JP2024003141A - フィラミンaに対する抗体およびその治療上の使用 - Google Patents
フィラミンaに対する抗体およびその治療上の使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024003141A JP2024003141A JP2023192525A JP2023192525A JP2024003141A JP 2024003141 A JP2024003141 A JP 2024003141A JP 2023192525 A JP2023192525 A JP 2023192525A JP 2023192525 A JP2023192525 A JP 2023192525A JP 2024003141 A JP2024003141 A JP 2024003141A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- filamin
- antibodies
- cells
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108060002900 Filamin Proteins 0.000 title abstract description 414
- 102000013366 Filamin Human genes 0.000 title abstract description 408
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title abstract description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 141
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 134
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 120
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 abstract description 79
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 abstract description 78
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 543
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 219
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 196
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 195
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 195
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 148
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 138
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 121
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 109
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 107
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 107
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 59
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 59
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 57
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 55
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 46
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 45
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 45
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 42
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 42
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 36
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 35
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 35
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 32
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 30
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 29
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 29
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 27
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 27
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 26
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 25
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 25
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 25
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 25
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 description 24
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 description 24
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 23
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 22
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 20
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 20
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- -1 other antibodies Substances 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 16
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 14
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 13
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 13
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 12
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 12
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 12
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 12
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 11
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 11
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 11
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 11
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 10
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 10
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 10
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 9
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 9
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 9
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 9
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 8
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 8
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 8
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 8
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 8
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 8
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 8
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 8
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 7
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 7
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 7
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 102100026561 Filamin-A Human genes 0.000 description 6
- 101710091743 Filamin-A Proteins 0.000 description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000913552 Mus musculus Filamin-A Proteins 0.000 description 6
- 101100066898 Mus musculus Flna gene Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 6
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 6
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 6
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 6
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 5
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 5
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 5
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000002783 cell motility assay Methods 0.000 description 5
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 5
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 5
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 5
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 5
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 4
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 4
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 101100066897 Homo sapiens FLNA gene Proteins 0.000 description 4
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 4
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 4
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 4
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 4
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 4
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-4-[(4-methyl-2-nitrophenyl)diazenyl]-N-(3-nitrophenyl)naphthalene-2-carboxamide Chemical compound Cc1ccc(N=Nc2c(O)c(cc3ccccc23)C(=O)Nc2cccc(c2)[N+]([O-])=O)c(c1)[N+]([O-])=O MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 208000009458 Carcinoma in Situ Diseases 0.000 description 3
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 3
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 3
- 241000532838 Platypus Species 0.000 description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 3
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 3
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 3
- 201000004933 in situ carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 3
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 3
- 229940037201 oris Drugs 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 description 2
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 2
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102000007590 Calpain Human genes 0.000 description 2
- 108010032088 Calpain Proteins 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100026560 Filamin-C Human genes 0.000 description 2
- 101710091745 Filamin-C Proteins 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 208000037564 High-grade astrocytoma Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 2
- 101000913549 Homo sapiens Filamin-A Proteins 0.000 description 2
- 101000913551 Homo sapiens Filamin-B Proteins 0.000 description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101001109503 Homo sapiens NKG2-C type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101000934376 Homo sapiens T-cell differentiation antigen CD6 Proteins 0.000 description 2
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 2
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 2
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 2
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 2
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 102100022683 NKG2-C type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 208000031673 T-Cell Cutaneous Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 102100025131 T-cell differentiation antigen CD6 Human genes 0.000 description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 2
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 description 2
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 2
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 201000007241 cutaneous T cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 2
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 2
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 208000030776 invasive breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 208000026037 malignant tumor of neck Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000003632 microfilament Anatomy 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 201000005962 mycosis fungoides Diseases 0.000 description 2
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 239000008191 permeabilizing agent Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 208000025638 primary cutaneous T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 2
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 2
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical class O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710085003 Alpha-tubulin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710085461 Alpha-tubulin N-acetyltransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710099705 Anti-lipopolysaccharide factor Proteins 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 101150019028 Antp gene Proteins 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- RKAIOFHOPUEFQQ-WEVVVXLNSA-N CC(C)(OC(=O)\C=C\c1ccc(O)cc1)C1Cc2cc3ccc(=O)oc3cc2O1 Chemical compound CC(C)(OC(=O)\C=C\c1ccc(O)cc1)C1Cc2cc3ccc(=O)oc3cc2O1 RKAIOFHOPUEFQQ-WEVVVXLNSA-N 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 229920002567 Chondroitin Polymers 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710088235 Envelope glycoprotein C homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100026559 Filamin-B Human genes 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150037430 Flna gene Proteins 0.000 description 1
- 101150031761 Flnc gene Proteins 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000913557 Homo sapiens Filamin-C Proteins 0.000 description 1
- 101000703436 Homo sapiens Sex hormone-binding globulin Proteins 0.000 description 1
- 108010070875 Human Immunodeficiency Virus tat Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 208000005016 Intestinal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- TWOFBVMVSYSAFW-UFUGHDFUSA-N N'-(3-aminopropyl)butane-1,4-diamine (3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol guanidine Chemical compound NC(N)=N.NC(N)=N.NCCCCNCCCN.C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 TWOFBVMVSYSAFW-UFUGHDFUSA-N 0.000 description 1
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010088535 Pep-1 peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000027190 Peripheral T-cell lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001244 Poly(D,L-lactide) Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101000916532 Rattus norvegicus Zinc finger and BTB domain-containing protein 38 Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- RKAIOFHOPUEFQQ-UHFFFAOYSA-N Secorin Natural products CC(C)(OC(=O)C=Cc1ccc(O)cc1)C2Cc3cc4C=CC(=O)Oc4cc3O2 RKAIOFHOPUEFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000031672 T-Cell Peripheral Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 101710175714 Tyrosine aminotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100036976 X-ray repair cross-complementing protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710124907 X-ray repair cross-complementing protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000012200 cell viability kit Methods 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N chondroitin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@H](O)C=C(C(O)=O)O1 DLGJWSVWTWEWBJ-HGGSSLSASA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 208000024207 chronic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003145 cytotoxic factor Substances 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 229940060037 fluorine Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000003712 glycosamine group Chemical group 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013198 immunometric assay Methods 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002520 isoleucines Chemical class 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002614 leucines Chemical class 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002960 lipid emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011271 lymphoscintigraphy Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000034724 negative regulation of cellular component movement Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000683 nonmetastatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 108010043655 penetratin Proteins 0.000 description 1
- MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N penetratin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108091005706 peripheral membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000575 polymersome Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000001855 preneoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000001273 protein sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229940065721 systemic for obstructive airway disease xanthines Drugs 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 108010062760 transportan Proteins 0.000 description 1
- PBKWZFANFUTEPS-CWUSWOHSSA-N transportan Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CN)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 PBKWZFANFUTEPS-CWUSWOHSSA-N 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- UZVNCLCLJHPHIF-NOJKMYKQSA-J zinc;(1e)-2-(ethylcarbamoylamino)-n-methoxy-2-oxoethanimidoyl cyanide;manganese(2+);n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[Zn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.CCNC(=O)NC(=O)C(\C#N)=N\OC UZVNCLCLJHPHIF-NOJKMYKQSA-J 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
- A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
- A61K2039/812—Breast
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
- A61K2039/86—Lung
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
- A61K2039/884—Vaccine for a specifically defined cancer prostate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/80—Immunoglobulins specific features remaining in the (producing) cell, i.e. intracellular antibodies or intrabodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4712—Muscle proteins, e.g. myosin, actin, protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
【課題】フィラミンAに対する抗体およびその治療上の使用の提供。【解決手段】本開示は、特に、ヒト癌を検出および治療する方法において有用な抗体を教示する。特定の態様では、本開示は、ヒト乳癌を検出および治療するのに有用である新規抗体を教示する。一部の実施形態では、本開示は、フィラミンAに結合する新規抗体を教示する。一部の実施形態では、抗体は、細胞内抗体である。本開示は、特に、モノクローナル抗体(mAb)を含む新規抗体およびその断片を提供することによって、医学界における前述のニーズに対処する。一部の実施形態では、mAbは、癌(例えば、ヒト乳癌)を選択的に標的にし、治療する。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、細胞内抗体である。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2018年10月9日に出願された米国仮特許出願第62/743,169号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2018年10月9日に出願された米国仮特許出願第62/743,169号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる:配列表のコンピュータ可読形式のコピー(ファイル名:IBEX_004_03WO_ST25.txt:記録日:2019年10月9日、ファイルサイズ:4キロバイト)。
本出願と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる:配列表のコンピュータ可読形式のコピー(ファイル名:IBEX_004_03WO_ST25.txt:記録日:2019年10月9日、ファイルサイズ:4キロバイト)。
本開示は、モノクローナル抗体(mAb)およびその断片、当該抗体またはその断片を分泌する新規タンパク質発現細胞株、ならびに抗原を優先的に検出し、および/または疾患を治療するための抗体および抗体断片の使用に関する。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体およびその断片は、細胞転移を調節する。本開示の特定の実施形態は、例えば、乳癌などのヒトの癌の治療に有用なヒトキメラmAb、細胞内抗体、および細胞免疫療法を教示する。
癌は、所定の正常組織からもたらされた異常細胞数の増加を特徴とする多面的な疾患であり、これらの細胞は、典型的には、血液またはリンパ系を介して身体の他の領域へと広がることによって、隣接組織に浸潤するか、または転移する。癌は、典型的には、新生物に進行し得る軽度な前腫瘍変化で始まる多段階プロセスを経て進行する。腫瘍性病変は、浸潤、成長、転移、および異種に対する増加する能力を生じ得る。
例えば、肺、結腸、乳房、直腸、前立腺、脳、および腸の癌を含む、非常に多様な癌が存在する。癌の発生は、集団が加齢すると共に、新規癌が発生すると共に、感受性集団が成長すると共に、上昇し続ける。癌を有する患者を治療するために使用できる新規方法および組成物の多大な要求が存在する。
癌を治療する現在の方法は、顕著に非選択性である。外科手術は罹患した組織を除去し、放射線療法は固形塊を縮小し、化学療法は急速に分裂する細胞を殺傷する。放射線照射および化学療法は、癌細胞と共に健常な細胞の非選択的な破壊など、様々な望ましくない副作用と関連する。
したがって、当該技術分野において、現在の治療に付随する欠点に苦しまない、癌を治療する方法を開発するニーズが依然としてある。具体的には、当該技術分野において、転移性細胞を優先的に標的とし、健常な細胞を破壊しない、高度に選択的な治療法を開発する大きなニーズがある。
新たな高度に選択的な癌治療法および処置のニーズは、乳癌に関して特に急務である。乳癌は、皮膚癌を除き、米国の女性の中で最も一般的な癌である。米国の女性の8人中約1人(12%)が、その生涯に浸潤性乳癌を発症する。米国癌協会による2015年の米国における乳癌の推定は、約231,840の新規症例の浸潤性乳癌が、女性において診断され、約60,290の新規症例の上皮内癌(CIS)が診断され(CISは非浸潤性であり、乳癌の最も早期の形態である)、約40,290人の女性が、乳癌で死亡する。これらは、驚くべき統計であり、当該技術分野において、新規治療法および乳癌の広がりを選択的に標的にし、予防する方法を開発する大きなニーズを強調する。
本開示は、特に、モノクローナル抗体(mAb)を含む新規抗体およびその断片を提供することによって、医学界における前述のニーズに対処する。一部の実施形態では、mAbは、癌(例えば、ヒト乳癌)を選択的に標的にし、治療する。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、細胞内抗体である。
一態様では、本開示は、フィラミンA抗原に結合するモノクローナル抗体(mAb)などの抗体を提供する。本明細書において記載される抗体は、一部の態様では、ヒト乳癌細胞などの哺乳類細胞によって分泌されるフィラミンA抗原に優先的に結合する、ヒトキメラmAbである。他の態様では、ヒトキメラmAbは、ヒト乳癌細胞などの哺乳類細胞の細胞膜と関連するフィラミンA抗原に優先的に結合する。一部の態様では、本明細書において提供される抗体または断片は、細胞ベースの免疫療法(例えば、キメラ抗原受容体T細胞(CAR-T))の一部であり、抗体または断片は、ヒト乳癌細胞などの哺乳類細胞の細胞膜と関連するフィラミンA抗原に結合する。なおさらなる態様では、本明細書において教示される抗体は、細胞内抗体である。したがって、一部の実施形態では、抗体は、細胞内のフィラミンA抗原に結合してもよい。一部の実施形態では、本明細書において教示される抗体は、細胞内小胞内のフィラミンA抗原に結合してもよい。さらなる実施形態では、本明細書において教示される抗体は、細胞外微小小胞またはエクソソーム内のフィラミンA抗原に結合してもよい。
本開示は、癌細胞由来のフィラミンA抗原を選択的に標的にすることができる新規の治療用mAbを提供するだけでなく、当該抗体を含む医薬組成物、および抗体で患者を治療する方法も教示する。一部の実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害活性(CDC)を誘導する。一部の実施形態では、本開示は、フィラミンA抗原を発現する癌細胞への標的化治療薬の送達のための抗体を提供する。さらなる実施形態において、標的化治療薬は、放射性ヌクレオチド、有効治療剤、薬物、化学療法剤、他の抗体、ナノ粒子、および遺伝子治療ベクターからなる群から選択される。一部の実施形態では、本開示は、治療剤に連結または結合された抗体を提供し、抗体は、癌細胞によって飲食運動される。
一部の実施形態では、本開示は、細胞内のフィラミンA抗原に特異的な細胞内抗体を発現させる方法を提供する。さらなる実施形態では、細胞は癌細胞である。
一部の実施形態では、本開示は、フィラミンA抗原に結合する抗体を提供し、抗体は、配列番号18、19、20、または21による重鎖CDR3領域を含む。かかる抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片、単離ヒトキメラ抗体、および/または細胞内抗体であってもよい。
一実施形態では、本開示は、三つの相補性決定領域(CDR)CDR1、CDR2、およびCDR3を含む軽鎖可変ドメインを含む、フィラミンA抗原に結合する抗体、例えば、単離ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片、または細胞内抗体を提供する。一部の実施形態では、軽鎖CDR1は、配列番号12および13から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖CDR2は、配列番号14のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、軽鎖CDR3は、配列番号15のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、三つの相補性決定領域(CDR)CDR1、CDR2、およびCDR3を含む重鎖可変ドメインを含む、フィラミンA抗原に結合する単離ヒトキメラ抗体、抗体断片、または細胞内抗体を提供する。一部の実施形態では、重鎖CDR1は、配列番号16のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖CDR2は、配列番号17のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、重鎖CDR3は、配列番号18、19、20、および21のアミノ酸配列を含む。
開示される抗体(例えば、単離ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片、または細胞内抗体)の一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号1または配列番号2を含む。一実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号4、5、6、または7を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号1を含み、重鎖可変領域は、配列番号4を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号1を含み、重鎖可変領域は、配列番号5を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号1を含み、重鎖可変領域は、配列番号6を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号1を含み、重鎖可変領域は、配列番号7を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号2を含み、重鎖可変領域は、配列番号4を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号2を含み、重鎖可変領域は、配列番号5を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号2を含み、重鎖可変領域は、配列番号6を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号2を含み、重鎖可変領域は、配列番号7を含む。
開示される抗体(例えば、単離ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片、または細胞内抗体)の一実施形態では、軽鎖定常ドメインは、配列番号3を含み、重鎖定常ドメインは、配列番号11を含む。
一部の実施形態において、抗体は、配列番号1または2を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号4、5、6、または7を含む重鎖可変ドメインを含むscFvである。さらなる実施形態では、抗体は、配列番号2を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号7を含む重鎖可変領域を含むscFvである。一部の実施形態では、scFv抗体は、細胞内抗体である。
開示される抗体(例えば、単離ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片、または細胞内抗体)の一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、配列番号1または2を含み、軽鎖定常ドメインは、配列番号3を含み、重鎖可変ドメインは、配列番号4、5、6、または7を含み、重鎖定常ドメインは、配列番号11を含む。一部の実施形態では、開示される単離ヒトキメラ抗体は、配列番号2を含む軽鎖可変ドメイン、配列番号3を含む軽鎖定常ドメイン、配列番号7を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号11を含む重鎖定常ドメインを含む。
一部の実施形態では、抗体または細胞内抗体は、本明細書において提供される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、可変領域は、軽鎖-重鎖の配向である。したがって、一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、重鎖可変領域のアミノ末端に位置する。さらなる実施形態では、抗体または細胞内抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、抗体または細胞内抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に、軽鎖可変領域、リンカー、および重鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、抗体または細胞内抗体は、本明細書において提供される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含み、可変領域は、重鎖-軽鎖の配向である。したがって、一部の実施形態では、重鎖可変領域は、軽鎖可変領域のアミノ末端に位置する。さらなる実施形態では、抗体または細胞内抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、抗体または細胞内抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に、重鎖可変領域、リンカー、および軽鎖可変領域を含む。一態様では、フィラミンA抗原は、FLNA遺伝子によってコードされる遺伝子産物、またはその相同体である。一部の実施形態では、フィラミンA抗原は、細胞内である。一部の実施形態では、フィラミンA抗原は、癌細胞などの細胞によって分泌される。一部の実施形態では、フィラミンA抗原は、細胞表面、例えば、細胞膜関連フィラミンA抗原と関連する。別の態様では、フィラミンA抗原は、膜または小胞などの細胞関連構造に結合し、および/または関連する。したがって、一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、細胞内のフィラミンA抗原に結合してもよい。一部の実施形態では、フィラミンA抗原は、微小胞に結合し、および/または関連する。一部の実施形態では、フィラミンA抗原は、エクソソームまたは他の多成分複合体に結合し、および/または関連する。一部の実施形態では、フィラミンA抗原は、断片である。一態様では、フィラミンA抗原は、約280kDaの乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンA抗原である。
一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、フィラミンA抗原またはその断片に優先的に結合することができ、当該優先結合は、非乳癌フィラミンA抗原に対してである。一部の実施形態では、乳癌細胞フィラミンA抗原は、可溶性フィラミンA抗原である。一部の実施形態では、乳癌細胞フィラミンA抗原は、細胞表面と関連する。一部の実施形態では、乳癌細胞フィラミンA抗原は、エクソソームまたは多成分複合体などの微小胞に取り込まれる。一部の実施形態では、乳癌細胞フィラミンA抗原は、分泌された可溶性形態で、細胞表面および/もしくは小胞と関連して、ならびに/または結合して見られる。
一部の実施形態では、抗体は、約10-5M~約10-12Mの特異的親和性でフィラミンA抗原に結合する能力を有する。一部の実施形態では、抗体は、約10-7M~約10-11Mの特異的親和性でフィラミンA抗原に結合する能力を有する。一部の実施形態では、抗体は、約10-8M~約10-11Mの特異的親和性でフィラミンA抗原に結合する能力を有する。
また、本明細書において提供される抗体をコードする単離ポリヌクレオチドDNA配列も本明細書において教示される。例えば、本開示は、本明細書において提供されるヒト、キメラ、またはヒト化抗体をコードする単離ポリヌクレオチドDNA配列を提供する。本明細書において提供される抗体をコードするポリヌクレオチドDNA配列を含むベクターも本明細書において提供される。当該ベクターを含む宿主細胞も本明細書において提供される。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される細胞内抗体をコードする単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、ポリヌクレオチドDNA配列である。一部の実施形態では、核酸は、RNA配列である。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される細胞内抗体をコードするRNAを提供し、RNAによってコードされる細胞内抗体は、遺伝子導入された細胞内で一過性に発現される。
本開示は、フィラミンAに対する単離ヒトキメラ抗体を産生する方法であって、ベクターを有する宿主細胞を培養して、当該抗体を発現させること、抗体を発現させること、および宿主細胞によって発現される抗体を回収することを含む方法を提供する。
本開示は、フィラミンAに対する細胞内抗体を産生するための組成物および方法、標的細胞に細胞内抗体遺伝子またはタンパク質を送達するための組成物および方法、ならびに細胞内の特定の細胞内位置に細胞内抗体遺伝子またはタンパク質を送達するための組成物および方法を提供する。開示される方法は、組み換えウイルスを介した送達、非ウイルス性遺伝子送達方法(ポリマーまたはカチオン性脂質送達システムなどのナノキャリア送達システム)、または機械的送達技術を介した他のプラスミドもしくはトランスポゾンシステム、ならびに細胞膜透過ペプチドまたはタンパク質を使用した送達を含む。したがって、本開示は、ナノ担体および本明細書において提供される細胞内抗体を含む組成物を提供し、細胞内抗体は、細胞貫通ペプチドまたは化学的部分と融合するか、または連結する。一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、転移性エレメント、またはトランスポゾンである。さらなる実施形態では、非ウイルスベクターは、スリープビューティトランスポゾン、piggyBacトランスポゾン、または当該技術分野で公知の任意の他のトランスポゾンを含む。一部の実施形態では、開示される方法は、遺伝子編集システムを介した送達を含む。例えば、一部の実施形態では、開示される方法は、(i)クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)関連(Cas)システム、(ii)転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)システム、または(iii)亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)システムを介した送達を含む。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される細胞内抗体をコードする遺伝子を含むプラスミドを提供する。一部の実施形態では、プラスミドは、細菌であるか、または細菌に由来するか、または例えば、真菌、藻類、もしくは植物などの非細菌性供給源に由来する。一部の実施形態では、核酸は、細胞内抗体の発現をもたらすための真核生物プロモーターを含むプラスミドである。さらなる実施形態では、プラスミドは、CMVプロモーターを含む。
一部の実施形態では、方法は、細胞内抗体を細胞内構造に標的化するための配列を有する細胞内抗体の送達を含む。細胞内抗体が標的化され得る細胞内構造としては、例えば、核、小胞体(ER)、ゴルジ装置、ミトコンドリア、またはリソソームが挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸は、細胞内で安定的にまたは一過性に発現されてもよい。一部の実施形態では、安定的発現は、核酸が細胞ゲノム内に統合されたことを意味し、一部の実施形態では、一過性発現は、遺伝子導入された遺伝子が、限られた期間発現することを意味する。一部の実施形態では、RNA、siRNA、miRNA、またはmRNAを使用して、細胞における細胞内抗体の一過性発現に影響する。
一部の態様では、教示される抗体は、固相に固定化される。一部の態様では、教示される抗体は、検出可能に標識される。一部の態様では、本明細書において提供される抗体は、細胞障害性薬物などの薬物に結合される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、抗体と薬物の結合体を提供する。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体と薬物の結合体は、エンドサイトーシスを介して内部移行される。一部の態様では、教示される抗体は、放射性核種、有効な治療剤、または薬物、または化学療法剤、またはタンパク質、または他の抗体に結合される。
本開示はまた、本明細書において提供される抗体(例えば、フィラミンA抗原に特異的な単離ヒトキメラ抗体)、および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される細胞内抗体(例えば、フィラミンA抗原に特異的な細胞内抗体)を含む医薬組成物、または本明細書において提供される細胞内抗体をコードする遺伝子もしくは核酸を含む送達システムを提供する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される細胞内抗体をコードするDNAまたはRNAを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書において提供される細胞内抗体をコードする遺伝子または核酸を含む送達システムは、非ウイルスまたはウイルス送達システムである。例えば、一部の実施形態では、ウイルス送達システムは、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。一部の実施形態では、医薬組成物は、細胞内位置への細胞内抗体の標的化送達のための遺伝子またはタンパク質をさらに含む。一部の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞を含む医薬組成物を提供し、CARは、本明細書において提供されるフィラミンA結合ドメインを含む。
本開示はまた、本明細書において提供される抗体(例えば、フィラミンA抗原に特異的な単離ヒトキメラ抗体、および/またはフィラミンA抗原に特異的な細胞内抗体)、および抗体に結合する二次抗体を含むヒト癌を診断するためのキットを教示し、二次抗体は、検出可能な標識に結合される。例えば、一部の実施形態では、本開示は、フィラミンA抗原に特異的な単離されたヒトキメラ抗体、および検出可能な標識に結合した二次抗体を含む、ヒト乳癌を診断するためのキットを提供する。
患者における癌を診断する方法であって、患者から生物学的試料得ること、生物学的試料を本明細書において提供される抗体(例えば、フィラミンA抗原に特異的な単離ヒトキメラ抗体、および/またはフィラミンA抗原に特異的な細胞内抗体)と接触させること、および抗体が、癌細胞により分泌された可溶性フィラミンA抗原に結合し、および/または癌細胞膜関連もしくは結合フィラミンA抗原に結合し、および/または細胞内フィラミンA抗原に結合するかどうかを検出することを含み、当該抗体とフィラミンA抗原の間の正の結合相互作用が、癌の指標である、方法も、本明細書において教示される。さらなる実施形態では、癌は、ヒト乳癌である。
本開示はまた、有効量の本明細書において提供される抗体を投与することを含む、患者における癌を治療する方法を提供する。例えば、本開示は、本明細書において提供される、フィラミンA抗原に特異的な単離ヒトキメラ抗体、および/またはフィラミンA抗原に特異的な細胞内抗体、および/またはフィラミンA抗体もしくはその断片(例えば、フィラミンA結合ドメイン)を含むCARを含む免疫細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む、治療方法を提供する。さらなる実施形態では、癌は、ヒト乳癌である。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、癌細胞に結合し、補体依存性細胞傷害活性(CDC)および/または抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性(ADCC)を含む。
さらに、本開示は、フィラミンA抗原を発現する癌腫瘍細胞の成長を予防または低減する方法であって、それを必要とするヒト患者に、有効量の本明細書において提供される抗体を投与することを含む、方法を教示する。一部の実施形態では、本方法は、配列番号12および13から選択される軽鎖CDR1、配列番号14の軽鎖CDR2、配列番号15の軽鎖CDR3、配列番号16の重鎖CDR1、配列番号17の重鎖CDR2、ならびに/または配列番号18、19、20、および21から選択される重鎖CDR3を含む抗体を投与することを含む。ある特定の実施形態では、当該抗体は、それぞれ、配列番号13、14、および15に記載の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにそれぞれ、配列番号16、17、および21に記載の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む。一部の実施形態では、当該抗体は、配列番号2を含む軽鎖可変領域および配列番号7を含む重鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、抗体は、非癌細胞により分泌された可溶性フィラミンA抗原と比較して、哺乳類癌細胞(乳癌細胞など)により分泌される可溶性フィラミンA抗原に優先的に結合する。一部の実施形態では、抗体は、細胞内であり、および/またはエクソソームなどの小胞内に位置するフィラミンA抗原に優先的に結合する。
一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒトキメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体は、細胞内抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体または多重特異性抗体である。一部の実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体は、フィラミンA抗原に結合する本明細書において提供される第一の抗体、および免疫細胞上の抗原に結合する第二の抗体を含む。免疫細胞は、一部の実施形態では、T細胞、B細胞、NK細胞、マクロファージ、単球、または樹状細胞から選択される。一部の実施形態では、抗原は、T細胞抗原である。一部の実施形態では、T細胞抗原は、CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69、およびCD90からなる群から選択される。一部の実施形態では、抗体は、フィラミンA抗原およびCD3に結合する二重特異性抗体である。
さらなる実施形態では、単離ヒトキメラ抗体は、フィラミンAに対するマウス抗体と比較して、低減した免疫原性を示し、抗体を投与された患者から負の免疫応答を導かない。他の実施形態では、開示された抗体は、当該抗体の免疫原性をさらに低減するようヒト化される。他の態様では、抗体は、例えば、抗体を「脱免疫化すること」によって、ヒト化以外の他の方法によって減少した免疫原性を有する。
定義
「約」とは、用語が利用される科学的背景に適切であると、当業者によって理解されるであろう、そのように適格である数、パラメータ、または特性のプラスまたはマイナスのパーセント(例えば、±5%)を意味する。さらに、本明細書で使用される数量を指す全ての数、値、および表現は、当技術分野で遭遇する測定値の様々な不確かさの対象となるため、別段の示唆がない限り、全ての提示される値は、用語「約」によって修正されると理解され得る。
「約」とは、用語が利用される科学的背景に適切であると、当業者によって理解されるであろう、そのように適格である数、パラメータ、または特性のプラスまたはマイナスのパーセント(例えば、±5%)を意味する。さらに、本明細書で使用される数量を指す全ての数、値、および表現は、当技術分野で遭遇する測定値の様々な不確かさの対象となるため、別段の示唆がない限り、全ての提示される値は、用語「約」によって修正されると理解され得る。
本明細書で使用される場合、冠詞「a」、「an」、および「the」は、別段、単数参照語に明らかに限定されない限り、または冠詞が、単数参照語を指す文章の文脈から当業者にとって明らかである場合を除き、複数の参照語を含み得る。
数値範囲が本明細書において開示されている場合、こうした範囲は、範囲の最小値と最大値の両方、ならびにこうした最小値と最大値の間の全ての値を含み、連続的である。さらに、ある範囲が整数を指す場合、その範囲の最小値と最大値との間の全ての整数が含まれる。さらに、特徴または特性を記載するために複数の範囲が提供される場合、こうした範囲を組み合わせることができる。すなわち、別段の示唆がない限り、本明細書において開示される全ての範囲は、その中に包含されるあらゆる全ての部分範囲を包含すると解されるべきである。例えば、所定の範囲「1~10」は、最小値1と最大値10の間のあらゆる全ての部分範囲を含むとみなされるべきである。範囲「1~10」の例示的な部分範囲には、1~6.1、3.5~7.8、および5.5~10が含まれるが、これらに限定されない。
用語「フィラミン」、「ヒトアクチン結合タンパク質」、または「ヒトABP」は、アクチンフィラメントを皮質細胞質の直交ネットワークに架橋し、アクチン細胞骨格のための膜タンパク質のアンカーリングに関与するタンパク質のファミリーを指す。フィラミンは、三つの機能的ドメイン:N末端フィラメント型アクチン結合ドメイン、C末端自己会合ドメイン、および膜糖タンパク質結合ドメインを含む。フィラミンタンパク質のファミリーは、以下の三つのタンパク質:フィラミンA、フィラミンB、およびフィラミンCを含む。
用語「フィラミンA」、「ヒトフィラミンA」、「アルファ-フィラミン」、「フィラミン1」、「ABP-280」、「内皮アクチン結合タンパク質」および「非筋肉フィラミン」は、インテグリン、膜貫通型受容体複合体、およびセカンドメッセンジャーと相互作用することによってアクチン細胞骨格の再構成を調節する広く発現されたタンパク質である、FLNA遺伝子によりコードされる約280kDのフィラミンタンパク質を指す。フィラミンA(またはその一部分)も、ヒト神経芽細胞腫細胞(例えば、NMB-7)の表面上に表示される。これはまた、NMB-7細胞の不可欠な膜画分、ならびに細胞質および末梢膜タンパク質を含有する親水性タンパク質画分にも存在する。したがって、細胞外表面を含む、細胞全体にわたって見出すことができる。FLNaはまた、ヒト細胞株HeLa(子宮頸癌)、SKOV3(卵巣癌)、およびHEK293(ヒト胚腎臓)の細胞表面に存在することが示されている。Bachmannら、Cancer Sci.97(12)、2006年を参照のこと、文献は参照によりその全体で全ての目的のため本明細書に組み込まれる。フィラミンAのポリペプチド配列は、GenBank受託番号P21333(Gorlinら、1990年、J.Cell Biol.111(3):1089~1105頁)で入手可能である。本明細書で使用される場合、「フィラミンA」は、そのバリアント、その変異体、その組み換え体バージョン、およびその断片を含む。
用語「フィラミンB」、「ヒトフィラミンB」、「ベータ-フィラミン」、「ABP-278」、「内皮アクチン結合タンパク質」、および「非筋肉フィラミン」は、アクチンフィラメントに結合するFLNB遺伝子によってコードされる約278kDを指す。フィラミンBのポリペプチド配列は、Gen Bank受託番号075369(Takafutaら、1998年、J.Biol.Chem.273(28)、17531~17538頁)を参照されたい。
用語「フィラミンC」、「ヒトフィラミンC」、「フィラミン2」、「ガンマフィラミン」、「ABP-280、常染色体形態」は、アクチンフィラメントに結合するFLNC遺伝子によってコードされる約280kDのタンパク質を指す。フィラミンCのポリペプチド配列は、GenBank受託番号Q14315(Xieら、1998年、Biochem.Biophys.Res.Commun.251(3)、914~919頁)で入手可能である。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、(a)免疫グロブリンポリペプチドおよび免疫グロブリンポリペプチドの免疫活性部分、すなわち、特定の抗原(例えば、フィラミンA)に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する、免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、もしくはその断片、または(b)抗原(例えば、フィラミンA)に免疫特異的に結合するそのような免疫グロブリンポリペプチドもしくは断片の保存的に置換された誘導体を指す。抗体は、例えば、HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988年)に一般的に記載されている。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、抗体断片を包含する。したがって、一部の実施形態では、抗体は、VhH抗体またはドメイン抗体などの単一ドメイン抗体(sdAb)、あるいは一本鎖可変断片(scFv)または他の抗体断片(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、もしくはFv断片)である。
本明細書で使用される場合、用語「細胞内抗体」は、細胞内タンパク質に結合し、細胞内で効果を有する抗体またはその断片(例えば、一本鎖可変断片(scFv)または他の一本鎖もしくは単一ドメイン抗体)を指す。一部の実施形態では、細胞内抗体は、標的細胞内で、例えば、遺伝子療法を介して発現される。例えば、細胞内抗体をコードするDNAまたはRNAは、プラスミド、ウイルス送達システム、または非ウイルス送達システムを使用して細胞に送達される。ウイルス送達システムには、例えば、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターが含まれる。非ウイルス送達システムとしては、例えば、カチオン性脂質、脂質エマルション、ナノ粒子、ペプチドベクター(例えば、カチオン性ペプチド)、ポリマー(例えば、合成ポリエチレンイミン(PEI)などのカチオン性ポリマー)、キトサン、ポリ(DL-ラクチド)(PLA)もしくはポリ(DL-ラクチド-コ-グリコシド(PLGA)粒子)、デンドリマーまたは機械的送達技術を使用して細胞に送達される、プラスミドもしくはDNA断片、またはRNAが挙げられる。一部の実施形態では、細胞内抗体は、細胞膜貫通型ペプチド、または細胞内部移行ペプチドを介して細胞内に送達されてもよい。任意で、本明細書において提供される細胞内抗体は、核局在化シグナル、または例えば、小胞体(ER)、ゴルジ装置、ミトコンドリア、リソソーム、または他の位置などの異なる細胞内構造に細胞内抗体を標的化するシグナルを含んでもよい。したがって、細胞内で一度発現された細胞内抗体は、細胞質内に留まり得るか、または特定の細胞内構造に局在化し得る。細胞内抗体は、細胞内微小環境に対する抵抗性を増加させるか、または安定性を強化するための追加の修飾を含んでもよい。
上で定義された免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の文脈において、「保存的置換」とは、免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片の抗原への特異的結合(例えば、KDによって測定される)を実質的に低減する一つまたは複数のアミノ酸置換(すなわち、例えば、ELISAなどの標準的な結合アッセイにより結合される、約40%以下、典型的には、約30%以下、より典型的には、約20%以下、なおより典型的には、約10%以下、または最も典型的には、約5%以下、結合を増加させる、結合を有意に変化させる、または結合を低減する置換)を意味する。
本明細書で使用される場合、「抗体誘導体」は、上で定義された抗体を意味し、例えば、異種ポリペプチドの結合による、または抗体と通常関連しないグリコシル化、アセチル化もしくはリン酸化などによる、異種分子の共有結合によって修飾される。例えば、化学療法剤、または蛍光標識、または放射性化学物質、または活性薬物が、とりわけ、結合されてもよい。
天然で生じる抗体(免疫グロブリン)は、ジスルフィド結合によって一緒に結合された二つの重鎖および各軽鎖がジスルフィド結合によって重鎖のうちの一つに結合されている二つの軽鎖を含む。各鎖は、N末端可変ドメイン(VHまたはVL)およびそのC末端に定常ドメイン(CHまたはCL)を有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと共に整列し、ジスルフィド結合し、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと共に整列する。重鎖定常領域は、(N末端からC末端方向に)CH1およびヒンジ領域を含む。軽鎖はまた、ヒンジドメインを含む。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成し、ジスルフィド結合を形成すると考えられており、例えば、Chothiaら、J.Mol.Biol.186:651~663(1985年);NovotnyおよびHaber、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
82:4592~4596(1985年);Padlarら、Mol.immunol.23(9):951~960(1986年);およびS.Miller、J.Mol.Biol.、216:965~973(1990年)を参照されたい。
82:4592~4596(1985年);Padlarら、Mol.immunol.23(9):951~960(1986年);およびS.Miller、J.Mol.Biol.、216:965~973(1990年)を参照されたい。
定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性および補体依存性細胞傷害における抗体の関与など、様々なエフェクター機能に関与する。軽鎖および重鎖の各対の可変ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与する。天然の軽鎖および重鎖のドメインは、同じ一般的な構造、いわゆる、免疫グロブリンフォールドを有し、各ドメインは、四つのフレームワーク(FR)領域を含み、その配列は、幾分保存されており、三つの超可変領域または相補性決定領域(CDR)によって結び付けられる(Kabat,E.Aら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、National Institutes of Health,Bethesda,Md.、(1987年)を参照)。四つのフレームワーク領域は、主に、βシート構造を採用し、CDRは、βシート構造、ある場合では、その形成部を結び付けるループを形成する。各鎖中のCDRは、フレームワーク領域によって近接して保持され、他方の鎖のCDRと共に、抗原結合部位の形成に関与する。
抗体は、様々な抗原結合断片に分けることができる。Fv断片は、重鎖および軽鎖の可変ドメインのみを含有するヘテロ二量体である。Fab断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン(CH1)を含有する。Fab’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一つ以上のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Fab断片とは異なる。Fab’-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を生じるFab’の本明細書における名称である。
また、本明細書では、前述のFab、Fab’、F(ab’)2、ScFv、およびFv断片、ならびに所望の標的エピトープまたは複数のエピトープに対する特異性を有する本開示の抗体の任意の部分を含む、「抗体断片」も教示される。一態様では、本開示の抗体は、抗フィラミンA抗体である。抗体断片の発現は、例えば、米国特許第5,648,237号において教示され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、scFvまたは他の抗体断片を含む細胞内抗体である。
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、一般的に少量で存在する、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る可能性のあるバリアントを除いて、同一であり、および/または同じエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)に指向される異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向される。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有利である。
修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature、256:495(1975年)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または組み換えDNA法によって作製されてもよい(例えば、米国特許第4,816,567号を参照)。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clacksonら、Nature、352:624~628(1991年)およびMarksら、J.Mol.Biol、222:581~597(1991年)に記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。本明細書のモノクローナル抗体の具体的な例には、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体が含まれる。
本明細書のモノクローナル抗体は、具体的には、所望の生物活性を示す限り、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含み、一方、鎖の残りの部分は、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同である(米国特許第4,816,567号;Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81 :6851~6855(1984年))。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最短配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域由来の残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体において、またはドナー抗体において見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。概して、ヒト化抗体は、超可変料理基の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FRの全てまたは実質的に全てが、上で示されたFR置換を除き、ヒト免疫グロブリンのものである、少なくとも一つ、典型的には、二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も任意で含む。詳細については、Jonesら、Nature 321 :522~525(1986年);Riechmannら、Nature 332:323~329(1988年);およびPresta、Curr.Op.Struct.Biol.2:593~596を参照されたい。
本明細書における「ヒト抗体」は、ヒトB細胞から取得可能な抗体のアミノ酸配列構造に対応するアミノ酸配列構造を含むものである。かかる抗体は、免疫の際、内因性免疫グロブリン産生の不存下でヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック動物(例えば、マウス)による産生(例えば、Jakobovitsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:2551(1993年);Jakobovitsら、Nature、362:255~258(1993年);Bruggermannら、Year in Immuno.、7:33(1993年);ならびに米国特許第5,591,669号、第5,589,369号および第5,545,807号を参照);ヒト抗体を発現するファージ提示ライブラリーからの選択(例えば、McCaffertyら、Nature 348:552~553(1990年);Johnsonら、Current
Opinion in Structural Biology 3:564~571(1993年);Clacksonら、Nature、352:624~628(1991年);Marksら、J.Mol.Biol.222:581~597(1991年);Griffithら、EMBO J.12:725~734(1993年);米国特許第5,565,332号および第5,573,905号を参照);インビトロ活性化B細胞を介した生成(米国特許第5,567,610号および第5,229,275号を参照);ならびにヒト抗体産生ハイブリドーマからの単離を含むが、これらに限定されない、様々な技術によって同定するか、または作製することができる。
Opinion in Structural Biology 3:564~571(1993年);Clacksonら、Nature、352:624~628(1991年);Marksら、J.Mol.Biol.222:581~597(1991年);Griffithら、EMBO J.12:725~734(1993年);米国特許第5,565,332号および第5,573,905号を参照);インビトロ活性化B細胞を介した生成(米国特許第5,567,610号および第5,229,275号を参照);ならびにヒト抗体産生ハイブリドーマからの単離を含むが、これらに限定されない、様々な技術によって同定するか、または作製することができる。
本明細書における「多重特異性抗体」は、二つ以上の異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性または四重特異性である。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、2価、3価、または4価である。
「二重特異性抗体」は、二つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、1価または2価である。
抗体結合体、融合タンパク質、および二重特異性抗体:これらは、放射性核種、薬物、巨大分子、または他の薬剤と化学的方法によって結合されたモノクローナル抗体を指す。
抗原:これは、さらに、動物が、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するよう誘導して抗体を生成することができる抗体によって結合されることができる一つまたは複数の分子または分子の一つ以上の部分を指す。抗原は、一つ以上のエピトープを有し得る。上で言及された特定の反応は、抗原が、非常に優先的な方法で、その対応する抗体と反応し、他の抗原によって誘発され得る他の抗体の多数と反応しないことを示すことを意味する。
エピトープ:これは、抗体によって認識され、抗体によって結合されることができる任意の分子のその部分を指す。概して、エピトープは、化学的に活性な表面群の分子、例えば、アミノ酸または糖側鎖からなり、特定の三次元構造特性ならびに特定の荷電特性を有する。一部の態様では、本開示の対象のエピトープは、フィラミンAの部分のエピトープである。フィラミンAのエピトープは、Antibodies,A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、HarlowおよびDavid Lane編(1988年)に記載されるようなクロスクロッキングアッセイで同定することができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
相補性決定領域またはCDR:これは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Fv領域の結合親和性および特異性を一緒に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ、三つのCDRを有する。CDRは、Kabatら、(1991年) Sequences of Proteins of Immunological
Interest、第5編、Department of Health and Human Services、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda(NIH公開第91-3242号)によって詳述された番号付け規則を使用して位置付けられ、説明され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Interest、第5編、Department of Health and Human Services、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda(NIH公開第91-3242号)によって詳述された番号付け規則を使用して位置付けられ、説明され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
フレームワーク領域またはFWR:これは、CDR間に介在するアミノ酸配列を指す。抗体のこれらの部分は、抗原結合のための適切な配向でCDRを保持する役割を果たす。
特異性決定残基またはSDR:これは、他のIgGと比較した場合の、本開示の抗体に特有のアミノ酸残基を指す。一態様では、SDRは、抗原接触に直接関与する免疫グロブリンの一部である。
定常領域:これは、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。重鎖定常領域は、五つのアイソタイプ:アルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、またはミューのいずれかから選択することができる。様々なサブクラスの重鎖(重鎖のIgGサブクラスなど)は、異なるエフェクター機能に関与する。したがって、所望の重鎖定常領域を選択することによって、所望のエフェクター機能を有するヒト化抗体を作製することができる。軽鎖定常領域は、カッパ型またはラムダ型であり得る。
免疫原性:レシピエントに投与されたとき、免疫応答(液性または細胞性)を誘発する標的タンパク質または治療部分の能力の尺度。
免疫反応性:特定の抗原を認識し、結合する免疫グロブリンの能力の尺度。
フィラミンA抗体またはFilA mAb:これらの用語は、本明細書において、用語「フィラミンA特異的抗体」および「フィラミンA抗原特異的抗体」および「フィラミンA抗原結合抗体」などと互換的に使用される。これらの用語は、フィラミンA遺伝子およびフィラミンA遺伝子の相同体の発現産物に優先的に結合することができる抗体を指し、癌細胞によって産生される、修飾された形態の発現産物に特異的な抗体を含み得る。抗体は、キメラ、ヒト化、および当業者に公知の他のバリアントなどのバリアントを含む。フィラミンA抗体は、それらが、別のタンパク質と比較して、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、または少なくとも500倍高い結合親和性でのフィラミンA抗原またはエピトープへの優先結合を示すなら、本開示のフィラミンA抗原またはエピトープに特異的であると言われる。一態様では、フィラミンA抗体は、それらが、任意の他のタンパク質と比較して、1000倍を超える高い親和性で結合する場合、本開示のフィラミンA抗原またはエピトープに特異的であると言われる。ネイキッドフィラミンA抗体は、ビオチンまたは放射性標識などの異種分子にコンジュゲートされていないか、またはそうでなければ結合されていない、本開示のフィラミンA抗体である。
フィラミンA抗原:これは、フィラミンA遺伝子によって生成される発現産物を指し、発現産物は、抗原、標的分子、バイオマーカー、またはそれらの任意の組み合わせとして使用することができる。フィラミンA抗原は、フィラミンA遺伝子およびフィラミンA遺伝子の相同体によって産生され得、様々な改変を含み得る。改変には、アミノ酸変異および/または翻訳後変異が含まれ得る。例えば、フィラミンA抗原は、癌細胞などのフィラミンA抗原を発現する細胞によって導入される改変を含んでもよい。一部の実施形態では、フィラミンA抗原は、FLNa遺伝子、またはその改変を使用して作製された組み換えタンパク質である。
実質的に類似した結合特性:これは、キメラ抗体を産生するために使用される親抗体によって認識される抗原に優先的に結合する能力を保持する、ヒト化抗体またはその断片などのキメラ抗体の能力を指す。一態様では、親抗体に「実質的に類似した結合特性」を有するキメラ抗体の親和性は、結合親和性が、親抗体によって標的化される記抗原に少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%特異的であるものである。
別の態様では、キメラ抗体、ヒト化抗体、または抗体断片の親和性は、親抗体の親和性の約10%~約95%、約10%~約50%、約50%~約95%、約10%~約25%、約25%~約50%、約50%~約95%、約10%~約20%、約20%~約30%、約30%~約40%、約40%~約50%、約50%~約60%、約60%~約70%、約70%~約80%、または約80%~約90%である。
抗原結合親和性をアッセイする方法は、当該技術分野で公知であり、最大藩領の結合アッセイ、競合アッセイ、およびスキャチャード解析を含む。一態様では、抗原結合親和性は、競合アッセイを使用してアッセイされる。
実質的に相同は、参照免疫グロブリン配列と少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を示す免疫グロブリン配列を指してもよく、パーセント同一性は、二つの免疫グロブリン間の同一のアミノ酸残基の数を比較することによって決定され、アミノ酸残基の位置は、例えば、Kabatナンバリングスキームを使用することによって示される。
二つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一」または「パーセント同一性」は、比較され、最大対応のために整列された場合、同じであるか、または同じである特定の割合のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する二つ以上の配列またはサブ配列を指す。パーセント同一性を決定するために、配列は、最適な比較目的のために整列させられる(例えば、ギャップは、第二のアミノ酸配列または核酸配列との最適なアラインメントのために、第一のアミノ酸の配列または核酸配列に導入され得る)。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一の配列における位置が、第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、次いで、分子は、その位置で同一である。二つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である(すなわち、%同一性=同一位置の数/位置の総数(例えば、重複位置)×100)。特定の実施形態では、二つの配列は、同じ長さである。
二つの核酸またはポリペプチドの文脈において、用語「実質的に同一」は、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも96%、97%、98%、もしくは99%の同一性(以下に記載される方法の一つを使用して決定される)を有する二つ以上の配列またはサブ配列を指す。
二つ以上のポリペプチド配列の文脈における「類似性」または「パーセント類似性」は、下に記載される方法の一つを使用して測定されるように、比較され、最大対応について整列されたとき、同じであるか、または保存的に置換された、特定の割合のアミノ酸残基を有する二つ以上の配列またはサブ配列を指す。例として、第一のアミノ酸配列は、第一のアミノ酸配列が、第一の配列に含有される数と同一の数のアミノ酸と比較されたとき、または当該技術分野においてこうちのコンピュータ類似性プログラム(以下を参照)により整列されたポリペプチドのアライメントと比較されたとき、第二のアミノ酸配列と少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、90%、もしくは95%以上同一であるか、または保存的に置換されているとき、第二のアミノ酸配列に類似とみなすことができる。
二つの配列間のパーセント同一性またはパーセント類似性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。二つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、KarlinおよびAltschul、1993年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873~5877において改変された、KarlinおよびAltschul、1990年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264~2268のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Altschulら、1990年、J.Mol.Biol.215:403~410のNBLASTおよびXBLASTプログラムに取り込まれる。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア=100、語長=12を用いて行い、対象のタンパク質をコードする核酸と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア=50、語長=3を用いて行い、対象のタンパク質と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップアライメントを得るために、Gapped BLASTを、Altschulら、1997年、Nucleic Acids Res.25:3389~3402に記載されるように利用することができる。あるいは、PSI-Blastを使用して、分子間の遠縁関係を検出する反復検索を行うことができる(Id.)。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)の既定のパラメータを使用することができる。(例えば、インターネットウェブサイトアドレス:www.ncbi.nlm.nih.govを参照。)配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、MyersおよびMiller、CABIOS(1989年)のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12、およびギャップペナルティ4を使用することができる。配列解析のためのさらなるアルゴリズムは、当該技術分野において公知であり、TorellisおよびRobotti、1994年、Comput.Appl.Biosci.10:3~5に記載されるADVANCEおよびADAM;ならびにPearsonおよびLipman、1988年、Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444~8に記載されるFASTAを含む。FASTA内で、ktupは、検索の感度と速度を設定する制御オプションである。ktup=2の場合、比較される二つの配列中の類似の領域は、整列した残基の対を見ることによって見出され、ktup=1の場合、単一の整列したアミノ酸が、調べられる。Ktupは、タンパク質配列については2または1に設定することができ、DNA配列については1~6に設定することができる。ktupを指定しない場合の既定値は、タンパク質について2、DNAについて6である。あるいは、タンパク質配列アライメントは、Higginsら、1996年、Methods Enzymol.266:383~402により記載される、CLUSTAL Wアルゴリズムを使用して行ってもよい。
実質的に純粋:本開示の目的のため、実質的に純粋は、均質な調製物を指す。一態様では、均質な調製物は、フィラミンA抗体もしくは抗体断片、または他の化学剤もしくは生物剤のものである。少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の均質性の実質的に純粋な免疫グロブリンが、想定される。
フィラミンA抗原発現は、特定の組織標本、血液、血清、または血漿におけるフィラミンA抗原の存在または存在量の測定、一態様では、フィラミンA、その相同体、そのバリアント、その変異体、その組み換えバージョン、および/またはその断片の遺伝子産物の発現によって特徴付けられる疾患に罹患している患者由来の組織標本を含む。そのような疾患には、乳癌、胃癌、および大腸癌が含まれる。
対象開示の「親和性試薬」は、標的分析物に対して高い結合親和性を有する分析物結合ドメイン、部分または成分を有する。高い結合親和性とは、少なくとも約10-4M、通常は、少なくとも約10-6M以上、例えば、10-9M以上の結合親和性を意味する。一態様では、本明細書において教示される抗体の結合親和性は、少なくとも10-2M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M以上、または前述の任意の組み合わせもしくは範囲であってもよい。親和性試薬は、タグ付けされた親和性リガンドとして提示するときに標的タンパク質に対して必要な結合親和性を示す限り、様々な異なるタイプの分子のいずれかであってもよい。したがって、親和性試薬は、小分子または高分子リガンドであってもよい。
また、本開示の対象は、一本鎖抗体またはscFvなどの組み換え産生抗体および抗体断片であり、このような組み換え産生抗体断片は、上記抗体の結合特性を保持する。かかる組み換え産生抗体断片は、対象抗体の結合特性を保持するために、概して、対象抗体の少なくともVHドメインおよびVLドメインを含む。対象の開示のこれらの組み換え産生抗体断片または模倣体は、その開示が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,851,829号および第5,965,371号に記載される方法論のような、任意の便宜的な方法論を使用して容易に調製され得る。
上記の抗体、断片、およびその模倣体は、市販の供給源から取得されてもよく、および/または任意の便宜的なテクノロジーを使用して調製されてもよく、その組み換え誘導体を含むポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、その断片および模倣体を作製する方法は、当業者に知られている。
第一の実施形態の配列およびCDR領域
表1Aは、本明細書において提供される抗体の例示的な可変領域および定常領域を提供する。
表1A-例示的な可変領域および定常領域
表1Aは、本明細書において提供される抗体の例示的な可変領域および定常領域を提供する。
表1A-例示的な可変領域および定常領域
ヒトキメラmAbの軽鎖可変アミノ酸配列である配列番号1は、残基31にイソロイシンを含み、これは、一実施形態では、代わりにロイシンを含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、軽鎖可変アミノ酸配列は、配列番号1を含む。一部の実施形態では、配列番号1および2のCDR領域は、アミノ酸残基27~32(CDR1)、50~53(CDR2)、および88~96(CDR3)を含む。
ヒトキメラmAbの重鎖可変アミノ酸配列である配列番号4は、残基101および102に二つのロイシンを含み、これは、一実施形態では、代わりに、二つイソロイシンを含んでもよく、別の実施形態では、一方の一にロイシンを、他方の一にイソロイシンを含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、重鎖可変アミノ酸配列は、配列番号5、6、または7を含む。一部の実施形態では、配列番号4~7のCDR領域は、アミノ酸残基26~33(CDR1)、51~58(CDR2)、および97~106(CDR3)を含む。
抗体および抗体断片
抗体および抗体断片
抗体AHO1402は、乳癌細胞株MDA.MB.231由来のタンパク質画分を使用して作製されたフィラミンAに対する市販のマウスIgG1k抗体である、Life Technologies社から得られるモノクローナル抗体である(Alperら、「Novel anti-filamin-A antibody detects a secreted filamin-A antigen in plasma from
patients with breast carcinoma and high-grade astrocytoma」、Cancer Sci.、100(9)巻、1748~1756頁、2009年、その全体が、参照により本明細書に取り込まれる)。
patients with breast carcinoma and high-grade astrocytoma」、Cancer Sci.、100(9)巻、1748~1756頁、2009年、その全体が、参照により本明細書に取り込まれる)。
本開示は、10-5M~10-11Mの特異的親和性で、可溶性形態または細胞関連形態のフィラミンAに結合することができる抗体または抗体断片;可溶性形態のフィラミンAに結合することができる抗体または抗体断片;可溶性フィラミンAの活性を選択的に低減することができる抗体または抗体断片;およびフィラミンAに結合することができる抗体または抗体断片を含む、フィラミンA抗原に対する抗体および抗体断片を含む。
抗体または抗体断片は、任意の抗体または抗体断片であることができ、限定されないが、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびscFv(キメラ抗原受容体、もしくはCARを含む)、または抗体もしくは抗体断片結合体であることができる。一態様では、抗体は、本開示のヒトフィラミンA抗原を同定するマウスモノクローナル抗体である。
一態様では、抗体または抗体断片は、脊椎動物の血液または他の体液において見られる任意のガンマグロブリンタンパク質であることができ、細菌およびウイルスなどの外来の対象物を同定し、中和するための宿主免疫システムによって使用され得る。一態様では、抗体または抗体断片は、抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびscFv、CAR、または抗体結合体から選択することができる。一部の実施形態において、scFvまたは他の抗体断片は、本明細書において提供される軽鎖可変領域、本明細書において提供される重鎖可変領域、およびリンカーを含む。本明細書において提供されるscFvの例示的なアミノ酸配列は、表1Bにおいて提供される。一態様では、抗体または抗体断片は、IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMなどの任意のタイプの免疫グロブリンタンパク質であり得る。一態様では、抗体は、IgGであり得る。
一態様では、抗体または抗体断片は、少なくとも一つの形態のフィラミンAの活性を低減することができる。一態様では、抗体または抗体断片は、可溶性形態のフィラミンAの活性を低減することができる。別の態様では、抗体または抗体断片は、分泌された形態のフィラミンAの活性を低減することができる。別の態様では、開示される抗体または抗体断片は、細胞表面と関連するフィラミンA抗原、例えば、細胞膜関連フィラミンA抗原、または細胞内小胞関連フィラミンA抗原の活性を低減することができる。したがって、本明細書において教示される抗体は、細胞によって取り込まれる可能性がある。一部の実施形態では、可溶性フィラミンAタンパク質は、勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定される通り、約250~280kDaの分子量を有し得る。一態様では、本開示の可溶性フィラミンA抗原は、リン酸化される。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、フィラミンA断片に結合する。例えば、一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、p180断片またはp100断片であるフィラミンAタンパク質に結合する。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、p180断片に結合する。
本開示の別の態様では、抗体または抗体断片を使用して、分泌された形態のフィラミンAを検出することができる。本開示の別の態様では、抗体または抗体断片を使用して、可溶性形態および分泌された形態または複数の形態のフィラミンAを検出することができる。本開示の別の態様では、抗体または抗体断片を使用して、フィラミンAエピトープまたはその断片を検出することができる。
本開示の一態様では、抗体または抗体断片は、可溶性形態のフィラミンAタンパク質に優先的に結合することができる。この態様では、フィラミンAへのこうした優先結合は、任意の他のタンパク質に対するものであってもよい。特定の態様では、フィラミンAへのこうした優先結合は、膜結合であるか、または関連するフィラミンAに対するものである。しかしながら、他の態様では、本明細書において教示される抗体または抗体断片は、非結合形態の抗原と比較して、細胞膜結合形態のフィラミンAタンパク質に優先的に結合することができる。したがって、膜結合形態のフィラミンA抗原、非膜結合形態のフィラミンA抗原、またはその両方に優先的に結合し得る抗体およびその断片が、本開示において提供される。
本開示の一態様では、抗体または抗体断片は、分泌された形態のフィラミンAタンパク質に優先的に結合することができる。本開示の別の態様では、抗体または抗体断片は、分泌された形態および可溶性形態または複数の形態のフィラミンAタンパク質に結合することができる。本開示の別の態様では、抗体または抗体断片は、本開示のフィラミンAエピトープまたはその断片に結合することができる。
本明細書で使用される場合、膜関連タンパク質または膜結合タンパク質は、細胞の検査時に、膜で局在化しているタンパク質である。膜結合タンパク質は、脂質二重層と少なくとも部分的に連結するものである。一態様では、それは、イオン相互作用を介して膜に結合される。別の態様では、膜結合タンパク質は、共有結合相互作用を介して膜に結合される。一態様では、膜結合タンパク質は、疎水性相互作用を介して膜に結合される。本明細書において教示される抗体は、前述の膜結合タンパク質、または膜関連タンパク質に結合してもよい。
本開示の一態様では、優先結合は、バックグラウンドに関する。別の態様では、優先結合は、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、1,000倍、10,000倍または1,000,000倍である。別の態様では、本開示の抗体は、膜形態のフィラミンAと比較して、可溶性形態のフィラミンAに優先的に結合する。特定の態様では、本開示の抗体は、核膜形態のフィラミンAと比較して、可溶性形態のフィラミンAに優先的に結合するか、または別の態様では、逆である。すなわち、一部の態様では、上記の優先結合は、細胞膜と関連するフィラミンA抗原に優先的に結合する教示された抗体の能力に関する。
一態様では、本明細書において教示される抗体または抗体断片は、約10-5M、約10-6M、約10-7M、約10-8M、約10-9M、約10-10M、約10-11M、もしくは約10-12Mより高い、または約10-8M~約10-11M、もしくは約10-9M~約10-10M、もしくは約10-10M~約10-11Mの特異的親和性で、分泌された形態もしくは可溶性形態(例えば、ヒト乳癌由来)、または膜結合形態のような、特定の形態のフィラミンAに結合する。一態様では、特異的活性は、競合結合アッセイを使用して測定される。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号12および13から選択される軽鎖CDR1配列を含む抗フィラミンA抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号14に記載の軽鎖CDR2配列を含む抗フィラミンA抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号15に記載の軽鎖CDR3配列を含む抗フィラミンA抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号16に記載の重鎖CDR1配列を含む抗フィラミンA抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号17に記載の重鎖CDR2配列を含む抗フィラミンA抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号18、19、20、および21から選択される重鎖CDR3配列を含む抗フィラミンA抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される軽鎖および重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3配列のいずれかを含む抗体を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号1および2から選択される軽鎖可変領域を含む抗フィラミンA抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号4、5、6、および7から選択される重鎖可変領域を含む抗フィラミンA抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される軽鎖および重鎖可変領域配列のいずれかを含む抗体を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、配列番号3または配列番号23を含む定常軽鎖領域を含む抗体を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号11または配列番号28を含む定常重鎖領域を含む抗体を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号1に記載の軽鎖可変領域および配列番号4に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンA抗体B185を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号1に記載の軽鎖可変領域および配列番号6に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンA抗体B405を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号1に記載の軽鎖可変領域および配列番号5に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンA抗体B406を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号1に記載の軽鎖可変領域および配列番号7に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンA抗体B407を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号2に記載の軽鎖可変領域および配列番号4に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンA抗体B408を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号2に記載の軽鎖可変領域および配列番号6に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンA抗体B409を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号2に記載の軽鎖可変領域および配列番号5に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンA抗体B410を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号2に記載の軽鎖可変領域および配列番号7に記載の重鎖可変領域を含む、抗フィラミンA抗体B411を提供する。一部の実施形態では、抗体B411は、それぞれ、配列番号13、14、および15に記載の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3、ならびにそれぞれ、配列番号16、17、および21に記載の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を含む。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される軽鎖および重鎖可変領域を含む細胞内抗体を提供する。一部の実施形態では、細胞内抗体は、本明細書において提供されるscFv配列を含む。本明細書において提供される例示的な細胞内抗体のアミノ酸配列およびDNA配列は、以下で表1Bにおいて提供される。一部の実施形態では、scFvまたは細胞内抗体は、配列番号67および69から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、scFvまたは細胞内抗体は、配列番号68および70から選択されるDNA配列を含む。
表1B.例示的なscFvまたは細胞内抗体配列
表1B.例示的なscFvまたは細胞内抗体配列
別の態様では、本開示の抗体または抗体断片を使用して、対象の組織内の乳癌を検出することができる。一部の実施形態では、本開示の抗体または抗体断片を使用して、例えば、生検試料、血漿または血清などの患者由来の任意の試料における癌を検出することができる。
本開示のさらなる態様は、組織標本、可溶性形態のフィラミンA抗原に優先的に結合することができる抗体と、当該標本内の可溶性形態のフィラミンA抗原の間の抗体と抗原の複合体を含む、組成物を提供する。本開示の一態様では、組織標本は、フィラミンAおよびその相同体の遺伝子産物の発現によって特徴付けられる疾患に罹患している患者由来のものである。本開示のさらなる態様では、患者は、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、頭頸部癌、または脳癌に罹患している。本開示の別の態様では、可溶性形態のフィラミンA抗原は、当該組織標本において過剰発現される。一態様では、本開示は、フィラミンAおよびその相同体の遺伝子産物の発現によって特徴付けられる、患者における疾患を検出するための当該組成物の使用を提供する。本開示の一態様では、当該組成物の免疫組織化学染色は、患者における疾患の存在を示す。本開示の一態様では、当該疾患は、乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、または頭頸部癌である。別の態様では、疾患は、乳癌、胃癌、大腸癌である。一態様では、疾患は、乳癌である。
一態様では、本開示のフィラミンA抗体は、治療から利益を得る可能性が高いフィラミンA抗体陽性癌細胞(転移性または非転移性)のサブセットを同定することができる。本開示のこのようなフィラミンA抗体は、治療から利益を得るであろう癌を有する患者のような、それを必要とする対象を同定する方法において使用することができる。本開示の方法は、本開示のフィラミンA抗体を使用して、血液、血漿、または血清中のより低いレベルのフィラミンAを検出する方法を含み得る。一態様では、方法は、現在利用可能な試験より疾患経過のより早期において、血漿中のフィラミンAを検出する。
抗体および抗体断片は、任意で、固相上に固定化され、検出可能に標識されるか、または細胞傷害性放射性核種、細胞傷害性薬物、もしくは細胞傷害性タンパク質などに結合され得る。
本開示の抗体および抗体断片は、細胞、哺乳類細胞、哺乳類癌細胞、ヒト細胞、およびヒト癌細胞によるフィラミンA抗原の発現を標的にすることができる。例示的な癌としては、ヒト乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、血液、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺および脳癌細胞の固形腫瘍が挙げられる。一態様では、抗体または抗体断片は、ヒト乳房、胃、および結腸細胞を標的にする。例示的な癌には、非固形癌も含まれる。例えば、癌には、急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)およびヘアリー細胞白血病などの急性白血病および慢性白血病を含む白血病;皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)などのリンパ腫、非皮膚末梢性T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)などのヒトT細胞リンパ栄養性ウイルス(HTLV)に関連するリンパ腫、ホジキン疾患および非ホジキンリンパ腫;ならびに多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない。発現されたフィラミンA抗原は、任意の形態の遺伝子産物を含み得るが、特定の態様は、可溶性形態または分泌された形態のフィラミンAの検出に関する。かかる抗原はまた、フィラミンA遺伝子の遺伝子産生された相同体、および癌細胞によって発現される改変フィラミンA抗原を含み得る。
一態様では、本開示は、重鎖CDR抗原結合部位のアミノ酸配列および軽鎖CDR抗原結合部位のアミノ酸配列を含む、フィラミンA抗原の優先結合を有する抗体または抗体断片を含む。本開示はまた、一つまたは複数の重鎖CDR抗原結合部位アミノ酸配列および一つまたは複数の軽鎖CDR抗原結合部位アミノ酸配列を含む、フィラミンA抗原の優先結合を有する抗体または抗体断片を含む。
本開示は、重鎖と軽鎖の両方のCDRのうちの一つまたは複数を有する抗原結合部位を有する、フィラミンA抗体または抗体断片を含む。本開示はまた、これらと実質的に相同であるか、または実質的に類似する結合特性をもたらす抗原結合部位を含有するフィラミンA発現産物に特異的な抗体および抗体断片も含む。かかる抗体またはその断片は、本開示のフィラミンA抗体由来のCDR重鎖または軽鎖のうちの一つまたは複数と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、または80%同一であり得る。
本開示はまた、正常細胞または癌細胞によって発現されるフィラミンA抗原に特異的である、新規タンパク質発現細胞株、およびそれらが分泌するモノクローナル抗体分子を含む。前述された通り、本明細書において作製される抗体は、一実施形態では、癌細胞、例えば、乳癌細胞によって産生される可溶性形態または分泌された形態のフィラミンAに結合することができる。しかしながら、他の実施形態では、本明細書において作製される抗体は、癌細胞、例えば、乳癌細胞によって産生されるか、または関連する膜結合形態または膜関連形態のフィラミンAと結合することができる。一部の実施形態では、本明細書において作製される抗体は、FLNaの可溶性または膜関連断片に結合することができる。
本開示は、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体を含む。本開示はまた、抗体断片、ならびに他の改変抗体および抗体断片を含む。
本開示はまた、フィラミンA抗原への優先結合を有するが、表1Aに含まれるものとは同一ではないFWRおよび/またはCDR抗原結合部位のアミノ酸配列を有する抗体および抗体断片を包含する。かかる抗体は、本開示のフィラミンA抗原またはその抗体断片に対して少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、または少なくとも50倍高い親和性でフィラミンA抗原に対して優先選択性であり得る。一態様では、本開示の抗体または抗体断片のバリアントは、本開示の非バリアント抗体または抗体断片としてフィラミンA抗原に対して特異的であり得るか、またはより特異的であり得る。
フィラミンAに特異的であるが、表1Aに含まれるものと同一ではないFWRおよび/またはCDR抗原結合部位アミノ酸配列を有し、表1Aに含まれるFWRおよび/またはCDRと同じまたは異なる特異性決定領域(SDR)を有し得る抗体および抗体断片が含まれる。
表1Aに記載されるアミノ酸配列に対する改変は、FWR配列およびCDR配列のいずれかまたは両方で起こり得る。一態様では、改変を別のフィラミンA抗体に行い、表1Aに記載される抗原結合部位の一つまたは複数のアミノ酸配列に一致させることができる。本開示の特定の態様によれば、抗体または抗体断片のバリエーションは、それらが実質的に相同なアミノ酸配列を有するか、抗体が、実質的に類似する結合特性を有するか、または両方の場合に生じ得る。本開示の一態様では、CDR抗原結合部位における単一のアミノ酸変化が存在し得る。フィラミンA抗体のアミノ酸配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化をフィラミンA抗体核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。かかる修飾には、例えば、フィラミンA抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および/またはそれらへの挿入および/または置換が含まれる。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを成して、最終コンストラクトに到達するが、但し、最終コンストラクトは、所望の特性を有する。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変更することのような、フィラミンA抗体の翻訳後プロセスを変更してもよい。
アミノ酸置換バリアントは、異なる残基によって置換された、フィラミンA抗体分子における少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発について最大の興味があるも部位は、超可変領域またはCDRを含むが、FWR領域における改変も企図される。
保存的置換は、類似の電荷または疎水性、例えば、(1)非極性:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M);(2)無電荷の極性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q);(3)酸性:Asp(D)、Glu(E);および(4)塩基性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)を有するものでアミノ酸を置換することを含む。
あるいは、天然に生じる残基は、共通の側鎖特性:(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性の疎水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性:Asp、Glu;(4)塩基性:His、Lys、Arg;(5)鎖の配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;および(6)芳香族:Trp、Tyr、Pheに基づいてグループに分けられてもよい。
特に具体化されたタイプの置換バリアントは、親抗体(例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体)の一つまたは複数の超可変領域残基を置換することを含む。概して、さらなる開発のために選択される得られるバリアントは、それらが生成される親抗体と比較して、改善された生物学的特性を有する。
本開示の抗体または抗体断片のヒト化バリアントは、AHO1402などのマウス抗体またはその抗体断片と比較したとき、低減したマウス含有量、および潜在的に、低減した免疫原性を含有し得る。ヒト化バリアントには、元の抗体または抗体断片のものと実質的に類似する結合親和性を保持するものが含まれる。本開示の態様は、1、2、3、4、5、または6つの(三つの重鎖および三つの軽鎖)CDRがヒト化されている、ヒト化フィラミンA抗体または抗体断片のCDRバリアントを提供する。別の態様では、本開示は、フィラミンA抗体および抗体断片の少なくとも一つのCDRの特異性決定残基(SDR)のみが、ヒト化抗体に存在する、ヒト化フィラミンA抗体および抗体断片のSDRバリアントを企図する。
CDRバリアントは、ヒト化フィラミンA抗体および抗体断片の少なくとも一つのCDRを、ヒト抗体由来の対応するCDRで置換することによって形成することができる。一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのCDRが、ヒト抗体由来の対応するCDRによって置換され、親フィラミンA mAbの結合親和性と実質的に類似する生物活性を保持するCDRバリアント。本開示のCDRバリアントは、親フィラミンA抗体または抗体断片の結合親和性より25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、63%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%である結合親和性を有し得る。
CDRバリアントは、フィラミンA抗体および抗体断片と比較したとき、変化した免疫原性を有し得、ヒト抗体および抗体断片の可変軽(VL)および可変重(VH)フレームワークに、本開示のフィラミンA抗体および抗体断片由来の全六つの(三つの重鎖および三つの軽鎖)CDRを移植することによって形成され得る。しかしながら、本開示の抗体が活性を保持するのを依然として可能にしながら、本開示のフィラミンA抗体および抗体断片のCDRの全六つ未満が存在する。特異性決定残基(SDR)などの抗原接触に直接関与する残基を精製することができる。SDRバリアントは、フィラミンA抗体または抗体断片の少なくとも一つのSDRを、ヒト抗体由来の対応する位置の残基で置換することによって形成される。なお、全てのCDRがSDRを含む必要はない。
一態様では、本抗体および抗体断片のバリアントは、ヒトにおける低減した免疫原性およびフィラミンAに対する親抗体または抗体断片のものと実質的に類似する結合親和性を有するバリアントを生成するためのCDRおよび/またはSDR置換の組み合わせを含む。
本明細書に具体的に記述されるバリアントに加えて、他の「実質的に相同な」改変された免疫グロブリンは、様々な組み換えDNA技術を使用して容易に設計し、製造することができる。例えば、フレームワーク領域(FWR)は、一次構造レベルで変化させることができる。さらに、様々な異なるヒトフレームワーク領域は、バリアントの基礎として単独でまたは組み合わせて使用することができる。概して、遺伝子の修飾は、部位特異的変異誘発およびランダム変異誘発などの様々な技術によって容易に達成され得る。
あるいは、一次抗体構造の一部のみを含むポリペプチド断片を作製することができ、断片は、バリアントの免疫反応性特性を実質的に保持する。かかるポリペプチド断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解切断により産生される断片、または部位特異的変異誘発を使用して所望の位置のヌクレオチド配列に終止コドンを挿入することによって産生される断片を含む。少なくともバリアントの免疫反応性断片を含む、一本鎖抗体および融合タンパク質も、本開示の範囲内に含まれる。
本開示による抗体およびそのバリアントは、治療活性を有するエフェクター部分に直接的または間接的に付着することができる。適切なエフェクター部分は、サイトカイン、細胞毒、放射性核種、薬物、免疫調節剤、治療用酵素、抗増殖剤などを含む。かかるエフェクターに抗体を付着させる方法は、当該技術分野で公知である。これらの結合した抗体は、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭、首、肺、血液、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺および脳の癌などの癌を含む、フィラミンAの発現によって特徴付けられる疾患の治療において使用するための医薬組成物を含む、任意の組成物に取り込むことができる。一態様では、細胞は、ヒト乳房、卵巣、頭部、頸部、または脳由来である。医薬組成物は、疾患を治療するために、このような治療を必要とするヒト患者を含み得る、哺乳動物に投与される。
抗体および抗体断片は、標識されるか、または標識されないかのいずれかであってもよい。標識されていない抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域に特異的な抗体などの、ヒト化抗体と反応性である他の標識された抗体(第二の抗体)と組合わせて使用することができる。あるいは、抗体は、直接標識することができる。放射性核種、フッ素、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、リガンド(特に、ハプテン)などのような、多種多様な標識を用いることができる。多数のタイプのイムノアッセイが利用可能である。
第二の実施形態の配列およびCDR領域
第二の実施形態の配列およびCDR領域
本開示の追加の配列は、以下の表2~5において見ることができる。
これらの配列は、特に、表1Aにおいて前述された配列由来の代替のCDR結合ドメイン領域に対応する。さらに、これらの結合ドメイン配列および全体的な抗体配列内のそれらの位置は、図28~31においてマッピングされる。
図28~31は、ヒトキメラ軽鎖可変CDR結合ドメイン領域(図28)、ヒトキメラ重鎖可変CDR結合ドメイン領域(図29)、マウス軽鎖可変CDR結合ドメイン領域(図30)、およびマウス重鎖可変CDR結合ドメイン領域(図31)について、Chothia、ABM、Kabat、およびContactにより予測されるCDR領域間の一致アライメント表す。
表2:ヒトキメラ軽鎖可変CDR結合ドメイン領域
表3:ヒトキメラ重鎖可変CDR結合ドメイン領域
表4:マウス軽鎖可変CDR結合ドメイン領域
表5:マウス重鎖可変CDR結合ドメイン領域
表2:ヒトキメラ軽鎖可変CDR結合ドメイン領域
CDR境界の同定を頻繁に使用して、多くが、抗原の抗体結合に重要であると考える配列を指摘する。したがって、CDRの定義は、超可変性の領域に焦点を当てる傾向があるが、抗体配列の鍵となるアミノ酸および位置も含む。結果として、これらの領域の境界は、配列データベースの解析のための基準の1設定に依存して変化し得る。データベース自体の組成も、結果に影響を与え得る。この点に関して、CDRを定義する境界は、システムごとに異なり得る。さらに、CDR/超可変領域の外側に位置するアミノ酸が、抗原の直接結合にも関与し得る既知の例もあるが、これは、必ずしもその特定のアミノ酸を含有する全ての抗体についての場合であるとは限らない。このため、抗原と直接相互作用し得るCDRおよび抗体位置を同定するいくつかの方法がある。
一態様では、本開示の範囲内で利用される配列データベースは、PDBからの構造データに加えて、Kabat、IMGT、PDBデータベースを含むいくつかのデータベースからの配列データを統合する、Abysisデータベース(www.bioinf.org.uk)である。Abysisシステムの使用において、医師は、Kabat、Chothia、Martin(強化されたChothia)、および接触情報によって定義されるCDR境界を同時に取得することができる。Kabatおよび他の抗体配列ナンバリングシステムは、異なってもよい。ナンバリングシステムに焦点を当てるよりむしろ、異なるシステム下でCDRを定義する実際のアミノ酸配列に焦点を当てる。Abysisデータベースに関する一般的な情報は、インターネットアドレスワールドワイドウェブ:bioinf.org.uk/abs/で見ることができ、これは、参照によりその全体で全ての目的のため本明細書に組み込まれる。
Abysis解析におけるCDR定義は、以下:(1)最も一般的に使用されるシステムである、配列変動に基づくKabat;(2)構造ループ領域の位置に基づく、Chothia;(3)Oxford Molecularの抗体モデリングソフトウェアに基づくKabatとChothiaの定義との間の妥協点である、Abysis-Martin(AbM);および(4)利用可能な複合体抗体と抗原結晶構造の分析に基づき、移植および変異誘発に有用である可能性が高い、Contactを含む。
結果は、前述のシステム間で常に100%一致しているわけではないが、これらの異なるシステムを使用することにより、抗原結合に重要であり得る抗体の領域をより良く理解することができる。本開示の抗体に関して、Abysis解析の結果は、表2~5および図28~31に詳述される。
抗原および本開示の抗体の結合領域
本開示の抗体およびその断片は、フィラミンA抗原に結合することができる。
本開示の抗体およびその断片は、フィラミンA抗原に結合することができる。
前述のように、本開示の一部の実施形態は、可溶性または分泌されたフィラミンA抗原に結合する。特定の態様では、可溶性または分泌されたフィラミンA抗原は、ヒト乳癌細胞に由来する。
一部の態様では、本開示の抗体によって結合される抗原は、参照によりその全体が全ての目的のため本明細書に組み込まれる、Alperら、「Novel anti-filamin-A antibody detects a secreted variant of filamin-A in plasma from patients with breast carcinoma and high-grade astrocytoma」、Cancer Sci.、100(9)巻、1748~1756頁、2009年において考察される抗原である。したがって、一部の態様では、本開示は、教示された抗体が、FLNaのカルパイン切断部位の上流(N末端)に結合し、約180kDa(p180、カルパイン部位のN末端)および約100kDa(p100、切断部位のC末端)のサイズの二つの断片を作製する、フィラミンA抗原モデルを提案する。このモデルでは、教示された抗体は、p100 C末端切断産物には結合しないがp280(全長)およびp180断片には結合しないように思われる。Alperら、2009年の図1cを参照されたい。
一部の態様では、本開示の抗体によって結合される抗原は、参照によりその全体が全ての目的のため本明細書に組み込まれる、Bachmanら、「Actin-binding protein filamin A is displayed on the surface of human neuroblastoma cells」、Cancer Sci.、97(12)巻、1359~1365頁、2006年において考察された、膜結合または膜関連フィラミンA抗原である。したがって、一部の態様では、本開示は、FLNaのC末端が、細胞外基質に曝露され、FLNaのN末端が、細胞質内に位置する、フィラミンA抗原モデルを提案する。このモデルでは、N末端のアクチン結合ドメインは、アクチン細胞骨格と会合し、一方、表面提示部分は、本明細書において教示される抗体を含む様々な細胞外リガンドとの相互作用を可能にする。
核酸分子および宿主細胞
本開示の抗体または抗体断片のいずれも、核酸によってコードされ得る。本開示は、かかる分子、かかる分子の断片、およびベクターに含まれるかかる分子などを含む。核酸分子はまた、かかる核酸分子の補体を含む。DNA分子とRNA分子の両方が、核酸分子の例である。
本開示の抗体または抗体断片のいずれも、核酸によってコードされ得る。本開示は、かかる分子、かかる分子の断片、およびベクターに含まれるかかる分子などを含む。核酸分子はまた、かかる核酸分子の補体を含む。DNA分子とRNA分子の両方が、核酸分子の例である。
別の態様では、本開示は、抗体分子の重鎖をコードする、単離DNA配列を提供し、抗体分子は、少なくともフィラミンAを含むフィラミンA抗原に優先結合を有し、重鎖の可変ドメインは、少なくとも一つ、二つ、または三つのCDRの抗原結合部位アミノ酸配列を有するCDRを含む。
なお別の態様では、本開示は、抗体分子の軽鎖をコードする、単離DNA配列を提供し、抗体分子は、少なくともフィラミンAを含むフィラミンA抗原に優先結合を有し、さらに、軽鎖の可変ドメインは、少なくとも一つ、二つ、または三つのCDRの抗原結合部位アミノ酸配列を有するCDRを含む。
別の態様では、本開示は、宿主細胞中の核酸分子を含む。かかる核酸分子は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得るか、またはプラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクターに存在し得る。本開示の核酸分子は、こうした宿主細胞に一過性に存在してもよい。一態様では、宿主細胞は、大腸菌;バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)を含むバチルス;サルモネラ、セラチアおよびシュードモナス、サッカロミセスを含む酵母を含む腸内細菌;ピキア・パストリス(Pichia pastoris);Sf9昆虫細胞;Sp2/0、VEROおよびHeLa細胞、ヒト胚性腎(HEK)細胞株、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株;W138、BHK、COS-7およびMDCK細胞株からなる群から選択される。一態様では、宿主細胞は、SKBR3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、およびZR75B細胞などの乳癌細胞株から選択される。別の態様では、宿主細胞は、PC3、DU145およびLNCap細胞などの前立腺癌細胞株から選択される。別の態様では、宿主細胞は、HT-29細胞などの大腸癌細胞株から選択される。別の態様では、宿主細胞は、A431細胞などの皮膚癌細胞株から選択される。別の態様では、宿主細胞は、BHK-21またはCOS-7細胞などの腎臓癌細胞株から選択される。別の態様では、宿主細胞は、A2780、A2780ADR、またはA2780cis細胞などの卵巣癌細胞株から選択される。別の態様では、これは、CHO細胞である。別の態様では、これは、肺癌細胞(例えば、A549細胞株)である。
フィラミンA抗体、細胞内抗体、または抗体断片を作製する方法
本開示のフィラミンA抗体または抗体断片は、例えば、MDA-MB-231乳癌細胞株からのタンパク質調製物で動物を免疫することによって発生させることができる。
本開示のフィラミンA抗体または抗体断片は、例えば、MDA-MB-231乳癌細胞株からのタンパク質調製物で動物を免疫することによって発生させることができる。
本開示は、組み換えDNAテクノロジーを使用してヒト化抗体を含む、モノクローナルキメラを作製するプロセスを含む。例えば、Antibodies、A Laboratory Manual(HarlowおよびLane編、Cold Spring Harbor Press、1988年)を参照のこと、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示のフィラミンA抗体または抗体断片は、フィラミンAに特異的な抗体または抗体断片を産生するマウスハイブリドーマを作製することを含むが、これに限定されない、任意の公知の方法によって産生され得る。ハイブリドーマは、例えば、マウス融合パートナー細胞とフィラミンAに対して免疫化されたマウス由来の脾細胞の融合によって形成され得る。マウスを免疫するために、様々な異なる従来のプロトコルに従うことができる。例えば、マウスは、抗原性調製物の一次免疫およびブースト免疫を受けることができる。
本開示は、細胞内抗体を作製する方法を提供する。フィラミンA特異的細胞内抗体は、例えば、細胞内でフィラミンA特異的scFvを発現させることを含む任意の公知の方法によって産生されてもよく、scFvは、細胞内局在化のために改変される。例えば、scFvをタンパク質とN末端および/またはC末端で融合させて、発現を補助し、安定性を増加させ、細胞内環境に対する抵抗性を増加させ、および/または特定の細胞内構造もしくは領域にscFvを標的化してもよい。一部の実施形態では、細胞内抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に、可変軽鎖領域、リンカー、および可変重鎖領域を含む。一部の実施形態では、細胞内抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端に、可変重鎖領域、リンカー、および可変軽鎖領域を含む。リンカーは、当該技術分野で公知の任意の融合タンパク質リンカーであってもよい。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、可撓性リンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、例えば、(GGGS)3(配列番号71)または(GGGGS)3(配列番号72)などのグリシン-セリンリンカーである。本明細書において提供される細胞内抗体の例示的なアミノ酸配列は、表1Bにおいて提供される。一部の実施形態では、scFvの可変重鎖および/または軽鎖は、ポリヒスチジンタグ、FLAGタグ、または当技術分野で抗体の他のタグなどのタグを含むか、またはそれらに連結される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、ヒスチジンタグ付き抗フィラミンA細胞内抗体を提供する。一部の実施形態では、細胞内抗体は、細胞内抗体の発現を助けるための融合タンパク質を含む。例えば、一部の実施形態では、融合タンパク質は、核、ER、ゴルジ装置、ミトコンドリア、リソソーム、または他の細胞内構造もしくは領域などの細胞内構造または領域に細胞内抗体を標的化する、GST、Ig-Fc、またはタンパク質配列などのscFvのN末端および/またはC末端に融合物を含む。
一部の実施形態では、細胞内抗体コンストラクトは、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、ルシフェラーゼ、またはその他などのレポーター遺伝子に遺伝子的に連結されている。一部の実施形態では、連結されたレポーター遺伝子は、それ自身のプロモーターによって駆動される。一部の実施形態では、連結されたレポーター遺伝子は、細胞内抗体プロモーターからの発現を駆動するためのIRES配列を介して駆動される。したがって、一部の実施形態では、細胞内抗体は、可変重鎖および軽鎖、タグ、ならびにレポーター遺伝子(例えば、Vh-Vl-His-IRES-GFPまたはVl-Vh-His-IRES-GFP)を含むフィラミンA特異的scFvを含む。一部の実施形態では、細胞内抗体は、EFプロモーターによって駆動される可変重鎖および軽鎖、タグ(例えば、Hisタグ)、ならびにIRES配列(例えば、EF-Vh-Vl-His-IRES-GFPまたはEF-Vl-Vh-His-G-IRE)によって駆動されるレポーター遺伝子(例えば、GFP)を含むフィラミンA特異的scFvを含む。一部の実施形態では、細胞内抗体は、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターを介して送達される。一部の実施形態では、細胞内抗体は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Reiserら、「Development of Multigene and Regulated Lentivirus Vectors」、Journal of Virology、74(22)巻、10589~99頁(2000年)のような、二相性レンチウイルスベクターを介して送達される。
一部の実施形態では、細胞内抗体は、細胞透過ペプチド、細胞膜を超えて細胞内抗体を転座させるための他の化学的部分またはナノキャリア送達システムを介して細胞に送達されるか、または転座されるタンパク質である。例示的な細胞透過ペプチド、他の化学的部分などは、当該技術分野で公知であり、アンテナペプチド配列、TAT、HIV-Tat、ペネトラチン、Antp-3A(Antp変異体)、バフォリンII、トランスポータン、MAP(モデル両親媒性ペプチド)、K-FGF、Ku70、プリオン、pVEC、Pep-1、SynB1、Pep-7、HN-1、BGSC(ビス-グアニジニウム-スペルミジン-コレステロール、およびBGTC(ビスグアニジニウム-トレン-コレステロール)を含むが、これらに限定されない。したがって、一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される抗体、例えば、scFvに融合されたタンパク質形質導入ドメインを含む融合タンパク質を提供する。ナノキャリア送達システムは、脂質ベースのナノキャリア(例えば、リポソームおよび他の脂質ベースのナノ粒子)、ポリマーベースのナノキャリア(例えば、ポリマーベースのリポソームまたはポリマーソーム)、無機ナノ粒子(例えば、シリカナノ粒子)、微粒子、および改変ウイルスまたはウイルス様粒子を含む。本明細書において提供される細胞内抗体は、当技術分野で公知の転位システムのいずれかを介してタンパク質として細胞に送達されてもよい。
細胞融合は、免疫学の分野の当業者に公知の手法によって達成され得る。融合パートナー細胞株およびハイブリドーマを融合させ、選択する方法ならびに抗体もしくは抗体断片をスクリーニング方法が、知られている。
本開示の抗体または抗体断片は、例えば、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔内に注射し、適切な時間後、高力価の抗体または抗体断片を含有する腹水を回収し、そこから抗体または抗体断片を単離することによって、大量に産生することができる。あるいは、インビトロでハイブリドーマ細胞を培養し、分泌された抗体または抗体断片を細胞培養培地から単離することによって、抗体および抗体断片を産生することができる。
本開示のフィラミンA抗体または抗体断片はまた、配列が発現制御配列に作動可能に連結された後、宿主細胞において適切なDNA配列を発現させることによっても産生され得る。このような発現ベクターは、多くの場合、エピソームとして、または宿主染色体DNAの不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。発現ベクターは、多くの場合、複製起点などの宿主細胞と互換可能な発現制御配列を含有する。さらに、発現ベクターは、遺伝子の発現を制御するためのプロモーターを、任意選択で、オペレーター配列と共に含み、転写および翻訳を開始し、完了するためのリボソーム結合部位配列等を有することができる。適切なプロモーターは、ポリヘドリンプロモーター、ラクトースプロモーターシ系、トリプトファンプロモーター系、β-ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダ由来のプロモーター系を含むが、これらに限定されない。発現ベクターはまた、選択マーカーを含み得る。フィラミンA抗体または抗体断片の軽鎖および重鎖をコードするDNA配列は、別個の発現ベクターに、または同じ発現ベクターに挿入され得る。
好適な宿主は、大腸菌;バチルス・スブチリスを含むバチルス、サルモネラ、セラチア、シュードモナスを含む腸内細菌などの原核生物を含むが、これらに限定されない。好適な宿主はまた、サッカロマイセスを含む酵母;ピキア・パストリス;Sf9昆虫細胞;Sp2/0、VEROおよびHeLa細胞、ヒト胚性腎(HEK)細胞株;チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株;W138、BHK、COS-7およびMDCK細胞株を含むが、これらに限定されない。他の適切な宿主はまた、既知の発現技術に従って使用することができる。
対象のDNAセグメントを含有するベクターは、細胞宿主のタイプに応じて変化する、任意の方法によって宿主細胞内に運ぶことができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクション、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーションまたはカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション(DOTAPなど)。首尾よく形質転換された細胞は、リガンドへの受容体の結合を検出するための様々な技術によって同定することができる。
発現された遺伝子産物は、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動を含むが、これらに限定されない、任意の方法に従って精製することができる。少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の実質的に純粋な免疫グロブリンが、想定される。
単離または精製されたDNA配列は、クローニングベクターまたは発現ベクターに組み込まれ、順に、宿主細胞を形質転換するために使用することができる。形質転換された宿主細胞は、宿主細胞の培養およびそれらが産生する抗体分子の単離を含む、フィラミンA抗原に対する特異性を有する抗体分子の産生のプロセスにおいて使用され得る。
キメラ抗原受容体形態のフィラミンA抗体
細胞外免疫療法として使用するため、フィラミンA抗体は、膜の細胞外側からのアクセスを必要とし得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、膜の細胞外側でフィラミンAに結合し、CAR-T療法などの細胞免疫療法において有用である。したがって、一部の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)形式でフィラミンA特異的抗体を提供する。例えば、本開示は、抗体、CAR、CARを発現する細胞を提供し、抗体、CAR、CARを発現する細胞は、細胞表面上で発現したフィラミンAに特異的に結合する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、フィラミンA抗体またはその断片(例えば、scFv)を含むフィラミンA特異的CARポリペプチドを提供する。さらなる実施形態では、CARポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通型ドメイン、および一つまたは複数の細胞外ドメインを含み、少なくとも一つの細胞外ドメインは、フィラミンA抗体またはその断片である。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン(例えば、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、およびそれらの任意の組み合わせ)ならびに/またはT細胞受容体(TCR)ゼータ鎖シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドのフィラミンA抗体またはその断片は、本明細書において提供される重鎖可変領域および軽鎖可変領域のCDR領域を含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドのフィラミンA抗体またはその断片は、本明細書において提供される重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において記載されるCARポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、フィラミンA抗体またはその断片を含むCARポリペプチドは、免疫細胞(例えば、T細胞、NK細胞、NK-T細胞、B細胞、マクロファージ、または幹細胞)上に発現される。さらなる実施形態では、免疫細胞は、T細胞である。したがって、一部の実施形態では、本開示は、細胞表面上でフィラミンAを発現する細胞にT細胞を標的化するCAR-T細胞などの操作された細胞を提供する。他の実施形態では、本開示は、フィラミンA CARを介して、細胞表面上でフィラミンAを発現する細胞にNK細胞またはNK-T細胞を標的化する操作されたNK細胞またはNK-T細胞を提供する。他の実施形態では、本開示は、CAR形式のフィラミンA抗体またはその断片を発現する操作されたマクロファージを提供し、操作されたマクロファージは、マクロファージが、細胞表面上でフィラミンAを発現する細胞を貪食するよう標的にする。一部の実施形態では、フィラミンA特異的抗体またはその断片(例えば、CAR発現免疫細胞上に発現される)は、細胞外フィラミンAを発現する癌細胞に優先的に結合する。
細胞外免疫療法として使用するため、フィラミンA抗体は、膜の細胞外側からのアクセスを必要とし得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、膜の細胞外側でフィラミンAに結合し、CAR-T療法などの細胞免疫療法において有用である。したがって、一部の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)形式でフィラミンA特異的抗体を提供する。例えば、本開示は、抗体、CAR、CARを発現する細胞を提供し、抗体、CAR、CARを発現する細胞は、細胞表面上で発現したフィラミンAに特異的に結合する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、フィラミンA抗体またはその断片(例えば、scFv)を含むフィラミンA特異的CARポリペプチドを提供する。さらなる実施形態では、CARポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通型ドメイン、および一つまたは複数の細胞外ドメインを含み、少なくとも一つの細胞外ドメインは、フィラミンA抗体またはその断片である。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン(例えば、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、およびそれらの任意の組み合わせ)ならびに/またはT細胞受容体(TCR)ゼータ鎖シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドのフィラミンA抗体またはその断片は、本明細書において提供される重鎖可変領域および軽鎖可変領域のCDR領域を含む。一部の実施形態では、CARポリペプチドのフィラミンA抗体またはその断片は、本明細書において提供される重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、本明細書において記載されるCARポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、フィラミンA抗体またはその断片を含むCARポリペプチドは、免疫細胞(例えば、T細胞、NK細胞、NK-T細胞、B細胞、マクロファージ、または幹細胞)上に発現される。さらなる実施形態では、免疫細胞は、T細胞である。したがって、一部の実施形態では、本開示は、細胞表面上でフィラミンAを発現する細胞にT細胞を標的化するCAR-T細胞などの操作された細胞を提供する。他の実施形態では、本開示は、フィラミンA CARを介して、細胞表面上でフィラミンAを発現する細胞にNK細胞またはNK-T細胞を標的化する操作されたNK細胞またはNK-T細胞を提供する。他の実施形態では、本開示は、CAR形式のフィラミンA抗体またはその断片を発現する操作されたマクロファージを提供し、操作されたマクロファージは、マクロファージが、細胞表面上でフィラミンAを発現する細胞を貪食するよう標的にする。一部の実施形態では、フィラミンA特異的抗体またはその断片(例えば、CAR発現免疫細胞上に発現される)は、細胞外フィラミンAを発現する癌細胞に優先的に結合する。
診断方法、アッセイ、およびキット
さらなる態様では、本開示は、本開示の抗体または抗体断片を含むフィラミンA抗原を検出するためのイムノアッセイを含む。
さらなる態様では、本開示は、本開示の抗体または抗体断片を含むフィラミンA抗原を検出するためのイムノアッセイを含む。
本開示はまた、表1Aにおいて記載される重鎖または軽鎖CDR抗原結合部位アミノ酸配列の一つまたは複数を有するモノクローナル抗体に結合する、フィラミンA抗原を含む、一つまたは複数のフィラミンA抗原を優先的に検出するためのイムノアッセイを含む。
かかるイムノアッセイは、(a)試料を、有効結合量の本開示の抗体または抗体断片の一つと接触させること、および(b)フィラミンA抗原への抗体の結合を検出することによって抗原を検出することを含むが、これらに限定されない、任意の適切な様式で使用され得る。本開示のイムノアッセイを使用して、フィラミンA抗原を発現する癌細胞、特に、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、血液、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺および脳がんからなる群から選択される癌、腫瘍、癌腫細胞または新生物疾患細胞を検出することができる。
さらなる態様では、本開示は、(a)本開示の抗体または抗体断片;および(b)検出可能な標識に結合された二次抗体を含む、癌の免疫組織化学的検出のためのキットを提供する。
さらなる態様では、本開示は、(a)表1Aにおいて記載される重鎖または軽鎖CDR抗原結合部位アミノ酸配列の一つまたは複数を有するモノクローナル抗体;および(b)検出可能な標識に結合された二次抗体を含む、癌の免疫組織化学的検出のためのキットを提供する。
キットは、フィラミンA抗原の試料をアッセイするための試薬を含み得、こうしたキットは、抗体、またはその断片もしくは模倣体などのフィラミンA抗原特異的親和性試薬、および/あるいは抗体、酵素基質などのような、シグナル産生システムの同じメンバーを含むイムノアッセイ装置;対象の検出アッセイを行うのに使用するための様々な緩衝液;試料中の一つまたは複数のフィラミンA抗原の量を決定するための参照などを含む。キットまたはキット形式の他の例は、参照によりその全体が全ての目的のため本明細書に組み込まれる、2008年8月8日に出願された米国特許出願第12/189,051号に対応する、米国特許出願公開第2008/0293162A1号において見られる。
さらなる態様では、本開示は、(a)癌を有すると疑われる患者から標本を取り出すこと;(b)標本を本開示の抗体または抗体断片と接触させること;および(c)抗原と抗体の複合体の存在を検出することを含む、ヒトにおける癌を診断する方法を提供する。一部の態様では、標識が使用され、検出される。癌を診断するこうした方法は、インビボまたはインビトロで実施することができる。
さらなる態様では、本開示は、(a)癌を有すると疑われる患者から標本を取り出すこと;(b)表1Aにおいて記載される重鎖または軽鎖CDR抗原結合アミノ酸配列の一つまたは複数を有するモノクローナル抗体と標本を接触させること;および(c)抗原と抗体の複合体の存在を検出することを含む、ヒトにおける癌を診断する方法を提供する。一部の態様では、標識が使用され、検出される。癌を診断する方法は、インビボまたはインビトロで実施することができる。
診断される癌は、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺、および脳の固形腫瘍からなる群から選択される癌を含む。細胞は、ヒト乳房、卵巣、頭部、頸部、および脳細胞をさらに含み得る。
一態様では、フィラミンAレベルは、年齢が一致した健康な対照と比較して、早期の乳癌患者においてより高い。別の態様では、フィラミンAレベルは、年齢が一致した健康な対照と比較して、中期の乳癌患者においてより高い。別の態様では、フィラミンAレベルは、年齢が一致した健康な対照と比較して、後期の乳癌患者においてより高い。一態様では、フィラミンAのレベルは、年齢が一致した健康な対照と比較して早期乳癌患者においてより高く、後期の乳癌において健康な対照レベルと類似する。フィラミンAレベルにおける増加は、一部の態様では、それらが、年齢が一致した健康な対照と比較して統計的に有意であることを意味する。健康な対照レベルと類似するレベルは、レベルが統計的に有意ではないことを意味し得る。一態様では、フィラミンAのレベルにおける統計的有意差は、マン・ホイットニー検定もしくはスチューデントt検定、または当技術分野で公知の任意の他の統計検定によって測定される、p<0.05のp値を有する。別の態様では、フィラミンAのレベルにおける統計的有意差は、マン・ホイットニー検定もしくはスチューデントt検定、または当技術分野で公知の任意の他の統計検定によって測定される、p<0.01のp値を有する。さらなる態様では、フィラミンAのレベルにおける統計的有意差は、マン・ホイットニー検定もしくはスチューデントt検定、または当技術分野で公知の任意の他の統計検定によって測定される、p<0.005のp値を有する。さらなる態様では、フィラミンAのレベルにおける統計的有意差は、マン・ホイットニー検定もしくはスチューデントt検定、または当技術分野で公知の任意の他の統計検定によって測定される、p<0.001のp値を有する。一部の実施形態では、患者間のレベルは、統計的に有意ではないが、結果は、依然として定量可能であり、癌を有する患者と正常な非癌性個体の間の差を示すことができる。
さらなる態様では、本開示は、(a)当該対象由来の標本を本開示の抗体または抗体断片と接触させること;および(b)乳癌を有する患者におけるフィラミンAの増加を検出すること、このような乳癌が、早期、中期、または後期であり得る、を含む、それを必要とする対象における乳癌を診断する方法を提供する。乳癌を診断するこうした方法は、インビボまたはインビトロで実施することができる。
診断される乳癌は、早期、中期または後期乳癌、またはその組み合わせのいずれかであり得る。
追加の態様では、本開示は、フィラミンAまたはその相同体の遺伝子産物の発現によって特徴付けられる疾患の治療、診断、または治療と診断の両方に有用な薬物を開発する方法を含む。これらの方法は、フィラミンAおよびその相同体によって発現される遺伝子産物を同定すること、およびフィラミンA抗体および抗体断片、阻害ペプチド、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ワクチン、ならびに遺伝子産物を特異的に標的とする化合物からなる群から選択される薬物の開発および同定におけるバイオマーカーとして、遺伝子産物を利用することを含む。
抗体および抗体断片は、フィラミンAの存在について、血清、痰、滲出物、尿、脳脊髄液などの体液をスクリーニングするためにイムノアッセイにおいて使用することができる。抗体および抗体断片は、適切な放射標識で標識されたとき、腫瘍細胞の原発または転移性病巣を検出するために、スキャンまたは放射撮像のため使用することができる。さらに、抗体は、疾患におけるリンパ節の関与を検出するためのリンパシンチグラフィーに有用である。
フィラミンA関連遺伝子産物に特異的な抗体または抗体断片のいずれかまたはすべて、および/またはそのヒト化などのキメラ、もしくは他のバリアントを含み得る、フィラミンA抗体または抗体断片は、治療上、またはアッセイ、インビボもしくはインビトロでの診断手法、および撮像の開発ならびに実施において使用され得る。抗体は、単独または医薬的に許容されるもしくは診断可能な担体製剤と組み合わせて使用することができる。フィラミンA抗体または抗体断片は、懸濁液または溶液として、医薬上または診断上許容可能な無毒性の無菌の担体に取り込まれ得る。これらは、別々に投与される組成物として、または化学療法剤もしくは免疫抑制剤と併せて投与され得る。
本開示は、医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と組み合わせて本開示の抗体または抗体断片を含む治療用および診断用組成物を含む。本開示はまた、本開示の抗体分子を医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と混合することを含む、治療用および診断用組成物の調製プロセスを含む。抗体分子は、治療用組成物または診断用組成物中の唯一の有効成分であり得るか、または他の抗体成分、例えば、抗T細胞、抗IFNγもしくは抗LPS抗体、またはキサンチンなどの非抗体成分を含む他の活性成分を伴ってもよい。組成物は、固形腫瘍、特に、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺および脳の固形腫瘍を含むが、これらに限定されない、フィラミンAの発現によって特徴付けられる疾患を診断または治療するためのキットに組み込まれ得る。細胞はまた、ヒト乳房、卵巣、頭部、頸部、または脳細胞であり得る。
本開示の抗体または抗体断片は、試料におけるフィラミンAまたはフィラミンAを生じる細胞を検出または定量するイムノアッセイに有用である。こうしたイムノアッセイは、典型的には、腫瘍抗原を同定することができる本開示の検出可能に標識された抗体の存在下で、それを必要とする対象由来の生物学的試料をインキュベートすること、および試料における結合する標識された抗体を検出することを含む。
本開示の一態様では、フィラミンA分布の観察を使用して、特定の疾患、例えば、乳癌と関連する段階を検出することができる。組織標本は、フィラミンA抗体とインキュベートされ得、得られたフィラミンA-抗原とフィラミンA抗体の複合体は、標準的な免疫組織化学染色を使用して検出され得る。
本開示の抗体が検出可能に標識され得る方法の一つは、それを酵素に連結させることによって検出可能に標識され、酵素免疫アッセイ(EIA)または酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で使用することができる。この酵素は、その後、その基質に曝露されたとき、例えば、分光光度手段、蛍光手段、または視覚手段によって検出され得る、化学的部分を生じる基質と反応する。代替の実施形態では、酵素を使用して、本開示の抗体の結合パートナーを標識する。かかる結合パートナーは、異種抗マウス免疫グロブリン抗体などの本開示の抗体の定常領域または可変領域に対する抗体であり得る。あるいは、結合パートナーは、本開示の抗体に結合することができる非抗体タンパク質であり得る。
本開示の抗体を放射性標識することによって、放射免疫アッセイ(RIA)の使用を通じてフィラミンAを検出することができる。放射性同位元素は、ガンマカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用のような手段により、またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。本開示の目的に特に有用である同位体は、当技術分野で公知である。
本開示の抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体が、適切な波長光に曝露されたとき、次に、その存在は、蛍光に起因して検出することができる。本開示の抗体はまた、化学発光化合物に結合させることによって検出可能に標識され得る。次いで、化学発光標識された抗体の存在は、化学反応の過程で発生する発光の存在を検出することによって決定される。生物発光化合物を使用して、本開示の抗体を標識することもできる。生体発光は、触媒タンパク質が、化学発光反応の効率を増加させる、生体系に見られる化学発光の一種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識の目的に重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびセコリンである。
抗体、断片または誘導体の検出は、例えば、検出可能な標識が放射性ガンマエミッターである場合、シンチレーションカウンターによって、または例えば、標識が蛍光材料である場合、蛍光光度計によって達成され得る。酵素標識の場合、検出は、酵素の基質を用いる比色法によって達成することができる。検出は、同様に調製された標準と比較して、基質の酵素反応の程度の視覚的比較によっても達成することができる。
生体内原位置での検出は、患者から標本を取り出すこと、標識抗体、または非標識抗体およびこのような標本の標識結合パートナーを用意することによって達成することができる。こうした手順の使用を通じて、抗原の存在だけでなく、調べた組織におけるその分布も決定することが可能である。本開示を使用して、当業者であれば、多種多様な組織学的方法(染色手法など)のいずれかが、そのような組織原位置での検出を達成するために改変され得ることを容易に認識するであろう。かかる方法は、例えば、免疫組織化学染色手法を含む。一態様では、アビジン-ビオチン免疫ペルオキシダーゼ染色システムを使用することができ、このシステムを利用するキットも意図されているが、本開示の方法は、当該技術分野で公知の任意の適切な染色手法を利用することができる。
本開示によるキットは、解凍することにより、または液体ビークル中で懸濁することにより再構成されるべき凍結または凍結乾燥された抗体を含み得る。キットはまた、担体または緩衝液を含み得る。別の実施形態では、キットは、抗体を再構成および使用するための指示書も含む。本開示のキメラ抗体およびヒト化抗体を含む抗体を用いるキットは、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、血液、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺、および脳の癌を含む、癌の免疫組織化学的評価のため使用することができる。細胞はまた、ヒト乳房、卵巣、頭部、頸部、および脳細胞であり得る。
免疫組織化学解析に必要な試薬を含むキットは、以下の通り提供することができる:(a)本開示のフィラミンA抗体もしくは抗体断片、またはそのキメラもしくはヒト化バリアント;(b)ブロッキング試薬(例えば、ヤギ血清の形態)および二次抗体(例えば、ヤギ抗マウス抗体など);(c)検出可能なマーカー(例えば、免疫ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなど);および(d)開発中の試薬。一次抗体(フィラミンA抗体もしくは抗体断片またはそのバリアント)は、一つより多くの二次抗体に結合することができる抗原として機能する。二次抗体は、一次抗体と、検出可能なマーカーおよび開発中の試薬(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ-アンチペルオキシダーゼ複合体)によって形成される複合体との間に「架橋」を形成する。
任意の適切な検出システムを、本開示の方法およびキットに従って使用することができる。このような検出システムは、免疫蛍光用途で広く使用され、フローサイトメトリー、顕微鏡、ウェスタンブロット、およびELISAを含むが、これらに限定されない技術を使用して撮像することができる。適切な検出システムは、順に、特異的な標的を検出するために使用される(本開示の文脈において、標的は、フィラミンA発現産物である)、一次タンパク質からのシグナルを増幅する(本開示の文脈において、増幅される一次タンパク質シグナルは、例えば、ビオチンなどのタンパク質で標識することができるか、またはできない、フィラミンA抗体に結合する)ために、二次抗体の結合体、コロイド状金の結合体、または二次タンパク質の結合体を利用することができる。
本開示の方法およびキットにおける使用に適切な二次結合体は、二次抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素の酵素結合体;アビジンまたはストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素の酵素結合体;タンパク質Aまたはタンパク質Gと西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素の酵素結合体;コロイド状金と二次抗体の結合体;コロイド状金とアビジンまたはストレプトアビジンの結合体;磁気粒子と二次抗体の結合体;および二次抗体と蛍光色素およびビオチンなどの標識の結合体を含み得るが、これらに限定されない。本開示は、任意の特定の検出システムに限定されず、本開示に従って、これらまたは他の検出システムを利用することは、当業者の能力の範囲内とみなされる。これらの二次結合体(本開示の文脈において標識とも呼ばれる)は、抗原と抗体の複合体を可視化するのに有用である。
本開示の抗体または抗体断片はまた、「二つの部位」または「サンドイッチ」アッセイとしても知られる、免疫測定アッセイにおける利用に適合され得る。典型的な免疫測定アッセイでは、非標識抗体(または抗体の断片)の量は、試験される流体中で不溶性である固体支持体に結合し、検出可能に標識された可溶性抗体の量が、固相抗体、抗原と標識された抗体の間で形成される三元複合体の検出および/または定量を可能にするよう適合される。
本開示の抗体または抗体断片を使用したヒト乳房、卵巣、頭部、頸部、および脳癌ならびに他の癌を含む、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、血液、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺および脳のインビボ撮像の目的のため、当業者に公知の多くの異なる標識および標識方法が存在する。本開示で使用され得る標識の種類の例は、放射性同位体、常磁性同位体、および陽電子放出断層撮影(PET)によって撮像され得る化合物を含む。
装置
装置
上述のように、対象の方法の実践における使用を見い出す装置も提供される。対象の方法を実施するための装置は、少なくとも、フィラミン分析物のための対象由来の試料をアッセイするための試薬を含み、このような装置は、固体支持体の表面に固定された抗体、またはその断片もしくは模倣体などのフィラミン分析物特異的親和性試薬を含み得る。一部の実施形態では、フィラミン分析物は、フィラミンA分析物である。
装置を用いて実施される方法において要求されるか、または所望される追加の品目が存在してもよく、追加の項目は、患者試料を得るための手段、例えば、シリンジ;ヘパリン、 Ficoll-Hypaque、溶解緩衝液、プロテアーゼ阻害剤等のような、患者由来試料の調製に必須の一つまたは複数の試薬;対象の装置を使用して対象の方法を行うための指示書;異常なレベルのフィラミン分析物を含む新生物疾患の存在を検出し、および/または特徴決定するために使用される追加の生化学アッセイ由来の一つまたは複数の試薬を含むが、これらに限定されない。
多数のこうした装置が、当該技術分野で公知である。一つの非限定的な例では、装置は、少なくとも三つの領域、流体輸送領域、試料領域、および測定領域を有する、好適なフィルターまたは膜の連続的な流路を概して採用する。試料領域は、試料を受け取る前に、流路の他の部分と流体移動接触することを妨げる。試料領域が、試料を受け取った後、他の領域と流体移動関係に持ち込まれ、流体と接触した流体移動領域は、試薬溶液が、試料領域を通り、測定領域内に入ることを可能にする。測定領域は、それを第一の親和性試薬、ならびにアッセイされる試料および上述のように行われるサンドイッチアッセイと組み合わせた第二の標識された親和性試薬と結び付け得る。
別の、フィラミン分析物に特異的に結合する、抗体、またはその断片もしくは模倣体などの親和性試薬に結合する表面に限定される例では、装置はディップスティックである。こうした例示的な装置では、ディップスティックは、ディップスティックに結合した親和性試薬へのフィラミン分析物の結合を可能にするのに十分な時間、対象由来の試料(例えば、血液、血清、または尿)に直接挿入される。次いで、ディップスティックは、抜去され、必要に応じて洗浄されて、非特異的に結合した物質を除去してもよい。次いで、ディップスティックは、フィラミン分析物に特異的に結合する、抗体、またはその断片もしくは模倣体などの検出可能に標識された第二の親和性試薬を含有する容器に挿入される。フィラミン分析物と親和性試薬の複合体への第二の抗体の結合に十分な時間インキュベーションした後、ディップスティックは、洗浄され、第二の親和性試薬の結合が、標準的な手段によって検出されてもよい。第二の抗体の検出に必要な場合、ディップスティックは、第二の抗体上の検出可能な標識を活性化する試薬を含有する第二の容器に挿入されてもよい。
医薬組成物および治療方法
本開示の別の態様は、任意選択で、医薬的に許容される担体と組み合わせた、開示された抗体のいずれかを含む組成物を提供する。別の態様では、本開示の抗体は、任意選択で、一つまたは複数の有効な剤、薬物、他の抗体、またはホルモンと組み合わされる。
本開示の別の態様は、任意選択で、医薬的に許容される担体と組み合わせた、開示された抗体のいずれかを含む組成物を提供する。別の態様では、本開示の抗体は、任意選択で、一つまたは複数の有効な剤、薬物、他の抗体、またはホルモンと組み合わされる。
本開示はまた、乳房、卵巣、子宮頸部、前立腺、結腸、胃、腎臓、肝臓、頭部、頸部、肺、血液、膵臓、皮膚、精巣、甲状腺および脳、ならびにヒト乳房、卵巣、頭部、頸部、および脳、特に、ヒト乳房細胞の固形腫瘍などの、フィラミンAを発現する癌に罹患しているか、またはリスクがあるヒトまたは動物対象を治療する方法を提供し、方法は、対象に、治療有効量の本開示の抗体、または治療上有効量の本開示の抗体を含む医薬組成物を投与することを含む。本開示はまた、フィラミンAを発現する癌に罹患しているか、またはリスクがあるヒトまたは動物対象を治療する方法における本明細書において提供される抗体の使用;およびフィラミンAを発現する癌に罹患しているか、またはリスクがあるヒトまたは動物対象を治療するための医薬の製造における本明細書において提供される抗体の使用を提供する。さらに、本開示は、フィラミンAを発現する癌に罹患するか、またはリスクのあるヒトまたは動物対象を治療する方法における使用のための、本明細書において開示される抗体、および/または本明細書において開示される抗体を提供する。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒト患者または対象を含む、治療を必要とする任意の対象を指す。
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、標的の疾患もしくは状態を治療するか、改善するか、もしくは予防するため、または検出可能な治療もしくは予防効果を示すために必要な治療剤の量を指す。
任意の抗体について、治療有効用量は、まず、細胞培養アッセイにおいて、または通常齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、または霊長類における動物モデルのいずれかにおいて推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲および投与経路を決定することもできる。次いで、こうした情報を使用して、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。
ヒト対象の有効量は、疾患状態の重症度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の回数および頻度、薬物併用、反応感受性および療法に対する抵抗性/応答に依存し得、日常的な実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。概して、有効用量は、約0.001mg/kg~約100mg/kg、または約0.01mg/kg~約50mg/kg、または約0.1mg/kg~約20mg/kg、または約1mg/kg~約15mg/kgであり得る。
組成物は、患者に個別に投与することができ、または他の薬剤、薬物、抗体、またはホルモンと組み合わせて投与することができる。一部の態様によれば、抗体は、これらの薬剤と結合され得る。本開示の抗体が治療上使用され得る方法の概要は、補体細胞またはエフェクター細胞のいずれかによって媒介されるか、または抗腫瘍薬、毒素、および放射性核種に結合された抗体による直接細胞毒性を含む。したがって、本開示は、本開示の抗体を投与することを含む癌を治療する方法を提供し、抗体は、癌細胞を標的とし、ADCCおよび/またはCDCを誘導する。さらに、本開示は、標的治療薬に連結されたか、または結合された本開示の抗体を投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、細胞によって貪食され、これにより、フィラミンA発現細胞に標的治療薬を送達することができる。したがって、本開示は、医薬的に許容される担体中に本明細書において提供される抗体、ならびに医薬的に許容される担体において、治療剤に連結または結合されたコンジュゲートされる本明細書において提供される抗体を含む医薬組成物を提供する。抗体は、血液循環または骨髄から腫瘍細胞の生体外除去にも使用することができる。
細胞傷害性タンパク質は、リシンA、シュードモナス毒素、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子を含み得るが、これらに限定されない。診断用放射性核種および細胞傷害性放射性核種などの細胞傷害性薬剤、薬物およびタンパク質も、本開示の抗体に結合され得る。抗体に結合され、抗原のインビボ部位に選択的に送達され得る放射性核種の例は、特に212Bi、131I、186Re、および90Yを含む。放射性核種は、放射線療法の技術分野で公知である、細胞を局所的に照射することによってその細胞傷害性効果を発揮し、これにより、様々な細胞内病変をもたらし得る。抗体に結合され、その後インビボ療法に使用され得る細胞障害性薬物の例は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびマイトマイシンCを含むが、これらに限定されない。細胞傷害性薬物は、DNA、RNA、およびタンパク質合成を含む重要な細胞プロセスと干渉し得る。
本開示の抗体分子が投与される用量は、治療されるべき状態の性質、および抗体分子が、予防的に使用されているか、または既存の状態を治療するために使用されているかどうかに依存する。予防的に、すなわちワクチンとして投与される場合、抗体は、対象において免疫応答を誘発するのに有効な量で投与される。
抗体分子が、短い半減期(例えば、2~10時間)を有する場合、1日当たり1回または複数の用量を与えるのに必要であり得る。あるいは、抗体分子が、長い半減期(例えば、2~15日)を有する場合、1日1回、週1回、または1か月もしくは2か月に1回のみ投与することが必要であり得る。
医薬組成物はまた、抗体の投与のための医薬的に許容される担体を含有し得る。担体は、それ自体、組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生を誘導するべきではなく、毒性であるべきではない。好適な担体は、当該技術分野で公知のものを含み、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子などの大型のゆっくりと代謝される巨大分子から選択され得るが、好適な担体は、これらの例に限定されない。
一実施形態では、投与のための形態は、例えば、注射または注入による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与に適した形態を含む。生成物が注射または注入用である場合、油性または水性ビークル中の懸濁液、溶液、またはエマルションの形態をとり得、懸濁剤、保存剤、安定化剤、および/または分散剤などの配合剤を含有し得る。あるいは、抗体分子は、適切な無菌の液体を用いた使用前に再構成するための、乾燥形態であってもよい。
一旦製剤化されると、本開示の組成物は、対象に直接投与され得る。治療されるべき対象は、動物またはヒトであり得る。
本開示の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所的、舌下、膣内または直腸経路を含むが、これらに限定されない、任意の数の経路によって投与され得る。皮下噴霧器を使用して、本開示の医薬組成物を投与することができる。治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製することができる。注射前の液体ビークル中の溶液または懸濁液に適した固体形態も調製され得る。
組成物の直接送達は、概して、皮下、腹腔内、静脈内、もしくは筋肉内注射により達成されるか、または組織の間質腔に送達され得る。投与処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。
抗体または抗体断片組成物が、消化管を使用した経路によって投与されるべきであるとき、組成物は、分解から抗体を保護するが、消化管から吸収されたら抗体を放出する追加の薬剤を含有し得る。こうした追加の薬剤は、当業者に周知である。
本開示の抗体はまた、遺伝子療法を行う方法で投与され得る。これを達成するために、適切な発現成分の制御下で抗体分子の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列は、抗体鎖が核酸配列から発現され、その場で構築されるように、患者に導入される。例えば、細胞内抗体コンストラクトは、プラスミドコンストラクト(例えば、細胞内抗体発現をもたらすための真核生物のプロモーターを含むプラスミド)、ウイルスベースのコンストラクト(例えばレンチウイルスもしくはレトロウイルスベクター)、または非ウイルスベースの送達ビークル(例えば、脂質ベースまたはぴりまーベースの送達ビークル)として細胞内に送達されてもよい。細胞内抗体コンストラクトは、DNAまたはRNAとして送達されてもよい。あるいは、組み換え細胞内抗体タンパク質コンストラクトは、細胞膜膜透過ペプチドを有するタンパク質を介して、または化学的もしくは機械的送達システムを介して細胞に送達されてもよい。
本開示の抗体はまた、免疫細胞を介してCAR形式で投与することができる。一部の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する細胞を含む医薬組成物を提供し、CARは、本明細書において提供されるフィラミンA結合ドメインを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、免疫細胞(例えば、T細胞、NK細胞、B細胞、または幹細胞)を含む。さらなる実施形態では、免疫細胞は、T細胞である。したがって、一部の実施形態では、本開示は、細胞表面上でフィラミンAを発現する細胞にT細胞を標的化するCAR-T細胞を含む医薬組成物を提供する。
実施例1:ヒトキメラフィラミンA抗体の調製
モノクローナルマウスフィラミンA IgG1k抗体であるAHO1402を、95%BSAおよび5%抗体の溶液においてLife Technologies社から得た。BSAを除去し、抗体を精製するために、抗体を単離し、ゲル電気泳動で精製し、サイズで分離し、ゲルから切り出した。
モノクローナルマウスフィラミンA IgG1k抗体であるAHO1402を、95%BSAおよび5%抗体の溶液においてLife Technologies社から得た。BSAを除去し、抗体を精製するために、抗体を単離し、ゲル電気泳動で精製し、サイズで分離し、ゲルから切り出した。
抗体を含むゲルスライスを、次いで、配列を再構築するための重複ペプチド配列解析により編集される配列情報を得るための高分解能MS/MSペプチド決定を利用する、データベース支援ショットガンシーケンシング(DASS)技術を利用した新規シーケンシングに供した。DASS法は、一般に、Creative Biolabsのウェブサイト(http://www.creative-biolabs.com/next-generation-antibody-sequencing.html)に記載される。
次いで、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン用に構築したアミノ酸配列を、本発明者が選択したマウス定常領域配列およびヒト定常領域配列に付加した。特定のアミノ酸選択を、軽鎖CDR1の位置31で、ならびに重鎖CDR3の位置101および102で行った。様々な変異を示すアミノ酸配列を、上記表1Aにおいて提供する。
次いで、これらのアミノ酸配列を、哺乳類細胞発現のためのコドン最適化を用いて逆翻訳した。再構成した遺伝子の核酸配列を、さらなる使用前に忠実性について確認し、次いで、発現ベクターにクローニングした。次いで、発現ベクター中のクローニングした遺伝子を、HEK293細胞に遺伝子導入し、組み換えmAbタンパク質を精製した。
実施例2:scFvの調製および特徴決定
重鎖可変領域および軽鎖可変領域をscFvベクターシステムにサブクローニングして、二つの可能な配向、軽鎖-重鎖(VL-VHまたはvl-vh)および重鎖-軽鎖(VH-VLまたはvh-vl)でscFvを生成した。
重鎖可変領域および軽鎖可変領域をscFvベクターシステムにサブクローニングして、二つの可能な配向、軽鎖-重鎖(VL-VHまたはvl-vh)および重鎖-軽鎖(VH-VLまたはvh-vl)でscFvを生成した。
得られた単鎖抗体を、細胞の免疫蛍光染色、細胞運動性、増殖、アポトーシス、および機能的生物活性を評価する他のアッセイを含むアッセイで試験する。
scFvを、診断検査および疾患、例えば、乳癌を治療する方法における使用のためにさらに評価する。
実施例3:細胞運動アッセイ
細胞運動アッセイを、本開示の作製したmAb(マウス抗体B186、ヒトキメラ抗体B185、およびヒトキメラ抗体B411)の機能活性を探索する際に利用した。
細胞運動アッセイを、本開示の作製したmAb(マウス抗体B186、ヒトキメラ抗体B185、およびヒトキメラ抗体B411)の機能活性を探索する際に利用した。
活性の根拠を、マウスとヒトキメラ抗体の両方を用いて得た。しかしながら、驚くべきことに、ヒトキメラmAbは、マウスmAbよりも強い生物活性を示した。効果はまた、コラーゲン被覆表面よりもフィブロネクチン被覆組織培養表面でより顕著であった。
細胞運動アッセイは、http://www.platypustech.com/discoverAssay.htmlで一般的に記載される、Platypus Technologies ORIS(商標)細胞遊走アッセイプラットフォームを利用した。
3D反復を含むこうした運動アッセイは、癌細胞の浸潤性および悪性と相関していると認識され、したがって、癌転移および他の活性の代替である。
具体的には、本開示のフィラミンA抗体を、三重被覆96ウェルプレート(Platypus # CMATR1.101)を使用したORIS(商標)細胞遊走アッセイにおいて評価した。細胞を約50,000細胞/ウェルで播種した。HEK-293細胞の場合、DMEMにおいて、MDA-MB-231細胞の場合、10%のFBSを含有するL-15において、細胞を37℃、CO2なしで一晩インキュベートした。細胞増殖チャンバを覆うストッパーを、ORIS(商標)ストッパーツールを使用して取り除き、成長培地を取り除き、ウェルを無菌PBS100マイクロリットルでやさしく洗浄した。染色工程が、遊走前の対照としての役目を果たすまで、参照ウェル内にストッパーを定位置に置いた。洗浄後、特定の処理を含有する新鮮培養培地の体積100マイクロリットルを各ウェルに加えた。次いで、細胞を一晩インキュベートさせた。インキュベーション期間の終了時に、細胞をカルセインAMで30分間蛍光染色した。次いで、蛍光を、検出マスクを定位置に置いたマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
図1および図2は、各状態についての検出ゾーンに存在する相対蛍光単位(RFU)を示す(平均±標準偏差、n=2ウェル/状態)。
細胞を含有するウェルは、三つの形態:コラーゲンで被覆、フィブロネクチンで被覆、または組織培養(TC)処理で存在した。
ウェル処理は、以下の通りであった:抗体対照なし、マウス抗体(mAb FLNA 1mcg/ml)、マウス抗体(mAb FLNA 20mcg/ml)、ヒトキメラ抗体(hAb FLNA 1mcg/ml)、ヒトキメラ抗体(hAb FLNA 20mcg/ml)、アピシン(100nM)、サイトカラシンB(30マイクロモル);図1を参照。RFU数の増加は、細胞運動性の増加と相関する。
細胞運動アッセイの結果
細胞遊走は、コラーゲンまたはフィブロネクチンで被覆したウェルにおいて最大であった。組織培養処理ウェルに関して、細胞骨格線維の相互作用を中断することが知られており、したがって運動性を阻害すると予想される、サイトカラシンBを除き、処理全体に渡って効果はほとんどないようである。
細胞遊走は、コラーゲンまたはフィブロネクチンで被覆したウェルにおいて最大であった。組織培養処理ウェルに関して、細胞骨格線維の相互作用を中断することが知られており、したがって運動性を阻害すると予想される、サイトカラシンBを除き、処理全体に渡って効果はほとんどないようである。
TC表面上の抗体処理に対する応答の明らかな欠如は、おそらく、細胞接着を補助し、細胞シグナル伝達およびプロセス、ならびに遊走に影響を与えることが知られている、コラーゲンまたはフィブロネクチンなどの細胞外タンパク質の欠如によるものである。抗体は、毒性であるとは予想されず、したがって、毒性成分はない。したがって、細胞は遊走し、フィラミンA抗体によって影響を受けない。図2を参照のこと。
フィブロネクチンおよびコラーゲン被覆ウェル内では、細胞遊走は、より低濃度の抗体(すなわち、1μg/mL対20μg/mL)で最も少ない。
コラーゲン被覆ウェル中のマウス抗体は、判定時点で大きな差異をもたらさなかった。しかしながら、ヒトキメラ抗体は、コラーゲン被覆ウェルにおける細胞運動性に対する阻害効果を示した。図1および図2を参照のこと。
フィブロネクチンについて、マウスおよびヒトキメラ抗体の両方を用いた細胞運動の減少が、より低い濃度(1μg/mL)で存在する。しかしながら、ヒトキメラ抗体は、マウス抗体よりも実質的に低いレベルの細胞運動性をもたらすと見ることができる。実際に、ヒトキメラ抗体は、マウス抗体と比較して、細胞の運動性の阻害においてほぼ100%の差異、すなわち、マウス抗体については191.34RFU、ヒトキメラ抗体については106.26RFUを示した。図1および図2を参照のこと。
1検査当たり2点のみの場合、コラーゲンまたはフィブロネクチンによって増強された細胞拡大および運動性に対するモノクローナル抗体の効果を示す傾向が見られる。
図2に見られる全体的な傾向は、ヒトキメラ抗フィラミンA抗体が、マウスフィラミンA抗体と比較して優れた結果をもたらすことである。
1μg/mL濃度では、ヒトキメラmAbは、コラーゲンとフィブロネクチン処理ウェルの両方で細胞遊走の減少をもたらした。これは、コラーゲン処理ウェルにおける細胞遊走の減少につながらず、特定の終点読取りでのヒトキメラmAbと比較して、フィブロネクチン処理ウェルにおける低減の喪失につながる、マウスmAbとは対照的である。
より高い抗体濃度における効果の欠如の原因は不明であるが、価数相互作用によって説明し得る。より低い抗体濃度で、単一の抗体分子が、細胞表面またはプレート表面で二つのフィラミンA分子を架橋し、結合することができる可能性がより高い。より高い抗体濃度で、全ての結合部位を、1個の抗体当たり一つのフィラミンA結合のみを有する別個の抗体によって取り込んでもよく、そのため架橋結合は生じない。したがって、架橋結合は、フィラミンA運動機能に干渉し得る。これは、投与の最適条件を示唆する。
実施例4:免疫蛍光(IF)アッセイ
MDA-MB-231乳癌細胞株を用いた免疫蛍光アッセイを使用して、フィラミンA
mAbの特徴決定を行った。これは、Life Technologies AHO1402 mAbの選択をもたらしたマウスを免疫化する抗原調製物を生成する際に利用する細胞株である。比較のため、AHO1402 mAbおよび別の市販のmAbであるTI10(Millipore MAB1680-C)を同時にアッセイした。TI10およびAHO1402 mAbが、細胞上の異なる染色パターンをもたらし、これが、異なる形態のフィラミンAタンパク質を認識することを示していることが、既にしめされた(Alperら、2009年)。
MDA-MB-231乳癌細胞株を用いた免疫蛍光アッセイを使用して、フィラミンA
mAbの特徴決定を行った。これは、Life Technologies AHO1402 mAbの選択をもたらしたマウスを免疫化する抗原調製物を生成する際に利用する細胞株である。比較のため、AHO1402 mAbおよび別の市販のmAbであるTI10(Millipore MAB1680-C)を同時にアッセイした。TI10およびAHO1402 mAbが、細胞上の異なる染色パターンをもたらし、これが、異なる形態のフィラミンAタンパク質を認識することを示していることが、既にしめされた(Alperら、2009年)。
本開示のマウスとヒトキメラ抗体の両方は、p280またはクローン209#13としても知られる、市販のAHO1402で観察したものと類似する点状染色パターンをもたらした。TI10の染色パターンは異なり、細胞質の一般的な染色を明らかにした。この結果に基づき、マウスmAbおよびヒトキメラmAbの結合は、AHO1402 mAbの結合と類似したと結論付けた。
免疫蛍光アッセイで利用し一次抗体は、以下の通りであった:
抗フィラミンA、クローンTI10(Millipore,p/n MAB1680-C)
抗フィラミンA、クローン209#13(Life Technologies社、p/n AHO1402)
抗フィラミンA、マウスmAb
抗フィラミンA、ヒトキメラmAb
抗ベータアクチン、ウサギポリクローナル(Rockland、p/n 600-401-886S)。
抗フィラミンA、クローンTI10(Millipore,p/n MAB1680-C)
抗フィラミンA、クローン209#13(Life Technologies社、p/n AHO1402)
抗フィラミンA、マウスmAb
抗フィラミンA、ヒトキメラmAb
抗ベータアクチン、ウサギポリクローナル(Rockland、p/n 600-401-886S)。
免疫蛍光染色の二つの主要な方法を利用した。第一の方法は、Alperら、2009年において記載される、 固定剤としてのメタノールおよび透過化剤として0.2%トリトンを用いた単一染色または二重染色を含む。第二の方法は、固定剤として2%パラホルムアルデヒドおよび透過化剤として0.2%トリトンを用いた二重染色技術を利用する。
一次抗体を、濃度1.25mcg/mlで、室温で1時間、固定および透過処理した細胞と共にインキュベートした。一つまたは複数の洗浄工程後、二次抗体を、室温で1時間、細胞とインキュベートした。対応する濃度を使用したアッセイで利用した二次抗体は、以下の通りである:
1.25μg/ml抗マウスIgG(H&L)(ロバ) DYLIGHT(商標)4885.0μg/mL抗ヒトIgG(H&L)(ロバ)フルオレセイン
1.25μg/ml F(ab’)2 抗ウサギIgG[H&L](ロバ)ローダミン。
1.25μg/ml抗マウスIgG(H&L)(ロバ) DYLIGHT(商標)4885.0μg/mL抗ヒトIgG(H&L)(ロバ)フルオレセイン
1.25μg/ml F(ab’)2 抗ウサギIgG[H&L](ロバ)ローダミン。
メタノールおよびトリトン固定/透過技術を用いた第一の方法を利用することは、細胞の完全性を有意に損ない、DAPI染色を核から漏出させる、図3~18を参照のこと。第一の方法を利用することにより、Alperら、2009年によって記載される染色パターンと一致する、クローンTI10(図3、11、および12)ならびにAHO1402(図4、13、および14)における点状染色パターンが明らかになる。
同じ方法を使用しながら、マウス(図5、15、および16)およびヒトキメラ(図6、17、および18)モノクローナル抗体は、前述の抗体に見られる点状染色パターンを再現した。
したがって、マウスmAbおよび開発したヒトキメラmAbは、前述のAHO1402抗体と類似の形態のフィラミンAに結合するように思われる。
ベータ-アクチン染色(図7)は、二次抗体単独によって生成されるバックグラウンド蛍光と異なるとは思えず、図8~10を参照のこと。
パラホルムアルデヒドおよびトリトン固定/透過技術を用いた第二の方法を利用することは、第一の方法によって観察されるDAPI漏出およびそうでなければ再現された染色パターンをもたらさず、図19~27を参照のこと。
実施例5:本開示の抗体のさらなる特徴決定
本開示の抗体を、免疫組織化学、ELISA、および生検組織試料(例えば、腫瘍試料、血液、または血液由来画分、尿など)上の抗体を利用する他の診断方法を含む診断方法において、疾患の診断において利用される能力について評価する。
本開示の抗体を、免疫組織化学、ELISA、および生検組織試料(例えば、腫瘍試料、血液、または血液由来画分、尿など)上の抗体を利用する他の診断方法を含む診断方法において、疾患の診断において利用される能力について評価する。
本開示の抗体は、ELISA、免疫ブロッティング技術、細胞染色(例えば、免疫蛍光、フローサイトメトリー)、免疫組織化学での抗体の特徴決定におけるさらなる解析の対象にする。細胞ベースのアッセイは、細胞運動、細胞増殖、アポトーシス、および様々な細胞シグナル伝達アッセイに対する効果の評価を含む。
本開示は、運動アッセイにさらに利用する多数の細胞タイプを提供する。本開示の抗体の特徴決定は、細胞外基質に見出され得る様々なタンパク質付加物用いた、または用いない3D MATRIGELアッセイにおける運動性の解析を含む。コラーゲンおよびフィブロネクチンに加えて、これらには、とりわけ、フィラミンA、プラスミン、ラミニン、ケラチン、エラスチン、プロテオグリカン、コンドロイチン、インテグリンなどの分子を含むが、これらに限定されない。追加の分子は、プロテアーゼ、ならびにとりわけ、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、キモトリプシン、マトリクスメタロプロテイナーゼなどの他の因子を含み得る。
加えて、さらなるアッセイを、追加の細胞株および組織、抗体滴定、抗体誘導体(例えば、抗体と薬物の結合体、scFv、および他の抗体フォーマット)を用いた細胞運動性アッセイとの関連で行う。
実施例6.B411v.シェルフ試薬を用いて行った追加研究
追加の細胞アッセイを、B411抗体ならびに乳癌細胞株MDA-MB-231およびSKBR3を使用して行った。具体的には、フィラミンA抗体B411を、三重被覆96ウェルプレート(Platypus # CMATR1.101)を使用したORIS(商標)細胞遊走アッセイにおいて評価した。細胞を、約25,000または50,000細胞/ウェルで播種した。SKBR3細胞の場合、McCoy’sにおいて、細胞を37℃、CO2でMDA-MB-231細胞の場合、10%のFBSを含有するL-15において、細胞をCO2なしで一晩インキュベートした。細胞増殖および遊走ゾーンを覆うストッパーを、ORIS(商標)ストッパーツールを使用して取り除き、成長培地を取り除き、ウェルを無菌PBS100マイクロリットルでやさしく洗浄した。染色工程が、遊走なしの対照としての役目を果たすまで、参照ウェル内にストッパーを定位置に置いた。洗浄後、特定の処理を含有する新鮮培養培地の体積100マイクロリットルを各ウェルに加えた。次いで、細胞を一晩インキュベートさせた。インキュベーション期間の終了時に、細胞を以下の通り蛍光染色した:
・ 残りの培地をウェルから慎重に取り出し、PBS100μLで洗浄する。PBSを除去する。
・ 各ウェルに1×カルセインAM(eBioscience、65-0853-78)溶液100μLを加える。
・ プレートを37℃で30分間インキュベートする。次いで、蛍光を、検出マスクを定位置に置いたマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
・ カルセインAMを慎重に除去し、PBS100μLで洗浄する。PBSを除去する。
・ ヨウ化プロピジウム(死細胞検出用)およびヘキスト33342(アポトーシス細胞検出用)を含有するPBS100μL(それぞれ、1:3,000および1:4,000希釈)を各ウェルに加える。室温で5~10分間インキュベートする。
・ 代表的なウェルの蛍光画像(青色、緑色、赤色のチャネル)を5×倍率で撮影する。
追加の細胞アッセイを、B411抗体ならびに乳癌細胞株MDA-MB-231およびSKBR3を使用して行った。具体的には、フィラミンA抗体B411を、三重被覆96ウェルプレート(Platypus # CMATR1.101)を使用したORIS(商標)細胞遊走アッセイにおいて評価した。細胞を、約25,000または50,000細胞/ウェルで播種した。SKBR3細胞の場合、McCoy’sにおいて、細胞を37℃、CO2でMDA-MB-231細胞の場合、10%のFBSを含有するL-15において、細胞をCO2なしで一晩インキュベートした。細胞増殖および遊走ゾーンを覆うストッパーを、ORIS(商標)ストッパーツールを使用して取り除き、成長培地を取り除き、ウェルを無菌PBS100マイクロリットルでやさしく洗浄した。染色工程が、遊走なしの対照としての役目を果たすまで、参照ウェル内にストッパーを定位置に置いた。洗浄後、特定の処理を含有する新鮮培養培地の体積100マイクロリットルを各ウェルに加えた。次いで、細胞を一晩インキュベートさせた。インキュベーション期間の終了時に、細胞を以下の通り蛍光染色した:
・ 残りの培地をウェルから慎重に取り出し、PBS100μLで洗浄する。PBSを除去する。
・ 各ウェルに1×カルセインAM(eBioscience、65-0853-78)溶液100μLを加える。
・ プレートを37℃で30分間インキュベートする。次いで、蛍光を、検出マスクを定位置に置いたマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
・ カルセインAMを慎重に除去し、PBS100μLで洗浄する。PBSを除去する。
・ ヨウ化プロピジウム(死細胞検出用)およびヘキスト33342(アポトーシス細胞検出用)を含有するPBS100μL(それぞれ、1:3,000および1:4,000希釈)を各ウェルに加える。室温で5~10分間インキュベートする。
・ 代表的なウェルの蛍光画像(青色、緑色、赤色のチャネル)を5×倍率で撮影する。
図32に見られるように、抗フィラミンA B411抗体で処理したMDA-MB-231乳癌細胞上のヘキスト33342染色(青色)の増加が存在し、これは、アポトーシス様表現型を有する細胞の増加を示唆する(ヘキスト33342染色は、正常細胞中のクロマチンよりもアポトーシス細胞中に凝縮されたクロマチンを明るく染色する)。さらに、カルセインAM染色(緑色)には、非常に強く染色された細胞および全く染色されていない細胞を伴うものがあり、抗フィラミンA抗体処理での代謝活性の有意な変化を示唆する。死細胞を、ヨウ化プロピジウム(赤色)による核の染色によって同定する。
実施例7.フィラミンA特異的細胞内抗体
フィラミンA抗原に特異的な細胞内抗体を作製し、細胞内抗体の発現および機能性を試験するための実験を行う。細胞内抗体コンストラクトは、細胞株(例えば、MDA-MB-231、HEK392、HeLa、または他の細胞株)において一過性に発現する。遺伝子導入した細胞を評価して、ウェスタンブロッティングを介して抗体(例えば、scFv)の発現を確認する。例えば、タグ付けした細胞内抗体について、scFv発現を、タグを介して(例えば、抗Hisまたは抗GSTタグ抗体を使用して)または抗scFv抗体もしくは他の抗細胞内抗体コンストラクト抗体を介して確認してもよい。あるいはまたは加えて、免疫蛍光アッセイを使用して、scFv発現を確認する(例えば、抗Hisタグ、抗GST、抗scFv、または他の細胞内抗体コンストラクト抗体での染色および検出による)。
フィラミンA抗原に特異的な細胞内抗体を作製し、細胞内抗体の発現および機能性を試験するための実験を行う。細胞内抗体コンストラクトは、細胞株(例えば、MDA-MB-231、HEK392、HeLa、または他の細胞株)において一過性に発現する。遺伝子導入した細胞を評価して、ウェスタンブロッティングを介して抗体(例えば、scFv)の発現を確認する。例えば、タグ付けした細胞内抗体について、scFv発現を、タグを介して(例えば、抗Hisまたは抗GSTタグ抗体を使用して)または抗scFv抗体もしくは他の抗細胞内抗体コンストラクト抗体を介して確認してもよい。あるいはまたは加えて、免疫蛍光アッセイを使用して、scFv発現を確認する(例えば、抗Hisタグ、抗GST、抗scFv、または他の細胞内抗体コンストラクト抗体での染色および検出による)。
細胞表現および代謝の差を、遺伝子導入した細胞においてモニターし、遺伝子導入していない細胞と比較するか、または抗フィラミンA抗体断片(例えば、抗体成分を有さないGST融合パートナー)を有さないベクターなどの無関係なコンストラクトで遺伝子導入した細胞と比較する。細胞表現および代謝の評価は、例えば、非限定的に、細胞内抗体、融合パートナー、および/または細胞マーカーの発現をモニターするか、または指示する細胞形態、増殖速度、接着、遊走、生/死細胞数および比、代謝速度、ウェスタンブロットおよび/または免疫組織化学、ならびにフローサイトメトリーを含む。
細胞内抗体発現、機能性、および有効性も、インビボで試験する。例えば、免疫不全マウスに癌細胞を(例えば、腹腔内、皮下、または同所性に)接種する、癌の異種移植片モデルを利用してもよい。腫瘍の成長をモニターし、腫瘍の発生の前または後に、潜在的な治療細胞内抗体または診断細胞内抗体を投与する。例えば、乳癌の同所性モデルでは、抗フィラミンA抗原細胞内抗体の投与または細胞内発現の前、または同時に、癌細胞を、免疫不全マウスの鼠径部乳腺脂肪パッドに移植する。例えば、抗フィラミンA細胞内抗体コンストラクトを、プラスミド、ウイルスベースまたは非ウイルスベースの送達ビークルを介して細胞内発現のため乳癌細胞に送達してもよい。一部の実施形態では、抗フィラミンA細胞内抗体コンストラクトを、細胞膜透過ペプチドを介して乳癌細胞にタンパク質として送達してもよい。ベクター対照、または無関係な細胞内抗体を投与した対照動物と比較して、抗フィラミンA細胞内抗体の存在の腫瘍成長に対する効果を測定する。研究の結果は、抗フィラミンA細胞内抗体の投与および細胞内発現が、癌の異種移植片モデルにおいて、腫瘍体積を低減するか、または腫瘍の成長を遅らせるか、または腫瘍の発生を妨げることを示す。
実施例8.細胞生存率アッセイ
抗体B411とのインキュベーション後の細胞生存を評価するための試験を行った。DU145(ヒト前立腺癌細胞株)およびHEK293A(ヒト胚性腎細胞株)細胞を、96ウェルプレート(104細胞/ウェル)に播種し、37℃で4時間インキュベートした。B411(エンドトキシン除去、1.2EU/mL)1μgまたは10μgを、ウェルに加え、24時間または48時間インキュベートした。両方の細胞タイプについての未処理群も含めた。CellCountzEZ(商標)細胞生存アッセイキットを使用して、細胞生存を検出し、OD412をOD650を参照して読み取ることによって結果を決定した。
抗体B411とのインキュベーション後の細胞生存を評価するための試験を行った。DU145(ヒト前立腺癌細胞株)およびHEK293A(ヒト胚性腎細胞株)細胞を、96ウェルプレート(104細胞/ウェル)に播種し、37℃で4時間インキュベートした。B411(エンドトキシン除去、1.2EU/mL)1μgまたは10μgを、ウェルに加え、24時間または48時間インキュベートした。両方の細胞タイプについての未処理群も含めた。CellCountzEZ(商標)細胞生存アッセイキットを使用して、細胞生存を検出し、OD412をOD650を参照して読み取ることによって結果を決定した。
研究の結果を、図33において提供し、B411が、DU145(癌)細胞増殖を阻害したことを示した。用量1μgで、B411は、DU145の無処理群と比較したとき、24時間でDU145細胞成長の増殖に対する有意な阻害効果を示した(*p<0.01)が、48時間での統計上有意な効果はなかった。B411の用量1μgは、いずれの時点でもHEK293A細胞株に対する効果を有さなかった(24時間または48時間)。用量10μgで、B411は、DU145の無処理群と比較したとき、24時間および48時間の両方の時点でDU145の増殖に対する有意な阻害効果を示した。HEK293細胞増殖の阻害も、10μgで観察した。
24時間および48時間におけるDU145のB411による阻害の比率は、それぞれ、7.8%および14.6%であり、両方とも有意であった(*p<0.01)。24時間および48時間におけるHEK293の阻害の比率は、9.3%および17.7%であり、また有意であった(*p<0.01)。
実施例9.フィラミンA細胞内抗体は、癌細胞におけるFLNAタンパク質レベルを低減し、癌細胞増殖を低減する
単一ベクターにおいて二つの遺伝子を同時発現させるための二色性レンチウイルスベクターを使用して、細胞内抗体を作製した。ベクターを、LV-EF-intrabodyFLNA/Histag-IRES-GFPと指定した。ベクターを細胞に送達するとき、第一の遺伝子産物である細胞内抗体FLNAを、EFプロモーターによって駆動させ、IRESは、第二の遺伝子産物であるGFPの翻訳を開始する。種々の癌細胞タイプに対する例示的なフィラミンA細胞内抗体の効果を評価するための研究を行った。GFPレポーター遺伝子を含む二つのレンチウイルスベクターFLNA細胞内抗体コンストラクトを試験した:LV-FLNA_1-GFPは、VH-VL配向でB411の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、LV-FLNA_2-GFPは、逆の配向であるVL-VHでB411の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。GFP発現レンチウイルス対照ベクター(LV-GFP)も、研究に使用した。
単一ベクターにおいて二つの遺伝子を同時発現させるための二色性レンチウイルスベクターを使用して、細胞内抗体を作製した。ベクターを、LV-EF-intrabodyFLNA/Histag-IRES-GFPと指定した。ベクターを細胞に送達するとき、第一の遺伝子産物である細胞内抗体FLNAを、EFプロモーターによって駆動させ、IRESは、第二の遺伝子産物であるGFPの翻訳を開始する。種々の癌細胞タイプに対する例示的なフィラミンA細胞内抗体の効果を評価するための研究を行った。GFPレポーター遺伝子を含む二つのレンチウイルスベクターFLNA細胞内抗体コンストラクトを試験した:LV-FLNA_1-GFPは、VH-VL配向でB411の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、LV-FLNA_2-GFPは、逆の配向であるVL-VHでB411の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。GFP発現レンチウイルス対照ベクター(LV-GFP)も、研究に使用した。
肺癌
A549(肺癌細胞株)細胞を、リポフェクタミン3000を使用して、DNA(LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、またはLV-FLNA_2-GFP)1μgで遺伝子導入するか、または偽遺伝子導入した。遺伝子導入の72時間後に細胞を回収し、生細胞解析および死細胞解析のため、それそれ、カルセイン-ディープ-レッドまたはEthD-1で染色した。細胞生存率をフローサイトメトリーにより評価した。
細胞生存率アッセイの結果を、図34~38に提供する。図34A~Eは、遺伝子導入の72時間後に遺伝子導入した細胞におけるGFP発現を示す。図34Aは、偽遺伝子導入した細胞においてGFP発現を示さない。図34B、C、およびDは、LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、およびLV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入した細胞におけるGFPを示す。図34Eは、図34A~Dにおけるヒストグラムの上書きである。
図35A~Fは、遺伝子導入の72時間後のGFPゲート化細胞の生細胞解析を示す。図35AおよびBは、無染色対照(図35A)および陽性対照細胞(カルセインディープレッド(CDR)生細胞染色)(図35B)を示す。図35C、D、およびEは、LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、またはLV-FLNA_2-GFPでの遺伝子導入の72時間後のGFP陽性細胞におけるCDR陽性染色を示す。図35Fは、図35C、D、およびEの生細胞解析のヒストグラムの上書きである。図36は、GFP陽性細胞集団におけるCDR陽性(生)細胞の総数を示す。LV-FLNA_1-GFPとLV-FLNA_2-GFPの両方が、生細胞数を有意に低減した(p<0.0001)。
図37A~Eは、遺伝子導入の72時間後のGFPゲート化細胞の死細胞解析を示す。図37AおよびBは、無染色対照(図37A)および陽性対照細胞(EthD-1死細胞染色)(図37B)を示す。図37C、D、およびEは、LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、またはLV-FLNA_2-GFPでの遺伝子導入の72時間後のGFP陽性細胞におけるEthD-1染色を示す。図38Aは、図37C、D、およびEの死細胞解析のヒストグラムの上書きである。図38Bは、GFP陽性細胞集団におけるEthD-1陽性(死)細胞の総数を示す。LV-FLNA_1-GFPとLV-FLNA_2-GFPの両方が、LV対照と比較して死細胞の数を有意に増加させた(それぞれ、p<0.005およびp<0.0001)。LV-FLNA_2-GFPは、LV対照とLV-FLNA_1-GFPの両方と比較して死細胞の数を有意に増加させた(p<0.0001)。
細胞増殖アッセイについて、DNA2.5μgを、リポフェクタミン3000を使用した6ウェルプレートの各ウェルのA549細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入の72時間後に細胞を回収し、EdU試薬と共に2時間インキュベートした。EdU試薬と接触していない細胞は、陰性対照として役立った。増殖をフローサイトメトリーにより評価した。
増殖アッセイの結果を、図39に提供する。図39Aは、無染色対照である。図39Bは、ベクター対照で遺伝子導入した細胞の増殖を示す。図39Cおよび39Dは、それぞれ、LV-FLNA_1-GFPおよびLV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入した細胞の増殖を示す。図39Eは、各群におけるパーセントEdU陽性(増殖)細胞を示すグラフである。LV-FLNA_2-GFPは、LV-GFPと比較してA549細胞の増殖を有意に低減した(p<0.0001)。
顕微鏡研究のため、DNA2.5μgを、リポフェクタミン3000を使用して6ウェルプレートの各ウェルのA549細胞に遺伝子導入し、細胞を、共焦点顕微鏡を使用して遺伝子導入の24時間後に撮像した。図40は、結果を提供する。図40A1、B1、およびC1は、それぞれ、LV-GFPで遺伝子導入した細胞、LV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入した細胞、およびLV-FLNA_1-GFPで遺伝子導入した細胞の蛍光画像を示す。図40A2、B2、およびC2は、それぞれ、LV-GFPで遺伝子導入した細胞、LV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入した細胞、およびLV-FLNA_1-GFPで遺伝子導入した細胞の明視野画像を示す。図40D1および40D2は、それぞれ、図40C1および40C2における選択した視野(白色の三角形)の拡大視野を示す。図40D3は、図40D1および40D2の混合視野である。白色の矢印は、A549細胞におけるFLNAのGFPとの共発現を示唆する。
さらに、A549細胞におけるFLNA細胞内抗体処理の効果を非癌MRC-5細胞と比較するための試験をさらに行った。DNA2.5μgを、リポフェクタミン3000を使用して6ウェルプレートの各ウェルのA549細胞に遺伝子導入し、細胞を、共焦点顕微鏡を使用して遺伝子導入の72時間後に撮像した。図41は、結果を提供する。LV-FLNA_2-GFPで処理したA549細胞(図41A2)において目に見える細胞死があったが、対照LV-GFPで処理したA549細胞においてはなかった(図41A1)。対照的に、LV-FLNA_2-GFPで処理したMRC-5細胞において目に見える細胞死はなかった(図41B2)。研究の結果は、FLNA細胞内抗体処置によって誘発された細胞死が、癌細胞に特異的であることを示す。
神経膠芽腫
U87MG(神経膠芽腫細胞株)細胞を、リポフェクタミン3000を使用して、12ウェルプレートにおいてDNA(LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、またはLV-FLNA_2-GFP)1μgで遺伝子導入するか、または偽遺伝子導入した。遺伝子導入の72時間後に細胞を回収し、生細胞解析および死細胞解析のため、それそれ、カルセイン-ディープ-レッドまたはEthD-1で染色した。細胞生存率をフローサイトメトリーにより評価した。
細胞生存率アッセイの結果を、図42~44に提供する。図42において、左列は、LV-GFP(上部)、LV-FLNA_1-GFP(中央)、およびLV-FLNA_2-GFP(下部)で遺伝子導入した細胞における生細胞数を示す。中央の列は、LV-GFP(上部)、LV-FLNA_1-GFP(中央)、およびLV-FLNA_2-GFP(下部)で遺伝子導入した細胞における死細胞数を示す。右の列は、LV-GFP(上部)、LV-FLNA_1-GFP(中央)、およびLV-FLNA_2-GFP(下部)で遺伝子導入した細胞における生/死細胞数(カラム1および2の混合)を示す。この研究は、FLNA細胞内抗体でのU87MG細胞の遺伝子導入の際の生細胞から死細胞へのシフトを示す。
図43Aおよび43Bは、遺伝子導入の72時間後の生細胞解析を示す。図43Aは、LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、およびLV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入した細胞の生細胞解析染色のヒストグラム上書きである。図43Bは、CDR陽性(生)細胞の総数を示す。LV-FLNA_1-GFPとLV-FLNA_2-GFPの両方が、生細胞数を有意に低減した(p<0.0001)。
図44Aおよび44Bは、遺伝子導入の72時間後のGFPゲート化細胞の死細胞解析を示す。図44Aは、LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、およびLV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入した細胞の死細胞解析染色のヒストグラム上書きである。図44Bは、EthD-1陽性(死)細胞の総数を示す。LV-FLNA_1-GFPとLV-FLNA_2-GFPの両方が、LV対照と比較して死細胞の数を有意に増加させた(それぞれ、p<0.005およびp<0.0001)。
神経膠芽腫細胞株と非癌HBEC-5i細胞の間でのFLNA細胞内抗体処理の効果を比較するための試験を行った。結果を、図45に提供する。遺伝子導入の72時間後、FLNA細胞内抗体処理は、LN229細胞(神経膠芽腫細胞株;図45A)において細胞死をもたらしたが、HBEC-5i細胞(非癌細胞株;図45B)ではもたらさなかった。研究の結果は、FLNA細胞内抗体処置によって誘発された細胞死が、癌細胞に特異的であることを示した。
顕微鏡研究のため、DNA2.5μgを、リポフェクタミン3000を使用して6ウェルプレートの各ウェルのU87MG細胞に遺伝子導入し、細胞を、共焦点顕微鏡を使用して遺伝子導入の24および72時間後に撮像した。図46および図47は、結果を提供する。図46A1、B1、およびC1は、遺伝子導入の24時間後の、それぞれ、LV-GFPで遺伝子導入した、LV-FLNA_1-GFPで遺伝子導入した、およびLV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入したU87MG細胞の蛍光画像を示す。図46A2、B2、およびC2は、遺伝子導入の24時間後の、それぞれ、LV-GFPで遺伝子導入した、LV-FLNA_1-GFPで遺伝子導入した、およびLV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入したU87MG細胞の明視野画像を示す。図47Aおよび47Bは、遺伝子導入の72時間後のLV-GFPで遺伝子導入したU87MG細胞の蛍光および明視野画像を示す。図47Cおよび47Dは、遺伝子導入の72時間後のLV-FLNA_1-GFPで遺伝子導入したU87MG細胞の蛍光および明視野画像を示し、図47Eおよび47Fは、遺伝子導入の72時間後のLV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入したU87MG細胞の蛍光および明視野画像を示す。同様に、図48A~Fは、72時間での、LV-GFP(図48A、48B)、LV-FLNA_1-GFPで遺伝子導入した(図48C、48D)、およびLV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入した(図48E、48F)細胞の明視野画像を示す。画像は、72時間での、LV-FLNA_1-GFPおよびLV-FLNA_2-GFP処理が、細胞接着の喪失およびU87MG神経膠芽腫細胞の死をもたらしたことが示される。
免疫細胞化学(ICC)によってFLNA細胞内抗体で処理したU87MG細胞におけるFLNA。細胞をチャンバースライドに播種し、遺伝子導入の72時間後に4%ホルムアルデヒドで固定した。次いで、PBS中の0.5%のトリトンX-100を使用して細胞を透過させた。PBS中の5%BSAを使用して、室温で1時間、ブロッキングを行った。抗フィラミン一次抗体インキュベーションを、4℃で一晩行い、二次抗体インキュベーションを、室温で1時間行った。細胞も核DAPI染色で染色した。結果を、図49に提供する。FLNA細胞内抗体で処理したU87MG細胞は、遺伝子導入の72時間後にFLNAタンパク質の破損を示す。
図50は、細胞内抗体上のHisタグおよびGFPについての免疫細胞化学(ICC)染色による、LV-FLNA_2細胞内抗体で遺伝子導入したU87MG細胞におけるFLNA scFvの解析を示す。図50の最上の行は、抗His(第一パネル)、抗GFP(第二パネル)、DAPI染色(第三パネル)、およびFLNA細胞内抗体とGFPの共発現を示す混合画像を示す。図50の下部の行は、LV-GFP対照を示す。データは、FLNA細胞内抗体が、GFPと共発現していることを示す(白色の矢印を参照)。
前立腺癌
細胞生存率アッセイも、FLNA細胞内抗体で処理したDU145(前立腺癌細胞株)細胞でも行った。DU145細胞を、リポフェクタミン3000を使用して、DNA(LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、またはLV-FLNA_2-GFP)0.5μgで遺伝子導入するか、または偽遺伝子導入した。遺伝子導入の72時間後に細胞を回収し、生細胞解析および死細胞解析のため、それそれ、カルセイン-ディープ-レッドまたはEthD-1で染色した。細胞生存率をフローサイトメトリーにより評価した。
細胞生存率アッセイの結果を、図51~55に提供する。図51A~Eは、遺伝子導入の72時間後に遺伝子導入した細胞におけるGFP発現を示す。図51Aは、偽遺伝子導入した細胞においてGFP発現を示さない。図51B、C、およびDは、LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、およびLV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入した細胞におけるGFPを示す。図51Eは、図51A~Dにおけるヒストグラムの上書きである。
図52A~Cは、遺伝子導入の72時間後のGFPゲート化DU145細胞の生細胞解析を示す。LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、またはLV-FLNA_2-GFPでの遺伝子導入の72時間後のGFP陽性細胞におけるCDR陽性染色を、それぞれ、図52A、52B、および52Cに示す。図53Aは、図52A~Cの生細胞解析のヒストグラムの上書きである。図53Bは、GFP陽性細胞集団におけるCDR陽性(生)細胞の総数を示す。LV-FLNA_1-GFPとLV-FLNA_2-GFPの両方が、LV-GFP遺伝子導入と比較して生DU145細胞の数を有意に低減した(それぞれ、p<0.0005およびp<0.0001)。
図54A~Cは、遺伝子導入の72時間後のGFPゲート化DU145細胞の死細胞解析を示す。LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、またはLV-FLNA_2-GFPでの遺伝子導入の72時間後のEthD-1陽性染色を、それぞれ、図54A、54B、および54Cに示す。図55Aは、図54A~Cの死細胞解析のヒストグラムの上書きである。図55Bは、GFP陽性細胞集団におけるEthD-1陽性(死)細胞の総数を示す。LV-FLNA_1-GFPとLV-FLNA_2-GFPの両方が、LV対照と比較して死細胞の数を有意に増加させた(それぞれ、p<0.05およびp<0.0001)。
乳癌
MDA-MB-231(乳癌細胞株)細胞を、リポフェクタミン3000を使用して、DNA(LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、またはLV-FLNA_2-GFP)2.5μgで遺伝子導入するか、または偽遺伝子導入した。細胞増殖および顕微鏡研究のため、遺伝子導入の72時間後に、細胞を回収した。細胞増殖アッセイのため、遺伝子導入の72時間後に、細胞を回収し、EdU試薬と共に2時間インキュベートした。EdU試薬と接触していない細胞は、陰性対照として役立った。増殖をフローサイトメトリーにより評価した。
MDA-MB-231細胞の遺伝子導入の72時間後のGFP発現を、図56に提供する。図56Aは、偽遺伝子導入である。図56Bは、LV-GFP対照で遺伝子導入したMDA-MB-231細胞の増殖を示す。図56Cおよび56Dは、それぞれ、LV-FLNA_1-GFPおよびLV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入したMDA-MB-231細胞の増殖を示す。図56Eは、図56A~Dにおけるデータのヒストグラムの上書きである。図57は、遺伝子導入の72時間後のGFPゲート化細胞におけるEdU染色により測定した増殖を示す。図57Aは、無染色対照である。図57B、57C、および57Dは、それぞれ、LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、またはLV-FLNA_2-GFPでの遺伝子導入の72時間後のGFP+細胞におけるEdU染色を示す。図57Eは、増殖研究のグラフィカル表現である。LV-FLNA_1-GFPとLV-FLNA_2-GFPの両方が、LV-GFPと比較してMDA-MB-231細胞の増殖を有意に低減した(それぞれ、p< 0.001およびp<0.0001)。
顕微鏡研究について、共焦点顕微鏡を使用して、遺伝子導入の24時間後に細胞を撮像した。図58は、結果を提供する。GFPは、全ての三つの群すべてについて24時間でMDA-MB-231細胞において発現した。
MDA-MB-231細胞の細胞内抗体処理後のFLNAタンパク質レベルを、ウェスタンブロットにより評価した。細胞を遺伝子導入の48時間後に溶解し、1試料当たりタンパク質35μgを、SDS-PAGEに供した。一次抗フィラミンA抗体を、1:500に希釈し、抗GAPDH抗体を、1:3000に希釈した。フィラミンA検出のための二次抗体は、1:1000に希釈したHRP結合ロバ抗マウスであった。GAPDHについての二次抗体は、1:1000に希釈した、HRP結合ヤギ抗ラットであった。研究の結果を、図59に提供する。FLNA細胞内抗体での処理は、MDA-MB-231細胞における減少したFLNAタンパク質レベルをもたらした。
実施例10.毒性研究
正常なヒト星状細胞(N7805100)を24ウェルプレートに播種し、LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、またはLV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入するか、または偽遺伝子導入した。溶解対照群および陰性対照群も含んだ。遺伝子導入の24時間後、フローサイトメトリーのため細胞を回収して、遺伝子導入効率を解析した。遺伝子導入の72時間後、異なるウェルからの細胞を使用して、LDH細胞障害性アッセイを行った。
正常なヒト星状細胞(N7805100)を24ウェルプレートに播種し、LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、またはLV-FLNA_2-GFPで遺伝子導入するか、または偽遺伝子導入した。溶解対照群および陰性対照群も含んだ。遺伝子導入の24時間後、フローサイトメトリーのため細胞を回収して、遺伝子導入効率を解析した。遺伝子導入の72時間後、異なるウェルからの細胞を使用して、LDH細胞障害性アッセイを行った。
研究の結果を、図60~62に提供する。図60A~Eは、遺伝子導入の24時間後の正常なヒト星状細胞におけるGFP発現を確認する。図61A~Cは、遺伝子導入の24時間後の正常なヒト星状細胞の顕微鏡的解析を提供する。GFP発現を、全三つの群:LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、およびLV-FLNA_2-GFPにおいて観察した。図62は、LDH細胞障害性アッセイの結果を提供する。パーセント細胞傷害を、市販のキットプロトコール(ThermoFisher社、88954)を使用して計算した。正常細胞では、%細胞傷害性は低く、群間での%細胞傷害性に差異はなかった。
実施例11.癌細胞上でのB411表面染色
いくつかの異なる細胞タイプでB411表面染色を行った。細胞を、1ウェル当たり50万個~100万個の細胞の濃度で播種し、一晩インキュベートした。次いで、細胞をウェルから持ち上げ、洗浄し、氷上で1時間、一次抗体2μgを含むフローサイトメトリー培地中に再懸濁した。細胞を洗浄し、二次抗体(5μg/ml)と共に氷上で30分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、フローサイトメトリーにより解析した。
いくつかの異なる細胞タイプでB411表面染色を行った。細胞を、1ウェル当たり50万個~100万個の細胞の濃度で播種し、一晩インキュベートした。次いで、細胞をウェルから持ち上げ、洗浄し、氷上で1時間、一次抗体2μgを含むフローサイトメトリー培地中に再懸濁した。細胞を洗浄し、二次抗体(5μg/ml)と共に氷上で30分間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、フローサイトメトリーにより解析した。
図63は、SKNAS(ヒトニューロブラストーマ)細胞株の結果を提供する。左のパネルは、B411についての陽性染色、およびアイソタイプ対照についての陰性染色、一次抗体対照なし、ならびに無染色細胞を示すヒストグラムである。右の二つのパネルは、各群における陽性細胞の%(上部)および各群における陽性細胞の総数(下部)を示す。
図64は、SKBR3(乳腺癌)細胞株の結果を提供する。左のパネルは、B411についてのいくつかの陽性染色、ならびに一次抗体対照なし、および無染色細胞についての陰性染色を示すヒストグラムである。右の二つのパネルは、各群における陽性細胞の%(上部)および各群における陽性細胞の総数(下部)を示す。
図65は、HeLa細胞(卵巣癌)の結果を提供する。左のパネルは、B411についての陽性染色、ならびに一次抗体対照なし、および無染色細胞についての陰性染色を示すヒストグラムである。右の二つのパネルは、各群における陽性細胞の%(上部)および各群における陽性細胞の総数(下部)を示す。
図66は、SKOV3細胞株(卵巣癌)の結果を提供する。左のパネルは、B411についての陽性染色、ならびに一次抗体対照なし、および無染色細胞についての陰性染色を示すヒストグラムである。右の二つのパネルは、各群における陽性細胞の%(上部)および各群における陽性細胞の総数(下部)を示す。
研究の結果は、B411が、様々な癌細胞株において表面フィラミンAを検出することができることを示した。SKBR3細胞株について、B411の陽性染色が存在したが、試験した他の細胞株と比較して弱かった。B411についての高い陽性染色を、SKNAS、SKOV3、およびHeLa細胞株で観察した。
実施例12.貪食
抗体B411が、細胞によって貪食されるかどうかを決定するための実験を行った。250,000個の細胞/ウェルを播種し、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。12μg/mL抗体を、製造業者のプロトコルに従い、Zenon pHrodoキット(ヒト緑色)を用いて、暗所で5分間室温で標識した。次いで、播種細胞を標識抗体と共に、24時間、37℃、5%CO2でインキュベートした。次いで、細胞を手動擦過によりはがし、フローサイトメトリーによる分析の前に洗浄した。
抗体B411が、細胞によって貪食されるかどうかを決定するための実験を行った。250,000個の細胞/ウェルを播種し、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。12μg/mL抗体を、製造業者のプロトコルに従い、Zenon pHrodoキット(ヒト緑色)を用いて、暗所で5分間室温で標識した。次いで、播種細胞を標識抗体と共に、24時間、37℃、5%CO2でインキュベートした。次いで、細胞を手動擦過によりはがし、フローサイトメトリーによる分析の前に洗浄した。
図67~68は、結果を提供する。パーセント貪食陽性SKBR3細胞(乳腺癌)およびHEK細胞(非癌)を、図67に示される。図68は、貪食についての陽性細胞の総数を示す。B411の貪食を、抗体と共にインキュベートしたSKBR3細胞(乳腺癌)において検出した(図67、左パネル)。より多くのSKBR3細胞が、HEK細胞よりもB411について陽性であり(図68)、SKBR3細胞が、HEK(非癌)細胞と比較して、より高いレベルのB411結合フィラミンAの貪食を有することを示唆している。研究の結果は、本明細書において提供されるフィラミンA抗体の貪食を使用して、処置のための標的治療薬を送達することができることを示した。
参照による組み込み
本明細書において引用される全ての参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報、および特許出願は、全ての目的のためその全体が参照により組み込まれる。
本明細書において引用される全ての参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報、および特許出願は、全ての目的のためその全体が参照により組み込まれる。
しかしながら、本明細書において引用される任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、それらが、妥当な先行技術を構成するか、または世界の任意の国における共通の一般的な知識の一部を形成する知識または任意の形態の示唆ではなく、そのように受け取られるべきではない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
フィラミンA抗原に結合する抗体であって、
a.CDR1、CDR2、およびCDR3を含む三つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変ドメインであって、前記軽鎖CDR1が、配列番号12および13から選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR2が、配列番号14のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR3が、配列番号15のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン;および
b.CDR1、CDR2、およびCDR3を含む三つのCDRを含む重鎖可変ドメインであって、前記重鎖CDR1が、配列番号16のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR2が、配列番号17のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR3が、配列番号18、19、20、および21から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、を含む、抗体。
(項目2)
前記軽鎖CDR1が、配列番号13を含み、前記重鎖CDR3が、配列番号21を含む、項目1に記載の抗体。
(項目3)
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号2を含み、前記重鎖可変ドメインが、配列番号7を含む、項目1に記載の抗体。
(項目4)
前記軽鎖および重鎖可変領域が、軽鎖-重鎖の配向である、項目1~3のいずれか1項に記載の抗体。
(項目5)
前記軽鎖および重鎖可変領域が、重鎖-軽鎖の配向である、項目1~3のいずれか1項に記載の抗体。
(項目6)
c.配列番号3を含む軽鎖定常ドメイン;および
d.配列番号11を含む重鎖定常ドメインをさらに含む、項目1~5のいずれか1項に記載の抗体。
(項目7)
前記抗体がヒトキメラ抗体である、項目1~6のいずれか1項に記載の抗体。
(項目8)
前記抗体がscFvである、項目1~5のいずれか1項に記載の抗体。
(項目9)
前記抗体が細胞内抗体である、項目1~5のいずれか1項に記載の抗体。
(項目10)
前記フィラミンA抗原が、FLNA遺伝子、またはその相同体によりコードされる遺伝子産物である、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目11)
前記フィラミンA抗原が、およそ280kDaの乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンA抗原である、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目12)
前記抗体が、乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンA抗原に優先的に結合することができ、前記優先結合が、非乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンA抗原と比較である、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目13)
前記抗体が、乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンA抗原に10 -7 M~10 -11 Mの特異的親和性で結合することができる、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目14)
前記フィラミンA抗原が、およそ280kDaの乳癌細胞膜関連フィラミンA抗原である、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目15)
前記抗体が、乳癌細胞膜関連フィラミンA抗原に優先的に結合することができ、前記優先結合が、非乳癌細胞膜関連フィラミンA抗原と比較である、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目16)
前記抗体が、乳癌細胞膜関連フィラミンA抗原に、10 -7 M~10 -11 Mの特異的親和性で結合することができる、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目17)
項目1~16のいずれか1項に記載の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドDNA配列。
(項目18)
項目17に記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
(項目19)
項目18に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
(項目20)
項目19に記載の宿主細胞を培養すること、前記抗体を発現させること、および前記宿主細胞により発現された前記抗体を回収することを含む方法により産生される、抗体。
(項目21)
固相に固定される、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目22)
前記抗体が検出可能に標識される、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目23)
前記抗体が放射性核種に結合される、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目24)
前記抗体が化学療法剤に結合される、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目25)
前記抗体がタンパク質に結合される、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目26)
前記抗体が、細胞内フィラミンA抗原、細胞膜関連フィラミンA抗原、および/または可溶性フィラミンA抗原に結合する、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目27)
a.項目1~16のいずれか1項に記載の抗体;および
b.医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
(項目28)
a.一次抗体として項目1~16のいずれか1項に記載の抗体;および
b.前記一次抗体に結合する二次抗体であって、検出可能な標識に結合される二次抗体、を含む、癌を診断するためのキット。
(項目29)
前記癌が乳癌である、項目28に記載のキット。
(項目30)
患者における癌を診断する方法であって、
a.生物学的試料を患者から得ること;
b.前記生物学的試料を項目1-16のいずれか1項に記載の抗体と接触させること;および
c.前記抗体が、前記試料中のフィラミンA抗原に結合するかどうかを検出することであって、前記抗体とフィラミンA抗原の間の正の結合相互作用が、癌の指標である、検出すること、を含む、方法。
(項目31)
前記癌が乳癌である、項目30に記載の方法。
(項目32)
患者における癌を治療する方法であって、
有効量の項目1~16のいずれか1項に記載の抗体をそれを必要とする患者に投与することを含む、方法。
(項目33)
前記癌が乳癌である、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記抗体が、癌細胞の抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害活性(CDC)を誘導する、項目32に記載の方法。
(項目35)
前記抗体が、癌細胞により貪食される、項目32に記載の方法。
(項目36)
前記抗体が、治療剤に連結されるか、または結合される、項目32に記載の方法。
(項目37)
フィラミンA抗原を発現する腫瘍細胞の成長を防ぐか、または低減する方法であって、
a.それを必要とするヒト患者に、有効量の抗体を投与することであって、前記抗体が、
i.配列番号1または配列番号2を含む、軽鎖可変ドメイン;
ii.配列番号3を含む、軽鎖定常ドメイン;
iii.配列番号4、5、6、または7を含む重鎖可変ドメイン;および
iv.配列番号11を含む、重鎖定常ドメインを含む、投与することを含む、方法。
(項目38)
前記癌が乳癌である、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記抗体が、分泌された可溶性フィラミンA抗原に優先的に結合する、項目37に記載の方法。
(項目40)
前記抗体が、膜関連フィラミンA抗原に優先的に結合する、項目37に記載の方法。
(項目41)
前記抗体が、細胞内フィラミンA抗原に優先的に結合する、項目37に記載の方法。
(項目42)
前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目37に記載の方法。
(項目43)
前記抗体が、ヒトキメラ抗体である、項目37に記載の方法。
(項目44)
前記抗体が、ヒト化抗体である、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記抗体が、フィラミンAに対するマウス抗体と比較して、低減した免疫原性を示し、前記患者から負の免疫応答を導かない、項目43または44に記載の方法。
(項目46)
前記抗体が、細胞内抗体である、項目37に記載の方法。
(項目47)
前記抗体が、細胞内局在化のため改変されている、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目48)
細胞内に局在化しているフィラミンA抗原に結合する、細胞内抗体。
(項目49)
a.CDR1、CDR2、およびCDR3を含む三つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変ドメインであって、前記軽鎖CDR1が、配列番号12および13から選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR2が、配列番号14のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR3が、配列番号15のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン;および
b.CDR1、CDR2、およびCDR3を含む三つのCDRを含む重鎖可変ドメインであって、前記重鎖CDR1が、配列番号16のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR2が、配列番号17のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR3が、配列番号18、19、20、および21から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、を含む、項目48に記載の細胞内抗体。
(項目50)
前記軽鎖CDR1が、配列番号13を含み、前記重鎖CDR3が、配列番号21を含む、項目48に記載の細胞内抗体。
(項目51)
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号2を含み、前記重鎖可変ドメインが、配列番号7を含む、項目48に記載の細胞内抗体。
(項目52)
前記フィラミンA抗原が、FLNA遺伝子、またはその相同体によりコードされる遺伝子産物である、項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体。
(項目53)
前記細胞内抗体が、フィラミンAに、10 -7 M~10 -11 Mの特異的親和性で結合することができる、項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体。
(項目54)
前記細胞内抗体が、scFvである、項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体。
(項目55)
項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体をコードする、単離されたRNA。
(項目56)
項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドDNA配列。
(項目57)
項目55に記載のRNAまたは項目56に記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
(項目58)
項目57に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
(項目59)
項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体および前記細胞内抗体を細胞膜を超えて転座させるためのタンパク質を含む、融合タンパク質。
(項目60)
項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体および前記細胞内抗体を細胞内構造に標的化するためのタンパク質を含む、融合タンパク質。
(項目61)
前記細胞内抗体が検出可能に標識される、項目48~51のいずれか1項に記載の単離された細胞内抗体。
(項目62)
前記細胞内抗体が放射性核種に結合される、項目48~51のいずれか1項に記載の単離された細胞内抗体。
(項目63)
前記細胞内抗体が化学療法剤に結合される、項目45~51のいずれか1項に記載の単離された細胞内抗体。
(項目64)
前記細胞内抗体がタンパク質に結合される、項目48~51のいずれか1項に記載の単離された細胞内抗体。
(項目65)
前記細胞内抗体が、細胞膜透過ペプチドもしくはタンパク質、または他の化学的部分に連結されるか、または結合される、項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体。
(項目66)
a.項目48~51のいずれか1項に記載の単離された細胞内抗体;および
b.医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
(項目67)
a.項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体をコードするDNAまたはRNAを含む送達システム;および
b.医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
(項目68)
前記送達システムが、プラスミド、RNA、ウイルスベクター、または非ウイルス送達システムを含む、項目67に記載の医薬組成物。
(項目69)
前記プラスミドが、真核生物のプロモーターを含む細菌プラスミドである、項目68に記載の医薬組成物。
(項目70)
前記送達システムが、RNAを含む、項目68に記載の医薬組成物。
(項目71)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターである、項目68に記載の医薬組成物。
(項目72)
前記非ウイルス送達システムが、カチオン性脂質またはポリマーを含む、項目68に記載の医薬組成物。
(項目73)
前記非ウイルス送達システムが、トランスポゾンを含む、項目68に記載の医薬組成物。
(項目74)
患者における癌を治療する方法であって、有効量の項目48~51のいずれか1項に記載の単離された細胞内抗体または項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体を発現する核酸を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
(項目75)
前記癌が乳癌である、項目74に記載の方法。
(項目76)
項目1~16のいずれか1項に記載の第一の抗体および免疫細胞上で発現された抗原に結合する第二の抗体を含む、二重特異性または多重特異性抗体。
(項目77)
前記免疫細胞が、T細胞、NK細胞、またはマクロファージである、項目76に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
(項目78)
前記抗原が、T細胞抗原である、項目76に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
(項目79)
前記T細胞抗原が、CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69、およびCD90からなる群から選択される、項目78に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
(項目80)
項目1~16のいずれか1項に記載の第一の抗体およびCD3に結合する第二の抗体を含む、二重特異性抗体。
(項目81)
フィラミンA抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチド。
(項目82)
前記フィラミンA抗原結合ドメインが、
a.CDR1、CDR2、およびCDR3を含む三つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変ドメインであって、前記軽鎖CDR1が、配列番号12および13から選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR2が、配列番号14のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR3が、配列番号15のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン;および
b.CDR1、CDR2、およびCDR3を含む三つのCDRを含む重鎖可変ドメインであって、前記重鎖CDR1は、配列番号16のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR2は、配列番号17のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR3は、配列番号18、19、20、および21から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、を含む、項目81に記載のCARポリペプチド。
(項目83)
前記軽鎖CDR1が、配列番号13を含み、前記重鎖CDR3が、配列番号21を含む、項目81に記載のCARポリペプチド。
(項目84)
前記フィラミンA抗原結合ドメインが、配列番号2を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号7を含む重鎖可変ドメインを含む、項目81のいずれか1項に記載のCARポリペプチド。
(項目85)
細胞内シグナル伝達ドメインおよび膜貫通型ドメインをさらに含む、項目81~84のいずれか1項に記載のCARポリペプチド。
(項目86)
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインを含む、項目85に記載のCARポリペプチド。
(項目87)
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、T細胞受容体(TCR)ゼータ鎖シグナル伝達ドメインである、項目85に記載のCARポリペプチド。
(項目88)
項目81~87のいずれか1項に記載のCARを発現する細胞。
(項目89)
前記細胞が、T細胞、NK細胞、NK-T細胞、B細胞、マクロファージ、または幹細胞からなる群から選択される、項目88に記載の細胞。
(項目90)
前記細胞がT細胞である、項目89に記載の細胞。
(項目91)
それを必要とする対象における癌を治療する方法であって、前記対象に項目88に記載の細胞を投与することを含む、方法。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
フィラミンA抗原に結合する抗体であって、
a.CDR1、CDR2、およびCDR3を含む三つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変ドメインであって、前記軽鎖CDR1が、配列番号12および13から選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR2が、配列番号14のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR3が、配列番号15のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン;および
b.CDR1、CDR2、およびCDR3を含む三つのCDRを含む重鎖可変ドメインであって、前記重鎖CDR1が、配列番号16のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR2が、配列番号17のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR3が、配列番号18、19、20、および21から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、を含む、抗体。
(項目2)
前記軽鎖CDR1が、配列番号13を含み、前記重鎖CDR3が、配列番号21を含む、項目1に記載の抗体。
(項目3)
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号2を含み、前記重鎖可変ドメインが、配列番号7を含む、項目1に記載の抗体。
(項目4)
前記軽鎖および重鎖可変領域が、軽鎖-重鎖の配向である、項目1~3のいずれか1項に記載の抗体。
(項目5)
前記軽鎖および重鎖可変領域が、重鎖-軽鎖の配向である、項目1~3のいずれか1項に記載の抗体。
(項目6)
c.配列番号3を含む軽鎖定常ドメイン;および
d.配列番号11を含む重鎖定常ドメインをさらに含む、項目1~5のいずれか1項に記載の抗体。
(項目7)
前記抗体がヒトキメラ抗体である、項目1~6のいずれか1項に記載の抗体。
(項目8)
前記抗体がscFvである、項目1~5のいずれか1項に記載の抗体。
(項目9)
前記抗体が細胞内抗体である、項目1~5のいずれか1項に記載の抗体。
(項目10)
前記フィラミンA抗原が、FLNA遺伝子、またはその相同体によりコードされる遺伝子産物である、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目11)
前記フィラミンA抗原が、およそ280kDaの乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンA抗原である、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目12)
前記抗体が、乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンA抗原に優先的に結合することができ、前記優先結合が、非乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンA抗原と比較である、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目13)
前記抗体が、乳癌細胞により分泌された可溶性フィラミンA抗原に10 -7 M~10 -11 Mの特異的親和性で結合することができる、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目14)
前記フィラミンA抗原が、およそ280kDaの乳癌細胞膜関連フィラミンA抗原である、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目15)
前記抗体が、乳癌細胞膜関連フィラミンA抗原に優先的に結合することができ、前記優先結合が、非乳癌細胞膜関連フィラミンA抗原と比較である、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目16)
前記抗体が、乳癌細胞膜関連フィラミンA抗原に、10 -7 M~10 -11 Mの特異的親和性で結合することができる、項目1~9のいずれか1項に記載の抗体。
(項目17)
項目1~16のいずれか1項に記載の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドDNA配列。
(項目18)
項目17に記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
(項目19)
項目18に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
(項目20)
項目19に記載の宿主細胞を培養すること、前記抗体を発現させること、および前記宿主細胞により発現された前記抗体を回収することを含む方法により産生される、抗体。
(項目21)
固相に固定される、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目22)
前記抗体が検出可能に標識される、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目23)
前記抗体が放射性核種に結合される、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目24)
前記抗体が化学療法剤に結合される、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目25)
前記抗体がタンパク質に結合される、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目26)
前記抗体が、細胞内フィラミンA抗原、細胞膜関連フィラミンA抗原、および/または可溶性フィラミンA抗原に結合する、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目27)
a.項目1~16のいずれか1項に記載の抗体;および
b.医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
(項目28)
a.一次抗体として項目1~16のいずれか1項に記載の抗体;および
b.前記一次抗体に結合する二次抗体であって、検出可能な標識に結合される二次抗体、を含む、癌を診断するためのキット。
(項目29)
前記癌が乳癌である、項目28に記載のキット。
(項目30)
患者における癌を診断する方法であって、
a.生物学的試料を患者から得ること;
b.前記生物学的試料を項目1-16のいずれか1項に記載の抗体と接触させること;および
c.前記抗体が、前記試料中のフィラミンA抗原に結合するかどうかを検出することであって、前記抗体とフィラミンA抗原の間の正の結合相互作用が、癌の指標である、検出すること、を含む、方法。
(項目31)
前記癌が乳癌である、項目30に記載の方法。
(項目32)
患者における癌を治療する方法であって、
有効量の項目1~16のいずれか1項に記載の抗体をそれを必要とする患者に投与することを含む、方法。
(項目33)
前記癌が乳癌である、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記抗体が、癌細胞の抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害活性(CDC)を誘導する、項目32に記載の方法。
(項目35)
前記抗体が、癌細胞により貪食される、項目32に記載の方法。
(項目36)
前記抗体が、治療剤に連結されるか、または結合される、項目32に記載の方法。
(項目37)
フィラミンA抗原を発現する腫瘍細胞の成長を防ぐか、または低減する方法であって、
a.それを必要とするヒト患者に、有効量の抗体を投与することであって、前記抗体が、
i.配列番号1または配列番号2を含む、軽鎖可変ドメイン;
ii.配列番号3を含む、軽鎖定常ドメイン;
iii.配列番号4、5、6、または7を含む重鎖可変ドメイン;および
iv.配列番号11を含む、重鎖定常ドメインを含む、投与することを含む、方法。
(項目38)
前記癌が乳癌である、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記抗体が、分泌された可溶性フィラミンA抗原に優先的に結合する、項目37に記載の方法。
(項目40)
前記抗体が、膜関連フィラミンA抗原に優先的に結合する、項目37に記載の方法。
(項目41)
前記抗体が、細胞内フィラミンA抗原に優先的に結合する、項目37に記載の方法。
(項目42)
前記抗体が、モノクローナル抗体である、項目37に記載の方法。
(項目43)
前記抗体が、ヒトキメラ抗体である、項目37に記載の方法。
(項目44)
前記抗体が、ヒト化抗体である、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記抗体が、フィラミンAに対するマウス抗体と比較して、低減した免疫原性を示し、前記患者から負の免疫応答を導かない、項目43または44に記載の方法。
(項目46)
前記抗体が、細胞内抗体である、項目37に記載の方法。
(項目47)
前記抗体が、細胞内局在化のため改変されている、項目1~16のいずれか1項に記載の抗体。
(項目48)
細胞内に局在化しているフィラミンA抗原に結合する、細胞内抗体。
(項目49)
a.CDR1、CDR2、およびCDR3を含む三つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変ドメインであって、前記軽鎖CDR1が、配列番号12および13から選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR2が、配列番号14のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR3が、配列番号15のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン;および
b.CDR1、CDR2、およびCDR3を含む三つのCDRを含む重鎖可変ドメインであって、前記重鎖CDR1が、配列番号16のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR2が、配列番号17のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR3が、配列番号18、19、20、および21から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、を含む、項目48に記載の細胞内抗体。
(項目50)
前記軽鎖CDR1が、配列番号13を含み、前記重鎖CDR3が、配列番号21を含む、項目48に記載の細胞内抗体。
(項目51)
前記軽鎖可変ドメインが、配列番号2を含み、前記重鎖可変ドメインが、配列番号7を含む、項目48に記載の細胞内抗体。
(項目52)
前記フィラミンA抗原が、FLNA遺伝子、またはその相同体によりコードされる遺伝子産物である、項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体。
(項目53)
前記細胞内抗体が、フィラミンAに、10 -7 M~10 -11 Mの特異的親和性で結合することができる、項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体。
(項目54)
前記細胞内抗体が、scFvである、項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体。
(項目55)
項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体をコードする、単離されたRNA。
(項目56)
項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドDNA配列。
(項目57)
項目55に記載のRNAまたは項目56に記載のポリヌクレオチドを含む、単離されたベクター。
(項目58)
項目57に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
(項目59)
項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体および前記細胞内抗体を細胞膜を超えて転座させるためのタンパク質を含む、融合タンパク質。
(項目60)
項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体および前記細胞内抗体を細胞内構造に標的化するためのタンパク質を含む、融合タンパク質。
(項目61)
前記細胞内抗体が検出可能に標識される、項目48~51のいずれか1項に記載の単離された細胞内抗体。
(項目62)
前記細胞内抗体が放射性核種に結合される、項目48~51のいずれか1項に記載の単離された細胞内抗体。
(項目63)
前記細胞内抗体が化学療法剤に結合される、項目45~51のいずれか1項に記載の単離された細胞内抗体。
(項目64)
前記細胞内抗体がタンパク質に結合される、項目48~51のいずれか1項に記載の単離された細胞内抗体。
(項目65)
前記細胞内抗体が、細胞膜透過ペプチドもしくはタンパク質、または他の化学的部分に連結されるか、または結合される、項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体。
(項目66)
a.項目48~51のいずれか1項に記載の単離された細胞内抗体;および
b.医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
(項目67)
a.項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体をコードするDNAまたはRNAを含む送達システム;および
b.医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
(項目68)
前記送達システムが、プラスミド、RNA、ウイルスベクター、または非ウイルス送達システムを含む、項目67に記載の医薬組成物。
(項目69)
前記プラスミドが、真核生物のプロモーターを含む細菌プラスミドである、項目68に記載の医薬組成物。
(項目70)
前記送達システムが、RNAを含む、項目68に記載の医薬組成物。
(項目71)
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターである、項目68に記載の医薬組成物。
(項目72)
前記非ウイルス送達システムが、カチオン性脂質またはポリマーを含む、項目68に記載の医薬組成物。
(項目73)
前記非ウイルス送達システムが、トランスポゾンを含む、項目68に記載の医薬組成物。
(項目74)
患者における癌を治療する方法であって、有効量の項目48~51のいずれか1項に記載の単離された細胞内抗体または項目48~51のいずれか1項に記載の細胞内抗体を発現する核酸を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
(項目75)
前記癌が乳癌である、項目74に記載の方法。
(項目76)
項目1~16のいずれか1項に記載の第一の抗体および免疫細胞上で発現された抗原に結合する第二の抗体を含む、二重特異性または多重特異性抗体。
(項目77)
前記免疫細胞が、T細胞、NK細胞、またはマクロファージである、項目76に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
(項目78)
前記抗原が、T細胞抗原である、項目76に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
(項目79)
前記T細胞抗原が、CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69、およびCD90からなる群から選択される、項目78に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
(項目80)
項目1~16のいずれか1項に記載の第一の抗体およびCD3に結合する第二の抗体を含む、二重特異性抗体。
(項目81)
フィラミンA抗原結合ドメインを含む、キメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチド。
(項目82)
前記フィラミンA抗原結合ドメインが、
a.CDR1、CDR2、およびCDR3を含む三つの相補性決定領域(CDR)を含む軽鎖可変ドメインであって、前記軽鎖CDR1が、配列番号12および13から選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR2が、配列番号14のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR3が、配列番号15のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン;および
b.CDR1、CDR2、およびCDR3を含む三つのCDRを含む重鎖可変ドメインであって、前記重鎖CDR1は、配列番号16のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR2は、配列番号17のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR3は、配列番号18、19、20、および21から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、を含む、項目81に記載のCARポリペプチド。
(項目83)
前記軽鎖CDR1が、配列番号13を含み、前記重鎖CDR3が、配列番号21を含む、項目81に記載のCARポリペプチド。
(項目84)
前記フィラミンA抗原結合ドメインが、配列番号2を含む軽鎖可変ドメインおよび配列番号7を含む重鎖可変ドメインを含む、項目81のいずれか1項に記載のCARポリペプチド。
(項目85)
細胞内シグナル伝達ドメインおよび膜貫通型ドメインをさらに含む、項目81~84のいずれか1項に記載のCARポリペプチド。
(項目86)
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激ドメインを含む、項目85に記載のCARポリペプチド。
(項目87)
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、T細胞受容体(TCR)ゼータ鎖シグナル伝達ドメインである、項目85に記載のCARポリペプチド。
(項目88)
項目81~87のいずれか1項に記載のCARを発現する細胞。
(項目89)
前記細胞が、T細胞、NK細胞、NK-T細胞、B細胞、マクロファージ、または幹細胞からなる群から選択される、項目88に記載の細胞。
(項目90)
前記細胞がT細胞である、項目89に記載の細胞。
(項目91)
それを必要とする対象における癌を治療する方法であって、前記対象に項目88に記載の細胞を投与することを含む、方法。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862743169P | 2018-10-09 | 2018-10-09 | |
US62/743,169 | 2018-10-09 | ||
PCT/US2019/055401 WO2020076954A1 (en) | 2018-10-09 | 2019-10-09 | Antibodies directed to filamin-a and therapeutic uses thereof |
JP2021519606A JP7442769B2 (ja) | 2018-10-09 | 2019-10-09 | フィラミンaに対する抗体およびその治療上の使用 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021519606A Division JP7442769B2 (ja) | 2018-10-09 | 2019-10-09 | フィラミンaに対する抗体およびその治療上の使用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024003141A true JP2024003141A (ja) | 2024-01-11 |
JP2024003141A5 JP2024003141A5 (ja) | 2024-04-19 |
Family
ID=70164718
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021519606A Active JP7442769B2 (ja) | 2018-10-09 | 2019-10-09 | フィラミンaに対する抗体およびその治療上の使用 |
JP2023192525A Pending JP2024003141A (ja) | 2018-10-09 | 2023-11-10 | フィラミンaに対する抗体およびその治療上の使用 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021519606A Active JP7442769B2 (ja) | 2018-10-09 | 2019-10-09 | フィラミンaに対する抗体およびその治療上の使用 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220025025A1 (ja) |
EP (1) | EP3863687A4 (ja) |
JP (2) | JP7442769B2 (ja) |
KR (1) | KR20210075132A (ja) |
CN (1) | CN113164633B (ja) |
AU (1) | AU2019358060A1 (ja) |
CA (1) | CA3115077A1 (ja) |
IL (1) | IL281932A (ja) |
WO (1) | WO2020076954A1 (ja) |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1383922A4 (en) * | 2001-04-10 | 2005-03-30 | Agensys Inc | NUCLEIC ACID AND ASSOCIATED PROTEIN SUITABLE FOR THE TREATMENT AND DETECTION OF CANCER WITH THE LABEL 158P3D2 |
CA2445746C (en) * | 2001-04-30 | 2012-09-18 | City Of Hope | Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers |
AU2002356522A1 (en) * | 2001-09-04 | 2003-04-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Polynucleotide encoding adapter protein, pmn29 |
US7553944B2 (en) * | 2004-07-21 | 2009-06-30 | The University Of Hong Kong | Human virus causing respiratory tract infection and uses thereof |
CA2677371A1 (en) * | 2007-02-06 | 2008-08-14 | Ribovax Biotechnologies S.A. | Antibodies specific for varicella zoster virus |
CA2705509A1 (en) * | 2007-11-14 | 2009-05-22 | Forerunner Pharma Research Co., Ltd. | Diagnosis and treatment of cancer using anti-gpr49 antibody |
FR2929946B1 (fr) * | 2008-04-11 | 2010-05-28 | Pf Medicament | Nouveaux anticorps anti-cd151 et leur utilisation pour le traitement du cancer |
US9891232B2 (en) * | 2010-11-09 | 2018-02-13 | Sarcotein Diagnostics, Llc | BIN1 expression as a marker of skeletal muscle mass and neurological conditions |
FR2971250A1 (fr) * | 2011-02-07 | 2012-08-10 | Univ Nantes | Anticorps anti-gb3 utiles dans le traitement des maladies associees a l'angiogenese |
GB201223097D0 (en) * | 2012-12-20 | 2013-02-06 | Max Planck Gesellschaft | Stable transformation of a population and a method of biocontainment using haploinsufficiency and underdominance principles |
WO2016094425A1 (en) * | 2014-12-08 | 2016-06-16 | Berg Llc | Use of markers including filamin a in the diagnosis and treatment of prostate cancer |
WO2016205704A2 (en) * | 2015-06-17 | 2016-12-22 | International Aids Vaccine Initiative | Engineered outer domain (eod) of hiv gp120, mutants and use thereof |
WO2018000324A1 (zh) * | 2016-06-30 | 2018-01-04 | 张军方 | 一种将抗体导入细胞内的方法 |
US11649285B2 (en) * | 2016-08-03 | 2023-05-16 | Bio-Techne Corporation | Identification of VSIG3/VISTA as a novel immune checkpoint and use thereof for immunotherapy |
WO2018085431A1 (en) | 2016-11-01 | 2018-05-11 | Berg Llc | Filamin a binding proteins and uses thereof |
-
2019
- 2019-10-09 AU AU2019358060A patent/AU2019358060A1/en active Pending
- 2019-10-09 WO PCT/US2019/055401 patent/WO2020076954A1/en unknown
- 2019-10-09 KR KR1020217013718A patent/KR20210075132A/ko unknown
- 2019-10-09 JP JP2021519606A patent/JP7442769B2/ja active Active
- 2019-10-09 CA CA3115077A patent/CA3115077A1/en active Pending
- 2019-10-09 EP EP19871405.7A patent/EP3863687A4/en active Pending
- 2019-10-09 US US17/283,434 patent/US20220025025A1/en active Pending
- 2019-10-09 CN CN201980080604.2A patent/CN113164633B/zh active Active
-
2021
- 2021-03-31 IL IL281932A patent/IL281932A/en unknown
-
2023
- 2023-11-10 JP JP2023192525A patent/JP2024003141A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20220025025A1 (en) | 2022-01-27 |
KR20210075132A (ko) | 2021-06-22 |
AU2019358060A1 (en) | 2021-04-29 |
EP3863687A1 (en) | 2021-08-18 |
JP2022512644A (ja) | 2022-02-07 |
JP7442769B2 (ja) | 2024-03-05 |
CA3115077A1 (en) | 2020-04-16 |
CN113164633B (zh) | 2023-11-21 |
EP3863687A4 (en) | 2022-08-31 |
IL281932A (en) | 2021-05-31 |
WO2020076954A1 (en) | 2020-04-16 |
CN113164633A (zh) | 2021-07-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11760795B2 (en) | Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (GDF-15), and uses thereof for treating cancer cachexia and cancer | |
EP2900263B1 (en) | Monoclonal antibodies to growth and differentiation factor 15 (gdf-15) | |
US8722362B2 (en) | Monoclonal antibodies against HER2 antigens, and uses therefor | |
US20040057952A1 (en) | Antibodies to non-shed Muc1 and Muc16, and uses thereof | |
US20210269549A1 (en) | Anti-sas1b antibodies, associated methods of use, and compositions and methods for detecting and treating cancer | |
US11667700B2 (en) | Anti-PCNA monoclonal antibodies and use thereof | |
BR112020019553A2 (pt) | Anticorpo, polinucleotídeos, vetores, células, métodos para preparar um anticorpo e para detectar especificamente claudina, composições, conjugados, proteínas, usos, métodos de detecção específica, diagnóstico do câncer, de imagiologia do câncer, detratamento do câncer, de entrega de fármaco, de prevenção e tratamento do câncer e de entrega intracelular de fármaco | |
JP7442769B2 (ja) | フィラミンaに対する抗体およびその治療上の使用 | |
JP2005519120A (ja) | 個別化抗ガン抗体 | |
KR20220131233A (ko) | Semg2 항체 및 이의 용도 | |
RU2816856C2 (ru) | Антитела, нацеленные на epn1 | |
WO2017147247A1 (en) | Anti-sas1b antibodies and methods of use | |
BARAL et al. | Patent 2813133 Summary |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231110 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240410 |