JP7442769B2 - フィラミンａに対する抗体およびその治療上の使用 - Google Patents

フィラミンａに対する抗体およびその治療上の使用 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月９日に出願された米国仮特許出願第６２／７４３，１６９号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＩＢＥＸ＿００４＿０３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ：記録日：２０１９年１０月９日、ファイルサイズ：４キロバイト）。
本開示は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびその断片、当該抗体またはその断片を分泌する新規タンパク質発現細胞株、ならびに抗原を優先的に検出し、および／または疾患を治療するための抗体および抗体断片の使用に関する。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体およびその断片は、細胞転移を調節する。本開示の特定の実施形態は、例えば、乳癌などのヒトの癌の治療に有用なヒトキメラｍＡｂ、細胞内抗体、および細胞免疫療法を教示する。
癌は、所定の正常組織からもたらされた異常細胞数の増加を特徴とする多面的な疾患であり、これらの細胞は、典型的には、血液またはリンパ系を介して身体の他の領域へと広がることによって、隣接組織に浸潤するか、または転移する。癌は、典型的には、新生物に進行し得る軽度な前腫瘍変化で始まる多段階プロセスを経て進行する。腫瘍性病変は、浸潤、成長、転移、および異種に対する増加する能力を生じ得る。
例えば、肺、結腸、乳房、直腸、前立腺、脳、および腸の癌を含む、非常に多様な癌が存在する。癌の発生は、集団が加齢すると共に、新規癌が発生すると共に、感受性集団が成長すると共に、上昇し続ける。癌を有する患者を治療するために使用できる新規方法および組成物の多大な要求が存在する。
癌を治療する現在の方法は、顕著に非選択性である。外科手術は罹患した組織を除去し、放射線療法は固形塊を縮小し、化学療法は急速に分裂する細胞を殺傷する。放射線照射および化学療法は、癌細胞と共に健常な細胞の非選択的な破壊など、様々な望ましくない副作用と関連する。
したがって、当該技術分野において、現在の治療に付随する欠点に苦しまない、癌を治療する方法を開発するニーズが依然としてある。具体的には、当該技術分野において、転移性細胞を優先的に標的とし、健常な細胞を破壊しない、高度に選択的な治療法を開発する大きなニーズがある。
新たな高度に選択的な癌治療法および処置のニーズは、乳癌に関して特に急務である。乳癌は、皮膚癌を除き、米国の女性の中で最も一般的な癌である。米国の女性の８人中約１人（１２％）が、その生涯に浸潤性乳癌を発症する。米国癌協会による２０１５年の米国における乳癌の推定は、約２３１，８４０の新規症例の浸潤性乳癌が、女性において診断され、約６０，２９０の新規症例の上皮内癌（ＣＩＳ）が診断され（ＣＩＳは非浸潤性であり、乳癌の最も早期の形態である）、約４０，２９０人の女性が、乳癌で死亡する。これらは、驚くべき統計であり、当該技術分野において、新規治療法および乳癌の広がりを選択的に標的にし、予防する方法を開発する大きなニーズを強調する。
本開示は、特に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む新規抗体およびその断片を提供することによって、医学界における前述のニーズに対処する。一部の実施形態では、ｍＡｂは、癌（例えば、ヒト乳癌）を選択的に標的にし、治療する。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、細胞内抗体である。
一態様では、本開示は、フィラミンＡ抗原に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの抗体を提供する。本明細書において記載される抗体は、一部の態様では、ヒト乳癌細胞などの哺乳類細胞によって分泌されるフィラミンＡ抗原に優先的に結合する、ヒトキメラｍＡｂである。他の態様では、ヒトキメラｍＡｂは、ヒト乳癌細胞などの哺乳類細胞の細胞膜と関連するフィラミンＡ抗原に優先的に結合する。一部の態様では、本明細書において提供される抗体または断片は、細胞ベースの免疫療法（例えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ））の一部であり、抗体または断片は、ヒト乳癌細胞などの哺乳類細胞の細胞膜と関連するフィラミンＡ抗原に結合する。なおさらなる態様では、本明細書において教示される抗体は、細胞内抗体である。したがって、一部の実施形態では、抗体は、細胞内のフィラミンＡ抗原に結合してもよい。一部の実施形態では、本明細書において教示される抗体は、細胞内小胞内のフィラミンＡ抗原に結合してもよい。さらなる実施形態では、本明細書において教示される抗体は、細胞外微小小胞またはエクソソーム内のフィラミンＡ抗原に結合してもよい。
本開示は、癌細胞由来のフィラミンＡ抗原を選択的に標的にすることができる新規の治療用ｍＡｂを提供するだけでなく、当該抗体を含む医薬組成物、および抗体で患者を治療する方法も教示する。一部の実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を誘導する。一部の実施形態では、本開示は、フィラミンＡ抗原を発現する癌細胞への標的化治療薬の送達のための抗体を提供する。さらなる実施形態において、標的化治療薬は、放射性ヌクレオチド、有効治療剤、薬物、化学療法剤、他の抗体、ナノ粒子、および遺伝子治療ベクターからなる群から選択される。一部の実施形態では、本開示は、治療剤に連結または結合された抗体を提供し、抗体は、癌細胞によって飲食運動される。
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のフィラミンＡ抗原に特異的な細胞内抗体を発現させる方法を提供する。さらなる実施形態では、細胞は癌細胞である。
一部の実施形態では、本開示は、フィラミンＡ抗原に結合する抗体を提供し、抗体は、配列番号１８、１９、２０、または２１による重鎖ＣＤＲ３領域を含む。かかる抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片、単離ヒトキメラ抗体、および／または細胞内抗体であってもよい。
一実施形態では、本開示は、三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む、フィラミンＡ抗原に結合する抗体、例えば、単離ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片、または細胞内抗体を提供する。一部の実施形態では、軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１２および１３から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメインを含む、フィラミンＡ抗原に結合する単離ヒトキメラ抗体、抗体断片、または細胞内抗体を提供する。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖ＣＤＲ３は、配列番号１８、１９、２０、および２１のアミノ酸配列を含む。
開示される抗体（例えば、単離ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片、または細胞内抗体）の一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１または配列番号２を含む。一実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号４、５、６、または７を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１を含み、重鎖可変領域は、配列番号４を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１を含み、重鎖可変領域は、配列番号５を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１を含み、重鎖可変領域は、配列番号６を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１を含み、重鎖可変領域は、配列番号７を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号２を含み、重鎖可変領域は、配列番号４を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号２を含み、重鎖可変領域は、配列番号５を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号２を含み、重鎖可変領域は、配列番号６を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号２を含み、重鎖可変領域は、配列番号７を含む。
開示される抗体（例えば、単離ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片、または細胞内抗体）の一実施形態では、軽鎖定常ドメインは、配列番号３を含み、重鎖定常ドメインは、配列番号１１を含む。
一部の実施形態において、抗体は、配列番号１または２を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号４、５、６、または７を含む重鎖可変ドメインを含むｓｃＦｖである。さらなる実施形態では、抗体は、配列番号２を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号７を含む重鎖可変領域を含むｓｃＦｖである。一部の実施形態では、ｓｃＦｖ抗体は、細胞内抗体である。
開示される抗体（例えば、単離ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片、または細胞内抗体）の一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号１または２を含み、軽鎖定常ドメインは、配列番号３を含み、重鎖可変ドメインは、配列番号４、５、６、または７を含み、重鎖定常ドメインは、配列番号１１を含む。一部の実施形態では、開示される単離ヒトキメラ抗体は、配列番号２を含む軽鎖可変ドメイン、配列番号３を含む軽鎖定常ドメイン、配列番号７を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号１１を含む重鎖定常ドメインを含む。
一部の実施形態では、抗体または細胞内抗体は、本明細書において提供される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、可変領域は、軽鎖－重鎖の配向である。したがって、一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、重鎖可変領域のアミノ末端に位置する。さらなる実施形態では、抗体または細胞内抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、抗体または細胞内抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に、軽鎖可変領域、リンカー、および重鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、抗体または細胞内抗体は、本明細書において提供される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、可変領域は、重鎖－軽鎖の配向である。したがって、一部の実施形態では、重鎖可変領域は、軽鎖可変領域のアミノ末端に位置する。さらなる実施形態では、抗体または細胞内抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、抗体または細胞内抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に、重鎖可変領域、リンカー、および軽鎖可変領域を含む。一態様では、フィラミンＡ抗原は、ＦＬＮＡ遺伝子によってコードされる遺伝子産物、またはその相同体である。一部の実施形態では、フィラミンＡ抗原は、細胞内である。一部の実施形態では、フィラミンＡ抗原は、癌細胞などの細胞によって分泌される。一部の実施形態では、フィラミンＡ抗原は、細胞表面、例えば、細胞膜関連フィラミンＡ抗原と関連する。別の態様では、フィラミンＡ抗原は、膜または小胞などの細胞関連構造に結合し、および／または関連する。したがって、一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、細胞内のフィラミンＡ抗原に結合してもよい。一部の実施形態では、フィラミンＡ抗原は、微小胞に結合し、および／または関連する。一部の実施形態では、フィラミンＡ抗原は、エクソソームまたは他の多成分複合体に結合し、および／または関連する。一部の実施形態では、フィラミンＡ抗原は、断片である。一態様では、フィラミンＡ抗原は、約２８０ｋＤａの乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンＡ抗原である。
一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、フィラミンＡ抗原またはその断片に優先的に結合することができ、当該優先結合は、非乳癌フィラミンＡ抗原に対してである。一部の実施形態では、乳癌細胞フィラミンＡ抗原は、可溶性フィラミンＡ抗原である。一部の実施形態では、乳癌細胞フィラミンＡ抗原は、細胞表面と関連する。一部の実施形態では、乳癌細胞フィラミンＡ抗原は、エクソソームまたは多成分複合体などの微小胞に取り込まれる。一部の実施形態では、乳癌細胞フィラミンＡ抗原は、分泌された可溶性形態で、細胞表面および／もしくは小胞と関連して、ならびに／または結合して見られる。
一部の実施形態では、抗体は、約１０－５Ｍ～約１０－１２Ｍの特異的親和性でフィラミンＡ抗原に結合する能力を有する。一部の実施形態では、抗体は、約１０－７Ｍ～約１０－１１Ｍの特異的親和性でフィラミンＡ抗原に結合する能力を有する。一部の実施形態では、抗体は、約１０－８Ｍ～約１０－１１Ｍの特異的親和性でフィラミンＡ抗原に結合する能力を有する。
また、本明細書において提供される抗体をコードする単離ポリヌクレオチドＤＮＡ配列も本明細書において教示される。例えば、本開示は、本明細書において提供されるヒト、キメラ、またはヒト化抗体をコードする単離ポリヌクレオチドＤＮＡ配列を提供する。本明細書において提供される抗体をコードするポリヌクレオチドＤＮＡ配列を含むベクターも本明細書において提供される。当該ベクターを含む宿主細胞も本明細書において提供される。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される細胞内抗体をコードする単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、ポリヌクレオチドＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される細胞内抗体をコードするＲＮＡを提供し、ＲＮＡによってコードされる細胞内抗体は、遺伝子導入された細胞内で一過性に発現される。
本開示は、フィラミンＡに対する単離ヒトキメラ抗体を産生する方法であって、ベクターを有する宿主細胞を培養して、当該抗体を発現させること、抗体を発現させること、および宿主細胞によって発現される抗体を回収することを含む方法を提供する。
本開示は、フィラミンＡに対する細胞内抗体を産生するための組成物および方法、標的細胞に細胞内抗体遺伝子またはタンパク質を送達するための組成物および方法、ならびに細胞内の特定の細胞内位置に細胞内抗体遺伝子またはタンパク質を送達するための組成物および方法を提供する。開示される方法は、組み換えウイルスを介した送達、非ウイルス性遺伝子送達方法（ポリマーまたはカチオン性脂質送達システムなどのナノキャリア送達システム）、または機械的送達技術を介した他のプラスミドもしくはトランスポゾンシステム、ならびに細胞膜透過ペプチドまたはタンパク質を使用した送達を含む。したがって、本開示は、ナノ担体および本明細書において提供される細胞内抗体を含む組成物を提供し、細胞内抗体は、細胞貫通ペプチドまたは化学的部分と融合するか、または連結する。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、転移性エレメント、またはトランスポゾンである。さらなる実施形態では、非ウイルスベクターは、スリープビューティトランスポゾン、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン、または当該技術分野で公知の任意の他のトランスポゾンを含む。一部の実施形態では、開示される方法は、遺伝子編集システムを介した送達を含む。例えば、一部の実施形態では、開示される方法は、（ｉ）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）システム、（ｉｉ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、または（ｉｉｉ）亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムを介した送達を含む。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される細胞内抗体をコードする遺伝子を含むプラスミドを提供する。一部の実施形態では、プラスミドは、細菌であるか、または細菌に由来するか、または例えば、真菌、藻類、もしくは植物などの非細菌性供給源に由来する。一部の実施形態では、核酸は、細胞内抗体の発現をもたらすための真核生物プロモーターを含むプラスミドである。さらなる実施形態では、プラスミドは、ＣＭＶプロモーターを含む。
一部の実施形態では、方法は、細胞内抗体を細胞内構造に標的化するための配列を有する細胞内抗体の送達を含む。細胞内抗体が標的化され得る細胞内構造としては、例えば、核、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ装置、ミトコンドリア、またはリソソームが挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸は、細胞内で安定的にまたは一過性に発現されてもよい。一部の実施形態では、安定的発現は、核酸が細胞ゲノム内に統合されたことを意味し、一部の実施形態では、一過性発現は、遺伝子導入された遺伝子が、限られた期間発現することを意味する。一部の実施形態では、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡを使用して、細胞における細胞内抗体の一過性発現に影響する。
一部の態様では、教示される抗体は、固相に固定化される。一部の態様では、教示される抗体は、検出可能に標識される。一部の態様では、本明細書において提供される抗体は、細胞障害性薬物などの薬物に結合される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、抗体と薬物の結合体を提供する。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体と薬物の結合体は、エンドサイトーシスを介して内部移行される。一部の態様では、教示される抗体は、放射性核種、有効な治療剤、または薬物、または化学療法剤、またはタンパク質、または他の抗体に結合される。
本開示はまた、本明細書において提供される抗体（例えば、フィラミンＡ抗原に特異的な単離ヒトキメラ抗体）、および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される細胞内抗体（例えば、フィラミンＡ抗原に特異的な細胞内抗体）を含む医薬組成物、または本明細書において提供される細胞内抗体をコードする遺伝子もしくは核酸を含む送達システムを提供する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される細胞内抗体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書において提供される細胞内抗体をコードする遺伝子または核酸を含む送達システムは、非ウイルスまたはウイルス送達システムである。例えば、一部の実施形態では、ウイルス送達システムは、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞内位置への細胞内抗体の標的化送達のための遺伝子またはタンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞を含む医薬組成物を提供し、ＣＡＲは、本明細書において提供されるフィラミンＡ結合ドメインを含む。
本開示はまた、本明細書において提供される抗体（例えば、フィラミンＡ抗原に特異的な単離ヒトキメラ抗体、および／またはフィラミンＡ抗原に特異的な細胞内抗体）、および抗体に結合する二次抗体を含むヒト癌を診断するためのキットを教示し、二次抗体は、検出可能な標識に結合される。例えば、一部の実施形態では、本開示は、フィラミンＡ抗原に特異的な単離されたヒトキメラ抗体、および検出可能な標識に結合した二次抗体を含む、ヒト乳癌を診断するためのキットを提供する。
患者における癌を診断する方法であって、患者から生物学的試料得ること、生物学的試料を本明細書において提供される抗体（例えば、フィラミンＡ抗原に特異的な単離ヒトキメラ抗体、および／またはフィラミンＡ抗原に特異的な細胞内抗体）と接触させること、および抗体が、癌細胞により分泌された可溶性フィラミンＡ抗原に結合し、および／または癌細胞膜関連もしくは結合フィラミンＡ抗原に結合し、および／または細胞内フィラミンＡ抗原に結合するかどうかを検出することを含み、当該抗体とフィラミンＡ抗原の間の正の結合相互作用が、癌の指標である、方法も、本明細書において教示される。さらなる実施形態では、癌は、ヒト乳癌である。
本開示はまた、有効量の本明細書において提供される抗体を投与することを含む、患者における癌を治療する方法を提供する。例えば、本開示は、本明細書において提供される、フィラミンＡ抗原に特異的な単離ヒトキメラ抗体、および／またはフィラミンＡ抗原に特異的な細胞内抗体、および／またはフィラミンＡ抗体もしくはその断片（例えば、フィラミンＡ結合ドメイン）を含むＣＡＲを含む免疫細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む、治療方法を提供する。さらなる実施形態では、癌は、ヒト乳癌である。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、癌細胞に結合し、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を含む。
さらに、本開示は、フィラミンＡ抗原を発現する癌腫瘍細胞の成長を予防または低減する方法であって、それを必要とするヒト患者に、有効量の本明細書において提供される抗体を投与することを含む、方法を教示する。一部の実施形態では、本方法は、配列番号１２および１３から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の重鎖ＣＤＲ２、ならびに／または配列番号１８、１９、２０、および２１から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む抗体を投与することを含む。ある特定の実施形態では、当該抗体は、それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ、配列番号１６、１７、および２１に記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、当該抗体は、配列番号２を含む軽鎖可変領域および配列番号７を含む重鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、抗体は、非癌細胞により分泌された可溶性フィラミンＡ抗原と比較して、哺乳類癌細胞（乳癌細胞など）により分泌される可溶性フィラミンＡ抗原に優先的に結合する。一部の実施形態では、抗体は、細胞内であり、および／またはエクソソームなどの小胞内に位置するフィラミンＡ抗原に優先的に結合する。
一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒトキメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体は、細胞内抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体または多重特異性抗体である。一部の実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体は、フィラミンＡ抗原に結合する本明細書において提供される第一の抗体、および免疫細胞上の抗原に結合する第二の抗体を含む。免疫細胞は、一部の実施形態では、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞から選択される。一部の実施形態では、抗原は、Ｔ細胞抗原である。一部の実施形態では、Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６９、およびＣＤ９０からなる群から選択される。一部の実施形態では、抗体は、フィラミンＡ抗原およびＣＤ３に結合する二重特異性抗体である。
さらなる実施形態では、単離ヒトキメラ抗体は、フィラミンＡに対するマウス抗体と比較して、低減した免疫原性を示し、抗体を投与された患者から負の免疫応答を導かない。他の実施形態では、開示された抗体は、当該抗体の免疫原性をさらに低減するようヒト化される。他の態様では、抗体は、例えば、抗体を「脱免疫化すること」によって、ヒト化以外の他の方法によって減少した免疫原性を有する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
フィラミンＡ抗原に結合する抗体であって、
ａ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変ドメインであって、前記軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１２および１３から選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン；および
ｂ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む三つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインであって、前記重鎖ＣＤＲ１が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ３が、配列番号１８、１９、２０、および２１から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、を含む、抗体。
（項目２）
前記軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１３を含み、前記重鎖ＣＤＲ３が、配列番号２１を含む、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２を含み、前記重鎖可変ドメインが、配列番号７を含む、項目１に記載の抗体。
（項目４）
前記軽鎖および重鎖可変領域が、軽鎖－重鎖の配向である、項目１～３のいずれか１項に記載の抗体。
（項目５）
前記軽鎖および重鎖可変領域が、重鎖－軽鎖の配向である、項目１～３のいずれか１項に記載の抗体。
（項目６）
ｃ．配列番号３を含む軽鎖定常ドメイン；および
ｄ．配列番号１１を含む重鎖定常ドメインをさらに含む、項目１～５のいずれか１項に記載の抗体。
（項目７）
前記抗体がヒトキメラ抗体である、項目１～６のいずれか１項に記載の抗体。
（項目８）
前記抗体がｓｃＦｖである、項目１～５のいずれか１項に記載の抗体。
（項目９）
前記抗体が細胞内抗体である、項目１～５のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１０）
前記フィラミンＡ抗原が、ＦＬＮＡ遺伝子、またはその相同体によりコードされる遺伝子産物である、項目１～９のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１１）
前記フィラミンＡ抗原が、およそ２８０ｋＤａの乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンＡ抗原である、項目１～９のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１２）
前記抗体が、乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンＡ抗原に優先的に結合することができ、前記優先結合が、非乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンＡ抗原と比較である、項目１～９のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１３）
前記抗体が、乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンＡ抗原に１０ －７ Ｍ～１０ －１１ Ｍの特異的親和性で結合することができる、項目１～９のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１４）
前記フィラミンＡ抗原が、およそ２８０ｋＤａの乳癌細胞膜関連フィラミンＡ抗原である、項目１～９のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１５）
前記抗体が、乳癌細胞膜関連フィラミンＡ抗原に優先的に結合することができ、前記優先結合が、非乳癌細胞膜関連フィラミンＡ抗原と比較である、項目１～９のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１６）
前記抗体が、乳癌細胞膜関連フィラミンＡ抗原に、１０ －７ Ｍ～１０ －１１ Ｍの特異的親和性で結合することができる、項目１～９のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１７）
項目１～１６のいずれか１項に記載の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドＤＮＡ配列。
（項目１８）
項目１７に記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
（項目１９）
項目１８に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
（項目２０）
項目１９に記載の宿主細胞を培養すること、前記抗体を発現させること、および前記宿主細胞により発現された前記抗体を回収することを含む方法により産生される、抗体。
（項目２１）
固相に固定される、項目１～１６のいずれか１項に記載の抗体。
（項目２２）
前記抗体が検出可能に標識される、項目１～１６のいずれか１項に記載の抗体。
（項目２３）
前記抗体が放射性核種に結合される、項目１～１６のいずれか１項に記載の抗体。
（項目２４）
前記抗体が化学療法剤に結合される、項目１～１６のいずれか１項に記載の抗体。
（項目２５）
前記抗体がタンパク質に結合される、項目１～１６のいずれか１項に記載の抗体。
（項目２６）
前記抗体が、細胞内フィラミンＡ抗原、細胞膜関連フィラミンＡ抗原、および／または可溶性フィラミンＡ抗原に結合する、項目１～１６のいずれか１項に記載の抗体。
（項目２７）
ａ．項目１～１６のいずれか１項に記載の抗体；および
ｂ．医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
（項目２８）
ａ．一次抗体として項目１～１６のいずれか１項に記載の抗体；および
ｂ．前記一次抗体に結合する二次抗体であって、検出可能な標識に結合される二次抗体、を含む、癌を診断するためのキット。
（項目２９）
前記癌が乳癌である、項目２８に記載のキット。
（項目３０）
患者における癌を診断する方法であって、
ａ．生物学的試料を患者から得ること；
ｂ．前記生物学的試料を項目１－１６のいずれか１項に記載の抗体と接触させること；および
ｃ．前記抗体が、前記試料中のフィラミンＡ抗原に結合するかどうかを検出することであって、前記抗体とフィラミンＡ抗原の間の正の結合相互作用が、癌の指標である、検出すること、を含む、方法。
（項目３１）
前記癌が乳癌である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
患者における癌を治療する方法であって、
有効量の項目１～１６のいずれか１項に記載の抗体をそれを必要とする患者に投与することを含む、方法。
（項目３３）
前記癌が乳癌である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記抗体が、癌細胞の抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を誘導する、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記抗体が、癌細胞により貪食される、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記抗体が、治療剤に連結されるか、または結合される、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
フィラミンＡ抗原を発現する腫瘍細胞の成長を防ぐか、または低減する方法であって、
ａ．それを必要とするヒト患者に、有効量の抗体を投与することであって、前記抗体が、
ｉ．配列番号１または配列番号２を含む、軽鎖可変ドメイン；
ｉｉ．配列番号３を含む、軽鎖定常ドメイン；
ｉｉｉ．配列番号４、５、６、または７を含む重鎖可変ドメイン；および
ｉｖ．配列番号１１を含む、重鎖定常ドメインを含む、投与することを含む、方法。
（項目３８）
前記癌が乳癌である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記抗体が、分泌された可溶性フィラミンＡ抗原に優先的に結合する、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記抗体が、膜関連フィラミンＡ抗原に優先的に結合する、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記抗体が、細胞内フィラミンＡ抗原に優先的に結合する、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目３７に記載の方法。
（項目４３）
前記抗体が、ヒトキメラ抗体である、項目３７に記載の方法。
（項目４４）
前記抗体が、ヒト化抗体である、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記抗体が、フィラミンＡに対するマウス抗体と比較して、低減した免疫原性を示し、前記患者から負の免疫応答を導かない、項目４３または４４に記載の方法。
（項目４６）
前記抗体が、細胞内抗体である、項目３７に記載の方法。
（項目４７）
前記抗体が、細胞内局在化のため改変されている、項目１～１６のいずれか１項に記載の抗体。
（項目４８）
細胞内に局在化しているフィラミンＡ抗原に結合する、細胞内抗体。
（項目４９）
ａ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変ドメインであって、前記軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１２および１３から選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン；および
ｂ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む三つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインであって、前記重鎖ＣＤＲ１が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ３が、配列番号１８、１９、２０、および２１から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、を含む、項目４８に記載の細胞内抗体。
（項目５０）
前記軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１３を含み、前記重鎖ＣＤＲ３が、配列番号２１を含む、項目４８に記載の細胞内抗体。
（項目５１）
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２を含み、前記重鎖可変ドメインが、配列番号７を含む、項目４８に記載の細胞内抗体。
（項目５２）
前記フィラミンＡ抗原が、ＦＬＮＡ遺伝子、またはその相同体によりコードされる遺伝子産物である、項目４８～５１のいずれか１項に記載の細胞内抗体。
（項目５３）
前記細胞内抗体が、フィラミンＡに、１０ －７ Ｍ～１０ －１１ Ｍの特異的親和性で結合することができる、項目４８～５１のいずれか１項に記載の細胞内抗体。
（項目５４）
前記細胞内抗体が、ｓｃＦｖである、項目４８～５１のいずれか１項に記載の細胞内抗体。
（項目５５）
項目４８～５１のいずれか１項に記載の細胞内抗体をコードする、単離されたＲＮＡ。
（項目５６）
項目４８～５１のいずれか１項に記載の細胞内抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドＤＮＡ配列。
（項目５７）
項目５５に記載のＲＮＡまたは項目５６に記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
（項目５８）
項目５７に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
（項目５９）
項目４８～５１のいずれか１項に記載の細胞内抗体および前記細胞内抗体を細胞膜を超えて転座させるためのタンパク質を含む、融合タンパク質。
（項目６０）
項目４８～５１のいずれか１項に記載の細胞内抗体および前記細胞内抗体を細胞内構造に標的化するためのタンパク質を含む、融合タンパク質。
（項目６１）
前記細胞内抗体が検出可能に標識される、項目４８～５１のいずれか１項に記載の単離された細胞内抗体。
（項目６２）
前記細胞内抗体が放射性核種に結合される、項目４８～５１のいずれか１項に記載の単離された細胞内抗体。
（項目６３）
前記細胞内抗体が化学療法剤に結合される、項目４５～５１のいずれか１項に記載の単離された細胞内抗体。
（項目６４）
前記細胞内抗体がタンパク質に結合される、項目４８～５１のいずれか１項に記載の単離された細胞内抗体。
（項目６５）
前記細胞内抗体が、細胞膜透過ペプチドもしくはタンパク質、または他の化学的部分に連結されるか、または結合される、項目４８～５１のいずれか１項に記載の細胞内抗体。
（項目６６）
ａ．項目４８～５１のいずれか１項に記載の単離された細胞内抗体；および
ｂ．医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
（項目６７）
ａ．項目４８～５１のいずれか１項に記載の細胞内抗体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む送達システム；および
ｂ．医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
（項目６８）
前記送達システムが、プラスミド、ＲＮＡ、ウイルスベクター、または非ウイルス送達システムを含む、項目６７に記載の医薬組成物。
（項目６９）
前記プラスミドが、真核生物のプロモーターを含む細菌プラスミドである、項目６８に記載の医薬組成物。
（項目７０）
前記送達システムが、ＲＮＡを含む、項目６８に記載の医薬組成物。
（項目７１）
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターである、項目６８に記載の医薬組成物。
（項目７２）
前記非ウイルス送達システムが、カチオン性脂質またはポリマーを含む、項目６８に記載の医薬組成物。
（項目７３）
前記非ウイルス送達システムが、トランスポゾンを含む、項目６８に記載の医薬組成物。
（項目７４）
患者における癌を治療する方法であって、有効量の項目４８～５１のいずれか１項に記載の単離された細胞内抗体または項目４８～５１のいずれか１項に記載の細胞内抗体を発現する核酸を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
（項目７５）
前記癌が乳癌である、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
項目１～１６のいずれか１項に記載の第一の抗体および免疫細胞上で発現された抗原に結合する第二の抗体を含む、二重特異性または多重特異性抗体。
（項目７７）
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージである、項目７６に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
（項目７８）
前記抗原が、Ｔ細胞抗原である、項目７６に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
（項目７９）
前記Ｔ細胞抗原が、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６９、およびＣＤ９０からなる群から選択される、項目７８に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
（項目８０）
項目１～１６のいずれか１項に記載の第一の抗体およびＣＤ３に結合する第二の抗体を含む、二重特異性抗体。
（項目８１）
フィラミンＡ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド。
（項目８２）
前記フィラミンＡ抗原結合ドメインが、
ａ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変ドメインであって、前記軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１２および１３から選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン；および
ｂ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む三つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインであって、前記重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ３は、配列番号１８、１９、２０、および２１から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、を含む、項目８１に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目８３）
前記軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１３を含み、前記重鎖ＣＤＲ３が、配列番号２１を含む、項目８１に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目８４）
前記フィラミンＡ抗原結合ドメインが、配列番号２を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号７を含む重鎖可変ドメインを含む、項目８１のいずれか１項に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目８５）
細胞内シグナル伝達ドメインおよび膜貫通型ドメインをさらに含む、項目８１～８４のいずれか１項に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目８６）
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインを含む、項目８５に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目８７）
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ鎖シグナル伝達ドメインである、項目８５に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目８８）
項目８１～８７のいずれか１項に記載のＣＡＲを発現する細胞。
（項目８９）
前記細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、または幹細胞からなる群から選択される、項目８８に記載の細胞。
（項目９０）
前記細胞がＴ細胞である、項目８９に記載の細胞。
（項目９１）
それを必要とする対象における癌を治療する方法であって、前記対象に項目８８に記載の細胞を投与することを含む、方法。
図１は、ＲＦＵで報告される、運動性アッセイの結果。結果は、図の左側に沿って表示された多数の実験的処置および対照の存在下でのＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＨＥＫ－２９３細胞の運動性として提示される。
図２は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の運動性アッセイのグラフ表示。エラーバーは標準偏差を表し、色の付いた棒のピークは、集められたデータの平均ＲＦＵを表す。データは三つのピークを出現させ、それぞれが利用された組織培養プレート表面コーティングを表す。具体的には、各処置について、左の棒は、ＴＣ（コーティングなし）であり、中央の棒は、コラーゲンでコーティングしたウェルであり、右の棒は、フィブロネクチンでコーティングしたウェルである。データは、ヒトキメラｍＡｂが、１μｇ／ｍＬの処置でマウスｍＡｂよりも大きな細胞運動性の減少をもたらしたことを説明する。
図３は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたＴＩ１０フィラミンＡ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図４は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたＡＨＯ１４０２フィラミンＡ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図５は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたマウスフィラミンＡ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図６は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたキメラフィラミンＡ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図７は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギポリクローナル抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図８は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色された抗マウスＩｇＧロバ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図９は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、フルオレセイン染色で染色された抗ヒトＩｇＧロバ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図１０は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ローダミン染色で染色されたＦ（ａｂ’）２抗ウサギＩｇＧロバ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図１１は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたＴＩ１０フィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図１２は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたＴＩ１０フィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図１３は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたＡＨＯ１４０２フィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図１４は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたＡＨＯ１４０２フィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図１５は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたマウスフィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図１６は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたマウスフィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図１７は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、フルオレセイン染色で染色されたキメラフィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図１８は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、フルオレセイン染色で染色されたキメラフィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図１９は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたＴＩ１０フィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図２０は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたＴＩ１０フィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図２１は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたＡＨＯ１４０２フィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図２２は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたＡＨＯ１４０２フィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図２３は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたマウスフィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図２４は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたマウスフィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図２５は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、フルオレセイン染色で染色されたキメラフィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図２６は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、フルオレセイン染色で染色されたキメラフィラミンＡ抗体、およびローダミン染色で染色されたベータアクチンウサギ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図２７は、ＤＡＰＩ ＤＮＡ染色で染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１癌細胞、ＤＹＬＩＧＨＴ ４８８染色で染色されたロバ由来のマウスＩｇＧ抗体の免疫蛍光顕微鏡写真。
図２８は、ヒトキメラ軽鎖可変ＣＤＲ結合ドメイン領域について予測されたＣＤＲ領域である、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ、Ｋａｂａｔ、およびＡｂｙｓｉｓデータベースを利用したＣｏｎｔａｃｔシステムによって予測されたＣＤＲ領域間の残基アライメントの描写を伴った、配列番号７３。
図２９は、ヒトキメラ重鎖可変ＣＤＲ結合ドメイン領域について予測されたＣＤＲ領域である、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ、Ｋａｂａｔ、およびＡｂｙｓｉｓデータベースを利用したＣｏｎｔａｃｔシステムによって予測されたＣＤＲ領域間の残基アライメントの描写を伴った、配列番号４。
図３０は、マウス軽鎖可変ＣＤＲ結合ドメイン領域について予測されたＣＤＲ領域である、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ、Ｋａｂａｔ、およびＡｂｙｓｉｓデータベースを利用したＣｏｎｔａｃｔシステムによって予測されたＣＤＲ領域間の残基アライメントの描写を伴った、配列番号７４。
図３１は、マウス重鎖可変ＣＤＲ結合ドメイン領域について予測されたＣＤＲ領域である、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ、Ｋａｂａｔ、およびＡｂｙｓｉｓデータベースを利用したＣｏｎｔａｃｔシステムによって予測されたＣＤＲ領域間の残基アライメントの描写を伴った、配列番号２４。
図３２は、細胞遊走アッセイにおける、緩衝液対照（左パネル）またはフィラミンＡ抗体Ｂ４１１（右パネル）との一晩のインキュベーション後のＭＤＡ－ＭＢ－３２１細胞の蛍光染色の画像。
図３３は、Ｂ４１１がＤＵ１４５（癌）細胞増殖を阻害することを示す棒グラフ。ＤＵ１４５またはＨＥＫ２９３Ａ（非癌）細胞を、処理しないか、またはＢ４１１１ １μｇもしくは１０μｇで２４時間もしくは４８時間処理し、細胞増殖を、ＯＤ６５０に対するＯＤ４１２によって測定した。
図３４は、感染の７２時間後のＡ５４９細胞におけるＧＦＰ発現のヒストグラム。図３４Ａは、模擬遺伝子導入した細胞を示す。図３４Ｂ、３４Ｃ、および３４Ｄは、それぞれ、ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞を示す。図３４Ｅは、図３４Ａ～Ｄの混合である。各群についての合計の非ゲート化取得現象（細胞数）：１０，０００。 同上。 同上。
図３５は、遺伝子導入の７２時間後の遺伝子導入したＡ５４９細胞におけるＣＤＲ（カルセインディープレッド）のヒストグラム（ＧＦＰゲート化細胞の生細胞解析）。図３５Ａは、無染色対照である。図３５Ｂは、陽性対照であり、図３５Ｃ、３５Ｄ、および３５Ｅは、それぞれ、ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞である。図３５Ｆは、図３５Ｃ～Ｅの混合である。各群についての合計の非ゲート化取得現象（細胞数）：１０，０００。 同上。 同上。
図３６は、Ａ５４９細胞におけるＦＬＮＡ細胞内抗体の発現が、減少した細胞生存率をもたらすことを示す、図３５Ａ～Ｆの統計解析。Ｎ＝３；両側不対、スチューデントｔ検定。
図３７は、遺伝子導入の７２時間後の遺伝子導入したＡ５４９細胞におけるＥｔｈＤ－１のヒストグラム（ＧＦＰゲート化細胞の死細胞解析）。図３７Ａは、無染色対照である。図３７Ｂは、陽性対照である。図３７Ｃ、３７Ｄ、および３７Ｅは、それぞれ、ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入している。図３７Ｆは、図３７Ｃ～Ｅの混合である。各群についての合計の非ゲート化取得現象（細胞数）：１０，０００。 同上。
図３８は、Ａ５４９細胞におけるＦＬＮＡ細胞内抗体の発現が、増大した細胞死をもたらすことを示す、図３７Ａ～Ｆの統計解析。Ｎ＝３；両側不対、スチューデントｔ検定。
図３９は、ＦＬＮＡ細胞内抗体を発現するＡ５４９細胞は、低減した細胞増殖を示す（ＧＦＰゲート化し、ＥｄＵによって染色）。図３９Ａは、染色していない対照であり、図３９Ｂ、３９Ｃ、および３９Ｄは、それぞれ、ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入されている。図３９Ｅは、図３９Ａ～Ｄの統計解析である（ｎ＝３；両側不対、スチューデントｔ検）。各群についての合計取得現象（細胞数）：１０，０００。
図４０は、ＬＶ－ＧＦＰおよびＬＶ－ＦＬＮＡ－ＧＦＰ細胞内抗体で遺伝子導入したＡ５４９細胞における発現。図４０Ａ（上部パネル、Ａ１）：ＬＶ－ＧＦＰ、図４０Ａ（底部パネル、Ａ２）：Ａ１の明視野。図４０Ｂ（上部パネル、Ｂ１）：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ；図４０Ｂ（下部パネル、Ｂ２）：Ｂ１の明視野。図４０Ｃ（上部パネル、Ｃ１）：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ；図４０Ｃ（下部パネル、Ｃ２）：Ｃ１の明視野。図４０Ｄ（上部および中央パネル、Ｄ１およびＤ２）：Ｃ１またはＣ２からズームインした選択ビュー（白色の長方形）。図４０Ｄ（底部パネル、Ｄ３）：Ｄ１とＤ２の混合ビュー。白色の矢印は、Ａ５４９細胞におけるＦＬＮＡのＧＦＰとの共発現を示唆する。
図４１は、Ａ５４９細胞と非癌ＭＲＣ－５細胞（正常細胞）の間での、ＦＬＮＡ細胞内抗体処置の比較。ＦＬＮＡ細胞内抗体処置は、Ａ５４９細胞においては目に見える細胞死をもたらすが、Ａ５４９細胞のＭＲＣ－５肺正常線維芽細胞明視野画像（図４０Ａ左パネル、Ａ１）およびＬＶ－ＧＦＰ（２．５μｇ）で遺伝子導入したＭＲＣ－５肺正常線維芽細胞細胞（図４０Ｂ左パネル、Ｂ１）においては目に見える細胞死をもたらさない。ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ細胞内抗体（２．５μｇ）で遺伝子導入したＡ５４９（図４０Ａ右パネル、Ａ２）およびＭＲＣ－５細胞（図４０Ｂ右パネル、Ｂ２）。短い矢印は、分離した死細胞を示す（１０×倍率）。挿入図：死細胞クラスター（短い矢印）と生細胞（長い矢印）の間の差を示す高倍率ビュー。
図４２は、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）細胞内抗体で処理したＵ８７ＭＧ細胞上での細胞生存率アッセイ：カルセインＡＭ（生細胞）およびＥｔｈＤ－１（死細胞）解析。Ｕ８７ＭＧ細胞におけるＦＬＮＡ細胞内抗体の発現は、減少した細胞生存率をもたらす。左パネル：カルセインＡＭ染色のヒストグラム（緑色）；中央パネル：ＥｔｈＤ－１染色のヒストグラム（赤色）；右パネル：両方のヒストグラムの混合。左端のピークを指す矢印は、ＥｔｈＤ－１陽性細胞（死細胞）のピークを示し、右端のピークを指す矢印は、ＬＶ－ＧＦＰと比較した、ＦＬＮＡ＿１／２による処理後のカルセインＡＭ陽性（生細胞）の不存在を示し、中間のピークを指す矢印は、ＦＬＮＡで処理した細胞におけるカルセインＡＭの中間シグナルを有する細胞を示す。各群についての現象での合計取得（細胞数）：５０，０００。
図４３は、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）細胞内抗体によって処理したＵ８７ＭＧ細胞上での細胞生存率アッセイ：生細胞解析の概要。図４３Ａ：図４２（左パネル）のカルセインＡＭ（生細胞）の混合ヒストグラム；図４３Ｂ：Ａの統計解析（ｎ＝３；スチューデントｔ検定、両側不対）。各群についての合計取得現象（細胞数）：５０，０００。
図４４は、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）細胞内抗体によって処理したＵ８７ＭＧ細胞上での細胞生存率アッセイ：死細胞解析の概要。図４４Ａ：図４２（中央パネル）のＥｔｈＤ－１（死細胞）の混合ヒストグラム；図４４Ｂ：Ａの統計解析（ｎ＝３；スチューデントｔ検定、両側不対）。各群についての合計取得現象（細胞数）：５０，０００。
図４５は、ＦＬＮＡ細胞内抗体処理は、遺伝子導入の７２時間後にＬＮ２２９細胞において細胞死をもたらすが、ＨＢＥＣ－５ｉ皮質上皮細胞において細胞死をもたらさない。図４５Ａ：示したコンストラクトで遺伝子導入したＬＮ２２９細胞におけるＥｔｈＤ－１染色（ＧＦＰゲート化）のヒストグラム。図４５Ｂ：示したコンストラクトで遺伝子導入したＨＥＢＣ－５ｉにおけるＥｔｈＤ－１染色（ＧＦＰゲート化）のヒストグラム。パネルＢにおいて対照群と比較して、処理群間で有意差は存在しない（総取得時間：各群について３０秒）。
図４６は、遺伝子導入の２４時間後で観察した、ＦＬＮＡ細胞内抗体処理後のＵ８７ＭＧ細胞の顕微鏡研究。図４６Ａ上部パネル（Ａ１）：ＬＶ－ＧＦＰ、図４６Ａ下部パネル（Ａ２）：Ａ１の明視野、図４６上部パネル（Ｂ１）：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、図４６下部パネル（Ｂ２）：Ｂ１の明視野、図４６Ｃ上部パネル（Ｃ１）：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ、図４６Ｃ下部パネル（Ａ２）：Ｃ１の明視野。
図４７は、遺伝子導入の７２時間後で観察した、ＦＬＮＡ細胞内抗体処理後のＵ８７ＭＧ細胞の顕微鏡研究。図４７Ａ１：ＬＶ－ＧＦＰ、図４７Ａ２：４７Ａ１の明視野、図４７Ｂ１：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、図４７Ｂ２：４７Ｂ１の明視野、図４７Ｃ１：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ、図４７Ｃ２：４７Ｃ１の明視野。
図４８は、遺伝子導入の７２時間後で観察した、ＦＬＮＡ細胞内抗体処理後のＵ８７ＭＧ細胞の顕微鏡研究。示したコンストラクトで遺伝子導入したＵ８７ＭＧ細胞の明視野画像。図４８Ａ、Ｂ：ＬＶ－ＧＦＰ；図４８Ｃ、Ｄ：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ；図４８Ｅ、Ｆ：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ。４８Ａ、４８Ｃ、４８Ｅは、４×倍率で撮影し、４８Ｂ、４８Ｄ、４８Ｆは、１０×倍率で撮影した。
図４９は、免疫細胞化学（ＩＣＣ）によってＦＬＮＡ細胞内抗体で処理したＵ８７ＭＧ細胞におけるＦＬＮＡの解析。遺伝子導入の７２時間後にＦＬＮＡ細胞内抗体で処置したＵ８７ＭＧ細胞は、ＩＣＣ解析によるＦＬＮＡタンパク質の破損を示す。パネルの左カラム：ＬＶ－ＧＦＰ（上段）、ＦＬＮＡ＿１（中段）、およびＦＬＮＡ＿２（下段）で処理したＵ８７ＭＧ細胞におけるＦＬＮＡ染色。パネルの中央カラム：ＤＡＰＩ核染色。パネルの右カラム：混合画像；矢印は、細胞外ＦＬＮＡ破片を示す。
図５０は、ＦＬＮＡ細胞内抗体で遺伝子導入したＵ８７ＭＧ細胞におけるＦＬＮＡ ｓｃＦｖの解析。Ｕ８７ＭＧ細胞を、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ細胞内抗体（パネルの上段）およびＬＶ－ＧＦＰ（パネルの下段）で処理した。遺伝子導入の４８時間後に、ＦＬＮＡ細胞内抗体を、Ａｌｅｘａ５５５に結合した抗マウスＩｇＧ二次抗体（１：２００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を有する抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）によって検出した（第一のパネル）。ＧＦＰの発現を、抗ＧＦＰ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）によって確認した（第二のパネル）。ＤＡＰＩ染色を、第三のパネルに示し、第四のパネルは、混合した画像である。全ての画像は、同じ顕微鏡設定で撮影した。白色の矢印は、ＦＬＮＡ細胞内抗体およびＧＦＰの共発現を示す。
図５１は、フィラミンＡ細胞内抗体で処理したＤＵ１４５細胞の細胞生存率アッセイ：遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰ発現。図５１Ａ、偽遺伝子導入。図５１Ｂ、ＬＶ－ＧＦＰ遺伝子導入。図５１Ｃ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ遺伝子導入。図５１Ｄ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ遺伝子導入。図５１Ｅ、５１Ａ～Ｄの混合。各群についての合計の非ゲート化取得現象（細胞数）：１０，０００。
図５２は、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）細胞内抗体で処理したＤＵ１４５細胞の細胞生存率アッセイ：カルセインディープレッド（ＣＤＲ）による生細胞解析（ＧＦＰゲート化細胞）。図５２Ａ：遺伝子導入したＬＶ－ＧＦＰ。図５２Ｂ：遺伝子導入したＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ；図５２Ｃ：遺伝子導入したＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ。各群についての合計の非ゲート化取得現象（細胞数）：１０，０００。
図５３は、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）細胞内抗体によって処理したＤＵ１４５細胞上での細胞生存率アッセイ：生細胞解析の概要。図５３Ａ：図５２Ａ～ＣのカルセインＡＭ（生細胞）の混合ヒストグラム。図５３Ｂは、図５３Ａの統計解析（ｎ＝３；両側不対、スチューデントｔ検）。各群についての合計取得現象（細胞数）：５０，０００。
図５４は、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）細胞内抗体によって処理したＤＵ１４５細胞の細胞生存率アッセイ：ＥｔｈＤ－１染色による死細胞解析（ＧＦＰゲート化細胞）。図５４Ａ：遺伝子導入したＬＶ－ＧＦＰ。図５４Ｂ：遺伝子導入したＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ；図５４Ｃ：遺伝子導入したＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ。各群についての合計の非ゲート化取得現象（細胞数）：１０，０００。
図５５は、フィラミンＡ（ＦＬＮＡ）細胞内抗体によって処理したＤＵ１４５細胞上での細胞生存率アッセイ：死細胞解析の概要。図５５Ａ：図５４Ａ～ＣのＥｔｈＤ－１（死細胞）の混合ヒストグラム；図５５Ｂ：５５Ａの統計解析（ｎ＝３；スチューデントｔ検定、両側不対）。各群についての合計取得現象（細胞数）：５０，０００。
図５６は、ＦＬＮＡ細胞内抗体で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３４細胞の細胞増殖アッセイ（ＥｄＵ）：遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰ発現。図５６Ａ、偽遺伝子導入。図５６Ｂ、ＬＶ－ＧＦＰ遺伝子導入。図５６Ｃ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ遺伝子導入。図５６Ｄ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ遺伝子導入。図５６Ｅ、５６Ａ～Ｄの混合。各群についての合計の非ゲート化取得現象（細胞数）：３０，０００。
図５７は、ＦＬＮＡ細胞内抗体で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３４細胞の細胞増殖アッセイ（ＥｄＵ）：ＦＬＮＡ細胞内抗体を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、低減した細胞増殖を示す（ＧＦＰゲート化、ＥｄＵにより染色）。図５７Ａ：染色していない対照；図５７Ｂ：ＬＶ－ＧＦＰ；図５７Ｃ：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ；図５７Ｄ：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ。図５７Ｅは、図５７Ａ～Ｄの統計解析（ｎ＝３；両側不対、スチューデントｔ検）。各群についての合計取得現象（細胞数）：３０，０００。
図５８は、遺伝子導入の２４時間後のＧＦＰ発現を観察した、ＦＬＮＡ細胞内抗体処理後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の顕微鏡研究。図５８Ａ、Ｄ：ＬＶ－ＧＦＰ；図５８Ｂ、Ｅ：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ；図５８Ｃ、Ｆ：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ。図５８Ａ、５８Ｂ、５８Ｃは、ＧＦＰ発現を示し、一方、図５８Ｄ、５８Ｅ、５８Ｆは、それぞれの明視野画像である。
図５９は、ウェスタンブロット解析による細胞内抗体処理後のＦＬＮＡタンパク質レベル。レーン１：ＬＶ－ＧＦＰ；レーン２：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ；レーン３：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ（ＧＡＰＤＨを、負荷対照として使用した）。
図６０は、遺伝子導入の２４時間後の正常ヒト星状細胞におけるＧＦＰ発現のヒストグラム。６０Ａ：偽遺伝子導入；６０Ｂ：ＬＶ－ＧＦＰ；６０Ｃ：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ；６０Ｄ：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ；６０Ｅ：６０Ａ～Ｄの混合。
図６１は、ＦＬＮＡ細胞内抗体での処置後の正常なヒト星状細胞の顕微鏡研究。示したコンストラクトで遺伝子導入した正常なヒト星状細胞におけるＧＦＰ発現。６１Ａ：ＬＶ－ＧＦＰ（下部パネル、Ａ２：上部パネルの明視野、Ａ１）；６１Ｂ：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ（下部パネル、Ｂ２：上部パネルの明視野、Ｂ１）；６１Ｃ：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ（６１Ｃ下部パネル、Ｂ２：上部パネルの明視野、Ｃ１）。
図６２は、遺伝子導入の７２時間後の正常なヒト星状細胞における細胞毒性の割合。キットプロトコールにおける計算：％細胞毒性＝（（化合物で処理したＬＤＨ活性－自然ＬＤＨ活性）×１００）／（最高ＬＤＨ活性－自然ＬＤＨ活性）を使用して、ＬＤＨ細胞毒性を計算した。化合物で処理したウェルは、示した処置群（ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ）からの記録したＬＤＨ放出であった。自然放出は、偽遺伝子導入群からの記録したＬＤＨ放出（遺伝子導入試薬によって引き起こされるバックグラウンドとして減算すべき）であった。最高ＬＤＨは、全細胞溶解からの記録したＬＤＨ放出であった。三つの処置群間での％細胞毒性において有意差は存在しなかった。
図６３は、ＳＫＮＡＳ細胞のＢ４１１の表面染色。
図６４は、ＳＫＢＲ３細胞のＢ４１１の表面染色。
図６５は、ＨｅＬａ細胞のＢ４１１の表面染色。
図６６は、ＳＫＯＶ細胞のＢ４１１の表面染色。
図６７は、Ｂ４１１エンドサイトーシス陽性ＳＫＢＲ３細胞（左パネル）またはＨＥＫ細胞（右パネル）の割合を示す、ヒストグラム。
図６８は、陰性対照（ゼノン標識のみ、または無染色（ＵＳＴ））と比較した、Ｂ４１１エンドサイトーシス陽性ＳＫＢＲ３およびＨＥＫ細胞の総細胞数を示す、棒グラフ。
定義
「約」とは、用語が利用される科学的背景に適切であると、当業者によって理解されるであろう、そのように適格である数、パラメータ、または特性のプラスまたはマイナスのパーセント（例えば、±５％）を意味する。さらに、本明細書で使用される数量を指す全ての数、値、および表現は、当技術分野で遭遇する測定値の様々な不確かさの対象となるため、別段の示唆がない限り、全ての提示される値は、用語「約」によって修正されると理解され得る。
本明細書で使用される場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段、単数参照語に明らかに限定されない限り、または冠詞が、単数参照語を指す文章の文脈から当業者にとって明らかである場合を除き、複数の参照語を含み得る。
数値範囲が本明細書において開示されている場合、こうした範囲は、範囲の最小値と最大値の両方、ならびにこうした最小値と最大値の間の全ての値を含み、連続的である。さらに、ある範囲が整数を指す場合、その範囲の最小値と最大値との間の全ての整数が含まれる。さらに、特徴または特性を記載するために複数の範囲が提供される場合、こうした範囲を組み合わせることができる。すなわち、別段の示唆がない限り、本明細書において開示される全ての範囲は、その中に包含されるあらゆる全ての部分範囲を包含すると解されるべきである。例えば、所定の範囲「１～１０」は、最小値１と最大値１０の間のあらゆる全ての部分範囲を含むとみなされるべきである。範囲「１～１０」の例示的な部分範囲には、１～６．１、３．５～７．８、および５．５～１０が含まれるが、これらに限定されない。
用語「フィラミン」、「ヒトアクチン結合タンパク質」、または「ヒトＡＢＰ」は、アクチンフィラメントを皮質細胞質の直交ネットワークに架橋し、アクチン細胞骨格のための膜タンパク質のアンカーリングに関与するタンパク質のファミリーを指す。フィラミンは、三つの機能的ドメイン：Ｎ末端フィラメント型アクチン結合ドメイン、Ｃ末端自己会合ドメイン、および膜糖タンパク質結合ドメインを含む。フィラミンタンパク質のファミリーは、以下の三つのタンパク質：フィラミンＡ、フィラミンＢ、およびフィラミンＣを含む。
用語「フィラミンＡ」、「ヒトフィラミンＡ」、「アルファ－フィラミン」、「フィラミン１」、「ＡＢＰ－２８０」、「内皮アクチン結合タンパク質」および「非筋肉フィラミン」は、インテグリン、膜貫通型受容体複合体、およびセカンドメッセンジャーと相互作用することによってアクチン細胞骨格の再構成を調節する広く発現されたタンパク質である、ＦＬＮＡ遺伝子によりコードされる約２８０ｋＤのフィラミンタンパク質を指す。フィラミンＡ（またはその一部分）も、ヒト神経芽細胞腫細胞（例えば、ＮＭＢ－７）の表面上に表示される。これはまた、ＮＭＢ－７細胞の不可欠な膜画分、ならびに細胞質および末梢膜タンパク質を含有する親水性タンパク質画分にも存在する。したがって、細胞外表面を含む、細胞全体にわたって見出すことができる。ＦＬＮａはまた、ヒト細胞株ＨｅＬａ（子宮頸癌）、ＳＫＯＶ３（卵巣癌）、およびＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓）の細胞表面に存在することが示されている。Ｂａｃｈｍａｎｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．９７（１２）、２００６年を参照のこと、文献は参照によりその全体で全ての目的のため本明細書に組み込まれる。フィラミンＡのポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ２１３３３（Ｇｏｒｌｉｎら、１９９０年、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１１（３）：１０８９～１１０５頁）で入手可能である。本明細書で使用される場合、「フィラミンＡ」は、そのバリアント、その変異体、その組み換え体バージョン、およびその断片を含む。
用語「フィラミンＢ」、「ヒトフィラミンＢ」、「ベータ－フィラミン」、「ＡＢＰ－２７８」、「内皮アクチン結合タンパク質」、および「非筋肉フィラミン」は、アクチンフィラメントに結合するＦＬＮＢ遺伝子によってコードされる約２７８ｋＤを指す。フィラミンＢのポリペプチド配列は、Ｇｅｎ Ｂａｎｋ受託番号０７５３６９（Ｔａｋａｆｕｔａら、１９９８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２８）、１７５３１～１７５３８頁）を参照されたい。
用語「フィラミンＣ」、「ヒトフィラミンＣ」、「フィラミン２」、「ガンマフィラミン」、「ＡＢＰ－２８０、常染色体形態」は、アクチンフィラメントに結合するＦＬＮＣ遺伝子によってコードされる約２８０ｋＤのタンパク質を指す。フィラミンＣのポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ１４３１５（Ｘｉｅら、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５１（３）、９１４～９１９頁）で入手可能である。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、（ａ）免疫グロブリンポリペプチドおよび免疫グロブリンポリペプチドの免疫活性部分、すなわち、特定の抗原（例えば、フィラミンＡ）に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する、免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、もしくはその断片、または（ｂ）抗原（例えば、フィラミンＡ）に免疫特異的に結合するそのような免疫グロブリンポリペプチドもしくは断片の保存的に置換された誘導体を指す。抗体は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８年）に一般的に記載されている。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、抗体断片を包含する。したがって、一部の実施形態では、抗体は、ＶｈＨ抗体またはドメイン抗体などの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、あるいは一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）または他の抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはＦｖ断片）である。
本明細書で使用される場合、用語「細胞内抗体」は、細胞内タンパク質に結合し、細胞内で効果を有する抗体またはその断片（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）または他の一本鎖もしくは単一ドメイン抗体）を指す。一部の実施形態では、細胞内抗体は、標的細胞内で、例えば、遺伝子療法を介して発現される。例えば、細胞内抗体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、プラスミド、ウイルス送達システム、または非ウイルス送達システムを使用して細胞に送達される。ウイルス送達システムには、例えば、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターが含まれる。非ウイルス送達システムとしては、例えば、カチオン性脂質、脂質エマルション、ナノ粒子、ペプチドベクター（例えば、カチオン性ペプチド）、ポリマー（例えば、合成ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオン性ポリマー）、キトサン、ポリ（ＤＬ－ラクチド）（ＰＬＡ）もしくはポリ（ＤＬ－ラクチド－コ－グリコシド（ＰＬＧＡ）粒子）、デンドリマーまたは機械的送達技術を使用して細胞に送達される、プラスミドもしくはＤＮＡ断片、またはＲＮＡが挙げられる。一部の実施形態では、細胞内抗体は、細胞膜貫通型ペプチド、または細胞内部移行ペプチドを介して細胞内に送達されてもよい。任意で、本明細書において提供される細胞内抗体は、核局在化シグナル、または例えば、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ装置、ミトコンドリア、リソソーム、または他の位置などの異なる細胞内構造に細胞内抗体を標的化するシグナルを含んでもよい。したがって、細胞内で一度発現された細胞内抗体は、細胞質内に留まり得るか、または特定の細胞内構造に局在化し得る。細胞内抗体は、細胞内微小環境に対する抵抗性を増加させるか、または安定性を強化するための追加の修飾を含んでもよい。
上で定義された免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の文脈において、「保存的置換」とは、免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の抗原への特異的結合（例えば、ＫＤによって測定される）を実質的に低減する一つまたは複数のアミノ酸置換（すなわち、例えば、ＥＬＩＳＡなどの標準的な結合アッセイにより結合される、約４０％以下、典型的には、約３０％以下、より典型的には、約２０％以下、なおより典型的には、約１０％以下、または最も典型的には、約５％以下、結合を増加させる、結合を有意に変化させる、または結合を低減する置換）を意味する。
本明細書で使用される場合、「抗体誘導体」は、上で定義された抗体を意味し、例えば、異種ポリペプチドの結合による、または抗体と通常関連しないグリコシル化、アセチル化もしくはリン酸化などによる、異種分子の共有結合によって修飾される。例えば、化学療法剤、または蛍光標識、または放射性化学物質、または活性薬物が、とりわけ、結合されてもよい。
天然で生じる抗体（免疫グロブリン）は、ジスルフィド結合によって一緒に結合された二つの重鎖および各軽鎖がジスルフィド結合によって重鎖のうちの一つに結合されている二つの軽鎖を含む。各鎖は、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）およびそのＣ末端に定常ドメイン（ＣＨまたはＣＬ）を有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと共に整列し、ジスルフィド結合し、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと共に整列する。重鎖定常領域は、（Ｎ末端からＣ末端方向に）ＣＨ１およびヒンジ領域を含む。軽鎖はまた、ヒンジドメインを含む。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成し、ジスルフィド結合を形成すると考えられており、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１～６６３（１９８５年）；ＮｏｖｏｔｎｙおよびＨａｂｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４５９２～４５９６（１９８５年）；Ｐａｄｌａｒら、Ｍｏｌ．ｉｍｍｕｎｏｌ．２３（９）：９５１～９６０（１９８６年）；およびＳ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１６：９６５～９７３（１９９０年）を参照されたい。
定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性および補体依存性細胞傷害における抗体の関与など、様々なエフェクター機能に関与する。軽鎖および重鎖の各対の可変ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与する。天然の軽鎖および重鎖のドメインは、同じ一般的な構造、いわゆる、免疫グロブリンフォールドを有し、各ドメインは、四つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、その配列は、幾分保存されており、三つの超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）によって結び付けられる（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．、（１９８７年）を参照）。四つのフレームワーク領域は、主に、βシート構造を採用し、ＣＤＲは、βシート構造、ある場合では、その形成部を結び付けるループを形成する。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によって近接して保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に、抗原結合部位の形成に関与する。
抗体は、様々な抗原結合断片に分けることができる。Ｆｖ断片は、重鎖および軽鎖の可変ドメインのみを含有するヘテロ二量体である。Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を生じるＦａｂ’の本明細書における名称である。
また、本明細書では、前述のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＳｃＦｖ、およびＦｖ断片、ならびに所望の標的エピトープまたは複数のエピトープに対する特異性を有する本開示の抗体の任意の部分を含む、「抗体断片」も教示される。一態様では、本開示の抗体は、抗フィラミンＡ抗体である。抗体断片の発現は、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号において教示され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、ｓｃＦｖまたは他の抗体断片を含む細胞内抗体である。
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、一般的に少量で存在する、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る可能性のあるバリアントを除いて、同一であり、および／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に指向される異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向される。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有利である。
修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５年）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組み換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４～６２８（１９９１年）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２２２：５８１～５９７（１９９１年）に記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。本明細書のモノクローナル抗体の具体的な例には、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体が含まれる。
本明細書のモノクローナル抗体は、具体的には、所望の生物活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、一方、鎖の残りの部分は、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１ ：６８５１～６８５５（１９８４年））。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最短配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体において、またはドナー抗体において見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。概して、ヒト化抗体は、超可変料理基の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、上で示されたＦＲ置換を除き、ヒト免疫グロブリンのものである、少なくとも一つ、典型的には、二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も任意で含む。詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１ ：５２２～５２５（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３～３２９（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３～５９６を参照されたい。
本明細書における「ヒト抗体」は、ヒトＢ細胞から取得可能な抗体のアミノ酸配列構造に対応するアミノ酸配列構造を含むものである。かかる抗体は、免疫の際、内因性免疫グロブリン産生の不存下でヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック動物（例えば、マウス）による産生（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５～２５８（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．、７：３３（１９９３年）；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号および第５，５４５，８０７号を参照）；ヒト抗体を発現するファージ提示ライブラリーからの選択（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２～５５３（１９９０年）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４～５７１（１９９３年）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４～６２８（１９９１年）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１～５９７（１９９１年）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５～７３４（１９９３年）；米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号を参照）；インビトロ活性化Ｂ細胞を介した生成（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照）；ならびにヒト抗体産生ハイブリドーマからの単離を含むが、これらに限定されない、様々な技術によって同定するか、または作製することができる。
本明細書における「多重特異性抗体」は、二つ以上の異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性または四重特異性である。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、２価、３価、または４価である。
「二重特異性抗体」は、二つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、１価または２価である。
抗体結合体、融合タンパク質、および二重特異性抗体：これらは、放射性核種、薬物、巨大分子、または他の薬剤と化学的方法によって結合されたモノクローナル抗体を指す。
抗原：これは、さらに、動物が、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するよう誘導して抗体を生成することができる抗体によって結合されることができる一つまたは複数の分子または分子の一つ以上の部分を指す。抗原は、一つ以上のエピトープを有し得る。上で言及された特定の反応は、抗原が、非常に優先的な方法で、その対応する抗体と反応し、他の抗原によって誘発され得る他の抗体の多数と反応しないことを示すことを意味する。
エピトープ：これは、抗体によって認識され、抗体によって結合されることができる任意の分子のその部分を指す。概して、エピトープは、化学的に活性な表面群の分子、例えば、アミノ酸または糖側鎖からなり、特定の三次元構造特性ならびに特定の荷電特性を有する。一部の態様では、本開示の対象のエピトープは、フィラミンＡの部分のエピトープである。フィラミンＡのエピトープは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ編（１９８８年）に記載されるようなクロスクロッキングアッセイで同定することができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
相補性決定領域またはＣＤＲ：これは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ、三つのＣＤＲを有する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔら、（１９９１年） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５編、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＮＩＨ公開第９１－３２４２号）によって詳述された番号付け規則を使用して位置付けられ、説明され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
フレームワーク領域またはＦＷＲ：これは、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列を指す。抗体のこれらの部分は、抗原結合のための適切な配向でＣＤＲを保持する役割を果たす。
特異性決定残基またはＳＤＲ：これは、他のＩｇＧと比較した場合の、本開示の抗体に特有のアミノ酸残基を指す。一態様では、ＳＤＲは、抗原接触に直接関与する免疫グロブリンの一部である。
定常領域：これは、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。重鎖定常領域は、五つのアイソタイプ：アルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、またはミューのいずれかから選択することができる。様々なサブクラスの重鎖（重鎖のＩｇＧサブクラスなど）は、異なるエフェクター機能に関与する。したがって、所望の重鎖定常領域を選択することによって、所望のエフェクター機能を有するヒト化抗体を作製することができる。軽鎖定常領域は、カッパ型またはラムダ型であり得る。
免疫原性：レシピエントに投与されたとき、免疫応答（液性または細胞性）を誘発する標的タンパク質または治療部分の能力の尺度。
免疫反応性：特定の抗原を認識し、結合する免疫グロブリンの能力の尺度。
フィラミンＡ抗体またはＦｉｌＡ ｍＡｂ：これらの用語は、本明細書において、用語「フィラミンＡ特異的抗体」および「フィラミンＡ抗原特異的抗体」および「フィラミンＡ抗原結合抗体」などと互換的に使用される。これらの用語は、フィラミンＡ遺伝子およびフィラミンＡ遺伝子の相同体の発現産物に優先的に結合することができる抗体を指し、癌細胞によって産生される、修飾された形態の発現産物に特異的な抗体を含み得る。抗体は、キメラ、ヒト化、および当業者に公知の他のバリアントなどのバリアントを含む。フィラミンＡ抗体は、それらが、別のタンパク質と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも５００倍高い結合親和性でのフィラミンＡ抗原またはエピトープへの優先結合を示すなら、本開示のフィラミンＡ抗原またはエピトープに特異的であると言われる。一態様では、フィラミンＡ抗体は、それらが、任意の他のタンパク質と比較して、１０００倍を超える高い親和性で結合する場合、本開示のフィラミンＡ抗原またはエピトープに特異的であると言われる。ネイキッドフィラミンＡ抗体は、ビオチンまたは放射性標識などの異種分子にコンジュゲートされていないか、またはそうでなければ結合されていない、本開示のフィラミンＡ抗体である。
フィラミンＡ抗原：これは、フィラミンＡ遺伝子によって生成される発現産物を指し、発現産物は、抗原、標的分子、バイオマーカー、またはそれらの任意の組み合わせとして使用することができる。フィラミンＡ抗原は、フィラミンＡ遺伝子およびフィラミンＡ遺伝子の相同体によって産生され得、様々な改変を含み得る。改変には、アミノ酸変異および／または翻訳後変異が含まれ得る。例えば、フィラミンＡ抗原は、癌細胞などのフィラミンＡ抗原を発現する細胞によって導入される改変を含んでもよい。一部の実施形態では、フィラミンＡ抗原は、ＦＬＮａ遺伝子、またはその改変を使用して作製された組み換えタンパク質である。
実質的に類似した結合特性：これは、キメラ抗体を産生するために使用される親抗体によって認識される抗原に優先的に結合する能力を保持する、ヒト化抗体またはその断片などのキメラ抗体の能力を指す。一態様では、親抗体に「実質的に類似した結合特性」を有するキメラ抗体の親和性は、結合親和性が、親抗体によって標的化される記抗原に少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％特異的であるものである。
別の態様では、キメラ抗体、ヒト化抗体、または抗体断片の親和性は、親抗体の親和性の約１０％～約９５％、約１０％～約５０％、約５０％～約９５％、約１０％～約２５％、約２５％～約５０％、約５０％～約９５％、約１０％～約２０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％、約５０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、または約８０％～約９０％である。
抗原結合親和性をアッセイする方法は、当該技術分野で公知であり、最大藩領の結合アッセイ、競合アッセイ、およびスキャチャード解析を含む。一態様では、抗原結合親和性は、競合アッセイを使用してアッセイされる。
実質的に相同は、参照免疫グロブリン配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す免疫グロブリン配列を指してもよく、パーセント同一性は、二つの免疫グロブリン間の同一のアミノ酸残基の数を比較することによって決定され、アミノ酸残基の位置は、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングスキームを使用することによって示される。
二つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一」または「パーセント同一性」は、比較され、最大対応のために整列された場合、同じであるか、または同じである特定の割合のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する二つ以上の配列またはサブ配列を指す。パーセント同一性を決定するために、配列は、最適な比較目的のために整列させられる（例えば、ギャップは、第二のアミノ酸配列または核酸配列との最適なアラインメントのために、第一のアミノ酸の配列または核酸配列に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一の配列における位置が、第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、次いで、分子は、その位置で同一である。二つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複位置）×１００）。特定の実施形態では、二つの配列は、同じ長さである。
二つの核酸またはポリペプチドの文脈において、用語「実質的に同一」は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性（以下に記載される方法の一つを使用して決定される）を有する二つ以上の配列またはサブ配列を指す。
二つ以上のポリペプチド配列の文脈における「類似性」または「パーセント類似性」は、下に記載される方法の一つを使用して測定されるように、比較され、最大対応について整列されたとき、同じであるか、または保存的に置換された、特定の割合のアミノ酸残基を有する二つ以上の配列またはサブ配列を指す。例として、第一のアミノ酸配列は、第一のアミノ酸配列が、第一の配列に含有される数と同一の数のアミノ酸と比較されたとき、または当該技術分野においてこうちのコンピュータ類似性プログラム（以下を参照）により整列されたポリペプチドのアライメントと比較されたとき、第二のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、もしくは９５％以上同一であるか、または保存的に置換されているとき、第二のアミノ酸配列に類似とみなすことができる。
二つの配列間のパーセント同一性またはパーセント類似性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。二つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３～５８７７において改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４～２２６８のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２を用いて行い、対象のタンパク質をコードする核酸と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて行い、対象のタンパク質と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～３４０２に記載されるように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠縁関係を検出する反復検索を行うことができる（Ｉｄ．）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の既定のパラメータを使用することができる。（例えば、インターネットウェブサイトアドレス：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照。）配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９年）のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用することができる。配列解析のためのさらなるアルゴリズムは、当該技術分野において公知であり、ＴｏｒｅｌｌｉｓおよびＲｏｂｏｔｔｉ、１９９４年、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：３～５に記載されるＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４～８に記載されるＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡ内で、ｋｔｕｐは、検索の感度と速度を設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合、比較される二つの配列中の類似の領域は、整列した残基の対を見ることによって見出され、ｋｔｕｐ＝１の場合、単一の整列したアミノ酸が、調べられる。Ｋｔｕｐは、タンパク質配列については２または１に設定することができ、ＤＮＡ配列については１～６に設定することができる。ｋｔｕｐを指定しない場合の既定値は、タンパク質について２、ＤＮＡについて６である。あるいは、タンパク質配列アライメントは、Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９９６年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３～４０２により記載される、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して行ってもよい。
実質的に純粋：本開示の目的のため、実質的に純粋は、均質な調製物を指す。一態様では、均質な調製物は、フィラミンＡ抗体もしくは抗体断片、または他の化学剤もしくは生物剤のものである。少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の均質性の実質的に純粋な免疫グロブリンが、想定される。
フィラミンＡ抗原発現は、特定の組織標本、血液、血清、または血漿におけるフィラミンＡ抗原の存在または存在量の測定、一態様では、フィラミンＡ、その相同体、そのバリアント、その変異体、その組み換えバージョン、および／またはその断片の遺伝子産物の発現によって特徴付けられる疾患に罹患している患者由来の組織標本を含む。そのような疾患には、乳癌、胃癌、および大腸癌が含まれる。
対象開示の「親和性試薬」は、標的分析物に対して高い結合親和性を有する分析物結合ドメイン、部分または成分を有する。高い結合親和性とは、少なくとも約１０－４Ｍ、通常は、少なくとも約１０－６Ｍ以上、例えば、１０－９Ｍ以上の結合親和性を意味する。一態様では、本明細書において教示される抗体の結合親和性は、少なくとも１０－２Ｍ、１０－３Ｍ、１０－４Ｍ、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、１０－１２Ｍ以上、または前述の任意の組み合わせもしくは範囲であってもよい。親和性試薬は、タグ付けされた親和性リガンドとして提示するときに標的タンパク質に対して必要な結合親和性を示す限り、様々な異なるタイプの分子のいずれかであってもよい。したがって、親和性試薬は、小分子または高分子リガンドであってもよい。
また、本開示の対象は、一本鎖抗体またはｓｃＦｖなどの組み換え産生抗体および抗体断片であり、このような組み換え産生抗体断片は、上記抗体の結合特性を保持する。かかる組み換え産生抗体断片は、対象抗体の結合特性を保持するために、概して、対象抗体の少なくともＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。対象の開示のこれらの組み換え産生抗体断片または模倣体は、その開示が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８５１，８２９号および第５，９６５，３７１号に記載される方法論のような、任意の便宜的な方法論を使用して容易に調製され得る。
上記の抗体、断片、およびその模倣体は、市販の供給源から取得されてもよく、および／または任意の便宜的なテクノロジーを使用して調製されてもよく、その組み換え誘導体を含むポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片および模倣体を作製する方法は、当業者に知られている。
第一の実施形態の配列およびＣＤＲ領域
表１Ａは、本明細書において提供される抗体の例示的な可変領域および定常領域を提供する。
表１Ａ－例示的な可変領域および定常領域
ヒトキメラｍＡｂの軽鎖可変アミノ酸配列である配列番号１は、残基３１にイソロイシンを含み、これは、一実施形態では、代わりにロイシンを含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、軽鎖可変アミノ酸配列は、配列番号１を含む。一部の実施形態では、配列番号１および２のＣＤＲ領域は、アミノ酸残基２７～３２（ＣＤＲ１）、５０～５３（ＣＤＲ２）、および８８～９６（ＣＤＲ３）を含む。
ヒトキメラｍＡｂの重鎖可変アミノ酸配列である配列番号４は、残基１０１および１０２に二つのロイシンを含み、これは、一実施形態では、代わりに、二つイソロイシンを含んでもよく、別の実施形態では、一方の一にロイシンを、他方の一にイソロイシンを含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、重鎖可変アミノ酸配列は、配列番号５、６、または７を含む。一部の実施形態では、配列番号４～７のＣＤＲ領域は、アミノ酸残基２６～３３（ＣＤＲ１）、５１～５８（ＣＤＲ２）、および９７～１０６（ＣＤＲ３）を含む。
抗体および抗体断片
抗体ＡＨＯ１４０２は、乳癌細胞株ＭＤＡ．ＭＢ．２３１由来のタンパク質画分を使用して作製されたフィラミンＡに対する市販のマウスＩｇＧ１ｋ抗体である、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から得られるモノクローナル抗体である（Ａｌｐｅｒら、「Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉ－ｆｉｌａｍｉｎ－Ａ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｔｅｃｔｓ ａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｉｌａｍｉｎ－Ａ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．、１００（９）巻、１７４８～１７５６頁、２００９年、その全体が、参照により本明細書に取り込まれる）。
本開示は、１０－５Ｍ～１０－１１Ｍの特異的親和性で、可溶性形態または細胞関連形態のフィラミンＡに結合することができる抗体または抗体断片；可溶性形態のフィラミンＡに結合することができる抗体または抗体断片；可溶性フィラミンＡの活性を選択的に低減することができる抗体または抗体断片；およびフィラミンＡに結合することができる抗体または抗体断片を含む、フィラミンＡ抗原に対する抗体および抗体断片を含む。
抗体または抗体断片は、任意の抗体または抗体断片であることができ、限定されないが、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびｓｃＦｖ（キメラ抗原受容体、もしくはＣＡＲを含む）、または抗体もしくは抗体断片結合体であることができる。一態様では、抗体は、本開示のヒトフィラミンＡ抗原を同定するマウスモノクローナル抗体である。
一態様では、抗体または抗体断片は、脊椎動物の血液または他の体液において見られる任意のガンマグロブリンタンパク質であることができ、細菌およびウイルスなどの外来の対象物を同定し、中和するための宿主免疫システムによって使用され得る。一態様では、抗体または抗体断片は、抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびｓｃＦｖ、ＣＡＲ、または抗体結合体から選択することができる。一部の実施形態において、ｓｃＦｖまたは他の抗体断片は、本明細書において提供される軽鎖可変領域、本明細書において提供される重鎖可変領域、およびリンカーを含む。本明細書において提供されるｓｃＦｖの例示的なアミノ酸配列は、表１Ｂにおいて提供される。一態様では、抗体または抗体断片は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭなどの任意のタイプの免疫グロブリンタンパク質であり得る。一態様では、抗体は、ＩｇＧであり得る。
一態様では、抗体または抗体断片は、少なくとも一つの形態のフィラミンＡの活性を低減することができる。一態様では、抗体または抗体断片は、可溶性形態のフィラミンＡの活性を低減することができる。別の態様では、抗体または抗体断片は、分泌された形態のフィラミンＡの活性を低減することができる。別の態様では、開示される抗体または抗体断片は、細胞表面と関連するフィラミンＡ抗原、例えば、細胞膜関連フィラミンＡ抗原、または細胞内小胞関連フィラミンＡ抗原の活性を低減することができる。したがって、本明細書において教示される抗体は、細胞によって取り込まれる可能性がある。一部の実施形態では、可溶性フィラミンＡタンパク質は、勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定される通り、約２５０～２８０ｋＤａの分子量を有し得る。一態様では、本開示の可溶性フィラミンＡ抗原は、リン酸化される。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、フィラミンＡ断片に結合する。例えば、一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、ｐ１８０断片またはｐ１００断片であるフィラミンＡタンパク質に結合する。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、ｐ１８０断片に結合する。
本開示の別の態様では、抗体または抗体断片を使用して、分泌された形態のフィラミンＡを検出することができる。本開示の別の態様では、抗体または抗体断片を使用して、可溶性形態および分泌された形態または複数の形態のフィラミンＡを検出することができる。本開示の別の態様では、抗体または抗体断片を使用して、フィラミンＡエピトープまたはその断片を検出することができる。
本開示の一態様では、抗体または抗体断片は、可溶性形態のフィラミンＡタンパク質に優先的に結合することができる。この態様では、フィラミンＡへのこうした優先結合は、任意の他のタンパク質に対するものであってもよい。特定の態様では、フィラミンＡへのこうした優先結合は、膜結合であるか、または関連するフィラミンＡに対するものである。しかしながら、他の態様では、本明細書において教示される抗体または抗体断片は、非結合形態の抗原と比較して、細胞膜結合形態のフィラミンＡタンパク質に優先的に結合することができる。したがって、膜結合形態のフィラミンＡ抗原、非膜結合形態のフィラミンＡ抗原、またはその両方に優先的に結合し得る抗体およびその断片が、本開示において提供される。
本開示の一態様では、抗体または抗体断片は、分泌された形態のフィラミンＡタンパク質に優先的に結合することができる。本開示の別の態様では、抗体または抗体断片は、分泌された形態および可溶性形態または複数の形態のフィラミンＡタンパク質に結合することができる。本開示の別の態様では、抗体または抗体断片は、本開示のフィラミンＡエピトープまたはその断片に結合することができる。
本明細書で使用される場合、膜関連タンパク質または膜結合タンパク質は、細胞の検査時に、膜で局在化しているタンパク質である。膜結合タンパク質は、脂質二重層と少なくとも部分的に連結するものである。一態様では、それは、イオン相互作用を介して膜に結合される。別の態様では、膜結合タンパク質は、共有結合相互作用を介して膜に結合される。一態様では、膜結合タンパク質は、疎水性相互作用を介して膜に結合される。本明細書において教示される抗体は、前述の膜結合タンパク質、または膜関連タンパク質に結合してもよい。
本開示の一態様では、優先結合は、バックグラウンドに関する。別の態様では、優先結合は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍または１，０００，０００倍である。別の態様では、本開示の抗体は、膜形態のフィラミンＡと比較して、可溶性形態のフィラミンＡに優先的に結合する。特定の態様では、本開示の抗体は、核膜形態のフィラミンＡと比較して、可溶性形態のフィラミンＡに優先的に結合するか、または別の態様では、逆である。すなわち、一部の態様では、上記の優先結合は、細胞膜と関連するフィラミンＡ抗原に優先的に結合する教示された抗体の能力に関する。
一態様では、本明細書において教示される抗体または抗体断片は、約１０－５Ｍ、約１０－６Ｍ、約１０－７Ｍ、約１０－８Ｍ、約１０－９Ｍ、約１０－１０Ｍ、約１０－１１Ｍ、もしくは約１０－１２Ｍより高い、または約１０－８Ｍ～約１０－１１Ｍ、もしくは約１０－９Ｍ～約１０－１０Ｍ、もしくは約１０－１０Ｍ～約１０－１１Ｍの特異的親和性で、分泌された形態もしくは可溶性形態（例えば、ヒト乳癌由来）、または膜結合形態のような、特定の形態のフィラミンＡに結合する。一態様では、特異的活性は、競合結合アッセイを使用して測定される。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１２および１３から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列を含む抗フィラミンＡ抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１４に記載の軽鎖ＣＤＲ２配列を含む抗フィラミンＡ抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１５に記載の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む抗フィラミンＡ抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１６に記載の重鎖ＣＤＲ１配列を含む抗フィラミンＡ抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１７に記載の重鎖ＣＤＲ２配列を含む抗フィラミンＡ抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１８、１９、２０、および２１から選択される重鎖ＣＤＲ３配列を含む抗フィラミンＡ抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される軽鎖および重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列のいずれかを含む抗体を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１および２から選択される軽鎖可変領域を含む抗フィラミンＡ抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号４、５、６、および７から選択される重鎖可変領域を含む抗フィラミンＡ抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される軽鎖および重鎖可変領域配列のいずれかを含む抗体を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、配列番号３または配列番号２３を含む定常軽鎖領域を含む抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１１または配列番号２８を含む定常重鎖領域を含む抗体を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１に記載の軽鎖可変領域および配列番号４に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンＡ抗体Ｂ１８５を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１に記載の軽鎖可変領域および配列番号６に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンＡ抗体Ｂ４０５を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１に記載の軽鎖可変領域および配列番号５に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンＡ抗体Ｂ４０６を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１に記載の軽鎖可変領域および配列番号７に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンＡ抗体Ｂ４０７を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２に記載の軽鎖可変領域および配列番号４に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンＡ抗体Ｂ４０８を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２に記載の軽鎖可変領域および配列番号６に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンＡ抗体Ｂ４０９を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２に記載の軽鎖可変領域および配列番号５に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンＡ抗体Ｂ４１０を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２に記載の軽鎖可変領域および配列番号７に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンＡ抗体Ｂ４１１を提供する。一部の実施形態では、抗体Ｂ４１１は、それぞれ、配列番号１３、１４、および１５に記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにそれぞれ、配列番号１６、１７、および２１に記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される軽鎖および重鎖可変領域を含む細胞内抗体を提供する。一部の実施形態では、細胞内抗体は、本明細書において提供されるｓｃＦｖ配列を含む。本明細書において提供される例示的な細胞内抗体のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列は、以下で表１Ｂにおいて提供される。一部の実施形態では、ｓｃＦｖまたは細胞内抗体は、配列番号６７および６９から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｓｃＦｖまたは細胞内抗体は、配列番号６８および７０から選択されるＤＮＡ配列を含む。
表１Ｂ．例示的なｓｃＦｖまたは細胞内抗体配列
別の態様では、本開示の抗体または抗体断片を使用して、対象の組織内の乳癌を検出することができる。一部の実施形態では、本開示の抗体または抗体断片を使用して、例えば、生検試料、血漿または血清などの患者由来の任意の試料における癌を検出することができる。
本開示のさらなる態様は、組織標本、可溶性形態のフィラミンＡ抗原に優先的に結合することができる抗体と、当該標本内の可溶性形態のフィラミンＡ抗原の間の抗体と抗原の複合体を含む、組成物を提供する。本開示の一態様では、組織標本は、フィラミンＡおよびその相同体の遺伝子産物の発現によって特徴付けられる疾患に罹患している患者由来のものである。本開示のさらなる態様では、患者は、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、頭頸部癌、または脳癌に罹患している。本開示の別の態様では、可溶性形態のフィラミンＡ抗原は、当該組織標本において過剰発現される。一態様では、本開示は、フィラミンＡおよびその相同体の遺伝子産物の発現によって特徴付けられる、患者における疾患を検出するための当該組成物の使用を提供する。本開示の一態様では、当該組成物の免疫組織化学染色は、患者における疾患の存在を示す。本開示の一態様では、当該疾患は、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、または頭頸部癌である。別の態様では、疾患は、乳癌、胃癌、大腸癌である。一態様では、疾患は、乳癌である。
一態様では、本開示のフィラミンＡ抗体は、治療から利益を得る可能性が高いフィラミンＡ抗体陽性癌細胞（転移性または非転移性）のサブセットを同定することができる。本開示のこのようなフィラミンＡ抗体は、治療から利益を得るであろう癌を有する患者のような、それを必要とする対象を同定する方法において使用することができる。本開示の方法は、本開示のフィラミンＡ抗体を使用して、血液、血漿、または血清中のより低いレベルのフィラミンＡを検出する方法を含み得る。一態様では、方法は、現在利用可能な試験より疾患経過のより早期において、血漿中のフィラミンＡを検出する。
抗体および抗体断片は、任意で、固相上に固定化され、検出可能に標識されるか、または細胞傷害性放射性核種、細胞傷害性薬物、もしくは細胞傷害性タンパク質などに結合され得る。
本開示の抗体および抗体断片は、細胞、哺乳類細胞、哺乳類癌細胞、ヒト細胞、およびヒト癌細胞によるフィラミンＡ抗原の発現を標的にすることができる。例示的な癌としては、ヒト乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、血液、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺および脳癌細胞の固形腫瘍が挙げられる。一態様では、抗体または抗体断片は、ヒト乳房、胃、および結腸細胞を標的にする。例示的な癌には、非固形癌も含まれる。例えば、癌には、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）およびヘアリー細胞白血病などの急性白血病および慢性白血病を含む白血病；皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）などのリンパ腫、非皮膚末梢性Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）などのヒトＴ細胞リンパ栄養性ウイルス（ＨＴＬＶ）に関連するリンパ腫、ホジキン疾患および非ホジキンリンパ腫；ならびに多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない。発現されたフィラミンＡ抗原は、任意の形態の遺伝子産物を含み得るが、特定の態様は、可溶性形態または分泌された形態のフィラミンＡの検出に関する。かかる抗原はまた、フィラミンＡ遺伝子の遺伝子産生された相同体、および癌細胞によって発現される改変フィラミンＡ抗原を含み得る。
一態様では、本開示は、重鎖ＣＤＲ抗原結合部位のアミノ酸配列および軽鎖ＣＤＲ抗原結合部位のアミノ酸配列を含む、フィラミンＡ抗原の優先結合を有する抗体または抗体断片を含む。本開示はまた、一つまたは複数の重鎖ＣＤＲ抗原結合部位アミノ酸配列および一つまたは複数の軽鎖ＣＤＲ抗原結合部位アミノ酸配列を含む、フィラミンＡ抗原の優先結合を有する抗体または抗体断片を含む。
本開示は、重鎖と軽鎖の両方のＣＤＲのうちの一つまたは複数を有する抗原結合部位を有する、フィラミンＡ抗体または抗体断片を含む。本開示はまた、これらと実質的に相同であるか、または実質的に類似する結合特性をもたらす抗原結合部位を含有するフィラミンＡ発現産物に特異的な抗体および抗体断片も含む。かかる抗体またはその断片は、本開示のフィラミンＡ抗体由来のＣＤＲ重鎖または軽鎖のうちの一つまたは複数と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％同一であり得る。
本開示はまた、正常細胞または癌細胞によって発現されるフィラミンＡ抗原に特異的である、新規タンパク質発現細胞株、およびそれらが分泌するモノクローナル抗体分子を含む。前述された通り、本明細書において作製される抗体は、一実施形態では、癌細胞、例えば、乳癌細胞によって産生される可溶性形態または分泌された形態のフィラミンＡに結合することができる。しかしながら、他の実施形態では、本明細書において作製される抗体は、癌細胞、例えば、乳癌細胞によって産生されるか、または関連する膜結合形態または膜関連形態のフィラミンＡと結合することができる。一部の実施形態では、本明細書において作製される抗体は、ＦＬＮａの可溶性または膜関連断片に結合することができる。
本開示は、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体を含む。本開示はまた、抗体断片、ならびに他の改変抗体および抗体断片を含む。
本開示はまた、フィラミンＡ抗原への優先結合を有するが、表１Ａに含まれるものとは同一ではないＦＷＲおよび／またはＣＤＲ抗原結合部位のアミノ酸配列を有する抗体および抗体断片を包含する。かかる抗体は、本開示のフィラミンＡ抗原またはその抗体断片に対して少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍高い親和性でフィラミンＡ抗原に対して優先選択性であり得る。一態様では、本開示の抗体または抗体断片のバリアントは、本開示の非バリアント抗体または抗体断片としてフィラミンＡ抗原に対して特異的であり得るか、またはより特異的であり得る。
フィラミンＡに特異的であるが、表１Ａに含まれるものと同一ではないＦＷＲおよび／またはＣＤＲ抗原結合部位アミノ酸配列を有し、表１Ａに含まれるＦＷＲおよび／またはＣＤＲと同じまたは異なる特異性決定領域（ＳＤＲ）を有し得る抗体および抗体断片が含まれる。
表１Ａに記載されるアミノ酸配列に対する改変は、ＦＷＲ配列およびＣＤＲ配列のいずれかまたは両方で起こり得る。一態様では、改変を別のフィラミンＡ抗体に行い、表１Ａに記載される抗原結合部位の一つまたは複数のアミノ酸配列に一致させることができる。本開示の特定の態様によれば、抗体または抗体断片のバリエーションは、それらが実質的に相同なアミノ酸配列を有するか、抗体が、実質的に類似する結合特性を有するか、または両方の場合に生じ得る。本開示の一態様では、ＣＤＲ抗原結合部位における単一のアミノ酸変化が存在し得る。フィラミンＡ抗体のアミノ酸配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化をフィラミンＡ抗体核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。かかる修飾には、例えば、フィラミンＡ抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれらへの挿入および／または置換が含まれる。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを成して、最終コンストラクトに到達するが、但し、最終コンストラクトは、所望の特性を有する。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変更することのような、フィラミンＡ抗体の翻訳後プロセスを変更してもよい。
アミノ酸置換バリアントは、異なる残基によって置換された、フィラミンＡ抗体分子における少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発について最大の興味があるも部位は、超可変領域またはＣＤＲを含むが、ＦＷＲ領域における改変も企図される。
保存的置換は、類似の電荷または疎水性、例えば、（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）無電荷の極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；および（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）を有するものでアミノ酸を置換することを含む。
あるいは、天然に生じる残基は、共通の側鎖特性：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性の疎水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅに基づいてグループに分けられてもよい。
特に具体化されたタイプの置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の一つまたは複数の超可変領域残基を置換することを含む。概して、さらなる開発のために選択される得られるバリアントは、それらが生成される親抗体と比較して、改善された生物学的特性を有する。
本開示の抗体または抗体断片のヒト化バリアントは、ＡＨＯ１４０２などのマウス抗体またはその抗体断片と比較したとき、低減したマウス含有量、および潜在的に、低減した免疫原性を含有し得る。ヒト化バリアントには、元の抗体または抗体断片のものと実質的に類似する結合親和性を保持するものが含まれる。本開示の態様は、１、２、３、４、５、または６つの（三つの重鎖および三つの軽鎖）ＣＤＲがヒト化されている、ヒト化フィラミンＡ抗体または抗体断片のＣＤＲバリアントを提供する。別の態様では、本開示は、フィラミンＡ抗体および抗体断片の少なくとも一つのＣＤＲの特異性決定残基（ＳＤＲ）のみが、ヒト化抗体に存在する、ヒト化フィラミンＡ抗体および抗体断片のＳＤＲバリアントを企図する。
ＣＤＲバリアントは、ヒト化フィラミンＡ抗体および抗体断片の少なくとも一つのＣＤＲを、ヒト抗体由来の対応するＣＤＲで置換することによって形成することができる。一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのＣＤＲが、ヒト抗体由来の対応するＣＤＲによって置換され、親フィラミンＡ ｍＡｂの結合親和性と実質的に類似する生物活性を保持するＣＤＲバリアント。本開示のＣＤＲバリアントは、親フィラミンＡ抗体または抗体断片の結合親和性より２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である結合親和性を有し得る。
ＣＤＲバリアントは、フィラミンＡ抗体および抗体断片と比較したとき、変化した免疫原性を有し得、ヒト抗体および抗体断片の可変軽（ＶＬ）および可変重（ＶＨ）フレームワークに、本開示のフィラミンＡ抗体および抗体断片由来の全六つの（三つの重鎖および三つの軽鎖）ＣＤＲを移植することによって形成され得る。しかしながら、本開示の抗体が活性を保持するのを依然として可能にしながら、本開示のフィラミンＡ抗体および抗体断片のＣＤＲの全六つ未満が存在する。特異性決定残基（ＳＤＲ）などの抗原接触に直接関与する残基を精製することができる。ＳＤＲバリアントは、フィラミンＡ抗体または抗体断片の少なくとも一つのＳＤＲを、ヒト抗体由来の対応する位置の残基で置換することによって形成される。なお、全てのＣＤＲがＳＤＲを含む必要はない。
一態様では、本抗体および抗体断片のバリアントは、ヒトにおける低減した免疫原性およびフィラミンＡに対する親抗体または抗体断片のものと実質的に類似する結合親和性を有するバリアントを生成するためのＣＤＲおよび／またはＳＤＲ置換の組み合わせを含む。
本明細書に具体的に記述されるバリアントに加えて、他の「実質的に相同な」改変された免疫グロブリンは、様々な組み換えＤＮＡ技術を使用して容易に設計し、製造することができる。例えば、フレームワーク領域（ＦＷＲ）は、一次構造レベルで変化させることができる。さらに、様々な異なるヒトフレームワーク領域は、バリアントの基礎として単独でまたは組み合わせて使用することができる。概して、遺伝子の修飾は、部位特異的変異誘発およびランダム変異誘発などの様々な技術によって容易に達成され得る。
あるいは、一次抗体構造の一部のみを含むポリペプチド断片を作製することができ、断片は、バリアントの免疫反応性特性を実質的に保持する。かかるポリペプチド断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解切断により産生される断片、または部位特異的変異誘発を使用して所望の位置のヌクレオチド配列に終止コドンを挿入することによって産生される断片を含む。少なくともバリアントの免疫反応性断片を含む、一本鎖抗体および融合タンパク質も、本開示の範囲内に含まれる。
本開示による抗体およびそのバリアントは、治療活性を有するエフェクター部分に直接的または間接的に付着することができる。適切なエフェクター部分は、サイトカイン、細胞毒、放射性核種、薬物、免疫調節剤、治療用酵素、抗増殖剤などを含む。かかるエフェクターに抗体を付着させる方法は、当該技術分野で公知である。これらの結合した抗体は、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭、首、肺、血液、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺および脳の癌などの癌を含む、フィラミンＡの発現によって特徴付けられる疾患の治療において使用するための医薬組成物を含む、任意の組成物に取り込むことができる。一態様では、細胞は、ヒト乳房、卵巣、頭部、頸部、または脳由来である。医薬組成物は、疾患を治療するために、このような治療を必要とするヒト患者を含み得る、哺乳動物に投与される。
抗体および抗体断片は、標識されるか、または標識されないかのいずれかであってもよい。標識されていない抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域に特異的な抗体などの、ヒト化抗体と反応性である他の標識された抗体（第二の抗体）と組合わせて使用することができる。あるいは、抗体は、直接標識することができる。放射性核種、フッ素、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、リガンド（特に、ハプテン）などのような、多種多様な標識を用いることができる。多数のタイプのイムノアッセイが利用可能である。
第二の実施形態の配列およびＣＤＲ領域
本開示の追加の配列は、以下の表２～５において見ることができる。
これらの配列は、特に、表１Ａにおいて前述された配列由来の代替のＣＤＲ結合ドメイン領域に対応する。さらに、これらの結合ドメイン配列および全体的な抗体配列内のそれらの位置は、図２８～３１においてマッピングされる。
図２８～３１は、ヒトキメラ軽鎖可変ＣＤＲ結合ドメイン領域（図２８）、ヒトキメラ重鎖可変ＣＤＲ結合ドメイン領域（図２９）、マウス軽鎖可変ＣＤＲ結合ドメイン領域（図３０）、およびマウス重鎖可変ＣＤＲ結合ドメイン領域（図３１）について、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡＢＭ、Ｋａｂａｔ、およびＣｏｎｔａｃｔにより予測されるＣＤＲ領域間の一致アライメント表す。
表２：ヒトキメラ軽鎖可変ＣＤＲ結合ドメイン領域
表３：ヒトキメラ重鎖可変ＣＤＲ結合ドメイン領域
表４：マウス軽鎖可変ＣＤＲ結合ドメイン領域
表５：マウス重鎖可変ＣＤＲ結合ドメイン領域
ＣＤＲ境界の同定を頻繁に使用して、多くが、抗原の抗体結合に重要であると考える配列を指摘する。したがって、ＣＤＲの定義は、超可変性の領域に焦点を当てる傾向があるが、抗体配列の鍵となるアミノ酸および位置も含む。結果として、これらの領域の境界は、配列データベースの解析のための基準の１設定に依存して変化し得る。データベース自体の組成も、結果に影響を与え得る。この点に関して、ＣＤＲを定義する境界は、システムごとに異なり得る。さらに、ＣＤＲ／超可変領域の外側に位置するアミノ酸が、抗原の直接結合にも関与し得る既知の例もあるが、これは、必ずしもその特定のアミノ酸を含有する全ての抗体についての場合であるとは限らない。このため、抗原と直接相互作用し得るＣＤＲおよび抗体位置を同定するいくつかの方法がある。
一態様では、本開示の範囲内で利用される配列データベースは、ＰＤＢからの構造データに加えて、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、ＰＤＢデータベースを含むいくつかのデータベースからの配列データを統合する、Ａｂｙｓｉｓデータベース（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ）である。Ａｂｙｓｉｓシステムの使用において、医師は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｍａｒｔｉｎ（強化されたＣｈｏｔｈｉａ）、および接触情報によって定義されるＣＤＲ境界を同時に取得することができる。Ｋａｂａｔおよび他の抗体配列ナンバリングシステムは、異なってもよい。ナンバリングシステムに焦点を当てるよりむしろ、異なるシステム下でＣＤＲを定義する実際のアミノ酸配列に焦点を当てる。Ａｂｙｓｉｓデータベースに関する一般的な情報は、インターネットアドレスワールドワイドウェブ：ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／で見ることができ、これは、参照によりその全体で全ての目的のため本明細書に組み込まれる。
Ａｂｙｓｉｓ解析におけるＣＤＲ定義は、以下：（１）最も一般的に使用されるシステムである、配列変動に基づくＫａｂａｔ；（２）構造ループ領域の位置に基づく、Ｃｈｏｔｈｉａ；（３）Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの抗体モデリングソフトウェアに基づくＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの定義との間の妥協点である、Ａｂｙｓｉｓ－Ｍａｒｔｉｎ（ＡｂＭ）；および（４）利用可能な複合体抗体と抗原結晶構造の分析に基づき、移植および変異誘発に有用である可能性が高い、Ｃｏｎｔａｃｔを含む。
結果は、前述のシステム間で常に１００％一致しているわけではないが、これらの異なるシステムを使用することにより、抗原結合に重要であり得る抗体の領域をより良く理解することができる。本開示の抗体に関して、Ａｂｙｓｉｓ解析の結果は、表２～５および図２８～３１に詳述される。
抗原および本開示の抗体の結合領域
本開示の抗体およびその断片は、フィラミンＡ抗原に結合することができる。
前述のように、本開示の一部の実施形態は、可溶性または分泌されたフィラミンＡ抗原に結合する。特定の態様では、可溶性または分泌されたフィラミンＡ抗原は、ヒト乳癌細胞に由来する。
一部の態様では、本開示の抗体によって結合される抗原は、参照によりその全体が全ての目的のため本明細書に組み込まれる、Ａｌｐｅｒら、「Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉ－ｆｉｌａｍｉｎ－Ａ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｔｅｃｔｓ ａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｆｉｌａｍｉｎ－Ａ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｇｒａｄｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．、１００（９）巻、１７４８～１７５６頁、２００９年において考察される抗原である。したがって、一部の態様では、本開示は、教示された抗体が、ＦＬＮａのカルパイン切断部位の上流（Ｎ末端）に結合し、約１８０ｋＤａ（ｐ１８０、カルパイン部位のＮ末端）および約１００ｋＤａ（ｐ１００、切断部位のＣ末端）のサイズの二つの断片を作製する、フィラミンＡ抗原モデルを提案する。このモデルでは、教示された抗体は、ｐ１００ Ｃ末端切断産物には結合しないがｐ２８０（全長）およびｐ１８０断片には結合しないように思われる。Ａｌｐｅｒら、２００９年の図１ｃを参照されたい。
一部の態様では、本開示の抗体によって結合される抗原は、参照によりその全体が全ての目的のため本明細書に組み込まれる、Ｂａｃｈｍａｎら、「Ａｃｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｉｌａｍｉｎ Ａ ｉｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．、９７（１２）巻、１３５９～１３６５頁、２００６年において考察された、膜結合または膜関連フィラミンＡ抗原である。したがって、一部の態様では、本開示は、ＦＬＮａのＣ末端が、細胞外基質に曝露され、ＦＬＮａのＮ末端が、細胞質内に位置する、フィラミンＡ抗原モデルを提案する。このモデルでは、Ｎ末端のアクチン結合ドメインは、アクチン細胞骨格と会合し、一方、表面提示部分は、本明細書において教示される抗体を含む様々な細胞外リガンドとの相互作用を可能にする。
核酸分子および宿主細胞
本開示の抗体または抗体断片のいずれも、核酸によってコードされ得る。本開示は、かかる分子、かかる分子の断片、およびベクターに含まれるかかる分子などを含む。核酸分子はまた、かかる核酸分子の補体を含む。ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の両方が、核酸分子の例である。
別の態様では、本開示は、抗体分子の重鎖をコードする、単離ＤＮＡ配列を提供し、抗体分子は、少なくともフィラミンＡを含むフィラミンＡ抗原に優先結合を有し、重鎖の可変ドメインは、少なくとも一つ、二つ、または三つのＣＤＲの抗原結合部位アミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。
なお別の態様では、本開示は、抗体分子の軽鎖をコードする、単離ＤＮＡ配列を提供し、抗体分子は、少なくともフィラミンＡを含むフィラミンＡ抗原に優先結合を有し、さらに、軽鎖の可変ドメインは、少なくとも一つ、二つ、または三つのＣＤＲの抗原結合部位アミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。
別の態様では、本開示は、宿主細胞中の核酸分子を含む。かかる核酸分子は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得るか、またはプラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクターに存在し得る。本開示の核酸分子は、こうした宿主細胞に一過性に存在してもよい。一態様では、宿主細胞は、大腸菌；バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含むバチルス；サルモネラ、セラチアおよびシュードモナス、サッカロミセスを含む酵母を含む腸内細菌；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）；Ｓｆ９昆虫細胞；Ｓｐ２／０、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株；Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７およびＭＤＣＫ細胞株からなる群から選択される。一態様では、宿主細胞は、ＳＫＢＲ３、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、およびＺＲ７５Ｂ細胞などの乳癌細胞株から選択される。別の態様では、宿主細胞は、ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａｐ細胞などの前立腺癌細胞株から選択される。別の態様では、宿主細胞は、ＨＴ－２９細胞などの大腸癌細胞株から選択される。別の態様では、宿主細胞は、Ａ４３１細胞などの皮膚癌細胞株から選択される。別の態様では、宿主細胞は、ＢＨＫ－２１またはＣＯＳ－７細胞などの腎臓癌細胞株から選択される。別の態様では、宿主細胞は、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、またはＡ２７８０ｃｉｓ細胞などの卵巣癌細胞株から選択される。別の態様では、これは、ＣＨＯ細胞である。別の態様では、これは、肺癌細胞（例えば、Ａ５４９細胞株）である。
フィラミンＡ抗体、細胞内抗体、または抗体断片を作製する方法
本開示のフィラミンＡ抗体または抗体断片は、例えば、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞株からのタンパク質調製物で動物を免疫することによって発生させることができる。
本開示は、組み換えＤＮＡテクノロジーを使用してヒト化抗体を含む、モノクローナルキメラを作製するプロセスを含む。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８８年）を参照のこと、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示のフィラミンＡ抗体または抗体断片は、フィラミンＡに特異的な抗体または抗体断片を産生するマウスハイブリドーマを作製することを含むが、これに限定されない、任意の公知の方法によって産生され得る。ハイブリドーマは、例えば、マウス融合パートナー細胞とフィラミンＡに対して免疫化されたマウス由来の脾細胞の融合によって形成され得る。マウスを免疫するために、様々な異なる従来のプロトコルに従うことができる。例えば、マウスは、抗原性調製物の一次免疫およびブースト免疫を受けることができる。
本開示は、細胞内抗体を作製する方法を提供する。フィラミンＡ特異的細胞内抗体は、例えば、細胞内でフィラミンＡ特異的ｓｃＦｖを発現させることを含む任意の公知の方法によって産生されてもよく、ｓｃＦｖは、細胞内局在化のために改変される。例えば、ｓｃＦｖをタンパク質とＮ末端および／またはＣ末端で融合させて、発現を補助し、安定性を増加させ、細胞内環境に対する抵抗性を増加させ、および／または特定の細胞内構造もしくは領域にｓｃＦｖを標的化してもよい。一部の実施形態では、細胞内抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に、可変軽鎖領域、リンカー、および可変重鎖領域を含む。一部の実施形態では、細胞内抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に、可変重鎖領域、リンカー、および可変軽鎖領域を含む。リンカーは、当該技術分野で公知の任意の融合タンパク質リンカーであってもよい。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、可撓性リンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、（ＧＧＧＳ）３（配列番号７１）または（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号７２）などのグリシン－セリンリンカーである。本明細書において提供される細胞内抗体の例示的なアミノ酸配列は、表１Ｂにおいて提供される。一部の実施形態では、ｓｃＦｖの可変重鎖および／または軽鎖は、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、または当技術分野で抗体の他のタグなどのタグを含むか、またはそれらに連結される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、ヒスチジンタグ付き抗フィラミンＡ細胞内抗体を提供する。一部の実施形態では、細胞内抗体は、細胞内抗体の発現を助けるための融合タンパク質を含む。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質は、核、ＥＲ、ゴルジ装置、ミトコンドリア、リソソーム、または他の細胞内構造もしくは領域などの細胞内構造または領域に細胞内抗体を標的化する、ＧＳＴ、Ｉｇ－Ｆｃ、またはタンパク質配列などのｓｃＦｖのＮ末端および／またはＣ末端に融合物を含む。
一部の実施形態では、細胞内抗体コンストラクトは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、またはその他などのレポーター遺伝子に遺伝子的に連結されている。一部の実施形態では、連結されたレポーター遺伝子は、それ自身のプロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、連結されたレポーター遺伝子は、細胞内抗体プロモーターからの発現を駆動するためのＩＲＥＳ配列を介して駆動される。したがって、一部の実施形態では、細胞内抗体は、可変重鎖および軽鎖、タグ、ならびにレポーター遺伝子（例えば、Ｖｈ－Ｖｌ－Ｈｉｓ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰまたはＶｌ－Ｖｈ－Ｈｉｓ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）を含むフィラミンＡ特異的ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、細胞内抗体は、ＥＦプロモーターによって駆動される可変重鎖および軽鎖、タグ（例えば、Ｈｉｓタグ）、ならびにＩＲＥＳ配列（例えば、ＥＦ－Ｖｈ－Ｖｌ－Ｈｉｓ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰまたはＥＦ－Ｖｌ－Ｖｈ－Ｈｉｓ－Ｇ－ＩＲＥ）によって駆動されるレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）を含むフィラミンＡ特異的ｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、細胞内抗体は、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターを介して送達される。一部の実施形態では、細胞内抗体は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｉｓｅｒら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７４（２２）巻、１０５８９～９９頁（２０００年）のような、二相性レンチウイルスベクターを介して送達される。
一部の実施形態では、細胞内抗体は、細胞透過ペプチド、細胞膜を超えて細胞内抗体を転座させるための他の化学的部分またはナノキャリア送達システムを介して細胞に送達されるか、または転座されるタンパク質である。例示的な細胞透過ペプチド、他の化学的部分などは、当該技術分野で公知であり、アンテナペプチド配列、ＴＡＴ、ＨＩＶ－Ｔａｔ、ペネトラチン、Ａｎｔｐ－３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、バフォリンＩＩ、トランスポータン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ－ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ－１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ－７、ＨＮ－１、ＢＧＳＣ（ビス－グアニジニウム－スペルミジン－コレステロール、およびＢＧＴＣ（ビスグアニジニウム－トレン－コレステロール）を含むが、これらに限定されない。したがって、一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される抗体、例えば、ｓｃＦｖに融合されたタンパク質形質導入ドメインを含む融合タンパク質を提供する。ナノキャリア送達システムは、脂質ベースのナノキャリア（例えば、リポソームおよび他の脂質ベースのナノ粒子）、ポリマーベースのナノキャリア（例えば、ポリマーベースのリポソームまたはポリマーソーム）、無機ナノ粒子（例えば、シリカナノ粒子）、微粒子、および改変ウイルスまたはウイルス様粒子を含む。本明細書において提供される細胞内抗体は、当技術分野で公知の転位システムのいずれかを介してタンパク質として細胞に送達されてもよい。
細胞融合は、免疫学の分野の当業者に公知の手法によって達成され得る。融合パートナー細胞株およびハイブリドーマを融合させ、選択する方法ならびに抗体もしくは抗体断片をスクリーニング方法が、知られている。
本開示の抗体または抗体断片は、例えば、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔内に注射し、適切な時間後、高力価の抗体または抗体断片を含有する腹水を回収し、そこから抗体または抗体断片を単離することによって、大量に産生することができる。あるいは、インビトロでハイブリドーマ細胞を培養し、分泌された抗体または抗体断片を細胞培養培地から単離することによって、抗体および抗体断片を産生することができる。
本開示のフィラミンＡ抗体または抗体断片はまた、配列が発現制御配列に作動可能に連結された後、宿主細胞において適切なＤＮＡ配列を発現させることによっても産生され得る。このような発現ベクターは、多くの場合、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。発現ベクターは、多くの場合、複製起点などの宿主細胞と互換可能な発現制御配列を含有する。さらに、発現ベクターは、遺伝子の発現を制御するためのプロモーターを、任意選択で、オペレーター配列と共に含み、転写および翻訳を開始し、完了するためのリボソーム結合部位配列等を有することができる。適切なプロモーターは、ポリヘドリンプロモーター、ラクトースプロモーターシ系、トリプトファンプロモーター系、β－ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダ由来のプロモーター系を含むが、これらに限定されない。発現ベクターはまた、選択マーカーを含み得る。フィラミンＡ抗体または抗体断片の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ配列は、別個の発現ベクターに、または同じ発現ベクターに挿入され得る。
好適な宿主は、大腸菌；バチルス・スブチリスを含むバチルス、サルモネラ、セラチア、シュードモナスを含む腸内細菌などの原核生物を含むが、これらに限定されない。好適な宿主はまた、サッカロマイセスを含む酵母；ピキア・パストリス；Ｓｆ９昆虫細胞；Ｓｐ２／０、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞株；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株；Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７およびＭＤＣＫ細胞株を含むが、これらに限定されない。他の適切な宿主はまた、既知の発現技術に従って使用することができる。
対象のＤＮＡセグメントを含有するベクターは、細胞宿主のタイプに応じて変化する、任意の方法によって宿主細胞内に運ぶことができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクション、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーションまたはカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション（ＤＯＴＡＰなど）。首尾よく形質転換された細胞は、リガンドへの受容体の結合を検出するための様々な技術によって同定することができる。
発現された遺伝子産物は、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動を含むが、これらに限定されない、任意の方法に従って精製することができる。少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の実質的に純粋な免疫グロブリンが、想定される。
単離または精製されたＤＮＡ配列は、クローニングベクターまたは発現ベクターに組み込まれ、順に、宿主細胞を形質転換するために使用することができる。形質転換された宿主細胞は、宿主細胞の培養およびそれらが産生する抗体分子の単離を含む、フィラミンＡ抗原に対する特異性を有する抗体分子の産生のプロセスにおいて使用され得る。
キメラ抗原受容体形態のフィラミンＡ抗体
細胞外免疫療法として使用するため、フィラミンＡ抗体は、膜の細胞外側からのアクセスを必要とし得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、膜の細胞外側でフィラミンＡに結合し、ＣＡＲ－Ｔ療法などの細胞免疫療法において有用である。したがって、一部の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）形式でフィラミンＡ特異的抗体を提供する。例えば、本開示は、抗体、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現する細胞を提供し、抗体、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現する細胞は、細胞表面上で発現したフィラミンＡに特異的に結合する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、フィラミンＡ抗体またはその断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含むフィラミンＡ特異的ＣＡＲポリペプチドを提供する。さらなる実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通型ドメイン、および一つまたは複数の細胞外ドメインを含み、少なくとも一つの細胞外ドメインは、フィラミンＡ抗体またはその断片である。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、およびそれらの任意の組み合わせ）ならびに／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ鎖シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドのフィラミンＡ抗体またはその断片は、本明細書において提供される重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドのフィラミンＡ抗体またはその断片は、本明細書において提供される重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において記載されるＣＡＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、フィラミンＡ抗体またはその断片を含むＣＡＲポリペプチドは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、または幹細胞）上に発現される。さらなる実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。したがって、一部の実施形態では、本開示は、細胞表面上でフィラミンＡを発現する細胞にＴ細胞を標的化するＣＡＲ－Ｔ細胞などの操作された細胞を提供する。他の実施形態では、本開示は、フィラミンＡ ＣＡＲを介して、細胞表面上でフィラミンＡを発現する細胞にＮＫ細胞またはＮＫ－Ｔ細胞を標的化する操作されたＮＫ細胞またはＮＫ－Ｔ細胞を提供する。他の実施形態では、本開示は、ＣＡＲ形式のフィラミンＡ抗体またはその断片を発現する操作されたマクロファージを提供し、操作されたマクロファージは、マクロファージが、細胞表面上でフィラミンＡを発現する細胞を貪食するよう標的にする。一部の実施形態では、フィラミンＡ特異的抗体またはその断片（例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞上に発現される）は、細胞外フィラミンＡを発現する癌細胞に優先的に結合する。
診断方法、アッセイ、およびキット
さらなる態様では、本開示は、本開示の抗体または抗体断片を含むフィラミンＡ抗原を検出するためのイムノアッセイを含む。
本開示はまた、表１Ａにおいて記載される重鎖または軽鎖ＣＤＲ抗原結合部位アミノ酸配列の一つまたは複数を有するモノクローナル抗体に結合する、フィラミンＡ抗原を含む、一つまたは複数のフィラミンＡ抗原を優先的に検出するためのイムノアッセイを含む。
かかるイムノアッセイは、（ａ）試料を、有効結合量の本開示の抗体または抗体断片の一つと接触させること、および（ｂ）フィラミンＡ抗原への抗体の結合を検出することによって抗原を検出することを含むが、これらに限定されない、任意の適切な様式で使用され得る。本開示のイムノアッセイを使用して、フィラミンＡ抗原を発現する癌細胞、特に、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、血液、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺および脳がんからなる群から選択される癌、腫瘍、癌腫細胞または新生物疾患細胞を検出することができる。
さらなる態様では、本開示は、（ａ）本開示の抗体または抗体断片；および（ｂ）検出可能な標識に結合された二次抗体を含む、癌の免疫組織化学的検出のためのキットを提供する。
さらなる態様では、本開示は、（ａ）表１Ａにおいて記載される重鎖または軽鎖ＣＤＲ抗原結合部位アミノ酸配列の一つまたは複数を有するモノクローナル抗体；および（ｂ）検出可能な標識に結合された二次抗体を含む、癌の免疫組織化学的検出のためのキットを提供する。
キットは、フィラミンＡ抗原の試料をアッセイするための試薬を含み得、こうしたキットは、抗体、またはその断片もしくは模倣体などのフィラミンＡ抗原特異的親和性試薬、および／あるいは抗体、酵素基質などのような、シグナル産生システムの同じメンバーを含むイムノアッセイ装置；対象の検出アッセイを行うのに使用するための様々な緩衝液；試料中の一つまたは複数のフィラミンＡ抗原の量を決定するための参照などを含む。キットまたはキット形式の他の例は、参照によりその全体が全ての目的のため本明細書に組み込まれる、２００８年８月８日に出願された米国特許出願第１２／１８９，０５１号に対応する、米国特許出願公開第２００８／０２９３１６２Ａ１号において見られる。
さらなる態様では、本開示は、（ａ）癌を有すると疑われる患者から標本を取り出すこと；（ｂ）標本を本開示の抗体または抗体断片と接触させること；および（ｃ）抗原と抗体の複合体の存在を検出することを含む、ヒトにおける癌を診断する方法を提供する。一部の態様では、標識が使用され、検出される。癌を診断するこうした方法は、インビボまたはインビトロで実施することができる。
さらなる態様では、本開示は、（ａ）癌を有すると疑われる患者から標本を取り出すこと；（ｂ）表１Ａにおいて記載される重鎖または軽鎖ＣＤＲ抗原結合アミノ酸配列の一つまたは複数を有するモノクローナル抗体と標本を接触させること；および（ｃ）抗原と抗体の複合体の存在を検出することを含む、ヒトにおける癌を診断する方法を提供する。一部の態様では、標識が使用され、検出される。癌を診断する方法は、インビボまたはインビトロで実施することができる。
診断される癌は、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺、および脳の固形腫瘍からなる群から選択される癌を含む。細胞は、ヒト乳房、卵巣、頭部、頸部、および脳細胞をさらに含み得る。
一態様では、フィラミンＡレベルは、年齢が一致した健康な対照と比較して、早期の乳癌患者においてより高い。別の態様では、フィラミンＡレベルは、年齢が一致した健康な対照と比較して、中期の乳癌患者においてより高い。別の態様では、フィラミンＡレベルは、年齢が一致した健康な対照と比較して、後期の乳癌患者においてより高い。一態様では、フィラミンＡのレベルは、年齢が一致した健康な対照と比較して早期乳癌患者においてより高く、後期の乳癌において健康な対照レベルと類似する。フィラミンＡレベルにおける増加は、一部の態様では、それらが、年齢が一致した健康な対照と比較して統計的に有意であることを意味する。健康な対照レベルと類似するレベルは、レベルが統計的に有意ではないことを意味し得る。一態様では、フィラミンＡのレベルにおける統計的有意差は、マン・ホイットニー検定もしくはスチューデントｔ検定、または当技術分野で公知の任意の他の統計検定によって測定される、ｐ＜０．０５のｐ値を有する。別の態様では、フィラミンＡのレベルにおける統計的有意差は、マン・ホイットニー検定もしくはスチューデントｔ検定、または当技術分野で公知の任意の他の統計検定によって測定される、ｐ＜０．０１のｐ値を有する。さらなる態様では、フィラミンＡのレベルにおける統計的有意差は、マン・ホイットニー検定もしくはスチューデントｔ検定、または当技術分野で公知の任意の他の統計検定によって測定される、ｐ＜０．００５のｐ値を有する。さらなる態様では、フィラミンＡのレベルにおける統計的有意差は、マン・ホイットニー検定もしくはスチューデントｔ検定、または当技術分野で公知の任意の他の統計検定によって測定される、ｐ＜０．００１のｐ値を有する。一部の実施形態では、患者間のレベルは、統計的に有意ではないが、結果は、依然として定量可能であり、癌を有する患者と正常な非癌性個体の間の差を示すことができる。
さらなる態様では、本開示は、（ａ）当該対象由来の標本を本開示の抗体または抗体断片と接触させること；および（ｂ）乳癌を有する患者におけるフィラミンＡの増加を検出すること、このような乳癌が、早期、中期、または後期であり得る、を含む、それを必要とする対象における乳癌を診断する方法を提供する。乳癌を診断するこうした方法は、インビボまたはインビトロで実施することができる。
診断される乳癌は、早期、中期または後期乳癌、またはその組み合わせのいずれかであり得る。
追加の態様では、本開示は、フィラミンＡまたはその相同体の遺伝子産物の発現によって特徴付けられる疾患の治療、診断、または治療と診断の両方に有用な薬物を開発する方法を含む。これらの方法は、フィラミンＡおよびその相同体によって発現される遺伝子産物を同定すること、およびフィラミンＡ抗体および抗体断片、阻害ペプチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ワクチン、ならびに遺伝子産物を特異的に標的とする化合物からなる群から選択される薬物の開発および同定におけるバイオマーカーとして、遺伝子産物を利用することを含む。
抗体および抗体断片は、フィラミンＡの存在について、血清、痰、滲出物、尿、脳脊髄液などの体液をスクリーニングするためにイムノアッセイにおいて使用することができる。抗体および抗体断片は、適切な放射標識で標識されたとき、腫瘍細胞の原発または転移性病巣を検出するために、スキャンまたは放射撮像のため使用することができる。さらに、抗体は、疾患におけるリンパ節の関与を検出するためのリンパシンチグラフィーに有用である。
フィラミンＡ関連遺伝子産物に特異的な抗体または抗体断片のいずれかまたはすべて、および／またはそのヒト化などのキメラ、もしくは他のバリアントを含み得る、フィラミンＡ抗体または抗体断片は、治療上、またはアッセイ、インビボもしくはインビトロでの診断手法、および撮像の開発ならびに実施において使用され得る。抗体は、単独または医薬的に許容されるもしくは診断可能な担体製剤と組み合わせて使用することができる。フィラミンＡ抗体または抗体断片は、懸濁液または溶液として、医薬上または診断上許容可能な無毒性の無菌の担体に取り込まれ得る。これらは、別々に投与される組成物として、または化学療法剤もしくは免疫抑制剤と併せて投与され得る。
本開示は、医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と組み合わせて本開示の抗体または抗体断片を含む治療用および診断用組成物を含む。本開示はまた、本開示の抗体分子を医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と混合することを含む、治療用および診断用組成物の調製プロセスを含む。抗体分子は、治療用組成物または診断用組成物中の唯一の有効成分であり得るか、または他の抗体成分、例えば、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγもしくは抗ＬＰＳ抗体、またはキサンチンなどの非抗体成分を含む他の活性成分を伴ってもよい。組成物は、固形腫瘍、特に、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺および脳の固形腫瘍を含むが、これらに限定されない、フィラミンＡの発現によって特徴付けられる疾患を診断または治療するためのキットに組み込まれ得る。細胞はまた、ヒト乳房、卵巣、頭部、頸部、または脳細胞であり得る。
本開示の抗体または抗体断片は、試料におけるフィラミンＡまたはフィラミンＡを生じる細胞を検出または定量するイムノアッセイに有用である。こうしたイムノアッセイは、典型的には、腫瘍抗原を同定することができる本開示の検出可能に標識された抗体の存在下で、それを必要とする対象由来の生物学的試料をインキュベートすること、および試料における結合する標識された抗体を検出することを含む。
本開示の一態様では、フィラミンＡ分布の観察を使用して、特定の疾患、例えば、乳癌と関連する段階を検出することができる。組織標本は、フィラミンＡ抗体とインキュベートされ得、得られたフィラミンＡ－抗原とフィラミンＡ抗体の複合体は、標準的な免疫組織化学染色を使用して検出され得る。
本開示の抗体が検出可能に標識され得る方法の一つは、それを酵素に連結させることによって検出可能に標識され、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で使用することができる。この酵素は、その後、その基質に曝露されたとき、例えば、分光光度手段、蛍光手段、または視覚手段によって検出され得る、化学的部分を生じる基質と反応する。代替の実施形態では、酵素を使用して、本開示の抗体の結合パートナーを標識する。かかる結合パートナーは、異種抗マウス免疫グロブリン抗体などの本開示の抗体の定常領域または可変領域に対する抗体であり得る。あるいは、結合パートナーは、本開示の抗体に結合することができる非抗体タンパク質であり得る。
本開示の抗体を放射性標識することによって、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）の使用を通じてフィラミンＡを検出することができる。放射性同位元素は、ガンマカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用のような手段により、またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。本開示の目的に特に有用である同位体は、当技術分野で公知である。
本開示の抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体が、適切な波長光に曝露されたとき、次に、その存在は、蛍光に起因して検出することができる。本開示の抗体はまた、化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識され得る。次いで、化学発光標識された抗体の存在は、化学反応の過程で発生する発光の存在を検出することによって決定される。生物発光化合物を使用して、本開示の抗体を標識することもできる。生体発光は、触媒タンパク質が、化学発光反応の効率を増加させる、生体系に見られる化学発光の一種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識の目的に重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびセコリンである。
抗体、断片または誘導体の検出は、例えば、検出可能な標識が放射性ガンマエミッターである場合、シンチレーションカウンターによって、または例えば、標識が蛍光材料である場合、蛍光光度計によって達成され得る。酵素標識の場合、検出は、酵素の基質を用いる比色法によって達成することができる。検出は、同様に調製された標準と比較して、基質の酵素反応の程度の視覚的比較によっても達成することができる。
生体内原位置での検出は、患者から標本を取り出すこと、標識抗体、または非標識抗体およびこのような標本の標識結合パートナーを用意することによって達成することができる。こうした手順の使用を通じて、抗原の存在だけでなく、調べた組織におけるその分布も決定することが可能である。本開示を使用して、当業者であれば、多種多様な組織学的方法（染色手法など）のいずれかが、そのような組織原位置での検出を達成するために改変され得ることを容易に認識するであろう。かかる方法は、例えば、免疫組織化学染色手法を含む。一態様では、アビジン－ビオチン免疫ペルオキシダーゼ染色システムを使用することができ、このシステムを利用するキットも意図されているが、本開示の方法は、当該技術分野で公知の任意の適切な染色手法を利用することができる。
本開示によるキットは、解凍することにより、または液体ビークル中で懸濁することにより再構成されるべき凍結または凍結乾燥された抗体を含み得る。キットはまた、担体または緩衝液を含み得る。別の実施形態では、キットは、抗体を再構成および使用するための指示書も含む。本開示のキメラ抗体およびヒト化抗体を含む抗体を用いるキットは、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、血液、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺、および脳の癌を含む、癌の免疫組織化学的評価のため使用することができる。細胞はまた、ヒト乳房、卵巣、頭部、頸部、および脳細胞であり得る。
免疫組織化学解析に必要な試薬を含むキットは、以下の通り提供することができる：（ａ）本開示のフィラミンＡ抗体もしくは抗体断片、またはそのキメラもしくはヒト化バリアント；（ｂ）ブロッキング試薬（例えば、ヤギ血清の形態）および二次抗体（例えば、ヤギ抗マウス抗体など）；（ｃ）検出可能なマーカー（例えば、免疫ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなど）；および（ｄ）開発中の試薬。一次抗体（フィラミンＡ抗体もしくは抗体断片またはそのバリアント）は、一つより多くの二次抗体に結合することができる抗原として機能する。二次抗体は、一次抗体と、検出可能なマーカーおよび開発中の試薬（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ－アンチペルオキシダーゼ複合体）によって形成される複合体との間に「架橋」を形成する。
任意の適切な検出システムを、本開示の方法およびキットに従って使用することができる。このような検出システムは、免疫蛍光用途で広く使用され、フローサイトメトリー、顕微鏡、ウェスタンブロット、およびＥＬＩＳＡを含むが、これらに限定されない技術を使用して撮像することができる。適切な検出システムは、順に、特異的な標的を検出するために使用される（本開示の文脈において、標的は、フィラミンＡ発現産物である）、一次タンパク質からのシグナルを増幅する（本開示の文脈において、増幅される一次タンパク質シグナルは、例えば、ビオチンなどのタンパク質で標識することができるか、またはできない、フィラミンＡ抗体に結合する）ために、二次抗体の結合体、コロイド状金の結合体、または二次タンパク質の結合体を利用することができる。
本開示の方法およびキットにおける使用に適切な二次結合体は、二次抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素の酵素結合体；アビジンまたはストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素の酵素結合体；タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇと西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素の酵素結合体；コロイド状金と二次抗体の結合体；コロイド状金とアビジンまたはストレプトアビジンの結合体；磁気粒子と二次抗体の結合体；および二次抗体と蛍光色素およびビオチンなどの標識の結合体を含み得るが、これらに限定されない。本開示は、任意の特定の検出システムに限定されず、本開示に従って、これらまたは他の検出システムを利用することは、当業者の能力の範囲内とみなされる。これらの二次結合体（本開示の文脈において標識とも呼ばれる）は、抗原と抗体の複合体を可視化するのに有用である。
本開示の抗体または抗体断片はまた、「二つの部位」または「サンドイッチ」アッセイとしても知られる、免疫測定アッセイにおける利用に適合され得る。典型的な免疫測定アッセイでは、非標識抗体（または抗体の断片）の量は、試験される流体中で不溶性である固体支持体に結合し、検出可能に標識された可溶性抗体の量が、固相抗体、抗原と標識された抗体の間で形成される三元複合体の検出および／または定量を可能にするよう適合される。
本開示の抗体または抗体断片を使用したヒト乳房、卵巣、頭部、頸部、および脳癌ならびに他の癌を含む、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、血液、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺および脳のインビボ撮像の目的のため、当業者に公知の多くの異なる標識および標識方法が存在する。本開示で使用され得る標識の種類の例は、放射性同位体、常磁性同位体、および陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）によって撮像され得る化合物を含む。
装置
上述のように、対象の方法の実践における使用を見い出す装置も提供される。対象の方法を実施するための装置は、少なくとも、フィラミン分析物のための対象由来の試料をアッセイするための試薬を含み、このような装置は、固体支持体の表面に固定された抗体、またはその断片もしくは模倣体などのフィラミン分析物特異的親和性試薬を含み得る。一部の実施形態では、フィラミン分析物は、フィラミンＡ分析物である。
装置を用いて実施される方法において要求されるか、または所望される追加の品目が存在してもよく、追加の項目は、患者試料を得るための手段、例えば、シリンジ；ヘパリン、 Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ、溶解緩衝液、プロテアーゼ阻害剤等のような、患者由来試料の調製に必須の一つまたは複数の試薬；対象の装置を使用して対象の方法を行うための指示書；異常なレベルのフィラミン分析物を含む新生物疾患の存在を検出し、および／または特徴決定するために使用される追加の生化学アッセイ由来の一つまたは複数の試薬を含むが、これらに限定されない。
多数のこうした装置が、当該技術分野で公知である。一つの非限定的な例では、装置は、少なくとも三つの領域、流体輸送領域、試料領域、および測定領域を有する、好適なフィルターまたは膜の連続的な流路を概して採用する。試料領域は、試料を受け取る前に、流路の他の部分と流体移動接触することを妨げる。試料領域が、試料を受け取った後、他の領域と流体移動関係に持ち込まれ、流体と接触した流体移動領域は、試薬溶液が、試料領域を通り、測定領域内に入ることを可能にする。測定領域は、それを第一の親和性試薬、ならびにアッセイされる試料および上述のように行われるサンドイッチアッセイと組み合わせた第二の標識された親和性試薬と結び付け得る。
別の、フィラミン分析物に特異的に結合する、抗体、またはその断片もしくは模倣体などの親和性試薬に結合する表面に限定される例では、装置はディップスティックである。こうした例示的な装置では、ディップスティックは、ディップスティックに結合した親和性試薬へのフィラミン分析物の結合を可能にするのに十分な時間、対象由来の試料（例えば、血液、血清、または尿）に直接挿入される。次いで、ディップスティックは、抜去され、必要に応じて洗浄されて、非特異的に結合した物質を除去してもよい。次いで、ディップスティックは、フィラミン分析物に特異的に結合する、抗体、またはその断片もしくは模倣体などの検出可能に標識された第二の親和性試薬を含有する容器に挿入される。フィラミン分析物と親和性試薬の複合体への第二の抗体の結合に十分な時間インキュベーションした後、ディップスティックは、洗浄され、第二の親和性試薬の結合が、標準的な手段によって検出されてもよい。第二の抗体の検出に必要な場合、ディップスティックは、第二の抗体上の検出可能な標識を活性化する試薬を含有する第二の容器に挿入されてもよい。
医薬組成物および治療方法
本開示の別の態様は、任意選択で、医薬的に許容される担体と組み合わせた、開示された抗体のいずれかを含む組成物を提供する。別の態様では、本開示の抗体は、任意選択で、一つまたは複数の有効な剤、薬物、他の抗体、またはホルモンと組み合わされる。
本開示はまた、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、血液、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺および脳、ならびにヒト乳房、卵巣、頭部、頸部、および脳、特に、ヒト乳房細胞の固形腫瘍などの、フィラミンＡを発現する癌に罹患しているか、またはリスクがあるヒトまたは動物対象を治療する方法を提供し、方法は、対象に、治療有効量の本開示の抗体、または治療上有効量の本開示の抗体を含む医薬組成物を投与することを含む。本開示はまた、フィラミンＡを発現する癌に罹患しているか、またはリスクがあるヒトまたは動物対象を治療する方法における本明細書において提供される抗体の使用；およびフィラミンＡを発現する癌に罹患しているか、またはリスクがあるヒトまたは動物対象を治療するための医薬の製造における本明細書において提供される抗体の使用を提供する。さらに、本開示は、フィラミンＡを発現する癌に罹患するか、またはリスクのあるヒトまたは動物対象を治療する方法における使用のための、本明細書において開示される抗体、および／または本明細書において開示される抗体を提供する。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒト患者または対象を含む、治療を必要とする任意の対象を指す。
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、標的の疾患もしくは状態を治療するか、改善するか、もしくは予防するため、または検出可能な治療もしくは予防効果を示すために必要な治療剤の量を指す。
任意の抗体について、治療有効用量は、まず、細胞培養アッセイにおいて、または通常齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、または霊長類における動物モデルのいずれかにおいて推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲および投与経路を決定することもできる。次いで、こうした情報を使用して、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。
ヒト対象の有効量は、疾患状態の重症度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の回数および頻度、薬物併用、反応感受性および療法に対する抵抗性／応答に依存し得、日常的な実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。概して、有効用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇであり得る。
組成物は、患者に個別に投与することができ、または他の薬剤、薬物、抗体、またはホルモンと組み合わせて投与することができる。一部の態様によれば、抗体は、これらの薬剤と結合され得る。本開示の抗体が治療上使用され得る方法の概要は、補体細胞またはエフェクター細胞のいずれかによって媒介されるか、または抗腫瘍薬、毒素、および放射性核種に結合された抗体による直接細胞毒性を含む。したがって、本開示は、本開示の抗体を投与することを含む癌を治療する方法を提供し、抗体は、癌細胞を標的とし、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘導する。さらに、本開示は、標的治療薬に連結されたか、または結合された本開示の抗体を投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、細胞によって貪食され、これにより、フィラミンＡ発現細胞に標的治療薬を送達することができる。したがって、本開示は、医薬的に許容される担体中に本明細書において提供される抗体、ならびに医薬的に許容される担体において、治療剤に連結または結合されたコンジュゲートされる本明細書において提供される抗体を含む医薬組成物を提供する。抗体は、血液循環または骨髄から腫瘍細胞の生体外除去にも使用することができる。
細胞傷害性タンパク質は、リシンＡ、シュードモナス毒素、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子を含み得るが、これらに限定されない。診断用放射性核種および細胞傷害性放射性核種などの細胞傷害性薬剤、薬物およびタンパク質も、本開示の抗体に結合され得る。抗体に結合され、抗原のインビボ部位に選択的に送達され得る放射性核種の例は、特に２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、および９０Ｙを含む。放射性核種は、放射線療法の技術分野で公知である、細胞を局所的に照射することによってその細胞傷害性効果を発揮し、これにより、様々な細胞内病変をもたらし得る。抗体に結合され、その後インビボ療法に使用され得る細胞障害性薬物の例は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびマイトマイシンＣを含むが、これらに限定されない。細胞傷害性薬物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質合成を含む重要な細胞プロセスと干渉し得る。
本開示の抗体分子が投与される用量は、治療されるべき状態の性質、および抗体分子が、予防的に使用されているか、または既存の状態を治療するために使用されているかどうかに依存する。予防的に、すなわちワクチンとして投与される場合、抗体は、対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与される。
抗体分子が、短い半減期（例えば、２～１０時間）を有する場合、１日当たり１回または複数の用量を与えるのに必要であり得る。あるいは、抗体分子が、長い半減期（例えば、２～１５日）を有する場合、１日１回、週１回、または１か月もしくは２か月に１回のみ投与することが必要であり得る。
医薬組成物はまた、抗体の投与のための医薬的に許容される担体を含有し得る。担体は、それ自体、組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生を誘導するべきではなく、毒性であるべきではない。好適な担体は、当該技術分野で公知のものを含み、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子などの大型のゆっくりと代謝される巨大分子から選択され得るが、好適な担体は、これらの例に限定されない。
一実施形態では、投与のための形態は、例えば、注射または注入による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与に適した形態を含む。生成物が注射または注入用である場合、油性または水性ビークル中の懸濁液、溶液、またはエマルションの形態をとり得、懸濁剤、保存剤、安定化剤、および／または分散剤などの配合剤を含有し得る。あるいは、抗体分子は、適切な無菌の液体を用いた使用前に再構成するための、乾燥形態であってもよい。
一旦製剤化されると、本開示の組成物は、対象に直接投与され得る。治療されるべき対象は、動物またはヒトであり得る。
本開示の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所的、舌下、膣内または直腸経路を含むが、これらに限定されない、任意の数の経路によって投与され得る。皮下噴霧器を使用して、本開示の医薬組成物を投与することができる。治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製することができる。注射前の液体ビークル中の溶液または懸濁液に適した固体形態も調製され得る。
組成物の直接送達は、概して、皮下、腹腔内、静脈内、もしくは筋肉内注射により達成されるか、または組織の間質腔に送達され得る。投与処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。
抗体または抗体断片組成物が、消化管を使用した経路によって投与されるべきであるとき、組成物は、分解から抗体を保護するが、消化管から吸収されたら抗体を放出する追加の薬剤を含有し得る。こうした追加の薬剤は、当業者に周知である。
本開示の抗体はまた、遺伝子療法を行う方法で投与され得る。これを達成するために、適切な発現成分の制御下で抗体分子の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列は、抗体鎖が核酸配列から発現され、その場で構築されるように、患者に導入される。例えば、細胞内抗体コンストラクトは、プラスミドコンストラクト（例えば、細胞内抗体発現をもたらすための真核生物のプロモーターを含むプラスミド）、ウイルスベースのコンストラクト（例えばレンチウイルスもしくはレトロウイルスベクター）、または非ウイルスベースの送達ビークル（例えば、脂質ベースまたはぴりまーベースの送達ビークル）として細胞内に送達されてもよい。細胞内抗体コンストラクトは、ＤＮＡまたはＲＮＡとして送達されてもよい。あるいは、組み換え細胞内抗体タンパク質コンストラクトは、細胞膜膜透過ペプチドを有するタンパク質を介して、または化学的もしくは機械的送達システムを介して細胞に送達されてもよい。
本開示の抗体はまた、免疫細胞を介してＣＡＲ形式で投与することができる。一部の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する細胞を含む医薬組成物を提供し、ＣＡＲは、本明細書において提供されるフィラミンＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、または幹細胞）を含む。さらなる実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。したがって、一部の実施形態では、本開示は、細胞表面上でフィラミンＡを発現する細胞にＴ細胞を標的化するＣＡＲ－Ｔ細胞を含む医薬組成物を提供する。
実施例１：ヒトキメラフィラミンＡ抗体の調製
モノクローナルマウスフィラミンＡ ＩｇＧ１ｋ抗体であるＡＨＯ１４０２を、９５％ＢＳＡおよび５％抗体の溶液においてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から得た。ＢＳＡを除去し、抗体を精製するために、抗体を単離し、ゲル電気泳動で精製し、サイズで分離し、ゲルから切り出した。
抗体を含むゲルスライスを、次いで、配列を再構築するための重複ペプチド配列解析により編集される配列情報を得るための高分解能ＭＳ／ＭＳペプチド決定を利用する、データベース支援ショットガンシーケンシング（ＤＡＳＳ）技術を利用した新規シーケンシングに供した。ＤＡＳＳ法は、一般に、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｅａｔｉｖｅ－ｂｉｏｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ｈｔｍｌ）に記載される。
次いで、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン用に構築したアミノ酸配列を、本発明者が選択したマウス定常領域配列およびヒト定常領域配列に付加した。特定のアミノ酸選択を、軽鎖ＣＤＲ１の位置３１で、ならびに重鎖ＣＤＲ３の位置１０１および１０２で行った。様々な変異を示すアミノ酸配列を、上記表１Ａにおいて提供する。
次いで、これらのアミノ酸配列を、哺乳類細胞発現のためのコドン最適化を用いて逆翻訳した。再構成した遺伝子の核酸配列を、さらなる使用前に忠実性について確認し、次いで、発現ベクターにクローニングした。次いで、発現ベクター中のクローニングした遺伝子を、ＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入し、組み換えｍＡｂタンパク質を精製した。
実施例２：ｓｃＦｖの調製および特徴決定
重鎖可変領域および軽鎖可変領域をｓｃＦｖベクターシステムにサブクローニングして、二つの可能な配向、軽鎖－重鎖（ＶＬ－ＶＨまたはｖｌ－ｖｈ）および重鎖－軽鎖（ＶＨ－ＶＬまたはｖｈ－ｖｌ）でｓｃＦｖを生成した。
得られた単鎖抗体を、細胞の免疫蛍光染色、細胞運動性、増殖、アポトーシス、および機能的生物活性を評価する他のアッセイを含むアッセイで試験する。
ｓｃＦｖを、診断検査および疾患、例えば、乳癌を治療する方法における使用のためにさらに評価する。
実施例３：細胞運動アッセイ
細胞運動アッセイを、本開示の作製したｍＡｂ（マウス抗体Ｂ１８６、ヒトキメラ抗体Ｂ１８５、およびヒトキメラ抗体Ｂ４１１）の機能活性を探索する際に利用した。
活性の根拠を、マウスとヒトキメラ抗体の両方を用いて得た。しかしながら、驚くべきことに、ヒトキメラｍＡｂは、マウスｍＡｂよりも強い生物活性を示した。効果はまた、コラーゲン被覆表面よりもフィブロネクチン被覆組織培養表面でより顕著であった。
細胞運動アッセイは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｔｙｐｕｓｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｄｉｓｃｏｖｅｒＡｓｓａｙ．ｈｔｍｌで一般的に記載される、Ｐｌａｔｙｐｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＯＲＩＳ（商標）細胞遊走アッセイプラットフォームを利用した。
３Ｄ反復を含むこうした運動アッセイは、癌細胞の浸潤性および悪性と相関していると認識され、したがって、癌転移および他の活性の代替である。
具体的には、本開示のフィラミンＡ抗体を、三重被覆９６ウェルプレート（Ｐｌａｔｙｐｕｓ ＃ ＣＭＡＴＲ１．１０１）を使用したＯＲＩＳ（商標）細胞遊走アッセイにおいて評価した。細胞を約５０，０００細胞／ウェルで播種した。ＨＥＫ－２９３細胞の場合、ＤＭＥＭにおいて、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の場合、１０％のＦＢＳを含有するＬ－１５において、細胞を３７℃、ＣＯ２なしで一晩インキュベートした。細胞増殖チャンバを覆うストッパーを、ＯＲＩＳ（商標）ストッパーツールを使用して取り除き、成長培地を取り除き、ウェルを無菌ＰＢＳ１００マイクロリットルでやさしく洗浄した。染色工程が、遊走前の対照としての役目を果たすまで、参照ウェル内にストッパーを定位置に置いた。洗浄後、特定の処理を含有する新鮮培養培地の体積１００マイクロリットルを各ウェルに加えた。次いで、細胞を一晩インキュベートさせた。インキュベーション期間の終了時に、細胞をカルセインＡＭで３０分間蛍光染色した。次いで、蛍光を、検出マスクを定位置に置いたマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
図１および図２は、各状態についての検出ゾーンに存在する相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す（平均±標準偏差、ｎ＝２ウェル／状態）。
細胞を含有するウェルは、三つの形態：コラーゲンで被覆、フィブロネクチンで被覆、または組織培養（ＴＣ）処理で存在した。
ウェル処理は、以下の通りであった：抗体対照なし、マウス抗体（ｍＡｂ ＦＬＮＡ １ｍｃｇ／ｍｌ）、マウス抗体（ｍＡｂ ＦＬＮＡ ２０ｍｃｇ／ｍｌ）、ヒトキメラ抗体（ｈＡｂ ＦＬＮＡ １ｍｃｇ／ｍｌ）、ヒトキメラ抗体（ｈＡｂ ＦＬＮＡ ２０ｍｃｇ／ｍｌ）、アピシン（１００ｎＭ）、サイトカラシンＢ（３０マイクロモル）；図１を参照。ＲＦＵ数の増加は、細胞運動性の増加と相関する。
細胞運動アッセイの結果
細胞遊走は、コラーゲンまたはフィブロネクチンで被覆したウェルにおいて最大であった。組織培養処理ウェルに関して、細胞骨格線維の相互作用を中断することが知られており、したがって運動性を阻害すると予想される、サイトカラシンＢを除き、処理全体に渡って効果はほとんどないようである。
ＴＣ表面上の抗体処理に対する応答の明らかな欠如は、おそらく、細胞接着を補助し、細胞シグナル伝達およびプロセス、ならびに遊走に影響を与えることが知られている、コラーゲンまたはフィブロネクチンなどの細胞外タンパク質の欠如によるものである。抗体は、毒性であるとは予想されず、したがって、毒性成分はない。したがって、細胞は遊走し、フィラミンＡ抗体によって影響を受けない。図２を参照のこと。
フィブロネクチンおよびコラーゲン被覆ウェル内では、細胞遊走は、より低濃度の抗体（すなわち、１μｇ／ｍＬ対２０μｇ／ｍＬ）で最も少ない。
コラーゲン被覆ウェル中のマウス抗体は、判定時点で大きな差異をもたらさなかった。しかしながら、ヒトキメラ抗体は、コラーゲン被覆ウェルにおける細胞運動性に対する阻害効果を示した。図１および図２を参照のこと。
フィブロネクチンについて、マウスおよびヒトキメラ抗体の両方を用いた細胞運動の減少が、より低い濃度（１μｇ／ｍＬ）で存在する。しかしながら、ヒトキメラ抗体は、マウス抗体よりも実質的に低いレベルの細胞運動性をもたらすと見ることができる。実際に、ヒトキメラ抗体は、マウス抗体と比較して、細胞の運動性の阻害においてほぼ１００％の差異、すなわち、マウス抗体については１９１．３４ＲＦＵ、ヒトキメラ抗体については１０６．２６ＲＦＵを示した。図１および図２を参照のこと。
１検査当たり２点のみの場合、コラーゲンまたはフィブロネクチンによって増強された細胞拡大および運動性に対するモノクローナル抗体の効果を示す傾向が見られる。
図２に見られる全体的な傾向は、ヒトキメラ抗フィラミンＡ抗体が、マウスフィラミンＡ抗体と比較して優れた結果をもたらすことである。
１μｇ／ｍＬ濃度では、ヒトキメラｍＡｂは、コラーゲンとフィブロネクチン処理ウェルの両方で細胞遊走の減少をもたらした。これは、コラーゲン処理ウェルにおける細胞遊走の減少につながらず、特定の終点読取りでのヒトキメラｍＡｂと比較して、フィブロネクチン処理ウェルにおける低減の喪失につながる、マウスｍＡｂとは対照的である。
より高い抗体濃度における効果の欠如の原因は不明であるが、価数相互作用によって説明し得る。より低い抗体濃度で、単一の抗体分子が、細胞表面またはプレート表面で二つのフィラミンＡ分子を架橋し、結合することができる可能性がより高い。より高い抗体濃度で、全ての結合部位を、１個の抗体当たり一つのフィラミンＡ結合のみを有する別個の抗体によって取り込んでもよく、そのため架橋結合は生じない。したがって、架橋結合は、フィラミンＡ運動機能に干渉し得る。これは、投与の最適条件を示唆する。
実施例４：免疫蛍光（ＩＦ）アッセイ
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞株を用いた免疫蛍光アッセイを使用して、フィラミンＡ ｍＡｂの特徴決定を行った。これは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＨＯ１４０２ ｍＡｂの選択をもたらしたマウスを免疫化する抗原調製物を生成する際に利用する細胞株である。比較のため、ＡＨＯ１４０２ ｍＡｂおよび別の市販のｍＡｂであるＴＩ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ１６８０－Ｃ）を同時にアッセイした。ＴＩ１０およびＡＨＯ１４０２ ｍＡｂが、細胞上の異なる染色パターンをもたらし、これが、異なる形態のフィラミンＡタンパク質を認識することを示していることが、既にしめされた（Ａｌｐｅｒら、２００９年）。
本開示のマウスとヒトキメラ抗体の両方は、ｐ２８０またはクローン２０９＃１３としても知られる、市販のＡＨＯ１４０２で観察したものと類似する点状染色パターンをもたらした。ＴＩ１０の染色パターンは異なり、細胞質の一般的な染色を明らかにした。この結果に基づき、マウスｍＡｂおよびヒトキメラｍＡｂの結合は、ＡＨＯ１４０２ ｍＡｂの結合と類似したと結論付けた。
免疫蛍光アッセイで利用し一次抗体は、以下の通りであった：
抗フィラミンＡ、クローンＴＩ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｐ／ｎ ＭＡＢ１６８０－Ｃ）
抗フィラミンＡ、クローン２０９＃１３（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ｐ／ｎ ＡＨＯ１４０２）
抗フィラミンＡ、マウスｍＡｂ
抗フィラミンＡ、ヒトキメラｍＡｂ
抗ベータアクチン、ウサギポリクローナル（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ｐ／ｎ ６００－４０１－８８６Ｓ）。
免疫蛍光染色の二つの主要な方法を利用した。第一の方法は、Ａｌｐｅｒら、２００９年において記載される、 固定剤としてのメタノールおよび透過化剤として０．２％トリトンを用いた単一染色または二重染色を含む。第二の方法は、固定剤として２％パラホルムアルデヒドおよび透過化剤として０．２％トリトンを用いた二重染色技術を利用する。
一次抗体を、濃度１．２５ｍｃｇ／ｍｌで、室温で１時間、固定および透過処理した細胞と共にインキュベートした。一つまたは複数の洗浄工程後、二次抗体を、室温で１時間、細胞とインキュベートした。対応する濃度を使用したアッセイで利用した二次抗体は、以下の通りである：
１．２５μｇ／ｍｌ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（ロバ） ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８
５．０μｇ／ｍＬ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（ロバ）フルオレセイン
１．２５μｇ／ｍｌ Ｆ（ａｂ’）２ 抗ウサギＩｇＧ［Ｈ＆Ｌ］（ロバ）ローダミン。
メタノールおよびトリトン固定／透過技術を用いた第一の方法を利用することは、細胞の完全性を有意に損ない、ＤＡＰＩ染色を核から漏出させる、図３～１８を参照のこと。第一の方法を利用することにより、Ａｌｐｅｒら、２００９年によって記載される染色パターンと一致する、クローンＴＩ１０（図３、１１、および１２）ならびにＡＨＯ１４０２（図４、１３、および１４）における点状染色パターンが明らかになる。
同じ方法を使用しながら、マウス（図５、１５、および１６）およびヒトキメラ（図６、１７、および１８）モノクローナル抗体は、前述の抗体に見られる点状染色パターンを再現した。
したがって、マウスｍＡｂおよび開発したヒトキメラｍＡｂは、前述のＡＨＯ１４０２抗体と類似の形態のフィラミンＡに結合するように思われる。
ベータ－アクチン染色（図７）は、二次抗体単独によって生成されるバックグラウンド蛍光と異なるとは思えず、図８～１０を参照のこと。
パラホルムアルデヒドおよびトリトン固定／透過技術を用いた第二の方法を利用することは、第一の方法によって観察されるＤＡＰＩ漏出およびそうでなければ再現された染色パターンをもたらさず、図１９～２７を参照のこと。
実施例５：本開示の抗体のさらなる特徴決定
本開示の抗体を、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、および生検組織試料（例えば、腫瘍試料、血液、または血液由来画分、尿など）上の抗体を利用する他の診断方法を含む診断方法において、疾患の診断において利用される能力について評価する。
本開示の抗体は、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロッティング技術、細胞染色（例えば、免疫蛍光、フローサイトメトリー）、免疫組織化学での抗体の特徴決定におけるさらなる解析の対象にする。細胞ベースのアッセイは、細胞運動、細胞増殖、アポトーシス、および様々な細胞シグナル伝達アッセイに対する効果の評価を含む。
本開示は、運動アッセイにさらに利用する多数の細胞タイプを提供する。本開示の抗体の特徴決定は、細胞外基質に見出され得る様々なタンパク質付加物用いた、または用いない３Ｄ ＭＡＴＲＩＧＥＬアッセイにおける運動性の解析を含む。コラーゲンおよびフィブロネクチンに加えて、これらには、とりわけ、フィラミンＡ、プラスミン、ラミニン、ケラチン、エラスチン、プロテオグリカン、コンドロイチン、インテグリンなどの分子を含むが、これらに限定されない。追加の分子は、プロテアーゼ、ならびにとりわけ、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、キモトリプシン、マトリクスメタロプロテイナーゼなどの他の因子を含み得る。
加えて、さらなるアッセイを、追加の細胞株および組織、抗体滴定、抗体誘導体（例えば、抗体と薬物の結合体、ｓｃＦｖ、および他の抗体フォーマット）を用いた細胞運動性アッセイとの関連で行う。
実施例６．Ｂ４１１ｖ．シェルフ試薬を用いて行った追加研究
追加の細胞アッセイを、Ｂ４１１抗体ならびに乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＳＫＢＲ３を使用して行った。具体的には、フィラミンＡ抗体Ｂ４１１を、三重被覆９６ウェルプレート（Ｐｌａｔｙｐｕｓ ＃ ＣＭＡＴＲ１．１０１）を使用したＯＲＩＳ（商標）細胞遊走アッセイにおいて評価した。細胞を、約２５，０００または５０，０００細胞／ウェルで播種した。ＳＫＢＲ３細胞の場合、ＭｃＣｏｙ’ｓにおいて、細胞を３７℃、ＣＯ２でＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の場合、１０％のＦＢＳを含有するＬ－１５において、細胞をＣＯ２なしで一晩インキュベートした。細胞増殖および遊走ゾーンを覆うストッパーを、ＯＲＩＳ（商標）ストッパーツールを使用して取り除き、成長培地を取り除き、ウェルを無菌ＰＢＳ１００マイクロリットルでやさしく洗浄した。染色工程が、遊走なしの対照としての役目を果たすまで、参照ウェル内にストッパーを定位置に置いた。洗浄後、特定の処理を含有する新鮮培養培地の体積１００マイクロリットルを各ウェルに加えた。次いで、細胞を一晩インキュベートさせた。インキュベーション期間の終了時に、細胞を以下の通り蛍光染色した：
・ 残りの培地をウェルから慎重に取り出し、ＰＢＳ１００μＬで洗浄する。ＰＢＳを除去する。
・ 各ウェルに１×カルセインＡＭ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、６５－０８５３－７８）溶液１００μＬを加える。
・ プレートを３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、蛍光を、検出マスクを定位置に置いたマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
・ カルセインＡＭを慎重に除去し、ＰＢＳ１００μＬで洗浄する。ＰＢＳを除去する。
・ ヨウ化プロピジウム（死細胞検出用）およびヘキスト３３３４２（アポトーシス細胞検出用）を含有するＰＢＳ１００μＬ（それぞれ、１：３，０００および１：４，０００希釈）を各ウェルに加える。室温で５～１０分間インキュベートする。
・ 代表的なウェルの蛍光画像（青色、緑色、赤色のチャネル）を５×倍率で撮影する。
図３２に見られるように、抗フィラミンＡ Ｂ４１１抗体で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞上のヘキスト３３３４２染色（青色）の増加が存在し、これは、アポトーシス様表現型を有する細胞の増加を示唆する（ヘキスト３３３４２染色は、正常細胞中のクロマチンよりもアポトーシス細胞中に凝縮されたクロマチンを明るく染色する）。さらに、カルセインＡＭ染色（緑色）には、非常に強く染色された細胞および全く染色されていない細胞を伴うものがあり、抗フィラミンＡ抗体処理での代謝活性の有意な変化を示唆する。死細胞を、ヨウ化プロピジウム（赤色）による核の染色によって同定する。
実施例７．フィラミンＡ特異的細胞内抗体
フィラミンＡ抗原に特異的な細胞内抗体を作製し、細胞内抗体の発現および機能性を試験するための実験を行う。細胞内抗体コンストラクトは、細胞株（例えば、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＥＫ３９２、ＨｅＬａ、または他の細胞株）において一過性に発現する。遺伝子導入した細胞を評価して、ウェスタンブロッティングを介して抗体（例えば、ｓｃＦｖ）の発現を確認する。例えば、タグ付けした細胞内抗体について、ｓｃＦｖ発現を、タグを介して（例えば、抗Ｈｉｓまたは抗ＧＳＴタグ抗体を使用して）または抗ｓｃＦｖ抗体もしくは他の抗細胞内抗体コンストラクト抗体を介して確認してもよい。あるいはまたは加えて、免疫蛍光アッセイを使用して、ｓｃＦｖ発現を確認する（例えば、抗Ｈｉｓタグ、抗ＧＳＴ、抗ｓｃＦｖ、または他の細胞内抗体コンストラクト抗体での染色および検出による）。
細胞表現および代謝の差を、遺伝子導入した細胞においてモニターし、遺伝子導入していない細胞と比較するか、または抗フィラミンＡ抗体断片（例えば、抗体成分を有さないＧＳＴ融合パートナー）を有さないベクターなどの無関係なコンストラクトで遺伝子導入した細胞と比較する。細胞表現および代謝の評価は、例えば、非限定的に、細胞内抗体、融合パートナー、および／または細胞マーカーの発現をモニターするか、または指示する細胞形態、増殖速度、接着、遊走、生／死細胞数および比、代謝速度、ウェスタンブロットおよび／または免疫組織化学、ならびにフローサイトメトリーを含む。
細胞内抗体発現、機能性、および有効性も、インビボで試験する。例えば、免疫不全マウスに癌細胞を（例えば、腹腔内、皮下、または同所性に）接種する、癌の異種移植片モデルを利用してもよい。腫瘍の成長をモニターし、腫瘍の発生の前または後に、潜在的な治療細胞内抗体または診断細胞内抗体を投与する。例えば、乳癌の同所性モデルでは、抗フィラミンＡ抗原細胞内抗体の投与または細胞内発現の前、または同時に、癌細胞を、免疫不全マウスの鼠径部乳腺脂肪パッドに移植する。例えば、抗フィラミンＡ細胞内抗体コンストラクトを、プラスミド、ウイルスベースまたは非ウイルスベースの送達ビークルを介して細胞内発現のため乳癌細胞に送達してもよい。一部の実施形態では、抗フィラミンＡ細胞内抗体コンストラクトを、細胞膜透過ペプチドを介して乳癌細胞にタンパク質として送達してもよい。ベクター対照、または無関係な細胞内抗体を投与した対照動物と比較して、抗フィラミンＡ細胞内抗体の存在の腫瘍成長に対する効果を測定する。研究の結果は、抗フィラミンＡ細胞内抗体の投与および細胞内発現が、癌の異種移植片モデルにおいて、腫瘍体積を低減するか、または腫瘍の成長を遅らせるか、または腫瘍の発生を妨げることを示す。
実施例８．細胞生存率アッセイ
抗体Ｂ４１１とのインキュベーション後の細胞生存を評価するための試験を行った。ＤＵ１４５（ヒト前立腺癌細胞株）およびＨＥＫ２９３Ａ（ヒト胚性腎細胞株）細胞を、９６ウェルプレート（１０４細胞／ウェル）に播種し、３７℃で４時間インキュベートした。Ｂ４１１（エンドトキシン除去、１．２ＥＵ／ｍＬ）１μｇまたは１０μｇを、ウェルに加え、２４時間または４８時間インキュベートした。両方の細胞タイプについての未処理群も含めた。ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｚＥＺ（商標）細胞生存アッセイキットを使用して、細胞生存を検出し、ＯＤ４１２をＯＤ６５０を参照して読み取ることによって結果を決定した。
研究の結果を、図３３において提供し、Ｂ４１１が、ＤＵ１４５（癌）細胞増殖を阻害したことを示した。用量１μｇで、Ｂ４１１は、ＤＵ１４５の無処理群と比較したとき、２４時間でＤＵ１４５細胞成長の増殖に対する有意な阻害効果を示した（＊ｐ＜０．０１）が、４８時間での統計上有意な効果はなかった。Ｂ４１１の用量１μｇは、いずれの時点でもＨＥＫ２９３Ａ細胞株に対する効果を有さなかった（２４時間または４８時間）。用量１０μｇで、Ｂ４１１は、ＤＵ１４５の無処理群と比較したとき、２４時間および４８時間の両方の時点でＤＵ１４５の増殖に対する有意な阻害効果を示した。ＨＥＫ２９３細胞増殖の阻害も、１０μｇで観察した。
２４時間および４８時間におけるＤＵ１４５のＢ４１１による阻害の比率は、それぞれ、７．８％および１４．６％であり、両方とも有意であった（＊ｐ＜０．０１）。２４時間および４８時間におけるＨＥＫ２９３の阻害の比率は、９．３％および１７．７％であり、また有意であった（＊ｐ＜０．０１）。
実施例９．フィラミンＡ細胞内抗体は、癌細胞におけるＦＬＮＡタンパク質レベルを低減し、癌細胞増殖を低減する
単一ベクターにおいて二つの遺伝子を同時発現させるための二色性レンチウイルスベクターを使用して、細胞内抗体を作製した。ベクターを、ＬＶ－ＥＦ－ｉｎｔｒａｂｏｄｙＦＬＮＡ／Ｈｉｓｔａｇ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰと指定した。ベクターを細胞に送達するとき、第一の遺伝子産物である細胞内抗体ＦＬＮＡを、ＥＦプロモーターによって駆動させ、ＩＲＥＳは、第二の遺伝子産物であるＧＦＰの翻訳を開始する。種々の癌細胞タイプに対する例示的なフィラミンＡ細胞内抗体の効果を評価するための研究を行った。ＧＦＰレポーター遺伝子を含む二つのレンチウイルスベクターＦＬＮＡ細胞内抗体コンストラクトを試験した：ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰは、ＶＨ－ＶＬ配向でＢ４１１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰは、逆の配向であるＶＬ－ＶＨでＢ４１１の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。ＧＦＰ発現レンチウイルス対照ベクター（ＬＶ－ＧＦＰ）も、研究に使用した。
肺癌
Ａ５４９（肺癌細胞株）細胞を、リポフェクタミン３０００を使用して、ＤＮＡ（ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、またはＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ）１μｇで遺伝子導入するか、または偽遺伝子導入した。遺伝子導入の７２時間後に細胞を回収し、生細胞解析および死細胞解析のため、それそれ、カルセイン－ディープ－レッドまたはＥｔｈＤ－１で染色した。細胞生存率をフローサイトメトリーにより評価した。
細胞生存率アッセイの結果を、図３４～３８に提供する。図３４Ａ～Ｅは、遺伝子導入の７２時間後に遺伝子導入した細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図３４Ａは、偽遺伝子導入した細胞においてＧＦＰ発現を示さない。図３４Ｂ、Ｃ、およびＤは、ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞におけるＧＦＰを示す。図３４Ｅは、図３４Ａ～Ｄにおけるヒストグラムの上書きである。
図３５Ａ～Ｆは、遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰゲート化細胞の生細胞解析を示す。図３５ＡおよびＢは、無染色対照（図３５Ａ）および陽性対照細胞（カルセインディープレッド（ＣＤＲ）生細胞染色）（図３５Ｂ）を示す。図３５Ｃ、Ｄ、およびＥは、ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、またはＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰでの遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰ陽性細胞におけるＣＤＲ陽性染色を示す。図３５Ｆは、図３５Ｃ、Ｄ、およびＥの生細胞解析のヒストグラムの上書きである。図３６は、ＧＦＰ陽性細胞集団におけるＣＤＲ陽性（生）細胞の総数を示す。ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰとＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰの両方が、生細胞数を有意に低減した（ｐ＜０．０００１）。
図３７Ａ～Ｅは、遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰゲート化細胞の死細胞解析を示す。図３７ＡおよびＢは、無染色対照（図３７Ａ）および陽性対照細胞（ＥｔｈＤ－１死細胞染色）（図３７Ｂ）を示す。図３７Ｃ、Ｄ、およびＥは、ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、またはＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰでの遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰ陽性細胞におけるＥｔｈＤ－１染色を示す。図３８Ａは、図３７Ｃ、Ｄ、およびＥの死細胞解析のヒストグラムの上書きである。図３８Ｂは、ＧＦＰ陽性細胞集団におけるＥｔｈＤ－１陽性（死）細胞の総数を示す。ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰとＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰの両方が、ＬＶ対照と比較して死細胞の数を有意に増加させた（それぞれ、ｐ＜０．００５およびｐ＜０．０００１）。ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰは、ＬＶ対照とＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰの両方と比較して死細胞の数を有意に増加させた（ｐ＜０．０００１）。
細胞増殖アッセイについて、ＤＮＡ２．５μｇを、リポフェクタミン３０００を使用した６ウェルプレートの各ウェルのＡ５４９細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入の７２時間後に細胞を回収し、ＥｄＵ試薬と共に２時間インキュベートした。ＥｄＵ試薬と接触していない細胞は、陰性対照として役立った。増殖をフローサイトメトリーにより評価した。
増殖アッセイの結果を、図３９に提供する。図３９Ａは、無染色対照である。図３９Ｂは、ベクター対照で遺伝子導入した細胞の増殖を示す。図３９Ｃおよび３９Ｄは、それぞれ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰおよびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞の増殖を示す。図３９Ｅは、各群におけるパーセントＥｄＵ陽性（増殖）細胞を示すグラフである。ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰは、ＬＶ－ＧＦＰと比較してＡ５４９細胞の増殖を有意に低減した（ｐ＜０．０００１）。
顕微鏡研究のため、ＤＮＡ２．５μｇを、リポフェクタミン３０００を使用して６ウェルプレートの各ウェルのＡ５４９細胞に遺伝子導入し、細胞を、共焦点顕微鏡を使用して遺伝子導入の２４時間後に撮像した。図４０は、結果を提供する。図４０Ａ１、Ｂ１、およびＣ１は、それぞれ、ＬＶ－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞の蛍光画像を示す。図４０Ａ２、Ｂ２、およびＣ２は、それぞれ、ＬＶ－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞の明視野画像を示す。図４０Ｄ１および４０Ｄ２は、それぞれ、図４０Ｃ１および４０Ｃ２における選択した視野（白色の三角形）の拡大視野を示す。図４０Ｄ３は、図４０Ｄ１および４０Ｄ２の混合視野である。白色の矢印は、Ａ５４９細胞におけるＦＬＮＡのＧＦＰとの共発現を示唆する。
さらに、Ａ５４９細胞におけるＦＬＮＡ細胞内抗体処理の効果を非癌ＭＲＣ－５細胞と比較するための試験をさらに行った。ＤＮＡ２．５μｇを、リポフェクタミン３０００を使用して６ウェルプレートの各ウェルのＡ５４９細胞に遺伝子導入し、細胞を、共焦点顕微鏡を使用して遺伝子導入の７２時間後に撮像した。図４１は、結果を提供する。ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで処理したＡ５４９細胞（図４１Ａ２）において目に見える細胞死があったが、対照ＬＶ－ＧＦＰで処理したＡ５４９細胞においてはなかった（図４１Ａ１）。対照的に、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで処理したＭＲＣ－５細胞において目に見える細胞死はなかった（図４１Ｂ２）。研究の結果は、ＦＬＮＡ細胞内抗体処置によって誘発された細胞死が、癌細胞に特異的であることを示す。
神経膠芽腫
Ｕ８７ＭＧ（神経膠芽腫細胞株）細胞を、リポフェクタミン３０００を使用して、１２ウェルプレートにおいてＤＮＡ（ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、またはＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ）１μｇで遺伝子導入するか、または偽遺伝子導入した。遺伝子導入の７２時間後に細胞を回収し、生細胞解析および死細胞解析のため、それそれ、カルセイン－ディープ－レッドまたはＥｔｈＤ－１で染色した。細胞生存率をフローサイトメトリーにより評価した。
細胞生存率アッセイの結果を、図４２～４４に提供する。図４２において、左列は、ＬＶ－ＧＦＰ（上部）、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ（中央）、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ（下部）で遺伝子導入した細胞における生細胞数を示す。中央の列は、ＬＶ－ＧＦＰ（上部）、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ（中央）、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ（下部）で遺伝子導入した細胞における死細胞数を示す。右の列は、ＬＶ－ＧＦＰ（上部）、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ（中央）、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ（下部）で遺伝子導入した細胞における生／死細胞数（カラム１および２の混合）を示す。この研究は、ＦＬＮＡ細胞内抗体でのＵ８７ＭＧ細胞の遺伝子導入の際の生細胞から死細胞へのシフトを示す。
図４３Ａおよび４３Ｂは、遺伝子導入の７２時間後の生細胞解析を示す。図４３Ａは、ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞の生細胞解析染色のヒストグラム上書きである。図４３Ｂは、ＣＤＲ陽性（生）細胞の総数を示す。ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰとＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰの両方が、生細胞数を有意に低減した（ｐ＜０．０００１）。
図４４Ａおよび４４Ｂは、遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰゲート化細胞の死細胞解析を示す。図４４Ａは、ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞の死細胞解析染色のヒストグラム上書きである。図４４Ｂは、ＥｔｈＤ－１陽性（死）細胞の総数を示す。ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰとＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰの両方が、ＬＶ対照と比較して死細胞の数を有意に増加させた（それぞれ、ｐ＜０．００５およびｐ＜０．０００１）。
神経膠芽腫細胞株と非癌ＨＢＥＣ－５ｉ細胞の間でのＦＬＮＡ細胞内抗体処理の効果を比較するための試験を行った。結果を、図４５に提供する。遺伝子導入の７２時間後、ＦＬＮＡ細胞内抗体処理は、ＬＮ２２９細胞（神経膠芽腫細胞株；図４５Ａ）において細胞死をもたらしたが、ＨＢＥＣ－５ｉ細胞（非癌細胞株；図４５Ｂ）ではもたらさなかった。研究の結果は、ＦＬＮＡ細胞内抗体処置によって誘発された細胞死が、癌細胞に特異的であることを示した。
顕微鏡研究のため、ＤＮＡ２．５μｇを、リポフェクタミン３０００を使用して６ウェルプレートの各ウェルのＵ８７ＭＧ細胞に遺伝子導入し、細胞を、共焦点顕微鏡を使用して遺伝子導入の２４および７２時間後に撮像した。図４６および図４７は、結果を提供する。図４６Ａ１、Ｂ１、およびＣ１は、遺伝子導入の２４時間後の、それぞれ、ＬＶ－ＧＦＰで遺伝子導入した、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰで遺伝子導入した、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入したＵ８７ＭＧ細胞の蛍光画像を示す。図４６Ａ２、Ｂ２、およびＣ２は、遺伝子導入の２４時間後の、それぞれ、ＬＶ－ＧＦＰで遺伝子導入した、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰで遺伝子導入した、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入したＵ８７ＭＧ細胞の明視野画像を示す。図４７Ａおよび４７Ｂは、遺伝子導入の７２時間後のＬＶ－ＧＦＰで遺伝子導入したＵ８７ＭＧ細胞の蛍光および明視野画像を示す。図４７Ｃおよび４７Ｄは、遺伝子導入の７２時間後のＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰで遺伝子導入したＵ８７ＭＧ細胞の蛍光および明視野画像を示し、図４７Ｅおよび４７Ｆは、遺伝子導入の７２時間後のＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入したＵ８７ＭＧ細胞の蛍光および明視野画像を示す。同様に、図４８Ａ～Ｆは、７２時間での、ＬＶ－ＧＦＰ（図４８Ａ、４８Ｂ）、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰで遺伝子導入した（図４８Ｃ、４８Ｄ）、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入した（図４８Ｅ、４８Ｆ）細胞の明視野画像を示す。画像は、７２時間での、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰおよびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ処理が、細胞接着の喪失およびＵ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞の死をもたらしたことが示される。
免疫細胞化学（ＩＣＣ）によってＦＬＮＡ細胞内抗体で処理したＵ８７ＭＧ細胞におけるＦＬＮＡ。細胞をチャンバースライドに播種し、遺伝子導入の７２時間後に４％ホルムアルデヒドで固定した。次いで、ＰＢＳ中の０．５％のトリトンＸ－１００を使用して細胞を透過させた。ＰＢＳ中の５％ＢＳＡを使用して、室温で１時間、ブロッキングを行った。抗フィラミン一次抗体インキュベーションを、４℃で一晩行い、二次抗体インキュベーションを、室温で１時間行った。細胞も核ＤＡＰＩ染色で染色した。結果を、図４９に提供する。ＦＬＮＡ細胞内抗体で処理したＵ８７ＭＧ細胞は、遺伝子導入の７２時間後にＦＬＮＡタンパク質の破損を示す。
図５０は、細胞内抗体上のＨｉｓタグおよびＧＦＰについての免疫細胞化学（ＩＣＣ）染色による、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿２細胞内抗体で遺伝子導入したＵ８７ＭＧ細胞におけるＦＬＮＡ ｓｃＦｖの解析を示す。図５０の最上の行は、抗Ｈｉｓ（第一パネル）、抗ＧＦＰ（第二パネル）、ＤＡＰＩ染色（第三パネル）、およびＦＬＮＡ細胞内抗体とＧＦＰの共発現を示す混合画像を示す。図５０の下部の行は、ＬＶ－ＧＦＰ対照を示す。データは、ＦＬＮＡ細胞内抗体が、ＧＦＰと共発現していることを示す（白色の矢印を参照）。
前立腺癌
細胞生存率アッセイも、ＦＬＮＡ細胞内抗体で処理したＤＵ１４５（前立腺癌細胞株）細胞でも行った。ＤＵ１４５細胞を、リポフェクタミン３０００を使用して、ＤＮＡ（ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、またはＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ）０．５μｇで遺伝子導入するか、または偽遺伝子導入した。遺伝子導入の７２時間後に細胞を回収し、生細胞解析および死細胞解析のため、それそれ、カルセイン－ディープ－レッドまたはＥｔｈＤ－１で染色した。細胞生存率をフローサイトメトリーにより評価した。
細胞生存率アッセイの結果を、図５１～５５に提供する。図５１Ａ～Ｅは、遺伝子導入の７２時間後に遺伝子導入した細胞におけるＧＦＰ発現を示す。図５１Ａは、偽遺伝子導入した細胞においてＧＦＰ発現を示さない。図５１Ｂ、Ｃ、およびＤは、ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入した細胞におけるＧＦＰを示す。図５１Ｅは、図５１Ａ～Ｄにおけるヒストグラムの上書きである。
図５２Ａ～Ｃは、遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰゲート化ＤＵ１４５細胞の生細胞解析を示す。ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、またはＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰでの遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰ陽性細胞におけるＣＤＲ陽性染色を、それぞれ、図５２Ａ、５２Ｂ、および５２Ｃに示す。図５３Ａは、図５２Ａ～Ｃの生細胞解析のヒストグラムの上書きである。図５３Ｂは、ＧＦＰ陽性細胞集団におけるＣＤＲ陽性（生）細胞の総数を示す。ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰとＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰの両方が、ＬＶ－ＧＦＰ遺伝子導入と比較して生ＤＵ１４５細胞の数を有意に低減した（それぞれ、ｐ＜０．０００５およびｐ＜０．０００１）。
図５４Ａ～Ｃは、遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰゲート化ＤＵ１４５細胞の死細胞解析を示す。ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、またはＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰでの遺伝子導入の７２時間後のＥｔｈＤ－１陽性染色を、それぞれ、図５４Ａ、５４Ｂ、および５４Ｃに示す。図５５Ａは、図５４Ａ～Ｃの死細胞解析のヒストグラムの上書きである。図５５Ｂは、ＧＦＰ陽性細胞集団におけるＥｔｈＤ－１陽性（死）細胞の総数を示す。ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰとＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰの両方が、ＬＶ対照と比較して死細胞の数を有意に増加させた（それぞれ、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０００１）。
乳癌
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳癌細胞株）細胞を、リポフェクタミン３０００を使用して、ＤＮＡ（ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、またはＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰ）２．５μｇで遺伝子導入するか、または偽遺伝子導入した。細胞増殖および顕微鏡研究のため、遺伝子導入の７２時間後に、細胞を回収した。細胞増殖アッセイのため、遺伝子導入の７２時間後に、細胞を回収し、ＥｄＵ試薬と共に２時間インキュベートした。ＥｄＵ試薬と接触していない細胞は、陰性対照として役立った。増殖をフローサイトメトリーにより評価した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰ発現を、図５６に提供する。図５６Ａは、偽遺伝子導入である。図５６Ｂは、ＬＶ－ＧＦＰ対照で遺伝子導入したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の増殖を示す。図５６Ｃおよび５６Ｄは、それぞれ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰおよびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の増殖を示す。図５６Ｅは、図５６Ａ～Ｄにおけるデータのヒストグラムの上書きである。図５７は、遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰゲート化細胞におけるＥｄＵ染色により測定した増殖を示す。図５７Ａは、無染色対照である。図５７Ｂ、５７Ｃ、および５７Ｄは、それぞれ、ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、またはＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰでの遺伝子導入の７２時間後のＧＦＰ＋細胞におけるＥｄＵ染色を示す。図５７Ｅは、増殖研究のグラフィカル表現である。ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰとＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰの両方が、ＬＶ－ＧＦＰと比較してＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の増殖を有意に低減した（それぞれ、ｐ＜ ０．００１およびｐ＜０．０００１）。
顕微鏡研究について、共焦点顕微鏡を使用して、遺伝子導入の２４時間後に細胞を撮像した。図５８は、結果を提供する。ＧＦＰは、全ての三つの群すべてについて２４時間でＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において発現した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞内抗体処理後のＦＬＮＡタンパク質レベルを、ウェスタンブロットにより評価した。細胞を遺伝子導入の４８時間後に溶解し、１試料当たりタンパク質３５μｇを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。一次抗フィラミンＡ抗体を、１：５００に希釈し、抗ＧＡＰＤＨ抗体を、１：３０００に希釈した。フィラミンＡ検出のための二次抗体は、１：１０００に希釈したＨＲＰ結合ロバ抗マウスであった。ＧＡＰＤＨについての二次抗体は、１：１０００に希釈した、ＨＲＰ結合ヤギ抗ラットであった。研究の結果を、図５９に提供する。ＦＬＮＡ細胞内抗体での処理は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における減少したＦＬＮＡタンパク質レベルをもたらした。
実施例１０．毒性研究
正常なヒト星状細胞（Ｎ７８０５１００）を２４ウェルプレートに播種し、ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、またはＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰで遺伝子導入するか、または偽遺伝子導入した。溶解対照群および陰性対照群も含んだ。遺伝子導入の２４時間後、フローサイトメトリーのため細胞を回収して、遺伝子導入効率を解析した。遺伝子導入の７２時間後、異なるウェルからの細胞を使用して、ＬＤＨ細胞障害性アッセイを行った。
研究の結果を、図６０～６２に提供する。図６０Ａ～Ｅは、遺伝子導入の２４時間後の正常なヒト星状細胞におけるＧＦＰ発現を確認する。図６１Ａ～Ｃは、遺伝子導入の２４時間後の正常なヒト星状細胞の顕微鏡的解析を提供する。ＧＦＰ発現を、全三つの群：ＬＶ－ＧＦＰ、ＬＶ－ＦＬＮＡ＿１－ＧＦＰ、およびＬＶ－ＦＬＮＡ＿２－ＧＦＰにおいて観察した。図６２は、ＬＤＨ細胞障害性アッセイの結果を提供する。パーセント細胞傷害を、市販のキットプロトコール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、８８９５４）を使用して計算した。正常細胞では、％細胞傷害性は低く、群間での％細胞傷害性に差異はなかった。
実施例１１．癌細胞上でのＢ４１１表面染色
いくつかの異なる細胞タイプでＢ４１１表面染色を行った。細胞を、１ウェル当たり５０万個～１００万個の細胞の濃度で播種し、一晩インキュベートした。次いで、細胞をウェルから持ち上げ、洗浄し、氷上で１時間、一次抗体２μｇを含むフローサイトメトリー培地中に再懸濁した。細胞を洗浄し、二次抗体（５μｇ／ｍｌ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、フローサイトメトリーにより解析した。
図６３は、ＳＫＮＡＳ（ヒトニューロブラストーマ）細胞株の結果を提供する。左のパネルは、Ｂ４１１についての陽性染色、およびアイソタイプ対照についての陰性染色、一次抗体対照なし、ならびに無染色細胞を示すヒストグラムである。右の二つのパネルは、各群における陽性細胞の％（上部）および各群における陽性細胞の総数（下部）を示す。
図６４は、ＳＫＢＲ３（乳腺癌）細胞株の結果を提供する。左のパネルは、Ｂ４１１についてのいくつかの陽性染色、ならびに一次抗体対照なし、および無染色細胞についての陰性染色を示すヒストグラムである。右の二つのパネルは、各群における陽性細胞の％（上部）および各群における陽性細胞の総数（下部）を示す。
図６５は、ＨｅＬａ細胞（卵巣癌）の結果を提供する。左のパネルは、Ｂ４１１についての陽性染色、ならびに一次抗体対照なし、および無染色細胞についての陰性染色を示すヒストグラムである。右の二つのパネルは、各群における陽性細胞の％（上部）および各群における陽性細胞の総数（下部）を示す。
図６６は、ＳＫＯＶ３細胞株（卵巣癌）の結果を提供する。左のパネルは、Ｂ４１１についての陽性染色、ならびに一次抗体対照なし、および無染色細胞についての陰性染色を示すヒストグラムである。右の二つのパネルは、各群における陽性細胞の％（上部）および各群における陽性細胞の総数（下部）を示す。
研究の結果は、Ｂ４１１が、様々な癌細胞株において表面フィラミンＡを検出することができることを示した。ＳＫＢＲ３細胞株について、Ｂ４１１の陽性染色が存在したが、試験した他の細胞株と比較して弱かった。Ｂ４１１についての高い陽性染色を、ＳＫＮＡＳ、ＳＫＯＶ３、およびＨｅＬａ細胞株で観察した。
実施例１２．貪食
抗体Ｂ４１１が、細胞によって貪食されるかどうかを決定するための実験を行った。２５０，０００個の細胞／ウェルを播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。１２μｇ／ｍＬ抗体を、製造業者のプロトコルに従い、Ｚｅｎｏｎ ｐＨｒｏｄｏキット（ヒト緑色）を用いて、暗所で５分間室温で標識した。次いで、播種細胞を標識抗体と共に、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。次いで、細胞を手動擦過によりはがし、フローサイトメトリーによる分析の前に洗浄した。
図６７～６８は、結果を提供する。パーセント貪食陽性ＳＫＢＲ３細胞（乳腺癌）およびＨＥＫ細胞（非癌）を、図６７に示される。図６８は、貪食についての陽性細胞の総数を示す。Ｂ４１１の貪食を、抗体と共にインキュベートしたＳＫＢＲ３細胞（乳腺癌）において検出した（図６７、左パネル）。より多くのＳＫＢＲ３細胞が、ＨＥＫ細胞よりもＢ４１１について陽性であり（図６８）、ＳＫＢＲ３細胞が、ＨＥＫ（非癌）細胞と比較して、より高いレベルのＢ４１１結合フィラミンＡの貪食を有することを示唆している。研究の結果は、本明細書において提供されるフィラミンＡ抗体の貪食を使用して、処置のための標的治療薬を送達することができることを示した。
参照による組み込み
本明細書において引用される全ての参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報、および特許出願は、全ての目的のためその全体が参照により組み込まれる。
しかしながら、本明細書において引用される任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、それらが、妥当な先行技術を構成するか、または世界の任意の国における共通の一般的な知識の一部を形成する知識または任意の形態の示唆ではなく、そのように受け取られるべきではない。

Claims (86)

  1. フィラミンＡ抗原に結合する抗体であって、
    ａ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変ドメインであって、前記軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン；および
    ｂ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む三つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインであって、前記重鎖ＣＤＲ１が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ３が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、を含む、抗体。
  2. 前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２を含み、前記重鎖可変ドメインが、配列番号７を含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記軽鎖および重鎖可変領域が、軽鎖－重鎖の配向である、請求項１または２に記載の抗体。
  4. 前記軽鎖および重鎖可変領域が、重鎖－軽鎖の配向である、請求項１または２に記載の抗体。
  5. ｃ．配列番号３を含む軽鎖定常ドメイン；および
    ｄ．配列番号１１を含む重鎖定常ドメインをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。
  6. 前記抗体がヒトキメラ抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体。
  7. 前記抗体がｓｃＦｖである、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。
  8. 前記抗体が細胞内抗体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。
  9. 前記フィラミンＡ抗原が、ＦＬＮＡ遺伝子、またはその相同体によりコードされる遺伝子産物である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
  10. 前記フィラミンＡ抗原が、およそ２８０ｋＤａの乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンＡ抗原である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
  11. 前記抗体が、乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンＡ抗原に優先的に結合することができ、前記優先結合が、非乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンＡ抗原と比較である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
  12. 前記抗体が、乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンＡ抗原に１０－７Ｍ～１０－１１Ｍの特異的親和性で結合することができる、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
  13. 前記フィラミンＡ抗原が、およそ２８０ｋＤａの乳癌細胞膜関連フィラミンＡ抗原である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
  14. 前記抗体が、乳癌細胞膜関連フィラミンＡ抗原に優先的に結合することができ、前記優先結合が、非乳癌細胞膜関連フィラミンＡ抗原と比較である、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
  15. 前記抗体が、乳癌細胞膜関連フィラミンＡ抗原に、１０－７Ｍ～１０－１１Ｍの特異的親和性で結合することができる、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体。
  16. 請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドＤＮＡ。
  17. 請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
  18. 請求項１７に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
  19. 請求項１８に記載の宿主細胞を培養すること、前記抗体を発現させること、および前記宿主細胞により発現された前記抗体を回収することを含む方法により産生される、抗体。
  20. 固相に固定される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体。
  21. 前記抗体が検出可能に標識される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体。
  22. 前記抗体が放射性核種に結合される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体。
  23. 前記抗体が化学療法剤に結合される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体。
  24. 前記抗体がタンパク質に結合される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体。
  25. 前記抗体が、細胞内フィラミンＡ抗原、細胞膜関連フィラミンＡ抗原、および／または可溶性フィラミンＡ抗原に結合する、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体。
  26. ａ．請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体；および
    ｂ．医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  27. ａ．一次抗体として請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体；および
    ｂ．前記一次抗体に結合する二次抗体であって、検出可能な標識に結合される二次抗体、を含む、癌を診断するためのキット。
  28. 前記癌が乳癌である、請求項２７に記載のキット。
  29. 請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体がフィラミンＡ抗原に結合するかどうかを、患者における癌の指標として検出する方法であって、
    ａ．前記患者から得た生物学的試料を前記抗体と接触させること；および
    ｂ．前記抗体が、前記試料中の前記フィラミンＡ抗原に結合するかどうかを検出することであって、前記抗体とフィラミンＡ抗原の間の正の結合相互作用が、癌の指標である、検出すること、を含む、方法。
  30. 前記癌が乳癌である、請求項２９に記載の方法。
  31. それを必要とする患者における癌を治療するための組成物であって、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体を含む、組成物。
  32. 前記癌が乳癌である、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記抗体が、癌細胞の抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）を誘導する、請求項３１に記載の組成物。
  34. 前記抗体が、癌細胞により貪食される、請求項３１に記載の組成物。
  35. 前記抗体が、治療剤に連結されるか、または結合される、請求項３１に記載の組成物。
  36. それを必要とするヒト患者において、フィラミンＡ抗原を発現する腫瘍細胞の成長を防ぐか、または低減するための組成物であって、抗体を含み、
    前記抗体が、
    ｉ．配列番号２を含む、軽鎖可変ドメイン；
    ｉｉ．配列番号３を含む、軽鎖定常ドメイン；
    ｉｉｉ．配列番号７を含む重鎖可変ドメイン；および
    ｉｖ．配列番号１１を含む、重鎖定常ドメインを含む、組成物。
  37. 前記癌が乳癌である、請求項３６に記載の組成物。
  38. 前記抗体が、分泌された可溶性フィラミンＡ抗原に優先的に結合する、請求項３６に記載の組成物。
  39. 前記抗体が、膜関連フィラミンＡ抗原に優先的に結合する、請求項３６に記載の組成物。
  40. 前記抗体が、細胞内フィラミンＡ抗原に優先的に結合する、請求項３６に記載の組成物。
  41. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項３６に記載の組成物。
  42. 前記抗体が、ヒトキメラ抗体である、請求項３６に記載の組成物。
  43. 前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項４２に記載の組成物。
  44. 前記抗体が、フィラミンＡに対するマウス抗体と比較して、低減した免疫原性を示し、前記患者から負の免疫応答を導かない、請求項４２または４３に記載の組成物。
  45. 前記抗体が、細胞内抗体である、請求項３６に記載の組成物。
  46. 前記抗体が、細胞内局在化のため改変されている、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗体。
  47. 細胞内に局在化しているフィラミンＡ抗原に結合する、細胞内抗体であって、
    ａ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変ドメインであって、前記軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン；および
    ｂ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む三つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインであって、前記重鎖ＣＤＲ１が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ３が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、を含む、細胞内抗体。
  48. 前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２を含み、前記重鎖可変ドメインが、配列番号７を含む、請求項４７に記載の細胞内抗体。
  49. 前記フィラミンＡ抗原が、ＦＬＮＡ遺伝子、またはその相同体によりコードされる遺伝子産物である、請求項４７または４８に記載の細胞内抗体。
  50. 前記細胞内抗体が、フィラミンＡに、１０－７Ｍ～１０－１１Ｍの特異的親和性で結合することができる、請求項４７または４８に記載の細胞内抗体。
  51. 前記細胞内抗体が、ｓｃＦｖである、請求項４７または４８に記載の細胞内抗体。
  52. 請求項４７または４８に記載の細胞内抗体をコードする、単離されたＲＮＡ。
  53. 請求項４７または４８に記載の細胞内抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドＤＮＡ。
  54. 請求項５２に記載のＲＮＡまたは請求項５３に記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
  55. 請求項５４に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
  56. 請求項４７または４８に記載の細胞内抗体および前記細胞内抗体を細胞膜を超えて転座させるためのタンパク質を含む、融合タンパク質。
  57. 請求項４７または４８に記載の細胞内抗体および前記細胞内抗体を細胞内構造に標的化するためのタンパク質を含む、融合タンパク質。
  58. 前記細胞内抗体が検出可能に標識される、請求項４７または４８に記載の単離された細胞内抗体。
  59. 前記細胞内抗体が放射性核種に結合される、請求項４７または４８に記載の単離された細胞内抗体。
  60. 前記細胞内抗体が化学療法剤に結合される、請求項４７または４８に記載の単離された細胞内抗体。
  61. 前記細胞内抗体がタンパク質に結合される、請求項４７または４８に記載の単離された細胞内抗体。
  62. 前記細胞内抗体が、細胞膜透過ペプチドもしくはタンパク質、または他の化学的部分に連結されるか、または結合される、請求項４７または４８に記載の細胞内抗体。
  63. ａ．請求項４７または４８に記載の単離された細胞内抗体；および
    ｂ．医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  64. ａ．請求項４７または４８に記載の細胞内抗体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む送達システム；および
    ｂ．医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  65. 前記送達システムが、プラスミド、ＲＮＡ、ウイルスベクター、または非ウイルス送達システムを含む、請求項６４に記載の医薬組成物。
  66. 前記プラスミドが、真核生物のプロモーターを含む細菌プラスミドである、請求項６５に記載の医薬組成物。
  67. 前記送達システムが、ＲＮＡを含む、請求項６５に記載の医薬組成物。
  68. 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターである、請求項６５に記載の医薬組成物。
  69. 前記非ウイルス送達システムが、カチオン性脂質またはポリマーを含む、請求項６５に記載の医薬組成物。
  70. 前記非ウイルス送達システムが、トランスポゾンを含む、請求項６５に記載の医薬組成物。
  71. それを必要とする患者における癌を治療するための組成物であって、請求項４７または４８に記載の単離された細胞内抗体、または請求項４７または４８に記載の細胞内抗体を発現する核酸を含む、組成物。
  72. 前記癌が乳癌である、請求項７１に記載の組成物。
  73. 請求項１～１５のいずれか１項に記載の第一の抗体および免疫細胞上で発現された抗原に結合する第二の抗体を含む、二重特異性または多重特異性抗体。
  74. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージである、請求項７３に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
  75. 前記抗原が、Ｔ細胞抗原である、請求項７３に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
  76. 前記Ｔ細胞抗原が、ＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ６９、およびＣＤ９０からなる群から選択される、請求項７５に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
  77. 請求項１～１５のいずれか１項に記載の第一の抗体およびＣＤ３に結合する第二の抗体を含む、二重特異性抗体。
  78. フィラミンＡ抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、前記フィラミンＡ抗原結合ドメインが、
    ａ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変ドメインであって、前記軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン；および
    ｂ．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む三つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインであって、前記重鎖ＣＤＲ１が、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ２が、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、前記重鎖ＣＤＲ３が、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、を含む、ＣＡＲポリペプチド。
  79. 前記フィラミンＡ抗原結合ドメインが、配列番号２を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号７を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項７８のいずれか１項に記載のＣＡＲポリペプチド。
  80. 細胞内シグナル伝達ドメインおよび膜貫通型ドメインをさらに含む、請求項７８または７９に記載のＣＡＲポリペプチド。
  81. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｂ７－Ｈ３、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインを含む、請求項８０に記載のＣＡＲポリペプチド。
  82. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ鎖シグナル伝達ドメインである、請求項８０に記載のＣＡＲポリペプチド。
  83. 請求項７８～８２のいずれか１項に記載のＣＡＲを発現する細胞。
  84. 前記細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、または幹細胞からなる群から選択される、請求項８３に記載の細胞。
  85. 前記細胞がＴ細胞である、請求項８４に記載の細胞。
  86. それを必要とする対象における癌を治療するための組成物であって、請求項８３に記載の細胞を含む、組成物。
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