IL208595A0; KR20110010708A; JP2011517565A

Abstract

La présente invention est relative à de nouveaux anticorps capables de se lier spécifiquement à la protéine humaine CD151, notamment monoclonaux d'origine murine, chimériques et humanisés, ainsi que les séquences d'acide aminé et nucléiques codant pour ces anticorps. L'invention comprend également l'utilisation de ces anticorps à titre de médicament pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de cancers ainsi que dans des procédés ou nécessaire de diagnostic de maladies liées à la surexpression de la protéine CD151. L'invention comprend enfin des produits et/ou des compositions comprenant de tels anticorps en association avec des anticorps et/ou des agents anticancéreux ou conjugués avec des toxines et./ou des radioéléments et leur utilisation pour la prévention et/ou le traitement de certains cancers.

Description

La présente invention est relative à de nouveaux anticorps, notamment monoclonaux d'origine murine, chimériques et humanisés, capables d'inhiber la croissance tumorale ainsi que les séquences d'acide aminé et nucléiques codant pour ces anticorps. Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet de nouveaux anticorps, composés dérivés ou fragments fitnctionnels, capables d'inhiber la prolifération des cellules tumorales. L'invention comprend également l'utilisation de ces anticorps à titre de médicament pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique des cancers ainsi que dans des procédés ou nécessaires de diagnostic des cancers. L'invention comprend enfin des produits et/ou des compositions comprenant de tels anticorps en association, par exemple, avec des anticorps et/ou des agents anticancéreux ou conjugués avec des toxines et leur utilisation pour la prévention et/ou le traitement de certains cancers. CD151, appelé aussi PETA-3 ou SFA-1, est une protéine membranaire appartenant à la famille des tétraspanines (Boucheix et Rubinstein, 2001, Cell Mol. Life Sei. 58, 1189-1205 ; Hemler, 2001, J. Cell Biol. 155, 1103-1107). Chez l'homme, CD151 possède 253 acides aminés, et comporte 4 fragments membranaires et 2 domaines extracellulaires EC1 (18 acides aminés, séquence [40-57]) et EC2 (109 acides aminés, séquence [113-221]), appelés aussi boucles extracellulaires. Il est cependant à noter qu'au niveau de la séquence nucléotidique, deux variants pour CD151 ont été identifiés à ce jour, à savoir l'un comprenant les nucléotides A et C respectivement aux positions 395 et 409 [Fitter et al., 1995, Blood 86(4), 1348-1355] et l'autre comprenant pour les mêmes positions les nucléotides G et T au lieu et place des nucléotides A et C [Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70(5), 3258-3263]. De ce fait, une mutation au niveau de la séquence peptidique peut être observée, à savoir une mutation des résidus K (Lys) et P (Pro) respectivement aux positions 132 et 137 en les résidus R Arg) et S (Ser) [Fitter et al., 1995, Blood 86(4), 1348-1355 / Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70(5), 3258-3263]. CD151 est surexprimé dans de nombreux cancers, comme par exemple les cancers du poumon [Tokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114], du colon [Hashida et al., 2003, Br. J. Cancer 89, 158-167], de la prostate [Ang et al., 2004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721] ou du pancréas [Gesierich et al., 2005, Clin. Cancer Res. 11, 2840-28.52]. L'utilisation des souris knock-out n'exprimant pas CD151, et d'anticorps anti-CD151 et de siRNA pour bloquer in vitro la fonctionnalité et l'expression de CD151 35 dans différents types cellulaires a permis de montrer que CD151 est impliqué dans 2 plusieurs phénomènes liés au cancer, comme l'adhésion cellulaire (Nishiuchi et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1939-1944 ; Winterwood et al., 2006, Mol. Biol. Cell 17, 2707-2721), la motilité cellulaire (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343), la migration cellulaire (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765 ; Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-2,820 ; Penas et al., 2000, J. Invest. Dermatol. 114, 1126-1135 ; Klosek et al., 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416), l'invasion cellulaire (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343 ; Shiomi et al., 2005, Lab. Invest. 85, 1489-1506 ; Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292) et l'angiogénèse (Yanez-Mo et al., 1998, J. Cell Biol. 141, 791-804 ; Sincock et al., 1999, J. Cell Sci. 112, 833-844 ; Takeda et al., 2007, Blood 109, 1524-1532). L'une des propriétés remarquable des tétraspanines est leur capacité à s'associer entre elles, ainsi qu'à un nombre important d'autres molécules de surface pour former des complexes macromoléculaires structurés. Au sein de ces complexes, chaque tétraspanine est associée spécifiquement à une ou plusieurs molécules de surface formant ainsi des complexes primaires, constitués d'une tétraspanine et d'une molécule partenaire. Les tétraspanines peuvent organiser des microdomaines particuliers de la membrane plasmique au sein desquels elles recruteraient leurs partenaires moléculaires qui pourraient être couplés fonctionnellement. L'ensemble des interactions impliquant les tétraspanines a été dénommé réseau des tétraspanines ou Tetraspanin Web .

CD151 interagit à la surface des cellules avec différentes protéines membranaires. Des complexes très stables, résistants à l'action de certains détergents, ont notamment été mis en évidence avec les intégrines récepteurs des laminines, et plus particulièrement avec les intégrines a3131 ou î6134 dont le ligand préférentiel est la larninine 5 (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765 ; Lammerding et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci USA 100, 7616-7621). Cette association implique les domaines extracellulaires de CD151 et des intégrines. La séquence QRD [194-196] de CD151, localisée dans la boucle EC2, est très importante dans cette association puisque la mutation de ce site provoque la perte de l'interaction avec certaines intégrines (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309). Des complexes ternaires fonctionnels CD151/intégrine î6134/c-Met (récepteur du HGF) ont d'autre part été mis en évidence dans les cellules tumorales (Klosek et al., 2005, Biochem. Biophys. Res. Commun. 336, 408-416). L'inhibition de l'expression de CD151 par traitement des cellules avec un 3 ARN interférence provoque une inhibition de la croissance et de la migration cellulaire induite par HGF'. Les interactions au sein d'une même cellule de CD151 avec d'autres tétraspanines, nécessaires à la formation du réseau des tétraspanines, dépendraient des régions membranaires et cytoplasmiques de CD151 puisqu'il a été montré que la délétion de la boucle EC2 ne rompait pas l'association de CD151 avec d'autres tétraspanines (Berditchevski, 2001, J. Cell Sci. 114, 4143-4151). CD151 est capable de réguler les phénomènes d'adhésion, de migration et d'invasion cellulaire par la modulation de différentes voies de signalisation, comme par exemple la voie des phosphoinositides via une association avec la PI4-kinase (Yauch et al., 1998, Mol. Biol. Cell 9, 2751-2765), la voie de signalisation de c-Jun via la phosphorylation de FAK, Src, p38-MAPK et JNK (Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292), la phosphorylation des intégrines par la PKC (Zhang et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 25005-25013), l'activation de GTPases de la famille Rho (Shigeta et al,, 2003, J. Cell Biol. 163, 165-176). Des interactions de type homophilique entre cellules sont aussi responsables d'une augmentation de la motilité cellulaire et de l'expression de la métalloprotéinase MMP-9 (Hong et al., 2006, J. Biol. Chem. 281, 24279-24292). Ces interactions intercellulaires CD151-CD151 provoquent l'activation de c-Jun via la phosphorylation de FAK, Src, p38-MAPK et JNK A ce jour, en dépit de l'intérêt de la protéine CD151, deux anticorps à visée thérapeutique ont été générés, à savoir les anticorps monoclonaux 50-6 et SFA1.2B4. Ces 2 anticorps possèdent des activités comparables. Ils inhibent en effet la formation des métastases in vivo dans des modèles animaux, mais aucun effet sur la croissance tumorale in vivo n'a été mis en évidence. L'anticorps monoclonal 50-6 (isotype IgGl) dirigé contre CD151 a été généré chez la souris par immunisations soustractives avec des cellules humaines de carcinome épidermoïde HEp-3 (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820). L'anticorps 50-6 est capable d'inhiber in vitro la migration des cellules humaines de carcinome cervical HeLa transfectées afin de surexprimer CD151 et des cellules HEp-3, et l'angiogénèse dans un modèle de néovascularisation de membrane chorioallantoïque induite par le bFGF (basic fibroblast growth factor). Il inhibe in vivo les métastases induites par inoculation de cellules HEp-3 dans 2 modèles d'embryon de poulet (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820). Dans ces modèles, l'activité inhibitrice de l'anticorps 50-6 est déterminée par la mesure de l'activité de la protéine huPA (human urokinase-type plasminogen activator) dans des extraits de poumons. Selon les auteurs, ce dosage constitue le reflet de la présence de cellules humaines dans les poumons. Après dosage, la réduction des métastases (dissémination des cellules HEp-3 dans les poumons des embryons de poulet) induite par l'anticorps 50-6 est estimée, par comparaison à un anticorps contrôle, à 74% dans un modèle dit de métastase spontanée dans lequel l'inoculation des cellules est suivie par une injection de l'anticorps, et à 57% dans un modèle dit de métastase expérimentale dans lequel les cellules et l'anticorps sont inoculés conjointement. Selon les auteurs, les propriétés anti-tumorales de l'anticorps 50-6 observées in vivo ne semblent pas être liées à un effet cytostatique ou cytotoxique puisqu'il n'a montré aucun effet sur la prolifération in vitro des cellules HEp-3. L'hybridome produisant l'anticorps 50-6 est disponible à l'ATCC sous la 15 référence CRU-2696 (hybridome déposé initialement sous la référence 50-6 [PTA- 227]). L'anticorps monoclonal anti-CD151 SFA1.2B4 (isotype IgGI) a été généré chez la souris après immunisation par voie intra-péritonéale avec des cellules NIH 3T3 transfectées par le gène de CD15]. humain (Hasegawa et al., 1996, J. Virol. 70, 3258- 20 3263). L'anticorps SFA1.2B4 est capable d'inhiber in vitro l'invasion et la motilité cellulaire de différentes lignées tumorales humaines (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343). Il inhibe in vivo les métastases pulmonaires induites par les lignées de cancer du colon RPMI14788 et de fibrosarcome HT 1080 transfectées pour surexprimer CD151 (Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343). 25 D'autres anticorps murins anti-CD151 ont été décrits dans la littérature, comme par exemple les anticorps monoclonaux 14A2H1 (Ashman et al., 1991, Br. J. Haematol. 79, 263-270 ; Roberts et al., 1995, Br. J. Haematol. 89, 853-860), TS151 et TS 151 R (Serru et al., 1999, Biochem. J. 340, 103-111 ; Geary et al., 2001, Tissue Antigens 58, 141-153 ; Charrin et al., J. Biol. Chem. 276, 14329-14337 ; Chometon et al., 2006, Exp. 30 Cell Res. 312, 983-985). Aucune activité anti-tumorale in vivo n'a été décrite pour ces différents anticorps. Plusieurs études expérimentales ont montré le rôle majeur des tétraspanines dans la. formation de métastases, en agissant soit comme suppresseurs, soit comme promoteurs de métastases. Ainsi, la transfection de tétraspanines comme CD9, CD63 ou CD82 réduit le potentiel métastatique de lignées cancéreuses. En revanche, l'expression des tétraspanines CD151 et Co-029 semble produire l'effet inverse. Ces 2 tétraspanines seraient donc des promoteurs de la métastase. Ces résultats sont cohérents avec 5 différentes études cliniques qui ont démontré que, dans plusieurs cancers (sein, poumon, oesophage, estomac, foie, pancréas, côlon, prostate, mélanome...), CD9 et CD82 sont moins exprimés sur les tumeurs primitives lorsqu'il y a métastase et que leur baisse d'expression prédit un taux de survie inférieur. Dans le cancer du poumon, la diminution combinée de l'expression de CD9 et de CD82 a été corrélée à un potentiel métastatique plus important que lorsque l'expression d'un seul de ces deux antigènes est réduite. Plusieurs études rétrospectives ont montré que la surexpression de CD151 était associée à l'agressivité de certains cancers, comme les cancers du poumon, du colon et de la prostate, et pouvait être considérée comme un facteur de mauvais pronostic (Tokuhara et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 4109-4114 ; Hashida et al., 2003, Br. J. Cancer 89, 158-167 ; Ang et al., 2.004, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 13, 1717-1721). Dans ces cas, la moyenne de survie est en effet diminuée chez les patients dont la tumeur exprime CD151, comparativement à ceux dont la tumeur n'exprime pas CD151. La surexpression de CD151 dans différentes lignées tumorales humaines (HeLa, RPMI 14788, A172, HT 1080), induite par transfection du gène correspondant, provoque une augmentation de la motilité, de la migration et de l'invasion des cellules transfectées (Testa et al., 1999, Cancer Res. 59, 3812-3820 ; Kohno et al., 2002, Int. J. Cancer 97, 336-343). Ces phénomènes sont inhibés en présence d'anticorps anti-CD151.

Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un anticorps isolé, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, capable de se lier à la protéine CD151, ledit anticorps étant caractérisé en ce qu'il comprend au moins un CDR choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 1-6, 17-22, 33-35, 43-48, 59-63, 69-73, 79-81, ou 85-89 ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 1-6, 17-22, 33-35, 43-48, 59-63, 69.73, 79-81, ou 85-89. Par fragment fonctionnel d'un anticorps selon l'invention, on entend désigner en particulier un fragment d'anticorps, tel que des fragments Fv, scFv (sc pour 6 simple chaîne), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diabodies, ou tout fragment dont la durée de demie-vie aurait été augmentée. De tels fragments fonctionnels seront décrits en détails plus loin dans la présente description. Par composé dérivé d'un anticorps selon l'invention, on entend désigner en particulier une protéine de liaison comprenant une charpente peptidique ou scaffold et au moins l'un des CDRs de l'anticorps d'origine afin d'en conserver la capacité de reconnaissance. De tels composés dérivés sont bien connus de l'homme de l'art et seront décrits plus en détails dans la suite de la présente description. De manière plus préférée, l'invention comprend les anticorps, leurs composés dérivés ou leurs fragments fonctionnels, selon la présente invention, notamment chimériques ou humanisés, obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique. Selon une forme de réalisation préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention est caractérisé en ce qu'il consiste en un anticorps monoclonal. Il faut entendre par anticorps monoclonal un anticorps issu d'une population d'anticorps sensiblement homogènes. Plus particulièrement, les anticorps individuels d'une population sont identiques à l'exception de quelques mutations éventuelles pouvant se produire naturellement qui peuvent se retrouver en proportions minimes. En d'autres termes, un anticorps monoclonal consiste en un anticorps homogène résultant de la prolifération d'un seul clone cellulaire (par exemple un hybridome, une cellule hôte eucaryote transféctée avec une molécule d'ADN codant pour l'anticorps homogène, une cellule hôte procaryote transfectée avec une molécule d"ADN codant pour l'anticorps homogène, etc.) et qui est généralement caractérisé par des chaînes lourdes d'une seule et même classe et sous-classe, et des chaînes légères d'un seul type. Les anticorps monoclonaux sont fortement spécifiques et sont dirigés contre un seul antigène. En outre, contrairement aux préparations d'anticorps polyclonaux qui comprennent classiquement différents anticorps dirigés contre différents déterminants, ou épitopes, chaque anticorps monoclonal est dirigé contre un seul épitope de l'antigène. Il doit être compris ici que l'invention ne concerne pas les anticorps sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être isolés ou obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien 7 obtenus par recombinaison génétique, ou par synthèse chimique, et qu'ils peuvent alors comporter des acides aminés non naturels comme cela sera décrit plus loin. Plus particulièrement, selon une première forme d'exécution de l'invention, il est décrit un premier anticorps qui est caractérisé en ce qu'il comprend i) une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3, avec - CDR-L1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 1 ou 59 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 1 ou 59 - CDR-L2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 2 ou 60 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 2 ou 60 - CDR-L3 de séquence SEQ ID No. 3 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 3; et:/ou ii) une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3, avec - CDR-H1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 4 ou 61 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal 20 avec la séquence SEQ ID No. 4 ou 61 - CDR-H2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 5 ou 62 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 5 ou 62 - CDR-H3 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 6 ou 63 , ou au 25 moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 6 ou 63. Selon une deuxième forme (l'exécution de l'invention, il est décrit un deuxième anticorps qui est caractérisé en ce qu'il comprend i) une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, 30 CI)R-L2 et CDR-L3, avec - CDR-L1. choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 17 ou 69 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 17 ou 69 ; 8 - CDR-L2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 18 ou 70 , ou au rnoins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 18 au 70 - CDR-L3 de séquence SEQ ID No. 19, ou au moins une séquence qui présente 5 au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 19 ; et/ou ii) une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR.-H3, avec - CDR-H 1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 20 ou 71 , ou au 10 moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 20 ou 71 - CDR-H2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 21 ou 72 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 21 ou 72 15 - CDR-H3 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 22 ou 73 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 22 ou 73. Selon encore une troisième forme d'exécution de l'invention, il est décrit un troisième anticorps qui est caractérisé en ce qu'il comprend 20 i) une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3, avec - CDR-L1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 33 ou 79 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 33 ou 79 ; 25 - CDR-L2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 2 ou 60 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 2 ou 60 ; - CDR-L3 de séquence SE'Q ID No. 3 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 3 ; 30 et/ou ii) une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3, avec - CDR-H1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 4 ou 61 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 4 ou 61 - CDR-H2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 34 ou 80 , ou au 5 moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 34 ou 80 - CDR-H3 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 35 ou 81 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 35 ou 81. 10 Enfin, selon une dernière forme d'exécution de l'invention, il est décrit un quatrième anticorps qui est caractérisé en ce qu'il comprend i) une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3, avec - CDR-L 1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 43 ou 85 , ou au 15 moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 43 ou 85 - CDR-L2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 44 ou 86 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 44 ou 86 20 - CDR-L3 de séquence SEQ ID No. 45 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 45 ; et/ou ii) une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3, avec 25 - CDR-H 1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 46 ou 87 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 46 ou 87 - CDR-H2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 47 ou 88 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal 30 avec la séquence SEQ ID No. 47 ou 88 - CDR-H3 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 48 ou 89 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 48 ou 89.

De manière générale, il est ici rappelé que par région CDR ou CDR, on entend désigner les régions hypervariables des chaînes lourdes et légères des immunoglobulines. Il existe 3 CDRs de chaîne lourde et 3 CDRs de chaîne légère. Le terme CDR ou CDRs est utilisé ici pour désigner suivant les cas, l'une de ces régions ou plusieurs, voire l'ensemble, de c:es régions qui contiennent la majorité des résidus d'acide aminés responsables de la liaison par affinité de l'anticorps pour l'antigène ou l'épitope qu'il reconnaît. Selon une première approche, les CDRs peuvent être définies suivant le système IMGT. Le système de numérotation unique IMGT a été défini de manière à comparer les domaines variables quelque soit l'antigène, le type de chaîne ou l'espèce [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) ; Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) ; Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. Dans ce système de numérotation, les acides aminés conservés gardent toujours la même position comme la cystéine 23 (lst-CYS), le tryptophane 41 (CONSERVED T'RP), l'acide aminé hydrophobe 89, la cystéine 104 (2nd-CYS), la phénylalanine ou tryptophane 118 (J-PHE ou TRP). Le système de numérotation unique IMGT fournit donc une délimitation standardisée des régions charpentes (FR1-IMGT : positions 1 à 26, FR2-IMGT : positions 39 à 55, FR3-IMGT : positions 66 à 104 et FR4 IMGT : positions 118 à 128) ainsi que des régions déterminant la complémentarité ou CDRs (CDR1-IMGT : positions 27 à 38, CDR2-IMGT : positions 56 à 65 et CDR3-IMGT : positions 105 à 117). Comme les trous ou espaces représentent des positions inoccupées, la longueur des CDR selon IMGT devient une information cruciale. Le système IMGT est utilisé dans les représentations graphiques en 2D, désignés alors comme les colliers de perles IMGT [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) ; Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], et dans les structures en 3D nommées IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T tell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, ID208-D210 (2004)].

Suivant cette première approche, le premier anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3 respectivement de séquence SEQ [D No. 1, 2 et 3, ou présentant au moins 80%, de 11 préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 1, 2 et 3 ; et/ou une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ ID No. 4, 5 et 6, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 4, 5 et 6. Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes : SEQ ID No. 1 : ASVEYYGTSL SEQ ID No. 2 : EAS SEQ ID No. 3 : QQSRKAPYT SEQ ID No. 4 : GFTFSTYT SEQ ID No. 5 : ISSGGGTT SEQ ID No. 6 : ATPRIGTGFAY

Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID Nos. 1, 2 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 1, 2 et 3. De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID No. 4, 5 et 6, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 4, 5 et 6. Suivant cette même approche, le deuxième anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3 respectivement de séquence SEQ ID No. 17, 18 et 19, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 17, 18 et 19 ; et/ou une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ ID No. 20, 21 et 22, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 20, 21 et 22. Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes : 12 SEQ ID No. 17 : ATPRIGTGFAY SEQ ID No. 18 : SAS SEQ ID No. 19 : QQYSSNPT SEQ ID No. 20 : GFTLSTSGMG SEQ ID No. 21 : IYWDDDK SEQ ID No. 22 : ARRDHYGDYSYAMDY

Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID Nos. 17, 18 et 18, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 17, 18 et 19. De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID No. 20, 21 et 22, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 20, 21 et 22. Toujours suivant cette même approche, le troisième anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant au moins un CD.R choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3 respectivement de séquence SEQ [D No. 33, 2 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 33, 2 et 3 ; et/ou une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ If) No. 4, 34 et 35, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 4, 34 et 35. Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes : SEQ ID No. 33 : ASVDYYGTSL SEQ ID No. 34 : ISSGGVTT SEQ ID No. 35 : TSPRTGTGFAY

Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID Nos. 33, 2 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 33, 2 et 3. De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde comprenant les trois CDRs, tels que définis selon [MGT, respectivement de séquence SEQ ID No. 4, 34 et 35, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 4, 34 et 35. Enfin, toujours selon cette même approche, le quatrième et dernier anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3 respectivement de séquence SEQ ID No. 43, 44 et 45, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 43, 44 et 45 ; et/ou une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ [D No. 46, 47 et 48, ou présentant au moins 80%, de préférence 85''A, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 46, 47 et 48. Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes : 20 SEQ ID No. 43 : ENVGTY SEQ ID No. 44 : GAS SEQ ID No. 45 : GQTYSFPYT SEQ ID No. 46 : GYTFTSSS SEQ ID No. 47 : IHPNSGNT 25 SEQ ID No. 48 : ARARSFYYAMDC

Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence 30 SEQ ID Nos. 43, 44 et 45, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 43, 44 et 45. De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID No. 46, 47 et 48, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 46, 47 et 48.

Selon une deuxième approche, les CDRs peuvent être définies suivant l'approche classique de Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, Sth Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, and later éditions). Suivant cette première approche, le premier anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3 respectivement de séquence SEQ ID No. 59, 60 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 59, 60 et 3 ; et/ou une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ IDD No. 61, 62 et 63, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 61, 62 et 63. Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes : SEQ ID No. 59 : RASASVEYYGTSLMH SEQ ID No. 60 : EASNVES SEQ ID No. 61 : STYTMS SEQ ID No. 62 : YISSGGGTTYYPDTVKG SEQ ID No. 63 : PRIGTGFAY Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID Nos. 59, 60 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 59, 60 et 3.

De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID No. 61, 62 et 63, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 61, 62 et 63. Suivant cette même approche, le deuxième anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3 respectivement de séquence SEQ ID No. 69, 70 et 19, ou présentant au moins 80%, de préférence 85''A, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 69, 70 et 1 9 ; et/ou une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ [D No. 71, 72 et 73, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 71, 72 et 73. Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes : SEQ ID No. 69 : KASQNVGIAVA SEQ ID No. 70 : SASNRYT SEQ ID No. 71 : STSGMGVS SEQ ID No. 72 : HIYWDDDKRYVPSLKS SEQ ID No. 73 : RDHYGDYSYA:VIDY

Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID Nos. 69, 70 et 19, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 69, 70 et 19. De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID No. 71, 72 et 73, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 71, 72 et 73. Toujours suivant cette même approche, le troisième anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3 respectivement de séquence SEQ ID No. 79, 60 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 79, 60 et 3 ; et/ou une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ ID No. 61, 80 et 81, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 100, 101 et 102.

Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes : SEQ ID No. 79 : ASVDYYGTSL SEQ ID No. 80 : YISSGGVTTYYPDTIKG SEQ ID No. 81 : PRTGTGFAY Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID Nos. 79, 60 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 79, 60 et 3.

De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID No. 61, 80 et 81, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 61, 80 et 81.

Enfin, toujours selon cette même approche, le quatrième et dernier anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3 respectivement de séquence SEQ ID No. 85, 86 et 45, ou présentant au rnoins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 85, 86 et 45 ; et/ou une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3 respectivement de séquence SEQ l[D No. 87, 88 et 89, ou présentant au moins 80%, de préférence 85°/>, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 87, 88 et 89.

Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes : SEQ ID No. 85 : KASENVGTYVS SEQ ID No. 86 : GASNRYTGVPI) SEQ ID No. 87 : TSSSMH 17 SEQ ID No. 88 : EIHPNSGNTNNNEKFKG SEQ ID No. 89 : ARSFYYAMDC

Plus particulièrement, de manière préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID Nos. 85, 86 et 45, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 85, 86 et 45. De manière également préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne lourde comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID No. 87, 88 et 89, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 87, 88 et 89.

Dans la présente description, les termes polypeptides, séquences polypeptidiques, peptides et protéines attachés aux composés anticorps ou à leur séquence sont interchangeables. Il doit être compris ici que l'invention ne concerne pas les anticorps sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être isolés ou obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, ou par synthèse chimique, et qu'ils peuvent alors comporter des acides aminés non naturels comme cela sera décrit plus loin. Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acide aminé au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acide aminé sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison pouvant être réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison . L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. I3iol. 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P). Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acide aminé est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acide nucléique ou d'acide aminé à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, BLAST 2 sequences (Tatusova et al.., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres open gap penaltie : 5, et extension gap penaltie : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice BLOSUM 62 proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme.

Par séquence d'acide aminé présentant au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité avec une séquences d'acide aminé de référence, on préfère celles présentant par rapport à la séquence de référence, certaines modifications, en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncation ou un allongement. Dans le cas d'une substitution, d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s) consécutif(s) ou non consécutif(s), on préfère les substitutions dans lesquelles les acides aminés substitués sont remplacés par des acides aminés équivalents . L'expression acides aminés équivalents vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les activités biologiques des anticorps correspondants et telles qu'elles seront définies par la suite, notamment dans les exemples. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec [es acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur des résultats d'essais comparatifs d'activité biologique entre les différents anticorps susceptibles d'être effectués. A titre d'exemple non limitatif, le tableau 1 ci-dessous reprend les possibilités de substitution susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification lo approfondie de l'activité biologique de l'anticorps modifié correspondant, les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. Résidu originel Substitution(s) Al a (A) Val, Gly, Pro Arg (R) Lys, His Asn (N) Gln A 5;p (D) Glu Cys (C) Ser Gln (Q) Asn Glu (G) Asp Gly (G) Ala His (H) Arg Ile (I) Leu Leu (L) Ile, Val, Met Lys (K) Arg Met (M) Leu Phe (F) Tyr Pro (P) Ala Ser (S) Thr, Cys Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Phe, Trp Val (V) Leu, Ala Tableau 1 Il est admis par l'homme de l'art, comme état de la technique, que la plus grande variabilité (longueur et composition) entre les 6 CDRs se retrouve chez les 3 CDRs de la chaîne lourde et, plus particulièrement, le CDR-H3 de cette chaîne lourde. Par conséquent, il sera évident que les CDRs caractéristiques préférés de l'anticorps selon l'invention seront les 3 CDRs de la chaîne lourde et, encore plus préférentiellement, le CDR correspondant au CDR-H3. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention est relative à un anticorps murin, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention Selon une autre forme de réalisation de l'invention, ledit premier anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID No. 1, 2 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 1, 2 et 3 ; et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de séquence SEQ ID Nos. 4, 5 et 6, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 4, 5 et 6. Selon encore une autre forme de réalisation de l'invention, ledit premier anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID No. 59, 60 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 59, 60 et 3 ; et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de séquence SEQ ID Nos. 61, 62 et 63, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 61, 62 et 63. Selon encore une autre forme de réalisation, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 7 ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 7, et/ou en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 8 ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 8. Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes : SEQ ID No. 7 : DIVLSQSPASLALSLGQRATISCRASASVEYYGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYE ASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDLAIYFCQQSRKAPYTFGGGTKLE IK SEQ ID No. 8 : EVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSTYTMSWVRQTPEKRLEWVAYISS 10 GGGTTYYPDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLKSEDTAMYYCATPRIGTGFA YWGQGTLVTVSA

Selon une autre forme de réalisation de l'invention, ledit deuxième anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend une chaîne légère 15 comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID No. 17, 18 et 19, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 17, 18 et 19 ; et une chaîne lourde comprenant [es trois CDRs respectivement de séquence SEQ ID Nos. 20, 21 et 22, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% 20 d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 20, 21 et 22. Selon encore une autre forme de réalisation de l'invention, ledit deuxième anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID No. 69, 70 et 19, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 25 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 69, 70 et 19 ; et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de séquence SEQ ID Nos. 71, 72 et 73, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 71, 72 et 73. 30 Selon encore une autre forme de réalisation, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 23 ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec la 22 séquence SEQ ID No. 23, et/ou en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 24 ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 24.

Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes : SEQ ID No. 23 : DIVMTQSQKFMSTSEGDRVSITCKASQNVGIAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASNR YTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYFCQQYSSNPTFGAGTKLELK SEQ ID No. 24 : QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFTLSTSGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYW DDDKRYNPSLKSRLTI SKDTSRNQ VFLKITS VDTADTATYYCARRDHYGDYSY AMDYWGQGTSVTVSS

Selon une autre forme de réalisation de l'invention, ledit troisième anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID No. 33, 2 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 33, 2 et 3 ; et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de séquence SEQ ID Nos. 4, 34 et 35, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 4, 34 et 35. Selon encore une autre firme de réalisation de l'invention, ledit troisième anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID No. 79, 60 et 3, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 79, 60 et 3 ; et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de séquence SEQ ID Nos. 61, 80 et 81, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 61, 80 et 81. Selon encore une autre forme de réalisation, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 36 ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 36, et/ou en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 37 ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 37. Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes : SEQ ID No. 36 : DIVLTQSPASLALSLGQRATISCRASASVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYE ASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDLAIYFCQQSRKAPYTFGGGTKLE IK SEQ ID No. 37 : EVKLVESGGDLVQPGGSLKLSICAASGFTFSTYTMSWVRQTPEKRLEWVAYISS GGVTTYYPDTIKGRFTISRDNAKNTLFLQMNSLKSEDTAMYYCTSPRTGTGFAY WGQGTLVTVSA Selon une autre forme de réalisation de l'invention, ledit quatrième anticorps, ou Fun de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon IMGT, respectivement de séquence SEQ ID No. 43, 44 et 45, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 43, 44 et 45 ; et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de séquence SEQ ID Nos. 46, 47 et 48, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 46, 47 et 48. Selon encore une autre forme de réalisation de l'invention, ledit quatrième anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels comprend une chaîne légère comprenant les trois CDRs, tels que définis selon Kabat, respectivement de séquence SEQ ID No. 85, 86 et 45, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 85, 86 et 45 ; et une chaîne lourde comprenant les trois CDRs respectivement de séquence SEQ ID Nos. 87, 88 et 89, ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec les séquences SEQ ID No. 87, 88 et 89.

Selon encore une autre forme de réalisation, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention comprend une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 49 ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 49, et/ou en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 50 ou présentant au moins 80%, de préférence 85%, 90%, 95% et 98% d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 50. Pour plus de clarté, les séquences protéiques mentionnées sont les suivantes : 10 SEQ ID No. 49 : l` IIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASN R:YTGVPDRFTGSGSATDFTLTL'S S VQAEDLADYHCGQTYSFPYTFGGGTKL EIK SEQ ID No. 50 : QVQLQQPGSVLVRPGASVKLSCKASGYTFTSSSMHWAKQR.PGQGLEWIGEIHP 15 NSGNTNNNEKFKGKATLTVDTSSSTAYVDLSSLSSEDSAVYYCAR.ARSFYYAM DCWGQGTSVTVSS

Comme vu plus haut, l'invention vise également tout composé dérivé d'un anticorps selon l'invention. 20 Plus particulièrement, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention est caractérisé en ce que ledit composé dérivé consiste en une protéine de liaison comprenant une charpente peptidique sur laquelle est greffé au moins un CDR de manière à conserver tout ou partie des propriétés paratopiques de reconnaissance de l'anticorps initial. 25 Une ou plusieurs séquences parmi les séquences des CDRs décrits dans cette invention peuvent aussi être présentées sur des charpentes (ou scaffold selon la nomenclature anglaise) protéiques différentes des immunoglobulines. Dans ce cas, la séquence protéique permet de recréer un squelette peptidique favorable au repliement du ou des CDRs greffés, lui(leur) permettant de conserver leurs propriétés paratopiques 30 de reconnaissance de l'antigène. De manière générale, l'homme de l'art sait déterminer le type de charpente protéique sur laquelle greffer au moins l'un des CDRs issu(s) de l'anticorps originel. Plus particulièrement, il est connu que, pour être sélectionnées, de telles charpentes doivent répondre au plus grand nombre de critères tels qu'énumérés ci-dessous (Skerra A., J. Mol. Recogn. 13, 2000, 167-187) : bonne conservation phylogénétique ; - structure tri-dimensionnelle connue (comme par exemple par 5 cristallographie, spectroscopie NMR ou toute autre technique connue de l'homme de l'art) ; petite taille ; - peu ou pas de modifications post-transcriptionelle ; et/ou - facile à produire, à exprimer et à purifier. 10 L'origine de telles charpentes protéiques peut être, mais n'est pas limitée à des structures sélectionnées parmi : la fibronectine et préférentiellement le 10ème domaine de la fibronectine de type 3, la lipocaline, l'anticaline (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4) :257-75), la protéine Z issue du domaine B de la protéine A de Staphylococcus aureus, la thioredoxin A ou encore les protéines à motifs répétés de type "ankyrin 15 repeat" (Kohl et al., PNAS, 2003, vol.100, No. 4, 1700-1705), "armadillo repeat", "leucine-rich repeat" ou "tetratricopeptide repeat". Peuvent également être mentionnées les charpentes dérivées de toxines comme, par exemple les toxines suivantes :issues de scorpions, insectes, plantes, mollusques, ...) ou les inhibiteurs protéiques de la NO synthase neuronale (PIN). 20 Comme exemple, aucunement limitatif, de telles constructions hybrides, il peut être cité l'insertion du CDR-H1 (chaîne lourde) d'un anticorps anti-CD4, à savoir le 13B8.2, sur l'une des boucles de PIN, la nouvelle protéine de liaison ainsi obtenue conservant les mêmes propriétés de liaison que l'anticorps d'origine (Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344). Peut également être mentionné à titre illustratif la greffe du CDR-H3 (chaîne 25 lourde) d'un anticorps VHH anti-lyzozyme sur l'une des boucles de la neocarzinostatine (Nicaise et al., 2004). Enfin, comme décrit plus haut, de telles charpentes peptidiques peuvent comprendre de 1 à 6 CDR(s) issu(s) de l'anticorps d'origine. De manière préférée, mais sans aucune obligation, l'homme de l'art sélectionnera au moins un CDR issu de la 30 chaîne lourde, cette dernière étant connue pour être principalement responsable de la spécificité de l'anticorps. La sélection du ou des CDR(s) pertinent(s) est évidente pour l'homme de l'art, ce dernier mettant alors en oeuvre des techniques connues (Bes et al., FEBS letters 508, 2001 67-74).

Bien évidemment, ces exemples ne sont aucunement limitatifs, et toute autre structure connue ou évidente pour l'homme de l'art doit être considérée comme faisant partie de la protection conférée par la présente demande de brevet. La présente invention a donc pour objet un anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels caractérisé en ce que la charpente peptidique est sélectionnée parmi les protéines a) phylogénétiquement bien conservée, b) d'architecture robuste, c) avec une organisation moléculaire en trois dimensions bien connues, d) de petite taille et/ou e) comprenant des régions pouvant être modifiées par délétion et/ou insertion sans modifications des propriétés de stabilité.

Selon une forme de réalisation préférée, l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention est caractérisé en ce que ladite charpente peptidique est sélectionnée parmi i) les charpentes issues de la fibronectine, préférentiellement le 10ème domaine de la fibronectine de type 3, la lipocaline, l'anticaline, la protéine Z issue du domaine B de la protéine A de Staphylococcus aureus, la thioredoxin A, ii) les protéines à motifs répétés de type "ankyrin repeat", "armadillo repeat", "leucine-rich repeat" ou "tetratricopeptide repeat", ou encore iii) les inhibiteurs protéiques de la NO synthase neuronale (PIN). Selon un autre aspect de l'invention, il est également fait mention des fragments fonctionnels de l'anticorps décrit plus haut.

Plus particulièrement, l'invention vise un anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, l'invention caractérisé en ce que ledit fragment fonctionnel est choisi parmi les fragments Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc et les diabodies, ou tout fragment dont la demie-vie aurait été augmentée comme des fragments pégylés.

De tels fragments fonctionnels d'anticorps selon l'invention consistent, par exemple, en des fragments Fv, scFv (sc pour simple chaîne), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diabodies, ou tout fragment dont la durée de demie-vie aurait été augmentée par modification chimique, comme l'ajout de poly(alkylène) glycol tel que le poly(éthylène)glycol ("PEGylation") (fragments PEGylés appelés Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab'')2-PEG ou Fab'-PEG) ( PEG d'après la nomenclature anglaise Poly(Ethylene) Glycol), ou par incorporation dans un liposome, microsphères ou PLGA, lesdits fragments présentant au moins un des CDRs caractéristiques selon l'invention, et, notamment, en ce qu'il est capable d'exercer de manière générale une activité même partielle de l'anticorps dont il est issu. De préférence, lesdits fragments fonctionnels seront constitués ou comprendront une séquence partielle de la chaîne variable lourde ou légère de l'anticorps dont ils sont dérivés, ladite séquence partielle étant suffisante pour retenir la même spécificité de liaison que l'anticorps dont elle est issue et une affinité suffisante, de préférence au moins égale à i/loo, de manière plus préférée à au moins 1/10 de celle de l'anticorps dont elle est issue. Un tel fragment fonctionnel comportera au minimum 5 acides aminés, de 10 préférence 10, 1.5, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence de l'anticorps dont il est issu. De préférence, ces fragments fonctionnels seront des fragments de type Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fe ou diabodies, qui possèdent généralement la même spécificité de fixation que l'anticorps dont ils sont issus. Selon la présente invention, 15 des fragments d'anticorps de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière les fragments d'anticorps compris dans la présente invention peuvent être obtenus par des techniques de recombinaisons génétiques bien 20 connues également de l'homme de l'art ou encore par synthèse peptidique au moyen par exemple de synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc.. Sous un aspect également particulier, la présente invention est relative à un anticorps chimérique, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon 25 l'invention, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend en outre les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps d'une espèce hétérologue à la souris, notamment de l'Homme. Selon encore un autre aspect de l'invention, l'anticorps humanisé, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, est caractérisé en ce que les régions 30 constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps humain sont respectivement la région lambda ou kappa et gamma-1, gamma-2 ou gamma-4. Selon un autre aspect, l'invention est relative à un premier hybridome murin capable de sécréter un anticorps monoclonal selon la présente invention, notamment l'hybridome d"origine murine tel que déposé au Centre National de Culture de Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 22 février 2008 sous le numéro I-3920. Ledit hybridome a été obtenu par fusion de splénocytes de souris immunisées Balb/c et de lignées cellulaires de myélome Sp 20 Ag 14. L'anticorps monoclonal dénommé ici 203B6, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fbnctionnels est sécrété par ledit hybridome déposé à la CNCM le 22 février 2008 sous le numéro I-3920. Selon un autre aspect, l'invention est relative à un deuxième hybridome murin capable de sécréter un anticorps monoclonal selon la présente invention, notamment l'hybridome d'origine murine tel que déposé au Centre National de Culture de Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 22 février 2008 sous le numéro I-3921,. Ledit hybridome a été obtenu par fusion de splénocytes de souris immunisées Balb/c et de lignées cellulaires de myélome Sp 20 Ag 14. L'anticorps monoclonal dénommé ici 205H8, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels est sécrété par ledit hybridome déposé à la CNCM le 22 février 2008 sous le numéro I-3921. Selon un autre aspect, l'invention est relative à un troisième hybridome murin capable de sécréter un anticorps monoclonal selon la présente invention, notamment l'hybridome d'origine murine tel que déposé au Centre National de Culture de Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 21 février 2008 sous le numéro I-3918. Ledit hybridome a été obtenu par fusion de splénocytes de souris immunisées Balb/c et de lignées cellulaires de myélome Sp 20 Ag 14. L'anticorps monoclonal dénommé ici 211F3, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels est sécrété par ledit hybridome déposé à la CNCM le 21 février 2008 sous le numéro I-3918. Enfin, selon un autre aspect, l'invention est relative à un quatrième hybridome murin capable de sécréter un anticorps monoclonal selon la présente invention, notamment l'hybridome d'origine murine tel que déposé au Centre National de Culture de Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France) le 21 février 2008 sous le numéro I-3919. Ledit hybridome a été obtenu par fusion de splénocytes de souris immunisées Balb/c et de lignées cellulaires de myélome Sp 20 Ag 14. L'anticorps monoclonal dénommé ici 214B2., ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels est sécrété par ledit hybridome déposé à la CNCM le 21 février 2008 sous le numéro I-3919. Pour plus de clarté, le tableau 2 ci dessous regroupe les différentes séquences en acides aminés correspondant aux différents anticorps selon l'invention avec les séquences de CDR définies selon IMGT en gras et celles définies selon Kabat en italique. 203B6 205H8 211F3 214B2 (I-3920) (I-3921) (I-3918) (I-3919) _CDR-L 1 1 59 17 69 33 79 43 85 CDR-L2 2 60 18 70 2 60 44 86 CDR-L3 3 3 19 19 3 3 45 45 Light Chain 7 23 36 49 _CDR-H 1 4 61 20 71 4 61 46 87 CDR-H2 5 62 21 72 34 80 47 88 _CDR-H3 6 63 22 73 35 81 48 89 _Fleavy Chain 8 24 37 50 Tableau 2 Sont également compris par anticorps selon la présente invention, les anticorps chimériques ou humanisés. Par anticorps chimérique, on entend désigner un anticorps qui contient une région variable (chaîne légère et chaîne lourde) naturelle dérivée d'un anticorps d'une espèce donnée en association avec les régions constantes de chaîne légère et chaîne lourde d'un anticorps d'une espèce hétérologue à ladite espèce donnée. Les anticorps ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent être préparés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, l'anticorps chimérique pourra être réalisé en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps monoclonal non humain, notamment murin, selon l'invention et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la spécificité de cet anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de l'ADN murin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain. Pour les méthodes de préparation d'anticorps chimériques, on pourra par exemple se référer au document Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988). Par anticorps humanisés, on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humaine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivée d'un (ou de plusieurs) anticorps humains. En outre, certains des résidus des segments du squelette (dénommés FR) peuvent être modifiés pour conserver l'affinité de liaison (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986 ; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988 ; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988). Les anticorps humanisés selon l'invention ou leurs fragments peuvent être ro préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (comme par exemple celles décrites dans les documents Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992 ; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992 ; ou Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). De tels anticorps humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vitro, ou de traitement 15 prophylactique et/ou thérapeutique in vivo. D'autres techniques d'humanisation sont également connues de l'homme de l'art comme par exemple la technique du CDR Grafting décrite par PDL faisant l'objet des brevets EP 0 451 261, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647 ou encore US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 et US 5,693,761. On peut également cirer les brevets US 5,639,641 ou encore 6,054,297, 20 5,886,152 et 5,877,293. En outre, l'invention vise également les anticorps humanisés issus des anticorps murins décrit ci-dessus. De manière préférée, les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps humain sont respectivement la région lambda ou kappa et 25 gamma-1, gamma-2 ou gamma-4 Dans la forme d'exécution correspondant à l'isotype IgG1, une caractéristique supplémentaire de l'anticorps est de présenter des fonctions effectrices comme l'ADCC (d'après la nomenclature anglaise Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity ) et/ou la. CDC (d'après la nomenclature anglaise Complement Dependent Cytotoxicity ). 30 En outre, comme cela ressortira des exemples ci-après, l'anticorps objet de la présente invention se caractérise des anticorps connus à ce jour en ce sens qu'il est capable d'inhiber la prolifération des cellules tumorales.

Comme cela a été dit plus haut, la protéine CD151 fait partie de la famille des tétraspanines et, à ce titre, comprend 2 domaines extracellulaires EC 1 (18 acides aminés, séquence [40-57]) et EC2 (109 acides aminés, séquence [113-221]), appelés aussi boucles extracellulaires.

Selon la présente invention, les anticorps utilisés sont capables de se lier à au moins un épitope situé dans le domaine extracellulaire. De manière préférée, ledit anticorps se fixera au niveau des boucles EC1 et/ou EC2. Plus particulièrement, selon une forme d'exécution préférée de l'invention, il est décrit l'utilisation d'au moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable de se lier à un épitope compris dans la boucle extra-cellulaire 1 (EC1) et/ou 2 (EC2), préférentiellement EC2, correspondant respectivement aux acides-aminés 40-57 et 113-221 de la protéine CD151. La boucle EC1 [40-57] comprend 18 acides-aminés et présente une masse théorique de 2002,2 Da.

La boucle EC2 [113-221] possède un site de N-glycosylation (résidu Asn159) et 6 résidus Cystéine formant 3 ponts disulfure. Un modèle structural de la boucle EC2 des tétraspanines, et notamment de CD151, a été proposé à partir de la structure tridimensionnelle de la boucle EC2 de la tétraspanine CD81 (Seigneuret et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 40055-40064). Selon ce modèle, les tétraspanines possèdent une charpente commune, relativement conservée et constituée de 3 hélices a, et un domaine spécifique variable. Pour CD151, cette charpente serait constituée des régions [113-157] et [209-221], et le domaine variable de la région [158-208]. Le domaine variable de la boucle EC2 serait plus particulièrement impliqué dans les interactions spécifiques de CD151 avec des protéines de la famille des intégrines.

Des expériences de mutagénèse dirigée ont notamment montré l'importance de la région [193-208], et plus précisément du tripeptide QRD [194-196] et du résidu Cystéine en position 192, dans l'association de CD151 avec certaines intégrines récepteurs de la laminine, telles que les intégrines a3(31 ou a6[34 (Kazarov et al., 2002, J. Cell Biol. 158, 1299-1309).

De manière encore plus préférée, la présente invention vise l'utilisation d'au moins un anticorps anti-CD151, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable de se lier à un épitope de la région EC2.

Sous un nouvel aspect, la présente invention est relative à un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique, ADN ou ARN, codant pour un anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, tel que défini plus haut ; b) un acide nucléique complémentaire d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus en a) : c) un acide nucléique d'au moins 18 nucléotides capable d'hybrider dans des conditions de forte stringence avec au moins l'une des séquences d'acide nucléique SEQ ID No. 9.46, 25-32, 38-42, 51-58, 64-68, 74-78, 82-84 ou 90-94 ou avec une séquence présentant au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 %, d'identité après alignement optimal avec lesdites séquences. Le tableau 3 ci-dessous regroupe les différents séquences nucléotidiques concernant les anticorps selon l'invention avec les séquences de CDR définies selon IMGT en gras et celles définies selon Kabat en italique. 203B6 205H8 211F3 214B2 (I-3920) (I-3921) (I-3918) (I-3919) C'DR-L 1 9 64 25 74 38 82 51 90 CDR-L2 10 65 26 75 10 65 52 91 CDR-L3 11 11 27 27 11 11 53 53 Light Chain 15 31 41 57 CDR-H1 12 66 28 76 12 66 54 92 CDR-H2 13 67 29 77 39 83 55 93 CDR-H3 14 68 30 78 40 84 56 94 Heavy Chain j 16 32 1 42 58 Tableau 3

Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits AI)Ns.

Il doit être aussi compris ici que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner ici les acides nucléiques isolés obtenus par recombinaison génétique au moyen par exemple de cellules hôtes ou obtenus par synthèse chimique. Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 %, après alignement optimal avec une séquence de préférence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique et/ou une substitution, notamment ponctuelle. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences codent pour les mêmes séquences d'acide aminés que la séquence de référence, ceci lié à la dégénérescence du code génétique, ou de séquences complémentaires qui sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences de référence de préférence dans des conditions de forte stringence notamment telles que définies ci-après. Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif; des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes. L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e.: 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., (1989, Molecular cloning : a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).

L'invention est également relative à un vecteur comprenant un acide nucléique selon la présente invention. L'invention vise notamment les vecteurs de clonage et/ou d'expression qui contiennent une séquence nucléotidique selon l'invention. Les vecteurs selon l'invention comportent de préférence des éléments qui permettent l'expression et/ou la sécrétion des séquences nucléotidiques dans une cellule hôte déterminée. Le vecteur doit alors comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule hôte et peut éventuellement posséder des signaux particuliers qui spécifient la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents éléments sont choisis et optimisés par l'homme du métier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou être des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telle que la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, ou des méthodes chimiques. Les vecteurs selon l'invention sont par exemple des vecteurs d'origine plasmidique ou virale. Ils sont utiles pour transformer des cellules hôtes afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques selon l'invention. L'invention comprend également les cellules hôtes transformées par ou comprenant un vecteur selon l'invention. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut également utiliser des cellules d'insectes ou des cellules de plantes. L'invention concerne également les animaux, excepté l'Homme, qui comprennent une cellule transformée selon l'invention.

Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de production d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a.) la culture dans un milieu et conditions de culture appropriés d'une cellule hôte selon l'invention ; et b) la récupération desdits anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ainsi produits à partir du milieu de culture ou desdites cellules cultivées. Les cellules transformées selon l'invention sont utilisables dans des procédés de préparation de polypeptides recombinants selon l'invention. Les procédés de préparation d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre un vecteur et/ou une cellule transformée par un vecteur selon l'invention sont eux-mêmes compris dans la présente invention. De préférence, on cultive une cellule transformée par un vecteur selon l'invention dans des conditions qui permettent l'expression dudit polypeptide et on récupère ledit peptide recombinant.

Ainsi qu'il a été dit, l'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes. En particulier, il est possible d'identifier des séquences nucléotidiques selon l'invention, facilitant la sécrétion dans un tel système procaryote ou eucaryote. Un vecteur selon l'invention portant une telle séquence peut donc être avantageusement utilisé pour la production de protéines recombinantes, destinées à être sécrétées. En effet, la purification de ces protéines recombinantes d'intérêt sera facilitée par le fait qu'elles sont présentes dans le surnageant de la culture cellulaire plutôt qu'à l'intérieur des cellules hôtes. On peut également préparer les polypeptides selon l'invention par synthèse chimique. Un tel procédé de préparation est également un objet de l'invention.

L'homme du métier connaît les procédés de synthèse chimique, par exemple les techniques mettant en oeuvre des phases solides (voir notamment Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2ème éd., (1984)) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique. Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention. 36 Les anticorps, ou l'un de leurs composés dérivés ou fragments fonctionnels, susceptibles d'être obtenus par un procédé selon l'invention sont également compris dans la présente invention. Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne un anticorps tel que décrit plus haut, caractérisé en ce qu'il est, en outre, bispécifique, c'est-à-dire capable de se lier spécifiquement sur une protéine humaine ou un récepteur humain autre que CD151. Les anticorps bispécifiques ou bifonctionnels constituent une seconde génération d'anticorps monoclonaux dans lesquelles deux régions variables différentes sont combinées dans la même molécule (Hollinger and Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev. 18: 411-419). Leur utilité .a été mise en évidence tant dans le domaine du diagnostic que dans le domaine de la thérapie de part leur capacité à recruter de nouvelles fonctions effectrices ou à cibler plusieurs molécules à la surface de cellules tumorales. Ces anticorps peuvent être obtenus par des méthodes chimiques (Glennie MJ et al. 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375 ; Repp R. et al. 1995 J. Hemat. 377-382) ou somatiques (Staerz U.D. and Bevan M.J. 1986 PNAS 83, 1453-1457 ; Suresh M.R. et al. 1986 Method Enzymol. 121 : 21.0-228) mais également et préférentiellement par des techniques d'ingénierie génétique qui permettent de forcer l'héterodimérisation et facilitent ainsi le procédé de purification de l'anticorps recherché (Merchand et al. 1998 Nature Biotech. 16 : 677-681). Ces anticorps bispécifiques peuvent être construits comme des IgG entières, comme des Fab'2 bispécifiques, comme des Fab'PEG ou comme des diabodies ou encore comme des scFv bispécifiques mais également comme un anticorps bispécifique tétravalent où deux sites de fixation sont présents pour chaque antigène ciblé (Park et al. 2000 Mol. Immunol. 37(18) : 1123-30) ou ses fragments comme décrit plus haut. Outre un avantage économique du fait que la production et l'administration d'un anticorps bispécifique soit moins onéreuse que le production de deux anticorps spécifiques, l'utilisation de tels anticorps bispécifiques a pour avantage de réduire la toxicité du traitement. En effet, l'utilisation d'un anticorps bispécifique permet de diminuer la quantité globale d'anticorps circulants et, par suite, la toxicité éventuelle. Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, l'anticorps bispécifique est un anticorps bivalent ou tétravalent. 37 Enfin, la présente invention vise l'anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, tel que décrit plus haut à titre de médicament. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un composé consistant en un anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'invention. De préférence, ledit anticorps est additionné d'un excipient et/ou d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Selon encore une autre forme d'exécution, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique telle que décrite plus haut qui comprend, en outre, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, au moins un autre anticorps, un agent cytotoxique/cytostatique, une toxine cellulaire ou un radioélément. On entend par "utilisation simultanée", l'administration des deux composés de la composition selon l'invention compris dans une seule et même forme pharmaceutique. On entend par "utilisation séparée", l'administration, en même temps, des deux composés de la composition selon l'invention, compris dans des formes pharmaceutiques distinctes. On entend par "utilisation étalée dans le temps", l'administration successive des deux composés de la composition selon l'invention, compris chacun dans une forme pharmaceutique distincte.

D'une façon générale, la composition selon l'invention augmente considérablement l'efficacité du traitement du cancer. En d'autres termes, l'effet thérapeutique de l'anticorps selon l'invention est potentialisé de manière inattendue par l'administration d'un agent cytotoxique. Un autre avantage subséquent majeur produit par une composition selon l'invention, concerne la possibilité d'utiliser des doses efficaces en principe actif plus faibles, ce qui permet d'éviter ou de réduire les risques d'apparition des effets secondaires, en particulier l'effet de l'agent cytotoxique. De plus, cette composition selon l'invention permettrait d'atteindre l'effet thérapeutique escompté plus rapidement. Par agents thérapeutiques anti-cancer ou agents cytotoxiques , il faut comprendre une substance qui, lorsqu'elle est administrée à un patient, traite ou prévient le développement du cancer chez le patient. A titre d'exemple non limitatif pour de tels agents, il peut être mentionné les agents alkylant , les antimétabolites, les antibiotiques anti-tumoraux, les inhibiteurs mitotiques, les inhibiteurs de fonction 38 chromatine, les agents anti-angiogénèse, les anti-oestrogène, les anti-androgène ou les immuno-modulateurs. De tels agents sont, par exemple, cités dans le VIDAL, à la page consacrée aux composés attachés à la cancérologie et l'hématologie colonne Cytotoxiques , ces composés cytotoxiques cités par référence à ce document sont cités ici comme agents cytotoxiques préférés. Les agents alkylants font référence à toute substance qui peut se coupler de manière covalente ou alkyler toute molécule, préférentiellement un acide nucléique (ex.: ADN), au sein d'une cellule. Comme exemples de tels agents alkylants, il peut être cité les moutardes à l'azote comme la méchloréthamine, le chlorambucil, le melphalan, le chlorhydrate, le pipobroman, la prednimustine, le phosphate disodique ou l'estramustine ; les oxazaphosphorines comme la cyclophosphamide, 1' altretamine, la trofosfamide, la, sulfofosfamide ou l'ifosfamide ; les aziridines ou ethylènes-imines comme le thiotepa, la triéthylèneamine ou l'altétramine ; les nitrosourées comme la carmustine, la streptozocine, la fotémustine ou la lomustine ; les sulfonates d'alkyle comme le busulfan, le tréosulfan ou l'improsulfan ; les triazènes comme la dacarbazine ; ou encore les complexes du platine comme le cisplatine, l'oxaliplatine ou le carboplatine. Les antimétabolites font référence à des substances qui bloquent la croissance et/ou le métabolisme cellulaire en interférant avec certaines activités, généralement la synthèse d'ADN. A titre d'exemple d'antimétabolite, il peut être mentionné les methotrexate, 5 -fluorouracile, floxuridine, 5-fluorodeoxyuridine, capecitabine, cytarabine, fludarabine, cytosine arabinoside, 6-mercaptopurine (6-MP), 6-thioguanine (6-TG), chlorodésoxyadénosine, 5-azacytidine, gemcitabine, cladribine, deoxycoformycine et la pentostatine. Les antibiotiques anti-tumoraux font référence aux composés qui peuvent prévenir ou inhiber la synthèse d'ADN, d'ARN et/ou de protéines. Des exemples de tels antibiotiques anti-tumoraux comprennent la doxorubicine, daunorubicine, idarubicine valrubicine, mitoxantrone, dactinoraycine, mithramycine, plicamycine, mitomycine C, bleomycine, et la procarbazine. Les inhibiteurs mitotiques préviennent la progression normale du cycle cellulaire et de la mitose. En general, les inhibiteurs des microtubules ou taxoides comme le paclitaxel et le docétaxel sont capables d'inhiber la mitose. Les alcaloîdes de 39 vinca, comme la vinblsatine, la vincristine, la vindésine et la vinorelbine sont également capables d'inhiber la mitose. Les inhibiteurs de fonction chromatine ou inhibiteurs de topoisomérases font référence à des substances qui inhibent la fonction normale des protéines modélant la chromatine comme les topo-isomérases I et II. Des exemples de tels inhibiteurs comprennent, pour la topo-isomérase I, la camptothécine ainsi que ses dérivés comme l'irinotécan ou le topotécan et, pour la topo-isomérase II, l'étoposide, le phosphate d'étiposide et le téniposide. Les agents anti-angiogénèse font références à toute drogue, composé, substance ou agent qui inhibe la croissance des vaisseaux sanguins. Des exemples d'agents anti-angiogénèse comprennent, sans aucune limitation, les razoxin, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginone, COL-3, neovastat, BMS-275291, thalidomide, CDC 501, DMXAA, L-651582, squalamine, endostatine, SU5416, SU6668, interferon-alpha, EMD121974, interleukine-12, IM862, angiostatine et la vitaxine. Les anti-oestrogène ou agents anti-oestrogénique font référence à toute substance qui diminue, antagonise ou inhibe l'action des oestrogènes. Des exemples de tels agents sont les tamoxifène, toremifène, raloxifène, droloxifène, iodoxyfène, anastrozole, letrozole, et l'exemestane.

Les anti-androgènes ou agents anti-androgène font référence à toute substance qui réduit, antagonise ou inhibe l'action d'un androgène. Des exemples d'anti-androgènes sont les flutamide, nilutamide, bicalutamide, sprironolactone, cyproterone acetate, finasteride et la cimitidine. Les immunomodulateurs sont des substances qui stimulent le système immunitaire. Des exemples de tels immunomodulateurs comprennent les interférons, les interleukines comme l'aldesleukine., OCT-43, denileukin diflitox ou l'interleukine-2, les facteurs de nécrose tumorale comme la tasonermine, ou d'autres types d' immunomodulateurs comme le lentinan, le sizofiran, le roquinimex, le pidotimod, la pégadémase, la thymopentine, le poly I :C, ou le levamisole en combinaison avec le 5- fluorouracil. Pour plus de détails, l'homme de l'art pourra se reporter au manuel édité par l'Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique intitulé traité de 40 chimie thérapeutique, Vol. 6, Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, édition TEC & DOC, 2003 . Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition comme produit de combinaison selon l'invention est caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique est couplé chimiquement audit anticorps pour une utilisation simultanée. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique/cytostatique est choisi parmi les agents inhibiteurs ou stabilisateurs du fuseau, de préférence la vinorelbine et/ou la vinflunine et/ou la vincristine.

Afin de faciliter le couplage entre ledit agent cytotoxique et ledit anticorps selon l'invention, on pourra notamment introduire des molécules espaceurs entre les deux composés à coupler, telles que des poly(alkylènes)glycols comme le polyéthylèneglycol, ou encore des acides aminés, ou, dans un autre mode de réalisation, utiliser des dérivés actifs desdits agents cytotoxiques dans lesquels auront été introduites des fonctions capables de réagir avec ledit anticorps selon l'invention. Ces techniques de couplage sont bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description. L'invention est, sous un autre aspect, relative à une composition caractérisée en ce que l'un, au moins, desdits anticorps, ou l'un de leur composé dérivé ou fragment fonctionnel, est conjugué avec une toxine cellulaire et/ou un radioélément De préférence, ladite toxine ou ledit radioélément est capable d'empêcher la croissance ou la prolifération de la cellule tumorale, notamment d'inactiver totalement ladite cellule tumorale. De préférence encore, ladite toxine est une toxine d'entérobactéries, notamment 25 l'exotoxine A de Pseudomonas. Les radioéléments (ou radio-isotopes) préférentiellement conjugués à l'anticorps ernployés en thérapie sont des radio-isotopes qui émettent des rayons gamma et préférentiellement l'iodine'31, l'yttrium90, l'or199, le palladium'0°, le cuivre67, le bismuth217 et l'antimony211. Les radio-isotopes qui émettent des rayons beta et alpha 30 peuvent également être utilisés en thérapie. Par toxine ou radioélément conjugué à au moins un anticorps, ou l'un de leur fragment fonctionnel, selon l'invention, on entend désigner tout moyen permettant de lier ladite toxine ou ledit radioélément audit au moins un anticorps, notamment par 41 couplage covalent entre les deux composés, avec ou sans introduction de molécule de liaison. Parmi les agents permettant une liaison chimique (covalente), électrostatique ou non covalente de tout ou partie des éléments du conjugué, il peut être mentionné tout particulièrement le benzoquinone, le carbodiimide et plus particulièrement l'EDC (1-ethyl-3-[3-dimet:hylaminopropyl]-carbodiimide hydrochloride), le dimaleimide, l'acide dithiobis-nitrobenzoic (DTNB), le N-succinimidyl S-acetyl thio-acetate (SATA),les agents dits de bridging présentant un ou plusieurs groupements, ayant un ou pliusieuyrs groupements phenylaside, réagissant avec les ultraviolets (U.V.) et tout préférentiellement le N-[ -4-(azi do salicylamino)butyl]-3 ' -(2 ' -pyri dyldithi o)-propionamide (APDP), le N-succinimid-yl 3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP) et le 6-hydrazino-nicotinamide (HYNIC). Une autre forme de couplage, tout spécialement pour les radioéléments, peut consister en l'utilisation d'un chélateur d'ions bifonctionnel.

Parmi ces chélateurs, il est possible de mentionner les chélates dérivés de l'EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) ou du DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid) qui ont été développés pour lier des métaux, particulièrement des métaux radioactifs, et des immunoglobulines. Ainsi, le DTPA et ses dérivés peut être substitué par différents groupements sur le chaîne de carbones de manière à augmenter la stabilité et la rigidité du complexe ligand-métal (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); US patent 4 831 175). Par exemple, le DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid) et ses dérivés, qui a été très largement utilisé en médecine et en biologie pendant longtemps soit sous sa forme libre, soit sous la forme d'un complexe avec un ion métallique, présente la caractéristique remarquable de former des chélates stables avec des ions métalliques et d'être couplé à des protéines d'intérêt thérapeutique ou diagnostique comme des anticorps pour le développement de radio-immunoconjugués en thérapie du cancer (Meases et al., (1984); Gansow et al. (1990)). De préférence également, ledit au moins un anticorps formant ledit conjugué 30 selon l'invention est choisi parmi ses fragments fonctionnels, notamment les fragments amputés de leur composante Fc tels que les fragments scFv. 42 La présente invention comprend en outre l'utilisation de la composition selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement du cancer. La présente invention est :relative également à l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, de préférence humanisé, et/ou d'une composition selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la prolifération de cellules tumorales. De manière générale, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, de préférence humanisé, et/ou d'une composition selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de cancer Parmi les cancers qui peuvent être prévenus et/ou traités, on préfère le cancer de la prostate, les ostéosarcomes, le cancer du poumon, le cancer du sein, le cancer de l'endomètre, le cancer du côlon, le myélome multiple ou le cancer des ovaires, le cancer du pancréas ou tout autre cancer.

De manière préférée, ledit cancer est un cancer choisi parmi le cancer de la prostate, le cancer du poumon, le cancer du colon et/ou le cancer du pancréas. Sous encore un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation e l'anticorps selon l'invention dans une méthode de diagnostic, de préférence in vitro, de maladies liées à un taux d'expression de CD151. Plus particulièrement, l'invention vise une méthode de diagnostic in vitro de maladies présentant une sur-expression ou une sous-expression de la protéine CD151 à partir d'un échantillon biologique dont on suspecte la présence anorrnale en protéine CD 151, ladite méthode consistant à mettre en contact ledit échantillon biologique avec un anticorps selon l'invention, ledit anticorps pouvant être le cas échéant marqué.

De préférence, lesdites maladies liées à la protéine CD151 dans ladite méthode de diagnostic seront des cancers. Ledit anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, peut se présenter sous forme d'immunoconjugué ou d'anticorps marqué afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.

Les anticorps marqués selon l'invention ou leurs fragments fonctionnels incluent par exemple des anticorps dits inununoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, l'a-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl- 43 cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromodésoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps ou leurs fragments fonctionnels selon l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour Green Fluorescent Protein ), le dansyl, l'umbelliférone etc... Dans de tels conjugués, les anticorps de l'invention ou leurs fragments fonctionnels peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhyde, l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylènetriaminepentaacétique (OPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que ceux mentionnés plus haut pour les conjugués thérapeutiques. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluorescéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate.

D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes, des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine, ou encore des marqueurs radioactifs tels que l'iodine123, l'iodine'25, l'iodine126, l'iodine133, le bromine77, le technetium99m, l'indium111, l'indium 13m, le gallium67, le gallium68, le ruthenium95, le ruthenium97, le ruthenium'03, le ruthenium'°5, le mercure107, le mercure203, le rh.enium99m, le rhenium101, le rhenium'°5, le scandium47, le tellurium121m, le tellurium122m, le tellurium125m, le thulium165, le thulium'67, le thulium168, la fluorine'8, l'yttrium199, l'iodine'3' Les procédés connus de l'homme de l'art existant pour coupler les radio-isotopes aux anticorps, soit directement, soit via un agent chélateur comme l'EDTA ou le DTPA mentionné plus haut, peuvent être utilisés pour les radioéléments en diagnostic. Il est donc également possible de mentionner le marquage au [I125]Na par la technique de la chloramine T [Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495] ou également avec le technetium99m par la technique de Crockford et al. (US patent 4 424 200) ou fixé via le DTPA comme décrit par Hnatowich (US patent 4 479 930). L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au ciblage spécifique d'un composé biologiquement actif vers des cellules exprimant ou surexprimant la protéine CD151. 44 On entend désigner ici par composé biologiquement actif tout composé capable die moduler, notamment d'inhiber, l'activité cellulaire, en particulier leur croissance, leur prolifération, la transcription ou la traduction de gènes. L'invention a aussi pour objet un réactif de diagnostic in vivo comprenant un anticorps selon l'invention, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence marqué, notamment radiomarqué, et son utilisation en imagerie médicale, en particulier pour la détection de cancer lié à l'expression ou à la surexpression par une cellule de la protéine CD151. L'invention est également relative à une composition comme produit de combinaison ou à un conjugué anti-CD151/toxine ou radioélément, selon l'invention, à titre de médicament. De préférence, ladite composition comme produit de combinaison ou ledit conjugué selon l'invention sera additionné d'un excipient et/ou d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Dans la présente description, on entend désigner par véhicule pharmaceutiquement acceptable, un composé ou une combinaison de composés entrant dans une composition pharmaceutique ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de l'administration du ou des composés actifs, l'augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l'organisme, l'augmentation de sa solubilité en solution ou encore l'amélioration de sa conservation. Ces véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront adaptés par l'homme de l'art en fonction de la nature et du mode d'administration du ou des composés actifs choisis. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou par voie orale. De manière plus préférée, la composition comprenant les anticorps selon l'invention, sera administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés. 45 L'invention concerne donc l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels pour la préparation d'un médicament destiné au ciblage spécifique d'un composé biologiquement actif vers des cellules exprimant ou surexprimant CD151. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.

LEGENDES DES FIGURES La figure 1 montre les séquences nucléotidiques et protéiques de la protéine CD151, séquences sur lesquelles sont mises en évidences les boucles EC1 et EC2. La figure 2 est un schéma illustrant la structure des tétraspanines dont fait partie la protéine CD151, et tout particulièrement les deux boucles extra-cellulaires EC1 et EC2. La figure 3 montre les séquences respectives des chaînes lourdes et légères de l'anticorps 203136 selon l'invention. Les CDRs définis selon le système IMGT apparaissent soulignés et en gras alors que les CDRs définis selon Kabat apparaissent encadrés.

La figure 4 montre les séquences respectives des chaînes lourdes et légères de l'anticorps 205118 selon l'invention. Les CDRs définis selon le système IMGT apparaissent soulignés et en gras alors que les CDRs définis selon Kabat apparaissent encadrés. La figure 5 montre les séquences respectives des chaînes lourdes et légères de l'anticorps 211F3 selon l'invention. Les CDRs définis selon le système IMGT apparaissent soulignés et en gras alors que les CDRs définis selon Kabat apparaissent encadrés. La figure 6 montre les séquences respectives des chaînes lourdes et légères de l'anticorps 214B2 selon l'invention. Les CDRs définis selon le système IMGT apparaissent soulignés et en gras alors que les CDRs définis selon Kabat apparaissent encadrés. La figure 7 illustre l'expression de la molécule CD151 chez des patients atteints de cancer de la prostate. Chaque lettre correspond à l'étude d'un patient et pour chaque 46 patient le panel supérieur correspond au tissu normal adjacent à la tumeur et le panel inférieur correspond au tissu tumoral. La figure 8 illustre l'expression de la molécule CD151 chez des patients atteints de cancer du poumon. Chaque lettre correspond à l'étude d'un patient et pour chaque patient le panel supérieur correspond au tissu normal adjacent à la tumeur et le panel inférieur correspond au tissu tumoral. La figure 9 montre l'analyse par cytométrie de flux de la reconnaissance de CD151 par l'anticorps 203B6 à la surface des cellules NIH 3T3-CD151, PC3 et A549. La figure 10 montre l'analyse par cytométrie de flux de la reconnaissance de CD151 par l'anticorps 205H8 à la surface des cellules NIH 3T3-CD151, PC3 et A549. La figure 11 montre l'analyse par cytométrie de flux de la reconnaissance de CD151 par l'anticorps 211F3 à la surface des cellules NIH 3T3-CD151, PC3 et A549. La figure 12 montre l'analyse par cytométrie de flux de la reconnaissance de CD151 par l'anticorps 214B2 à la surface des cellules NIH 3T3-CD151, PC3 et A549.

La figure 13 présente les résultats de l'évaluation de la spécificité des anticorps 203B6, 205H8, 211F3 et 214B2 par western blot. La figure 14 illustre l'activité anti-tumorale d'anticorps monoclonaux anti-CD151 dans le modèle de xénogreffe de tumeur de la prostate PC3. Des souris Swiss Nude (n=6) ont été greffées par voie sous cutanée avec les cellules PC3. Cinq jours après la greffe des cellules, les souris reçoivent, par voie i.p., une dose d'appel de 2 mg/souris de l'anticorps à tester su:[vie de deux administrations par semaine d'une dose de 1 mg/souris de cet anticorps. Le volume tumoral est évalué par la formule ir/6 x Longueur x largeur x épaisseur.

EXEMPLES

Exemple 1 : Etude de l'expression de la molécule CD151 L'expression de la protéine CD151 a été recherchée par immunohistochimie (IHC) dans des échantillons de tissus humains issus de patients atteints de cancers de la prostate ou de cancer du poumon. Pour ces patients des lames de tissus normaux adjacents à la tumeur étaient disponibles et ont donc été incluses pour calibrer le niveau d'expression dans les tissus tumoraux versus normaux. 47 Pour ces expériences, des lames de type Tissue array commerciales sont utilisées. Après déparaffinage, un démasquage antigénique est effectué à 30°C à l'aide d'une solution enzymatique contenant de la pepsine (Labvision ref. AP-9007-005). Cette étape est suivie par une étape d'élimination des peroxydases endogènes par incubation des coupes dans une solution de peroxyde d'hydrogène (Sigma) à 0,3% dans l'eau. Une saturation des sites non spécifiques est alors effectuée avec une solution d'Ultra-V-Block (Labvision, ref. TA-125-UB) et le marquage est effectué à l'aide d'un anticorps murin anti-CD151 commercial (Serotech, Ref. MCA 1856) utilisé à une concentration finale de 5 gg/ml. Un anticorps isotype contrôle IgGI murin (DakoCytomation, Ref. X0931) est utilisé comme contrôle négatif d'expérience. La révélation du marquage se fait avec le système de révélation Envision Dual Link (DakoCytomation, Ref. K4061) et :[a référence de la DAB, substrat des peroxydases est S3309 de DakoCytomation. Les résultats présentés dans la figure 7 montrent que plusieurs patients développant des tumeurs de la prostate présentent une sur-expression de la molécule CD151. Cette sur-expression peut être très significative pour 20% des patients étudiés (patients A et C) ou modérée (patients A et D). Il est à noter que, excepté au niveau des cellules endothéliales, les tissus normaux prostatiques correspondant n'expriment pas ou peu le CD151 et que, en cas d'expression, celle-ci semble être limitée à des structures de type glandulaires. Le patient E présente un exemple de tumeur n'exprimant pas CD151. Dans le cas du cancer du poumon (Figure 8), une expression modérée (patient A) à forte (patient B) est observée au niveau de certaines cellules du tissu pulmonaire normal. Cependant le tissu tumoral présente une très grande densité de cellules fortement marquées (patients A et B). Le patient C présente un exemple de tumeur n'exprimant pas CD151.

Exemple 2 : Génération et sélection des anticorps Des souris BALB/c ont été immunisées par voie sous-cutanée à l'aide de 20.106 cellules NIH 3T3 exprimant CD1,S1 humain à leur surface, cellules générées par transfection avec le gène de CD151. La première immunisation a été réalisée en présence d'adjuvant complet de Freund, puis les 2 suivantes en présence d'adjuvant incomplet de Freund. Trois jours avant la fusion, une injection de rappel finale de 10.106 cellules NIH 3T3-CD151 a été réalisée par voie intra-péritonéale. Les cellules de la rate d'une souris ont ensuite été fusionnées à des cellules de myélome SP2/0-Ag14 dans un rapport 1/1 par les techniques classiquement décrites par Kahler et Milstein. Les anticorps sécrétés dans les surnageants des hybridomes résultant de la fusion ont ensuite été criblés pour leur capacité à reconnaître la boucle extracellulaire recombinante EC2 de CD 151 par ELISA, et CD 151 exprimé à la surface de la lignée tumorale humaine de cancer de la prostate PC3 par cytométrie de flux. Pour l'ELISA, des plaques 96 puits sont sensibilisées pendant 1 nuit à +4°C avec la boucle extracellulaire recombinante EC2 à 5 g/ml dans du PBS. Après lavage par du PBS, les puits sont saturés par une solution de gélatine à 0,5% dans du PBS pendant 1 h à 37°C puis lavés à nouveau par du PBS. Les surnageant de culture des hybridomes sont évalués sans dilution (incubation 1 h à 37°C). Les anticorps fixés sur la boucle EC2 immobilisée sont détectés par incubation successives avec un anticorps polyclonal de chèvre anti-IgG de souris conjugué à la péroxydase (Jackson/USA, dilution au 1/5000ème, 1 h à 37°C) puis avec un substrat de la péroxydase (TMB, Interchim/France, 10 min à température ambiante). La réaction est stoppée par addition d'acide sulfurique 1M et la densité optique (DO) est mesurée à 450nm. Les analyses par cytométrie de flux sont réalisées sur des plaques 96 puits. Les surnageants d'hybridome non dilués sont ajoutés à 100000 cellules PC3 préalablement introduites dans :les puits. Après une incubation de 20 min à +4°C suivie d'un lavage, un anticorps polyclonal de chèvre anti-IgG de souris marqué à l'Alexa488 (Molecular Probes, dilution au 1/500ème) est ajouté. L'intensité de fluorescence (MFI) est déterminée à l'aide d'un cytofluorimètre après une nouvelle incubation de 20 min à +4°C.

A l'issue de ce criblage, les 4 hybridomes suivants ont été sélectionnés (critères de sélection : DO > 0,5 pour l'ELISA et MFI > 50 pour la cytométrie de flux) : 203B6, 205H8, 211F3 et 214B2. Les résultats obtenus pour ces 4 hybridomes sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous : 15 Hybridome ELISA Cytométrie (PC3 ) DO 450nm MFI 203B6 1,130 975 205H8 0,649 595 211F3 0,959 936 214B2 0,684 1004 Tableau 4

Après clonage, un clone de chaque hybridome sélectionné a été amplifié.

L'isotype des anticorps produits a été déterminé pour chaque surnageant de culture à l'aide d'un kit d'isotypage des anticorps murins (SBA clonotyping system, Southern Biotech), puis une caractérisation finale a été réalisée par ELISA (boucle extracellulaire EC2) et par cytométrie de flux sur la lignée murine NIH 3T3 et le transfectant stable NIH 3T3-CD151, puis sur des lignées tumorales humaines de cancer du poumon A549, de la prostate DU145 et du pancréas BxPC3 dans les conditions décrites précédemment. La concentration en anticorps des surnageants a été ajustée à 5 g/ml pour l'ELISA et à 10 g/ml pour les analyses par cytométrie de flux Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 5 ci-dessous : Anticorps Isotype ELISA Cytométrie de flux anti-CD151 DO à MFI 450nm NIH3T3 NIH3T3- A549 DU145 BxPC3 CD 151 203B6 c11A IgGl K 2,218 16 540 675 860 768 205H8 cl1A IgG3 K 1,842 16 332 ^ 388 584 350 211F3 c11A IgGl K 2,301 16 556 481 524 536 214B2 c11A IgG1 K 2,477 16 748 820 1332 849 ~ I . Tableau 5

Les figures 9, 10, 11 et 12 montrent les profils de reconnaissance par cytométrie de flux des cellules NIH 3T3-CD151, PC3 et A549 obtenus pour les anticorps 203B6, 0 2,05H8, 211F3 et 214B2. Ces profils sont comparables à ceux obtenus avec l'anticorps anti-CD 151 50-6 (ATCC CRL-2696) et démontrent la spécificité de ces anticorps pour CD151. Les hybridomes ont ensuite été déposés à la CNCM, Collection Nationale de 5 Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15.

Exemple 3 : Spécificité des anticorps La spécificité des anticorps 203B6, 205H8, 211F3 et 214B2 a été évaluée par 1 o western blot. La boucle EC2 de CD 15 ]. a été clonée dans le vecteur pET22b pour une expression sous forme soluble dans le périplasme de Escherichia coli. La protéine produite comporte les acides aminés 130 à 221 de la séquence peptidique de CD151 humain, auxquels a été ajoutée une queue Poly-His en position C-terminale pour 15 faciliter la purification. La protéine EC2 recombinante a été purifiée par chromatographie d'affinité sur métaux immobilisés (IMAC) sur support Chelating Sepharose HP (GE Healthcare). Des quantités croissantes de la protéine recombinante EC2 CD151 (1, 2, 4 et 8 g) et de lysat de cellules HT-29 (10, 20 et 50 g de protéines totales) ont été déposées 20 sur un gel d'acrylamide 4-12% (BioRad). Après électrophorèse (conditions non réductrices), les protéines ont été transférées sur membrane de nitrocellulose. Les membranes de transfert ont ensuite été incubées avec les anticorps 203B6, 205H8, 211F3 et 214B2 purifiés (0,5 gg/ml), puis avec un anticorps polyclonal de lapin anti-Ig de souris couplé à la péroxvdase (GE Healthcare) avant révélation par 25 chimioluminescence. Les anticorps 203B6, 205H8, 21:LF3 et 214B2 reconnaissent la protéine CD151 complète et la boucle EC2 recombinante par western blot (Figure 13). L'anticorps 205H8 présente une réactivité inférieure pour la protéine CD151 complète dans les conditions d'analyse. Comparativement au signal observé pour les anticorps 203B6, 30 211F3 et 214B2, le signal obtenu pour l'anticorps 205H8 s'avère plus faible. Cette différence n'est pas observée pour la reconnaissance de la protéine EC2 recombinante. 51 Exemple 4 : Activité antitumorale d'anticorps anti-CD151 dans le modèle de xénogreffe PC3 Matériel et méthodes Une surexpression de CD 1:51 dans les tissus tumoraux de cancer de la prostate ayant été observée par immunohistochimie sur une série de tissus array humains, l'évaluation d'anticorps anti-CD151 sur une xénogreffe de cellules de cancer de la prostate PC3 a été envisagée. La lignée PC3 est une lignée prostatique androgéno- indépendante originaire de l'ATCC et cultivée en milieu F12K (Invitrogen Corporation, Ecosse, Royaume-Uni), 10% FCS (Invitrogen Corporation). Les cellules sont divisées deux jours avant la greffe de telle sorte qu'elles soient en phase de croissance exponentielle. Cinq millions de cellules PC3 sont greffées en sous-cutané sur des souris mâle Swiss Nude âgées de six semaines. Cinq jours après l'implantation, les volumes tumoraux sont mesurés, les souris sont randomisées pour constituer des lots non statistiquement différents et le traitement est initié par l'injection i.p. d'une dose d'appel de 2 mg d'anticorps par souris. Les animaux sont ensuite traités deux fois par semaine avec une dose de 1 mg d'anticorps par souris et les tumeurs mesurées 2 fois par semaine. Les animaux du groupe contrôle reçoivent une injection de PBS. Les volumes tumoraux sont calculés selon la formule nt/6 x longueur x largeur x hauteur. Une analyse statistique est effectuée à chaque mesure en utilisant un test de Mann-Whitney.

Résultats Les résultats présentés en Figure 14 montrent que les anticorps 203B6, 214B2 et 211F3 indiquent des inhibitions significatives de la croissance tumorale in vivo des cellules PC3. L'anticorps 205H8, bien qu'inhibiteur, montre une activité antitumorale plus modeste dans ce modèle.

Claims

REVENDICATIONS1. Anticorps isolé, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, capable de se lier à la protéine CD151, caractérisé en ce qu'il comprend : i) une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3, avec - CDR-L 1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 1 ou 59 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 1 ou 59 - CDR-L2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 2 ou 60 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 2 ou 60 - CDR-L3 de séquence SEQ ID No. 3, ou au moins une séquence qui présente au. moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 3; et/ou ii) une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, CDR-H2 et CDR-H3, avec - CDR-H1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 4 ou 61 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal 20 avec la séquence SEQ ID No. 4 ou 61 - CDR-H2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 5 ou 62 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 5 ou 62 - CDR-H3 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 6 ou 63 , ou au 25 moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 6 ou 63.
2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 7 et/ou une 30 chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 8.
3. Hybridome murin déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) le 22 février 2008 sous le numéro 1-3920. 35 53
4. Anticorps isolé, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, capable de se lier à la protéine CD [51, caractérisé en ce qu'il comprend : i) une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3, avec - CDR-L1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 17 ou 69 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 17 ou 69 - CDR-L2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 18 ou 70 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal 10 avec la séquence SEQ ID No. 18 ou 70 - CDR-L3 de séquence SEQ ID No. 19, ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 19; et/ou ii) une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, 15 CDR-H2 et CDR-H3, avec - CDR-H 1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 20 ou 71 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 20 ou 71 - CDR-H2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 21 ou 72 , ou au 20 moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 21 ou 72 - CDR-H3 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 22 ou 73 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 22 ou 73. 25
5. Anticorps selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 23 et/ou une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 24. 30
6. Hybridome murin déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) le 22 février 2008 sous le numéro I-3921. 54
7. Anticorps isolé, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, capable de se lier à la protéine CD] 51, caractérisé en ce qu'il comprend : i) une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, C'DR-L2 et CDR-L3, avec - CDR-L1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 33 ou 79 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 33 ou 79 ; - CDR-L2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 2 ou 60 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal 10 avec la séquence SEQ ID No. 2 ou 60 ; - CDR-L3 de séquence SEQ ID No. 3 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 3 ; et/ou ii) une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, 15 CDR-H2 et CDR-H3, avec - CDR-1-il choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 4 ou 61 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 4 ou 61 ; - CDR-H2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 34 ou 80 , ou au 20 moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 34 ou 80 ; - CDR-H3 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 35 ou 81 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 35 ou 81. 25
8. Anticorps selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 36 et/ou une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 37. 30
9. Hybridome murin déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) le 21 février 2008 sous le numéro I-3918. 55
10. Anticorps isolé, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, capable de se lier à la protéine CD151 et, caractérisé en ce qu'il comprend : i) une chaîne légère comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-L1, CDR-L2 et CDR-L3, avec - CDR-L1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 43 ou 85 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 43 ou 85 - CDR-L2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 44 ou 86 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal 10 avec la séquence SEQ ID No. 44 ou. 86 - CDR-L3 de séquence SEQ ID No. 45 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 45 ; et/ou ii) une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDR-H1, 15 CDR-H2 et CDR-H3, avec - CDR-H1 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 46 ou 87 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 46 ou 87 - CDR-H2 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 47 ou 88 , ou au 20 moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 47 ou 88 - CDR-H3 choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 48 ou 89 , ou au moins une séquence qui présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 48 ou 89. 25
11. Anticorps selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 49 et/ou une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 50. 30
12. Hybridome murin déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) le 21 février 2008 sous le numéro I-3919.
13. Acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique, ADN ou ARN, codant pour un anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1, 2, 4, 5 5., 7, 8, l 0 ou 11; b) un acide nucléique complémentaire d'un acide nucléique tel que défini en c) un acide nucléique d'au moins 18 nucléotides capable d'hybrider dans des conditions de forte stringence avec au moins l'une des séquences d'acide nucléique 10 S.EQ ID No. 9-16, 25-32, 38-42, 51-58, 64-68, 74-78, 82-84 ou 90-94 ou avec une séquence présentant au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 %, d'identité après alignement optimal avec lesdites séquences.
14. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 13. 15
15. Cellule hôte comprenant un vecteur selon la revendication 14.
16. Animal transgénique à l'exception de l'Homme comprenant une cellule selon la revendication 15. 20
17. Procédé de production d'un anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 ou 11, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture dans un milieu et conditions de culture appropriés d'une cellule 25 selon la revendication 15 ; et b) la récupération desdits anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ainsi produits à partir du milieu de culture ou desdites cellules cultivées.
18. Anticorps, ou l'un de ses composés dérivés ou fragments fonctionnels, 30 susceptible d'être obtenu par un procédé selon la revendication 17.
19. Composition comprenant à titre de principe actif un composé consistant en un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1, 2, 4,5, 7, 8, 10, 11 ou 18 ou produit par l'hybridome selon les revendications 3, 6, 9 ou 12.
20. Composition selon la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, un anticorps, un agent cytotoxique/cytostatique, une toxine cellulaire ou un radioélément.
21. Composition selon l'une des revendications 19 ou 20, à titre de médicament.
22. Utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11 ou 18 ou produit par l'hybridome selon les revendications 3, 6, 9 ou 12 et/ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 19 à 21 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de cancer.
23. Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que ledit cancer est un cancer choisi parmi le cancer de la prostate, le cancer du poumon, le cancer du côlon ou le cancer du pancréas.
24. Méthode de diagnostic in vitro de maladies présentant une sur-expression ou une sous-expression de la protéine CI)151 à partir d'un échantillon biologique dont on suspecte la présence anormale en protéine CD151, caractérisée en ce qu'on met en contact ledit échantillon biologique avec un anticorps selon l'une des revendications 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11 ou 18 ou produit par l'hybridome selon les revendications 3, 6, 9 ou 12, ledit anticorps pouvant être, le cas échéant, marqué.