CN113164633B - 针对细丝蛋白-a的抗体及其治疗用途 - Google Patents

针对细丝蛋白-a的抗体及其治疗用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113164633B
CN113164633B CN201980080604.2A CN201980080604A CN113164633B CN 113164633 B CN113164633 B CN 113164633B CN 201980080604 A CN201980080604 A CN 201980080604A CN 113164633 B CN113164633 B CN 113164633B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
filamin
cell
antigen
intracellular
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201980080604.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113164633A (zh
Inventor
M·J·卡林
A·M·克罗西
V·F·德拉科鲁兹
N·Z·莱
R·费森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abix Biosciences
Original Assignee
Abix Biosciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abix Biosciences filed Critical Abix Biosciences
Publication of CN113164633A publication Critical patent/CN113164633A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113164633B publication Critical patent/CN113164633B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/812—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/86—Lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/884—Vaccine for a specifically defined cancer prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/80—Immunoglobulins specific features remaining in the (producing) cell, i.e. intracellular antibodies or intrabodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4712—Muscle proteins, e.g. myosin, actin, protein

Abstract

本公开内容教导了尤其可用在用于检测和治疗人癌症的方法中的抗体。在一个特定方面，本公开内容教导了可用于检测和治疗人乳腺癌的新颖抗体。在某些实施方案中，本公开内容教导了结合细丝蛋白A的新颖抗体。在某些实施方案中，所述抗体是细胞内抗体。

Description

针对细丝蛋白-A的抗体及其治疗用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年10月9日提交的美国临时申请号62/743,169的权益，其整个内容特此通过引用并入。
电子提交的文本文件的描述
随同以电子方式提交的文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读形式副本(文件名称:IBEX_004_03WO_ST25.txt:记录日期：2019年10月9日；文件大小:4千字节)。
技术领域
本公开内容涉及单克隆抗体(mAb)及其片段，分泌所述抗体或其片段的新的蛋白表达细胞系，以及所述抗体和抗体片段在优先检测抗原和/或治疗疾病中的用途。在某些实施方案中，本文提供的抗体及其片段调节细胞转移。本公开内容的特定实施方案教导了可用于治疗人癌症(例如，乳腺癌)的人嵌合mAb、细胞内抗体和细胞免疫疗法。
背景技术
癌症是一种多方面的疾病，其特征是源自给定正常组织的异常细胞的数量的增加，这些细胞通常通过经由血液或淋巴系统扩散到身体的其它区域而侵入邻近组织或发生转移。癌症通常通过多步骤过程而进展，该过程开始于微小癌前变化，其可能进展至瘤形成。赘生性病变可能发展增加的侵袭、生长、转移和异质性的能力。
癌症的种类繁多，其实例包括肺癌、结肠癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、脑癌和肠癌。随着人口的老龄化、新癌症的发展以及易感人群的增加，癌症的发病率继续攀升。对于可用于治疗具有癌症的患者的新方法和组合物存在相当大的需求。
目前治疗癌症的方法是相当非选择性的。外科手术除去患病的组织，放射疗法缩小实体块，化学疗法杀死快速分裂的细胞。放射和化学疗法与多种不希望的副作用有关，例如与癌细胞一起健康细胞的非选择性破坏。
因此，本领域中仍然需要开发治疗癌症的方法，其不会遭受与当前治疗相关的缺点。具体地，在本领域中非常需要开发优先靶向转移性细胞并且不破坏健康细胞的高度选择性的治疗剂。
就乳腺癌而言，对新的高度选择性的癌症治疗剂和治疗的需求尤为迫切。乳腺癌是除了皮肤癌以外在美国女性中最常见的癌症。在美国，约八分之一(12％)的女性在其一生中会发生侵袭性乳腺癌。美国癌症学会(American Cancer Society)对2015年美国乳腺癌的估计为：将在女性中诊断出约231,840例新的侵袭性乳腺癌病例；将诊断出约60,290例新的原位癌(CIS)病例(CIS是非侵袭性的，并且是乳腺癌的最早形式)；和约40,290名女性将死于乳腺癌。这些是令人震惊的统计数据，并突显了本领域中对开发新的治疗剂和方法以选择性地靶向和预防乳腺癌扩散的巨大需求。
发明内容
本公开内容尤其通过提供新颖的抗体及其片段(包括单克隆抗体(mAb))来满足医学界的前述需求。在某些实施方案中，所述mAb选择性地靶向和治疗癌症(例如，人乳腺癌)。在某些实施方案中，本文提供的抗体是细胞内抗体。
在一个方面，本公开内容提供了抗体，诸如结合细丝蛋白-A抗原的单克隆抗体(mAb)。在某些方面，本文所述的抗体是人嵌合mAb，其优先结合由哺乳动物细胞(诸如人乳腺癌细胞)分泌的细丝蛋白-A抗原。在其它方面，人嵌合mAb优先结合与哺乳动物细胞(诸如人乳腺癌细胞)的细胞膜相关的细丝蛋白-A抗原。在某些方面，本文提供的抗体或片段是基于细胞的免疫疗法(例如，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T))的一部分，其中所述抗体或片段结合与哺乳动物细胞(诸如人乳腺癌细胞)的细胞膜相关的细丝蛋白-A抗原。在其它方面，本文教导的抗体是细胞内抗体。因此，在某些实施方案中，所述抗体可以结合细胞内的细丝蛋白-A抗原。在某些实施方案中，本文教导的抗体可以结合细胞内囊泡内的细丝蛋白-A抗原。在其它实施方案中，本文教导的抗体可以结合细胞外微囊泡或外核体内的细丝蛋白-A抗原。
本公开内容不仅提供了能够选择性靶向来自癌细胞的细丝蛋白-A抗原的新型治疗性mAb，而且教导了包含所述抗体的药物组合物，以及用所述抗体治疗患者的方法。在某些实施方案中，所述抗体诱导抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)。在某些实施方案中，本公开内容提供了用于将靶向治疗剂递送至表达细丝蛋白-A抗原的癌细胞的抗体。在其它实施方案中，所述靶向治疗剂选自放射性核苷酸、活性治疗剂、药物、化学治疗剂、其它抗体、纳米颗粒和基因疗法载体。在某些实施方案中，本公开内容提供了与治疗剂连接或缀合的抗体，其中所述抗体被癌细胞内吞。
在某些实施方案中，本公开内容提供了在细胞内表达对细丝蛋白-A抗原特异性的细胞内抗体的方法。在其它实施方案中，所述细胞是癌细胞。
在某些实施方案中，本公开内容提供了结合细丝蛋白-A抗原的抗体，其中所述抗体包含根据SEQ ID NO:18、19、20或21的重链CDR3区域。这样的抗体可以是单克隆抗体、抗体片段、分离的人嵌合抗体和/或细胞内抗体。
在一个实施方案中，本公开内容提供了结合细丝蛋白-A抗原的抗体，例如，分离的人嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段或细胞内抗体，其包含：含有三个互补性决定区(CDR)CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变结构域。在某些实施方案中，所述轻链CDR1包含选自SEQ IDNO:12和13的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述轻链CDR2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述轻链CDR3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开内容提供了结合细丝蛋白-A抗原的分离的人嵌合抗体、抗体片段或细胞内抗体，其包含：含有三个互补性决定区(CDR)CDR1、CDR2和CDR3的重链可变结构域。在某些实施方案中，所述重链CDR1包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述重链CDR2包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述重链CDR3包含选自SEQ ID NO:18、19、20和21的氨基酸序列。
在公开的抗体(例如，分离的人嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段或细胞内抗体)的一个实施方案中，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。在一个实施方案中，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:4、5、6或7。在一个实施方案中，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:1，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:1，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:5。在一个实施方案中，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:1，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:6。在一个实施方案中，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:1，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7。在一个实施方案中，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:2，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:2，且所述重链可变区包含SEQ IDNO:5。在一个实施方案中，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:2，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:6。在一个实施方案中，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:2，且所述重链可变区包含SEQ ID NO:7。
在公开的抗体(例如，分离的人嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段或细胞内抗体)的一个实施方案中，所述轻链恒定结构域包含SEQ ID NO:3；且所述重链恒定结构域包含SEQID NO:11。
在某些实施方案中，所述抗体是scFv，其包含含有SEQ ID NO:1或2的轻链可变结构域和含有SEQ ID NO:4、5、6或7的重链可变结构域。在其它实施方案中，所述抗体是scFv，其包含含有SEQ ID NO:2的轻链可变结构域和含有SEQ ID NO:7的重链可变结构域。在某些实施方案中，所述scFv抗体是细胞内抗体。
在公开的抗体(例如，分离的人嵌合抗体、人源化抗体、抗体片段或细胞内抗体)的一个实施方案中，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO:1或2且所述轻链恒定结构域包含SEQ ID NO:3且所述重链可变结构域包含SEQ ID NO:4、5、6或7且所述重链恒定结构域包含SEQ ID NO:11。在某些实施方案中，公开的分离的人嵌合抗体包含：含有SEQ ID NO:2的轻链可变结构域，含有SEQ ID NO:3的轻链恒定结构域，含有SEQ ID NO:7的重链可变结构域，和含有SEQ ID NO:11的重链恒定结构域。
在某些实施方案中，所述抗体或细胞内抗体包含本文提供的轻链和重链可变区，其中所述可变区处于轻-重取向。因而，在某些实施方案中，所述轻链可变区位于所述重链可变区的氨基端。在其它实施方案中，所述抗体或细胞内抗体包含，从氨基端至羧基端，轻链可变区和重链可变区。在其它实施方案中，所述抗体或细胞内抗体包含，从氨基端至羧基端，轻链可变区、接头和重链可变区。
在某些实施方案中，所述抗体或细胞内抗体包含本文提供的轻链和重链可变区，其中所述可变区处于重-轻取向。因而，在某些实施方案中，所述重链可变区位于所述轻链可变区的氨基端。在其它实施方案中，所述抗体或细胞内抗体包含，从氨基端至羧基端，重链可变区和轻链可变区。在其它实施方案中，所述抗体或细胞内抗体包含，从氨基端至羧基端，重链可变区、接头和轻链可变区。在一个方面，所述细丝蛋白-A抗原是由FLNA基因编码的基因产物或其同系物。在某些实施方案中，所述细丝蛋白-A抗原是细胞内的。在某些实施方案中，所述细丝蛋白-A抗原由细胞(诸如癌细胞)分泌。在某些实施方案中，所述细丝蛋白-A抗原与细胞表面有关，例如细胞膜相关的细丝蛋白-A抗原。在另一个方面，所述细丝蛋白-A抗原附着至细胞相关结构(诸如膜或囊泡)和/或与其有关。因而，在某些实施方案中，本文提供的抗体可以结合细胞内的细丝蛋白-A抗原。在某些实施方案中，所述细丝蛋白-A抗原附着至微囊泡和/或与其有关。在某些实施方案中，所述细丝蛋白-A抗原附着至外核体或其它多组分复合物和/或与其有关。在某些实施方案中，所述细丝蛋白-A抗原是片段。在一个方面，所述细丝蛋白-A抗原是由乳腺癌细胞分泌的大约280-kDa可溶性细丝蛋白-A抗原。
在某些实施方案中，本文提供的抗体能够优先结合细丝蛋白-A抗原或其片段，其中所述优先结合是相对于非乳腺癌细丝蛋白-A抗原。在某些实施方案中，所述乳腺癌细胞细丝蛋白-A抗原是可溶性细丝蛋白-A抗原。在某些实施方案中，所述乳腺癌细胞细丝蛋白-A抗原与细胞表面有关。在某些实施方案中，将所述乳腺癌细胞细丝蛋白-A抗原掺入微囊泡诸如外核体或多组分复合物中。在某些实施方案中，所述乳腺癌细胞细丝蛋白-A抗原以分泌的可溶形式存在且与细胞表面和/或囊泡有关和/或附着。
在某些实施方案中，所述抗体能够以约10-5M至约10-12M之间的特异性亲和力结合细丝蛋白-A抗原。在其它实施方案中，所述抗体能够以约10-7M至约10-11M之间的特异性亲和力结合细丝蛋白-A抗原。在其它实施方案中，所述抗体能够以约10-8M至约10-11M之间的特异性亲和力结合细丝蛋白-A抗原。
本文还教导了分离的多核苷酸DNA序列，其编码本文提供的抗体。例如，本公开内容提供了分离的多核苷酸DNA序列，其编码本文提供的人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。本文还提供了载体，其包含编码本文提供的抗体的多核苷酸DNA序列。本文还提供了包含所述载体的宿主细胞。在某些实施方案中，本公开内容提供了一种分离的核酸，其编码本文提供的细胞内抗体。在某些实施方案中，所述分离的核酸是多核苷酸DNA序列。在某些实施方案中，所述核酸是RNA序列。在某些实施方案中，本公开内容提供了一种RNA，其编码本文提供的细胞内抗体，其中由所述RNA编码的细胞内抗体在转染的细胞中瞬时表达。
本公开内容提供了产生针对细丝蛋白-A的分离的人嵌合抗体的方法，其包括：培养具有表达所述抗体的载体的宿主细胞，表达所述抗体，和回收由所述宿主细胞表达的抗体。
本公开内容提供了用于产生针对细丝蛋白-A的细胞内抗体的组合物和方法，用于将细胞内抗体基因或蛋白递送至靶细胞的组合物和方法，以及用于将细胞内抗体基因或蛋白递送至细胞内的特定亚细胞位置的组合物和方法。公开的方法包括经由重组病毒的递送，非病毒基因递送方法(纳米载体递送系统，诸如聚合物或阳离子脂质递送系统)，或经由机械递送技术的其它质粒或转座子系统，以及使用细胞膜穿透肽或蛋白的递送。因而，本公开内容提供了组合物，其包含：纳米载体和本文提供的细胞内抗体；以及与细胞穿透肽或化学部分融合或连接的细胞内抗体。在某些实施方案中，所述非病毒载体是转座元件或转座子。在其它实施方案中，所述非病毒载体包含睡美人转座子、piggyBac转座子或本领域已知的任何其它转座子。在某些实施方案中，所公开的方法包括经由基因编辑系统的递送。例如，在某些实施方案中，所公开的方法包括通过以下系统的递送：(i)成簇的规律间隔的回文重复序列(CRISPR)-相关的(Cas)系统；(ii)转录激活子样效应核酸酶(TALEN)系统；或(iii)锌指核酸酶(ZFN)系统。
在某些实施方案中，本公开内容提供了一种质粒，其包含编码本文提供的细胞内抗体的基因。在某些实施方案中，所述质粒是细菌，或起源于细菌，或衍生自非细菌来源，例如，真菌、藻类或植物。在某些实施方案中，所述核酸是包含真核启动子以驱动细胞内抗体的表达的质粒。在其它实施方案中，所述质粒包含CMV启动子。
在某些实施方案中，所述方法包括递送细胞内抗体，该细胞内抗体具有用于将细胞内抗体靶向亚细胞结构的序列。细胞内抗体可能靶向的亚细胞结构包括，例如，细胞核、内质网(ER)、高尔基体、线粒体或溶酶体。在某些实施方案中，所述核酸可以在细胞中稳定或瞬时表达。在某些实施方案中，稳定表达是指核酸已经整合到细胞基因组中；在某些实施方案中，瞬时表达是指转染的基因表达有限的时间段。在某些实施方案中，RNA、siRNA、miRNA或mRNA用于实现细胞内抗体在细胞中的瞬时表达。
在某些方面，所教导的抗体被固定在固相上。在某些方面，所教导的抗体被可检测地标记。在某些方面，本文提供的抗体缀合至药物，例如细胞毒性药物。因此，在某些实施方案中，本公开内容提供了抗体-药物缀合物。在某些实施方案中，本文提供的抗体-药物缀合物通过胞吞作用内化。在某些方面，所教导的抗体缀合至放射性核素、或活性治疗剂、或药物、或化学治疗剂、或蛋白、或其它抗体。
本公开内容也提供了药物组合物，其包含：本文提供的抗体(例如，对细丝蛋白-A抗原特异性的分离的人嵌合抗体)；和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含本文提供的细胞内抗体(例如，对细丝蛋白-A抗原特异性的细胞内抗体)的药物组合物，或包含编码本文提供的细胞内抗体的基因或核酸的递送系统。例如，在某些实施方案中，本公开内容提供了一种药物组合物，其包含编码本文提供的细胞内抗体的DNA或RNA。在某些实施方案中，包含编码本文提供的细胞内抗体的基因或核酸的递送系统是非病毒或病毒递送系统。例如，在某些实施方案中，所述病毒的递送系统是慢病毒载体或腺病毒载体。在某些实施方案中，所述药物组合物进一步包含用于将细胞内抗体靶向递送至亚细胞位置的基因或蛋白。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞的药物组合物，其中所述CAR包含本文提供的细丝蛋白-A结合结构域。
本公开内容也教导了用于诊断人癌症的试剂盒，其包含：本文提供的抗体(例如，对细丝蛋白-A抗原特异性的分离的人嵌合抗体，和/或对细丝蛋白-A抗原特异性的细胞内抗体)；和结合所述抗体的第二抗体，其中所述第二抗体缀合至可检测标记物。例如，在某些实施方案中，本公开内容提供了用于诊断人乳腺癌的试剂盒，其包含对细丝蛋白-A抗原特异性的分离的人嵌合抗体和缀合至可检测标记物的第二抗体。
本文还教导了用于诊断患者中的癌症的方法，其包括：从患者得到生物样品；使所述生物样品与本文提供的抗体(例如，对细丝蛋白-A抗原特异性的分离的人嵌合抗体,和/或对细丝蛋白-A抗原特异性的细胞内抗体)接触；和检测所述抗体是否结合癌细胞分泌的可溶性细丝蛋白-A抗原，和/或是否结合癌细胞膜有关的或结合的细丝蛋白-A抗原，和/或是否结合细胞内的细丝蛋白-A抗原，其中所述抗体和细丝蛋白-A抗原之间的阳性结合相互作用指示癌症。在其它实施方案中，所述癌症是人乳腺癌。
本公开内容还提供了治疗患者中的癌症的方法，其包括：施用有效量的本文提供的抗体。例如，本公开内容提供了治疗方法，其包括：给有此需要的患者施用对细丝蛋白-A抗原特异性的分离的人嵌合抗体，和/或对细丝蛋白-A抗原特异性的细胞内抗体，和/或包含CAR的免疫细胞，所述CAR包含本文提供的细丝蛋白-A抗体或其片段(例如，细丝蛋白-A结合结构域)。在其它实施方案中，所述癌症是人乳腺癌。在某些实施方案中，本文提供的抗体结合癌细胞并诱导补体依赖性的细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)。
此外，本公开内容教导了用于预防或减少表达细丝蛋白-A抗原的癌症肿瘤细胞的生长的方法，其包括：给有此需要的人患者施用有效量的本文提供的抗体。在某些实施方案中，所述方法包括施用抗体，所述抗体包含：选自SEQ ID NO:12和13的轻链CDR1；SEQ IDNO:14的轻链CDR2；SEQ ID NO:15的轻链CDR3；SEQ ID NO:16的重链CDR1；SEQ ID NO:17的重链CDR2；和/或选自SEQ ID NO:18、19、20和21的重链CDR3。在某些实施方案中，所述抗体包含分别根据SEQ ID NO:13、14和15的轻链CDR1、CDR2和CDR3；和分别根据SEQ ID NO:16、17和21的重链CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:2的轻链可变区和含有SEQ ID NO:7的重链可变区。
在某些实施方案中，相对于非癌细胞分泌的可溶性细丝蛋白-A抗原，所述抗体优先结合哺乳动物癌细胞(诸如乳腺癌细胞)分泌的可溶性细丝蛋白-A抗原。在某些实施方案中，所述抗体优先结合在细胞内的和/或位于囊泡(诸如外核体)中的细丝蛋白-A抗原。
在某些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，抗体是人嵌合抗体。在某些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，所述抗体是全人抗体。在某些实施方案中，所述抗体是细胞内抗体。
在某些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体包含：结合细丝蛋白-A抗原的本文提供的第一抗体，和结合免疫细胞上的抗原的第二抗体。在某些实施方案中，所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。在某些实施方案中，所述抗原是T细胞抗原。在某些实施方案中，所述T细胞抗原选自CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90。在某些实施方案中，所述抗体是结合细丝蛋白-A抗原和CD3的双特异性抗体。
在其它实施方案中，与针对细丝蛋白-A的鼠抗体相比，所述分离的人嵌合抗体表现出降低的免疫原性，并且不导致来自施用抗体的患者的阴性免疫应答。在其它实施方案中，将公开的抗体人源化以进一步降低所述抗体的免疫原性。在其它方面，通过人源化以外的其它方法(例如通过“去免疫化”抗体)，降低抗体的免疫原性。
附图说明
图1：活动力测定的结果，如RFU所报道。将结果表示为在图的左侧显示的多种实验处理和对照存在下MDA-MB-231和HEK-293细胞的活动力。
图2：MDA-MB-231细胞的活动力测定的图解表示。误差棒表示标准差，且彩色棒的峰值表示合并的数据的平均RFU。数据出现在三个峰中，每个峰代表所利用的组织培养板表面涂层。具体而言，对于每种处理，左边的条是TC(无涂层)；中间的条是胶原包被的孔，且右边的条是纤连蛋白包被的孔。数据表明，在1μg/mL处理下，人嵌合mAb比鼠mAb导致更大的细胞活动力降低。
图3：用DAPI DNA染料、TI10细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT 488染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图4：用DAPI DNA染料、AHO1402细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT 488染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图5：用DAPI DNA染料、小鼠细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT 488染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图6：用DAPI DNA染料、嵌合的细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT488染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图7：用DAPI DNA染料、β肌动蛋白兔多克隆抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图8：用DAPI DNA染料、抗-小鼠IgG驴抗体+DYLIGHT 488染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图9：用DAPI DNA染料、抗-人IgG驴抗体+荧光素染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图10：用DAPI DNA染料、F(ab’)2抗-兔IgG驴抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图11：用DAPI DNA染料、TI10细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT488染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图12：用DAPI DNA染料、TI10细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT488染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图13：用DAPI DNA染料、AHO1402细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT 488染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图14：用DAPI DNA染料、AHO1402细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT 488染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图15：用DAPI DNA染料、小鼠细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT488染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图16：用DAPI DNA染料、小鼠细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT488染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图17：用DAPI DNA染料、嵌合的细丝蛋白-A抗体+荧光素染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图18：用DAPI DNA染料、嵌合的细丝蛋白-A抗体+荧光素染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图19：用DAPI DNA染料、TI10细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT488染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图20：用DAPI DNA染料、TI10细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT488染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图21：用DAPI DNA染料、AHO1402细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT 488染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图22：用DAPI DNA染料、AHO1402细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT 488染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图23：用DAPI DNA染料、小鼠细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT488染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图24：用DAPI DNA染料、小鼠细丝蛋白-A抗体+DYLIGHT488染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图25：用DAPI DNA染料、嵌合的细丝蛋白-A抗体+荧光素染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图26：用DAPI DNA染料、嵌合的细丝蛋白-A抗体+荧光素染料和β肌动蛋白兔抗体+罗丹明染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图27：用DAPI DNA染料、来自驴的小鼠IgG抗体+DYLIGHT488染料染色的MDA-MB-231癌细胞的免疫荧光显微照片。
图28：SEQ ID NO:73和利用Abysis数据库通过Chothia、ABM、Kabat和Contact系统预测的CDR区域之间的残基比对的描述；人嵌合轻链可变CDR结合结构域区域的预测的CDR区域。
图29：SEQ ID NO:4和利用Abysis数据库通过Chothia、ABM、Kabat和Contact系统预测的CDR区域之间的残基比对的描述；人嵌合重链可变CDR结合结构域区域的预测的CDR区域。
图30：SEQ ID NO:74和利用Abysis数据库通过Chothia、ABM、Kabat和Contact系统预测的CDR区域之间的残基比对的描述；鼠轻链可变CDR结合结构域区域的预测的CDR区域。
图31：SEQ ID NO:24和利用Abysis数据库通过Chothia、ABM、Kabat和Contact系统预测的CDR区域之间的残基比对的描述；鼠重链可变CDR结合结构域区域的预测的CDR区域。
图32：在细胞迁移测定中与缓冲液对照(左图)或细丝蛋白A抗体B411(右图)一起过夜温育后MDA-MB-321细胞的荧光染色的图像。
图33：条形图表明，B411抑制DU145(癌症)细胞增殖。将DU145或HEK293A(非癌症)细胞未处理或用1μg或10μg B4111处理24或48小时并通过OD412参考OD650测量细胞增殖。
图34：在感染后72小时A549细胞中的GFP表达的直方图。图34A显示了假转染的细胞。图34B、34C和34D分别显示了LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP转染的细胞。图34E是图34A-D的合并。每组的总非门控采集事件(细胞数目)：10,000。
图35：转染后72小时转染的A549细胞中的CDR(Calcein Deep Red，钙黄绿素深红)的直方图(GFP门控的细胞的活细胞分析)。图35A是未染色的对照。图35B是阳性对照。图35C、35D和35E分别是LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP转染的细胞。图35F是图35C-E的合并。每组的总非门控采集事件(细胞数目)：10,000。
图36：图35A-F的统计分析，表明A549细胞中FLNA细胞内抗体的表达导致降低的细胞生存力。N＝3；student氏t-检验，双尾未配对。
图37：转染后72小时转染的A549细胞中的EthD-1的直方图(GFP门控的细胞的死细胞分析)。图37A是未染色的对照。图37B是阳性对照。图37C、37D和37E分别是LV-GFP LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP转染的细胞。图37F是图37C-E的合并。每组的总非门控采集事件(细胞数目)：10,000。
图38：图37A-F的统计分析，表明A549细胞中FLNA细胞内抗体的表达导致增加的细胞死亡。N＝3；student氏t-检验，双尾未配对。
图39：表达FLNA细胞内抗体的A549细胞表现出减少的细胞增殖(GFP门控和通过EdU染色)。图39A是未染色的对照；图39B、39C和39D分别是LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP转染的细胞。图39E是图39A-D的统计分析(n＝3；student氏t-检验，双尾未配对)。每组的总采集事件(细胞数目)：10,000。
图40：用LV-GFP和LV-FLNA-GFP细胞内抗体转染的A549细胞中的表达。图40A(顶图,A1)：LV-GFP,图40A(底图,A2)：A1的明视野。图40B(顶图,B1)：LV-FLNA_2-GFP；图40B(底图,B2)：B1的明视野。图40C(顶图,C1：LV-FLNA_1-GFP；图40C(底图,C2)：C1的明视野。图40D(顶图和中图,D1和D2)：从C1或C2放大的选定视图(白色矩形)。图40D(底图,D3)：D1和D2的合并视图。白色箭头提示在A549细胞中FLNA与GFP的共表达。
图41：在A549细胞和非癌症MRC-5细胞(正常细胞)之间FLNA细胞内抗体处理的对比。FLNA细胞内抗体处理导致A549细胞中可见的细胞死亡，但是没有导致MRC-5肺正常成纤维细胞的死亡。用LV-GFP(2.5μg)转染的A549细胞(图40A左图,A1)和MRC-5肺正常成纤维细胞(图40B左图,B1)的明视野图像。用LV-FLNA_2-GFP细胞内抗体(2.5μg)转染的A549(图40A右图,A2)和MRC-5细胞(图40B右图,B2)。短箭头显示了脱离的死细胞(10X放大率)。插图：高放大率视图显示了死细胞簇(短箭头)和活细胞(长箭头)之间的差异。
图42：用细丝蛋白A(FLNA)细胞内抗体处理的U87MG细胞上的细胞生存力测定：钙黄绿素AM(活细胞)和EthD-1(死细胞)分析。FLNA细胞内抗体在U87MG细胞中的表达导致降低的细胞生存力。左图：钙黄绿素AM染色的直方图(绿色)；中图：EthD-1染色的直方图(红色)；右图：两个直方图的合并。指向最左侧峰的箭头指示EthD-1阳性细胞(死细胞)的峰；指向最右侧峰的箭头指示与LV-GFP相比在FLNA_1/2处理后钙黄绿素AM阳性细胞(活细胞)的缺失；指向中间峰的箭头指示在FLNA-处理的细胞中具有钙黄绿素AM的中间信号的细胞。每组的总采集事件(细胞数目)：50,000。
图43：用细丝蛋白A(FLNA)细胞内抗体处理的U87MG细胞上的细胞生存力测定：活细胞分析的总结。图43A：来自图42的钙黄绿素AM(活细胞)的合并直方图(左图)；图43B：A的统计分析(n＝3；student氏t-检验，双尾未配对)。每组的总采集事件(细胞数目)：50,000。
图44：用细丝蛋白A(FLNA)细胞内抗体处理的U87MG细胞上的细胞生存力测定：死细胞分析的总结。图44A：来自图42的EthD-1(死细胞)的合并直方图(中图)；图44B：A的统计分析(n＝3；student氏t-检验，双尾未配对)。每组的总采集事件(细胞数目)：50,000。
图45：在转染后72小时，FLNA细胞内抗体处理导致LN229细胞中的细胞死亡，但是没有导致HBEC-5i皮质上皮细胞死亡。图45A：用指示的构建体转染的LN229细胞中的EthD-1染色(GFP门控)的直方图。图45B：用指示的构建体转染的HEBC-5i中的EthD-1染色(GFP门控)的直方图。在图B中处理组相对于对照组之间没有显著差异(总采集时间：每组30秒)。
图46：用FLNA细胞内抗体处理后在U87MG细胞上的显微术研究；在转染后24小时的观察结果。图46A顶图(A1)：LV-GFP，图46A底图(A2)：A1的明视野，图46顶图(B1)：LV-FLNA_1-GFP，图46底图(B2)：B1的明视野，图46C顶图(C1)：LV-FLNA_2-GFP，图46C底图(A2)：C1的明视野。
图47：用FLNA细胞内抗体处理后在U87MG细胞上的显微术研究；在转染后72小时的观察结果。图47A1：LV-GFP,图47A2:47A1的明视野,图47B1：LV-FLNA_1-GFP,图47B2:47B1的明视野,图47C1：LV-FLNA_2-GFP图47C2:47C1的明视野。
图48：用FLNA细胞内抗体处理后在U87MG细胞上的显微术研究；在转染后72小时的观察结果。用指示的构建体转染的U87MG细胞的明视野图像。图48A,B：LV-GFP；图48C,D：LV-FLNA_1-GFP；图48E,F：LV-FLNA_2-GFP。48A、48C、48E在4X放大率获得，而48B、48D、48F在10X放大率获得。
图49：通过免疫细胞化学(ICC)对用FLNA细胞内抗体处理的U87MG细胞中的FLNA的分析。转染后72小时用FLNA细胞内抗体处理的U87MG细胞通过ICC分析显示FLNA蛋白的破坏。在图的左列：用LV-GFP(顶行)、FLNA_1(中行)和FLNA_2(底行)处理的U87MG细胞中的FLNA染色。图的中列：DAPI核染色。图的右列：合并的图像；箭头指示细胞外FLNA碎片。
图50：用FLNA细胞内抗体转染的U87MG细胞中的FLNA scFv的分析。用LV-FLNA_2-GFP细胞内抗体(图的顶行)和LV-GFP(图的底行)处理U87MG细胞。在转染后48小时，用缀合至Alexa555的抗-小鼠IgG第二抗体(1:200,ThermoFisher)通过抗-His-标签抗体(R&DSystems)检测到FLNA细胞内抗体(第一图)。通过抗-GFP抗体(R&D Systems)证实GFP的表达(第二图)。DAPI染色显示在第三图中，且第四图是合并图像。所有图像用相同显微镜设置获得。白色箭头指示FLNA细胞内抗体和GFP的共表达。
图51：用细丝蛋白A细胞内抗体处理的DU145细胞上的细胞生存力测定：在转染后72小时的GFP表达。图51A，假转染。图51B，LV-GFP转染。图51C，LV-FLNA_1-GFP转染。图51D，LV-FLNA_2-GFP转染。图51E，51A-D的合并。每组的总非门控采集事件(细胞数目)：10,000。
图52：用细丝蛋白A(FLNA)细胞内抗体处理的DU145细胞上的细胞生存力测定：通过钙黄绿素深红(CDR)的活细胞分析(GFP门控的细胞)。图52A：LV-GFP转染。图52B：LV-FLNA_1-GFP转染；图52C：LV-FLNA_2-GFP转染。每组的总非门控采集事件(细胞数目)：10,000。
图53：用细丝蛋白A(FLNA)细胞内抗体处理的DU145细胞上的细胞生存力测定：活细胞分析的总结。图53A：来自图52A-C的钙黄绿素AM(活细胞)的合并直方图。图53B：图53A的统计分析(n＝3；student氏t-检验，双尾未配对)。每组的总采集事件(细胞数目)：50,000。
图54：用细丝蛋白A(FLNA)细胞内抗体处理的DU145细胞上的细胞生存力测定：通过EthD-1染色的死细胞分析(GFP门控的细胞)。图54A：LV-GFP转染。图54B：LV-FLNA_1-GFP转染；图54C：LV-FLNA_2-GFP转染。每组的总非门控采集事件(细胞数目)：10,000。
图55：用细丝蛋白A(FLNA)细胞内抗体处理的DU145细胞上的细胞生存力测定：死细胞分析的总结。图55A：来自图54A-C的EthD-1(死细胞)的合并直方图；图55B：55A的统计分析(n＝3；student氏t-检验，双尾未配对)。每组的总采集事件(细胞数目)：50,000。
图56：用FLNA细胞内抗体处理的MDA-MB-234细胞上的细胞增殖测定(EdU)：在转染后72小时的GFP表达。图56A，假转染。图56B，LV-GFP转染。图56C，LV-FLNA_1-GFP转染。图56D，LV-FLNA_2-GFP转染。图56E，56A-D的合并。每组的总非门控采集事件(细胞数目)：30,000。
图57：用FLNA细胞内抗体处理的MDA-MB-234细胞上的细胞增殖测定(EdU)：表达FLNA细胞内抗体的MDA-MB-231细胞表现出减少的细胞增殖(GFP门控和通过EdU染色)。图57A：未染色的对照；图57B：LV-GFP；图57C：LV-FLNA_1-GFP；图57D：LV-FLNA_2-GFP。图57E：图57A-D的统计分析(n＝3；student氏t-检验，双尾未配对)。每组的总采集事件(细胞数目)：30,000。
图58：用FLNA细胞内抗体处理后在MDA-MB-231细胞上的显微术研究：转染后24小时GFP表达的观察。图58A、D：LV-GFP；图58B、E：LV-FLNA_1-GFP；图58C、F：LV-FLNA_2-GFP。图58A、58B、58C显示了GFP表达，而图58D、58E、58F是各个明视野图像。
图59：通过蛋白质印迹分析得到的细胞内抗体处理后的FLNA蛋白水平。泳道1：LV-GFP；泳道2：LV-FLNA_1-GFP；泳道3：LV-FLNA_1-GFP(GAPDH用作负载对照)。
图60：在转染后24小时在正常人星形胶质细胞中的GFP表达的直方图。60A：假转染；60B：LV-GFP；60C：LV-FLNA_1-GFP；60D：LV-FLNA_2-GFP；60E：60A–D的合并。
图61：用FLNA细胞内抗体处理后在正常人星形胶质细胞上的显微术研究。用指示的构建体转染的正常人星形胶质细胞中的GFP表达。61A：LV-GFP(底图,A2:顶图的明视野,A1)；61B：LV-FLNA_1-GFP(底图,B2:顶图的明视野,B1)；61C：LV-FLNA_2-GFP(61C底图,B2:顶图的明视野,C1)。
图62：在转染后72小时在正常人星形胶质细胞中的细胞毒性百分比。使用试剂盒方案中的计算，计算LDH细胞毒性：％细胞毒性＝((化合物处理的LDH活性-自发的LDH活性)x 100)/(最大LDH活性-自发的LDH活性))。化合物处理的孔是从指定的处理组(LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP、LV-FLNA_2-GFP)记录的LDH释放。自发的释放是从假转染组记录的LDH释放(要作为转染试剂引起的背景减去)。最大LDH是从总细胞裂解记录的LDH释放。在三个处理组之间在％细胞毒性方面没有显著差异。
图63：B411在SKNAS细胞上的表面染色。
图64：B411在SKBR3细胞上的表面染色。
图65：B411在HeLa细胞上的表面染色。
图66：B411在SKOV细胞上的表面染色。
图67：直方图显示了B411胞吞作用阳性的SKBR3细胞(左图)或HEK细胞(右图)的百分比。
图68：条形图显示了与阴性对照(仅Zenon标记)或未染色(UST)相比，B411胞吞作用阳性的SKBR3和HEK细胞的总细胞计数。
具体实施方式
定义
“约”是指如此限定的数量、参数或特性的±百分比(例如，±5％)，其在该术语所应用的科学背景下会被熟练的技术人员理解为适当的。此外，由于涉及本文使用的量的所有数字、值和表述都受到本领域中遇到的各种测量的不确定性影响，因此，除非另有说明，否则所有呈现的值都可以理解为被术语“约”修饰。
如本文所使用的，冠词“一种”、“一个”和“所述”可以包括复数指示物，除非另外明确地限制为一个所指物，或者如果熟练的技术人员从句子的上下文显而易见，该冠词是指单数所指物。
在本文公开数值范围的情况下，则这样的范围是连续的，包括该范围的最小值和最大值以及这样的最小值和最大值之间的每个值。更进一步，在范围表示整数的情况下，包括这样的范围的最小值和最大值之间的每个整数。另外，在提供多个范围来描述特征或特性的情况下，可以组合这样的范围。也就是说，除非另有说明，否则本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如，所述的从“1至10”的范围应视为包括最小值1和最大值10之间的任何和所有子范围。范围“1至10”的示例性子范围包括、但不限于1至6.1、3.5至7.8和5.5至10。
术语“细丝蛋白”、“人肌动蛋白结合蛋白”或“人ABP”表示将肌动蛋白丝交联成皮质细胞质中的正交网络并参与肌动蛋白细胞骨架对膜蛋白的锚定的蛋白家族。细丝蛋白包括三个功能结构域：N-端丝状肌动蛋白-结合结构域，C-端自结合结构域，和膜糖蛋白-结合结构域。细丝蛋白蛋白家族包括以下三种蛋白：细丝蛋白-A、细丝蛋白B和细丝蛋白C。
术语“细丝蛋白-A”、“人细丝蛋白-A”、“α-细丝蛋白”、“细丝蛋白1”、“ABP-280”、“内皮肌动蛋白-结合蛋白”和“非肌肉细丝蛋白”表示由FLNA基因编码的大约280-kD细丝蛋白蛋白，它是通过与整联蛋白、跨膜受体复合物和第二信使相互作用来调节肌动蛋白细胞骨架的重新组构的广泛表达的蛋白。细丝蛋白A(或其部分)也展示在人神经母细胞瘤细胞(例如，NMB-7)的表面上。它也存在于NMB-7细胞的整体膜级分中，以及存在于含有细胞质和外周膜蛋白的亲水性蛋白级分中。因此，可以在整个细胞中发现它，包括细胞外表面。还已经证实FLNa存在于人细胞系HeLa(宫颈癌)、SKOV3(卵巢癌)和HEK293(人胚胎肾)的细胞表面上。参见Bachmann等人,Cancer Sci.97(12),2006,通过引用整体并入本文用于所有目的。细丝蛋白-A的多肽序列可在GenBank登记号P21333得到(Gorlin,等人,1990,J.CellBiol.111(3):1089-1105)。本文中使用的“细丝蛋白-A”包括其变体、其突变体、其重组形式及其片段。
术语“细丝蛋白B”、“人细丝蛋白B”、“β-细丝蛋白”、“ABP-278”、“内皮肌动蛋白-结合蛋白”和“非肌肉细丝蛋白”表示由FLNB基因编码的结合肌动蛋白丝的大约278-kD蛋白。细丝蛋白B的多肽序列可在Gen Bank登记号075369得到(Takafuta等人,1998,J.Biol.Chem.273(28),17531-17538)。
术语“细丝蛋白C”、“人细丝蛋白C”、“细丝蛋白2”、“γ细丝蛋白”、“ABP-280,常染色体形式”表示由FLNC基因编码的结合肌动蛋白丝的大约280-kD蛋白。细丝蛋白C的多肽序列可在GenBank登记号Q14315得到(Xie等人,1998,Biochem.Biophys.Res.Commun.251(3),914-919)。
本文中使用的术语“抗体”表示(a)免疫球蛋白多肽和免疫球蛋白多肽的免疫学活性部分，即，免疫球蛋白家族的多肽或其片段，其含有免疫特异性地结合特定抗原(例如，细丝蛋白-A)的抗原结合位点，或(b)免疫特异性地结合抗原(例如，细丝蛋白-A)的这样的免疫球蛋白多肽或片段的保守取代的衍生物。在例如Harlow&Lane,Antibodies:ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)中一般地描述了抗体。本文中使用的术语“抗体”涵盖抗体片段。因而，在某些实施方案中，所述抗体是单结构域抗体(sdAb)，诸如VhH抗体或结构域抗体或单链可变片段(scFv)或其它抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2或Fv片段)。
本文中使用的术语“细胞内抗体”表示结合细胞内蛋白并在细胞内起作用的抗体或其片段(例如，单链可变片段(scFv)或其它单链或单结构域抗体)。在某些实施方案中，细胞内抗体在靶细胞内表达，例如通过基因疗法。例如，使用质粒、病毒递送系统或非病毒递送系统将编码细胞内抗体的DNA或RNA递送至细胞。病毒递送系统包括、例如，慢病毒或逆转录病毒载体。非病毒递送系统包括使用例如以下物质或机械递送技术递送至细胞的质粒或DNA片段或RNA：阳离子脂质、脂质乳剂、纳米颗粒、肽载体(例如，阳离子肽)、聚合物(例如，阳离子聚合物诸如合成的聚乙烯胺(PEI)、壳聚糖、聚(DL-丙交酯)(PLA)或聚(DL-丙交酯-共聚-糖苷(PLGA)颗粒)、树枝状聚合物。在某些实施方案中，可以通过细胞膜穿透肽或细胞内化肽在细胞内递送细胞内抗体。任选地，本文提供的细胞内抗体可以包括核定位信号，或将细胞内抗体靶向不同亚细胞结构(例如内质网(ER)、高尔基体、线粒体、溶酶体或其它位置)的信号。因此，细胞内抗体一旦在细胞内表达就可以保留在细胞质中，或者可以定位至特定亚细胞结构。细胞内抗体可以包括额外的修饰以增加对细胞内微环境的抵抗力或增强稳定性。
在如上定义的免疫球蛋白多肽或其片段的上下文中，“保守置换”是指基本上不降低免疫球蛋白多肽或其片段与抗原的特异性结合(例如，如通过KD测量)的一个或多个氨基酸置换(即，这样的置换：其增加结合，不会显著改变结合，或使结合降低不超过约40％，通常不超过约30％，更通常不超过约20％，甚至更通常不超过约10％，或最通常不超过约5％，如通过标准结合测定例如ELISA所确定的)。
本文中使用的“抗体衍生物”是指通过异源分子的共价连接而修饰的如上定义的抗体，例如，通过异源多肽的附着，或通过通常不与抗体相关的糖基化、乙酰化或磷酸化等。例如，除其它外，可以附着化学治疗剂、荧光标记、或放射化学或活性药物。
天然存在的抗体(免疫球蛋白)包含通过二硫键连接在一起的两条重链和两条轻链，每条轻链通过二硫键连接到重链之一。每条链具有N-端可变结构域(VH或VL)和在其C端的恒定结构域(CH或CL)；轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐并形成二硫键，并且轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐。重链恒定区包括(在N端至C端方向)CH 1和铰链区。轻链还含有铰链结构域。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面并形成二硫键，参见例如Chothia等人,J.Mol.Biol.186:651-663(1985)；Novotny和Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4592-4596(1985)；Padlar等人,Mol.immunol.,23(9):951-960(1986)；和S.Miller,J.Mol.Biol.,216:965-973(1990)。
恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，而是参与各种效应子功能，例如抗体在抗体依赖性的细胞的细胞毒性和补体依赖性的细胞毒性中的参与。每对轻链和重链的可变结构域直接参与抗体与抗原的结合。天然轻链和重链的结构域具有相同的一般结构，即所谓的免疫球蛋白折叠，且每个结构域包含四个框架(FR)区域，其序列在一定程度上是保守的，通过三个高变区或互补性决定区(CDR)连接(参见Kabat,E.A.等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,(1987))。四个框架区主要采用β-折叠构象，而CDR形成连接β-折叠结构的环，且在某些情况下，所述环形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR都被框架区保持紧密靠近，并且与来自其它链的CDR一起促进抗原结合位点的形成。
抗体可以分为多种抗原结合片段。Fv片段是仅含有重链和轻链的可变结构域的异源二聚体。Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的差别在于几个残基在重链CH1结构域的羧基端处的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中关于Fab’而命名，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。
本文还教导了“抗体片段”，其包括前述Fab、Fab'、F(ab')2、ScFvs和Fv片段，以及对期望的靶表位具有特异性的本公开内容的抗体的任何部分。在一个方面，本公开内容的抗体是抗-细丝蛋白-A抗体。在例如美国专利号5,648,237(其通过引用整体并入本文)中教导了抗体片段的表达。在特定实施方案中，本文提供的抗体是包含scFv或其它抗体片段的细胞内抗体。
本文中使用的术语“单克隆抗体”表示从基本上均匀的抗体群体得到的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，但是在单克隆抗体的生产过程中可能产生的可能变体除外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性以外，所述单克隆抗体是有利的，因为它们未被其它免疫球蛋白污染。
修饰词“单克隆的”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)来制备。使用例如在Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol,222:581-597(1991)中描述的技术，也可以从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。本文中单克隆抗体的具体例子包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
本文中的单克隆抗体特异性地包括“嵌合的”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性即可(美国专利号4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有从非人免疫球蛋白衍生出的最小序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(诸如具有期望的特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区的残基替代。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。做出这些修饰以进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、并且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR是除了上面提到的FR置换外的人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还任选地包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于其它细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。
本文中的“人抗体”是包含与可得自人B细胞的抗体的氨基酸序列结构相对应的氨基酸序列结构的抗体。这样的抗体可以通过多种技术来鉴定或制得，包括、但不限于：通过转基因动物(例如小鼠)的生产，所述动物在免疫接种后能够在没有内源性免疫球蛋白生产存在下产生人抗体(参见，例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等人,Year inImmuno.,7:33(1993)；和美国专利号5,591,669,5,589,369和5,545,807))；从表达人抗体的噬菌体展示文库中选择(参见，例如，McCafferty等人,Nature 348:552-553(1990)；Johnson等人,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)；Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)；Griffith等人,EMBO J.12:725-734(1993)；美国专利号5,565,332和5,573,905)；通过体外活化的B细胞产生(参见美国专利5,567,610和5,229,275)；和从产生人抗体的杂交瘤中分离。
本文的“多特异性抗体”是对两种或更多种不同表位具有结合特异性的抗体。在某些实施方案中，所述多特异性抗体是三特异性的或四特异性的。在某些实施方案中，所述多特异性抗体可以是二价、三价或四价。
“双特异性抗体”是对两种不同表位具有结合特异性的抗体。在某些实施方案中，所述双特异性抗体是单价或二价。
抗体缀合物、融合蛋白和双特异性抗体：这些表示通过化学方法与放射性核素、药物、大分子或其它试剂缀合的单克隆抗体。
抗原：这表示能够被抗体结合的一种或多种分子或分子的一个或多个部分，其另外能够诱导动物产生能够结合该抗原的表位的抗体。抗原可以具有一个或超过一个表位。上面提到的特异性反应意在指示，抗原将以高度优先的方式与其对应抗体反应，并且不与其它抗原可以引起的多种其它抗体反应。
表位：这表示能够被抗体识别并结合的任何分子的部分。一般而言，表位由分子的化学活性表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。在某些方面，对于本公开内容而言，感兴趣的表位是细丝蛋白-A的部分的表位。可以用跨时序(cross-clocking)测定来鉴定细丝蛋白-A的表位，诸如在Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane(1988)(通过引用整体并入本文)中描述的跨时序(cross-clocking)测定。
互补性决定区或CDR：这表示一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区域的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个CDR。可以使用以下文献中描述的编号惯例来定位和描述CDR：Kabat等人,(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版,Department of Health and Human Services,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda(NIH PublicationNo.91-3242)，通过引用整体并入本文。
框架区或FWR：这表示插入CDR之间的氨基酸序列。抗体的这些部分用于将CDR保持在适合抗原结合的取向。
特异性决定残基或SDR：这表示当与其它IgG对比时，本公开内容的抗体特有的氨基酸残基。在一个方面，SDR是免疫球蛋白的直接参与抗原接触的部分。
恒定区：这表示抗体分子的赋予效应子功能的部分。重链恒定区可以选自五种同种型中的任一种：α、δ、ε、γ或μ。各种亚类的重链(例如IgG亚类的重链)负责不同的效应子功能。因此，通过选择期望的重链恒定区，可以产生具有期望的效应子功能的人源化抗体。轻链恒定区可以是κ或λ型。
免疫原性：靶向蛋白或治疗性部分当施用给接受者时引起免疫应答(体液或细胞免疫应答)的能力的量度。
免疫反应性：免疫球蛋白识别并结合特定抗原的能力的量度。
细丝蛋白-A抗体或FilA mAb：这些术语在本文中与术语“细丝蛋白-A特异性抗体”和“细丝蛋白-A抗原特异性抗体”和“细丝蛋白-A抗原结合抗体”等可互换地使用。这些术语表示能够优先结合细丝蛋白-A基因的表达产物和细丝蛋白-A基因的同系物的抗体，且可以包括对由癌细胞产生的表达产物的修饰形式具有特异性的抗体。所述抗体包括变体，诸如嵌合抗体、人源化抗体和本领域技术人员已知的其它变体。如果细丝蛋白-A抗体相对于另一种蛋白以高至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或至少500倍的结合亲和力优先结合细丝蛋白-A抗原或表位，就说细丝蛋白-A抗体对本公开内容的细丝蛋白-A抗原或表位具有特异性。在一个方面，如果细丝蛋白-A抗体相对于任意其它蛋白以高大于1000倍的亲和力结合，就说细丝蛋白-A抗体对本公开内容的细丝蛋白-A抗原或表位具有特异性。细丝蛋白-A抗体是不与异源分子(诸如生物素或放射性标记)缀合或以其它方式结合的本公开内容的细丝蛋白-A抗体。
细丝蛋白-A抗原：这表示由细丝蛋白-A基因产生的表达产物，其中所述表达产物可以用作抗原、靶分子、生物标记物或它们的任意组合。细丝蛋白-A抗原可以由细丝蛋白-A基因和细丝蛋白-A基因的同系物产生，并且可以包括各种修饰。修饰可以包括氨基酸突变和/或翻译后突变。例如，细丝蛋白-A抗原可以包括由表达细丝蛋白-A抗原的细胞(诸如癌细胞)引入的修饰。在某些实施方案中，所述细丝蛋白-A抗原是使用FLNa基因或其修饰制备的重组蛋白。
基本上相似的结合特性：这表示嵌合抗体(诸如人源化抗体或其片段)的保留优先结合被用于产生嵌合抗体的亲本抗体识别的抗原的能力。在一个方面，与亲本抗体具有“基本上相似的结合特性”的嵌合抗体的亲和力是这样的：其中结合亲和力为对亲本抗体所靶向的抗原具有至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％特异性。
在另一个方面，嵌合抗体、人源化抗体或抗体片段的亲和力是在亲本抗体的亲和力的约10％至约95％、约10％至约50％、约50％至约95％、约10％至约25％、约25％至约50％、约50％至约95％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、或约80％至约90％之间。
用于测定抗原-结合亲和力的方法是本领域已知的，并且包括半数最大结合测定、竞争测定和Scatchard分析。在一个方面，使用竞争测定来测定抗原-结合亲和力。
基本上同源的：可以表示与参考免疫球蛋白序列表现出至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的免疫球蛋白序列，其中同一性百分比通过对比两种免疫球蛋白之间的相同氨基酸残基的数目来确定，其中例如使用Kabat编号方案指出氨基酸残基的位置。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或“同一性百分比”表示当对比并对齐以得到最大对应性时，相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或多个序列或子序列。为了确定同一性百分比，将所述序列比对以达到最佳对比目的(例如，可以在第一个氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口以与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。接着对比相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当占据第一个序列中的某一位置的氨基酸残基或核苷酸与第二个序列中相应位置的氨基酸残基或核苷酸相同时，则所述分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是所述序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)×100)。在某些实施方案中，两个序列是相同的长度。
在两个核酸或多肽的上下文中，术语“基本上相同的”表示具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少96％、97％、98％或99％同一性的两个或多个序列或子序列(使用下文所述的方法之一确定)。
在两个或更多个多肽序列的上下文中，“相似性”或“相似性百分比”表示，当对比并对齐以得到最大对应性时，具有指定百分比的相同或保守取代的氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列，如使用下文所述的方法之一测量的。作为例子，当与第一个序列中包含的相同数目的氨基酸进行对比时，或者当与通过本领域已知的计算机相似性程序(见下文)进行比对的多肽进行对比时，当第一个氨基酸序列与第二个氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、90％或甚至95％或更多同一性或被保守取代时，可以认为第一氨基酸序列与第二氨基酸序列相似。
可以使用数学算法来确定两个序列之间的同一性百分比或相似性百分比。用于对比两个序列的数学算法的一个非限制性例子是Karlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法，在Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中修改。这样的算法被并入Altschul,等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序。可以用NBLAST程序(分数＝100，字长＝12)执行BLAST核苷酸搜索，以得到与编码目标蛋白的核酸同源的核苷酸序列。可以用XBLAST(分数＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白搜索，以得到与目标蛋白同源的氨基酸序列。为了获得缺口比对以用于对比目的，可以如Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述利用缺口BLAST。可替换地，可以使用PSI-Blast执行迭代搜索，其检测分子之间的远关系(Id.)。当使用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。(参见，例如，因特网网站地址：www.ncbi.nlm.nih.gov.)。用于序列对比的数学算法的另一个非限制性例子是Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法。这样的算法被并入ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序对比氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。用于序列分析的其它算法是本领域已知的，并且包括：在Torellis和Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5中描述的ADVANCE和ADAM；和在Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-8中描述的FASTA。在FASTA内，ktup是一个控制选项，其设置搜索的灵敏度和速度。如果ktup＝2，则通过查看成对的比对残基发现对比的两个序列中相似的区域；如果ktup＝1，则检查单个比对的氨基酸。对于蛋白序列，可以将Ktup设置为2或1，对于DNA序列，可以将Ktup设置为1至6。如果未指定ktup，则默认值为2(对于蛋白)和6(对于DNA)。可替换地，可以使用CLUSTAL W算法进行蛋白序列比对，如Higgins等人,1996,Methods Enzymol.266:383-402所述。
基本上纯的：为了本公开内容的目的，基本上纯的表示均质制剂。在一个方面，均质制剂是细丝蛋白-A抗体或抗体片段或其它化学或生物试剂的均质制剂。考虑至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同质性的基本上纯的免疫球蛋白。
细丝蛋白-A抗原表达：包括特定组织样本、血液、血清或血浆中的细丝蛋白-A抗原的存在或丰度的测量，在一个方面，组织样本来自遭受疾病的患者，所述疾病的特征在于细丝蛋白-A的基因产物、其同系物、其变体、其突变体、其重组形式和/或其片段的表达。这样的疾病包括乳腺癌、胃癌和结肠癌。
本公开内容的“亲和试剂”具有对靶分析物具有高结合亲和力的分析物结合结构域、部分或组分。高结合亲和力是指至少约10-4M、通常至少约10-6M或更高(例如，10-9M或更高)的结合亲和力。在各方面，本文教导的抗体的结合亲和力可以是至少10-2M、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更高，或前述的任何组合或范围。亲和试剂可以是多种不同类型的分子中的任一种，只要它作为被标记的亲和配体存在时对靶蛋白表现出必要的结合亲和力即可。这样，亲和试剂可以是小分子或大分子配体。
本公开内容还感兴趣的是重组生产的抗体和抗体片段，诸如单链抗体或scFv，其中这样的重组生产的抗体片段保留上述抗体的结合特征。这样的重组生产的抗体片段通常至少包括主题抗体的VH和VL结构域，从而保留主题抗体的结合特征。本公开内容的这些重组生产的抗体片段或模拟物可以使用任何方便的方法容易地制备，例如在美国专利号5,851,829和5,965,371中公开的方法；其公开内容通过引用并入本文。
上述的抗体、其片段和模拟物可以从商业来源得到和/或使用任何方便的技术来制备，其中生产多克隆抗体、单克隆抗体、其片段和模拟物(包括其重组衍生物)的方法是本领域技术人员已知的。
第一个实施方案的序列和CDR区域
表1A提供了本文提供的抗体的示例性的可变区和恒定区。
表1A-示例性的可变区和恒定区
/>
/>
/>
/>
SEQ ID NO:1，人嵌合mAb的轻链可变氨基酸序列，包含在残基31处的异亮氨酸，在一个实施方案中，其可替代地包含亮氨酸。例如，在某些实施方案中，所述轻链可变氨基酸序列包含SEQ ID NO:1。在某些实施方案中，SEQ ID NO:1和2的CDR区域包含氨基酸残基27-32(CDR1)、50-53(CDR2)和88-96(CDR3)。
SEQ ID NO:4，人嵌合mAb的重链可变氨基酸序列，包含在残基101和102处的两个亮氨酸，在一个实施方案中，其可替代地包含两个异亮氨酸，或在另一个实施方案中，可以包含在一个位置的亮氨酸和在另一个位置的异亮氨酸。例如，在某些实施方案中，所述重链可变氨基酸序列包含SEQ ID NO:5、6或7。在某些实施方案中，SEQ ID NO:4-7的CDR区域包含氨基酸残基26-33(CDR1)、51-58(CDR2)和97-106(CDR3)。
抗体和抗体片段
抗体AHO1402是从Life Technologies得到的单克隆抗体，它是使用来自乳腺癌细胞系MDA.MB.231的蛋白级分生产的针对细丝蛋白-A的商购可得的鼠IgG1k抗体(Alper等人,“Novel anti-filamin-A antibody detects a secreted filamin-A antigen inplasma from patients with breast carcinoma and high-grade astrocytoma,”CancerSci.,第100(9)卷,第1748-1756页,2009，其通过引用整体并入本文)。
本公开内容包括细丝蛋白-A抗原的抗体和抗体片段，包括能够以10-5M至10-11M的特异性亲和力结合细丝蛋白-A的可溶形式或细胞相关形式的抗体或抗体片段；能够结合细丝蛋白-A的可溶形式的抗体或抗体片段；能够选择性地降低可溶性细丝蛋白-A的活性的抗体或抗体片段；和能够结合细丝蛋白-A的抗体或抗体片段。
抗体或抗体片段可以是任何抗体或抗体片段，并且，但不限于，可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和scFv(包括嵌合的抗原受体或CAR)或抗体或抗体片段缀合物。在一个方面，抗体是鉴别本公开内容的人细丝蛋白-A抗原的小鼠单克隆抗体。
在一个方面，抗体或抗体片段可以是在脊椎动物的血液或其它体液中发现的任何γ球蛋白蛋白，并被宿主免疫系统用于鉴别和中和外来物，诸如细菌和病毒。在一个方面，抗体或抗体片段可以选自抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和scFv、CAR或抗体缀合物。在某些实施方案中，所述scFv或其它抗体片段包含本文提供的轻链可变区、本文提供的重链可变区和接头。表1B提供了本文提供的scFv的示例性氨基酸序列。在一个方面，抗体或抗体片段可以是任何类型的免疫球蛋白蛋白，诸如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一个方面，抗体可以是IgG。
在一个方面，抗体或抗体片段能够降低至少一种形式的细丝蛋白-A的活性。在一个方面，抗体或抗体片段能够降低可溶形式的细丝蛋白-A的活性。在另一个方面，抗体或抗体片段能够降低分泌形式的细丝蛋白-A的活性。在另一个方面，所公开的抗体或抗体片段能够降低与细胞表面相关的细丝蛋白-A抗原(例如细胞膜相关的细丝蛋白-A抗原，或细胞内囊泡有关的细丝蛋白-A抗原)的活性。因此，本文教导的抗体可能被细胞吸收。在某些实施方案中，如通过梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳所测量的，可溶性细丝蛋白-A蛋白可以具有约250-280kDa的分子量。在一个方面，本公开内容的可溶性细丝蛋白-A抗原被磷酸化。在某些实施方案中，本文提供的抗体结合细丝蛋白-A片段。例如，在某些实施方案中，本文提供的抗体结合作为p180片段或p100片段的细丝蛋白-A蛋白。在特定实施方案中，本文提供的抗体结合p180片段。
在本公开内容的另一个方面，抗体或抗体片段可以用于检测细丝蛋白-A的分泌形式。在本公开内容的另一个方面，抗体或抗体片段可以用于检测细丝蛋白-A的可溶形式和/或分泌形式。在本公开内容的另一个方面，抗体或抗体片段可以用于检测细丝蛋白-A表位或其片段。
在本公开内容的一个方面，抗体或抗体片段能够优先结合细丝蛋白-A蛋白的可溶形式。在该方面，这样的对细丝蛋白-A的优先结合可以是相对于任意其它蛋白。在一个特定方面，这样的对细丝蛋白-A的优先结合是相对于膜结合的或有关的细丝蛋白-A。但是，在其它方面，相对于抗原的未结合的形式，本文教导的抗体或抗体片段能够优先结合细丝蛋白-A蛋白的细胞膜结合形式。因而，在本公开内容中提供了可以优先结合以下形式的抗体及其片段：细丝蛋白-A抗原的膜结合形式，细丝蛋白-A抗原的非膜结合形式，或二者。
在本公开内容的一个方面，抗体或抗体片段能够优先结合细丝蛋白-A蛋白的分泌形式。在本公开内容的另一个方面，抗体或抗体片段能够结合细丝蛋白-A蛋白的分泌形式和/或可溶形式。在本公开内容的另一个方面，抗体或抗体片段能够结合本公开内容或其片段的细丝蛋白-A表位。
如本文中使用的，膜有关的蛋白或膜结合的蛋白是在检查细胞时可以发现与膜一起定位的蛋白。膜结合的蛋白是至少部分地与脂质双层接界的蛋白。在一个方面，它通过离子相互作用与膜结合。在另一个方面，膜结合的蛋白通过共价相互作用与膜结合。在一个方面，膜结合的蛋白通过疏水相互作用与膜结合。本文教导的抗体可以结合上述膜结合的或膜有关的蛋白。
在本公开内容的一个方面，优先结合是相对于背景。在另一个方面，所述优先结合是至少2倍,3倍,4倍,5倍,10倍,100倍,1,000倍,10,000倍或1,000,000倍。在另一个方面，相对于细丝蛋白-A的膜形式，本公开内容的抗体优先结合细丝蛋白-A的可溶形式。在一个特定方面，相对于细丝蛋白-A的核膜形式，本公开内容的抗体优先结合细丝蛋白-A的可溶形式，或在另一个方面，反之。也就是说，在某些方面，以上优先结合涉及教导的抗体优先结合与细胞膜有关的细丝蛋白-A抗原的能力。
在一个方面，本文教导的抗体或抗体片段以大于约10-5M、约10-6M、约10-7M、约10- 8M、约10-9M、约10-10M、约10-11M、或约10-12M、或约10-8M至约10-11M、或约10-9M至约10-10M、或约10-10M至约10-11M的特异性亲和力结合细丝蛋白-A或细丝蛋白-A的特定形式，诸如分泌或可溶形式(例如来自人乳腺癌)，或膜结合的形式。在一个方面，使用竞争性结合测定来测量比活性。
在某些实施方案中，本公开内容提供了包含选自SEQ ID NO:12和13的轻链CDR1序列的抗-细丝蛋白-A抗体。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含根据SEQ ID NO:14的轻链CDR2序列的抗-细丝蛋白-A抗体。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含根据SEQID NO:15的轻链CDR3序列的抗-细丝蛋白-A抗体。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含根据SEQ ID NO:16的重链CDR1序列的抗-细丝蛋白-A抗体。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含根据SEQ ID NO:17的重链CDR2序列的抗-细丝蛋白-A抗体。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含选自SEQ ID NO:18、19、20和21的重链CDR3序列的抗-细丝蛋白-A抗体。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含本文提供的轻链和重链CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一种的抗体。
在某些实施方案中，本公开内容提供了包含选自SEQ ID NO:1和2的轻链可变区的抗-细丝蛋白-A抗体。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含选自SEQ ID NO:4、5、6和7的重链可变区的抗-细丝蛋白-A抗体。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含本文提供的轻链和重链可变区序列中的任一种的抗体。在其它实施方案中，本公开内容提供了包含含有SEQ NO:3或SEQ ID NO:23的恒定轻链区的抗体。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含含有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:28的恒定重链区的抗体。
在某些实施方案中，本公开内容提供了抗-细丝蛋白-A抗体B185，其包含根据SEQID NO:1的轻链可变区和根据SEQ ID NO:4的重链可变区。在某些实施方案中，本公开内容提供了抗-细丝蛋白-A抗体B405，其包含根据SEQ ID NO:1的轻链可变区和根据SEQ ID NO:6的重链可变区。在某些实施方案中，本公开内容提供了抗-细丝蛋白-A抗体B406，其包含根据SEQ ID NO:1的轻链可变区和根据SEQ ID NO:5的重链可变区。在某些实施方案中，本公开内容提供了抗-细丝蛋白-A抗体B407，其包含根据SEQ ID NO:1的轻链可变区和根据SEQID NO:7的重链可变区。在某些实施方案中，本公开内容提供了抗-细丝蛋白-A抗体B408，其包含根据SEQ ID NO:2的轻链可变区和根据SEQ ID NO:4的重链可变区。在某些实施方案中，本公开内容提供了抗-细丝蛋白-A抗体B409，其包含根据SEQ ID NO:2的轻链可变区和根据SEQ ID NO:6的重链可变区。在某些实施方案中，本公开内容提供了抗-细丝蛋白-A抗体B410，其包含根据SEQ ID NO:2的轻链可变区和根据SEQ ID NO:5的重链可变区。在某些实施方案中，本公开内容提供了抗-细丝蛋白-A抗体B411，其包含根据SEQ ID NO:2的轻链可变区和根据SEQ ID NO:7的重链可变区。在某些实施方案中，抗体B411包含分别根据SEQID NO:13、14和15的轻链CDR1、CDR2和CDR3；和分别根据SEQ ID NO:16、17和21的重链CDR1、CDR2和CDR3。
在某些实施方案中，本公开内容提供了包含本文提供的轻链和可变链区域的细胞内抗体。在某些实施方案中，所述细胞内抗体包含本文提供的scFv序列。在下面表1B中提供了本文提供的示例性细胞内抗体的氨基酸和DNA序列。在某些实施方案中，所述scFv或细胞内抗体包含选自SEQ ID NO:67和69的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述scFv或细胞内抗体包含选自SEQ ID NO:68和70的DNA序列。
表1B.示例性的scFv或细胞内抗体序列
/>
在另一个方面，本公开内容的抗体或抗体片段可以用于检测受试者的组织中的乳腺癌。在某些实施方案中，本公开内容的抗体或抗体片段可以用于检测来自患者的任何样品中的癌症，例如，活组织检查样品、血浆或血清。
本公开内容的另一个方面提供了一种组合物，其包含：组织样本，能够优先结合细丝蛋白-A抗原的可溶形式的抗体与所述样本内的细丝蛋白-A抗原的可溶形式之间的抗体-抗原复合物。在本公开内容的一个方面，所述组织样本来自遭受疾病的患者，所述疾病的特征在于细丝蛋白-A的基因产物及其同系物的表达。在本公开内容的另一个方面，所述患者遭受乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、头/颈癌或脑癌。在本公开内容的另一个方面，细丝蛋白-A抗原的可溶形式在所述组织样本中过表达。在一个方面，本公开内容提供了所述组合物用于检测患者中的疾病的用途，所述疾病的特征在于细丝蛋白-A的基因产物及其同系物的表达。在本公开内容的一个方面，所述组合物的免疫组织化学染色指示患者中疾病的存在。在本公开内容的一个方面，所述疾病是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌或头/颈癌。在另一个方面，所述疾病是乳腺癌、胃癌、结肠癌。在一个方面，所述疾病是乳腺癌。
在一个方面，本公开内容的细丝蛋白-A抗体可以鉴定可能受益于治疗的细丝蛋白-A-抗体-阳性的癌细胞(转移性或非转移性)的子集。本公开内容的这样的细丝蛋白-A抗体可以用在鉴定将受益于治疗的有此需要的受试者(诸如具有癌症的患者)的方法中。本公开内容的方法可以包括使用本公开内容的细丝蛋白-A抗体检测血液、血浆或血清中的较低细丝蛋白-A水平的方法。在一个方面，与目前可得到的试验相比，所述方法在疾病过程中在血浆中更早地检测到细丝蛋白-A。
可以任选地将抗体和抗体片段固定化在固相上，可检测地标记，或缀合至细胞毒性的放射性核素、细胞毒性的药物或细胞毒性的蛋白等。
本公开内容的抗体和抗体片段可以靶向细胞、哺乳动物细胞、哺乳动物癌细胞、人细胞和人癌细胞对细丝蛋白-A抗原的表达。示例性的癌症包括人乳房、卵巢、子宫颈、前列腺、结肠、胃、肾、肝、头、颈、肺、血液、胰腺、皮肤、睾丸、甲状腺和脑癌细胞的实体瘤。在一个方面，抗体或抗体片段靶向人乳房、胃和结肠细胞。示例性的癌症也包括非实体癌症。例如，癌症包括、但不限于：白血病，包括急性白血病和慢性白血病诸如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)和毛细胞白血病；淋巴瘤诸如皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)、非皮肤的周围T-细胞淋巴瘤、与人T-细胞淋巴营养病毒(HTLV)相关的淋巴瘤，诸如成年T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤；和多发性骨髓瘤。表达的细丝蛋白-A抗原可以包括任何形式的基因产物，尽管特定方面涉及细丝蛋白-A的可溶或分泌形式的检测。这样的抗原还可以包括细丝蛋白-A基因的基因产生的同系物和由癌细胞表达的修饰的细丝蛋白-A抗原。
在一个方面，本公开内容包括与细丝蛋白-A抗原优先结合的抗体或抗体片段，包括重链CDR抗原结合位点氨基酸序列和轻链CDR抗原结合位点氨基酸序列。本公开内容还包括与细丝蛋白-A抗原优先结合的抗体，其包含一个或多个重链CDR抗原结合位点氨基酸序列和一个或多个轻链CDR抗原结合位点氨基酸序列。
本公开内容包括具有抗原结合位点的细丝蛋白-A抗体或抗体片段，所述抗原结合位点具有来自重链和轻链的一个或多个CDR。本公开内容还包括对细丝蛋白-A表达产物具有特异性的抗体和抗体片段，其含有与这些基本同源的抗原结合位点，或其导致基本相似的结合特性。这样的抗体或其片段可以与来自本公开内容的细丝蛋白-A抗体的一个或多个CDR重链或轻链具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％同一性。
本公开内容也包括新颖的蛋白表达细胞系和它们所分泌的单克隆抗体分子，所述单克隆抗体分子对正常细胞或癌细胞所表达的细丝蛋白-A抗原具有特异性。如前所述，在一个实施方案中，本文产生的抗体能够结合由癌细胞(例如乳腺癌细胞)产生的细丝蛋白-A的可溶或分泌形式。但是，在其它实施方案中，本文产生的抗体能够结合由癌细胞(例如乳腺癌细胞)产生或有关的细丝蛋白-A的膜结合的或膜相关的形式。在某些实施方案中，本文产生的抗体能够结合FLNa的可溶性的或膜有关的片段。
本公开内容包括嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。本公开内容还包括抗体片段和其它修饰的抗体和抗体片段。
本公开内容也涵盖优先结合细丝蛋白-A抗原的抗体和抗体片段，但是其具有与表1A中所含的那些不同的FWR和/或CDR抗原结合位点氨基酸序列。这样的抗体对细丝蛋白-A抗原的优先选择性可以是比本公开内容的细丝蛋白-A抗原或其抗体片段高至少2倍、至少5倍、至少10倍或至少50倍的亲和力。在一个方面，本公开内容的抗体或抗体片段的变体可以与本公开内容的非变体抗体或抗体片段一样对细丝蛋白-A抗原具有特异性，或者可以是更特异性的。
对细丝蛋白-A具有特异性、但其FWR和/或CDR抗原结合位点氨基酸序列与表1A中所含的那些不同的抗体和抗体片段可以具有与表1A中所含的FWR和/或CDR相同或不同的特异性决定区(SDR)。
对表1A中列出的氨基酸序列的修饰可以发生在FWR和CDR序列中的一个或两个中。在一个方面，可以对另一种细丝蛋白-A抗体进行修饰以匹配表1A中列出的抗原结合位点的一个或多个氨基酸序列。根据本公开内容的某些方面，当抗体或抗体片段具有基本同源的氨基酸序列时，抗体或抗体片段中的变异可以发生在具有基本上相似的结合特性的抗体或两者中。在本公开内容的一个方面，在CDR抗原结合位点中可以存在单个氨基酸变化。通过将适当的核苷酸改变引入细丝蛋白-A抗体核酸中，或通过肽合成，制备细丝蛋白-A抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如，在细丝蛋白-A抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或置换。只要最终的构建体具有期望的特征，就可以做出缺失、插入和置换的任何组合以形成最终的构建体。氨基酸变化还可能改变细丝蛋白-A抗体的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数量或位置。
氨基酸置换变体具有被不同的残基替代的在细丝蛋白-A抗体分子中的至少一个氨基酸残基。对于置换诱变而言最感兴趣的位点包括高变区或CDR，但也涵盖在FWR区域中的改变。
保守置换涉及用具有相似电荷或疏水性的氨基酸替换氨基酸，例如：(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)；和(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
可替换地，可以基于共同的侧链性质将天然残基分组：(1)疏水的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性的亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的：Asp、Glu；(4)碱性的：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。
一种具体体现的置换变体类型包括置换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，相对于产生它们的亲本抗体，选择用于进一步开发的所得变体将具有改善的生物学特性。
当与鼠抗体(诸如AHO1402)或其抗体片段对比时，本公开内容的抗体或抗体片段的人源化变体可以含有减少的鼠含量和可能降低的免疫原性。人源化变体包括保留与原始抗体或抗体片段的结合亲和力基本相似的结合亲和力的那些。本公开内容的一个方面提供了人源化的细丝蛋白-A抗体或抗体片段的CDR变体，其中1、2、3、4、5或6个(三个重链和三个轻链)CDR被人源化。在另一个方面，本公开内容涵盖人源化的细丝蛋白-A抗体和抗体片段的SDR变体，其中在人源化抗体中仅存在来自细丝蛋白-A抗体和抗体片段的至少一个CDR的特异性决定残基(SDR)。
通过用来自人抗体的相应CDR替换人源化的细丝蛋白-A抗体和抗体片段的至少一个CDR，可以形成CDR变体。其中一、二、三、四、五或六个CDR被来自人抗体的相应CDR替换并保留生物活性的CDR变体与亲本细丝蛋白-A mAb的结合亲和力基本上相似。本公开内容的CDR变体可以具有比亲本细丝蛋白-A抗体或抗体片段的结合亲和力多25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的结合亲和力。
通过将来自本公开内容的细丝蛋白-A抗体和抗体片段的所有六个(三个重链和三个轻链)CDR嫁接到人抗体和抗体片段的可变轻(VL)和可变重(VH)框架上，可以形成与细丝蛋白-A抗体和抗体片段相比具有改变的免疫原性的CDR变体。但是，可以存在本公开内容的细丝蛋白-A抗体和抗体片段的小于所有六个CDR，同时仍然允许本公开内容的抗体保留活性。可以精制直接参与抗原接触的残基，诸如特异性决定残基(SDR)。通过用来自人抗体的相应位置处的残基替换细丝蛋白-A抗体或抗体片段的至少一个SDR来形成SDR变体。应当指出，并非所有的CDR都必须包括SDR。
在一个方面，本发明的抗体和抗体片段的变体包括CDR和/或SDR置换的组合，以产生在人类中具有降低的免疫原性和与亲本抗体或抗体片段对细丝蛋白-A的结合亲和力基本相似的结合亲和力的变体。
除了本文具体描述的变体以外，使用各种重组DNA技术可以容易地设计和制造其它“基本上同源的”修饰的免疫球蛋白。例如，可以在一级结构水平改变框架区(FWR)。此外，可以将多种不同的人框架区单独或组合用作变体的基础。一般而言，通过多种技术诸如定位诱变和随机诱变，可以容易地完成基因的修饰。
可替换地，可以产生仅包含第一抗体结构的一部分的多肽片段，其中所述片段基本上保留变体的免疫反应性性能。这样的多肽片段包括通过完整抗体的蛋白水解性裂解而产生的片段或通过使用定位诱变在核苷酸序列的所需位置插入终止密码子而产生的片段。至少包括变体的免疫反应性片段的单链抗体和融合蛋白也被包括在本公开内容的范围内。
根据本公开内容的抗体及其变体可以直接地或间接地连接至具有治疗活性的效应物部分。合适的效应物部分包括细胞因子、细胞毒素、放射性核素、药物、免疫调节剂、治疗性酶、抗增殖剂等。将抗体附着于这样的效应物的方法是本领域已知的。这些缀合的抗体可以掺入任何组合物中，包括用于治疗以细丝蛋白-A的表达为特征的疾病的药物组合物，所述疾病包括癌症，例如乳房、卵巢、子宫颈、前列腺、结肠、胃、肾、肝、头、颈、肺、血液、胰腺、皮肤、睾丸、甲状腺和脑的癌症。在一个方面，所述细胞来自人乳房、卵巢、头、颈或脑。将所述药物组合物施用于哺乳动物，所述哺乳动物可以包括需要这种治疗的人患者，以治疗所述疾病。
抗体和抗体片段可以被标记或未被标记。未标记的抗体可以与可与人源化抗体反应的其它标记抗体(第二抗体)组合使用，例如对人免疫球蛋白恒定区具有特异性的抗体。可替换地，可以直接标记抗体。可以使用多种标记，诸如放射性核素、荧光素、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。多种类型的免疫测定法是可得到的。
第二个实施方案的序列和CDR区域
本公开内容的其它序列可以在下表2-5中找到。
这些序列尤其对应于表1A中的前述序列的备选CDR结合结构域区域。此外，这些结合结构域序列及其在总抗体序列中的位置作图在图28-31中。
图28-31描绘了关于人嵌合轻链可变CDR结合结构域区域(图28)、人嵌合重链可变CDR结合结构域区域(图29)、鼠轻链可变CDR结合结构域区域(图30)和鼠重链可变CDR结合结构域区域(图31)，通过Chothia、ABM、Kabat和Contact预测的CDR区域之间的比对。
表2：人嵌合轻链可变CDR结合结构域区域
/>
/>
表3：人嵌合重链可变CDR结合结构域区域
/>
/>
表4：鼠轻链可变CDR结合结构域区域
/>
/>
表5：鼠重链可变CDR结合结构域区域
/>
CDR边界的鉴定经常用于查明许多人认为对抗原的抗体结合至关重要的序列。因此，CDR的定义倾向于集中在高变异性区域，但也包括抗体序列中的关键氨基酸和位置。所以，这些区域的边界可以根据用于序列数据库分析的一组标准而变化。数据库本身的组成也可能影响结果。在这点上，定义CDR的边界可以在一个系统与另一个系统之间变化。另外，在已知实例中，落在CDR/高变区之外的氨基酸也可能有助于抗原的直接结合，尽管并非所有含有该特定氨基酸的抗体都总是如此。因此，有几种方法用于鉴定可直接与抗原相互作用的CDR和抗体位置。
在一个方面，在本公开内容的范围内使用的序列数据库是Abysis数据库(www.bioinf.org.uk)，其除了来自PDB的数据结构数据以外还整合了来自多个数据库(包括Kabat、IMGT、PDB数据库)的序列数据。在使用Abysis系统时，从业人员可以同时得到由Kabat、Chothia、Martin(增强的Chothia)定义的CDR边界和接触信息。Kabat和其它数据库的抗体序列编号系统可能有所不同。焦点不是集中在编号系统上，而是集中在在不同系统下定义CDR的实际氨基酸序列上。有关Abysis数据库的一般信息可以在以下万维网因特网地址找到：bioinf.org.uk/abs/，其通过引用整体并入本文用于所有目的。
Abysis分析中的CDR定义包括以下：(1)Kabat，基于序列变异性，这是最常用的系统；(2)Chothia，基于结构环区域的位置；(3)Abysis-Martin(AbM)，这是基于OxfordMolecular的抗体建模软件的Kabat和Chothia定义之间的折衷方案；(4)Contact，基于对可用的复杂抗体-抗原晶体结构的分析，可能对移植和诱变有用。
尽管结果在上述系统中并不总是100％一致，但是通过使用这些不同的系统，可以更好地理解对于抗原结合可能重要的抗体区域。关于本公开内容的抗体，在表2-5和图28-31中详细描述了Abysis分析的结果。
抗原和本公开内容的抗体的结合区
本公开内容的抗体及其片段能够结合细丝蛋白-A抗原。
如前所述，本公开内容的一些实施方案结合可溶性的或分泌的细丝蛋白-A抗原。在特定方面，可溶性的或分泌的细丝蛋白-A抗原源自人乳腺癌细胞。
在某些方面，被本公开内容的抗体结合的抗原是在Alper等人,“Novel anti-filamin-A antibody detects a secreted variant of filamin-A in plasma frompatients with breast carcinoma and high-grade astrocytoma,”Cancer Sci.,第100(9)卷,第1748-1756页,2009(其通过引用整体并入本文用于所有目的)中讨论的抗原。因此，在某些方面，本公开内容提出了一种细丝蛋白-A抗原模型，其中所教导的抗体在上游(N-端)结合FLNa中的钙蛋白酶切割位点，从而导致两个具有约180kDa(p180,N-端至钙蛋白酶位点)和约100kDa(p100,C-端至切割位点)的大小的片段的产生。在该模型中，所教导的抗体似乎不结合p100 C-端切割产物，但是结合p280(全长)和p180片段。参见Alper等人,2009的图1c。
在某些方面，被本公开内容的抗体结合的抗原是膜结合的或膜有关的细丝蛋白-A抗原，如在Bachman,等人“Actin-binding protein filamin A is displayed on thesurface of human neuroblastoma cells,”Cancer Sci.,第97(12)卷,第1359-1365页,2006(其通过引用整体并入本文用于所有目的)中所讨论的。因此，在某些方面，本公开内容提出了一种细丝蛋白-A抗原模型，其中FLNa的C-端暴露于细胞外基质，且FLNa的N-端位于细胞质中。在该模型中，N-端的肌动蛋白-结合结构域继续与肌动蛋白细胞骨架结合，而表面展示的部分允许与各种细胞外配体(包括本文教导的抗体)相互作用。
核酸分子和宿主细胞
本公开内容的任何抗体或抗体片段可以由核酸编码。本公开内容包括在载体中包含的此类分子、此类分子的片段和此类分子等。核酸分子还包括此类核酸分子的互补物。DNA和RNA分子都是核酸分子的例子。
在另一个方面，本公开内容提供了分离的DNA序列，其编码抗体分子的重链，其中所述抗体分子对细丝蛋白-A抗原(至少包括细丝蛋白-A)具有优先结合，并且其中重链的可变结构域包含具有至少一、二或三个CDR的抗原结合位点氨基酸序列的CDR。
在另一个方面，本公开内容提供了分离的DNA序列，其编码抗体分子的轻链，其中所述抗体分子对细丝蛋白-A抗原(至少包括细丝蛋白-A)具有优先结合，并且进一步其中轻链的可变结构域包含具有至少一、二或三个CDR的抗原结合位点氨基酸序列的CDR。
在另一个方面，本公开内容包括在宿主细胞中的核酸分子。这样的核酸分子可以整合到宿主细胞的基因组中，或者可以存在于载体诸如质粒或病毒载体上。本公开内容的核酸分子可以瞬时存在于这样的宿主细胞中。在一个方面，宿主细胞选自：大肠杆菌(E.coli)；芽孢杆菌，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肠细菌科，包括沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和假单胞菌属(Pseudomonas)、酵母，包括酵母属(Saccharomyces)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；Sf9昆虫细胞；Sp2/0、VERO和HeLa细胞、人胚胎肾(HEK)细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系；W138、BHK、COS-7和MDCK细胞系。在一个方面，宿主细胞选自乳腺癌细胞系诸如SKBR3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435和ZR75B细胞。在另一个方面，宿主细胞选自前列腺癌细胞系诸如PC3、DU145和LNCap细胞。在另一个方面，宿主细胞选自结肠癌细胞系诸如HT-29细胞。在另一个方面，宿主细胞选自皮肤癌细胞系诸如A431细胞。在另一个方面，宿主细胞选自肾癌细胞系诸如BHK-21或COS-7细胞。在另一个方面，宿主细胞选自卵巢癌细胞系诸如A2780、A2780ADR或A2780cis细胞。在另一个方面，它是CHO细胞。在另一个方面，它是肺癌细胞(例如，A549细胞系)。
制备细丝蛋白-A抗体、细胞内抗体或抗体片段的方法
例如通过用来自MDA-MB-231乳腺癌细胞系的蛋白制剂免疫动物，可以开发本公开内容的细丝蛋白-A抗体或抗体片段。
本公开内容包括使用重组DNA技术生产单克隆抗体、嵌合抗体(包括人源化抗体)的方法。参见，例如，Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane编,Cold SpringHarbor Press,1988)，其通过引用整体并入本文。
可以通过任何已知方法来产生本公开内容的细丝蛋白-A抗体或抗体片段，所述方法包括、但不限于，产生鼠杂交瘤，所述鼠杂交瘤产生对细丝蛋白-A特异性的抗体或抗体片段。杂交瘤可以如下形成：例如，通过融合小鼠融合配偶体细胞和来自针对细丝蛋白-A免疫的小鼠的脾细胞。为了免疫小鼠，可以遵循多种不同的常规方案。例如，小鼠可以接受抗原制剂的初次和加强免疫接种。
本公开内容提供了制备细胞内抗体的方法。可以通过任何已知方法产生细丝蛋白-A特异性的细胞内抗体，所述方法包括、例如在细胞中表达细丝蛋白-A特异性的scFv，其中所述scFv被修饰用于细胞内定位。例如，scFv可以在N-和/或C-端与蛋白融合以帮助表达、增加稳定性、增加对细胞内环境的抗性和/或将scFv靶向特定的亚细胞结构或区域。在某些实施方案中，所述细胞内抗体包含，从氨基端至羧基端，可变轻链、接头和可变重链。在某些实施方案中，所述细胞内抗体包含，从氨基端至羧基端，可变重链、接头和可变轻链。接头可以是本领域已知的任何融合蛋白接头。例如，在某些实施方案中，所述接头是柔性的接头。在某些实施方案中，所述接头是甘氨酸-丝氨酸接头，例如，例如(GGGS)3(SEQ ID NO:71)或(GGGGS)3(SEQ ID NO:72)。在表1B中提供了本文提供的细胞内抗体的示例性氨基酸序列。在某些实施方案中，scFv的可变重链和/或轻链包含或连接至标签，诸如聚-组氨酸标签、FLAG标签、或本领域已知的其它标签。因此，在某些实施方案中，本公开内容提供了组氨酸标记的抗-细丝蛋白A细胞内抗体。在某些实施方案中，所述细胞内抗体包含融合蛋白以帮助细胞内抗体的表达。例如，在某些实施方案中，所述融合蛋白包含在scFv的N-和/或C-端的融合体，诸如GST、Ig-Fc或将细胞内抗体靶向亚细胞结构或区域(诸如细胞核、ER、高尔基体、线粒体、溶酶体或其它亚细胞结构或区域)的蛋白序列。
在某些实施方案中，将细胞内抗体构建体遗传上连接至报道基因，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、萤光素酶或其它基因。在某些实施方案中，连接的报道基因由其自身的启动子驱动。在某些实施方案中，通过IRES序列驱动连接的报道基因，以驱动来自细胞内抗体启动子的表达。因而，在某些实施方案中，所述细胞内抗体包含细丝蛋白-A特异性的scFv，其包含可变重链和轻链、标签和报道基因(例如，Vh-Vl-His-IRES-GFP或Vl-Vh-His-IRES-GFP)。在某些实施方案中，所述细胞内抗体包含细丝蛋白-A特异性的scFv，其包含由EF启动子驱动的可变重链和轻链、标签(例如，His标签)和由IRES序列驱动的报道基因(例如，GFP)(例如，EF-Vh-Vl-His-IRES-GFP或EF-Vl-Vh-His-IRES-GFP)。在某些实施方案中，通过病毒载体(例如，逆转录病毒、慢病毒或腺病毒载体)递送细胞内抗体。在某些实施方案中，通过双顺反子慢病毒载体递送细胞内抗体，例如，如在Reiser等人,“Development of Multigene and Regulated Lentivirus Vectors,”Journal ofVirology,第74(22)卷第10589-99页(2000)(其通过引用整体并入本文)中所述。
在某些实施方案中，所述细胞内抗体是经由细胞穿透肽、其它化学部分或纳米载体递送系统递送或转移到细胞内以跨细胞膜转移细胞内抗体的蛋白。示例性的细胞穿透肽、其它化学部分等是本领域已知的，并且包括、但不限于，触角足基因序列、TAT、HIV-Tat、穿透素(Penetratin)、Antp-3A(Antp突变体)、Buforin II、转运素、MAP(模型两亲肽)、K-FGF、Ku70、朊病毒、pVEC、Pep-1、SynB1、Pep-7、HN-1、BGSC(Bis-Guanidinium-精脒-胆固醇和BGTC(BisGuanidinium-Tren-胆固醇)。因此，在某些实施方案中，本公开内容提供了融合蛋白，其包含与本文提供的抗体(例如，scFv)融合的蛋白转导结构域。纳米载体递送系统包括基于脂质的纳米载体(例如、脂质体和其它基于脂质的纳米颗粒)、基于聚合物的纳米载体(例如、基于聚合物的脂质体或聚合体)、无机纳米颗粒(例如、二氧化硅纳米颗粒)、微粒以及修饰的病毒或病毒样颗粒。本文提供的细胞内抗体可以通过本领域已知的任何转移系统以蛋白的形式递送至细胞。
可以通过免疫学领域的技术人员已知的规程完成细胞融合。融合配偶体细胞系以及用于融合和选择杂交瘤的方法以及筛选抗体或抗体片段的方法是已知的。
本公开内容的抗体或抗体片段可以大量产生，例如，通过将分泌抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔中，并且在适当的时间之后，收集含有高滴度的抗体或抗体片段的腹水液，并从中分离抗体或抗体片段。可替换地，通过在体外培养杂交瘤细胞并从细胞培养基中分离分泌的抗体或抗体片段，可以产生抗体和抗体片段。
在序列已经可操作地连接至表达控制序列后，通过在宿主细胞中表达适当的DNA序列，也可以产生本公开内容的细丝蛋白-A抗体或抗体片段。这样的表达载体经常可以作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物中复制。表达载体经常含有与宿主细胞相容的表达控制序列，例如复制起点。另外，表达载体可以包括启动子以控制基因的表达(任选地与操纵子序列一起)，并具有核糖体结合位点序列等以启动和完成转录和翻译。合适的启动子包括、但不限于，多角体蛋白启动子、乳糖启动子系统、色氨酸启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。表达载体也可以含有选择标记。可以将编码细丝蛋白-A抗体或抗体片段的轻链和重链的DNA序列插入分开的表达载体或相同的表达载体中。
合适的宿主包括、但不限于，原核菌株诸如大肠杆菌(E.coli)；芽孢杆菌，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肠细菌科，包括沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)和假单胞菌属(Pseudomonas)。合适的宿主也包括真核宿主诸如酵母，包括酵母属(Saccharomyces)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；Sf9昆虫细胞；Sp2/0、VERO和HeLa细胞、人胚胎肾(HEK)细胞系；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系；W138、BHK、COS-7和MDCK细胞系。根据已知的表达技术，也可以使用其它合适的宿主。
含有目的DNA区段的载体可以通过任何方法转移到宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染、磷酸钙处理、电穿孔或阳离子脂质体介导的转染(诸如DOTAP)。通过用于检测受体与配体的结合的多种技术，可以鉴定成功转化的细胞。
可以根据任何方法纯化表达的基因产物，包括、但不限于硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱法和凝胶电泳。考虑了至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同质性的基本上纯的免疫球蛋白。
可以将分离的或纯化的DNA序列掺入克隆或表达载体中，所述载体又可以用于转化宿主细胞。转化的宿主细胞可以用在产生对细丝蛋白-A抗原具有特异性的抗体分子的方法中，所述方法包括培养宿主细胞并分离它们产生的抗体分子。
嵌合抗原受体形式的细丝蛋白-A抗体
为了用作细胞外免疫疗法，细丝蛋白-A抗体可能需要从膜的细胞外侧接近。在某些实施方案中，本文提供的抗体结合在膜的细胞外侧上的细丝蛋白-A，并且可用于细胞免疫疗法诸如CAR-T疗法。因此，在某些实施方案中，本公开内容提供了呈嵌合抗原受体(CAR)形式的细丝蛋白-A-特异性抗体。例如，本公开内容提供了抗体、CAR和表达CAR的细胞，其中所述抗体、CAR或表达CAR的细胞特异性地结合在细胞表面上表达的细丝蛋白-A。例如，在某些实施方案中，本公开内容提供了包含细丝蛋白-A抗体或其片段(例如，scFv)的细丝蛋白-A-特异性的CAR多肽。在其它实施方案中，所述CAR多肽包含细胞内信号传递结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞外结构域，其中至少一个细胞外结构域是细丝蛋白-A抗体或其片段。在某些实施方案中，所述细胞内信号传递结构域包含共刺激结构域(例如CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3和它们的任意组合)和/或T细胞受体(TCR)ζ链信号传递结构域。在某些实施方案中，CAR多肽的细丝蛋白-A抗体或其片段包含本文提供的重链和轻链可变区的CDR区域。在某些实施方案中，CAR多肽的细丝蛋白-A抗体或其片段包含本文提供的重链和轻链可变区的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开内容提供了编码本文所述的CAR多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，包含细丝蛋白-A抗体或其片段的CAR多肽在免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、NK-T细胞、B细胞、巨噬细胞或干细胞)上表达。在其它实施方案中，免疫细胞是T细胞。因此，在某些实施方案中，本公开内容提供了经工程改造的细胞诸如CAR-T细胞，其将T细胞靶向至在细胞表面上表达细丝蛋白-A的细胞。在其它实施方案中，本公开内容提供了经工程改造的NK细胞或NK-T细胞，其通过细丝蛋白-A CAR将NK细胞或NK-T细胞靶向至在细胞表面上表达细丝蛋白-A的细胞。在其它实施方案中，本公开内容提供了经工程改造的巨噬细胞，其以CAR形式表达细丝蛋白-A抗体或其片段，其中所述经工程改造的巨噬细胞将巨噬细胞靶向至在细胞表面上表达细丝蛋白-A的吞噬细胞(engulf cells)。在某些实施方案中，所述细丝蛋白-A特异性抗体或其片段(例如在表达CAR的免疫细胞上表达)优先结合表达细胞外细丝蛋白-A的癌细胞。
诊断方法、测定和试剂盒
在另一个方面，本公开内容包括用于检测包含本公开内容的抗体或抗体片段的细丝蛋白-A抗原的免疫测定。
本公开内容也包括这样的免疫测定：其用于优先检测一种或多种细丝蛋白-A抗原(包括一种细丝蛋白-A抗原)，所述细丝蛋白-A抗原结合具有表1A中所示的一个或多个重链或轻链CDR抗原结合位点氨基酸序列的单克隆抗体。
可以以任何合适的方式使用这样的免疫测定，包括、但不限于，包括：(a)使样品与有效结合量的本公开内容的抗体或抗体片段之一接触；和(b)通过检测抗体与细丝蛋白-A抗原的结合来检测抗原。本公开内容的免疫测定可以用于检测表达细丝蛋白-A抗原的癌细胞，特别是选自乳房、卵巢、宫颈、前列腺、结肠、胃、肾、肝、头、颈、肺、血液、胰腺、皮肤、睾丸、甲状腺和脑癌的癌症、肿瘤、癌细胞或赘生性疾病细胞。
在另一个方面，本公开内容提供了用于癌症的免疫组织化学检测的试剂盒，其包含：(a)本公开内容的抗体或抗体片段；和(b)与可检测标记物缀合的第二抗体。
在另一个方面，本公开内容提供了用于癌症的免疫组织化学检测的试剂盒，其包含：(a)具有表1A所示的一个或多个重链或轻链CDR抗原结合位点氨基酸序列的单克隆抗体；和(b)与可检测标记物缀合的第二抗体。
试剂盒可以包括用于测定样品中的细丝蛋白-A抗原的试剂，其中这样的试剂盒可以包括：细丝蛋白-A抗原特异性的亲和试剂，例如抗体、其片段或模拟物，和/或包含信号产生系统的相同成员(诸如抗体、酶底物等)的免疫测定装置；用于进行主题检测测定的各种缓冲液；用于确定样品中的一种或多种细丝蛋白-A抗原的量的参考；等。试剂盒或试剂盒形式的其它实例可以在2008年8月08日提交的美国专利申请公开号2008/0293162 A1(对应于美国专利申请号12/189,051)中找到，其通过引用整体并入本文用于所有目的。
在另一个方面，本公开内容提供了一种用于诊断人类中的癌症的方法，该方法包括：(a)从疑似具有癌症的患者取出样本；(b)使所述样本与本公开内容的抗体或抗体片段接触；和(c)检测抗原-抗体复合物的存在。在某些方面，使用和检测标签。可以在体内或在体外进行这样的诊断癌症的方法。
在另一个方面，本公开内容提供了一种用于诊断人类中的癌症的方法，该方法包括：(a)从疑似具有癌症的患者取出样本；(b)使所述样本与具有表1A所示的一种或多种重链或轻链CDR抗原结合位点氨基酸序列的单克隆抗体接触；和(c)检测抗原-抗体复合物的存在。在某些方面，使用和检测标签。诊断癌症的方法可以在体内或在体外进行。
被诊断的癌症包括选自乳房、卵巢、子宫颈、前列腺、结肠、胃、肾、肝、头、颈、肺、胰腺、皮肤、睾丸、甲状腺和脑的实体瘤的那些。所述细胞可以进一步包括人乳房、卵巢、头、颈和脑细胞。
在一个方面，相对于年龄匹配的健康对照，早期乳腺癌患者中的细丝蛋白-A水平更高。在另一个方面，相对于年龄匹配的健康对照，中期乳腺癌患者中的细丝蛋白-A水平更高。在另一个方面，相对于年龄匹配的健康对照，晚期乳腺癌患者中的细丝蛋白-A水平更高。在一个方面，相对于年龄匹配的健康对照，早期乳腺癌患者中的细丝蛋白-A水平更高，并且在乳腺癌晚期类似于健康对照水平。在某些方面，细丝蛋白-A水平的增加意味着它们相对于年龄匹配的健康对照而言是统计上显著的。与健康对照水平相似的水平可能意味着该水平不是统计上显著的。在一个方面，如通过Mann-Whitney检验或Student氏t-检验或本领域已知的任何其它统计检验所测量的，细丝蛋白-A水平的统计学显著差异具有p<0.05的p-值。在另一个方面，如通过Mann-Whitney检验或Student氏t-检验或本领域已知的任何其它统计检验所测量的，细丝蛋白-A水平的统计学显著差异具有p<0.01的p-值。在另一个方面，如通过Mann-Whitney检验或Student氏t-检验或本领域已知的任何其它统计检验所测量的，细丝蛋白-A水平的统计学显著差异具有p<0.005的p-值。在另一个方面，如通过Mann-Whitney检验或Student氏t-检验或本领域已知的任何其它统计检验所测量的，细丝蛋白-A水平的统计学显著差异具有p<0.001的p-值。在某些实施方案中，患者之间的水平不是统计上显著的；但是，结果仍是可计量的，且可以指示具有癌症的患者与正常的非癌性个体之间的差异。
在另一个方面，本公开内容提供了一种在有此需要的受试者中诊断乳腺癌的方法，该方法包括：(a)使来自所述受试者的样本与本公开内容的抗体或抗体片段接触；和(b)在具有乳腺癌的患者中检测细丝蛋白-A的增加，其中这样的乳腺癌可以处于早期、中期或晚期。这样的诊断乳腺癌的方法可以在体内或在体外进行。
被诊断的乳腺癌可以是早期、中期或晚期乳腺癌中的任何一种或它们的组合。
在另一个方面，本公开内容包括用于开发药物的方法，所述药物可用于治疗、诊断或同时治疗和诊断以细丝蛋白-A的基因产物及其同系物的表达为特征的疾病。这些方法包括鉴定由细丝蛋白-A表达的基因产物及其同系物，以及在药物的开发和鉴定中利用所述基因产物作为生物标记物，所述药物选自细丝蛋白-A抗体和抗体片段、抑制肽、siRNA、反义寡核苷酸、疫苗和化学化合物，它们特异性地靶向所述基因产物。
抗体和抗体片段可以用于免疫测定中以关于细丝蛋白-A的存在来筛选体液，诸如血清、痰、渗出液、尿、脑脊液等。当用适当的放射性标记物标记时，抗体和抗体片段可用于扫描或放射成像，以检测肿瘤细胞的原发灶或转移灶。此外，所述抗体可用于淋巴闪烁照相术以检测该疾病中的淋巴结牵涉。
细丝蛋白-A抗体或抗体片段(其可以包括对细丝蛋白-A相关的基因产物具有特异性的任何或所有抗体或抗体片段，和/或其嵌合变体，诸如人源化变体或其它变体)可以治疗性地使用，或者用在开发和执行测定、体内或体外诊断规程和成像中。所述抗体可以单独使用，或者与药学上可接受的或诊断性的载体制剂联合使用。细丝蛋白-A抗体或抗体片段可以作为混悬液或溶液掺入药学上或诊断上可接受的无毒无菌载体中。它们可以用作单独施用的组合物，或与化学治疗剂或免疫抑制剂结合使用。
本公开内容包括治疗性和诊断性组合物，其包含与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的本公开内容的抗体或抗体片段。本公开内容还包括制备治疗或诊断组合物的方法，该方法包括将本公开内容的抗体分子与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体混合在一起。抗体分子可以是治疗或诊断组合物中的唯一活性成分，或者可以伴有其它活性成分，包括其它抗体成分，例如抗-T细胞、抗-IFNγ或抗-LPS抗体或非抗体成分诸如黄嘌呤。可以将组合物掺入试剂盒中，所述试剂盒用于诊断或治疗以细丝蛋白-A的表达为特征的疾病，所述疾病包括、但不限于实体瘤，尤其是乳房、卵巢、子宫颈、前列腺、结肠、胃、肾、肝、头、颈、肺、胰腺、皮肤、睾丸、甲状腺和脑的实体瘤。所述细胞还可以是人乳房、卵巢、头、颈或脑细胞。
本公开内容的抗体或抗体片段可用于免疫测定，所述免疫测定检测或定量样品中的细丝蛋白-A或带有细丝蛋白-A的细胞。这样的免疫测定通常包括：在能够鉴定肿瘤抗原的本公开内容的可检测地标记的抗体存在下，温育来自有此需要的受试者的生物样品，和检测结合在样品中的被标记的抗体。
在本公开内容的一个方面，对细丝蛋白-A分布的观察可以用于检测与特定疾病(例如，乳腺癌)相关的阶段。可以将组织样本与细丝蛋白-A抗体一起温育，并可以使用标准的免疫组织化学染色检测所得的细丝蛋白-A-抗原-细丝蛋白-A抗体复合物。
可以可检测地标记本公开内容的抗体的一种方式是，将其连接至酶并用于酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)中。当该酶随后暴露于其底物时，它将与底物反应从而产生可以被检测到的化学部分，例如通过分光光度计测量、荧光测量或通过视觉手段。在一个替代实施方案中，该酶用于标记本公开内容的抗体的结合配偶体。这样的结合配偶体可以是针对本公开内容的抗体的恒定或可变区的抗体，诸如异源抗-小鼠免疫球蛋白抗体。可替换地，结合配偶体可以是能够结合本公开内容的抗体的非抗体蛋白。
通过放射性地标记本公开内容的抗体，可能通过使用放射免疫测定(RIA)来检测细丝蛋白-A。通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的方法或通过放射自显影术，可以检测放射性同位素。对于本公开内容的目的特别有用的同位素是本领域已知的。
也可能用荧光化合物标记本公开内容的抗体。当荧光地标记的抗体暴露于适当波长的光时，然后由于荧光的原因可以检测到它的存在。本公开内容的抗体还可以通过偶联至化学发光的化合物而被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光来确定化学发光地标记的抗体的存在。生物发光的化合物也可以用于标记本公开内容的抗体。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光类型，其中催化蛋白提高化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。用于标记目的的重要生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白(sequorin)。
抗体、片段或衍生物的检测可以通过闪烁计数器完成，例如，如果可检测的标记物是放射性γ发射体，或者通过荧光计，例如，如果标记物是荧光物质。在酶标记的情况下，通过使用酶底物的比色测量方法，可以完成检测。通过相对于类似制备的标准品目测对比底物的酶促反应程度，也可以完成检测。
可以如下完成原位检测：从患者取出样本，并向这样的样本提供被标记的抗体或未标记的抗体+被标记的结合配偶体。通过使用这样的规程，可能不仅确定抗原的存在，而且确定其在被检查组织中的分布。使用本公开内容，普通技术人员将容易地认识到，可以修改多种组织学方法(例如染色规程)中的任何一种以便实现这样的原位检测。这样的方法包括，例如，免疫组织化学染色规程。在一个方面，尽管本公开内容的方法可以利用本领域已知的任何合适的染色规程，但是可以使用抗生物素蛋白-生物素免疫过氧化物酶染色系统，并且也涵盖利用该系统的试剂盒。
根据本公开内容的试剂盒可以包括冷冻的或低压冻干的抗体，所述抗体将通过解冻或通过悬浮在液体媒介物中而重构。试剂盒还可以包括载体或缓冲液。在另一个实施方案中，试剂盒还包含关于重构和使用抗体的说明书。采用抗体(包括本公开内容的嵌合和人源化抗体)的试剂盒可用于癌症的免疫组织化学评价，所述癌症包括乳房、卵巢、子宫颈、前列腺、结肠、胃、肾、肝、头、颈、肺、血液、胰腺、皮肤、睾丸、甲状腺和脑的癌症。所述细胞还可以是人乳房、卵巢、头、颈和脑细胞。
可以如下提供包括免疫组织化学分析所必需的试剂的试剂盒：(a)本公开内容的细丝蛋白-A抗体或抗体片段，或其嵌合或人源化变体；(b)封闭试剂(例如，山羊血清的形式)和第二抗体(例如，山羊抗-小鼠抗体)；(c)可检测的标记物(例如，免疫过氧化物酶或碱性磷酸酶)；和(d)显影剂。第一抗体(细丝蛋白-A抗体或抗体片段或其变体)用作可结合超过一种第二抗体的抗原。第二抗体在第一抗体和由可检测标记物和显影剂形成的复合物(例如，辣根过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物)之间形成“桥”。
根据本公开内容的方法和试剂盒，可以使用任何合适的检测系统。这样的检测系统被广泛用在免疫荧光应用中，并且可以使用包括、但不限于流式细胞计量术、显微术、蛋白质印迹法和ELISA的技术进行成像。合适的检测系统可以采用第二抗体的结合物、胶体金的缀合物或第二蛋白的缀合物，以扩增来自第一蛋白的信号(在本公开内容的上下文中，被扩增的第一蛋白信号是结合的细丝蛋白-A抗体，其可以用或不用例如蛋白诸如生物素标记)，该信号又被用于检测特定靶标(在本公开内容的上下文中，该靶标是细丝蛋白-A表达产物)。
用于本公开内容的方法和试剂盒的合适的第二缀合物可以包括、但不限于：第二抗体和酶(诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的酶缀合物；抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素和酶(诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的酶缀合物；蛋白A或蛋白G和酶(诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的酶缀合物；胶体金和第二抗体的缀合物；胶体金和抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的缀合物；磁性颗粒和第二抗体的缀合物；以及第二抗体和标记(诸如荧光染料和生物素)的缀合物。本公开内容不限于任何特定的检测系统，并且在本领域普通技术人员的能力范围内考虑使用根据本公开内容的这些或其它检测系统。这些第二缀合物(在本公开内容的上下文中也被称作标记)可用于使抗原-抗体复合物显影。
本公开内容的抗体或抗体片段也可以适合用于免疫测定，也被称作“两位点”或“夹心”测定。在典型的免疫测定中，使一定量的未标记抗体(或抗体片段)结合至不溶于被测流体的固体支持物，并添加一定量的可检测标记的可溶性抗体以允许在固相抗体、抗原和被标记的抗体之间形成的三元复合物的检测和/或定量。
为了使用本公开内容的抗体或抗体片段对乳房、卵巢、子宫颈、前列腺、结肠、胃、肾、肝、头、颈、肺、血液、胰腺、皮肤、睾丸、甲状腺和脑(人乳房、卵巢、头、颈和脑癌和其它癌症)进行体内成像，本领域普通技术人员已知许多不同的标记和标记方法。可以在本公开内容中使用的标记的类型的例子包括放射性同位素、顺磁性同位素和可以通过正电子发射断层摄影术(PET)成像的化合物。
装置
如上所述，还提供了可用于实践主题方法的装置。用于实践主题方法的装置至少包括用于测定源自受试者的样品中的细丝蛋白-分析物的试剂，其中这样的装置可以包括：固定在固体支持物的表面上的细丝蛋白-分析物特异性亲和试剂，诸如抗体或其片段或模拟物。在某些实施方案中，所述细丝蛋白-分析物是细丝蛋白-A分析物。
可以存在在要与装置一起实践的方法中需要或期望的额外物品，所述额外物品包括、但不限于：用于得到患者样品的装置，例如注射器；制备患者衍生的样品所需的一种或多种试剂，诸如肝素、Ficoll-Hypaque、裂解缓冲液、蛋白酶抑制剂等；关于使用主题装置实行主题方法的说明书；来自另外的生化测定的一种或多种试剂，所述生化测定用于检测涉及细丝蛋白-分析物的异常水平的赘生性疾病的存在和/或表征所述疾病。
许多这样的装置是本领域已知的。在一个非限制性例子中，该装置通常将采用合适的过滤器或膜的连续流动路径，其具有至少三个区域：流体运输区域、样品区域和测量区域。在接收样品之前，防止样品区域与流动路径的其它部分发生流体转移接触。在样品区域接收样品之后，它与其它区域发生流体转移关系，并且所述流体转移区域与流体接触以允许试剂溶液穿过样品区域并进入测量区域。测量区域可以已经结合有与测定样品组合的第一亲和试剂和第二标记的亲和试剂，并如上进行夹心测定。
在另一个非限制性例子中，该装置是浸渍片，其表面结合有特异性地结合细丝蛋白-分析物的亲和试剂，例如抗体、其片段或模拟物。在这样的示例性装置中，将浸渍片直接插入源于受试者的试验样品(例如，血液、血清或尿)中一段时间，该时间足以允许细丝蛋白-分析物与结合至浸渍片的亲和试剂结合。然后可以抽出浸渍片，且如果必要的话，洗涤以除去非特异性结合的物质。然后将浸渍片插入容器，所述容器含有特异性结合细丝蛋白-分析物的可检测地标记的第二亲和试剂，例如抗体或其片段或模拟物。在温育足以使第二抗体结合细丝蛋白-分析物-亲和试剂复合物的时间后，可以洗涤浸渍片，并通过标准方法检测第二亲和试剂的结合。在第二抗体的检测所必需的情况下，可将浸渍片插入第二容器中，所述第二容器含有激活第二抗体上的可检测标记物的试剂。
药物组合物和治疗方法
本公开内容的另一个方面提供了一种组合物，其包含任何公开的抗体，任选地与药学上可接受的载体组合。在另一个方面，本公开内容的抗体任选地与一种或多种活性剂、药物、其它抗体或激素组合。
本公开内容也提供了治疗患有表达细丝蛋白-A的癌症或处于该癌症风险中的人或动物受试者的方法，所述癌症是例如乳房、卵巢、子宫颈、前列腺、结肠、胃、肾、肝、头、颈、肺、血液、胰腺、皮肤、睾丸、甲状腺和脑的实体瘤；和人乳房、卵巢、头、颈和脑，尤其人乳房细胞，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的本公开内容的抗体，或包含治疗有效量的本公开内容的抗体的药物组合物。本公开内容也提供了本文提供的抗体在治疗患有表达细丝蛋白-A的癌症或处于该癌症风险中的人或动物受试者的方法中的用途；和本文提供的抗体在药物制备中的用途，所述药物用于治疗患有表达细丝蛋白-A的癌症或处于该癌症风险中的人或动物受试者。进一步，本公开内容提供了用于用在治疗患有表达细丝蛋白-A的癌症或处于该癌症风险中的人或动物受试者的方法中的本文公开的抗体，和/或本文中公开的抗体。
本文中使用的术语”受试者”表示任何需要治疗的受试者，包括人患者或受试者。
本文中使用的术语“治疗有效量”表示治疗、改善或预防目标疾病或病症、或表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。
对于任何抗体，最初可以在细胞培养测定中或在动物模型中(通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中)估计治疗有效剂量。动物模型也可以用于确定合适的浓度范围和施用途径。然后可以使用这样的信息来确定在人类中有用的剂量和施用途径。
对人类受试者的有效量可以取决于疾病状态的严重程度、受试者的一般健康、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用时间和频率、药物组合、反应敏感性以及对治疗的耐受性/应答，并且可以通过例行实验确定，并且是在临床医师的判断之内。通常，有效剂量可以是约0.001mg/kg至约100mg/kg，或约0.01mg/kg至约50mg/kg，或约0.1mg/kg至约20mg/kg，或约1mg/kg至约15mg/kg。
组合物可以单独施用给患者，或可以与其它药剂、药物、抗体或激素组合施用。根据某些方面，抗体可以与这些试剂缀合。可在治疗上使用本公开内容的抗体的方式的概述包括：抗体的直接细胞毒性(由补体或效应细胞介导)，或缀合至抗肿瘤药物、毒素和放射性核素。因此，本公开内容提供了用于治疗癌症的方法，其包括施用本公开内容的抗体，其中所述抗体靶向癌细胞并诱导ADCC和/或CDC。此外，本公开内容提供了用于治疗癌症的方法，其包括施用与靶向治疗剂连接或缀合的本公开内容的抗体。在某些实施方案中，本文提供的抗体被细胞内吞，且因此能够将靶向治疗剂递送至表达细丝蛋白-A的细胞。因而，本公开内容提供了药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的本文提供的抗体，以及与治疗剂连接或缀合且在药学上可接受的载体中的本文提供的抗体。抗体也可用于从循环中或从骨髓中离体去除肿瘤细胞。
细胞毒性蛋白可以包括、但不限于蓖麻蛋白-A、假单胞菌毒素、白喉毒素和肿瘤坏死因子。诊断放射性核素和细胞毒性剂诸如细胞毒性的放射性核素、药物和蛋白也可以缀合至本公开内容的抗体。可以与抗体偶联并在体内选择性地递送至抗原位点的放射性核素的例子包括212Bi、131I、186Re和90Y以及其它。如放射疗法领域中已知的，放射性核素可以通过局部照射细胞而发挥其细胞毒性效应，从而导致各种细胞内损伤。可以缀合至抗体并随后用于体内疗法的细胞毒性药物的例子包括、但不限于柔红霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和丝裂霉素C。细胞毒性药物可以与关键的细胞过程(包括DNA、RNA和蛋白合成)接口。
施用本公开内容的抗体分子的剂量取决于待治疗的病症的性质，并且取决于抗体分子被预防性使用还是用于治疗现有病症。如果预防性施用，即作为疫苗施用，则以在受试者中有效引发免疫应答的量施用抗体。
如果抗体分子具有短的半衰期(例如2至10小时)，则可能有必要每天施用一剂或多剂。可替换地，如果抗体分子具有长的半衰期(例如2至15天)，则仅需要每天、每周或甚至每1或2个月一次施用剂量。
药物组合物还可以含有用于施用抗体的药学上可接受的载体。载体本身不应诱导对接受该组合物的个体有害的抗体的产生，并且不应是有毒的。合适的载体包括本领域已知的那些，并且可以选自大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒，尽管合适的载体不限于这些例子。
在一个实施方案中，用于施用的形式包括适合于胃肠外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过快速推注或连续输注。在产品用于注射或输注的情况下，它可以呈在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳剂的形式，并且它可以含有配制剂，例如助悬剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可替换地，抗体分子可以是干燥形式，用于在使用之前用适当的无菌液体重构。
一旦配制，本公开内容的组合物可以直接施用给受试者。待治疗的受试者可以是动物或人类。
本公开内容的药物组合物可以通过任何数目的途径施用，包括、但不限于：口服、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或直肠途径。无针注射器也可以用于施用本公开内容的药物组合物。可以将治疗组合物制备成注射剂，作为液体溶液或混悬液。也可以制备适于在注射之前溶解或悬浮在液体媒介物中的固体形式。
组合物的直接递送通常可以通过皮下地、腹膜内地、静脉内地或肌肉内地注射完成，或递送至组织的间质间隙。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。
当通过使用胃肠道的途径施用抗体或抗体片段组合物时，该组合物可以含有另外的试剂，所述试剂保护抗体免于降解，但是一旦它已经从胃肠道吸收就释放出抗体。这样的另外的试剂是本领域技术人员众所周知的。
本公开内容的抗体也可以在进行基因疗法的方法中施用。为了实现这一点，将在适当表达组分控制下的编码抗体分子的重链和轻链的核酸序列引入患者体内，使得抗体链从核酸序列表达并原位组装。例如，细胞内抗体构建体可以作为质粒构建体(例如，具有真核启动子以驱动细胞内抗体表达的质粒)、基于病毒的构建体(例如，慢病毒或逆转录病毒载体)或基于非病毒的递送媒介物(例如，基于脂质的或基于聚合物的递送媒介物)在细胞内递送。细胞内抗体构建体可以作为DNA或RNA来递送。可替换地，重组细胞内抗体蛋白构建体可以通过具有细胞膜穿透肽的蛋白或通过化学或机械递送系统递送至细胞。
本公开内容的抗体也可以经由免疫细胞以CAR形式施用。在某些实施方案中，本公开内容提供了包含表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞的药物组合物，其中所述CAR包含本文提供的细丝蛋白-A结合结构域。在某些实施方案中，所述药物组合物包含免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞或干细胞)。在其它实施方案中，免疫细胞是T细胞。因而，在某些实施方案中，本公开内容提供了包含CAR-T细胞的药物组合物，所述CAR-T细胞将T细胞靶向至在细胞表面上表达细丝蛋白-A的细胞。
实施例
实施例1：人嵌合细丝蛋白-A抗体的制备
AHO1402(一种单克隆鼠细丝蛋白-A IgG1k抗体)以95％BSA和5％抗体的溶液得自Life Technologies。为了去除BSA并纯化抗体，将抗体用凝胶电泳分离并纯化，并按大小分离，并从凝胶上切下。
使用数据库辅助的散弹枪测序(Database Assisted Shotgun Sequencing，DASS)技术对包含抗体的凝胶切片进行从头测序，该技术利用高分辨率MS/MS肽测定得到序列信息，然后通过重叠肽序列分析来编译以重构序列。在Creative Biolabs网站(http://www.creative-biolabs.com/next-generation-antibody-sequencing.html)上一般地描述了DASS方法。
然后将轻链和重链可变结构域的构建氨基酸序列添加到发明人选择的鼠和人恒定区序列上。在轻链CDR1的第31位以及在重链CDR3的第101和102位进行了某些氨基酸选择。上面表1A中提供了显示各种突变的氨基酸序列。
然后为了哺乳动物细胞表达将这些氨基酸序列用密码子优化反向翻译。在进一步使用之前确认重构基因的核酸序列的保真度，并然后克隆进表达载体中。然后将表达载体中克隆的基因转染到HEK293细胞中，并纯化重组mAb蛋白。
实施例2：scFv制备和表征
将重链和轻链可变区亚克隆进scFv载体系统中，以在两个可能取向生成scFv，即轻-重(VL-VH或vl-vh)和重-轻(VH-VL或vh-vl)。
所得的单链抗体将在测定中测试，所述测定包括细胞的免疫荧光染色、细胞活动力、增殖、细胞凋亡和评价功能性生物学活性的其它测定。
将进一步评价scFv用于用在诊断试验和治疗疾病(例如乳腺癌)的方法中。
实施例3：细胞活动力测定
细胞活动力测定用于探索本公开内容产生的mAb(小鼠抗体B186、人嵌合抗体B185和人嵌合抗体B411)的功能活性。
用鼠和人嵌合抗体得到了活性的证据。但是，令人惊奇地，人嵌合mAb显示出比鼠mAb更强的生物学活性。与胶原包被的表面相比，在纤连蛋白包被的组织培养表面上的作用也更明显。
细胞活动力测定利用了Platypus Technologies ORISTM细胞迁移测定平台，该平台在http://www.platypustech.com/discoverAssay.html上进行一般描述。
这种活动力测定(包括3D迭代)被认为与癌细胞侵袭力和恶性程度相关，且因此是癌症转移和其它活性的替代物。
具体地，在ORISTM细胞迁移测定中评价了本公开内容的细丝蛋白-A抗体，该测定使用了三包被的96孔板(Platypus#CMATR1.101)。以大约50,000个细胞/孔接种细胞。在DMEM中(对于HEK-293细胞)，或在含有10％FBS的L-15中(对于MDA-MB-231细胞)，将细胞在无CO2的情况下在37℃温育过夜。用ORISTM塞子工具除去覆盖细胞生长室的塞子，除去生长培养基，并用100微升无菌PBS轻轻洗涤孔。将塞子留在参考孔中，直到染色步骤用作迁移前对照。洗涤后，将含有特定处理的100微升体积的新鲜培养基添加到每个孔中。然后将细胞温育过夜。在温育时段结束时，将细胞用钙黄绿素AM荧光染色30分钟。然后使用装有检测掩模(Detection Mask)的微量培养板读数器测量荧光。
图1和2描绘了对于每种条件在检测区域中存在的相对荧光单位(RFU)(平均值±S.D.,n＝2孔/条件)。
含有细胞的孔以三种形式存在：涂有胶原、涂有纤连蛋白或组织培养(TC)处理。
孔处理如下：无抗体对照，小鼠抗体(mAb FLNA 1微克/ml)，小鼠抗体(mAb FLNA20微克/ml)，人嵌合抗体(hAb FLNA 1微克/ml)，人嵌合抗体(hAb FLNA 20微克/ml)，apicdin(100nM)，细胞松弛素B(30微摩尔)；参见图1。RFU数量的增加与细胞活动力的增加有关。
细胞活动力测定结果
细胞迁移在用胶原或纤连蛋白包被的孔中最大。关于组织培养处理孔，除细胞松弛素B外，似乎在所有处理中几乎没有效果，已知细胞松弛素B会中断细胞骨架纤维相互作用且因此有望抑制活动力。
在TC表面上对抗体处理的应答的明显缺乏可能是由于缺乏已知有助于细胞粘附并影响细胞信号传递和过程以及迁移的细胞外蛋白，诸如胶原或纤连蛋白。预期抗体没有毒性，因此没有毒性组分。因此，细胞迁移并且不受细丝蛋白-A抗体影响。参见图2。
在纤连蛋白和胶原包被的孔中，随着抗体浓度的降低，细胞迁移最弱(即1μg/mL相对于20μg/mL)。
胶原包被的孔中的小鼠抗体在读出时间点没有导致显著的差异。但是，人嵌合抗体表现出对胶原包被的孔中的细胞活动力的抑制作用。参见图1和图2。
对于纤连蛋白，鼠和人嵌合抗体在较低浓度(1μg/mL)时的细胞活动力均降低。但是，可以看到人嵌合抗体导致比鼠抗体低得多的细胞活动力水平。实际上，与鼠抗体相比，人嵌合抗体在抑制细胞活动力方面显示出几乎100％差异，即鼠抗体的191.34RFU相对于人嵌合抗体的106.26RFU。参见图1和图2。
每个试验只有两个点，可以看出一种趋势，表明单克隆抗体对胶原或纤连蛋白增强的细胞扩散和活动力的影响。
在图2中可以看出的总趋势是，相对于鼠细丝蛋白-A抗体，人嵌合抗细丝蛋白-A抗体提供了优秀的结果。
在1μg/mL浓度,人嵌合mAb导致胶原和纤连蛋白处理的孔中细胞迁移的减少。这与鼠mAb相反，在特定终点读数与人嵌合mAb相比，所述鼠mAb没有导致胶原处理的孔中细胞迁移的减少和纤连蛋白处理的孔中的更少减少。
在较高抗体浓度缺乏效果的原因尚不清楚；但是，它可以通过价相互作用来解释。在较低的抗体浓度，单个抗体分子可以交联并结合在细胞表面或平板表面上的两个细丝蛋白-A分子的可能性更高。在较高的抗体浓度，所有结合位点可能被单独的抗体占据，每个抗体仅结合一个细丝蛋白-A，因此不会发生交联。因此，交联可能干扰细丝蛋白-A运动功能。这提示最佳的剂量。
实施例4：免疫荧光(IF)测定
用MDA-MB-231乳腺癌细胞系使用免疫荧光测定进行了细丝蛋白-A mAb的表征。这是用于产生抗原制剂的细胞系，所述抗原制剂用于免疫小鼠，这导致Life TechnologiesAHO1402 mAb的选择。为了对比，同时测定了AHO1402 mAb和另一种商购可得的mAb,TI10(Millipore MAB1680-C)。先前证实了TI10和AHO1402 mAb导致在细胞上不同的染色模式，表明它们识别不同形式的细丝蛋白-A蛋白(Alper等人,2009)。
本公开内容的鼠和人嵌合抗体均产生了类似于用市售的AHO1402(也被称作p280或克隆209#13)观察到的点状染色模式。TI10的染色模式是不同的，揭示了细胞质的一般染色。基于该结果，结论是，鼠mAb和人嵌合mAb的结合与AHO1402 mAb的结合相似。
在免疫荧光测定中使用的第一抗体如下：
抗-细丝蛋白-A,克隆TI10(Millipore,p/n MAB1680-C)
抗-细丝蛋白-A,克隆209#13(Life Technologies,p/n AHO1402)
抗-细丝蛋白-A,小鼠mAb
抗-细丝蛋白-A,人嵌合mAb
抗-β肌动蛋白，兔多克隆(Rockland,p/n 600-401-886S)
使用了两种主要的免疫荧光染色方法。第一种方法包括使用甲醇作为固定剂和使用0.2％Triton作为透化剂的单染色或双重染色，这在Alper等人2009中有所描述。第二种方法利用了双重染色技术，其中2％低聚甲醛作为固定剂和0.2％triton作为透化剂。
将第一抗体与固定的和透化的细胞在室温在1.25微克/ml的浓度温育1小时。一个或多个洗涤步骤后，将第二抗体与细胞在室温温育1小时。在测定中使用的第二抗体及使用的相应浓度如下：
1.25μg/ml抗-小鼠IgG(H&L)(驴)DYLIGHTTM488
5.0μg/ml抗-人IgG(H&L)(驴)荧光素
1.25μg/ml F(ab')2抗-兔IgG[H&L](驴)罗丹明
利用具有甲醇和triton固定/透化技术的第一种方法会大大损害细胞完整性，并导致DAPI染色剂从细胞核中泄漏,参见图3-18。利用第一种方法揭示了在克隆TI10(图3、11和12)和AHO1402(图4、13和14)中的点状染色模式，这与Alper等人,2009描述的染色模式一致。
当使用相同的方法时，小鼠(图5、15和16)和人嵌合(图6、17和18)单克隆抗体再现了在前述抗体中看到的点状染色模式。
因此，与前述AHO1402抗体一样，小鼠mAb和已开发的人嵌合mAb似乎结合细丝蛋白-A的类似形式。
β-肌动蛋白染色(图7)看起来与单独的第二抗体产生的背景荧光没有区别，参见图8-10。
利用具有低聚甲醛和triton固定/透化技术的第二种方法不会导致DAPI泄漏，并且在其它方面再现了通过第一种方法观察到的染色模式，参见图19-27。
实施例5：本公开内容的抗体的进一步表征
关于它们在诊断方法中用于诊断疾病的能力，评价了本公开内容的抗体，所述诊断方法包括免疫组织化学、ELISA以及在活检组织样品(例如，肿瘤样品、血液或血液衍生的级分、尿等)上利用抗体的其它诊断方法。
用ELISA、免疫印迹法技术、细胞染色(例如，免疫荧光、流式细胞计量术)、免疫组织化学对本公开内容的抗体进行进一步测定以表征抗体。基于细胞的测定将包括对细胞活动力、细胞增殖、细胞凋亡和各种细胞信号传递测定的影响的评价。
本公开内容提供了许多进一步用于活动力测定的细胞类型。本公开内容的抗体的表征包括在3D MATRIGEL测定中在有和没有在细胞外基质中发现的各种蛋白添加剂的情况下的活动力分析。除了胶原和纤连蛋白外，这些可以包括、但不限于分子诸如细丝蛋白-A、纤溶酶、层粘连蛋白、角蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、软骨素、整联蛋白以及其它。其它分子可以包括蛋白酶和其它因子，诸如尿激酶纤溶酶原激活物、组织型纤溶酶原激活物、糜蛋白酶、基质金属蛋白酶，以及其它。
另外，用另外的细胞系和组织、抗体滴定、抗体衍生物(例如，抗体-药物缀合物、scFv和其它抗体形式)在细胞活动力测定的背景下进行了进一步测定。
实施例6.用B411相对于货架试剂进行的进一步研究
使用B411抗体和乳腺癌细胞系MDA-MB-231和SKBR3进行了其它细胞测定。具体而言，在ORISTM细胞迁移测定中评价了细丝蛋白-A抗体B411，该测定使用了三包被的96孔板(Platypus#CMATR1.101)。将细胞以大约25,000或50,000个细胞/孔接种。将细胞在37℃、CO2、McCoy's(在SKBR3细胞的情况下)或含有10％FBS的L-15、没有CO2(在MDA-MB-231细胞的情况下)温育过夜。用ORISTM塞子工具除去覆盖细胞生长和迁移地带的塞子，除去生长培养基，并用100微升无菌PBS轻轻洗涤孔。将塞子留在参考孔中，直到染色步骤用作无迁移对照。洗涤后，将含有特定处理的100微升体积的新鲜培养基添加到每个孔中。然后将细胞温育过夜。在温育时段结束时，将细胞如下荧光染色：
·小心地从孔中除去残留的培养基，并用100μL PBS洗涤。除去PBS。
·将100μL 1X钙黄绿素AM(eBioscience,65-0853-78)溶液加入每个孔。
·在37℃温育平板30分钟。然后使用装有检测掩模的微量培养板读数器测量荧光。
·小心取出钙黄绿素AM，并用100μL PBS洗涤。除去PBS。
·向每个孔中加入100μL含有碘化丙啶(用于检测死细胞)和Hoechst 33342(用于检测细胞凋亡的细胞)(分别1:3,000和1:4,000稀释)的PBS。在室温温育5-10min。
·使用5X放大率拍摄代表性孔的荧光图像(蓝色、绿色和红色通道)。
如在图32中可以看到的，用抗-细丝蛋白-A B411抗体处理的MDA-MB-231乳腺癌细胞上的Hoechst 33342染色(蓝色)增加，表明具有细胞凋亡-样表型的细胞增加(Hoechst33342将细胞凋亡的细胞中的浓缩染色质染色成比正常细胞中的染色质更亮)。此外，钙黄绿素AM染色(绿色)存在更多的变异性，其中一些细胞染色强度很高，而有些则根本不染色，这提示抗-细丝蛋白-A抗体处理后代谢活性的显著变化。通过用碘化丙啶(红色)对细胞核染色来鉴定死细胞。
实施例7.细丝蛋白-A-特异性的细胞内抗体
产生了对细丝蛋白-A抗原特异性的细胞内抗体，并进行实验以测试细胞内抗体的表达和功能。在细胞系(例如，MDA-MB-231、HEK392、HeLa或其它细胞系)中瞬时表达细胞内抗体构建体。通过蛋白质印迹法评估转染的细胞以确认抗体(例如，scFv)表达。例如，对于标记的细胞内抗体，scFv表达可以通过标签(例如，使用抗-His或抗-GST标签抗体)或通过抗-scFv抗体或其它抗-细胞内抗体构建体抗体来确认。可替换地或额外地，将免疫荧光测定用于确认scFv表达(例如，通过用抗-His标签、抗-GST、抗-scFv或其它抗-细胞内抗体构建体抗体染色并检测)。
在转染的细胞中监测细胞表型和代谢差异，并与未转染的细胞进行对比，或与用不相关的构建体(诸如不含有抗-细丝蛋白A抗体片段的载体(例如，不含抗体组分的GST融合配偶体)转染的细胞进行对比。细胞表型和代谢评估包括、例如、但不限于，细胞形态、增殖速率、粘附、迁移、活/死细胞数目和比率、代谢速率、蛋白质印迹和/或免疫组织化学和流式细胞计量术，以监测或指导细胞内抗体、融合配偶体和/或细胞标记物的表达。
也在体内测试了细胞内抗体表达、功能和效力。例如，可以利用癌症的异种移植物模型，其中给免疫缺陷小鼠接种(例如，腹膜内地、皮下地或原位)癌细胞。监测肿瘤生长，并在肿瘤发展之前或之后施用潜在治疗性或诊断性细胞内抗体。例如，在乳腺癌的原位模型中，在施用或在细胞内表达抗-细丝蛋白A抗原细胞内抗体之前或同时，将癌细胞植入免疫缺陷小鼠的腹股沟乳房脂肪垫中。例如，通过质粒、基于病毒的或基于非病毒的递送媒介物，可以将抗-细丝蛋白A细胞内抗体构建体递送至乳腺癌细胞以进行细胞内表达。在某些实施方案中，抗-细丝蛋白A细胞内抗体构建体可以作为蛋白经由细胞膜穿透肽被递送至乳腺癌细胞。与接受载体对照或无关的细胞内抗体的对照动物相比，测量了抗-细丝蛋白A细胞内抗体的存在对肿瘤生长的影响。研究结果表明，在癌症的异种移植物模型中，抗-细丝蛋白A细胞内抗体的施用和细胞内表达会减少肿瘤体积，或减慢肿瘤的生长，或防止肿瘤的产生。
实施例8.细胞生存力测定
进行了一项研究以评估与抗体B411一起温育后的细胞存活。将DU145(人前列腺癌细胞系)和HEK293A(人胚胎肾细胞系)细胞接种在96-孔平板中(104个细胞/孔)，并在37℃温育4小时。将1μg或10μg B411(去除了内毒素，1.2EU/mL)添加至孔中，并温育24或48小时。还包括两种细胞类型的未处理组。使用CellCountzEZTM细胞存活测定试剂盒检测细胞存活，并通过参照OD650读取OD412来确定结果。
研究结果提供在图33中，并表明B411抑制了DU145(癌症)细胞增殖。在1μg剂量，与DU145的未处理组相比，B411在24h时表现出对DU145细胞生长的增殖的显著抑制作用(*p<0.01)；但在48h没有统计上显著的影响。1μg剂量的B411在任一时间点(24h或48h)对HEK293A细胞系均无影响。在10μg剂量，与DU145的未处理组相比，B411在24h和48h的两个时间点均显示出对DU145细胞的增殖的显著抑制作用。在10μg时也观察到HEK293细胞增殖的抑制。
B411对DU145的抑制的比率在24h和48h分别为7.8％和14.6％，两者均是显著的(*p<0.01)。HEK293的抑制比率在24h和48h分别为9.3％和17.7％，并且也是显著的(*p<0.01)。
实施例9.细丝蛋白A细胞内抗体降低癌细胞中的FLNA蛋白水平并减少癌细胞增殖
使用双顺反子慢病毒载体产生细胞内抗体，以在单个载体中共表达两个基因。将该载体命名为LV-EF-细胞内抗体FLNA/His标签-IRES-GFP。当载体被递送到细胞中时，第一基因产物细胞内抗体FLNA由EF启动子驱动，且IRES启动第二基因产物GFP的翻译。进行了研究以评估示例性的细丝蛋白A细胞内抗体对各种癌细胞类型的影响。测试了两种包含GFP报道基因的慢病毒载体化的FLNA细胞内抗体构建体：LV-FLNA_1-GFP包含处于VH-VL取向的B411的重链和轻链可变区，和LV-FLNA_2-GFP包含处于相反取向(即VL-VH)的B411的轻链和重链可变区。在研究中还使用了表达GFP的慢病毒对照载体(LV-GFP)。
肺癌
将A549(肺癌细胞系)细胞使用lipofectamine 3000用1μg DNA(LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP或LV-FLNA_2-GFP)转染，或假转染。在转染后72小时收获细胞，并用钙黄绿素-深红色或EthD-1染色，分别用于活细胞和死细胞分析。通过流式细胞计量术评估细胞生存力。
细胞生存力测定的结果提供在图34-38中。图34A-E显示了转染后72小时在转染的细胞中的GFP表达。图34A显示在假转染的细胞中没有GFP表达。图34B、C和D显示了在LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP转染的细胞中的GFP表达。图34E是图34A-D中的直方图的重叠。
图35A-F显示了在转染后72小时GFP-门控的细胞的活细胞分析。图35A和B显示了未染色的对照(图35A)和阳性对照细胞(钙黄绿素深红(CDR)活细胞染色)(图35B)。图35C、D和E显示了在用LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP或LV-FLNA_2-GFP转染后72小时GFP阳性细胞中的CDR阳性染色。图35F是来自图35C、D和E的活细胞分析的直方图重叠。图36显示了GFP阳性细胞群体中CDR阳性(活)细胞的总数。LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP都显著减少了活细胞的数量(p<0.0001)。
图37A-E显示了在转染后72小时GFP-门控的细胞的死细胞分析。图37A和B显示了未染色的对照(图37A)和阳性对照细胞(EthD-1死细胞染色)(图37B)。图37C、D和E显示了在用LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP或LV-FLNA_2-GFP转染后72小时GFP阳性细胞中的EthD-1染色。图38A是来自图37C、D和E的死细胞分析的直方图重叠。图38B显示了在GFP阳性细胞群体中EthD-1阳性(死)细胞的总数。相对于LV对照，LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP都显著增加了死细胞的数量(分别p<0.005和p<0.0001)。相对于LV对照和LV-FLNA_1-GFP，LV-FLNA_2-GFP显著增加了死细胞的数量(p<0.0001)。
对于细胞增殖测定，使用lipofectamine 3000将2.5μg DNA转染到6孔板的每个孔中的A549细胞中。在转染后72小时收获细胞，并与EdU试剂一起温育两小时。未与EdU试剂接触的细胞用作阴性对照。通过流式细胞计量术评估增殖。
增殖测定的结果提供在图39中。图39A是未染色的对照。图39B显示了载体对照转染的细胞的增殖。图39C和39D分别显示了LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP转染的细胞的增殖。图39E的图显示了每组中的EdU阳性(增殖)细胞的百分比。相对于LV-GFP(p<0.0001)，LV-FLNA_2-GFP显著降低了A549细胞的增殖。
为了显微术研究，使用lipofectamine 3000将2.5μg DNA转染到6孔板的每个孔中的A549细胞中，并在转染后24小时使用共焦显微镜对细胞成像。图40提供了结果。图40A1、B1和C1分别显示了LV-GFP转染的细胞、LV-FLNA_2-GFP转染的细胞和LV-FLNA_1-GFP转染的细胞的荧光图像。图40A2、B2和C2分别显示了LV-GFP转染的细胞、LV-FLNA_2-GFP转染的细胞和LV-FLNA_1-GFP转染的细胞的明视野图像。图40D1和40D2分别显示了图40C1和40C2中的选定视图(白色三角形)的放大视图。图40D3是图40D1和40D2的合并视图。白色箭头表示FLNA与GFP在A549细胞中共表达。
进一步进行了一项研究以对比FLNA细胞内抗体处理在A549细胞中相对于非癌症MRC-5细胞的效果。使用lipofectamine 3000将2.5μg DNA转染到6孔板的每个孔中的A549细胞中，并在转染后72小时使用共焦显微镜对细胞成像。图41提供了结果。在LV-FLNA_2-GFP处理的A549细胞中可见细胞死亡(图41A2)，但在对照LV-GFP处理的A549细胞中却没有(图41A1)。相反，在LV-FLNA_2-GFP处理的MRC-5细胞中没有可见的细胞死亡(图41B2)。研究结果指示，由FLNA细胞内抗体处理引起的细胞死亡是癌细胞特异性的。
胶质母细胞瘤
将U87MG(胶质母细胞瘤细胞系)细胞使用lipofectamine 3000在12-孔平板中用1μg DNA(LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP或LV-FLNA_2-GFP)转染，或假转染。在转染后72小时收获细胞，并用钙黄绿素-深红色或EthD-1染色，分别用于活细胞和死细胞分析。通过流式细胞计量术评估细胞生存力。
细胞生存力测定的结果提供在图42-44中。在图42中，左列显示了在LV-GFP(上)、LV-FLNA_1-GFP(中)和LV-FLNA_2-GFP(下)转染的细胞中的活细胞计数。中间列显示了在LV-GFP(上)、LV-FLNA_1-GFP(中)和LV-FLNA_2-GFP(下)转染的细胞中的死细胞计数。右列显示了在LV-GFP(上)、LV-FLNA_1-GFP(中)和LV-FLNA_2-GFP(下)转染的细胞中的活/死细胞计数(第1列和第2列的合并)。研究表明，用FLNA细胞内抗体转染U87MG细胞后，活细胞转变为死细胞。
图43A和43B显示了在转染后72小时的活细胞分析。图43A是LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP转染的细胞的活细胞分析染色的直方图重叠。图43B显示了CDR阳性(活)细胞的总数。LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP都显著减少了活细胞的数量(p<0.0001)。
图44A和44B显示了在转染后72小时GFP-门控的细胞的死细胞分析。图44A是LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP转染的细胞的死细胞分析染色的直方图重叠。图44B显示了EthD-1阳性(死)细胞的总数。相对于LV对照(分别p<0.005和p<0.0001)，LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP都显著增加了死细胞的数量。
进行了一项研究以对比FLNA细胞内抗体处理在胶质母细胞瘤细胞系和非癌症HBEC-5i细胞之间的效果。结果提供在图45中。在转染后72小时，FLNA细胞内抗体处理导致LN229细胞的细胞死亡(胶质母细胞瘤细胞系；图45A)，但在HBEC-5i细胞中没有(非癌细胞系；图45B)。研究结果表明，由FLNA细胞内抗体处理引起的细胞死亡是癌细胞特异性的。
为了显微术研究，使用lipofectamine 3000将2.5μg DNA转染到6孔板的每个孔中的U87MG细胞中，并在转染后24和72小时使用共焦显微镜对细胞成像。图46和47提供了结果。图46A1、B1和C1分别显示了在转染后24小时LV-GFP转染的、LV-FLNA_1-GFP转染的和LV-FLNA_2-GFP转染的U87MG细胞的荧光图像。图46A2、B2和C2分别显示了在转染后24小时LV-GFP转染的、LV-FLNA_1-GFP转染的和LV-FLNA_2-GFP转染的U87MG细胞的明视野图像。图47A和47B显示了在转染后72小时LV-GFP转染的U87MG细胞的荧光图像和明视野图像。图47C和47D显示了在转染后72小时LV-FLNA_1-GFP转染的U87MG细胞的荧光图像和明视野图像，且图47E和47F显示了在转染后72小时LV-FLNA_2-GFP转染的U87MG细胞的荧光图像和明视野图像。类似地，图48A-F显示了在72小时LV-GFP(图48A、48B)、LV-FLNA_1-GFP转染的(图48C、48D)和LV-FLNA_2-GFP转染的(图48E、48F)细胞的明视野图像。图像表明，在72小时，LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP处理导致U87MG胶质母细胞瘤细胞的细胞粘附丧失和死亡。
通过免疫细胞化学(ICC)分析了用FLNA细胞内抗体处理的U87MG细胞中的FLNA。在转染后72小时，将细胞接种在腔室载玻片上，并在4％甲醛中固定。然后使用0.5％的TritonX-100在PBS中的溶液透化细胞。在室温使用5％的BSA在PBS中的溶液封闭1小时。在4℃进行抗-细丝蛋白A第一抗体温育过夜；在室温进行第二抗体温育1小时。也用核DAPI染料将细胞染色。结果提供在图49中。在转染后72小时，用FLNA细胞内抗体处理的U87MG细胞显示出FLNA蛋白的破坏。
图50显示了关于细胞内抗体上的His标签和关于GFP，通过免疫细胞化学(ICC)染色对用LV-FLNA_2细胞内抗体和GFP转染的U87MG细胞中的FLNA scFv的分析。图50的顶行显示了抗-His(第一图)、抗-GFP(第二图)、DAPI染色(第三图)，以及显示FLNA细胞内抗体和GFP的共表达的合并图像。图50的底行显示了LV-GFP对照。数据显示，FLNA细胞内抗体与GFP共表达(见白色箭头)。
前列腺癌
还对用FLNA细胞内抗体处理的DU145(前列腺癌细胞系)细胞进行了细胞生存力测定。将DU145细胞使用lipofectamine 3000用0.5μg DNA(LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP或LV-FLNA_2-GFP)转染，或假转染。在转染后72小时收获细胞，并用钙黄绿素-深红色或EthD-1染色，分别用于活细胞和死细胞分析。通过流式细胞计量术评估细胞生存力。
细胞生存力测定的结果提供在图51-55中。图51A-E显示了转染后72小时在转染的细胞中的GFP表达。图51A显示在假转染的细胞中没有GFP表达。图51B、C和D显示了在LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP转染的细胞中的GFP表达。图51E是图51A-D中的直方图的重叠。
图52A-C显示了在转染后72小时GFP-门控的DU145细胞的活细胞分析。在用LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP或LV-FLNA_2-GFP转染后72小时在GFP阳性细胞中的CDR阳性染色分别显示在图52A、52B和52C中。图53A是来自图52A-C的活细胞分析的直方图重叠。图53B显示了GFP阳性细胞群体中CDR阳性(活)细胞的总数。相对于LV-GFP转染，LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP都显著减少了活DU145细胞的数量(分别p<0.0005和p<0.0001)。
图54A-C显示了在转染后72小时GFP-门控的DU145细胞的死细胞分析。在用LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP或LV-FLNA_2-GFP转染后72小时的EthD-1阳性染色分别显示在图54A、54B和54C中。图55A是来自图54A-C的死细胞分析的直方图重叠。图55B显示了GFP阳性细胞群体中EthD-1阳性(死)细胞的总数。相对于LV对照，LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP都显著增加了死细胞的数量(分别p<0.05和p<0.0001)。
乳腺癌
将MDA-MB-231(乳腺癌细胞系)细胞使用lipofectamine 3000用2.5μg DNA(LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP或LV-FLNA_2-GFP)转染，或假转染。在转染后72小时收获细胞，用于细胞增殖和显微术研究。对于细胞增殖测定，在转染后72小时，收获细胞并与EdU试剂一起温育两小时。未与EdU试剂接触的细胞用作阴性对照。通过流式细胞计量术评估增殖。
在MDA-MB-231细胞转染后72小时的GFP表达提供在图56中。图56A是假转染的。图56B显示了LV-GFP对照转染的MDA-MB-231细胞的增殖。图56C和56D分别显示了LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP转染的MDA-MB-231细胞的增殖。图56E是图56A-D中数据的直方图重叠。图57显示了在转染后72小时通过EdU染色测量的GFP门控的细胞中的增殖。图57A是未染色的对照。图57B、57C和57D分别显示了用LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP或LV-FLNA_2-GFP转染后72小时在GFP+细胞中的EdU染色。图57E是增殖研究的图形表示。相对于LV-GFP，LV-FLNA_1和LV-FLNA_2-GFP都显著降低了MDA-MB-231细胞的增殖(分别p<0.001和p<0.0001)。
为了显微术研究，在转染后24小时使用共焦显微镜对细胞成像。图58提供了结果。对于所有三组，GFP在MDA-MB-231细胞中在24小时表达。
通过蛋白质印迹评估了MDA-MB-231细胞的细胞内抗体处理后的FLNA蛋白水平。在转染后48小时裂解细胞，并将每个样品的35μg蛋白进行SDS-PAGE。将第一抗-细丝蛋白A抗体以1:500稀释，并将抗-GAPDH抗体以1:3000稀释。用于细丝蛋白-A检测的第二抗体是以1:1000稀释的HRP-缀合的驴抗-小鼠。GAPDH的第二抗体是以1:1000稀释的HRP-缀合的山羊抗-大鼠。研究的结果提供在图59中。用FLNA细胞内抗体处理导致MDA-MB-231细胞中降低的FLNA蛋白水平。
实施例10.毒性研究
将正常人星形胶质细胞细胞(N7805100)接种在24孔板中并用LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP或LV-FLNA_2-GFP转染，或假转染。也包括了裂解对照组和阴性对照组。在转染后24小时，收获细胞用于流式细胞计量术以分析转染效率。在转染后72小时，将来自不同的孔的细胞用于进行LDH细胞毒性测定。
研究的结果提供在图60-62中。图60A-E证实了在转染后24小时在正常人星形胶质细胞细胞中的GFP表达。图61A-C提供了在转染后24小时正常人星形胶质细胞细胞的显微镜分析。在所有三个组中观察到了GFP表达：LV-GFP、LV-FLNA_1-GFP和LV-FLNA_2-GFP。图62提供了LDH细胞毒性测定的结果。使用市售的试剂盒方案(ThermoFisher,88954)计算细胞毒性百分比。在正常细胞中，细胞毒性百分比是低的，且各组之间的细胞毒性百分比没有差异。
实施例11.在癌细胞上的B411表面染色
进行了在几种不同细胞类型上的B411表面染色。将细胞以50–100万个细胞/孔的浓度铺板，并温育过夜。然后将细胞从孔中取出，洗涤，并在冰上重新悬浮于具有2μg第一抗体的流式细胞计量术培养基中1小时。洗涤细胞，并与第二抗体(5μg/ml)一起在冰上温育30分钟。再次洗涤细胞并通过流式细胞计量术分析。
图63提供了SKNAS(人神经母细胞瘤)细胞系的结果。左图是直方图，显示了B411的阳性染色和同种型对照的阴性染色、无第一抗体对照和未染色的细胞。右侧的两个图显示了每组中阳性细胞的百分比(顶部)和每组中阳性细胞的总细胞计数(底部)。
图64提供了SKBR3(乳腺癌)细胞系的结果。左图是直方图，显示了B411的一些阳性染色以及无第一抗体对照和未染色的细胞的阴性染色。右侧的两个图显示了每组中阳性细胞的百分比(顶部)和每组中阳性细胞的总细胞计数(底部)。
图65提供了HeLa细胞(卵巢癌)的结果。左图是直方图，显示了B411的阳性染色，以及无第一抗体对照和未染色的细胞的阴性染色。右侧的两个图显示了每组中阳性细胞的百分比(顶部)和每组中阳性细胞的总细胞计数(底部)。
图66提供了SKOV3细胞系(卵巢癌)的结果。左图是直方图，显示了B411的阳性染色，以及无第一抗体对照和未染色的细胞的阴性染色。右侧的两个图显示了每组中阳性细胞的百分比(顶部)和每组中阳性细胞的总细胞计数(底部)。
研究结果表明，B411可以检测不同的癌细胞系中的表面细丝蛋白A。对于SKBR3细胞系，B411呈阳性染色，但与测试的其它细胞系相比更弱。在SKNAS、SKOV3和HeLa细胞系中观察到B411的高阳性染色。
实施例12.胞吞作用
进行实验以确定抗体B411是否被细胞内吞。铺板250,000个细胞/孔，并在37℃、5％CO2下温育过夜。根据生产商的方案，使用Zenon pHrodo试剂盒(人类绿色)在暗处在室温标记12μg/mL抗体5分钟。然后将铺板的细胞与标记的抗体一起在37℃、5％CO2下温育24小时。然后通过手工刮提取出细胞，并洗涤，然后通过流式细胞计量术分析。
图67-68提供了结果。胞吞作用阳性的SKBR3细胞(乳腺癌)和HEK细胞(非癌症)的百分比如图67所示。图68显示了胞吞作用阳性的细胞的总数。在与抗体一起温育的SKBR3细胞(乳腺癌)中检测到B411的胞吞作用(图67，左图)。与HEK细胞相比，更多的SKBR3细胞是B411阳性的(图68)，从而提示，与HEK(非癌症)细胞相比，SKBR3细胞具有更高程度的B411结合的细丝蛋白A的胞吞作用。研究结果表明，本文提供的细丝蛋白A抗体的胞吞作用可用于递送靶向治疗剂以进行治疗。
通过引用并入
本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请通过引用整体并入用于所有目的。
但是，本文中引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及没有且不应视作承认或以任何形式暗示：它们在世界上的任何国家构成有效的现有技术或形成普通一般知识的一部分。

Claims (88)

1.一种结合细丝蛋白-A抗原的抗体，所述抗体包含：
含有三个互补性决定区(CDR)的轻链可变结构域，所述互补性决定区包含CDR1、CDR2和CDR3，其中轻链CDR1由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成；轻链CDR2由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成，并且轻链CDR3由SEQ ID NO: 15的氨基酸序列组成；和
含有三个CDR的重链可变结构域，所述CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中重链CDR1由SEQID NO: 16的氨基酸序列组成，重链CDR2由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，并且重链CDR3由SEQ ID NO: 21的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述轻链可变结构域由SEQ ID NO:2组成，并且所述重链可变结构域由SEQ ID NO:7组成。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体，其中轻链可变结构域和重链可变结构域处于轻-重取向。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的抗体，其中轻链可变结构域和重链可变结构域处于重-轻取向。
5.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体进一步包含：
包含SEQ ID NO:3的轻链恒定结构域；和
包含SEQ ID NO:11的重链恒定结构域。
6.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是人嵌合抗体。
7.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是scFv。
8.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是细胞内抗体。
9.根据权利要求1所述的抗体，其中所述细丝蛋白-A抗原是由FLNA基因编码的基因产物。
10.根据权利要求1所述的抗体，其中所述细丝蛋白-A抗原是乳腺癌细胞表达的细丝蛋白-A抗原。
11.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体能够优先结合乳腺癌细胞表达的细丝蛋白-A抗原，其中所述优先结合是相对于非乳腺癌细胞表达的细丝蛋白-A抗原。
12.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体能够以10−7 M至10−11 M的特异性亲和力结合乳腺癌细胞表达的细丝蛋白-A抗原。
13.根据权利要求1所述的抗体，其中所述细丝蛋白-A抗原是乳腺癌细胞膜有关的细丝蛋白-A抗原。
14.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体能够优先结合乳腺癌细胞膜有关的细丝蛋白-A抗原，其中所述优先结合是相对于非乳腺癌细胞膜有关的细丝蛋白-A抗原。
15.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体能够以10−7 M至10−11 M的特异性亲和力结合乳腺癌细胞膜有关的细丝蛋白-A抗原。
16.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体固定化在固相上。
17.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体被可检测地标记。
18.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体缀合至放射性核素。
19.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体缀合至化学治疗剂。
20.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体缀合至蛋白。
21.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合细胞内的细丝蛋白-A抗原、细胞膜相关的细丝蛋白-A抗原和/或可溶性细丝蛋白-A抗原。
22.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体已经为细胞内定位进行了修饰。
23.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是Fab抗体。
24.一种分离的多核苷酸DNA，其编码根据权利要求1-23中任一项所述的抗体。
25.一种分离的RNA，其编码根据权利要求1-23中任一项所述的抗体。
26.一种分离的载体，其包含根据权利要求24所述的多核苷酸。
27.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求26所述的载体。
28.一种通过包括如下步骤的方法生产的抗体：培养根据权利要求27所述的宿主细胞，表达所述抗体，以及回收由所述宿主细胞表达的抗体。
29.一种药物组合物，其包含：
根据权利要求1-23中任一项所述的抗体；和
药学上可接受的载体。
30.一种用于诊断癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：
根据权利要求1-23中任一项所述的抗体作为第一抗体；和
结合所述第一抗体的第二抗体，其中所述第二抗体缀合至可检测标记物。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述癌症是乳腺癌。
32.根据权利要求1-23中任一项所述的抗体在制备用于诊断患者癌症的试剂中的用途，所述用途包括使从患者得到的生物样品与所述抗体接触；和检测所述抗体是否结合样品中的细丝蛋白-A抗原，其中所述抗体和细丝蛋白-A抗原之间的阳性结合相互作用指示癌症。
33.根据权利要求32所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌。
34.根据权利要求1-23中任一项所述的抗体在制备用于治疗患者癌症的试剂中的用途，所述用途包括：
给有此需要的患者施用有效量的所述抗体。
35.根据权利要求34所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌。
36.根据权利要求34所述的用途，其中所述抗体诱导癌细胞的抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)。
37.根据权利要求34所述的用途，其中所述抗体被癌细胞内吞。
38.根据权利要求34所述的用途，其中所述抗体连接或缀合至治疗剂。
39.细丝蛋白-A抗体在制备用于预防或减少表达细丝蛋白-A抗原的肿瘤细胞的生长的试剂中的用途，所述用途包括：
给有此需要的人患者施用有效量的抗体，所述抗体包含：
由SEQ ID NO: 2组成的轻链可变结构域；
包含SEQ ID NO: 3的轻链恒定结构域；
由SEQ ID NO: 7组成的重链可变结构域；和
包含SEQ ID NO: 11的重链恒定结构域。
40.根据权利要求39所述的用途，其中所述肿瘤是乳腺肿瘤。
41.根据权利要求39所述的用途，其中所述抗体优先结合分泌的可溶性细丝蛋白-A抗原。
42.根据权利要求39所述的用途，其中所述抗体优先结合膜有关的细丝蛋白-A抗原。
43.根据权利要求39所述的用途，其中所述抗体优先结合细胞内的细丝蛋白-A抗原。
44.根据权利要求39所述的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。
45.根据权利要求39所述的用途，其中所述抗体是人嵌合抗体。
46.根据权利要求45所述的用途，其中所述抗体是人源化抗体。
47.根据权利要求45或46所述的用途，其中与针对细丝蛋白-A的鼠抗体相比，所述抗体表现出降低的免疫原性，并且不会导致来自患者的阴性免疫应答。
48.根据权利要求39所述的用途，其中所述抗体是细胞内抗体。
49.一种结合细丝蛋白-A抗原的细胞内抗体，其中所述细胞内抗体包含：
含有三个互补性决定区(CDR)的轻链可变结构域，所述互补性决定区包含CDR1、CDR2和CDR3，其中轻链CDR1由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成；轻链CDR2由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成，并且轻链CDR3由SEQ ID NO: 15的氨基酸序列组成；和
含有三个CDR的重链可变结构域，所述CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中重链CDR1由SEQID NO: 16的氨基酸序列组成，重链CDR2由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，并且重链CDR3由SEQ ID NO: 21的氨基酸序列组成。
50.根据权利要求49所述的细胞内抗体，其中所述轻链可变结构域由SEQ ID NO:2组成，并且所述重链可变结构域由SEQ ID NO:7组成。
51.根据权利要求49所述的细胞内抗体，其中所述细丝蛋白-A抗原是由FLNA基因编码的基因产物。
52.根据权利要求49所述的细胞内抗体，其中所述细胞内抗体能够以10−7 M至10−11 M的特异性亲和力结合细丝蛋白-A。
53.根据权利要求49所述的细胞内抗体，其中所述细胞内抗体是scFv。
54.根据权利要求49所述的细胞内抗体，其中所述细胞内抗体被可检测地标记。
55.根据权利要求49所述的细胞内抗体，其中所述细胞内抗体缀合至放射性核素。
56.根据权利要求49所述的细胞内抗体，其中所述细胞内抗体缀合至化学治疗剂。
57.根据权利要求49所述的细胞内抗体，其中所述细胞内抗体缀合至蛋白。
58.根据权利要求49所述的细胞内抗体，其中所述细胞内抗体连接或缀合至细胞膜穿透肽或蛋白或其它化学部分。
59.一种分离的RNA，其编码根据权利要求49-58中任一项所述的细胞内抗体。
60.一种分离的多核苷酸DNA，其编码根据权利要求49-58中任一项所述的细胞内抗体。
61.一种分离的载体，其包含根据权利要求59所述的RNA或根据权利要求60所述的多核苷酸。
62.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求61所述的载体。
63.一种融合蛋白，其包含根据权利要求49-58中任一项所述的细胞内抗体和用于跨细胞膜转移细胞内抗体的蛋白。
64.一种融合蛋白，其包含根据权利要求49-58中任一项所述的细胞内抗体和用于将细胞内抗体靶向至亚细胞结构的蛋白。
65.一种药物组合物，其包含：
根据权利要求49-58中任一项所述的细胞内抗体；和
药学上可接受的载体。
66.一种药物组合物，其包含：
递送系统，其包含编码根据权利要求49-58中任一项所述的细胞内抗体的DNA或RNA；和
药学上可接受的载体。
67.根据权利要求66所述的药物组合物，其中所述递送系统包含质粒、RNA、病毒载体或非病毒递送系统。
68.根据权利要求67所述的药物组合物，其中所述质粒是包含真核启动子的细菌质粒。
69.根据权利要求67所述的药物组合物，其中所述递送系统包含RNA。
70.根据权利要求67所述的药物组合物，其中所述递送系统包含所述病毒载体，并且其中所述病毒载体是慢病毒或逆转录病毒载体。
71.根据权利要求67所述的药物组合物，其中所述递送系统包含所述非病毒递送系统，并且其中所述非病毒递送系统包含阳离子脂质或聚合物。
72.根据权利要求67所述的药物组合物，其中所述递送系统包含所述非病毒递送系统，并且其中所述非病毒递送系统包含转座子。
73.根据权利要求49-58中任一项所述的细胞内抗体或表达根据权利要求49-58中任一项所述的细胞内抗体的核酸在制备用于治疗患者癌症的药物中的用途，所述用途包括给有此需要的患者施用所述细胞内抗体。
74.根据权利要求73所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌。
75.一种双特异性或多特异性抗体，其包含根据权利要求1-23中任一项所述的抗体和结合在免疫细胞上表达的抗原的第二抗体。
76.根据权利要求75所述的双特异性或多特异性抗体，其中所述免疫细胞是T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
77.根据权利要求75所述的双特异性或多特异性抗体，其中所述抗原是T细胞抗原。
78.根据权利要求77所述的双特异性或多特异性抗体，其中所述T细胞抗原选自CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90。
79.一种双特异性抗体，其包含根据权利要求1-23中任一项所述的抗体和结合CD3的第二抗体。
80.一种嵌合的抗原受体(CAR)多肽，其包含细丝蛋白-A抗原结合结构域，其中所述细丝蛋白-A抗原结合结构域包含
含有三个互补性决定区(CDR)的轻链可变结构域，所述互补性决定区包含CDR1、CDR2和CDR3，其中轻链CDR1由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成；轻链CDR2由SEQ ID NO: 14的氨基酸序列组成，并且轻链CDR3由SEQ ID NO: 15的氨基酸序列组成；和
含有三个CDR的重链可变结构域，所述CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中重链CDR1由SEQID NO: 16的氨基酸序列组成，重链CDR2由SEQ ID NO: 17的氨基酸序列组成，并且重链CDR3由SEQ ID NO: 21的氨基酸序列组成。
81.根据权利要求80所述的CAR多肽，其中所述细丝蛋白-A抗原结合结构域包含由SEQID NO:2组成的轻链可变结构域和由SEQ ID NO:7组成的重链可变结构域。
82.根据权利要求80所述的CAR多肽，其进一步包含细胞内信号传递结构域和跨膜结构域。
83.根据权利要求82所述的CAR多肽，其中所述细胞内信号传递结构域包含选自CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、B7-H3和它们的任意组合的共刺激结构域。
84.根据权利要求82所述的CAR多肽，其中所述细胞内信号传递结构域是T细胞受体(TCR)ζ链信号传递结构域。
85.一种细胞，其表达根据权利要求80-84中任一项所述的CAR。
86.根据权利要求85所述的细胞，其中所述细胞选自T细胞、NK细胞、NK-T细胞、B细胞、巨噬细胞或干细胞。
87.根据权利要求86所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
88.根据权利要求85所述的细胞在制备用于在有此需要的受试者中治疗癌症的药物中的用途，所述用途包括给所述受试者施用所述细胞。
CN201980080604.2A 2018-10-09 2019-10-09 针对细丝蛋白-a的抗体及其治疗用途 Active CN113164633B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862743169P 2018-10-09 2018-10-09
US62/743,169 2018-10-09
PCT/US2019/055401 WO2020076954A1 (en) 2018-10-09 2019-10-09 Antibodies directed to filamin-a and therapeutic uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113164633A CN113164633A (zh) 2021-07-23
CN113164633B true CN113164633B (zh) 2023-11-21

Family

ID=70164718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980080604.2A Active CN113164633B (zh) 2018-10-09 2019-10-09 针对细丝蛋白-a的抗体及其治疗用途

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220025025A1 (zh)
EP (1) EP3863687A4 (zh)
JP (2) JP7442769B2 (zh)
KR (1) KR20210075132A (zh)
CN (1) CN113164633B (zh)
AU (1) AU2019358060A1 (zh)
CA (1) CA3115077A1 (zh)
IL (1) IL281932A (zh)
WO (1) WO2020076954A1 (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102027014A (zh) * 2008-04-11 2011-04-20 皮埃尔法布雷医药公司 用于治疗癌症的新抗体
CN107428821A (zh) * 2014-12-08 2017-12-01 博格有限责任公司 包括细丝蛋白a的标志物在诊断和治疗前列腺癌中的用途
WO2018000324A1 (zh) * 2016-06-30 2018-01-04 张军方 一种将抗体导入细胞内的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL158293A0 (en) * 2001-04-10 2004-05-12 Agensys Inc Nucleic acid and corresponding protein entitled 158p3d2 and pharmaceutical compositions containing the same
JP4448282B2 (ja) * 2001-04-30 2010-04-07 シティ・オブ・ホープ ヒト癌を処置するのに有用なキメライムノレセプター
US20030157514A1 (en) * 2001-09-04 2003-08-21 Finger Joshua N. Polynucleotide encoding a novel pleckstrin homology domain and proline rich domain containing adapter protein, PMN29
US7553944B2 (en) * 2004-07-21 2009-06-30 The University Of Hong Kong Human virus causing respiratory tract infection and uses thereof
AU2008214476A1 (en) * 2007-02-06 2008-08-14 Ribovax Biotechnologies S.A. Antibodies specific for varicella zoster virus
CA2705509A1 (en) * 2007-11-14 2009-05-22 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-gpr49 antibody
US9891232B2 (en) * 2010-11-09 2018-02-13 Sarcotein Diagnostics, Llc BIN1 expression as a marker of skeletal muscle mass and neurological conditions
FR2971250A1 (fr) * 2011-02-07 2012-08-10 Univ Nantes Anticorps anti-gb3 utiles dans le traitement des maladies associees a l'angiogenese
GB201223097D0 (en) * 2012-12-20 2013-02-06 Max Planck Gesellschaft Stable transformation of a population and a method of biocontainment using haploinsufficiency and underdominance principles
EP3334446A4 (en) * 2015-06-17 2019-06-19 International Aids Vaccine Initiative GENETICALLY MODIFIED EXTERNAL DOMAIN (EOD) OF HIV GP120, MUTANTS AND THEIR USE
EP3494141A4 (en) * 2016-08-03 2020-04-08 Bio-Techne Corporation IDENTIFICATION OF VSIG3 / VISTA AS A NEW IMMUNE CONTROL POINT AND ITS USE IN IMMUNOTHERAPY
WO2018085431A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 Berg Llc Filamin a binding proteins and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102027014A (zh) * 2008-04-11 2011-04-20 皮埃尔法布雷医药公司 用于治疗癌症的新抗体
CN107428821A (zh) * 2014-12-08 2017-12-01 博格有限责任公司 包括细丝蛋白a的标志物在诊断和治疗前列腺癌中的用途
WO2018000324A1 (zh) * 2016-06-30 2018-01-04 张军方 一种将抗体导入细胞内的方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Engineered CAR T Cells Targeting the Cancer-Associated Tn-Glycoform of the Membrane Mucin MUC1 Control Adenocarcinoma";Avery D. Posey Jr et al.;《Immunity》;20160621;第44卷(第6期);第1444-1454页 *
"Novel anti-filamin-A antibody detects a secreted variant of filamin-A in plasma from patients with breast carcinoma and high-grade astrocytoma";Ozge Alper et al.;《Cancer Sci》;20090930;第100卷(第9期);第1748-1756页 *
"肝癌患者外周血及癌组织细丝蛋白A表达临床意义的研究";刘海潮 等;《中华肿瘤防治杂志》;20130731;第20卷(第13期);第1003-1006页 *
A Monoclonal Antibody SZ-117 That Recognizes Filamin A Derived from Tumor Cells;Zibin Bu et al.;《HYBRIDOMA》;第31卷(第3期);第214-218页 *
antibody light chain variable region, partial [Mus musculus], GenBank:CAA62406.1;Geiser,M et al.;《GenPept》;第1-2页 *
Avery D. Posey Jr et al.."Engineered CAR T Cells Targeting the Cancer-Associated Tn-Glycoform of the Membrane Mucin MUC1 Control Adenocarcinoma".《Immunity》.2016,第44卷(第6期),第1444-1454页. *
Ozge Alper et al.."Novel anti-filamin-A antibody detects a secreted variant of filamin-A in plasma from patients with breast carcinoma and high-grade astrocytoma".《Cancer Sci》.2009,第100卷(第9期),第1748-1756页. *
刘海潮 等."肝癌患者外周血及癌组织细丝蛋白A表达临床意义的研究".《中华肿瘤防治杂志》.2013,第20卷(第13期),第1003-1006页. *
肝癌患者外周血及癌组织细丝蛋白Ａ表达临床意义的研究;刘海潮 等;《中华肿瘤防治杂志》;第20卷(第13期);第1003-1006页 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210075132A (ko) 2021-06-22
JP2022512644A (ja) 2022-02-07
EP3863687A4 (en) 2022-08-31
CA3115077A1 (en) 2020-04-16
US20220025025A1 (en) 2022-01-27
JP2024003141A (ja) 2024-01-11
IL281932A (en) 2021-05-31
WO2020076954A1 (en) 2020-04-16
EP3863687A1 (en) 2021-08-18
JP7442769B2 (ja) 2024-03-05
CN113164633A (zh) 2021-07-23
AU2019358060A1 (en) 2021-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7202346B2 (en) Antibodies to non-shed Muc1 and Muc16, and uses thereof
US20070207510A1 (en) Methods and compounds for lymphoma cell detection and isolation
US20140248283A1 (en) Monoclonal antibodies against her2 antigens, and uses therefor
KR102125032B1 (ko) 인간 dlk1에 대한 항체 및 이의 용도
CA2471206A1 (en) Individualized anti-cancer antibodies
AU2008258503A1 (en) Compositions and methods for treating pancreatic tumors
KR20230060509A (ko) 넥틴-4 항체 및 이의 용도
RU2768002C1 (ru) Антитело, специфически связывающееся с ecl-2 клаудина 3, его фрагмент и его применение
US11667700B2 (en) Anti-PCNA monoclonal antibodies and use thereof
CN113164633B (zh) 针对细丝蛋白-a的抗体及其治疗用途
US8540991B2 (en) Monoclonal antibodies against PCBP-1 antigens, and uses therefor
RU2816856C2 (ru) Антитела, нацеленные на epn1
WO2010080935A1 (en) Monoclonal antibodies against pcbp-1 antigens, and uses therefor
WO2017147247A1 (en) Anti-sas1b antibodies and methods of use
WO2023136779A2 (en) Antibody sequences of three antibody candidates targeting human lymphocyte antigen 6 family member k (ly6k)
CN116507641A (zh) 结合素-4抗体及其用途
EP1757305A2 (en) Individualized anti-cancer antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Maryland, USA

Applicant after: Abix Biosciences

Address before: Maryland, USA

Applicant before: Ebx bioscience Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant