PL210174B1 - Sposób indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych, przeciwciało anty-DR5 do zastosowania w tym sposobie, kompozycja farmaceutyczna i komórka zwierzęca wykazująca ekspresję kwasu nukleinowego kodującego to przeciwciało - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych, obejmującego skontaktowanie komórek z przeciwciałem anty-DR5 o określonej sekwencji zmiennego regionu ciężkiego łańcucha i określonej sekwencji zmiennego regionu lekkiego łańcucha oraz z określonym środkiem indukującym apoptozę. Wynalazek dotyczy również przeciwciała anty-DR5 do zastosowania do indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych przy podawaniu wspólnie ze środkiem indukującym apoptozę. Ponadto, wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej o działaniu niszczącym nowotwory, zawierającej terapeutycznie skuteczną ilość wspomnianego przeciwciała anty-DR5 oraz środka indukującego apoptozę. W kolejnych aspektach wynalazek dotyczy także wspomnianego przeciwciała anty-DR5, komórki zwierzęcej wykazującej ekspresję kwasu nukleinowego kodującego to przeciwciało oraz sposobu indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych, obejmującego skontaktowanie komórek ze wspomnianym przeciwciałem anty-DR5.

Apoptoza to programowana śmierć komórek o charakterze zachowawczym, istotna dla rozwoju i homeostazy tkankowej wszystkich organizmów wielokomórkowych. Zmiany w przebiegu apoptozy zapobiegające lub opóźniające normalny cykl metaboliczny komórek mogą być istotne dla patogenezy chorób, tak jak wszelkie odchylenia od normy w regulacji cyklu komórkowego. Podobnie jak podział komórki, który kontrolowany jest przez złożone oddziaływania między białkami regulującymi cykl komórkowy, apoptoza w normalnych warunkach regulowana jest przez oddziaływania między produktami genów, które zapobiegają lub indukują śmierć komórki.

Ligand indukujący apoptozę spokrewniony z czynnikiem martwicy nowotworu TNF (TRAIL, także określany nazwą Apo2L) należy do rodziny cytokin TNF. Po związaniu się z DR4 lub DR5, należącymi do nadrodziny receptorów TNF, TRAIL indukuje śmierć komórek w procesie apoptozy, zob. na przykład Pan i in., Science 277:815-8 (1997); Sheridan, i in., Science 277:818-21 3 (1997); Walczak i in., EMBO J. 16:5386-97 4 (1997). W badaniach in vitro pokazano, ż e TRAIL powoduje ś mier ć komórek nowotworowych, ale jest względnie nieszkodliwy dla normalnych komórek.

Celem wynalazku było opracowanie nowych rozwiązań pozwalających na opracowanie nowych, dodatkowych metod leczenia raka.

Przedmiotem wynalazku jest sposób indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych, obejmujący skontaktowanie komórek z: (a) przeciwciałem anty-DR5 oraz (b) środkiem indukującym apoptozę, wybranym z grupy złożonej z:

(i) środka zapobiegającego lub zmniejszającego ekspresję BCL-2;

(ii) inhibitora proteasomów;

(iii) inhibitora białka hamującego apoptozę (lAP);

(iv) antagonisty PAK1;

(v) antagonisty polipeptydu wybranego z grupy złożonej z nsurf i JIK; oraz (vi) siRNA, przy czym przeciwciało anty-DR5 zawiera zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający sekwencję nr 6 oraz zmienny region lekkiego łańcucha o sekwencji nr 8.

W jednym z korzystnych wariantów sposobu według wynalazku przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane. W innym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku przeciwciałem jest przeciwciało jednołańcuchowe. W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku środek zapobiegający lub zmniejszający ekspresję BCL-2 zapobiega aktywacji NFkB. W szczególnie korzystnym przypadku środek zapobiegający aktywacji NFkB zapobiega degradacji IkB.

W kolejnym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku inhibitor proteasomów jest wybrany z grupy złożonej z PS-341, MG-262 i MG-132. W następnym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku inhibitorem białka hamującego apoptozę (lAP) jest SMAC lub mimetyk SMAC. W dalszym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku komórkami nowotworowymi są komórki raka okrężnicy lub komórki raka trzustki.

Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało anty-DR5 do zastosowania do indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych przy podawaniu wspólnie ze środkiem indukującym apoptozę, wybranym z grupy złożonej z:

(i) środka zapobiegającego lub zmniejszającego ekspresję BCL-2 lub UbcH10;

(ii) inhibitora proteasomów;

(iii) inhibitora białka hamującego apoptozę (lAP);

(iv) antagonisty PAK1;

PL 210 174 B1 (v) antagonisty polipeptydu wybranego z grupy złożonej z UbcH10, nsurf i JIK; oraz (vi) siRNA, przy czym przeciwciało anty-DR5 zawiera zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający sekwencję nr 6 oraz zmienny region lekkiego łańcucha o sekwencji nr 8.

W jednym z korzystnych wariantów przeciwcia ło anty-DR5 wedł ug wynalazku jest przeznaczone do podawania osobno w stosunku do środka indukującego apoptozę. W innym korzystnym wariancie przeciwciało anty-DR5 według wynalazku jest przeznaczone do podawania w postaci mieszaniny ze środkiem indukującym apoptozę. W jeszcze innym korzystnym wariancie przeciwciało anty-DR5 według wynalazku jest przeciwciałem humanizowanym. W kolejnym korzystnym wariancie przeciwciało anty-DR5 według wynalazku jest przeciwciałem jednołańcuchowym. W następnym korzystnym wariancie przeciwciało anty-DR5 według wynalazku jest przeznaczone do podawania wspólnie ze środkiem zapobiegającym lub zmniejszającym ekspresję BCL-2 lub UbcH10, przy czym ten środek zapobiega aktywacji NFkB. W szczególnie korzystnym przypadku środek zapobiegający aktywacji NFkB zapobiega degradacji IkB.

W kolejnym korzystnym wariancie przeciwciało anty-DR5 według wynalazku jest przeznaczone do podawania wspólnie z inhibitorem proteasomów wybranym z grupy złożonej z PS-341, MG-262 i MG-132. W następnym korzystnym wariancie przeciwciało anty-DR5 według wynalazku jest przeznaczone do podawania wspólnie z inhibitorem białka hamującego apoptozę (lAP) którym jest SMAC lub mimetyk SMAC. W innym korzystnym wariancie przeciwciało anty-DR5 według wynalazku jest przeznaczone do zastosowania do indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych, którymi są komórki raka okrężnicy lub komórki raka trzustki.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja farmaceutyczna o działaniu niszczącym nowotwory, zawierająca terapeutycznie skuteczną ilość (a) przeciwciała anty-DR5 oraz (b) środka indukującego apoptozę, wybranym z grupy złożonej z:

(i) środka zapobiegającego lub zmniejszającego ekspresję BCL-2 lub UbcH10;

(ii) inhibitora proteasomów;

(iii) inhibitora białka hamującego apoptozę (lAP);

(iv) antagonisty PAK1;

(v) antagonisty polipeptydu wybranego z grupy złożonej z UbcH10, nsurf i JIK; oraz (vi) siRNA, przy czym przeciwciało anty-DR5 zawiera zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający sekwencję nr 6 oraz zmienny region lekkiego łańcucha o sekwencji nr 8.

W jednym z korzystnych wariantów realizacji kompozycji według wynalazku przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane. W innym korzystnym wariancie realizacji kompozycji według wynalazku przeciwciałem jest przeciwciało jednołańcuchowe. W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji kompozycji według wynalazku środek zapobiegający lub zmniejszający ekspresję BCL-2 lub UbcH10 zapobiega aktywacji NFkB. W szczególnie korzystnym przypadku środek zapobiegający aktywacji NFkB zapobiega degradacji IkB.

W następnym korzystnym wariancie realizacji kompozycji według wynalazku inhibitorem białka hamującego apoptozę (lAP) jest SMAC lub mimetyk SMAC.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto przeciwciało anty-DR5 zawierające zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający sekwencję nr 6 oraz zmienny region lekkiego łańcucha o sekwencji nr 8. W jednym z korzystnych wariantów realizacji przeciwciało to jest przeciwciałem humanizowanym. W innym korzystnym wariancie realizacji przeciwciało to jest przeciwciałem jednołańcuchowym. W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji przeciwciało to jest przeciwciałem tetramerowym.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka zwierzęca wykazująca ekspresję kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało określone powyżej.

Ponadto, przedmiotem wynalazku jest sposób indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych, obejmujący skontaktowanie komórek z przeciwciałem anty-DR5 zawierającym zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający sekwencję nr 6 oraz zmienny region lekkiego łańcucha o sekwencji nr 8.

Do środków indukujących apoptozę należy polipeptyd należący do grupy obejmującej pleksynę B1 (PLXNB1), białko zawierające domenę SET 7 (SET7), kinazę białkową aktywowaną przez mitogen 5 (MAP3K5), kinazę podobną do STE20 (JIK), kinazę serynowo-treoninową oddziałującą z kinazą MAP 1 (MKNK1), przypuszczalne białko retikulum endoplazmatycznego (RFT1), 5-kinazę typu I, gamma (PIP5K1C), kinazę białkową aktywowaną przez kinazę MAP 2 (MAPKAPK2), kinazę kinazy MAP 5 (MAP2K5), cyklinozależną kinazę 6 (CDK6), receptor aktywiny A podobny do typu II, 1 (ACVRL1),

PL 210 174 B1 homolog onkogenu wirusa mięśniaka kociego Gardner-Rasheeda (v-fgr) (FGR), hipotetyczne białko FLJ21802 (FLJ21802), receptorową kinazę tyrozynową swoistą dla mięśni szkieletowych (MUSK), otwartą ramkę odczytu chromosomu 20, 88 (C20orf88), pączkowanie niehamowane przez bezoimidazole 1 (homolog drożdży) (BUB1), rybosomalną kinazę białkową S6, 90kD, polipeptyd 5 (RPS6KA5), homolog onkogenu spokrewnionego z wirusem mięsaka Yamaguchi v-yes-1 (LYN), kinazę białkową aktywowaną przez mitogen 7 (MAPK7), homolog onkogenu wirusa grasiczaka mysiego v-akt 1 (AKT1).

W niektórych wykonaniach środek indukujący apoptozę jest aktywatorem polipeptydu należącego do grupy obejmującej cząstkę rozpoznającą sygnał 72kD (SRP72), kaspazę-8, białko Bid, B-limfoidalną kinazę tyrozynową (BLK), produkt genu podobny do izoenzymu M2 kinazy pirogronianowej (LOC148283), kinazę syntazy glikogenu 3 alfa (GSK3A), hipotetyczne białko FLJ32312 (FLJ32312), kinazę białkową aktywowaną przez mitogen, 10 (MAPK10), TCF4: czynnik transkrypcyjny 4, homolog onkogenu wirusa mysiej białaczki Abelsona v-abl 2 (arg, gen spokrewniony z onkogenem Abelsona) (ABL2), homolog onkogenu wirusa ptasiego mięsaka UR2, v-ros, 1 (ROS1) i homolog onkogenu ptasich nacieków mielocytowych v-myc. W niektórych wykonaniach środek indukujący apoptozę jest antagonistą PAK1. W niektórych wykonaniach środek jest antagonistą polipeptydu należącego do grupy obejmującej UbcH10, nsurf, stk12, Ask1 i JIK. W niektórych wykonaniach środek jest cząsteczką siRNA.

Definicje

Termin „przeciwciało oznacza polipeptyd zawierający region strukturalny genu immunoglobuliny lub jego fragmenty, mający zdolność swoistego rozpoznania antygenu i związania się z nim. Poznane geny immunoglobuliny obejmują geny stałych regionów: kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon i oraz liczne geny kodujące zmienne regiony immunoglobuliny. Lekkie łańcuchy klasyfikowane są jako kappa lub lambda. Ciężkie łańcuchy klasyfikowane są jako gamma, mu, alfa, delta, lub epsilon i okreś lają klasy immunoglobulin, odpowiednio, IgG, IgM, IgA, IgD i IgE.

Immunoglobuliny pochodzenia naturalnego mają typową strukturę rdzenia, w której dwa identyczne lekkie łańcuchy (około 24 kD) i dwa identyczne ciężkie łańcuchy (około 55 lub 70 kD) tworzą tetrametr. N-końcowy odcinek każdego z łańcuchów znany jest pod nazwą zmiennego regionu (V) i należy go odróż nić od pozostałej bardziej zabezpieczonej części, zwanej regionem stałym (C). W obrę bie zmiennego regionu lekkiego ł a ń cucha znajduje się C-koń cowy odcinek zwany regionem J. W obrę bie zmiennego regionu ciężkiego ł ań cucha oprócz regionu J wystę puje region D. Zmienno ść sekwencji aminokwasowych w immunoglobulinach przeważnie dotyczy trzech oddzielnych lokalizacji w regionach V zwanych regionami hyperzmiennymi lub regionami CDR, decydują cymi o swoistoś ci wiązania, które bezpośrednio włączone są w proces wiązania antygenu. Zaczynając od N-końca regiony te oznaczone są odpowiednio jako CDR1, CDR2 i CDR3. Regiony CDR utrzymywane są w miejscu przez prawie nieulegające zmianom regiony strukturalne (FR). Zaczynając od N-końca regiony te oznaczone są odpowiednio jako FR1, FR2, FR3 i FR4. Położenia regionów CDR i FR i sposób numerowania zostały określone przez, na przykład. Kabat i in. (Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 wyd., U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)).

Przykładową jednostkę strukturalną immunoglobuliny (przeciwciała) stanowi tetrametr. Każdy tetrametr składa się z dwóch identycznych par łańcuchów polipetydowych, a każda para zawiera jeden lekki (około 25 kDa) i jeden ciężki łańcuch (około 50-70 kDa). N-koniec każdego łańcucha określa zmienny region składający się z około 100 do 110 lub więcej aminokwasów zasadniczo odpowiedzialnych za rozpoznanie antygenu. Termin zmienna część lekkiego łańcucha (VL) i zmienna część ciężkiego łańcucha (VH) odnosi się odpowiednio do lekkich i ciężkich łańcuchów.

Przeciwciała występują, na przykład, w postaci nienaruszonych przeciwciał lub w postaci kilku dobrze zdefiniowanych fragmentów wytworzonych poprzez trawienie z różnymi peptydazami. Zatem, na przykład pepsyna trawi przeciwciało poniżej wiązania dwusiarczkowego w regionie zawiasowym z wytworzeniem F(ab)'2, dimera Fab (fragment wiążący antygen) będą cego lekkim łańcuchem związanym z VH-CH1 wiązaniem dwusiarczkowym. F(ab)'2 można zredukować w łagodnych warunkach w celu przerwania wiązania dwusiarczkowego w regionie zawiasowym i w ten sposób przekształcić dimer F(ab)'2 w monomer Fab'. Monomer Fab' to głównie Fab z częścią regionu zawiasowego (zob. FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Paul ed., 3d ed. 1993). Podczas gdy różne fragmenty przeciwciał definiuje się w oparciu o proces trawienia przeciwciała nienaruszonego, dla osoby biegłej w dziedzinie oczywiste będzie, że fragmenty te mogą być syntezowane metodami chemicznymi albo przy użyciu techniki rekombinowanego DNA. Zatem używany tu termin „przeciwciało obejmuje także fragmenty przeciwPL 210 174 B1 ciała wytworzone poprzez modyfikację całego przeciwciała lub syntezowane z zastosowaniem techniki rekombinowanego DNA (na przykład pojedynczego łańcucha Fv), lub te zidentyfikowane za pomocą fagowych bibliotek ekspresyjnych (zob., np., McCafferty i in., Nature 348:552-554 (1990)).

W celu otrzymania monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwciał moż na zastosować dowolną metodę należącą do stanu techniki (zob., np., Kohler i Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor i in., Immunology Today 4:72 (1983); Cole i in., str. 77-96 w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Przeciwciała monoklonalne to przeciwciała otrzymane z pojedynczego klonu komórek. Metody wytwarzania jedno-łańcuchowych przeciwciał (zob. opis patentu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 946 778) można zaadaptować do syntezy przeciwciał polipeptydowych według wynalazku. Ponadto, do ekspresji humanizowanych przeciwciał można wykorzystać transgeniczną mysz lub inne organizmy, na przykład inne ssaki. Alternatywnie, w celu zidentyfikowania przeciwciał i heteromerycznych fragmentów Fab, które wiążą się swoiście do wybranych antygenów, można wykorzystać metodę ekspresji fagowej (zob., np., McCafferty i in., Nature 348:552-554 (1990); Marks i in., Biotechnology 10: 779-783 (1992)).

„Chimeryczne przeciwciało to cząsteczka przeciwciała, w której (a) region stały lub jego część jest zmodyfikowana, podstawiona lub wymieniona tak, że fragment wiążący antygen (region zmienny) jest związany z regionem stałym o różnej lub zmodyfikowanej klasie, funkcji efektorowej i/lub należącym do osobnika innego gatunku, lub całkowicie różnej molekuły, która nadaje chimerycznemu przeciwciału nowe właściwości (na przykład enzymu, toksyny, hormonu, czynnika wzrostu, leku, itd.); lub (b) zmienny region lub jego część jest zmodyfikowana, podstawiona lub wymieniona na zmienny region o innej lub zmodyfikowanej swoistości.

„Humanizowane przeciwciało to przeciwciało, które zachowuje reaktywność przeciwciała nie będącego przeciwciałem ludzkim, ale wywołuje słabsze reakcje immunologiczne u ludzi. Można to osiągnąć, na przykład, pozostawiając regiony CDR przeciwciał nie będących przeciwciałami ludzkimi i wymieniają c pozostał e części przeciwciał a na odpowiadają ce im odcinki przeciwciał a ludzkiego, zob., np., Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen i in., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994).

Określenie „swoiście (lub selektywnie) wiąże się do przeciwciała lub „ulega swoistej (lub selektywnej) reakcji immunologicznej z, w odniesieniu do białka albo peptydu oznacza reakcję wiązania, która decyduje o obecności białka w różnorodnej populacji białek i innych substancji biologicznych. Zatem, we wskazanych warunkach testów immunologicznych określone przeciwciała wiążą się do określonych białek dając sygnał dwa razy większy od sygnału tła i zasadniczo nie wiążą się w istotnej ilości do innych białek obecnych w próbce. Swoiste wiązanie do przeciwciała w takich warunkach może oznaczać konieczność wyboru przeciwciała pod względem jego swoistości wiązania do określonego białka. Selekcji tej można dokonać eliminując przeciwciała, które reagują z, na przykład, cząsteczkami DR5 innych gatunków. W celu selekcji przeciwciał, które wchodzą w specyficzne reakcje immunologiczne z określonymi białkami można zastosować różne testy immunologiczne. Na przykład, w tym celu stosuje się rutynowo testy immunologiczne ELISA w fazie sta łej (opis testów immunologicznych i warunków stosowanych do określania swoistej immunoreaktywności zamieszczono, np., w Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)). Typowo, specyficzna lub selektywna reakcja daje sygnał dwa razy większy od sygnału tła lub szumów i bardziej typowo 10 do 100 razy większy od sygnału tła.

Terminy „peptydomimetyk i „mimetyk oznaczają syntetyczne związki chemiczne o zasadniczo takiej samej strukturze i działaniu jak polipeptydy pochodzenia naturalnego lub niewystępujące naturalnie w przyrodzie (np. SMAC). Analogi peptydowe są powszechnie stosowane w przemyśle farmaceutycznym jako leki niepeptydowe o właściwościach analogicznych do właściwości określonych peptydów. Tego typu związki niepeptydowe określa się terminem „mimetyki peptydowe lub „peptydomimetyki (zob. Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS str. 392 (1985); i Evans i in., J. Med. Chem. 30:1229 (1987), które włączono tu w charakterze odnoś ników). Mimetyki peptydowe o podobnej budowie do budowy terapeutycznie użytecznych peptydów, mogą być wykorzystywane do wytwarzania równoważnego lub wzmocnionego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego. Zasadniczo peptydomimetyki wykazują podobieństwo strukturalne do modelowego polipeptydu (tj., polipeptydu wykazującego aktywność biologiczną lub farmakologiczną), tak jak w przypadku polipeptydu będącego przedmiotem niniejszego wynalazku, ale mają jedno lub kilka wiązań peptydowych ewentualnie zamienionych na wiązania wybrane z grupy obejmującej, na przykład, -CH2NH-,

PL 210 174 B1

-CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Mimetyk może składać się w całości z syntetycznych, niewystępujących w przyrodzie analogów aminokwasów lub jest chimeryczną cząsteczką złożoną z naturalnych peptydowych aminokwasów i niewystępujących w przyrodzie analogów aminokwasów. Mimetyk może także zawierać dowolną ilość konserwatywnych substytucji aminokwasowych, jeśli te substytucje nie modyfikują w sposób zasadniczy budowy i (lub) aktywności mimetyka. Na przykład skład mimetyka należy od zakresu niniejszego wynalazku, jeśli mimetyk ten wykazuje przynajmniej jeden rodzaj aktywności wiązania lub aktywności enzymatycznej polipeptydu będącego przedmiotem wynalazku.

Termin „siRNA oznacza małe interferujące RNA, zdolne do blokowania i powodujące potranskrypcyjne wyciszenie ekspresji specyficznych genów w komórkach, na przykład w komórkach ssaka (z włączeniem komórek człowieka) i w ciele, na przykład ciele ssaka (z włączeniem człowieka). Zjawisko interferencji RNA opisano i omówiono w Bass, Nature 411:428-29 (2001); Elbahir i in., Nature 411: 494-98 (2001); i Fire i in., Nature 391: 806-11 (1998); i publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 01/75164, gdzie przedyskutowano także metody wytwarzania małego interferującego RNA. siRNA bazujące na sekwencjach i kwasach nukleinowych kodujących produkty genów ujawnione w niniejszym wynalazku typowo mają mniej niż 100 par zasad i mogą mieć długość, na przykład, około 30 bps lub mniej. siRNA można otrzymywać metodami znanymi ze stanu techniki z włączeniem metod wykorzystujących nici komplementarnego DNA lub syntez chemicznych. siRNA mogą blokować i powodować potranskrypcyjne wyciszenie ekspresji specyficznych genów w komórkach, na przykład w komórkach ssaka (z włączeniem komórek człowieka) i w ciele, na przykład ciele ssaka (z włączeniem człowieka). Przykładowe siRNA według wynalazku mogą mieć do 29 bps, 25 bps, 22 bps, 21 bps, 20 bps, 15 bps, 10 bps, 5 bps lub jakąkolwiek liczbę całkowitą bps, bliską podanym. Narzędzia służące projektowaniu siRNA o optymalnych właściwościach hamujących obejmują te dostępne z DNAengine Inc. (Seattle, WA) i Ambion, Inc. (Austin, TX).

W jednej technice RNAi stosuje się struktury genetyczne, w których sensowne i antysensowne sekwencje (nici) umieszczone są w regionach flankujących sekwencję intronu w odpowiedniej orientacji składania w stosunku do donorowych i akceptorowych miejsc zespalania składowych. Alternatywnie, w celu rozdzielenia regionów wzajemnej komplementarności sekwencji w strukturze, można zastosować wstawki (sekwencje) o różnych długościach. Podczas przetwarzania transkryptu genu, introny są wycinane, co umożliwia sekwencjom sensownym i antysensownym, a także sekwencjom łączącym składania, połączenie się z utworzeniem dwuniciowego RNA. Następnie wybrane rybonukleazy wiążą się do dwuniciowego RNA i rozszczepiają go inicjując w ten sposób kaskadę zdarzeń prowadzących do degradacji specyficznych sekwencji genów mRNA i wyciszenia specyficznych genów.

Termin „kwas nukleinowy odnosi się do dezoksyrybonukleotydów lub rybonukleotydów oraz ich polimerów w postaci jedno- lub dwu-niciowej. Termin obejmuje kwasy nukleinowe zawierające znane analogi nukleotydów lub zmodyfikowane reszty szkieletowe lub wiązania, które mogą być syntezowane chemicznie, pochodzenia naturalnego lub niewystępujące naturalnie w przyrodzie i które mają podobne właściwości wiązania jak wzorcowy kwas nukleinowy i które są metabolizowane w podobny sposób jak wzorcowe nukleotydy. Przykładowe analogi opisane powyżej to fosforoamidany, fosforotioniany, fosfoniany metylu, chiralne fosfoniany metylu, 2-O-metylorybonukleotydy, kwasy peptydonukleinowe (PNA).

Jeśli nie wskazano inaczej, szczególna sekwencja kwasu nukleinowego niebezpośrednio obejmuje także jej modyfikacje konserwatywne (na przykład zdegenerowane substytucje kodonów) i sekwencje komplementarne, a także sekwencje wskazane wprost. W szczególności zdegenerowane substytucje kodonów można uzyskać wytwarzając sekwencje, w których kodon lub kilka kodonów, bądź wszystkie kodony znajdujące się w pozycji trzeciej zostały wymienione na reszty będące mieszanymi zasadami i (lub) reszty dezosksyinozynowe (Batzer i in., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka i in., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini i in., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Określenie „kwas nukleinowy obejmuje: gen, cDNA, mRNA, oligonukleotyd i polinukleotyd.

W niniejszym dokumencie terminy „polipeptyd, „peptyd i „białko są używane zamiennie i odnoszą się do polimeru zbudowanego z reszt aminokwasowych. Terminy te dotyczą polimerów aminokwasowych, w których jedna lub kilka reszt aminokwasowych jest zsyntezowanym chemicznie mimetykiem odpowiedniego aminokwasu pochodzenia naturalnego. Terminy te odnoszą się także do polimerów aminokwasowych pochodzenia naturalnego i lub polimerów aminokwasowych niewystępujących w przyrodzie.

PL 210 174 B1

Termin „aminokwas oznacza aminokwasy występujące w przyrodzie i syntetyczne, a także analogi aminokwasów i mimetyki aminokwasów, działające podobnie do aminokwasów pochodzenia naturalnego. Aminokwasy pochodzenia naturalnego to te kodowane przez kod genetyczny, a także aminokwasy później zmodyfikowane, na przykład hydroksyprolina, gamma-karboksyglutaminian i O-fosfoseryna. Analogi aminokwasów odnoszą się do związków o takiej samej budowie chemicznej jak aminokwasy pochodzenia naturalnego, na przykład mających węgiel alfa związany z wodorem, grupę karboksylową, aminową, grupę R, takich jak homoseryna, norleucyna, sulfotlenek metioniny, sól metylosulfoniowa metioniny. Analogi te mają zmodyfikowane grupy R (np. norleucyna) lub zmodyfikowane szkielety peptydowe. Mimetyki aminokwasów oznaczają związki chemiczne o budowie różniącej się od zasadniczej budowy chemicznej aminokwasów, ale mające podobne działanie jak aminokwasy pochodzenia naturalnego.

Określenie „konserwatywnie modyfikowane warianty dotyczy zarówno sekwencji aminokwasowych jak i sekwencji kwasów nukleinowych. W odniesieniu do danych sekwencji kwasów nukleinowych, termin ten odnosi się do kwasów kodujących sekwencje identyczne lub istotnie identyczne, albo w przypadku gdy kwas nukleinowy nie koduje sekwencji aminokwasowej, do istotnie identycznych sekwencji. Z powodu degeneracji kodu genetycznego, duża liczba funkcjonalnie identycznych kwasów nukleinowych koduje określone białko. Na przykład, wszystkie kodony typu GCA, GCC, GCG i GCU kodują alaninę. Zatem, występujący w dowolnej pozycji kodon alaniny może zostać zmodyfikowany na dowolny z wymienionych kodonów bez wpływu na kodowany polipetyd. Tego typu mutacje kwasów nukleinowych nazywane są „mutacjami niemymi. Każda sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd opisuje również każdą możliwą niemą mutację kwasu nukleinowego. Dla osoby biegłej w dziedzinie oczywiste będzie, że każdy kodon w kwasie nukleinowym (za wyjątkiem AUG, który jest zwykle jedynym kodonem dla metioniny i TGG, który jest zwykle jedynym kodonem tryptofanu) można zmodyfikować tak, aby otrzymać cząsteczkę o identycznym działaniu. Odpowiednio, każda niema mutacja kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd jest ukryta w każdej opisanej sekwencji.

W przypadku sekwencji aminokwasowych dla osoby biegłej w dziedzinie będzie oczywiste, że pojedyncze substytucje, delecje lub addycje aminokwasu lub niewielkiego procentu aminokwasów do sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu, polipeptydu lub białka jest „konserwatywną modyfikacją, gdzie modyfikacja powoduje substytucję aminokwasu chemicznie podobnym aminokwasem. Tabele konserwatywnych substytucji z funkcjonalnie podobnymi aminokwasami są znane ze stanu techniki. Konserwatywnie modyfikacje stanowią uzupełnienie i nie wyłączają wariantów polimorficznych, homologów międzygatunkowych i alleli według wynalazku.

Poniżej przedstawiono osiem grup, z których każda zawiera aminokwasy stanowiące dla siebie konserwatywne substytucje:

1) Alanina (A), glicyna (G);

2) Kwas asparginowy (D), kwas glutaminowy (E);

3) Asparagina (N), glutamina (Q);

4) Arginina (R), lizyna (K);

5) Izoleucyna (I), leucyna (L), metionina (M), walina (V);

6) Fenyloalanina (F), tyrozyna (Y), tryptofan (W);

7) Seryna (S), treonina (T); oraz

8) Cysteina (C), metionina (M) (zob., np., Creighton, Proteins (1984)).

„Procent identyczności sekwencji określa się porównując za pomocą okna porównań dwie optymalnie ułożone (uliniowane) względem siebie sekwencje, gdzie fragment sekwencji polinukleotydu w okienku porównań może zawierać addycje lub delecje (tj. szczeliny) w porównaniu z sekwencją odniesienia (np. polipeptydu według wynalazku), która nie zawiera addycji ani delecji. Procent ten oblicza się określając liczbę pozycji, w których występują identyczne zasady kwasu nukleinowego lub reszty aminokwasowe w obu sekwencjach i dzieląc tę liczbę przez całkowitą liczbę pozycji w oknie porównań oraz mnożąc otrzymany wynik przez 100.

Terminy „identyczne lub „procent identyczności w kontekście dwóch lub większej liczby kwasów nukleinowych albo sekwencji polipeptydów, dotyczy dwóch lub większej liczby sekwencji bądź podsekwencji, które są takimi samymi sekwencjami. Dwie sekwencje są „istotnie identyczne, jeśli zawierają określony procent takich samych reszt aminokwasowych lub nukleotydów (tj., identyczność wynosi 60%, opcjonalnie 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, lub 95% specyficznego regionu, lub, jeśli nie określono inaczej, całej sekwencji), w przypadku gdy są one porównywane i uliniowane w celu uzyskania orientacji sprzyjającej najlepszemu porównaniu w oknie porównań lub określonego regionu,

PL 210 174 B1 co wynika z pomiarów wykonywanych z użyciem jednego z algorytmów porównywania sekwencji lub manualnego uliniowienia i oceny wzrokowej. Przedmiotem wynalazku są polipeptydy lub polinukleotydy, które są istotnie identyczne z, odpowiednio, polipeptydami lub polinukleotydami podawanymi w niniejszym dokumencie jako przykłady (np. przykładowe CDR zilustrowano na fig. 23-25). Opcjonalnie, identyczne są ich regiony o długości przynajmniej 25 nukleotydów, lub korzystniej o długości 100 do 500 lub 1000, bądź więcej nukleotydów.

W przypadku porównywania sekwencji typowo jedna sekwencja jest sekwencją odniesienia, z którą porównuje się sekwencję testowaną. Jeśli używa się algorytmu porównywania sekwencji, sekwencje testowane i porównawcze (odniesienia) wprowadza się do komputera, następnie wyznacza współrzędne, jeśli jest to konieczne, i określa parametry programu. Można stosować parametry domyślne lub je wyznaczyć. Następnie, na podstawie zadanych parametrów, algorytm oblicza procent identyczności sekwencji badanej sekwencji z sekwencją porównawczą.

Termin „okno porównań używany w niniejszym dokumencie obejmuje odniesienie do segmentu składającego się z wielu dowolnych sąsiednich pozycji wybranych z grupy składającej się z 20 do 600, zazwyczaj około 50 do około 200, częściej około 100 do około 150, w którym sekwencję można porównać z sekwencją odniesienia o tej samej liczbie sąsiadujących pozycji po optymalnym ich uliniowieniu. Metody układania sekwencji w celu ich porównania są znane ze stanu techniki. Optymalne uliniowienie można uzyskać na przykład posługując się algorytmem lokalnego uliniowienia Smitha i Watermana (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, algorytmem uliniowienia Needlemana i Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, metodą wyszukiwania podobieństwa Pearsona i Lipmana (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, poprzez komputerowe implementacje tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA w Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) lub poprzez manualne uliniowienie i ocenę wzrokową (zob., np., Ausubel i in., Current Protocols in Molecular Biology (dodatek 1995)).

Dwa przykładowe algorytmy odpowiednie do określania procentu identyczności i podobieństwa sekwencji to algorytm BLAST i algorytm BLAST 2.0, opisane odpowiednio w Altschul i in., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 i Altschul i in., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Oprogramowanie algorytmu BLAST jest ogólnie dostępne poprzez National Center for Biotechnology Information. Algorytm ten polega na identyfikacji par sekwencji o wysokiej wartości punktacji porównania (HSP) poprzez znalezienie w badanej sekwencji krótkich słów o długości W, które są identyczne lub dla których punktacja porównania ze słowem z bazy danych o tej samej długości jest większa niż określona wartość progowa T. T jest określane jako wartość progowa dla sąsiednich słów (Altschul i in., jw.). Te wstępne trafienia dla sąsiednich słów służą jako wartości początkowe dla zainicjowania poszukiwania dłuższych par HSP je zawierających. Trafienia (wyłowione sekwencje) wydłuża się w obu kierunkach wzdłuż każdej sekwencji tak długo jak zwiększa się sumaryczna punktacja (wynik/współczynnik porównania). Całkowitą punktację oblicza się dla sekwencji nukleotydowej używając parametru M (punktacja nagrody dla identycznej pary reszt, zawsze > 0) i N (punktacja kary za niepasujące reszty, zawsze < 0). Dla sekwencji aminokwasowych w celu obliczenia całkowitej punktacji stosuje się macierz punktową. Przedłużanie trafień w obu kierunkach zatrzymuje się, gdy: całkowita punktacja spadnie o wartość X w stosunku do swojej maksymalnej wartości; całkowita punktacja spadnie do zera lub poniżej z powodu nagromadzenia jednego lub więcej uliniowień reszt o ujemnej wartości punktacji; zostanie osiągnięty koniec dowolnej z sekwencji. Parametry W, T i X algorytmu BLAST określają czułość i szybkość uliniowienia. Program BLASTN (stosowany w przypadku sekwencji nukleotydowych) używa wartości domyślnej parametru W (długość słowa) równej 11 i domyślnej wartości oczekiwanej (E) równej 10, M=5, N=-4. Porównywane są dwie nici. Program BLASTP (stosowany w przypadku sekwencji aminokwasowych) używa w ustawieniu domyślnym wartości parametru W (długość słowa) równej 3 i wartości oczekiwanej (E) równej 10, a program BLOSUM62 (zob. Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) używa parametru uliniowienia (B) równego 50, wartości oczekiwanej (E) równej 10, M=5, N=-4 i porównywane są dwie nici.

Przy użyciu algorytmu BLAST można także przeprowadzić analizę statystyczną podobieństwa dwóch sekwencji (zob., np., Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Jedną miarę podobieństwa w algorytmie BLAST stanowi prawdopodobieństwo najmniejszych sum (P(N)) określające prawdopodobieństwo przypadkowego wystąpienia identycznych dwóch sekwencji nukleotydowych lub aminokwasowych. Na przykład kwas nukleinowy jest uważany za podobny do sekwencji odniesienia, jeśli prawdopodobieństwo najmniejszych sum kwasu nukleinowego w porówPL 210 174 B1 naniu z kwasem nukleinowym odniesienia jest mniejsze niż 0,2, korzystniej mniejsze niż około 0,01 i najkorzystniej mniejsze niż około 0,001.

Wskazaniem istotnej identyczności dwóch sekwencji kwasów nukleinowych lub polipeptydów jest to, że polipeptyd kodowany przez pierwszy kwas nukleinowy reaguje krzyżowo z przeciwciałami wytworzonymi przeciw polipeptydowi kodowanemu przez drugi kwas nukleinowy, co opisano poniżej. Zatem, polipeptyd jest typowo istotnie identyczny jak drugi polipetyd, jeśli na przykład dwa peptydy różnią się jedynie substytucjami konserwatywnymi. Kolejnym wskazaniem istotnej identyczności dwóch sekwencji kwasów nukleinowych jest to, że dwie cząsteczki lub ich komplementy hybrydyzują w pewnych warunkach, co opisano poniżej. Dalszym wskazaniem istotnej identyczności dwóch sekwencji kwasów nukleinowych jest to, że w celu zwielokrotnienia sekwencji mogą zostać użyte te same startery.

Termin „agonista związku wykazującego powinowactwo lub „agonista dotyczy związku wykazującego powinowactwo (tj. cząsteczki, która swoiście wiąże się z docelową molekułą) zdolnego do aktywacji receptora w celu indukowania całkowitej lub częściowej odpowiedzi zależnej od receptora. Na przykład agonista DR4 lub DR5 wiąże się do DR4 lub DR5 indukując powstanie sygnału z udziałem DR4 lub DR5. W niektórych wykonaniach agonista związku wykazującego powinowactwo do DR4 lub DR5 może być rozpoznany z powodu jego zdolności do wiązania do DR4 lub DR5 i indukowania apoptozy w przypadku kontaktu z komórkami Jurkat. Termin „agonista przeciwciała odnosi się do sytuacji, w której związek wykazujący powinowactwo jest przeciwciałem.

Termin „środek indukujący apoptozę dotyczy związku, który indukuje lub jest promotorem apoptozy przynajmniej jednego typu komórek, w przypadku kontaktu z nimi. Przykładowe środki indukujące apoptozę obejmują, na przykład, agonistów lub mimetyki: SMAC, Bax, Bik, Bok, Bim, Bak, Bid, Noxa, Puma, Hrk, lub Bad; BH3, p53, liganda TRAIL, Fadd, Myc i Mekk1, receptora cząstki rozpoznawania sygnału 72kD (SRP72), kaspazy-8, Bid, B-limfoidalnej kinazy tyrozynowej (BLK), produktu genu podobnego do izoenzymu M2 kinazy pirogronianowej (LOC148283), kinazy syntazy glikogenu 3 alfa (GSK3A), hipotetycznego białka FLJ32312 (FLJ32312), kinazy białkowej aktywowanej przez mitogen 10 (MAPK10), TCF4: czynnika transkrypcyjnego 4, homologu onkogenu wirusa mysiej białaczki Abelsona v-abl 2 (arg, gen spokrewniony z onkogenem Abelsona) (ABL2), homologu onkogenu wirusa ptasiego mięsaka UR2, v-ros, 1 (ROS1) i homologu onkogenu ptasich nacieków mielocytowych v-myc, a także antagonistów i inhibitory: inhibitorów proteasomu 26S, c-flip, szlaku NFkB, członków rodziny białek lAP (np., XIAP, cIAP1, cIAP2, NAIP, MLIAP/liwiny, surwiwiny), członków szlaku proteasomowego (np., E1, E2 i E3); kinaz PI3, Akt1 2, i 3, Rip, Nik; CD40; członków rodziny Bcl2 (np., BcI2, BcI-xI, A1, Mcl1), koniugazy ubikwitynowej UbcH10, osteoprotegryny, pleksyny B1 (PLXNB1), białka zawierającego domenę SET 7 (SET7), kinazy białkowej aktywowanej przez mitogen 5 (MAP3K5), kinazy podobnej do STE20 (JIK), kinazy serynowo-treoninowej oddziałującej z kinazą MAP 1 (MKNK1), przypuszczalnego białka retikulum endoplazmatycznego (RFT1), 5-kinazy typu I, gamma (PIP5K1C), kinazy białkowej aktywowanej przez kinazę MAP 2 (MAPKAPK2), kinazy kinazy MAP 5 (MAP2K5), cyklinozależnej kinazy 6 (CDK6), receptora aktywiny A podobnego do typu II, 1 (ACVRL1), homologu onkogenu wirusa mięśniaka kociego Gardner-Rasheeda (v-fgr) (FGR), hipotetycznego białka FLJ21802 (FLJ21802), receptorowej kinazy tyrozynowej swoistej dla mięśni szkieletowych (MUSK), otwartej ramki odczytu chromosomu 20, 88 (C20orf88), pączkowania niehamowanego przez bezoimidazole 1 (homolog drożdży) (BUB1), rybosomalnej kinazy białkowej S6, 90kD, polipeptyd 5 (RPS6KA5), homologu onkogenu spokrewnionego z wirusem mięsaka Yamaguchi v-yes-1 (LYN), kinazy białkowej aktywowanej przez mitogen 7 (MAPK7), homologu onkogenu wirusa grasiczaka mysiego v-akt 1 (AKT1), PAK1 (z włączeniem, np., dowolnej z substancji: kinazy aktywowanej przez P21(CDKN1A) 1, PAKA, P65-PAK, P68-PAK, alfa-PAK, MUK2, PAK1B (kinazy aktywowanej przez p21, 1B), kinazy aktywowanej przez P21/Cdc42/Rac1-1 (spokrewnionej z Ste20), kinazy efektorowej Cdc42/Rac PAK-A, kinazy białkowej MUK2), nsurf, stk12 (z włączeniem, np., kinazy serynowo-treoninowej 12, kinazy związanej z aurorą 2, kinazy podobnej do aurory/IPL1 2, AIK2, ARK2, AIM-1, and AIM1), kinazy regulującej sygnał apoptozy 1 (Ask1), TLK1 (np., numer dostępu NM_012290), NLK (np., numer dostępu NM_016231), GRAF (np., numer dostępu NM_015071), GCK (np., numer dostępu NM_000162), ERK5 (np., numer dostępu NM_002749), FGR (np., numer dostępu NM_005248), ACVRL1 (np., numer dostępu NM_000020), MEKK5 (np., numer dostępu NM_002757), PIP5K1C (np., numer dostępu XM_047620), MAPKAPK2 (np., numer dostępu NM_004759), RFT1 (np., numer dostępu NM_052859), MKNK1 (np., numer dostępu NM_003684), PLXNB1 (np., numer dostępu NM_002673). Dodatkowo, jako przykładowe środki indukujące apoptozę można wymienić środki, które wzmacniają

PL 210 174 B1 ekspresję i (lub) stabilność DR5 i DR4, środki, które podwyższają aktywność i (lub) stabilność kaspazy oraz środki, które indukują lub wzmacniają odpowiedź na uszkodzenie DNA. Agoniści lub mimetyki wymienione powyżej obejmują również same produkty genów, na przykład, p53 jest agonistą p53. Antagoniści obejmują środki, które bezpośrednio hamują aktywność i środki, które niebezpośrednio hamują aktywność poprzez zmniejszanie ekspresji lub stabilności docelowej molekuły mRNA (np. siRNA) lub białka.

Określenie „środek, który zapobiega lub zmniejsza ekspresję białka dotyczy związków, które, na przykład, wiążą się, częściowo lub całkowicie blokują stymulację, zmniejszają, zapobiegają i opóźniają ekspresję. Ekspresja białka może być zmniejszona przykładowo przynajmniej o 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% Iub 100%.

Określenie „aktywacja NFkB oznacza indukcję lokalizacji jądrowej NFkB, związanie DNA przez NFkB lub transkrypcję wynikającą ze związania DNA przez NFkB.

Określenie „zapobiega degradacji IkB odnosi się do degradacji IkB przez proteasom, co powoduje uwolnienie NFkB do jąder komórek.

Określenie „inhibitor proteasomu odnosi się do środka, który hamuje szlak proteasomowo-ubikwitynowy, zapobiegając w ten sposób degradacji IkB i dalszej lokalizacji jądrowej NFkB, będącego partnerem IkB. Proteasom obejmuje, na przykład, kompleks proteasomu 26S.

Określenie „białko hamujące apoptozę (lAP) odnosi się do polipeptydu z rodziny białek hamujących aktywność kaspazy. Wszystkie z wyjątkiem jednego ze znanych białek lAP mają dwukrotne lub trzykrotne powtórzenia charakterystycznego motywu sekwencji - powtórzona sekwencja inhibitorowa z bakulowirusa (BIR; ~70 reszt; surwiwina to ostatnio odkryte ludzkie białko lAP, które zawiera region BIR). Region BIR zawiera szereg konserwatywnych reszt o sekwencji (konsensus): R-X(20-23)-G-X(11)-C-X(2)-C-X(16)-H-X(6)-C. Przykładowe białka lAP obejmują inhibitor apoptozy powiązany z chromosomem X (XIAP; nr dostępu Banku Genów U32974), komórkowe białka lAP (c-IAP-1/HIAP-2/hMIHB i c-IAP-2/HIAP-1/hMIHC; Liston i in., Nature 379:349-353 (1996); Rothe i in., Cell 83:1243-1252 (1995)); białko hamujące apoptozę komórek neuronowych (NAIP; Roy i in., Cell 80:167-178 (1995)); oraz surwiwinę (Ambrosini i in., Nature Med. 3:917-921 (1997)); zob., np., opis zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2002/0009757 i opis patentu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 6 187 557.

Termin „SMAC odnosi się do mitochondrialnego polipeptydu, który jest uwalniany razem z cytochromem c z mitochondrium w odpowiedzi na stymulację apoptozy. SMAC aktywuje kaspazy poprzez wiązanie i neutralizowanie białek lAP, zob., np., Du i in., Cell 102:33-42 (2000); Verhagen i in.,

Cell 102:43-53 (2000).

Termin „modulatory jest używany w niniejszym wynalazku do określenia cząsteczek, które hamują lub podwyższają aktywność ekspresji produktu genu. „Antagoniści albo „inhibitory to związki, które, na przykład, hamują ekspresję produktu genu lub wiążą częściowo lub całkowicie blokując stymulację, zmniejszając, zapobiegając opóźniając aktywację, dezaktywując, zmniejszając czułość lub regulując „w dół aktywność produktu genu lub wiążąc, bądź regulując „w dół aktywność receptora, do którego wiąże się produkt genu. „Agoniści lub „aktywatory to związki, które, na przykład, indukują lub aktywują ekspresję produktu genu lub wiążą, stymulują, zwiększają, rozpoczynają, aktywują, umożliwiają, wzmacniają aktywację, uwrażliwiają lub regulują w górę aktywność produktu genu, bądź wiążą lub regulują w górę aktywność receptora, do którego wiąże się produkt genu. Agoniści lub antagoniści obejmują, na przykład, przeciwciała, małe cząsteczki organiczne (na przykład o masie cząsteczkowej mniejszej od 1500 Daltonów), genetycznie zmodyfikowane wersje produktów genów, itd. Antagoniści obejmują, na przykład, cząsteczki siRNA zmniejszające ekspresję transkryptu kodującego produkt genu.

Zwięzły opis rysunków

Fig. 1 przedstawia apoptozę komórek Jurkat indukowaną przez TRAIL.

Fig. 2 przedstawia swoistość przeciwciał funkcjonalnych DR5.

Fig. 3 przedstawia wpływ trzech różnych agonistów przeciwciał DR5 na komórki Jurkat.

Fig. 4 ilustruje aktywność kaspazy-3 w komórkach Jurkat, na które działano ligandem TRAIL lub przeciwciałem anty-DR5.

Fig. 5 ilustruje wpływ przeciwciał funkcjonalnych DR4/DR5 na linie komórek raka okrężnicy i czerniaka.

Fig. 6 ilustruje wpływ przeciwciał funkcjonalnych DR4/DR5 na linie komórek raka piersi.

PL 210 174 B1

Fig. 7 ilustruje wpływ różnych dawek agonisty przeciwciała DR5 na odpowiedź komórek nowotworowych i normalnych.

Fig. 8 ilustruje wpływ agonisty przeciwciała anty-DR5 na aktywację kaspazy-3.

Fig. 9 ilustruje wpływ agonisty przeciwciała DR5 stosowanego w linii komórek ludzkiego raka okrężnicy Colo 205 na objętość guza.

Fig. 10 ilustruje odpowiedź na różne dawki anty-DR5 w linii komórek ludzkiego raka okrężnicy Colo 205.

Fig. 11 ilustruje aktywność przeciwnowotworową monoklonalnego przeciwciała DR5 w warunkach in vivo.

Fig. 12 ilustruje ścieżki aktywacji kaspazy i apoptozy.

Fig. 13 ilustruje wpływ obecności mimetyka SMAC na apoptozę indukowaną przez przeciwciała anty-DR4 lub anty-DR5 w komórkach A2058.

Fig. 14 ilustruje wpływ mimetyka SMAC na komórki normalne i nowotworowe.

Fig. 15 ilustruje badania farmakokinetyczne i farmakodynamiczne mimetyka SMAC.

Fig. 16 ilustruje aktywację NFkB przez proteasom.

Fig. 17 ilustruje efekt podwyższenia stopnia apoptozy indukowanej przez przeciwciała anty-DR5 przez inhibitor MG132 proteasomu.

Fig. 18 przedstawia różne inhibitory proteasomu.

Fig. 19 ilustruje wpływ inhibitorów proteasomu na linię komórkową A2058.

Fig. 20 ilustruje wpływ inhibitorów proteasomu na linię komórek raka wątroby.

Fig. 21 ilustruje wpływ inhibitorów proteasomu na normalne komórki ssaka (HMEC).

Fig. 22 ilustruje ekspresję chimerycznych mysio-ludzkich przeciwciał DR5.

Fig. 23 przedstawia sekwencje nukleotydowe zmiennych regionów ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała A.

Fig. 24 ilustruje sekwencję zmiennego regionu ciężkiego łańcucha przeciwciała A.

Fig. 25 ilustruje sekwencję zmiennego regionu lekkiego łańcucha przeciwciała A.

Fig. 26 ilustruje metodę identyfikacji produktów genów, które pośredniczą w apoptozie indukowanej przez TRAIL, poprzez wprowadzenie siRNA w celu wyciszenia specyficznej ekspresji genów w testach na komórkach.

Fig. 27 także ilustruje metodę identyfikacji produktów genów, które pośredniczą w apoptozie indukowanej przez TRAIL, poprzez wprowadzenie siRNA w celu wyciszenia specyficznej ekspresji genów w testach na komórkach.

Na fig. 28 przedstawiono listę zidentyfikowanych produktów genów w opisanym powyżej skriningu z udziałem siRNA. „Stosunek oznacza stosunek liczby żywych komórek (tj. nieapoptotycznych) po dodaniu liganda TRAIL do tych bez dodatku TRAIL. Niskie stosunki (mniejsze od 50) wskazują, że produkty genów interferują z apoptozą. Wyższe stosunki (większe od 50) wskazują produkty genów, które przyczyniają się do apoptozy.

Fig. 29 ilustruje dane dotyczące siRNA dla Gsk3a i Gsk3e. Z obrazu zamieszczonego w górnej części fig. wynika, że siRNA są specyficzne dla Gsk3a lub Gsk3e. Wykres słupkowy na dole fig. pokazuje aktywność kaspazy po wprowadzeniu siRNA w obecności lub przy braku obecności liganda TRAIL.

Fig. 30 ilustruje mechanizm regulacji dla apoptozy indukowanej przez TRAIL. Myc działa proapoptotycznie, dlatego hamowanie myc powoduje hamowanie apoptozy indukowanej przez TRAIL, a aktywacja myc synergistycznie aktywuje apoptozę indukowaną przez TRAIL lub przeciwciała anty-DR4, albo anty-DR5.

Fig. 31 przedstawia efekt addytywny siUbcH10 i klasycznych cytotoksycznych środków przeciwnowotworowych w procesie apoptozy komórek nowotworowych. Fig. ta pokazuje także, że leczenie wstępne komórek guza siUbcH10 powoduje znaczący wzrost apoptozy indukowanej przez przeciwciała DR5.

Fig. 32 ilustruje uwrażliwianie komórek nowotworowych na indukujący apoptozę ligand TRAIL lub przeciwciała anty-DR5 poprzez regulację „w dół UbcH10 przez siUbcH10.

Fig. 33 ilustruje uwrażliwianie komórek HCT116-Bax-/- na ligand TRAIL w wyniku hamowania przez inhibitory proteasomu 26S: laktacystynę (LC), MG-132 i MG-262.

Fig. 34 ilustruje wpływ inhibitora MG-262 proteasomu na ekspresję białek różnych szlaków apoptozy mitochondrialnej.

Fig. 35 ilustruje alternatywne sekwencje zmiennych regionów ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciała A.

PL 210 174 B1

Szczegółowy opis wynalazku

I. Wprowadzenie

Niniejszy wynalazek demonstruje nieoczekiwany efekt synergistyczny przeciwciał anty-DR4 lub anty-DR5 i środków indukujących apoptozę w indukcji apoptozy komórek nowotworowych. Zatem komórki nowotworowe, które są oporne na leczenie jednym z tych składników najprawdopodobniej ulegną apoptozie pod wpływem agonisty przeciwciała anty-DR4 lub anty-DR5 i drugiego środka indukującego apoptozę. Ponadto, kontakt z obydwoma tymi środkami prowadzi do szybszej indukcji apoptozy w komórkach, które ulegają apoptozie pod wpływem kontaktu z jednym z tych składników.

Przedmiotem niniejszego wynalazku są także silnie działające agonistyczne przeciwciała DR5 i ich zastosowanie do indukowania apoptozy komórek nowotworowych.

II. Przeciwciała anty-DR4 lub anty-DR5

1. Wprowadzenie

Agonistów przeciwciał anty-DR4 lub anty-DR5 można otrzymać sposobami według niniejszego wynalazku. DR4 (receptor śmierci 4) i DR5 (receptor śmierci 5) to dwa receptory linganda TRAIL, zob., np., Pan i in., Science 277:815-8 (1997); Sheridan, i in., Science 277:818-21 3 (1997); Walczak i in., EMBO J. 16:5386-97 4 (1997). Przeciwciała anty-DR5 zostały wcześniej opisane, na przykład w publikacji PCT międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 01/83560 (przeciwciało TRA-8; ATCC PTA-1428) i WO 02/079377. Ponadto, agonistów przeciwciał anty-DR5 opisano w niniejszym dokumencie. Zmienne regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha przykładowego agonisty przeciwciała anty-DR5 przedstawiono na fig. 23-25. W niektórych wykonaniach, przeciwciała anty-DR5 konkurują z przykładowym przeciwciałem w wiązaniu do DR5. W niektórych wykonaniach, agoniści przeciwciał anty-DR5 mają CDR zasadniczo podobne do CDR przedstawionych jako przykłady na fig. 24 i (lub) 25.

W sposobach według niniejszego wynalazku mogą zostać użyci agoniści przeciwciał dowolnego typu. Zasadniczo stosowane są przeciwciała monoklonalne. Przeciwciała monoklonalne można otrzymać metodami należącymi do stanu techniki (na przykład stosując hybrydomy, metodę ekspresji rekombinacyjnej i (lub) metodę ekspresji fagowej.

Przeciwciała według wynalazku nie muszą być zmostkowane (usieciowane) lub poddawane jakiemukolwiek działaniu przed podaniem. Jednakże w niektórych wykonaniach przeciwciała według wynalazku są zmostkowane. Mostkowanie (na przykład przy użyciu hetero- lub homo-dwufunkcyjnych chemicznych środków sieciujących) należy do stanu techniki. Alternatywnie mogą zostać podane stabilne, poliwalentne przeciwciała (np., trimery lub tetramery, etc), zob., np., publikację PCT międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 99/27964.

Przykładowe przeciwciała anty-DR6 obejmują te wykazujące swoistość względem wiązania taką jak przeciwciała zawierające sekwencje zmiennych regionów lekkich i ciężkich łańcuchów pokazane na fig. 24 i 25. W niektórych wykonaniach, przeciwciałem jest przeciwciało A.

W wielu wykonaniach przeciwciała anty-DR5 według wynalazku nie wiążą się do żadnego receptora z rodziny receptorów TNF (np., TNFR2, TNFR3, OX40, CD40, FAS, DcR3, CD27, CD30, CD137, DR4, DcR1, DcR2, RANK, OPG, DR3, TR2, NGFR, TNFR1 i TAC1). W niektórych wykonaniach przeciwciała anty-DR5 nie wiążą się do DR4, DTR1, DTR2 ani OPG.

Przeciwciała anty-DR4 lub anty-DR5 według wynalazku mogą mieć wyjątkowo silne działanie. Na przykład w niektórych wykonaniach w standardowym teście usuwania guza podskórnego przeciwciała według wynalazku w stężeniu 1 mg/kg masy ciała lub mniejszym (w niektórych wykonaniach 0,50 mg/kg, 0,05 mg/kg lub 0,01 mg/kg bądź mniej) mogą zmniejszyć rozmiary guza o 50%, jeśli podawane są zwierzęciu trzy razy w tygodniu przez dwa tygodnie i usuwają zupełnie guza, jeśli zostaną użyte dziesięciokrotnie w tej ilości.

W niektórych przypadkach przeciwciała anty-DR4 lub anty-DR5 według wynalazku powinny nie wykazywać lub wykazywać ograniczoną cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciała (ADCCC). Na przykład, w niektórych wykonaniach, przeciwciała według wynalazku zawierają fragmenty Fc IgG-1, IgG-2, IgG-2A, IgG-3 lub IgG-4.

Do wykrycia zmiennych sekwencji łańcuchów lekkich i ciężkich pokazanych na fig. 24 i 25 można użyć wielu syntetycznych wzorców molekularnych. W publikacji Koide, A. i in., J. Mol. Biol 284:1141-1151 (1988) opisano zastosowanie domeny fibronektyny typu III (FN3) jako specyficznego wzorca molekularnego do wykrycia peptydów z włączeniem CDRS. Inne alternatywne wzorce molekularne obejmują, na przykład, „miniciała (Pessi, A. i in., Nature 362:367-369 (1993)), tendamistat (McConnell, S. J. and Hoess, R. H. J. Mol. Biol. 250:460-470 (1995)) oraz „kamelizowaną domenę VH (Davies J. and Riechmann, L. BiolTechnology 13:475-479 (1995)). Inne wzorce, które nie są oparte na

PL 210 174 B1 immunoglobulinopodobnej strukturze, zamieszczono w pracy przeglądowej Nygren, P. A. and Uhlen, M. Curr. Opin. Struct. Biol. 7:463-469 (1997). Dodatkowe wzorce opisano w opisie patentu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 6 153 380. Termin „związki wykazujące powinowactwo obejmuje cząsteczki zawierające syntetyczny wzorzec molekularny taki, jak opisane wyżej służący do wykrycia (zobrazowania) domen wiążących o swoistości wiązania do DR4 lub DR5 i z włączeniem swoistości opisanej w niniejszym dokumencie, charakterystycznej dla przeciwciał.

2. Przeciwciała humanizowane

W niektórych wykonaniach, przeciwciało stosowane sposobem według wynalazku jest chimerycznym (np. mysio-ludzkim) przeciwciałem złożonym z regionów agonisty przeciwciała anty-DR4 lub anty-DR5 nie będącego przeciwciałem ludzkim i regionów przeciwciał ludzkich. Na przykład, ciężki łańcuch chimerycznego przeciwciała (chimeryczny łańcuch H) może zawierać fragment wiążący antygen zmiennego regionu ciężkiego łańcucha (np. o sekwencji pokazanej na fig. 24 lub 25) przeciwciała nie będącego przeciwciałem ludzkim połączony przynajmniej z jakimś odcinkiem stałego regionu łańcucha ciężkiego przeciwciała ludzkiego. Ten ciężki łańcuch humanizowanego lub chimerycznego przeciwciała może łączyć się z lekkim łańcuchem chimerycznego przeciwciała (chimeryczny łańcuch L) zawierającym fragment wiążący antygen zmiennego regionu łańcucha lekkiego (na przykład o sekwencji pokazanej na fig. 25 lub 35) przeciwciała nie będącego ludzkim, połączony przynajmniej z pewnym odcinkiem stałego regionu łańcucha lekkiego przeciwciała ludzkiego. W niektórych wykonaniach, stały region ciężkiego łańcucha może być przeciwciałem IgM lub IgA.

Chimeryczne przeciwciała według wynalazku mogą być immunoglobulinami monowalentnymi, diwalentnymi lub poliwalentnymi. Na przykład, monowalentne chimeryczne przeciwciało jest dimerem (HL) składającym się z chimerycznego łańcucha H związanego mostkami dwusiarczkowymi z chimerycznym łańcuchem L, jak wskazano wcześniej. Diwalentne chimeryczne przeciwciało jest tetramerem (H2 L2) składającym się z dwóch dimerów HL związanych przynajmniej jednym mostkiem dwusiarczkowym. Poliwalentne chimeryczne przeciwciało jest połączeniem wielu łańcuchów.

Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe zmiennego regionu przykładowego agonisty przeciwciała anty-DR5 pokazano na fig. 22-24. Sekwencje DNA przeciwciał według wynalazku mogą zostać identyfikowane, izolowane, sklonowane i przeniesione do komórek prokariotycznych lub eukariotycznych w celu ekspresji metodami należącymi do stanu techniki. Procedury te zasadniczo opisano w Sambrook i in., jw., i Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel i in., ed., 1989). Wektory ekspresyjne i komórki gospodarzy odpowiednie do ekspresji rekombinowanych przeciwciał i humanizowanych przeciwciał są znane ze stanu techniki. Sposoby i wektory odpowiednie do ekspresji rekombinowanych immunoglobulin, które mogą znaleźć zastosowanie według wynalazku opisano w: Weidle i in., Gene, 51: 21-29 (1987); Dorai i in., J. Immunol., 13(12):4232-4241 (1987); De Waele i in., Eur. J. Biochem., 176:287-295 (1988); Colcher i in., Cancer Res., 49:1738-1745 (1989); Wood i in., J. Immunol., 145(a):3011-3016 (1990); Bulens i in., Eur. J. Biochem., 195:235-242 (1991); Beggington i in., Biol. Technology, 10:169 (1992); King i in., Biochem. J., 281:317-323 (1992); Page i in., Biol. Technology, 2:64 (1991); King i in., Biochem. J., 290:723-729 (1993); Chaudary i in., Nature, 339:394-397 (1989); Jones i in., Nature, 321:522-525 (1986); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Benhar i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:12051-12055 (1994); Singer i in., J. Immunol., 150:2844-2857 (1993); Cooto i in., Hybridoma, 13(3):215-219 (1994); Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989); Caron i in., Cancer Res., 32:6761-6767 (1992); Cotoma i in., J. Immunol. Meth., 152:89-109 (1992). Ponadto, wektory do ekspresji rekombinowanych przeciwciał są dostępne na rynku.

Komórki gospodarza zdolne do ekspresji immunoglobulin funkcjonalnych obejmują, na przykład, komórki ssaków, takie jak komórki jajnika chomika chińskiego (Chinese hamster ovary, CHO); komórki COS; komórki szpiczaka, takie jak komórki NSO i SP2/O; bakterie takie jak Escherichia coli; komórki drożdży, takie jak Saccharomyces cerevisiae; i komórki innych gospodarzy.

3. Przeciwciała jedno-łańcuchowe

W niektórych wykonaniach, przeciwciała według wynalazku to przeciwciała jedno-łańcuchowe. Przykładowe metody wytwarzania jedno-łańcuchowych zmiennych regionów i przeciwciał obejmują te opisane w opisach patentów Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 946 778 i 5 258 498; i publikacjach: Huston i in., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999 (1993); oraz Skerra i in., Science 240:1038-1040 (1988).

PL 210 174 B1

4. Przeciwciała ludzkie

W niektórych wykonaniach wynalazku stosowane są przeciwciała ludzkie. Przeciwciała ludzkie można otrzymać różnymi metodami należącymi do stanu techniki, z włączeniem metod ekspresji fagowej z użyciem biblioteki przeciwciał (na podstawie sekwencji immunoglobulin ludzkich), zob., np., Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995), opisy patentów Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 444 887 i 4 716 111; oraz publikacje PCT międzynarodowych zgłoszeń patentowych WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 oraz WO 91/10741; które włączono tu w całości w charakterze odniesień literaturowych.

W niektórych wykonaniach, przeciwciała według wynalazku otrzymuje się metodą ekspresji fagowej. Na przykład, domeny przeciwciał funkcyjnych są obrazowane na powierzchni cząsteczek fagowych będących nośnikami sekwencji polinukleotydowych kodujących te domeny. Taki fag może zostać wykorzystany do prezentacji domen wiążących antygen ekspresjowanych z repertuaru albo kombinatorycznej biblioteki antygenów (np. ludzkiej lub mysiej). Fag wykazujący ekspresję domeny wiążącej antygen, która wiąże DR4 lub DR5, może zostać wybrany lub zidentyfikowany przy użyciu znakowanych DR4 lub DR5. Fagi stosowane w tych sposobach to typowo fagi włóknikowate zawierające domeny wiążące fd i M13 otrzymane po powieleniu w fagach poprzez fuzję fragmentów przeciwciał, Fv, Fab lub Fab stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowmymi, z genem III faga lub genem VIII białka. Przykładowe metody ekspresji fagowej, które mogą zostać zastosowane do otrzymania przeciwciał według niniejszego wynalazku obejmują te ujawnione w Brinkman i in., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames i in., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough i in., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic i in., Gene 187:9-18 (1997); Burton i in., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); zgłoszeniu PCT PCT/GB91/01134; publikacjach PCT międzynarodowych zgłoszeń patentowych WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; i opisie patentu Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 698 426; 5 223 409; 5 403 484; 5 580 717; 5 427 908; 5 750 753; 5 821 047; 5 571 698; 5 427 908; 5 516 637; 5 780 225; 5 658 727; 5 733 743 i 5,969,108; które włączono tu w całości w charakterze odniesień literaturowych.

5. Wytwarzanie przeciwciał agonistycznych

Przeciwciała agonistyczne można zidentyfikować poprzez wytwarzanie przeciwciał anty-DR4 lub anty-DR5 i dalsze testowanie zdolności każdego z nich do wywoływania efektów, w których pośredniczą DR4 lub DR5, na przykład indukowania apoptozy komórek nowotworowych. W celu wykrycia indukcji apoptozy można użyć różnych znanych w dziedzinie testów.

W jednym z testów komórki DOHH-2 lub komórki Jurkat kontaktuje się z badanym agonistą przeciwciała i następnie monitoruje przeżywalność tych komórek w zależności od stężenia przeciwciała. Zmniejszanie przeżywaIności komórek (np. spowodowane zwiększeniem apoptozy) wraz ze wzrostem stężenia przeciwciała wskazuje, że przeciwciało jest agonistą. Przeżywalność komórek można badać dodając błękit alamara, który fluoryzuje jedynie w obecności żywych komórek. Jak opisano w przykładach, przeciwciała agonistyczne można identyfikować poddając skriningowi hybrydomy wyhodowane przeciwko DR4 lub DR5 i następnie określając zdolność ich nadsączu do indukowania apoptozy w komórkach DOHH-2 lub Jurkat. W celu weryfikacji wyników można przeprowadzić analogiczne badania w grupie kontroli pozytywnej i negatywnej. Na przykład, komórki nie poddające się apoptozie indukowanej przez TRAIL, w której pośredniczą DR4 i DR5, nie powinny ulegać apoptozie w odpowiedzi na badanego agonistę przeciwciał anty-DR4 lub anty-DR5.

III. Środki indukujące apoptozę

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest synergistyczny efekt łącznego stosowania agonisty przeciwciał anty-DR4 lub anty-DR5 z drugim środkiem indukującym apoptozę. Środek indukujący apoptozę to dowolny środek indukujący apoptozę komórek. W niektórych wykonaniach środek ten preferencyjnie indukuje apoptozę komórek nowotworowych w stosunku do normalnych komórek. Typowo środkami indukującymi apoptozę są agoniści aktywatorów apoptozy, bądź antagoniści inhibitorów apoptozy.

Przykładowe środki indukujące apoptozę to agoniści lub mimetyki następujących: SMAC, Bax, Bik, Bok, Bim, Bak, Bid, Noxa, Puma, Hrk, lub Bad; BH3, p53, liganda TRAIL, Fadd, Myc i Mekk1, receptora cząstki rozpoznawania sygnału 72kD (SRP72), kaspazy-8, Bid, B-limfoidalnej kinazy tyrozynowej (BLK), produktu genu podobnego do izoenzymu M2 kinazy pirogronianowej (LOC148283), kinazy syntazy glikogenu 3 alfa (GSK3A), hipotetycznego białka FLJ32312 (FLJ32312), kinazy białkowej aktywowanej przez mitogen 10 (MAPK10), TCF4: czynnika transkrypcyjnego 4, homologu onkogenu wirusa mysiej białaczki Abelsona v-abl 2 (arg, gen spokrewniony z onkogenem Abelsona)

PL 210 174 B1 (ABL2), homologu onkogenu wirusa ptasiego mięsaka UR2, v-ros, 1 (ROS1) i homologu onkogenu ptasich nacieków mielocytowych v-myc, a także antagonistów i inhibitory: inhibitorów proteasomu 26S, c-flip, szlaku NFkB, członków rodziny białek lAP (np., XIAP, cIAPI, cIAP2, NAIP, MLIAP/liwiny, surwiwiny), członków szlaku proteasomowego (np., E1, E2 i E3); kinaz PI3, Akt1 2, i 3, Rip, Nik; CD40; członków rodziny Bcl2 (np., Bcl2, Bcl-xl, A1, Mcl1), koniugazy ubikwitynowej UbcH10, osteoprotegryny, pleksyny B1 (PLXNB1), białka zawierającego domenę SET 7 (SET7), kinazy białkowej aktywowanej przez mitogen 5 (MAP3K5), kinazy podobnej do STE20 (JIK), kinazy serynowo-treoninowej oddziałującej z kinazą MAP 1 (MKNK1), przypuszczalnego białka retikulum endoplazmatycznego (RFT1), 5-kinazy typu I, gamma (PIP5K1C), kinazy białkowej aktywowanej przez kinazę MAP 2 (MAPKAPK2), kinazy kinazy MAP 5 (MAP2K5), cyklinozależnej kinazy 6 (CDK6), receptora aktywiny A podobnego do typu II, 1 (ACVRL1), homologu onkogenu wirusa mięśniaka kociego Gardner-Rasheeda (v-fgr) (FGR), hipotetycznego białka FLJ21802 (FLJ21802), receptorowej kinazy tyrozynowej swoistej dla mięśni szkieletowych (MUSK), otwartej ramki odczytu chromosomu 20, 88 (C20orf88), pączkowania niehamowanego przez bezoimidazole 1 (homolog drożdży) (BUB1), rybosomalnej kinazy białkowej S6, 90kD, polipeptyd 5 (RPS6KA5), homologu onkogenu spokrewnionego z wirusem mięsaka Yamaguchi v-yes-1 (LYN), kinazy białkowej aktywowanej przez mitogen, 7 (MAPK7), homologu onkogenu wirusa grasiczaka mysiego v-akt, 1 (AKT1), PAK1 (z włączeniem, np., dowolnej z substancji: kinazy aktywowanej przez P21(CDKN1A) 1, PAKA, P65-PAK, P68-PAK, alfa-PAK, MUK2, PAK1B (kinazy aktywowanej przez p21, 1B), kinazy aktywowanej przez P21/Cdc42/Rac1-1 (spokrewnionej z Ste20), kinazy efektorowej Cdc42/Rac PAK-A, kinazy białkowej MUK2), nsurf, stk12 (z włączeniem, np., kinazy serynowo-treoninowej 12, kinazy związanej z aurorą 2, kinazy podobnej do aurory/IPL1 2, AIK2, ARK2, AIM-1, and AIM1), kinazy regulującej sygnał apoptozy 1 (Ask1), TLK1 (np., numer dostępu NM_012290), NLK (np., numer dostępu NM_016231), GRAF (np., numer dostępu NM_015071), GCK (np., numer dostępu NM_000162), ERK5 (np., numer dostępu NM_002749), FGR (np., numer dostępu NM_005248), ACVRL1 (np., numer dostępu NM_000020), MEKK5 (np., numer dostępu NM_002757), PIP5K1C (np., numer dostępu XM_047620), MAPKAPK2 (np., numer dostępu NM_004759), RFT1 (np., numer dostępu NM_052859), MKNK1 (np., numer dostępu NM_003684), PLXNB1 (np., numer dostępu NM_002673). Dodatkowo, jako przykładowe środki indukujące apoptozę można wymienić związki, które powodują wzrost ekspresji i (lub) stabilności DR5 i DR4, środki, które podwyższają aktywność i (lub) stabilność kaspazy oraz środki, które indukują lub wzmacniają odpowiedź na uszkodzenie DNA. Agoniści lub mimetyki wymienione powyżej obejmują również same produkty genów, na przykład, p53 jest agonistą p53, i również same agonistyczne przeciwciała. Antagoniści obejmują środki, które bezpośrednio hamują aktywność i środki, które niebezpośrednio hamują aktywność poprzez zmniejszanie ekspresji lub stabilności docelowej molekuły mRNA (np. siRNA) lub białka.

Środki indukujące apoptozę, które można zidentyfikować poprzez ukierunkowywanie na produkty genów obejmują związki o różnej naturze chemicznej. Na przykład modulatory tych produktów genów można identyfikować przeglądając biblioteki polipetydów, beta-skrętnych mimetyków, polisacharydów, fosfolipidów, hormonów, prostaglandyn, steroidów, związków aromatycznych, związków heterocyklicznych, benzodiazepin, oligomerycznych N-podstawionych glicyn, oligokarbaminianów, polipeptydów, sacharydów, kwasów tłuszczowych, puryn, pirymidyn, ich pochodnych, analogów strukturalnych lub kombinacji.

W niektórych wykonaniach, środkiem indukującym apoptozę jest polinukleotyd. Na przykład, może to być siRNA ukierunkowane na gen, który hamuje apoptozę indukowaną przez TRAIL (np. UbcH10 lub cząsteczka wymieniona w pierwszej części fig. 27). W innych wykonaniach środkiem indukującym apoptozę jest małocząsteczkowy związek (np. cząsteczka o masie cząsteczkowej mniejszej od 1500 Daltonów, a w niektórych przypadkach mniejsza od 1000 Daltonów). Na przykład, środkiem indukującym apoptozę może być małocząsteczkowy związek, który hamuje ekspresję lub aktywność produktu genu hamującego apoptozę indukowaną przez TRAIL (np. UbcH10 lub cząsteczka wymieniona w pierwszej części fig. 27). Środkiem indukującym apoptozę może być małocząsteczkowy związek, który powoduje zwiększenie ekspresji lub aktywności produktu genu aktywującego apoptozę indukowaną przez TRAIL (np. UbcH10 lub cząsteczki wymienione w dolnej części fig. 27). Sposoby skriningu modulatorów (z włączeniem modulatorów małocząsteczkowych) genu i kodowanego polipeptydu oraz metod wytwarzania siRNA lub innych polinukleotydów o działaniu hamującym znanego genu należą do stanu techniki, zob., np. opisy patentów Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 6 573 099 i 6 506 559; Principles and Practice of High Throughput Screening, K. Murray (ed.), CRC Press

PL 210 174 B1 (2003); High Throughput Screening: Methods and Protocols, W. Janzen (ed.), Humana Press (2002); publikacje PCT międzynarodowych zgłoszeń patentowych WO 95/35503, WO 95/30642 i WO 91/18980; Schultz i in., Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414, 1998; oraz Weller i in., Mol Divers. 3:61-70, 1997. Inne metody, które można zastosować do skriningu modulatorów tych genów i ich produktów ujawniono, na przykład, w Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 3^rd Ed. (2000); oraz Ausubel i in., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999).

W niektórych wykonaniach, środek indukujący apoptozę jest sprzężony z agonistą przeciwciał anty-DR4 lub anty-DR5. W niektórych wykonaniach środek indukujący apoptozę nie jest sprzężony z agonistą przeciwciał anty-DR4 lub anty-DR5.

W niektórych wykonaniach, środek indukujący apoptozę nie jest TNF-alfa, TNF-beta, AIM I, AIM II, ligandem Fas ani VEGI.

1. SMAC

W niektórych wykonaniach, środek indukujący apoptozę jest SMAC/Diablo lub agonistą, bądź mimetykiem SMAC. SMAC/Diablo aktywuje kaspazę poprzez wiązanie białek hamujących apoptozę (lAP), zob., np., Du i in., Cell 102:33-42 (2000); Verhagen i in., Cell 102:43-53, 2000; opis zgłoszenia patentowego USA nr 2002/0110851. Niniejszy wynalazek obejmuje podawanie lub ekspresjonowanie SMAC w komórkach. Fragmenty SMAC, takie jak N-końcowe peptydy SMAC (np. N-końcowe tetra lub heptapeptydy (Guo i in., Blood 99(9):3419-3426 (2002); Srinivasula i in., J. Biol. Chem. 275:36152-36157 (2000)) mogą także być ekspresjonowane lub podawane, zob. także opis zgłoszenia patentowego USA nr 2002/0132786.

Dodatkowo w niniejszym wynalazku mogą być stosowane mimetyki SMAC. Związki te mogą mieć korzystne właściwości farmaceutyczne i mogą być niezwykle efektywne, jeśli podawane z przeciwciałami anty-DR4 lub anty-DR5. Przykładowe mimetyki SMAC obejmują peptydy zawierające tetrapeptyd, który wiąże się do rowków powierzchniowych wewnątrz domeny BIR białka lAP, z włączeniem tetrapeptydów o wzorze

X1X2X3X4, gdzie X1 oznacza A, X2 oznacza V, T, lub I, X3 oznacza P lub A oraz X4 oznacza F, Y,

I lub V, bądź inne peptydy SMAC, agonistów lub peptydomimetyki opisane w publikacji PCT międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 02/26775. Inne przykładowe mimetyki SMAC obejmują LBP672, zob., np., Fig. 15 i Przykład 54.

Inhibitory proteasomu 26S

W niektórych wykonaniach, środkiem indukującym apoptozę jest inhibitor proteasomu 26S. Inhibitory proteasomów to związki hamujące szlak proteasomowo-ubikwitynowy i w ten sposób zapobiegające degradacji IkB i dalszej lokalizacji jądrowej NFkB, partnera IkB. Proteasom ma dwa elementy funkcjonalne: rdzeniową podjednostkę katalityczną 20S i podjednostkę regulacyjną 19S. Podjednostki 20S i 19S tworzą kompleks 26S, który degraduje białka ukierunkowane na degradację poprzez dodatek ubikwityny. Przykładowe inhibitory proteasomów obejmują: PS-341 (nr NSC 681239, zwany także bortezomibem) i ich analogi (zob., np., Adams, Cur. Opin. Chem. Biol. 6:493-500 (2002)). PS-341 i inne inhibitory proteasomów mające zastosowanie według wynalazku opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5,780,454, który włączono tu w charakterze odnośnika.

Inne przykładowe inhibitory proteasomów obejmują: laktacystynę, PS-273 (nr NSC 681226); PS-293 (nr NSC 681227); PS-296 (nr NSC 681228); PS-303 (nr NSC 681229); PS-305 (nr NSC 681231); PS-313 (nr NSC 681234); PS-321 (nr NSC 681236); PS-334 (nr NSC 681237); PS-364 (nr NSC 681242); PS-325 (nr NSC 683086); PS-352 (nr NSC 683094); PS-383 (nr NSC 683098), YU101 (ac-hFLFL-epoksyd) (zob., np., Elofsson, i in., Chem. Biol. 6:811-822 (1999)), MG262, MG132, MG115, PSI (inhibitor proteasomu N-benzyloksykarbonylo-Ile-Glu(O-tert-butylo)-Ala-leucynal). Testy do identyfikacji inhibitorów proteasomu są dostępne na rynku, na przykład z Discoverx (Fremont, CA, USA).

Połączenie inhibitorów proteasomu 26S z agonistami DR4 lub DR5 (np. przeciwciałami anty-DR4 lub anty-DR5 według wynalazku) może być skuteczne w leczeniu hyperproliferacji, a szczególnie może efektywnie działać przeciw komórkom nowotworowym z defektami białka Bax lub innych komponentów apoptozy przebiegającej ścieżką mitochondrialną (np., Bcl-xl lub Bcl-2). Na przykład, komórki guza pacjentów z rakiem okrężnicy mają defekt białka Bax. Z tego też powodu połączenie inhibitora proteasomu 26S z agonistami DR4 lub DR5 powinno być szczególnie skuteczne w leczeniu raka okrężnicy, w przypadku występowania defektu białka Bax lub innych defektów mitochondrialnej ścieżki apoptozy.

PL 210 174 B1

W niektórych wykonaniach, inhibitor proteasomu jest zwią zkiem o wzorze I

gdzie

R1 oznacza niepodstawioną lub podstawioną grupę arylową; aryloalkilokarbonylową, gdzie grupa arylowa jest niepodstawiona lub podstawiona; niepodstawioną lub podstawioną grupę heterocyklilową; lub heterocykliloalkilokarbonylową, gdzie grupa heterocyklilowa jest niepodstawiona lub podstawiona;

R2 oznacza niepodstawioną lub podstawioną grupę arylową lub niepodstawioną lub podstawioną grupę heteroarylową;

R3 oznacza atom wodoru, niepodstawioną lub podstawioną grupę arylową lub alkilową niepodstawioną lub podstawioną niepodstawionym lub podstawionym podstawnikiem cykloalkilowym, niepodstawionym lub podstawionym podstawnikiem arylowym lub niepodstawionym lub podstawionym podstawnikiem heteroarylowym zawierającym przynajmniej jeden atom azotu;

R4 oznacza grupę o wzorze lA,

gdzie A1 i A2 oznaczają grupę hydroksylową lub podstawioną grupę hydroksylową, lub razem z wiążącym atomem boru i dwoma wiążącymi atomami tlenu tworzą pierścień o wzorze IA*,

Ο-W (ΙΑ*) gdzie W oznacza grupę alkilenową, podstawioną grupę alkilenową, niepodstawioną lub podstawioną grupę cykloalkilenową, niepodstawioną lub podstawioną grupę bicykloalkilenową, lub niepodstawioną lub podstawioną grupę tricykloalkilenową;

oraz R5 oznacza niepodstawioną lub podstawioną grupę alkilową, niepodstawioną lub podstawioną grupę arylową, niepodstawioną lub podstawioną grupę heterocyklilową, lub niepodstawioną lub podstawioną grupę cykloalkilową; lub ich sole.

W kontekś cie wzoru I, terminy ogólne używane w niniejszym dokumencie mają następujące znaczenie:

Grupę arylową korzystnie tworzy układ pierścieniowy zawierający maksymalnie 20 atomów węgla, w szczególności nie więcej niż 12 atomów węgla, korzystnie jedno-, dwu- lub trójpierścieniowy, niepodstawiony lub podstawiony, korzystnie w każdym przypadku jest to niepodstawiona lub podstawiona grupa fenylowa lub (w szczególności 1- lub 2-)naftylowa, jeden lub kilka podstawników niezależnie i korzystnie należy do grupy obejmującej rodnik alifatyczny, wolną, eteryfikowaną lub estryfikowaną grupę hydroksylową; wolną, eteryfikowaną lub estryfikowaną grupę karboksylową, formylową; alkanoilową; niepodstawioną, mono- lub di-podstawioną grupę aminową; mercapto; sulfonową; alkilo-tio; karbamoilową; N-alkilo-karbamoilową; N,N-di-alkilo-karbamoilową; fenylową; naftylową; heterocyklilową, w szczególności pirydylową; cyjanową i nitrową, korzystniej jest wybrany z grupy obejmującej grupę alkilową, na przykład metylową, etylową lub propylową; alkoksylową, na przykład metoksylową lub etoksylową; di-podstawioną aminową, na przykład dimetyloaminową; atom fluorowca, na przykład atom chloru lub bromu; grupę fluorowcoalkilową, na przykład trifluorometylową; i fenylową, (w szczególności 1- lub 2-)naftylową, i heterocyklilową, w szczególności jak określono powyżej, w szczególności pirydylową, na przykład 3-, 4- lub w szczególności 2-pirydylową, z których każda jest niepodstawiona lub podstawiona jednym lub kilkoma, w szczególności maksymalnie trzema podstawnikami,

PL 210 174 B1 w szczególności niezależnie wybranymi z innych wymienionych w dokumencie podstawników grupy arylowej. Grupa arylowa R1 jest korzystniej grupą bifenylilową, w szczególności 2-, 4- lub korzystnie 3-bifenylilową, pirydylofenylową, w szczególności 4-, 3- lub zwłaszcza 2-pirydylo-(2-, 4- lub korzystnie 3-)fenylową, lub niższą grupą alkilo-fenylową, w szczególności propylo-fenylową, taką jak 2-, 4- lub w szczególności 3-izopropylofenylową. Grupa aryloalkilokarbonylowa R1 (z niepodstawionym lub korzystnie podstawionym arylem) jest korzystnie grupą arylo-niższą alkilokarbonylową z arylem jak określono powyżej, korzystniej grupą fenylo-niższą alkiloksy-fenylo-niższą alkilokarbonylową, w szczególności 2-, 4- lub korzystnie 3-benzyloksy-fenylo-acetylową lub -propionylową, pirydylo-niższą alkiloksyfenylo-niższą alkilokarbonylową, w szczególności 2-, 4- lub korzystnie 3-(pirydyno-2-, 4- lub korzystnie -3-)acetylową lub -propionylową, lub fenylo-niższą alkilokarbonylową, w szczególności fenylo-2- lub korzystnie 3-fenylo-propionylową lub fenyloacetylową, gdzie fenyl oznacza grupę niepodstawioną lub podstawioną maksymalnie trzema podstawnikami wybranymi niezleżnie z grupy obejmującej niższą grupę alkoksylową, w szczególności metoksylową, atom fluorowca, w szczególności fluoru lub chloru, lub niższą grupę fluorowcoalkilową, taką jak trifluorometylowa. Niepodstawiona lub podstawiona grupa arylowa R2 lub (niezależnie) R3 jest korzystnie mono-, di- lub tripodstawioną grupą fenylową, w szczególności podstawioną maksymalnie czterema podstawnikami wybranymi niezależnie z podstawników wymienionych dla grupy arylowej, w szczególności z podstawników obejmujących grupę hydroksylową, niższą grupę alkoksylową (najbardziej preferowana), korzystnie metoksylową, atom fluorowca, korzystnie fluoru lub chloru, i niższą grupę fluorowco-alkilową, korzystnie trifluorometylową, w szczególności jest grupą fenylową podstawioną maksymalnie trzema niższymi podstawnikami alkoksylowymi, korzystnie metoksylowym, lub w przypadku R3 niepodstawioną grupą fenylową, lub niepodstawioną lub podstawioną grupą naftylową, w szczególności 1- lub 2-naftylową niepodstawioną lub podstawioną maksymalnie czterema podstawnikami wybranymi niezależnie z podstawników wymienionych dla grupy arylowej, w szczególności z podstawników obejmujących grupę hydroksylową, niższą grupę alkoksylową (najbardziej preferowana), korzystnie metoksylową, atom fluorowca, korzystnie fluoru lub chloru i niższą grupę fluorowco-alkilową, korzystnie trifluorometylową.

Niepodstawioną grupą heterocyklilową jest korzystnie rodnik heterocykliczny o nienasyconym, nasyconym lub częściowo nasyconym pierścieniu korzystnie jest to grupa jednopierścieniowa lub w szerszym znaczeniu dwupierścieniowa lub trójpierścieniowa; w pierścieniu ma od 3 do 24 atomów, korzystniej od 4 do 16; gdzie przynajmniej w pierścieniu wiążącym do rodnika cząsteczki o wzorze I jeden lub kilka, korzystnie jeden do czterech, w szczególności jeden lub dwa atomy węgla odpowiedniego podstawnika arylowego są podstawione heteroatomem wybranym z atomów obejmujących azot, tlen i siarkę, a pierścień wiążący korzystnie ma od 4 do 12, w szczególności od 5 do 7 atomów; heteroaryl jest niepodstawiony lub podstawiony jednym lub kilkoma, w szczególności 1 do 3, podstawnikami wybranymi niezależnie ze zdefiniowanych wcześniej podstawników podstawionej grupy arylowej; i w szczególności jest podstawnikiem heteroarylowym wybranym z grupy obejmującej grupę imidazolilową, tienylową, furylową, tetrahydrofurylową, piranylową, tiantrenylową, izobenzofuranylową, benzofuranylową, chromenylową, 2H-pirolilową, pirolilową, pirolinylową, pirolidynylową, imidazolilową, imidazolidynylową, benzimidazolilową, pirazolilową, pirazolidynylową, piranoilową, tiazolilową, izotiazolilową, oksazolilową, izoksazolilową, pirydylową, pirazynylową, pirymidynylową, piperydylową, piperazynylową, pirydazynylową, morfolinylową, tiomorfolinylową, indolizynylową, izoindolilową, 3H-indolilową, indolilową, indazolilową, triazolilową, tetrazolilową, purynylową, 4H-chinolizynylową, izochinolilową, chinolilową, tetrahydrochinolilową, tetrahydroizochinolilową, dekahydrochinolilową, oktahydroizochinolilową, benzofuranylową, benzotiofenylową, ftalazynylową, naftyrydynylową, chinoksalilową, chinazolinylową, chinazolinylową, cynolinylową, pterydynylową, karbazolilową, β-karbolinylową, fenantrydynylową, akrydynylową, perymidynylową, fenantrolinylową, furazanylową, fenazynylową, fenotiazynylową, fenoksazynylową, izochromanylową i chromanylową, a każda z nich jest niepodstawiona lub podstawiona jednym lub dwoma podstawnikami wybranymi z grupy obejmującej niższą grupę alkilową, w szczególności metylową lub tert-butylową, niższą grupę alkoksylową, w szczególności metoksylową, i atom fluorowca, w szczególności bromu lub chloru; szczególnie preferowana jest grupa pirydylowa, w szczególności 2- lub 3-pirydylowa, lub indolilowa, w szerszym aspekcie niższa grupa alkilopirydylowa, pirymidynylowa lub niższa grupa alkilopirymidynylowa, niższa grupa fluorowcoalkilopirydylowa, niższa grupa alkoksy-pirydylowa, niższa grupa di-alkilo-pirydylowa, lub fluorowco-pirydylowa. Grupa heterocyklilowa oznacza niepodstawioną lub podstawioną jednym lub kilkoma, korzystnie maksymalnie trzema, podstawnikami wybranymi niezależnie z tych wymienionych wyżej dla grupy arylowej (gdzie heterocyklilo jako podstawnik grupy heterocyklilowej nie ma dalszych podstawPL 210 174 B1 ników heterocyklilowych, innych niż pirydyl lub indolil) i z określonych powyżej grup arylowych, a w szczególnoś ci preferowana jest grupa fenylowa i te wymienione jako preferowane. Preferowana jest niepodstawiona grupa heterocyklilowa.

W grupie heterocykliloalkilokarbonylowej R1, grupa heterocyklilowa jest korzystnie podstawioną lub w szczególności niepodstawioną grupą heterocyklilową jak wskazano powyżej; preferowana jest podstawiona lub korzystnie niepodstawiona grupa heterocyklilo-niższa alkilowa, w szczególności z koń cową podstawioną lub korzystnie niepodstawioną grupą heterocyklilową , gdzie grupa heterocyklilowa jest taka, jak opisano wcześniej; preferowana jest grupa pirydylo-niższa alkilokarbonylowa, taka jak -acetylowa lub -propionylowa.

Jako R1 preferowana jest niepodstawiona lub podstawiona grupa arylowa lub podstawiona grupa arylo-niższa alkilokarbonylowa.

Grupa heteroarylowa R2 korzystnie jest niepodstawioną lub podstawioną grupą heteroarylową jak wskazano wyżej, w szczególności grupą indolilową niepodstawioną lub podstawioną jednym lub kilkoma, w szczególności maksymalnie trzema, podstawnikami wybranymi niezależnie z tych wymienionych powyżej dla podstawionej grupy arylowej, w szczególności grupą hydroksylową, niższą grupą alkoksylową (najbardziej preferowana), korzystnie metoksylową, atomem fluorowca, korzystnie fluoru lub chloru, i niższą grupą fluorowco-alkilową, korzystnie trifluorometylową.

R2 korzystnie jest podstawioną grupą arylową.

Podstawnik alifatyczny korzystnie zawiera maksymalnie 12 atomów węgla, korzystnie do 7 atomów węgla, najkorzystniej do 4 atomów węgla, i jest alifatycznym podstawnikiem węglowodorowym, takim jak niepodstawiony lub podstawiony alkinyl, alkenyl lub korzystnie alkil, korzystniej jest niższą grupą alkilową, w szczególności metylową, etylową, n-propylową, izo-propylową, n-butylową, sec-butylową, izo-butylową lub tert-butylową.

Grupa alkilowa, która może być rozgałęziona lub prostołańcuchowa, korzystnie zawiera maksymalnie 12 atomów węgla, i korzystnie jest niższą grupą alkilową. Grupa alkilowa R3 korzystnie jest niższą grupą alkilową, w szczególności izobutylową.

Określenie „niższa oznacza grupę zawierającą maksymalnie 7, korzystnie do 4, atomów węgla.

Niższa grupa alkilowa jest korzystnie grupą n-propylową, izopropylową, n-butylową, izobutylową, sec-butylową, tert-butylową, n-pentylową, izopentylową, neopentylową, n-heksylową lub n-heptylową, korzystnie izobutylową, sec-butylową, tert-butylową, izopropylową, etylową lub metylową, najkorzystniej izopropylową, etylową lub metylową.

Eteryfikowana grupa hydroksylowa jest, na przykład, grupą alkoksylową, w szczególności niższą grupą alkoksylową, taką jak etoksylowa lub metoksylowa, aryloksylową, w szczególności fenyloksylową, grupą arylo-niższą alkoksylową, w szczególności fenylo-niższą alkoksylową, heterocykliloksylową, w szczególności pirydyloksylową, lub heterocyklilo-niższą alkoksylową, w szczególności pirydylo-niższą alkoksylową (podstawniki arylowy i heterocyklilowy korzystnie mają znaczenie podane powyżej).

Estryfikowana grupa hydroksylowa korzystnie jest grupą hydroksylową estryfikowaną organicznym kwasem karboksylowym, takim jak kwas alkanokarboksylowy, na przykład jest to niższa grupa alkanoiloksylowa.

Estryfikowana grupa karboksylowa jest, na przykład, grupą alkoksykarbonylową, w szczególności niższą grupą alkoksykarbonylową, taką jak na przykład metoksykarbonylowa.

Mono- lub di-podstawiona grupa aminowa jest, korzystnie, grupą N-alkiloaminową lub N,N-dialkiloaminową, w szczególności niższą grupą N-alkiloaminową lub niższą grupą N,N-dialkiloaminową, taką jak grupa N-metyloaminowa lub N,N-dimetyloaminowa.

Fluorowiec jest atomem fluoru, chloru, bromu lub jodu, korzystnie fluoru, chloru lub bromu.

Niepodstawiona lub podstawiona grupa cykloalkilowa korzystnie zawiera w pierścieniu maksymalnie 12, korzystniej od 3 do 8 atomów i jest podstawiona jednym lub kilkoma, w szczególności maksymalnie trzema, podstawnikami wybranymi niezależnie z tych wymienionych dla podstawionej grupy arylowej, lub korzystnie jest niepodstawiona. Preferowana jest grupa cyklopentylowa, cykloheksylowa lub cykloheptylowa.

W grupie alkilowej R3 podstawionej niepodstawioną lub podstawioną grupą cykloalkilową, alkil korzystnie jest taki, jak określono wcześniej, korzystniej jest niższą grupą alkilową, w szczególności izopropylową, i jest (korzystnie na końcu) podstawiony podstawnikiem cykloalkilowym określonym wcześniej.

PL 210 174 B1

W grupie alkilowej R3 podstawionej niepodstawioną lub podstawioną grupą arylową, alkil korzystnie jest taki, jak określono w poprzednim paragrafie i aryl jest taki, jak określono powyżej i jest podstawiony jednym lub kilkoma, w szczególności maksymalnie trzema, podstawnikami wybranymi niezależnie z tych wymienionych dla podstawionej grupy arylowej, lub jest niepodstawiony; w szczególności aryl jest grupą fenylową podstawioną jednym lub kilkoma, w szczególności maksymalnie trzema, podstawnikami wybranymi niezależnie z grupy obejmującej atom fluorowca, w szczególności atom fluoru, grupę hydroksylową lub niższą grupą alkoksylową, w szczególności metoksylową, lub jest to niepodstawiony fenyl.

W grupie alkilowej R3 podstawionej niepodstawioną lub podstawioną grupą heterocyklilową, alkil korzystnie jest jaki, jak zdefiniowano dla grupy alkilowej R3 podstawionej podstawnikiem cykloalkilowym, a grupa heterocyklilowa jest taka, jak zdefiniowano powyżej i jest podstawiona jednym lub kilkoma, w szczególności maksymalnie trzema, podstawnikami wybranymi niezależnie z tych wymienionych dla podstawionej grupy heterocyklilowej, lub jest niepodstawiona.

Jeśli A1 i A2 są podstawionymi grupami hydroksylowymi, to podstawiona grupa hydroksylowa korzystnie jest grupą alkiloksylową, w szczególności niższą grupą alkiloksylową, aryloksylową, w szczególności z niepodstawionym lub podstawionym podstawnikiem arylowym jak określono powyżej, lub grupą cykloalkiloksylową z niepodstawionym lub podstawionym podstawnikiem cykloalkilowym jak określono powyżej.

Jeśli A1 i A2 razem z wiążącym atomem boru i atomami tlenu tworzą pierścień o pokazanym wyżej wzorze lA*, wówczas W korzystnie stanowi połączenie dwóch atomów tlenu związanych z atomem boru poprzez dwa różne atomy węgla, które przestrzennie są bliskimi lub sąsiadującymi atomami węgla, w szczególności w pozycji sąsiedniej („1,2-) lub „1,3 w stosunku do siebie.

Grupa alkilenowa jest korzystnie nierozgałęzioną grupą C2-C12-, korzystnie grupą C2-C7 alkilenową, na przykład etylenową, lub propylenową, w szerszym aspekcie butylenową, pentylenową lub heksylenową, związana poprzez dwa różne atomy węgla jak opisano powyżej, korzystnie sąsiednie lub położone w pozycji „1,3. Jeden lub kilka, w szczególności jeden z atomów węgla niezwiązanych z atomami tlenu połączonych z atomem boru, może być wymieniony na heteroatom wybrany z atomów obejmujących O, S lub korzystnie N (związanych z odpowiednią liczbą atomów wodoru), na przykład w grupie 1,5-(3-azapentylenowej).

Podstawioną grupą alkilenową korzystnie jest nierozgałęziona niższa grupa alkilowa jak określono powyżej, podstawiona lub niepodstawiona jednym lub kilkoma, w szczególności maksymalnie trzema, podstawnikami korzystnie wybranymi niezależnie z grupy obejmującej niższą grupę alkilową, taką jak metylowa lub etylowa, na przykład w grupie 1-metyloetylenowej, 1,2-dimetyloetylenowej, hydroksylową, na przykład w grupie 2-hydroksypropylenowej, lub niższą grupą hydroksy-alkilową, taką jak hydroksymetylowa, na przykład w grupie 1-hydroksymetylo-etylenowej.

Niepodstawiona lub podstawiona grupa cykloalkilenowa korzystnie jest grupą C3-C12-, korzystniej C3-C8-cykloalkilenową związaną poprzez dwa różne atomy węgla jak opisano dla W, korzystnie sąsiednie lub w pozycji „1,3, taką jak grupa cykloheksylenowa lub cyklopentylenowa, w której jeden lub kilka, w szczególności jeden z atomów węgla niezwiązanych z atomami tlenu połączonymi z atomem boru może zostać wymieniony na heteroatom wybrany z atomów obejmujących O, S lub N (związanych z odpowiednią liczbą atomów wodoru), na przykład w grupie tetrahydrofurylenowej lub tetrahydropiranylenowej, i może być niepodstawiona lub podstawiona jednym lub kilkoma, w szczególności maksymalnie trzema podstawnikami wybranymi niezależnie z grupy obejmującej niższą grupę alkilową, taką jak metylowa lub etylowa, hydroksylową, niższą grupę hydroksy-alkilową, taką jak metoksylowa, lub mono-, lub oligosacharydylową związaną poprzez atom tlenu (grupa „oligosacharydylowa korzystnie składa się z maksymalnie pięciu podstawników sacharydylowych).

Niepodstawiona lub podstawiona grupa bicykloalkilenowa korzystnie jest grupą C5-C12-bicykloalkilenową związaną poprzez dwa różne atomy węgla jak opisano dla W, korzystnie sąsiednie lub w pozycji „1,3, taką jak grupa cykloheksylenowa lub cyklopentylenowa, w której jeden lub kilka, w szczególności jeden z atomów węgla niezwiązanych z atomami tlenu połączonymi z atomem boru może zostać wymieniony na heteroatom wybrany z atomów obejmujących O, S lub N (związanych z odpowiednią liczbą atomów wodoru), i może być niepodstawiona lub podstawiona jednym lub kilkoma, w szczególności maksymalnie trzema podstawnikami wybranymi niezależnie z grupy obejmującej niższą grupą alkilową, taką jak metylowa lub etylowa, hydroksylową i niższą grupę hydroksy-alkilową, taką jak metoksylowa. Preferowana jest grupa pinanylenowa (2,3-(2,6,6-trimetylo-bicyklo[3.1.1]heptan)).

PL 210 174 B1

Niepodstawiona lub podstawiona grupa tricykloalkilenowa korzystnie jest grupą C8-C12-tricykloalkilenową związaną poprzez dwa różne atomy węgla jak opisano dla W, korzystnie sąsiednie lub w pozycji „1,3, taką jak grupa cykloheksylenowa lub cyklopentylenowa, w której jeden lub kilka, w szczególności jeden z atomów węgla niezwiązanych z atomami tlenu połączonymi z atomem boru może zostać wymieniony na heteroatom wybrany z atomów obejmujących O, S lub N (związanych z odpowiednią liczbą atomów wodoru), i może być niepodstawiona lub podstawiona jednym lub kilkoma, w szczególności maksymalnie trzema podstawnikami wybranymi niezależnie z grupy obejmującej niższą grupą alkilową, taką jak metylowa lub etylowa, hydroksylową i niższą grupę hydroksy-alkilową, taką jak metoksylowa.

Najkorzystniej, R4 oznacza -B(OH)2 lub grupę 2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6.1.1.0^2,6]dec-4-ylową, w szczególności (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6.1.1.0^2,6]dec-4-ylową.

W niepodstawionej lub podstawionej grupie alkilowej R5 alkil, który może być rozgałęziony lub prostołańcuchowy, korzystnie zawiera maksymalnie 12 atomów węgla i korzystnie jest to niższa grupa alkilowa. Alkil R5 korzystnie jest niższą grupą alkilową, w szczególności izopropylową. Podstawniki obecne w liczbie jednego lub kilku, w szczególności maksymalnie dwóch, wybiera się niezależnie z grupy obejmującej niepodstawioną lub podstawioną grupę arylową (w szczególności fenylową lub hydroksyfenylową), niepodstawioną lub podstawioną grupę heterocyklilową (w szczególności imidazolilową lub indolilową), niepodstawioną lub podstawioną grupę cykloalkilową, każda jak zdefiniowano powyżej; hydroksylową (preferowana), karboksylową (preferowana), karbamoilową, mercapto, niższą grupę alkilo-tio, na przykład metyltio, fenylową, hydroksyfenylową, indolilową, imidazolilową, aminową, niższą grupę tri-alkiloaminową, na przykład trimetyloaminową, niższą grupę alkanoiloaminową, na przykład acetyloaminową, guanidynową, niższą grupę N-alkiloguanidynową, na przykład N-metyloguanidynową, lub dowolną inną grupą aminokwasu zawierającego R5. Korzystnie, R5 może być grupą metylową, izopropylową, izobutylową, sec-butylową, merkaptometylową, 2-metylotioetylową, fenylometylową, hydroksyfenylometylową, indol-3-ilometylową, hydroksymetyIową, 1-hydroksyetylową, 2-hydroksyetylową, karbamoilometyIową, 2-karbamoiloetylową, 4-aminobutylową, 3-guanidynopropylową, 5-imidazolilometylową, karboksymetylową lub 2-karboksyetylową.

Asymetryczne atomy węgla związku o wzorze I mogą występować w konfiguracji (R), (S) lub (R,S), w konfiguracji (R) lub (S), najkorzystniej w konfiguracji wskazanej w zamieszczonym poniżej wzorze I*. Podstawniki przy wiązaniach podwójnych lub w pierścieniu mogą występować w położeniu cis- (= Z-) lub trans (= E-). Zatem związki mogą być mieszaninami izomerów lub korzystnie czystymi izomerami.

Grupy tworzące sole w związku o wzorze I są grupami lub rodnikami o właściwościach zasadowych lub kwasowych. Związki zawierające przynajmniej jedną grupę zasadową lub przynajmniej jeden rodnik zasadowy, na przykład grupę aminową, drugorzędową grupę aminową nietworzącą wiązania peptydowego lub rodnik pirydylowy, mogą tworzyć sole addycyjne z kwasami, na przykład z kwasami nieorganicznymi, takimi jak kwas solny, siarkowy lub fosforowy, lub odpowiednimi organicznymi kwasami karboksylowymi lub sulfonowymi, na przykład alifatycznymi kwasami mono- lub di-karboksylowymi, takimi jak kwas trifluorooctowy, octowy, propionowy, glikolowy, bursztynowy, maleinowy, fumarowy, hydroksymaleinowy, maleinowy, winowy, cytrynowy lub szczawiowy, lub aminokwasami takimi jak arginina lub lizyna, aromatycznymi kwasami karboksylowymi, takimi jak kwas benzoesowy, 2-fenoksy-bezoesowy, 2-acetoksy-bezoesowy, salicylowy, 4-aminosalicylowy, aromatyczno-alifatycznymi kwasami karboksylowymi, takimi jak kwas migdałowy lub cynamonowy, heteroaromatycznymi kwasami karboksylowymi, takimi jak kwas nikotynowy lub izonikotynowy, alifatycznymi kwasami sulfonowymi, takimi jak kwas metano-, etano- lub 2-hydroksyetanosulfonowy, lub aromatycznymi kwasami sulfonowymi, takimi jak kwas benzeno-, p-tolueno- lub naftaleno-2-sulfonowy. W przypadku obecności kilku grup zasadowych mogą tworzyć się sole addycyjne z jednym lub kilkoma kwasami.

Związki o wzorze I mające grupy kwasowe, na przykład grupę wolnego kwasu boronowego (-B(OH)2, co oznacza, że we wzorze lA* A1 i A2 są grupami hydroksylowymi) lub grupę karboksylową, mogą tworzyć sole z metalami lub sole amoniowe, takie jak sole metali alkalicznych lub sole metali ziem rzadkich, na przykład sole sodowe, potasowe, magnezowe lub wapniowe, bądź amoniowe z amoniakiem lub odpowiednimi aminami organicznymi, takimi jak trzeciorzędowe monoaminy, na przykład trietyloamina lub tri-(2-hydroksyetylo)-amina, lub z heterocyklicznymi zasadami, na przykład z N-etylo-piperydiną lub N,N'-dimetylopiperazyną. Możliwe są mieszaniny soli.

Związki o wzorze I mające zarówno grupy kwasowe, jak i zasadowe mogą tworzyć sole wewnętrzne.

PL 210 174 B1

Przykładowe związki o wzorze I obejmują te, w których

R1 oznacza podstawioną grupę arylo-niższą alkilokarbonylową lub niepodstawioną, bądź podstawioną grupę arylową,

R2 oznacza podstawioną grupę arylową lub niepodstawioną, bądź podstawioną grupę heterocyklilową,

R3 oznacza niższą grupę alkilową, niepodstawioną lub podstawioną grupę arylową, lub niższą grupę alkilową podstawioną niepodstawioną lub podstawioną grupą arylową,

R4 jest grupą o wzorze lA podanym wyżej, gdzie A1 i A2 oznaczają grupę hydroksylową, niższą grupę alkiloksylową, aryloksylową z niepodstawioną lub podstawioną grupą arylową lub cykloalkiloksylową z niepodstawioną lub podstawioną grupą cykloalkilową, lub gdzie A1 i A2 razem z wiążącym atomem boru i dwoma wiążącymi atomami tlenu tworzą pierścień o podanym wyżej wzorze lA*, gdzie W oznacza niepodstawioną lub podstawioną niższą grupę alkilenową związaną poprzez dwa różne atomy węgla, które są przestrzennie ułożone blisko siebie lub sąsiadują ze sobą, w szczególności sąsiadują ze sobą lub znajdują się w stosunku do siebie w pozycji „1,3 oraz

R5 oznacza niższą grupę alkilową, lub jej sole.

Przykładowe związki o wzorze I obejmują te, w których

R1 oznacza grupę fenyloksyfenylo-niższą alkilokarbonylową; grupę fenylo-niższą alkoksyfenylo-niższą alkilokarbonylową; pirydyloksyfenylo-niższą alkilokarbonylową; fenylo-niższą alkiloalkilokarbonylową podstawioną niższą grupą alkoksylową, w szczególności metoksylową, atomem fluorowca, w szczególności atomem fluoru lub chloru, lub niższą grupą fluorowcoalkilową, w szczególności trifluorometylową; lub korzystnie niepodstawioną lub podstawioną grupę fenylową lub naftylową, gdzie w obu przypadkach podstawniki, jeśli są obecne, są niezależnie jednym lub kilkoma, w szczególności jednym do trzech podstawników wybranych z grupy obejmującej niższą grupę alkilową, hydroksylową, niższą grupę alkoksylową, niższą grupę alkanoiloksylową, karboksylową, niższą grupę alkoksykarbonylową, formylową, niższą grupę alkanoilową, aminową, niższą grupę N-alkiloaminową, niższą grupę N,N-di-alkiloaminową, merkapto, sulfonową, niższą grupę alkilo-tio, karbamoilową, niższą grupę N-alkilo-karbamoilową; niższą grupę N,N-di-alkilo-karbamoilową, fenylową, naftylową, pirydylową, cyjanową i nitrową, korzystniej niższą grupę alkoksylową, w szczególności metoksylową lub etoksylową;

R2 jest grupą fenylową podstawioną jednym lub kilkoma, w szczególności jednym do trzech podstawników wybranych niezależnie z grupy obejmującej grupę hydroksylową, niższą grupę alkoksylową, w szczególności metoksylową, atom fluorowca, w szczególności atom fluoru lub chloru, i niższą grupę fluorowco-alkilową, w szczególności trifluorometylową;

R3 jest niższą grupą alkilową, w szczególności izobutylową, fenylową lub fenylową podstawioną jednym lub kilkoma, w szczególności maksymalnie trzema podstawnikami wybranymi niezależnie z grupy obejmującej grupę hydroksylową, niższą grupę alkoksylową, w szczególności metoksylową, atom fluorowca, w szczególności atom fluoru lub chloru i niższą grupę fluorowco-alkilową, w szczególności trifluorometylową;

R4 oznacza grupę -B(OH)2 (szczególnie preferowana) lub grupę 2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6.1.1.0^2,6]dec-4-ylową, w szczególności (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6.1.1.0^2,6]dec-4-ylową; oraz

R5 oznacza niższą grupą alkilową, w szczególności izopropylową; lub ich sole.

Przykładowe związki o wzorze I obejmują te, w których

R1 oznacza grupę fenyloksyfenyloacetylową, benzyloksyfenyloacetylową, pirydyloksyfenyloacetylową, bifenylilową, pirydylofenylową, niższą grupę alkilofenylową lub podstawioną grupę fenylopropionyloksylową, gdzie podstawniki grupy fenylowej są maksymalnie trzema podstawnikami wybranymi niezależnie z grupy obejmującej grupę metoksylową, atom fluoru, chloru i grupę trifluorometylową;

R2 oznacza grupę fenylową podstawioną maksymalnie trzema podstawnikami metoksylowymi, w szczególności grupę 2,3,4-trimetoksyfenylową lub 3,4,5-trimetoksyfenylową;

R3 oznacza grupę izobutylową lub fenylową niepodstawioną lub podstawioną maksymalnie trzema podstawnikami wybranymi niezależnie z grupy obejmującej grupę hydroksylową, atom fluoru i grupę metoksylową ;

R4 oznacza grupę (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6.1.1.0^2,6]dec-4-ylową lub w szczególności grupę -B(OH)2; oraz

R5 oznacza grupę izopropylową; lub ich sole.

Przykładowe związki o wzorze I obejmują te, w których

PL 210 174 B1

R1 oznacza grupę bifenylilową, niższą grupę alkilo-fenylową, niższą grupę fenylo-alkilo-karbonylową, niższą grupę fenoksy-fenylo-alkilo-karbonylową, grupę fenylo-niższą alkoksy-fenylo-niższą alkilo-karbonylową lub grupę pirydylo-fenylową;

R2 oznacza grupę fenylową podstawioną 1 do 3 niższych podstawników alkoksylowych lub niższą grupę fenylo-alkoksy-fenylową;

R3 oznacza niższą grupę alkilową lub niższą grupę fenylo-alkilową;

R4 oznacza grupę 4,4,5,5-tetrametylo-[1,3,2]dioksaborolan-2-ylową, (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6.1.1.0^2,6]dec-4-ylową lub -B(OH)2; oraz

R5 oznacza niższą grupę akilową; lub ich sole.

Inne przykładowe związki o wzorze I lub ich sole obejmują te o konfiguracji wskazanej wzorem I*

gdzie pokazana konfiguracja reprezentuje konfigurację absolutną i gdzie R1, R2, R3, R4 oraz R5 mają znaczenie takie, jak zdefiniowano dla związku o wzorze I, w szczególności znaczenie wskazane jako preferowane.

Inne przykładowe związki o wzorze I lub ich sole obejmują te o konfiguracji wskazanej wzorem I**

gdzie pokazana konfiguracja reprezentuje konfigurację absolutną i gdzie R1, R2, R3, R4 mają znaczenie takie, jak zdefiniowano dla związku o wzorze I, w szczególności znaczenie wskazane jako preferowane.

Inne przykładowe związki o wzorze I lub ich sole obejmują te o konfiguracji wskazanej wzorem I***

gdzie pokazana konfiguracja reprezentuje konfigurację absolutną i gdzie R1, R2, R3, R4 mają znaczenie takie, jak zdefiniowano dla związku o wzorze I, w szczególności znaczenie wskazane jako preferowane.

Najbardziej preferowane są te związki o wzorze I, które opisano w przykładach, lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.

Związki o wzorze I lub ich sole otrzymuje się znanymi sposobami. Proces korzystnie obejmuje: a) poddawanie reakcji analogu dipeptydu o wzorze II,

PL 210 174 B1

gdzie R3, R4 i R5 mają znaczenie takie, jak zdefiniowano dla związku I, z aminokwasem o wzorze III,

lub jego reaktywną pochodną, gdzie R1 i R2 mają znaczenie takie, jak zdefiniowano dla związku o wzorze I, a grupy funkcyjne obecne w związku o wzorze II i/lub III, za wyjątkiem grup biorących udział w reakcji, jeśli jest to konieczne są osłaniane przez łatwe do usunięcia grupy osłaniające, i wszystkie grupy os łaniające są usuwane, lub

b) w celu otrzymania związku o wzorze I, gdzie R1 jest grupą aryloalkilokarbonylową lub heterocykliloalkilokarbonylową i inne grupy R2 do R5 mają znaczenie takie, jak zdefiniowano dla związku I, poddaje się reakcji związek aminowy o wzorze IV,

gdzie R2, R3, R4 i R5 mają znaczenie takie, jak zdefiniowano dla związku I, z podstawionym kwasem węglowym o wzorze V,

lub jego reaktywną pochodną, gdzie R1 jest grupą aryloalkilokarbonylową lub heterocykliloaIkilokarbonyIową, grupy funkcyjne obecne w związku o wzorze IV i/lub V, za wyjątkiem grup biorących udział w reakcji, jeśli jest to konieczne są osłaniane przez łatwe do usunięcia grupy osłaniające, i wszystkie grupy osłaniające są usuwane, oraz, jeśli jest to pożądane, przekształcanie związku o wzorze I otrzymanego w wyniku procesu a) lub b) w inny związek o wzorze I, przekształcanie otrzymanego wolnego związku o wzorze I w sól, przekształcanie otrzymanej soli związku o wzorze I w inną sól lub do postaci wolnego związku, i (lub) rozdzielanie mieszaniny izomerycznych związków o wzorze I na pojedyncze izomery.

Różne możliwe stereoizomery związku o wzorze I mogą być otrzymywane przy użyciu wydzielonych substancji o odpowiedniej konfiguracji. Na przykład, związki o wzorze I* lub ich sole mogą być otrzymywane poprzez

a) poddawanie reakcji analogu dipeptydu o wzorze II*,

PL 210 174 B1 gdzie R3, R4 i R5 mają znaczenie takie, jak zdefiniowano dla związku I, z aminokwasem o wzorze III*

lub jego reaktywną pochodną, gdzie R1 i R2 mają znaczenie takie, jak zdefiniowano dla związku I, grupy funkcyjne obecne w związku o wzorze II* i (lub) III*, za wyjątkiem grup biorących udział w reakcji, jeśli jest to konieczne są osłaniane przez łatwe do usunięcia grupy osłaniające, i wszystkie grupy osłaniające są usuwane, lub

b) w celu otrzymania związku o wzorze I* gdzie R1 jest grupą aryloalkilokarbonylową lub heterocykliloalkilokarbonylową i inne grupy R2 do R5 mają znaczenie takie, jak zdefiniowano dla związku I, poddawanie reakcji związku aminowego o wzorze IV*,

gdzie R2, R3, R4 i R5 mają znaczenie takie, jak zdefiniowano dla związku I, z podstawionym kwasem węglowym o wzorze V,

(V) lub jego reaktywną pochodną, gdzie R1 jest grupą aryloalkilokarbonylową lub heterocykliloalkilokarbonylową, grupy funkcyjne obecne w związku o wzorze IV* i (lub) V, za wyjątkiem grup biorących udział w reakcji, jeśli jest to konieczne są osłaniane przez łatwe do usunięcia grupy osłaniające, i wszystkie grupy osłaniające są usuwane, oraz, jeśli jest to pożądane, przekształcanie związku o wzorze I* otrzymanego w wyniku procesu a) lub b) w inny zwią zek o wzorze I*, przekształ canie otrzymanego wolnego związku o wzorze I* w sól, przekształcanie otrzymanej soli związku o wzorze I* w inną sól lub do postaci wolnego związku.

Produkty końcowe o wzorze I mogą zawierać podstawniki używane jako grupy osłaniające w związkach wyjściowych w celu otrzymania innych produktów końcowych o wzorze I, na przykład w przypadku grupy R4, związku o grupie innej niż -B(OH)2. Zatem, w kontekście niniejszego wynalazku, jedynie łatwa do usunięcia grupa, która nie jest częścią składową określonego pożądanego produktu końcowego o wzorze I może być „grupą osłaniającą, jeśli nie wskazano inaczej.

Osłanianie grup funkcyjnych przez grupy osłaniające tego typu, same grupy osłaniające i rekacje odbezpieczania opisano w pracach takich jak J. F. W. McOmie, „Protective Groups in Lubganic Chemistry, Plenum Press, London and New Ylubk 1973, w T. W. Greene and P. G. M. Wuts, „Protective Groups in Lubganic Synthesis, wyd. 3, Wiley, New Ylubk 1999, w „The Peptides; tom 3 (ed.: E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, London and New Ylubk 1981, w „Methoden der lubganischen Chemie' (Methods of Lubganic Chemistry), Houben Weylową, wyd. 4, tom 15/1, Gelubg

Thieme Verlag, Stuttgart 1974, w H.-D. Jakubke and H. Jescheit, „Aminosauren, Peptide, Proteine (Amino acids, Peptides, Proteins), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982, and in Jochen Lehmann, „Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate (Chemistry of Carbohydrates: Monosaccharides and Derivatives), Gelubg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.

Grupy osłaniające charakteryzują się tym, że mogą być w prosty sposób usuwane (tj. nie występują niepożądane reakcje wtórne) na przykład poprzez solwolizę, redukcję, fotolizę lub alternatywnie w warunkach fizjologicznych (na przykład poprzez odszczepienie enzymatyczne).

PL 210 174 B1

Grupę osłaniającą grupę -B(OH)2- (w celu otrzymania związku o wzorze I, gdzie R4 oznacza -B(OH)2) korzystnie usuwa się przy użyciu kwasu, na przykład kwasu solnego, w odpowiednim rozpuszczalniku, na przykład niższym alkanolu, takim jak metanol, lub niższym alkanie, takim jak heksan, lub ich mieszaninie, w temperaturze od 0 do 50°C, na przykład w temperaturze pokojowej.

W celu syntezy inhibitorów proteasomu o wzorze I można zastosować przynajmniej dwie metody. W metodzie „a, reakcję przeprowadza się rozpuszczając związki o wzorze II i III w odpowiednim rozpuszczalniku, na przykład N,N-dimetyloformamidzie, N,N-dimetyloacetamidzie, N-metylo-2-pirolidonie, chlorku metylenu, lub mieszaninie dwóch lub kilku rozpuszczalników, i dodając odpowiedniej zasady, na przykład trietyloaminy, diizopropyloetyloaminy (DIEA) lub N-metylomorfoliny i odpowiedniego czynnika sprzęgającego tworzącego in situ preferowaną reaktywną pochodną kwasu węglowego o wzorze III, na przykład może to być dicykloheksylokarbodiimid/1-hydroksybenzotriazol (DCC/HOBT); tetrafluoroboran O-(1,2-dihydro-2-okso-1-pirydylo)-N,N,N',N'-tetrametylouronium (TPTU); tetrafluoroboran O-benzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetrametylouronium (TBTU); lub fluorowodorek 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (EDC). W celu zasięgnięcia informacji na temat innych możliwych środków sprzęgających, zob. na przykład Klauser; Bodansky, Synthesis 1972, 453-463. W celu otrzymania związku o wzorze I mieszaninę reakcyjną korzystnie miesza się w temperaturze pomiędzy około -20 i 50°C, w szczególności między 0°C i temperaturą pokojową. Reakcję korzystnie przeprowadza się w atmosferze inertnego gazu, na przykład azotu lub argonu.

W metodzie „b reakcję korzystnie przeprowadza się w warunkach analogicznych do tych opisanych dla metody a).

Sole związku o wzorze I z grupami tworzącymi sole można otrzymywać znanymi sposobami. Sole addycyjne związków o wzorze I z kwasami można zatem otrzymać działając kwasem lub środkiem wymieniającym aniony.

Sole można zazwyczaj przekształcić w wolne związki, na przykład działając na nie odpowiednim środkiem zasadowym, na przykład węglanami, wodorowęglanami lub wodorotlenkami metali alkalicznych, typowo węglanem sodu lub potasu.

Mieszaniny stereoizomerów, na przykład mieszaniny diastereoizomerów, można rozdzielić do odpowiednich izomerów znanym sposobem stosując odpowiednią technikę rozdzielania. Mieszaniny diastereoizomerów na przykład można rozdzielić na pojedyncze diastereoizomery metodą krystalizacji frakcyjnej, chromatografii, rozdziału między rozpuszczalniki i innymi podobnymi metodami. Mieszaniny można rozdzielać na etapie związków wyjściowych lub związku o wzorze I. Enancjomery można rozdzielać poprzez wytwarzanie soli diastereoizomerycznych, na przykład poprzez tworzenie soli z enancjomerycznie czystym chiralnym kwasem, lub metodą chromatograficzną, na przykład za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC, używając odpowiednich stosowanych w chromatografii związków z chiralnymi ligandami.

Związki o wzorze I, gdzie R4 oznacza inną grupę niż -B(OH)2 można przekształcić w związki o wzorze I, gdzie R4 oznacza -B(OH)2 stosując standardowe metody, na przykład używając kwasu izobutylo-boronowego i-BuB(OH)2 w obecności kwasu, w szczególności fluorowcokwasu w mieszaninie wody z metanolem i heksanem, w temperaturze korzystnie od 0 do 50°C, na przykład w temperaturze pokojowej.

W obu procesach a) i b), w celu konwersji lub syntezy związków przejściowych lub wyjściowych, rozpuszczalniki odpowiednie do przeprowadzenia reakcji mogą zostać wybrane z grupy obejmującej wodę, typowo niższy alkanian (sól kwasu alkanokarboksylowego) niższego alkilu, na przykład octan dietylu, etery, typowo eter alifatyczny, na przykład eter dietylowy, lub cykliczne etery, na przykład tetrahydrofuran, ciekłe węglowodory aromatyczne, typowo benzen lub toluen, alkohole, typowo metanol, etanol lub 1- lub 2-propanol, nitryle, typowo acetonitryl, fluorowcowane węglowodory, typowo dichlorometan, amidy kwasowe, typowo dimetyloformamid, zasady, typowo heterocykliczne zasady azotowe, na przykład pirydyna, kwasy karboksylowe, typowo niższe kwasy alkanokarboksylowe, na przykład kwas octowy, bezwodniki kwasów karboksylowych, typowo bezwodniki niższych kwasów alkanokarboksylowych, na przykład bezwodnik octowy, cykliczne, prostołańcuchowe lub rozgałęzione węglowodory, typowo cykloheksan, heksan lub izopentan lub mieszaniny tych rozpuszczalników, na przykład roztwory wodne, jeśli nie wskazano inaczej w opisie procedur. Tego typu mieszaniny rozpuszczalników mogą być stosowane w przetwarzaniu, na przykład w chromatografii, lub rozdziale.

Związki wyjściowe o wzorze II - V lub ich prekursory są znane, mogą być otrzymywane znanymi metodami lub są dostępne na rynku; w szczególności, mogą być wytwarzane sposobami identycznymi lub analogicznymi do tych opisanych w Przykładach.

PL 210 174 B1

Związek o wzorze II, gdzie podstawniki są takie, jak określono powyżej dla wzoru I, otrzymuje się na przykład w następujących reakcjach:

Najpierw, analog aminokwasowy kwasu boronowego o wzorze VI

na przykład o konfiguracji wskazanej we wzorze VI*

gdzie R3 ma znaczenie podane powyżej dla związku o wzorze I i R4 ma znaczenie inne niż -B(OH)2, wymienione powyżej dla związku o wzorze I, w szczególności jest to grupa (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6.1.1.0^2,6]dec-4-ylowa, lub jej sól addycyjna z kwasem, w szczególności sól z kwasem trifluorooctowym, poddaje się reakcji kondensacji z aminokwasem o wzorze VII

na przykład o konfiguracji wskazanej we wzorze VII*

lub jego reaktywną pochodną, gdzie R5 ma znaczenie podane powyżej dla związków o wzorze I i Pr1 jest zabezpieczoną grupą aminową, korzystnie grupą tert-butoksykarbonyloaminową, w warunkach reakcji analogicznych do tych opisanych powyżej dla reakcji a) (także reakcja kondensacji, także korzystnie tworzenie in situ aktywnych pochodnych kwasów karboksylowych), otrzymując w ten sposób związek o wzorze II z zabezpieczoną grupą aminową, z której jest następnie usuwana grupa osłaniająca, na przykład w warunkach opisanych w wymienionych w niniejszym tekście podręcznikach, w przypadku grupy tert-butoksykarbonyloaminowej na przykład przy użyciu kwasu solnego w odpowiednim rozpuszczalniku, na przyk ł ad dioksan i (lub) chlorku metylenu, w wyniku czego otrzymuje się związek o wzorze II, który może być bezpośrednio używany w procesie a).

Kwasy boronowe o wzorze VI są znane, dostępne na rynku i (lub) mogą zostać otrzymane znanymi metodami. Na przykład, związki o wzorze VI, gdzie R3 jest niższą grupą alkilową, w szczególności izobutylową, i R4 ma znaczenie takie, jak podano dla związków o wzorze VI, korzystnie jest grupą (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6.1.1.0^2,6]dec-4-ylową, mogą być otrzymane w reakcji zwią zku o wzorze VIII,

gdzie R4 ma znaczenie takie jak określono wyżej, w odpowiednim rozpuszczalniku, na przykład chlorku metylenu, z niższym n-alkilolitem, w szczególności n-butylolitem, i kolejno z chlorkiem cynku, otrzymując związek o wzorze IX,

PL 210 174 B1

gdzie R4 ma znaczenie takie, jak podano wyżej dla wzoru VI. Związek ten poddaje się dalej reakcji z LiN(SiCH3)2 i z otrzymanego produktu w obecności kwasu trifluorooctowego uzyskuje się sól o wzorze X,

gdzie R4 ma znaczenie takie, jak podano dla wzoru VI, który jest związkiem o wzorze VI i może być dalej stosowany w reakcji ze związkiem o wzorze VII, jak pokazano powyżej.

Związek o wzorze III jest znany, dostępny na rynku i (lub) może być otrzymany typowymi metodami. Na przykład, związek o wzorze III, gdzie R1 jest grupą arylową, w szczególności bifenylilową, można otrzymać w reakcji związku o wzorze XI,

na przykład o konfiguracji wskazanej we wzorze XI*

gdzie R2 ma znaczenie takie, jak podano dla związku o wzorze I, który jest związkiem znanym, dostępnym na rynku lub możliwym do otrzymania typowymi metodami, ze związkiem o wzorze XII,

R1-X (XII) gdzie R1 jest grupą arylową, a X jest atomem fluorowca, w szczególności atomem bromu, w odpowiednim rozpuszczalniku, na przykład w dimetyloformamidzie, w obecności zasady, w szczególności węglanu metali alkalicznych, na przykład węglanu potasu, w temperaturze między 50 a 100°C, na przykład w 90°C, korzystnie w atmosferze gazu obojętnego, na przykład azotu lub argonu. W ten sposób otrzymuje się bezpośrednio odpowiedni związek o wzorze III.

Pochodne aminokwasu o wzorze VII są znane, dostępne na rynku lub możliwe do otrzymania typowymi metodami. Korzystnie są one używane w postaci zabezpieczonej z osłoniętą grupą aminową, na przykład z grupą tert-butoksykarbonyloaminową zamiast wolnej grupy aminowej.

PL 210 174 B1

Związki o wzorze IV można otrzymać na przykład w reakcji związku o wzorze II na przykład o konfiguracji wskazanej we wzorze II*, jak określono w procesie a), z aminokwasem o zabezpieczonej grupie aminowej, o wzorze XIII,

na przykład o konfiguracji wskazanej we wzorze XIII*

lub jego reaktywną pochodną, gdzie R2 ma znaczenie takie, jak określono dla wzoru I i Pr2 jest osłanianą grupą aminową, w szczególności tert-butoksykarbonyloaminową, w preferowanych warunkach reakcji kondensacji jak opisano powyżej dla procesu a). Z otrzymanego produktu, związku o wzorze IV usuwana jest grupa osłaniająca N-końcową grupę aminową, na przykład w przypadku grupy tert-butoksykarbonyloaminowej przy użyciu chlorowodoru w dioksanie.

W innych wykonaniach, środek indukujący apoptozę jest inhibitorem proteasomu z rodziny kwasu 2,4-diamino-3-hydroksykarboksylowego, zob. publikacje PCT międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 00 64863. Na przykład, w niektórych wykonaniach, inhibitor proteasomu jest kwasem 2,4-diamino-3-hydroksykarboksylowym o wzorze XIV,

gdzie

A i B niezależnie oznaczają wiązanie lub niepodstawioną lub podstawioną grupę aminoacylową;

R1 oznacza atom wodoru; grupę osłaniającą grupę aminową; lub grupę o wzorze R5Y-, gdzie

R5 oznacza atom wodoru lub niepodstawioną lub podstawioną grupę alkilową, alkenylową, alkinylową, aryIową, aryloalkilową, heteroarylową, heteroaryloalkilową, heterocyklilową lub heterocykliloalkilową; oraz

Y oznacza -CO-; -NH-CO-; -NH-CS-; -SO2-; -O-CO-; lub -O-CS-;

R2 oznacza łańcuch boczny naturalnie występującego aminokwasu; grupę alkilową, aryloalkilową, heteroaryloalkilową lub cykloalkiloalkilową; lub trimetylosilylometyIową, 2-tienylometylową lub styrylometylową;

R3 oznacza atom fluorowca, grupę alkilową, alkoksylową lub hydroksyalkoksylową; oraz

R4 oznacza grupę 2(R)-hydroksyindan-1(S)-ylową; (S)-2-hydroksy-1-fenyloetylową; lub 2-hydroksy-benzylową niepodstawioną lub podstawioną w pozycji 4 grupą metoksylową; gdzie kwas 2,4-diamino-3-hydroksykarboksylowy występuje w postaci wolnej, jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub w postaci kompozycji farmaceutycznej.

Niepodstawiona lub podstawiona grupa alkilowa korzystnie jest grupą alkilową zawierającą od 1 do 5 atomów węgla, korzystnie od 1 do 4 atomów węgla; na przykład jest grupą metylową, etylową,

PL 210 174 B1 izopropylową lub tert-butylową; w szczególności zawiera 1 lub 4 atomy węgla. Podstawnikiem jest na przykład grupa fenoksylowa, hydroksylowa lub nieosłaniana, bądź osłaniana grupa aminowa.

Niepodstawioną lub podstawioną grupą aryloalkilową jest na przykład grupa fenyloalkilowa zawierająca w sumie od 7 do 10 atomów węgla, taka jest grupa benzylowa lub 2-fenyloetylowa. Grupa ta może być niepodstawiona lub podstawiona w części arylowej lub alkilowej na przykład grupą hydroksylową, tak jak w grupie benzylo-CH(OH)- lub fenylo-CH(CH2OH)-, alkilową, aminową lub alkiloaminową, lub jest na przykład grupą naftyloalkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla w części alkilenowej, w szczególności jest to grupa naftylometylowa.

Grupa osłaniająca grupę aminową korzystnie jest grupą benzyloksykarbonylową, cykloalkiloalkoksykarbonylową, w szczególności cykloheksylometoksykarbonylową, lub tert-butoksykarbonylową. Niepodstawioną lub podstawioną grupą heteroaryloalkilową korzystnie jest grupa pirydyloalkilowa, w szczególności 2-pirydylometylowa i 4-pirydylometylowa.

Podstawniki arylowe, heteroarylowe oraz arylowe grupy aryloalkilowej i heteroaryloalkilowej mogą być jedno- lub wielopierścieniowe, takie jak podstawnik pirydylowy, naftylowy, 9-fluorenylometoksykarbonylowy (FMOC) lub benzo-imidazolilowy. Podstawnik alkilenowy grupy aryloalkilowej lub heteroaryloalkilowej może być podstawiony na przykład grupą hydroksylową.

Grupa heterocyklilowa i podstawnik heterocyklilowy grupy heterocykliloalkilowej, może być nasyconą grupą heterocykliczną zawierającą jeden lub kilka heteroatomów wybranych z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę. Grupa ta ma korzystnie 5 lub 6 atomów węgla w pierścieniu i korzystnie maksymalnie 3 heteroatomy.

Grupa cykloalkiloalkilowa korzystnie jest grupą cykloheksyloalkilową; korzystnie podstawnik alkilenowy tej grupy zawiera od 1 do 4 atomów węgla.

Fluorowiec jest atomem fluoru, chloru, bromu lub jodu, korzystnie chloru lub bromu.

Grupa alkilowa i alkoksylowa korzystnie składają się z 1 do 4 atomów węgla, w szczególności z 1 lub 2 atomów węgla, zwłaszcza może to być grupa metylowa lub metoksylowa.

Grupa hydroksyalkoksylowa korzystnie jest grupą ω-hydroksyalkoksylową złożoną z 2 do 4 atomów węgla, w szczególności jest to grupa 2-hydroksyetoksylowa.

Sól jest na przykład solą addycyjną z kwasem, na przykład jest to chlorowodorek.

Związki o wzorze I mają klika centrów chiralności i z tego powodu mogą istnieć w postaci różnych streoizomerów. Przedmiotem wynalazku są stereoizomery i mieszaniny racemiczne, jeśli nie określono inaczej. Izomery można rozdzielić typowymi metodami, na przykład chromatograficznie. Jak wynika ze wzoru I, konfiguracja atomu węgla w pozycji 2 jest konfiguracją R, a węgla w pozycji 3 i 4 jest konfiguracją S.

R1 oznacza korzystnie atom wodoru, grupę pirydyloalkoksykarbonylową, naftyloalkoksykarbonylową, naftyloalkilokarbonylową, benzylo-CH(OH)-karbonylową, fenoksymetylokarbonylową, fenyloalkilokarbonylową lub grupę osłaniającą grupę aminową taką jak grupa tert-butoksykarbonylowa, grupę cykloalkiloalkoksykarbonylową, w szczególności cykloheksylometoksykarbonylową lub benzyloksykarbonylową niepodstawioną lub podstawioną grupą alkilową lub aminową, a w szczególności jest grupą naftylometoksykarbonylową, naftylometylokarbonylową, pirydylometoksykarbonylową, fenylopropionylową, aminofenylopropionylową, tert-butoksykarbonylową, aminobenzoksykarbonylową, alkilobenzyloksykarbonylową, dialkilobenzyloksykarbonylową lub benzyloksykarbonylową, korzystniej benzyloksykarbonylową.

Jeśli A oznacza niepodstawioną lub podstawioną grupę aminoacylową, korzystnie jest niepodstawioną lub podstawioną grupą α-aminoacylową, taką jak alanina, leucyna, izoleucyna, asparagina, walina, tert-butyloglicyna, tert-leucyna lub histydyna. Korzystnie jest osłanianą lub nieosłanianą grupą α-aminokwasu pochodzenia naturalnego, korzystnie aminokwasu, który jest normalną konstytutywną częścią białka lub jest to tert-leucyna. Korzystnie grupa ma konfigurację L. A w szczególności jest L-waliną, L-tert-leucyną lub wiązaniem, korzystniej L-tert-leucyną.

R2 korzystnie oznacza łańcuch boczny aminokwasu pochodzenia naturalnego, korzystnie α-aminokwasu, korzystnie aminokwasu, który stanowi normalną konstytutywną część białka. Jest to na przykład grupa izopropylowa, aminokarbonylometylowa, metylowa, 1-metylopropylowa, benzylowa, 4-hydroksybenzylowa lub izobutylowa, korzystnie benzylowa.

Jeśli B oznacza niepodstawioną lub podstawioną grupę aminoacylową, korzystnie jest niepodstawioną lub podstawioną grupą α-aminoacylową, taką jak fenyloalanina, walina, leucyna, izoleucyna, alanina lub aspargina. Korzystnie jest niepodstawioną lub podstawioną grupą α-aminokwasu pochodzenia naturalnego, korzystnie aminokwasu, który stanowi normalną konstytutywną część białka.

PL 210 174 B1 α-Aminokwasy mające dwie grupy karboksylowe, na przykład kwas glutaminowy, są korzystnie estryfikowane alkoholem C1-C3, w szczególności metanolem. B korzystnie ma konfigurację L. B w szczególności jest L-waliną, estrem metylowym kwasu L-glutaminowego lub wiązaniem, korzystniej L-waliną.

R3 korzystnie oznacza atom fluorowca, grupę metylową lub metoksylową, w szczególności grupę metoksylową.

R4 korzystnie oznacza grupę 2(R)-hydroksyindan-1(S)-ylową lub 2-hydroksybenzylową niepodstawioną lub podstawioną jak określono powyżej, w szczególności grupę 2-hydroksy-4-metoksy-benzylową.

Y korzystnie oznacza -CO- lub -O-CO-, w szczególności -O-CO-.

R5 korzystnie oznacza niepodstawioną lub podstawioną grupę alkilową, aryloalkilową lub heteroaryloalkilową, w szczególności alkilową; jeśli oznacza niepodstawioną lub podstawioną grupę heteroaryloalkilową, korzystnie jest grupą pirydyloalkilową, w szczególności 2-pirydylometylową; jeśli oznacza niepodstawioną lub podstawioną grupę aryloalkilową, korzystnie jest grupą benzylo-CH(OH)-; jeśli oznacza podstawioną grupę alkilową, korzystnie jest grupą fenoksymetylową.

W niektórych wykonaniach, inhibitor proteasomu jest pochodną amidu kwasu 2-amino-3-hydroksy-4-tert-leucylo-amino-5-fenylo-pentanowego, zob., na przykład, publikację PCT nr 01/89282.

Na przykład, w niektórych wykonaniach, inhibitory proteasomu według wynalazku odnoszą się do związków o wzorze XV

gdzie n oznacza 0 lub 1;

R1 i R2 oznaczają niezależnie grupę alifatyczną, aromatyczną, aromatyczno-alifatyczną, cykloalifatyczną, cykloalifatyczno-alifatyczną, heterocykliczną lub heterocykliczno-alifatyczną, z których każda nie zawiera więcej niż 20 atomów węgla;

R3 oznacza atom wodoru, grupę oksa-alkilową, grupę alifatyczną lub grupę zawierającą maksymalnie 20 atomów węgla, o wzorze -(Y)m-R6, gdzie Y jest grupą alkilową, m oznacza 0 lub 1, a R6 jest niepodstawionym lub podstawionym podstawnikiem jednopierścieniowym o pierścieniu 5 lub 6-członowym zawierającym maksymalnie 3 heteroatomy wybrane z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę, gdzie podstawnik jednopierścieniowy może być skondensowany z pierścieniem benzenowym;

R4 i R5 są wybrane niezależnie z grupy obejmującej atom wodoru; grupę alifatyczną; wolną, eteryfikowaną lub estryfikowaną grupę hydroksylową; wolną lub estryfikowaną grupę karboksylową; formylową; alkanolową; niepodstawioną, mono- lub di-podstawioną aminową, merkapto; sulfonową; alkilo-tio; karbamoilową; N-alkilo-karbamoilową; N,N-di-alkilo-karbamoilową; cyjanową i nitrową; gdzie rodniki z grupami R4 i R5 zawierają maksymalnie 12 atomów węgla, pod warunkiem, że R4 i R5 nie oznaczają atomów wodoru (oba), jeśli n oznacza 1, R1 jest grupą benzylową lub tert-butylową, R2 jest grupą benzylową lub 4-metoksy-benzylową, R3 jest grupą izopropylową i X jest atomem tlenu, a R4 nie jest grupą metoksylową, jeśli n oznacza 0 lub 1, R2 jest grupą 4-metoksy-benzylową, R3 jest atomem wodoru, a X jest atomem tlenu; oraz

X oznacza atom azotu, tlenu lub siarki; lub ich sole.

W kontekście pochodnych amidu kwasu 2-amino-3-hydroksy-4-tert-leucylo-amino-5-fenylo-pentanowego, terminy ogólne używane w niniejszym dokumencie korzystnie mają następujące znaczenie: n oznacza 0 lub 1, korzystnie 0.

Grupa alifatyczna zawiera maksymalnie 12 atomów węgla, korzystnie maksymalnie 7 atomów węgla, najkorzystniej maksymalnie 4 atomy węgla, w takiej niepodstawionej lub podstawionej alifa32

PL 210 174 B1 tycznej grupie węglowodorowej, takiej jak niepodstawiona lub podstawiona grupa alkinylowa, alkenylowa lub korzystnie alkilowa, jeden lub kilka podstawników korzystnie wybiera się niezależnie z grupy obejmującej wolną, eteryfikowaną lub estryfikowaną grupę hydroksylową; wolną lub estryfikowaną grupę karboksylową; formylową; alkanolową; niepodstawioną, mono- lub di-podstawioną grupę aminową, guanidynową; merkapto; sulfonową; alkilo-tio; karbamoilową; N-alkilo-karbamoilową; N,N-di-alkilo-karbamoilową; cyjanową i nitrową.

Grupa alifatyczna R1 korzystnie jest niższą grupą alkilową, w szczególności tert-butyIową.

Grupa alifatyczna R3 korzystnie jest niepodstawioną niższą grupą alkilową lub niższą grupą alkilową podstawioną podstawnikiem hydroksylowym, karboksylowym, aminowym, karbamoilowym, guanidynowym, merkapto lub alkilo-tio, najkorzystniej łańcuchem bocznym aminokwasu takiego jak alanina, leucyna, izoleucyna, seryna, treonina, cysteina, metionina, aspargina, glutamina, asparaginian, glutaminian, lizyna lub arginina, w szczególności walina.

Grupa alifatyczna R4 korzystnie jest grupą metoksylową.

Grupa aromatyczna R1 lub R2 zawiera maksymalnie 20 atomów węgla, w szczególności nie więcej niż 12 atomów węgla, i oznacza niepodstawioną lub podstawioną, korzystnie w każdym przypadku niepodstawioną lub podstawioną grupę fenylową lub naftylową, w szczególności 1-naftylową, gdzie jeden lub kilka podstawników jest korzystnie wybranych niezależnie z grupy obejmującej rodniki alifatyczne; wolną, eteryfikowaną lub estryfikowaną grupę hydroksylową; wolną lub estryfikowaną grupę karboksylową; formylową; alkanolową; niepodstawioną, mono- lub di-podstawioną aminową, merkapto; sulfonową; alkilo-tio; karbamoilową; N-alkilo-karbamoilową; N,N-di-alkilo-karbamoilową; cyjanową i nitrową, korzystniej należy do grupy obejmującej grupę alkilową, np. metylową, etylową lub propylową; alkoksylową, np. metoksylową lub etoksylową; di-podstawioną aminową, np. dimetyloaminową, atom fluorowca, np. atom chloru lub bromu; i grupę fluorowco-alkilową, np. trifluorometylową.

W grupie aromatyczno-alifatycznej R1 lub R2 mającej maksymalnie 20 atomów węgla grupa aromatyczna ma znaczenie takie, jak określono powyżej, a grupa alifatyczna korzystnie jest niższą grupą alkilową, w szczególności C1-C2 alkilową, podstawioną korzystnie w sposób określony powyżej dla rodnika aromatycznego lub korzystnie niepodstawioną. Grupa aromatyczno-alifatyczna R1 korzystnie jest rodnikiem benzylowym lub naftalen-1-ylometylowym. Grupa aromatyczno-alifatyczna R2 korzystnie jest rodnikiem benzylowym podstawionym przy benzenie podstawnikiem 1-5, korzystnie 1-3 metoksylowym; benzylowym podstawionym przy benzenie, korzystnie w pozycji 4, grupą dimetylo-aminową; lub naftalen-1-ylometylową. Najkorzystniej grupa aromatyczno-alifatyczna R2 jest rodnikiem 2,3,4- lub 3,4,5-trimetoksy-benzylowym.

Grupa cykloalifatyczna R1 lub R2 zawiera maksymalnie 20, w szczególności maksymalnie 10 atomów węgla, jest rodnikiem jedno- lub wielopierścieniowym i jest podstawiona korzystnie w sposób określony dla grupy aromatycznej lub korzystnie niepodstawioną, na przykład jest to grupa cykloalkilowa, w szczególności 5- lub 6-członowa grupa cykloalkilowa, korzystnie cykloheksylowa.

W grupie cykloalifatyczno-alifatycznej R1 lub R2 o maksymalnie 20 atomach węgla grupa cykloalifatyczna ma znaczenie określone powyżej, a grupa alifatyczna korzystnie jest niższą grupą alkilową, w szczególności C1-C2 alkilową, podstawioną korzystnie w sposób określony dla grupy aromatycznej lub korzystnie niepodstawioną, na przykład jest grupą cykloheksylometylową.

Grupa heterocykliczna R1 lub R2 zawiera maksymalnie 20 atomów węgla, zwykle do 12 atomów węgla, i jest podstawiona korzystnie w sposób określony dla grupy aromatycznej lub niepodstawiona i korzystnie jest nasyconym lub nienasyconym jednopierścieniowym rodnikiem 5 lub 6-członowym, zawierającym od 1 do 3 heteroatomów korzystnie wybranych z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę, na przykład, jest to tienyl lub pirydyl, lub rodnik dwu- lub trójpierścieniowy, na przykład, a rodnik benzenowy jest skondensowany z wymienionym rodnikiem jednopierścieniowym, w szczególności, na przykład, jest to rodnik indolilowy, taki jak 5-indolil, lub chinolilowy, taki jak 8-chinolil.

W grupie heterocykliczno-aromatycznej R1 lub R2 zawierającej maksymalnie 20 atomów węgla, grupa heterocykliczna ma znaczenie takie, jak określono powyżej, a grupa alifatyczna korzystnie jest niższą grupą alkilową, w szczególności C1-C2 alkilową, podstawioną korzystnie w sposób określony dla grupy aromatycznej lub korzystnie niepodstawioną. Grupa heterocykliczno-aromatyczna R1 lub R2 jest na przykład grupą indolilo-metylową, w szczególności 5-indolilo-metylową, lub chinolilo-metylową, w szczególności 8-chinolilo-metylową.

Oksa-alkil R3 jest grupą o wzorze -G(O-CH2-CH2)t-R7, gdzie G i R7 oznaczają grupę alkilową, korzystnie niższą grupą alkilową, i t oznacza 1 do 3, korzystnie 2, i w szczególności jest to grupa 2-(1,4-dioksa-heksylo)etylowa.

PL 210 174 B1

W grupie o wzorze -(Y)m-R6 maj ą cej do 20 atomów wę gla, Y oznacza grupę alkilową , korzystnie niższą grupę alkilową, m oznacza 0 lub 1 i R6 jest nasyconym lub nienasyconym jednopierścieniowym rodnikiem 5 lub 6-członowym zawierającym 3 heteroatomy wybrane z grupy obejmującej azot, tlen oraz siarkę i alternatywnie zawierającym skondensowany pierścień benzenowy, na przykład jest to rodnik podstawiony korzystnie w sposób określony dla rodnika aromatycznego lub korzystnie niepodstawiony.

Grupa R6 korzystnie jest związana z Y poprzez pierścieniowy atom węgla i jest na przykład niepodstawioną lub podstawioną grupą wybraną z tych obejmujących cyklopentylową, cykloheksylową, cyklopentadienylową, fenylową, pirolidylową, pirazolidylową, imidazolidylową, tetrahydrofurylową, piperydylową, piperazynylową, morfolinylową, pirolilową, pirazolilową, imidazolilową, furylową, tienylową, pirydylową, pirazynylową, pirydazynylową, pirymidynylową, indenylową, naftylową, indolilową i chinolilową.

Najkorzystniej grupa o wzorze -(Y)m-R6 jest grupą piperydylową, w szczególności 4-piperydylową, piperazyno-etylową, w szczególności piperazyn-1-yloetylową, morfolinylo-etylową, w szczególności morfolin-4-yloetylową, pirydylo-metylową, na przykład 2-, 3- lub 4-pirydylo-metylową, lub łańcuchem bocznym aminokwasu, np. fenyloalaniny, tyrozyny, tryptofanu lub histydyny.

X korzystnie jest atomem tlenu (-O-).

Alkil korzystnie jest niższą grupą alkilową.

Określenie „niższa oznacza grupę zawierającą 7, korzystnie do (z włączeniem) 4 atomów węgla.

Niższa grupa alkilowa jest, na przykład, grupą n-propylową, izopropylową, n-butylową, izobutylową, sec-butylową, tert-butylową, n-pentylową, izopentylową, neopentylową, n-heksylową lub n-heptylową, korzystnie izobutylową, sec-butylową, tert-butylową, izopropylową, etylową lub metylową, najkorzystniej izobutylową, etylową lub metylową.

Eteryfikowana grupa hydroksylowa jest, na przykład, grupą alkoksylową, w szczególności niższą grupą alkoksylową, taką jak etoksylowa lub metoksylowa. Estryfikowana grupa hydroksylowa korzystnie jest grupą hydroksylową estryfikowaną organicznym kwasem karboksylowym, takim jak kwas alkanokarboksylowy, lub kwasem nieorganicznym, takim jak fluorowcokwas, na przykład jest to niższa grupa alkanoiloksylowa, lub w szczególności fluorowcem, taki jak jod lub w szczególności fluor, chlor lub brom.

Estryfikowana grupa karboksylowa jest, na przykład, grupą alkoksykarbonylową, w szczególności niższą grupą alkoksykarbonylową, taką jak np. grupa metoksykarbonylowa.

Alkanol jest, na przykład, grupą alkilokarbonylową, w szczególności niższą grupą alkilokarbonylową, taką jak np. acetylową.

Mono- lub di-podstawiona grupa aminowa jest, na przykład, grupą N-alkiloaminową lub N,N-dialkiloaminową, w szczególności niższą grupą N-alkiloaminową lub niższą grupą N,N-dialkiloaminową, taką jak np. N-metyloaminowa lub N,N-dimetyloaminowa.

Fluorowiec jest atomem fluoru, chloru, bromu lub jodu, korzystnie fluoru, chloru lub bromu.

Struktura w pokazanym wyżej wzorze XV wskazuje konfigurację absolutną.

Grupy tworzące sole w związku o wzorze XV są grupami lub rodnikami o właściwościach zasadowych lub kwasowych. Związki zawierające przynajmniej jedną grupę zasadową lub przynajmniej jeden rodnik zasadowy, na przykład wolną grupę aminową, rodnik pirazynylowy lub rodnik pirydylowy, mogą tworzyć sole addycyjne z kwasami, na przykład z kwasami nieorganicznymi, takimi jak kwas solny, siarkowy lub fosforowy, lub z odpowiednimi organicznymi kwasami karboksylowymi lub sulfonowymi, na przykład alifatycznymi kwasami mono- lub di-karboksylowymi, takimi jak kwas trifluorooctowy, octowy, propionowy, glikolowy, bursztynowy, maleinowy, fumarowy, hydroksymaleinowy, maleinowy, winowy, cytrynowy lub szczawiowy, lub aminokwasami takimi jak arginina lub lizyna, aromatycznymi kwasami karboksylowymi, takimi jak kwas benzoesowy, 2-fenoksy-bezoesowy, 2-acetoksy-bezoesowy, salicylowy, 4-aminosalicylowy, aromatyczno-alifatycznymi kwasami karboksylowymi, takimi jak kwas migdałowy lub cynamonowy, heteroaromatycznymi kwasami karboksylowymi, takimi jak kwas nikotynowy lub izonikotynowy, alifatycznymi kwasami sulfonowymi, takimi jak kwas metano-, etano- lub 2-hydroksyetanosulfonowy, lub aromatycznymi kwasami sulfonowymi, takimi jak kwas benzeno-, p-tolueno- lub naftaleno-2-sulfonowy. W przypadku obecności kilku grup zasadowych mogą tworzyć się sole addycyjne z jednym lub kilkoma kwasami.

Związki o wzorze XV mające grupy kwasowe, na przykład wolną grupę karboksylową w rodniku Rio, mogą tworzyć sole z metalami lub sole amoniowe, takie jak sole metali alkalicznych lub sole metali ziem rzadkich, na przykład sole sodowe, potasowe, magnezowe lub wapniowe, bądź amoniowe

PL 210 174 B1 z amoniakiem lub odpowiednimi aminami organicznymi, takie jak trzeciorzędowe monoaminy, na przykład trietyloamina lub tri-(2-hydroksyetylo)-amina, lub heterocykliczne zasady, na przykład N-etylo-piperydina lub N,N'-dimetylopiperazyna.

Związki o wzorze XV mające zarówno grupy kwasowe, jak i zasadowe mogą tworzyć sole wewnętrzne.

W celu wyodrębnienia i oczyszczenia, a także w przypadku związków dalej stosowanych jako przejściowe, możliwe jest zastosowanie farmaceutycznie niedopuszczalnych soli.

Jedynie farmaceutycznie dopuszczalne, nietoksyczne sole stosowane są w leczeniu i są z tego powodu solami preferowanymi.

Z powodu bliskiego związku między nowymi związkami w wolnej postaci i w postaci soli, z włączeniem soli, które mogą być stosowane jako związki przejściowe, na przykład do oczyszczania lub identyfikacji nowych związków, tam gdzie jest to pożądane i wskazane wszystkie odniesienia do wolnych związków powinny być rozumiane jako obejmujące odpowiednie sole.

VII. Podawanie i kompozycje farmaceutyczne

Przeciwciała i środki według wynalazku mogą być podawane bezpośrednio ssakowi leczonemu na, na przykład zaburzenia związane z nadmierną proliferacją z włączeniem nowotworów złośliwych, na przykład, raka, glajaka, międzybłoniaka, czerniaka, chłoniaka, białaczki, gruczolakoraka, nowotworu złośliwego piersi, jajnika, szyjki macicy, glejaka, nowotworu złośliwego prostaty, chłoniaka Burkitta, nowotworu złośliwego głowy i szyi, okrężnicy, jelita grubego, niedrobnokomórkowego nowotworu złośliwego płuc, drobnokomórkowego nowotworu złośliwego płuc, nowotworu złośliwego przełyku, żołądka, trzustki, wątroby i dróg żółciowych, pęcherzyka żółciowego, jelita cienkiego, odbytnicy, nerki, pęcherza, prostaty, prącia, cewki moczowej, tarczycy, przytarczycy, nadnerczy, nowotworu z komórek wewnątrzwydzielniczych trzustki, rakowiaka, nowotworu złośliwego kości, skóry, glejaka siatkówki, szpiczaka mnogiego, chłoniaka Hodgkina, i chłoniaka nie będącego chłoniakiem Hodgkina (w celu zasięgnięcia informacji na temat innych rodzajów nowotworów złośliwych zob. Cancer: Principles and Parctice (DeVita, V.T. i in., wyd. 1997)).

Podawanie kompozycji według niniejszego wynalazku każdą drogą służy zapewnieniu optymalnego kontaktu chemioterapeutyku z leczoną tkanką. Przeciwciała i środki podawane są w odpowiedni sposób, opcjonalnie z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami. Odpowiednie sposoby podawania przeciwciał i środków według wynalazku są znane osobom biegłym w dziedzinie, i chociaż daną kompozycję można podawać różnymi drogami, tylko poprzez podawanie jedną szczególną drogą osiąga się szybszą i bardziej skuteczną reakcję w stosunku do innych dróg podawania.

Rodzaj farmaceutycznie dopuszczalnych nośników zależy częściowo od podawanej kompozycji, a także od sposobu jej podawania. Odpowiednio, farmaceutyczne kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być podawane w postaci różnych preparatów o różnym składzie (zob., np., Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 17 1985).

Przeciwciała i środki, oddzielnie lub w połączeniu z innymi odpowiednimi składnikami, mogą być podawane metodą wziewną w postaci preparatów aerozolowych (tj. w postaci rozpylonej). Dopuszczalne propelenty, które mogą zostać zastosowane w postaci sprężonej w preparatach aerozolowych to na przykład dichlorodifluorometan, propan, azot i związki podobne.

Odpowiednie do podawania preparaty obejmują roztwory wodne i niewodne, izotoniczne sterylne roztwory, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, substancje bakteriostatyczne, soluty do sporządzania roztworów izotonicznych, wodne i niewodne sterylne zawiesiny mogące zawierać środki ułatwiające tworzenie zawiesin, środki zwiększające rozpuszczalność, środki zagęszczające, środki stabilizujące i konserwanty. W realizacjach wynalazku, kompozycje mogą być podawane, na przykład, doustnie, miejscowo, dożylnie, dootrzewnowo, dopęcherzowo lub dooponowo. Ewentualnie, kompozycje mogą być podawane donosowo. Preparaty związków mogą być umieszczane w szczelnych opakowaniach zawierających dawki jednostkowe lub wielokrotne, na przykład ampułkach i fiolkach. Roztwory i zawiesiny mogą być sporządzane z dowolnego opisanego wcześniej typu sterylnych proszków, granulatu lub tabletek. Modulatory mogą być podawane jako część posiłku lub leku. Związki według wynalazku mogą być stosowane efektywnie w połączeniu z jednym lub kilkoma dodatkowymi aktywnymi środkami (np. chemioterapeutykami), zależnie od pożądanej terapii lub efektu.

Dawkowanie w kontekście niniejszego wynalazku powinno być wystarczające do osiągnięcia korzystnej odpowiedzi u pacjenta w określonym czasie. Dawkowanie będzie zależało od skuteczności stosowanych modulatorów i stanu pacjenta, a także masy ciała lub rozmiaru leczonej powierzchni. Wielkość dawek będzie także zależna od obecności, natury i nasilenia jakichkolwiek szkodliwych dziaPL 210 174 B1 łań ubocznych towarzyszących podawaniu określonego związku lub wektora danemu pacjentowi. Można podawać dawki pojedyncze lub podzielone.

Agonista przeciwciała i środek indukujący apoptozę mogą być podawane łącznie w postaci mieszaniny lub oddzielnie. Agonista przeciwciała i środek indukujący apoptozę mogą być, ale nie muszą, podawane jednocześnie.

VIII. Inhibitory apoptozy

Jak opisano w niniejszym dokumencie, różne produkty genów hamują (np. cząsteczki wymienione w górnej części fig. 27 i UbcH10) lub aktywują (np. cząsteczki wymienione w dolnej części fig. 27) apoptozę indukowaną przez TRAIL (i indukowaną przez anty-DR4 lub anty-DR5). Produkty genów, które hamują apoptozę indukowaną przez TRAIL mogą być ukierunkowywane przez inhibitory na synergistyczne zmniejszanie stopnia apoptozy indukowanej przez TRAIL i przeciwciała anty-DR4 lub antyDR5. Podobnie, produkty genów, które aktywują apoptozę indukowaną przez TRAIL mogą być ukierunkowywane przez aktywatory na synergistyczne zwiększanie stopnia apoptozy indukowanej przez TRAIL i przeciwciała anty-DR4 lub anty-DR5.

Alternatywnie, aktywatory produktów genów hamujących apoptozę indukowaną przez TRAIL mogą być stosowane do zmniejszania jej stopnia, w czasie i miejscu, gdzie jest ona niekorzystna. Podobnie, inhibitory produktów genów aktywujących apoptozę indukowaną przez TRAIL mogą być stosowane do zmniejszania jej stopnia, w czasie i miejscu, gdzie jest ona niekorzystna. Jedną z chorób, w której może mieć to zastosowanie, jest choroba Moschowitza (Kwaan, H. C, Semin. Hematol., 24:71 (1987); Thompson i in., Blood, 80:1890, (1992)). Amerykańskie Centra Kontroli Zachorowalności odnotowały zwiększenie śmiertelności związanej z zachorowalnością na chorobę Moschowitza (Torok i in., Am. J. Hematol. 50:84, 1995). Osocze pacjentów dotkniętych chorobą Moschowitza (z włączeniem pacjentów HIV⁺ i HIV^-) indukuje apoptozę ludzkich komórek śródbłonka drobnych naczyń skórnych, ale nie tych pochodzących z większych naczyń (Laurence i in., Blood, 87:3245 (1996)). Uważa się, że osocze pacjentów cierpiących na chorobę Moschowitza zawiera jeden lub kilka czynników, które w sposób bezpośredni lub niebezpośredni indukują apoptozę. Jak opisano w publikacji PCT międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 97/01633 (włączonej tu w całości w charakterze odnośnika), w surowicy pacjentów cierpiących na chorobę Moschowitza obecny jest ligand TRAIL i może odgrywać istotną rolę w indukowaniu apoptozy komórek śródbłonka drobnych naczyń.

Inną mikroangiopatią zakrzepową jest zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS) (Moake, J. L., Lancet, 343:393 (1994); Melnyk i in., Arch. Intern. Med. 155:2077, (1995)).

Celem jednego wykonania niniejszego wynalazku jest leczenie stanów znanych często pod nazwą „zespół hemolityczno-mocznicowy dorosłych (mimo, iż choroba ta może dotknąć także dzieci). Etiologia zespołu hemolityczno-mocznicowego wieku dziecięcego lub związanego z biegunką jest inna niż etiologia HUS dorosłych.

Również inne stany charakteryzują się tworzeniem zakrzepów w małych naczyniach krwionośnych. Na przykład zjawisko to obserwuje się w przypadku dolegliwości sercowych występujących u około 5-10% dzieci z AIDS. U wielu pacjentów cierpiących na stwardnianie rozsiane zaobserwowano poważne uszkodzenie mikrounaczynienia serca. Rozważa się leczenie układowe liszaja rumieniowatego.

IX. Przewidywanie efektywności leczenia przeciwnowotworowego z użyciem agonistów przeciwciał anty-DR5

Autorzy niniejszego wynalazku odkryli, że ekspresja Myc (produkt genu) jest warunkiem koniecznym, ale nie wystarczającym skutecznego indukowania apoptozy komórek nowotworowych przez przeciwciała anty-DR5. Odpowiednio, ekspresja Myc w komórkach nowotworowych (np. z biopsji) jest wskaźnikiem komórek (a zatem osób), które najprawdopodobniej nie odpowiedzą na terapię ukierunkowaną na DR5. Dokładniej, jeśli w komórkach nowotworowych ulega ekspresji mniej Myc niż w „dzikich typach komórek (komórki nienowotworowe), wówczas jest mniej prawdopodobne, by terapia ukierunkowana na DR5 była skuteczna, niż gdy Myc ulega ekspresji na poziomie lub powyżej poziomu ekspresji w „dzikich typach komórek (drożdży dzikich). Zatem, przedmiotem niniejszego wynalazku są sposoby określania skuteczności terapii z zastosowaniem agonisty przeciwciała anty-DR5 poprzez pobieranie próbki komórek nowotworowych od pacjenta i określanie poziomu ekspresji Myc w komórkach. Niższy poziom ekspresji Myc niż w „dzikich typach komórek wskazuje, że terapia będzie miała niewielki wpływ lub nie będzie miała wpływu na apoptozę komórek nowotworowych.

Przykłady wykonania

Wynalazek został poniżej przedstawiony w przykładach wykonania, których nie należy traktować jako ograniczenie zakresu i ducha tego wynalazku do podanych w nich konkretnych związków

PL 210 174 B1 chemicznych i procedur laboratoryjnych. Inne warianty wynalazku powinny być oczywiste dla osób biegłych w dziedzinie i zostały objęte zakresem zastrzeżeń patentowych.

Skróty:

abs. absolutny(a) i-BuB(OH)2 kwas izobutylo-boronowy

DIEA N-etylodiizopropyloamina

DMF N,N-dimetyloformamid równow. równoważnik

ES-MS spektroskopia masowa z rozpylaniem w polu elektrycznym

EtOAc octan etylu godz. godzina(y)

HPLC wysokosprawna chromatografia cieczowa

MeOH metanol min. minuta(y) temp. topn. temperatura topnienia

MPLC średniociśnieniowa chromatografia cieczowa

Rf współczynnik retencji - stosunek drogi przebytej przez badaną substancję do drogi przebytej przez rozpuszczalnik w chromatografii TLC na żelu krzemionkowym 60 F254 (Merck, Darmstadt) temp. pok. temperatura pokojowa

TBTU tetrafluoroboran O-(benzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetrametyluronium

TFA kwas trifluorooctowy

TLC chromatografia cienkowarstwowa tR czas retencji

Jeśli nie określono inaczej, stosunki eluentów lub mieszanin rozpuszczalników są stosunkami objętościowymi.

Wywoływanie chromatogramu w metodzie TLC:

Plamy związków końcowych lub pośrednich w metodzie TLC, które nie są wykrywane promieniowaniem UV mogą zostać uwidocznione przy użyciu barwiącego roztworu nadmanganianu potasu i po ogrzaniu płytki.

Skład barwiącego roztworu nadmanganianu potasu: 2,5 g KMnO4 (nadmanganian potasu) (Fluka, Buchs, Szwajcaria) w 800 ml H2O i 200 ml 1M H2SO4.

Warunki analizy metodą HPCL:

System 1

Liniowy gradient 2-100% CH3CN (0,1% TFA) i H2O (0,1% TFA) w ciągu 10 minut + 2 minuty 100% CH3CN (0,1% TFA); detekcja przy 215 nm, szybkość przepływu 0,7 ml/min w 25°C. Kolumna: Nucleosil 120-3 C18 (125 x 3,0 mm).

System 2

Liniowy gradient 20-100% CH3CN (0,1% TFA) i H2O (0,1% TFA) w ciągu 7 minut + 2 minuty 100% CH3CN (0,1% TFA); detekcja przy 215 nm, szybkość przepływu 1 ml/min w 30°C. Kolumna: Nucleosil 100-3 C18HD (125 x 4 mm).

System 3

Liniowy gradient 20-100% CH3CN (0,1% TFA) i H2O (0,1% TFA) w ciągu 7 minut + 2 minuty 100% CH3CN (0,1% TFA); detekcja przy 215 nm, szybkość przepływu 1 ml/min w 30°C. Kolumna: Nucleosil 100-3 C8 godzinD (125 x 4 mm).

Schemat 1 (Przykłady 1 i 2):

PL 210 174 B1

Przykład 2

PL 210 174 B1

P r z y k ł a d 1: (S)-2-[(S)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-N-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-butyroamid

Etap A: 4M roztwór HCI w dioksanie (5,7 ml, 22,77 mmol, 30 równow.) dodaje się do zimnego (0°C) roztworu estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego ((A) w Schemacie 1) (0,352 g, 0,759 mmol) w CH2CI2 abs. (5,5 ml), w atmosferze argonu. Otrzymaną mieszaninę pozostawia do ogrzania do temperatury pokojowej i miesza przez 10 minut. Dodaje się dodatkowo 4M HCI (1,9 ml, 7,59 mmol, 10 równow.). Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 10 minut i zatęża się otrzymują c surowy chlorowodorek w postaci ż ó ł tej piany.

Etap B: Do zimnego (0°C) roztworu surowego chlorowodorku (0,331 g, 0,828 mmol), kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego ((B) w Schemacie 1) (0,518 g, 0,994 mmol, 1,2 równow.) i TBTU (0,292 g, 0,910 mmol, 1,1 równow.) w DMF abs. (3,0 ml), w atmosferze argonu dodaje się kroplami (1,9 ml/min) DIEA abs. (0,72 ml, 4,14 mmol, 5 równow.). Mieszaninę reakcyjną pozostawia do ogrzania do temperatury pokojowej, miesza przez 40 minut i wlewa do wody o temperaturze 0°C (45 ml). Otrzymany osad zbiera się poprzez filtrację próżniową, rozpuszcza się w octanie etylu i przemywa wodą. Fazę organiczną suszy się (Na2SO4), odsącza się i zatęża się. Pozostałość oczyszcza się na kolumnie chromatograficznej wypełnionej żelem krzemionkowym (25 g) (CH2Cl2/MeOH, 90/10) otrzymując związek tytułowy w postaci żółtej piany.

Związek tytułowy: ES-MS: 754,2 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 11,85 min.

(System 1); Rf = 0,72 (CH2Cl2/MeOH, 90/10).

Związki wyjściowe sporządza się w następujący sposób:

(a) Kwas (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowy (do etapu B)

Związek tytułowy otrzymuje się ogrzewając zawiesinę 3-bromo-bifenylu (1,47 ml, 8,54 mmol, Aldrich 25,538-6), kwasu (S)-2-amino-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego (3,4,5-OCH3-phe-OH) (3,27 g, 12,81 mmol), K2CO3 (1,18 g, 8,54 mmol) i Cul (163 mg, 0,854 mmol) w DMF abs. (10,6 ml) przez 24 godziny w temperaturze 90°C w atmosferze argonu. Otrzymaną mieszaninę pozostawia do ostygnięcia do temperatury pokojowej, następnie zatęża pod próżnią i oczyszcza metodą MPLC (CH3CN/H2O/TFA) otrzymując związek tytułowy.

Związek tytułowy: ES-MS: 408,2 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 8,86 min. (System 1).

(b) (L-3,4,5-Trimetoksy-fenylo-alanina) kwasu (S)-2-amino-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego

Związek tytułowy otrzymuje się z dostępnego na rynku 3,4,5-trimetoksybenzaldehydu i N-acetyloglicyny według procedury opisanej w literaturze (E.M. OItz, R. C. Bruening, M. J. Smith, K. Kustin i K. Nakanishi w J. Am. Chem. 1998, 110 (18), 6162-6172). Racemiczny ester metylowy N-acetylo-3,4,5-trimetoksy-fenyloalaniny rozdziela się poprzez katalizowaną enzymatycznie hydrolizę L-estru przy użyciu Alcalase® (Novo Nordisk), jak opisano w literaturze (J.J. Nestor, Jr., T. L. Ho, R. A. Simpson, B. L. Horner, G. godzin Jones, G. I. McRae i B. H. Vickery w J. Med. Chem. 1982, 25 (7), 795-801; lub O. D. Tyagi & P. M. Bol w Indian J. Chem. 1992, str. 851-854).

Związek tytułowy: [a]D²⁰ = - 18,9° (c = 1,025, H₂O); ES-MS: 256,1 [M+H]+; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 2,08 min. (System 2).

(c) Ester tert-butylowy kwasu {(S)-2-metylo-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w etapie B przykładu 1, ale używając trifluorooctanu (S)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butyloamonu ((C) w Schemacie 1) (zob. Kettner, C. A. i Shenvi, A. B. J. Biol. Chem. 1984, 259, str. 15106-15114 i Matteson, D. S. i Sadhu, K. M. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, str. 5241-5242) (2,395 g, 6,32 mmol), Boc-L-waliny (1,373 g, 6,32 mmol), TBTU (2,23 g, 6,95 mmol, 1,1 równow.), DIEA (3,3 ml, 18,95 mmol, 3,0 równow.) i DMF (24 ml).

Związek tytułowy: ES-MS: 465,1 [M+H]⁺ HPLC: pojedynczy pik przy tR = 9,95 min. (System 1).

P r z y k ł a d 2: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-butyryloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Do mieszaniny (S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-N-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1 ,1 ,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-butyroamidu, metanolu (4,3 ml), heksanu (4,3 ml) i 1M HCI (1,45 ml) dodaje się i-BuB(OH)2. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i następnie

PL 210 174 B1 rozcieńcza metanolem (8 ml) i heksanem (8 ml). Dwie warstwy rozdziela się. Warstwę metanolu przemywa się dwukrotnie heksanem, rozcieńcza CH2CI2, przemywa H2O, suszy (Na2SO4), odsącza i zatęża. Pozostałość rozpuszcza się w CH2CI2 i oczyszcza się na kolumnie chromatograficznej wypełnionej żelem krzemionkowym (20 g) (CH2Cl2/MeOH, 80/20) otrzymując związek tytułowy w postaci jasnożółtej piany.

Związek tytułowy: ES-MS: 618,2 [M-H]^-; Rf = 0,03 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Schemat 2 (Przykłady 3 i 4):

PL 210 174 B1

P r z y k ł a d 3: (S)-3-Metylo-N-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-2-[(S)-2-[2-(3-fenoksy-fenylo)-acetyloamino]-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-butyroannid

Związek tytułowy otrzymuje się z estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego ((A) w Schemacie 2) poprzez powtórzenie dwuetapowej (usuwanie grupy osłaniającej/sprzęganie) procedury opisanej w Przykładzie 1, ale przy użyciu, odpowiednio, kwasu (S)-2-tert-butoksykarbonyloamino-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionowego ((D) w Schemacie 2) i kwasu (3-fenoksy-fenylo)-octowego ((F) w Schemacie 2) (Trans World Chemicals, Inc.; Rockvile, MD, USA) jako partnera w każdej reakcji sprzęgania (etap B, Przykład 1). Związek tytułowy otrzymuje się w postaci białego ciała stałego.

Związek tytułowy: ES-MS: 812,1 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 11,13 min. (System 1); Rf = 0,41 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 3.1: (L-2,3,4-Trimetoksy-fenylo-alanina) kwasu (S)-2-amino-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionowego

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany dla kwasu (S)-2-amino-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego (Przykład 1).

Związek tytułowy: ES-MS: 256,1 [M+H]+; HPLC: tp = 2,54 min. (System 2); [α]·²⁰ = -18,5° (c =

0,99, H2O).

Etap 3.2: Kwas (S)-2-tert-butoksykarbonyloamino-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionowy

Związek tytułowy syntezuje się zaczynając od kwasu (S)-2-amino-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionowego według procedury znanej ze stanu techniki (M. Bodanszky w Principles Peptide Synthesis, Akad.-Verlag, 1984).

Związek tytułowy: ES-MS: 356,1 [M+H]+; HPLC: tp = 5,35 min. (System 1); [α]·²² = -2,5° (c = 0,985, metanol).

P r z y k ł a d 4: Kwas (p)-3-metylo-1-{(S)-3-metylo-2-[(S)-2-[2-(3-fenoksy-fenylo)-acetyloamino]-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-butyryloamino}-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 676,0 [M-H]^-; pf = 0,025 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 5: (S)-3-Metylo-N-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-2-[(S)-2-(3-fenylo-propionylo-amino)-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się z estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego poprzez powtórzenie dwuetapowej (usuwanie grupy osłaniającej/sprzęganie) procedury opisanej w Przykładzie 1, ale przy użyciu, odpowiednio, kwasu (S)-2-(tert-butyloksykarbonylo-amino)-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionowego i kwasu 3-fenylo-propionowego (Fluka, Buchs, Szwajcaria) jako partnera w każdej reakcji sprzęgania (etap B, Przykład 1).

Związek tytułowy: ES-MS: 734,1 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tp = 11,25 min. (System 1); pf = 0,41 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 6: Kwas (p)-3-metylo-1-{(S)-3-metylo-2-[(S)-2-(3-fenylo-propionyloamino)-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-butyryloamino}-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 598,2 [M-H]^-; pf = 0,025 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 7: (S)-2-[(S)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-N-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 694,4 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tp = 12,01 min. (System 1); pf = 0,56 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 7.1: Kwas (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-propionowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany dla kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego (Przykład 1), ale przy użyciu O-metylo-L-tyrozyny (Bachem). Oczyszczanie przeprowadza się metodą MPLC (CH3CN/H2O/TFA) otrzymując związek tytułowy; ES-MS: 348,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tp = 9,52 min. (System 1).

PL 210 174 B1

P r z y k ł a d 8: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-butyryloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 558,0 [M-H]^-; HPLC: tR = 6,47 min. (System 3); Rf = 0,086 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 9: (S)-2-[(S)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4-dimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-N-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4-dimetoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 724,4 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 11,75 min. (System 1); Rf = 0,41 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 9.1: Kwas (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4-dimetoksy-fenylo)-propionowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany dla kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego (Przykład 1), ale przy użyciu 3-(3,4-dimetoksyfenylo)-L-alaniny (Aldrich). Oczyszczanie przeprowadza się metodą MPLC (CH3CN/H2O/TFA) otrzymując związek tytułowy; ES-MS: 378,2 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 9,10 min. (System 1).

P r z y k ł a d 10: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4-dimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-butyryloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 588,2 [M-H]^-; Rf = 0,090 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 11: (S)-2-[(S)-2-(3-Izopropylo-fenyloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-N-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo-[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu kwasu (S)-2-(3-izopropylo-fenyloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 720,4 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 11,85 min. (System 1); Rf = 0,43 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 11.1: Kwas (S)-2-(3-izopropylo-fenyloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany dla kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego (Przykład 1), ale przy użyciu 1-bromo-3-izopropylobenzenu (Lancaster). Oczyszczanie przeprowadza się metodą MPLC (CH3CN/H2O/TFA) otrzymując związek tytułowy; ES-MS: 374,1 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 8,95 min. (System 1).

P r z y k ł a d 12: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(3-izopropylo-fenyloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-butyryloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 584,3 [M-H]^-; Rf = 0,13 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 13: (S)-3-Metylo-N-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-2-[(S)-2-(3-pirydyn-2-ylo-fenyloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu kwasu (S)-2-(3-pirydyn-2-ylo-fenyloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 755,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 9,97 min. (System 1); Rf = 0,23 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 13.1: 2-(3-Bromo-fenylo)-pirydyna

Związek tytułowy otrzymuje się metodami znanymi z literatury: Zhang, Biliang, Breslow, Ronald Ester Hydrolysis by a Catalytic Cyklodextrin Dimer Enzyme Mimic a Metalobipyridyl Linking Group. J.

Am. Chem. Soc. (1997), 119(7), 1676-1681; M. Van der Sluis, V. Beverwijk, A. Termaten, F. Bickelhaupt, H. Kooijman, A.L. Spek Synthesis Novel Phosphaalkene-Based Bidentate Ligands Mes*P:CH(3-R-Ar) (R = Pyridyl, Carbaldimino) and Formation Three-Membered Paladacycles Mes*(Me)P-CH(3-R-Ar)-PdCI by Karbopaladation P:C Double Bond. Organometalics (1999), 18(8), 1402-1407.

Związek tytułowy: ES-MS: 235,0 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 6,64 min. (System 1); Rf = 0,17 (Heksan/eter dietylowy, 80/20).

Etap 13.2: Kwas (S)-2-(3-pirydyn-2-ylo-fenyloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany dla kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego (przykład 1), ale przy użyciu 2-(3-bromo-fenylo)-pirydyny. Oczysz42

PL 210 174 B1 czanie przeprowadza się metodą MPLC (CH3CN/H2O/TFA) otrzymując związek tytułowy; ES-MS: 409,2 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 6,64 min. (System 1).

P r z y k ł a d 14: Kwas (R)-3-metylo-1-{(S)-3-metylo-2-[(S)-2-(3-pirydyn-2-ylo-fenyloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-butyryloamino}-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 619,2 [M-H]^-; Rf = 0,044 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 15: (S)-2-[(S)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-N-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 754,4 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 12,08 min. (System 1); Rf = 0,66 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 15.1: Kwas (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany dla kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego (Przykład 1), ale przy użyciu kwasu (S)-2-amino-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionowego. Oczyszczanie przeprowadza się metodą MPLC (CH3CN/H2O/TFA) otrzymując związek tytułowy; ES-MS: 408,2 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 9,42 min. (System 1).

P r z y k ł a d 16: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-butyryloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 618,3 [M-H]^-; Rf = 0,23 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 17: (S)-2-[(S)-3-(4-Benzyloksy-fenylo)-2-(bifenyl-3-iloamino)-propionyloamino]-3-metylo-N-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetyio-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu kwasu (S)-3-(4-benzyloksy-fenylo)-2-(bifenyl-3-iloamino)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 770,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 12,45 min. (System 1); Rf = 0,74 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 17.1: Kwas (S)-3-(4-benzyloksy-fenylo)-2-(bifenyl-3-iloamino)-propionowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany dla kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego (Przykład 1), ale przy użyciu kwasu (S)-2-amino-3-(4-benzyloksy-fenylo)-propionowego (O-benzylo-L-tyrozyna). Oczyszczanie przeprowadza się metodą MPLC (CH3CN/H2O/TFA) otrzymując związek tytułowy; ES-MS: 424,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 10,40 min. (System 1).

P r z y k ł a d 18: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(S)-3-(4-benzyloksy-fenylo)-2-(bifenyl-3-iloamino)-propionyloamino]-3-metylo-butyryloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 633,9 [M-H]^-; Rf =

0,65 (CH2Cl2/MeOH, 90/10).

P r z y k ł a d 19: (R)-2-[(S)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-N-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu estru tert-butylowego kwasu {(R)-2-metylo-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 754,1 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 11,73 min. (System 1); Rf = 0,52 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 19.1: Ester tert-butylowy kwasu {(R)-2-metylo-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany dla estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego (Przykład 1 (c)), ale przy użyciu Boc-D-waliny (Fluka).

Związek tytułowy: ES-MS: 465,4 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 20: Kwas (R)-1-{(R)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-butyryloamino}-3-metylo-butyloboronowy

PL 210 174 B1

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 618,2 [M-H]^-; Rf = 0,088 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 21: (S)-2-[(R)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-N-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu kwasu (R)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 754,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 11,71 min. (System 1); Rf = 0,67 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 21.1: Kwas (R)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany dla kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego (przykład 1), ale przy użyciu kwasu (R)-2-amino-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego (3,4,5-OCH3-phe-OH).

Związek tytułowy: ES-MS: 408,2 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 9,10 min. (System 1).

W celu zasięgnięcia informacji na temat syntezy kwasu (R)-2-amino-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego zob. Przykład 1.

Po rozdzieleniu enzymatycznym, pozostający ester metylowy D-aminokwasu jest hydrolizowany i dezacetylowany przy użyciu procedur należących do stanu techniki; [a]D²⁰ = +19,7° (c = 1,04, H₂O); ES-MS: 256,2 [M+H]⁺; pojedynczy pik przy tR = 2,11 min. (System 2).

P r z y k ł a d 22: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(R)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-butyryloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 618,2 [M-H]^-; Rf = 0,20 (CH2CI2/MeOH, 90/10).

P r z y k ł a d 23: (S)-2-[(S)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-N-[3-metylo-1-(4,4,5,5-tetrametylo-[1,3,2]dioksaborolan-2-ylo)-butylo]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[3-metylo-1-(4,4,5,5-tetrametylo-[1,3,2]dioksaborolan-2-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego.

Związek tytułowy otrzymuje się w postaci surowego produktu; ES-MS: 702,3 [M+H]⁺; HPLC: tR = 10,31 min. (System 1).

Etap 23.1: Ester tert-butylowy kwasu {(S)-2-metylo-1-[3-metylo-1-(4,4,5,5-tetrametylo-[1,3,2]dioksaborolan-2-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób analogiczny do syntezy estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego (Przykład 1 (c)).

Związek tytułowy: ES-MS: 413,3 [M+H]⁺.

P r z y k ł a d 24: Kwas 1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-butyryloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 618,2 [M-H]^-; Rf = 0,076 (CH2Cl2/MeOH, 95/5); HPLC: two peaks at tR = 6,23 minut i 6,36 min. (stosunek 1:1) (System 3).

P r z y k ł a d 25: (S)-2-{(S)-3-(3,4-Dimetoksy-fenylo)-2-[2-(3-fenoksy-fenylo)-acetyloamino]-propionyloamino}-3-metylo-N-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się z estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego poprzez powtórzenie dwuetapowej (usuwanie grupy osłaniającej/sprzęganie) procedury opisanej w Przykładzie 1, ale przy użyciu Boc-L-3,4-dimetoksyfenyloalaniny (Synthetech) i kwasu (3-fenoksy-fenylo)-octowego (Trans World Chemicals, Inc.; Rockvile, MD, USA) jako partnera w każdej reakcji sprzęgania (etap B, Przykład 1). Związek tytułowy otrzymuje się w postaci piany; ES-MS: 782,3 [M+H]⁺; HPLC; pojedynczy pik przy tR = 11,76 min. (System 1); Rf = 0,61 (CH2Cl2/MeOH, 90/10).

P r z y k ł a d 26: Kwas (R)-1-((S)-2-{(S)-3-(3,4-dimetoksy-fenylo)-2-[2-(3-fenoksy-fenylo)-acetyloamino]-propionyloamino}-3-metylo-butyryloamino)-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 646,2 [M-H]^-; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 5,90 min. (System 3); Rf = 0,12 (CH2Cl2/MeOH, 90/10).

PL 210 174 B1

P r z y k ł a d 27: (S)-3-Metylo-N-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-2-[(S)-2-[2-(3-fenoksy-fenylo)-acetyloamino]-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się z estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego poprzez powtórzenie dwuetapowej (usuwanie grupy osłaniającej/sprzęganie) procedury opisanej w Przykładzie 1, ale przy użyciu kwasu (S)-2-tert-butoksykarbonyloamino-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego i kwasu (3-fenoksy-fenylo)-octowego (Trans World Chemicals, Inc.; pockvile, MD, USA) jako partnera w każdej reakcji sprzęgania (etap B, Przykład 1).

Związek tytułowy otrzymuje się w postaci żółtej piany; ES-MS: 812,4 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tp = 11,36 min. (System 1); pf = 0,53 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 27.1: Kwas (S)-2-tert-butoksykarbonyloamino-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowy

Związek tytułowy syntezuje się w sposób podobny do opisanego dla kwasu (S)-2-tert-butoksykarbonyloamino-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionowego (Przykład 3), ale zaczynając od kwasu (S)-2-amino-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 356 [M+H]+; HPLC: tp = 4,83 min. (System 2); m.p. = 76-80°C; [α^²⁰ = + 13,4° (c = 1,01, metanol).

P r z y k ł a d 28: Kwas (p)-3-metylo-1-{(S)-3-metylo-2-[(S)-2-[2-(3-fenoksy-fenylo)-acetyloamino]-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-butyryloamino}-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 676,2 [M-H]^-; pf = 0,14 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 29: (S)-2-{(S)-3-(4-Benzyloksy-fenylo)-2-[2-(3-benzyloksy-fenylo)-acetyloamino]-propionyloamino}-3-metylo-N-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się z estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego poprzez powtórzenie dwuetapowej (usuwanie grupy osłaniającej/sprzęganie) procedury opisanej w Przykładzie 1, ale przy użyciu kwasu (S)-3-(4-benzyloksy-fenylo)-2-tert-butoksykarbonyloamino-propionowego i kwasu (3-fenoksy-fenylo)-octowego (Trans World Chemicals, Inc.; pockvile, MD, USA) jako partnera w każdej reakcji sprzęgania (etap B, Przykład 1). Związek tytułowy otrzymuje się w postaci beżowej piany; ES-MS: 842,0 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tp = 12,19 min. (System 1); pf = 0,37 (CH2Cl2/IMeOH, 95/5).

Etap 29.1: Kwas (S)-3-(4-benzyloksy-fenylo)-2-tert-butoksykarbonyloamino-propionowy

Związek tytułowy syntezuje się w sposób podobny do opisanego dla kwasu (S)-2-tert-butoksykarbonyloamino-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionowego (Przykład 3), ale zaczynając od O-benzylo-L-tyrozyny (Fluka).

Związek tytułowy: ES-MS: 370,1 [M-H]^-; HPLC: tp = 9,23 min. (System 1).

P r z y k ł a d 30: Kwas (p)-1-((S)-2-{(S)-3-(4-benzyloksy-fenylo)-2-[2-(3-benzyloksy-fenylo)-acetyloamino]-propionyloamino}-3-metylo-butyryloamino)-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 705,8 [M-H]^-; pf = 0,12 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 31: [(p)-3-Metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-amid kwasu (S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-4-metylo-pentanowego

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu estru tert-butylowego kwasu {(S)-3-metylo-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-butylo}-karbamowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 768,2 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tp = 11,79 min. (System 1); pf = 0,72 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 31.1: Ester tert-butylowy kwasu {(S)-3-Metylo-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-butylo}-karbamowego

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany dla estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego (przykład 1 (c)), ale przy użyciu Boc-L-leucyny.

Związek tytułowy: ES-MS: 479,2 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tp = 10,05 min. (System 1).

PL 210 174 B1

P r z y k ł a d 32: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-4-metylo-pentanoiloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 632,2 [M-H]^-; Rf = 0,15 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 33: [(R)-3-Metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-amid kwasu (S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4-dimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-4-metylo-pentanowego

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu estru tert-butylowego kwasu {(S)-3-metylo-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-butylo}-karbamowego i kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4-dimetoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 738,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 11,76 min. (System 1); Rf = 0,59 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 34: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-4-metylo-pentanoiloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 602,2 [M-H]^-; Rf = 0,14 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 35: [(R)-3-Metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylo]-amid kwasu (S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-propionyloamino]-4-metylo-pentanowego

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu estru tert-butylowego kwasu {(S)-3-metylo-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-butylo}-karbamowego i kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 708,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR= 12,03 min. (System 1); Rf = 0,70 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 36: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-propionyloamino]-4-metylo-pentanoiloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 572,1 [M-H]^-; Rf = 0,25 (CH2Cl2/MeOH, 90/10).

P r z y k ł a d 37: (S)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-N-{(S)-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-3-(3,4,5-trimetoksyfenylo)-propionoamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu estru tert-butylowego kwasu {(S)-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-karbamowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 726,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR= 11,24 min. (System 1); Rf = 0,41 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 37.1: Ester tert-butylowy kwasu {(S)-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-karbamowego

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany dla estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego (etap 1.1, Przykład 1), ale przy użyciu Boc-L-alaniny (Fluka).

Związek tytułowy: ES-MS: 437,4 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR= 10,91 min. (System 1).

P r z y k ł a d 38: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-propionyloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 590,0 [M-H]^-; Rf = 0,12 (CH2CI2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 39: (S)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-N-{(S)-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-3-(2,3,4-trimetoksyfenylo)-propionoamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu estru tert-butylowego kwasu {(S)-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-karbamowego i kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionowego.

PL 210 174 B1

Związek tytułowy: ES-MS: 726,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tp = 11,71 min. (System 1); pf = 0,45 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 40: Kwas (p)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-propionyloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 590,0 [M-H]^-; pf = 0,033 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 41: (S)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-N-{(S)-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-propionoamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu estru tert-butylowego kwasu {(S)-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-karbamowego i kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 666,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tp= 11,63 min. (System 1); pf = 0,46 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 42: Kwas (p)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-propionyloamino]-propionyloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 530,3 [M-H]^-; pf = 0,051 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 43: (S)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4-dimetoksy-fenylo)-N-{(S)-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-propionoamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu estru tert-butylowego kwasu {(S)-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-karbamowego i kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4-dimetoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 696,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tp = 11,39 min. (System 1); pf = 0,53 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 44: Kwas (p)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4-dimetoksy-fenylo)propionyloamino]-propionyloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 560,2 [M-H]^-; pf = 0,023 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 45: (S)-2-(3-Izopropylo-fenyloamino)-N-{(S)-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionoamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu estru tert-butylowego kwasu {(S)-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-karbamowego i kwasu (S)-2-(3-izopropylo-fenyloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 692,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tp = 11,49 min. (System 1); pf = 0,24 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 46: Kwas (p)-1-{(S)-2-[(S)-2-(3-izopropylo-fenyloamino)-3-(3,4,5-trimetoksyfenylo)-propionyloamino]-propionyloamino}-3-metylo-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 560,2 [M-H]^-; pf = 0,22 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 47: (S)-N-{(S)-1-[(p)-3-Metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-2-(3-fenylo-propionyloamino)-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionoamid

Związek tytułowy otrzymuje się z estru tert-butylowego kwasu {(S)-1-[(p)-3-metylo-1-((1S,2S,6p,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-etylo}-karbamowego poprzez powtórzenie dwuetapowej (usuwanie grupy osłaniającej/sprzęganie) procedury opisanej w Przykładzie 1, ale przy użyciu kwasu (S)-2-amino-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionowego i kwasu 3-fenylo-propionowego (Fluka) jako partnera w każdej reakcji sprzęgania (etap B, Przykład 1).

Związek tytułowy: ES-MS: 706,3 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tp = 10,81 min. (System 1); pf = 0,32 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

PL 210 174 B1

P r z y k ł a d 48: Kwas (R)-3-metylo-1-{(S)-2-[(S)-2-(3-fenylo-propionyloamino)-3-(2,3,4-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-propionyloamino}-butyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 570,3 [M-H]^-; Rf = 0,22 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 49: (S)-2-[(S)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-N-[(R)-2-fenylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-etylo]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(R)-2-fenylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-etylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 788,0 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 11,66 min. (System 1); Rf = 0,79 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etap 49.1: Ester tert-butylowy kwasu {(S)-2-metylo-1-[(R)-2-fenylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-etylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób analogiczny do syntezy estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(R)-3-metylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-butylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego (Przykład 1 (c)).

Związek tytułowy: ES-MS: 499,1 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 10,78 min. (System 1).

P r z y k ł a d 50: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(3,4,5-trimetoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-butyryloamino}-2-fenylo-etyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 652,2 [M-H]^-; Rf = 0,22 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 51: (S)-2-[(S)-2-(Bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-N-[(R)-2-fenylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-etylo]-butyroamid

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 1, ale przy użyciu estru tert-butylowego kwasu {(S)-2-metylo-1-[(R)-2-fenylo-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetylo-3,5-dioksa-4-bora-tricyklo[6,1,1,0^2,6]dec-4-ylo)-etylokarbamoilo]-propylo}-karbamowego i kwasu (S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-propionowego.

Związek tytułowy: ES-MS: 727,9 [M+H]⁺; HPLC: pojedynczy pik przy tR = 11,87 min. (System 1); Rf = 0,73 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 52: Kwas (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(bifenyl-3-iloamino)-3-(4-metoksy-fenylo)-propionyloamino]-3-metylo-butyryloamino}-2-fenylo-etyloboronowy

Związek tytułowy otrzymuje się w sposób opisany w Przykładzie 2; ES-MS: 591,8 [M-H]^-; Rf = 0,13 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

P r z y k ł a d 53: Hamowanie chymotrypsyno-podobnej aktywności protesomu 20S

W Tabeli 1 przedstawiono przykładowe wartości IC50 wyznaczone metodami testu opisanego powyżej dla związków o wzorze ogólnym I.

T a b e l a 1

Przykład	IC50 ^M] (wyniki z 1 lub 2 eksperymentów)	Przykład	IC50 ^M] (wyniki z 1 lub 2 eksperymentów)
1	2	3	4
1	0,0046/0,0024	28	0,0008
2	0,0028/0,0021	29	0,004
3	0,0017/0,0014	30	0,0059
4	0,0019/0,0015	31	0,0022
5	0,0013/0,0006	32	0,0037
6	0,0018/0,0019	33	0,0026
7	0,0029/0,0032	34	0,0013
8	0,0028/0,0045	35	0,0023
9	0,0017/0,0022	36	0,0023
10	0,0029/0,004	37	0,0013

PL 210 174 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4
11	0,0039	38	0,0017
12	0,0038	39	0,0019
13	0,0013	40	0,0022
14	0,0017	41	0,0012
15	0,0071	42	0,0019
16	0,0059	43	0,0018
17	0,0093	44	0,001
18	0,0015	45	0,0013
21	0,0015	46	0,0019
22	0,0017	47	0,0008
23	0,0021	48	0,0007
24	0,0021	50	0,0023
25	0,0008	51	0,0043
26	0,001	52	0,005
27	0,0003

P r z y k ł a d 54:

Ligand Trail został sklonowany, powielony, oczyszczony i przetestowany na komórkach Jurkat w celu określenia jego zdolności do indukowania apoptozy komórek. Stanowiło to część skriningu na anty-DR5. W skład testu wchodził błękit alamara, wskaźnik redoks fluoryzujący w przypadku, gdy zostaje zredukowany przez żywe komórki. Jeśli komórki ulegają apoptozie, powstałe środowisko ma właściwości utleniające i wskaźnik nie jest redukowany i nie obserwuje się fluorescencji. Jak pokazano na fig. 1, ligand TRAIL indukuje apoptozę komórek Jurkat.

Przeprowadzono skrining agonistów przeciwciał. Myszy immunizowano receptorem DR5 i pobrane komórki B poddano fuzji z komórkami szpiczaka. Powstałe hybrydomy ułożono na płytkach zawierających 384 studzienki i po kilku dniach hodowli do studzienek z komórkami Jurkat dodano 20 μl nadsączu i przeciwciała mostkującego. Po 24 godzinach dodano błękitu almara i po kolejnych 24 godzinach odczytano wynik używając czytnika Acquest. Pozytywny wynik reakcji przeciwciał uzyskano dla kilku studzienek.

Przetestowano swoistość przeciwciał dających wynik dodatni. Trzy hybrydomy, dla których uzyskano wynik dodatni zostały subklonowane, namnożone i oczyszczone. Sklonowano, powielono i oczyszczono 21 receptorów TNF. Receptory naniesiono na studzienki i trzy przeciwciała poddano analizie testem ELISA. Przeciwciała reagowały jedynie z DR5, zatem wykazywały wysoką swoistość, zob. Fig. 2.

Na fig. 3 przedstawiono analizę odpowiedzi na różne wielkości dawek. Trzech agonistów przeciwciał wykazywało różną odpowiedź (wywoływanie śmierci komórek Jurkat) na dawki. Przeciwciało A działało najsilniej i dlatego zostało wybrane do dalszych badań. Imgenex-257 to przeciwciało specyficzne względem DR5 bez aktywności funkcjonalnej.

Zbadano aktywację kaspazy 3. W celu określenia, czy przeciwciało powoduje śmierć komórek w procesie apoptozy a nie poprzez inny niebezpośredni lub nie-specyficzny mechanizm, przeprowadzono analizę aktywności kazspazy-3. Przeciwciało lub ligand zmieszano z komórkami w różnych stężeniach i zbadano uzyskane ekstrakty komórkowe. W celu określenia aktywacji kaspazy-3 do lizatu dodano odczynnika fluorescencyjnego. Przeciwciało stymulowało apoptozę w sposób podobny jak ligand. Wyniki zamieszczono na fig. 4.

Określono wpływ przeciwciała anty-DR5 na linie komórek raka okrężnicy i czerniaka. Na fig. 5 przedstawiono wyniki odpowiedzi komórek nowotworowych różnych linii na różne wielkości dawek przeciwciała. Wszystkie linie komórkowe były wrażliwe na przeciwciała DR5 indukujące apoptozę, za wyjątkiem linii komórek HCF 116 bax/bax, w przypadku której nie doszło do apoptozy.

PL 210 174 B1

Fig. 6 przedstawia taki sam eksperyment przeprowadzony na różnych liniach komórkowych raka piersi, Linie T47D i Zp-75-1 okazały się oporne na działanie przeciwnowotworowe przeciwciała anty-Dp5, podczas gdy linie MCF-7 i MDA-MB-231 były wrażliwe.

Z fig. 7 wynika, że komórki nowotworowe są wrażliwe na działanie przeciwciała, ale normalne komórki, ludzkie fibroblasty płuc (HLF) i ludzkie komórki nabłonka żyły pępkowej (HUVEC), są oporne, na co wskazuje brak odpowiedzi na różnej wielkości dawki przeciwciała.

W celu dalszego potwierdzenia tezy, że przeciwciało nie wywołuje apoptozy normalnych komórek, zbadano aktywność kaspazy 3 w ludzkich fibroblastach płuc, ludzkich komórkach nabłonka żyły pępkowej i normalnych ludzkich hepatocytach po podaniu przeciwciała anty-Dp5. Żadne z normalnych komórek nie wykazały aktywności kaspazy-3, podczas gdy taką aktywność, związaną z apoptozą, stwierdzono w komórkach DOHH2 chłoniaka grudkowego i komórkach Jurkat, zob. fig. 8.

Ponadto, przeciwciało anty-Dp5 działa na linię komórek raka jajnika (CaOV3), a nie działa na normalne komórki HLF i HMEC.

Badano skuteczność przeciwciała w warunkach in vivo. Dnia 0 dziesięciu myszom wstrzyknięto dożylnie 5x10⁶ komórek raka okrężnicy (colo 205). Leczenie przeciwciałem anty-DR5 (400 μg) rozpoczęto dnia 11. U pięciu zwierząt, którym wstrzyknięto dwukrotnie 400 μg DR5 oznak nowotworu nie zaobserwowano, podczas gdy u pięciu, którym podano bufor PBS zamiast Dp5, nowotwory były duże. Zatem wydaje się, że przeciwciało jest również skuteczne w warunkach in vivo.

Badanie kontynuowano do dnia 32. Myszy nieleczone miały duże nowotwory lub zdechły. U leczonych myszy nie stwierdzono oznak choroby. Eksperyment ukończono dnia 50. Wówczas wszystkie nieleczone myszy już nie żyły. Żadna z leczonych myszy nie wykazywała oznak choroby dnia 50. Na fig. 9 w sposób graficzny pokazano wyniki badania skuteczności przeciwciała w linii komórkowej Colo 205. Strzałki wskazują dzień leczenia.

Opisany wyżej eksperyment był badaniem z podawaniem dawki jednokrotnej. W celu określenia potencjału działania przeciwciała przeprowadzono badania z podawaniem dawek w większym zakresie. pozmiar grup powiększono do 8 myszy na grupę i podawano przeciwciało w dawkach 50, 200 i 400 μg w sposób opisany w poprzednim badaniu. Wyniki badania pokazują, że przeciwciało jest skuteczne także w niskich dawkach (np. 50 μg), zob. Fig. 10.

Przeprowadzono także badania odpowiedzi na niższe dawki leku w nowym modelu na linii komórek czerniaka A2058. Ta linia komórkowa była bardziej oporna na przeciwciało w warunkach in vitro. Grupa składała się z dwóch myszy. U leczonych myszy (400 μg) zaobserwowano działanie przeciwnowotworowe przeciwciała, podczas gdy u myszy leczonych dawką wielkości 20 μg lub u tych, którym podawano bufor PBS, guzy miały duże rozmiary, zob. Fig. 11.

Ponieważ w różnych liniach komórkowych zaobserwowano różną wrażliwość na przeciwciało Dp5, zbadano wpływ małocząsteczkowych synergetyków uwrażliwiających oporne linie komórkowe na działanie przeciwciała. Problem rozwiązywano analizując ścieżki apoptozy, określając w którym miejscu ścieżki apoptoza może być potencjalnie blokowana i jakiego typu małocząsteczkowe synergetyki mogłyby działać z natury proapoptotycznie.

Na fig. 12 przedstawiono zewnętrzne (receptorowe) i wewnętrzne (mitochondrialne) ścieżki apoptozy. Istotne jest, że w komórkach nowotworowych nadekspresji ulegają inhibitory apoptozy (białka lAP) i Bcl2 blokujący uwalnianie kluczowych białek działających proapoptotycznie (cytochrom c i SMAC) z mitochondrium. Blokowanie tego typu można obejść dodając SMAC, który hamuje białka lAP. Mimetyk SMAC zwany LB 672 został przebadany pod względem jego potencjalnego synergistycznego wpływu na uwrażliwianie komórek nowotworowych na działanie agonisty Dp5.

Fig. 13 ilustruje wpływ mimetyka SMAC na komórki czerniaka A2058. Wcześniej, w niniejszym dokumencie pokazano, iż komórki te są częściowo wrażliwe na przeciwciało. Z zamieszczonego wykresu wynika, że komórki poddawane działaniu SMAC i przeciwciała Dp5 ulegają apoptozie, podczas gdy sam związek 672 praktycznie na nie nie działa.

Na fig. 14 zamieszczono wykresy ilustrujące odpowiedź komórek czerniaka A2058 w zależności od stężenia SMAC. Ponownie okazuje się, że komórki nowotworowe są częściowo oporne, ale są wrażliwe na niskie stężenia SMAC (50-100 nM). Jednakże bardziej istotne jest, że ani komórki HMEC, ani komórki HLF nie są uwrażliwiane przez mimetyk SMAC LB672.

Fig. 15 przedstawia właściwości farmakokinetyczne SMAC.

Badano działanie inhibitorów proteasomów jako synergetyków przeciwciał anty-Dp4/Dp5. Jak wynika z fig. 16, inhibitory proteasomów zapobiegają degradacji IkB przez proteasom, co z kolei za50

PL 210 174 B1 pobiega uwalnianiu NFkB, o którym wiadomo, że przemieszcza jądra i inicjuje transkrypcję BCL2, lAPS i innych czynników antyapoptotycznych.

Najpierw zbadano, czy inhibitory proteasomu będą uwrażliwiać komórki nowotworowe na DR5. W tym celu dodano MG132, dostępny na rynku słaby inhibitor proteasomu. Z fig. 17 wynika, że MG132 stosowany w dość wysokich stężeniach uwrażliwia oporne komórki raka okrężnicy SW 480 na działanie przeciwciała.

W pracy zidentyfikowano także kilka silnych inhibitorów protesomów. Związkami, które wykazywały najsilniejszy efekt były boroniany. Maksymalna tolerowana dawka wskazuje, że są to związki o względnie dużej szkodliwości, a zatem zakres między toksycznością a aktywnością przeciwnowotworową w warunkach in vivo jest wąski, zob. Fig. 18.

Inhibitory proteasomów uwrażliwiają A2058-LUC na przeciwciała anty-DR5, zob. Fig. 19. Inhibitory proteasomów uwrażliwiają również na te przeciwciała oporne komórki wątrobiaka linii HUH-7. Ponadto, żaden z tych związków nie ma wpływu na normalne komórki HMEC i komórki te nie są wrażliwe na działanie przeciwciała, zob. Fig. 21.

Zmienne regiony przeciwciała A myszy A sklonowano i umieszczono w systemie ekspresji SP20. Wektory te kodowały fragmenty fc ludzkiego IgG 1. Powstała w wyniku tego chimera składa się z 80% przeciwciała ludzkiego i 20% przeciwciała myszy. Sekwencje nukleinowe zmiennych regionów ciężkiego i lekkiego łańcucha zamieszczono na fig. 23. Sekwencję aminokwasową zmiennego regionu ciężkiego łańcucha zamieszczono na fig. 24 lub 35, a sekwencję aminokwasową zmiennego regionu lekkiego łańcucha zamieszczono na fig. 25 lub 35. Chimerę poddano ekspresji w komórkach SP2/0 (20 pg/komórkę/dzień). Powstałe ludzkie chimeryczne przeciwciało zostało zmostkowane z fragmentem Fc anty-ludzkiego przeciwciała koziego i przetestowane pod względem jego aktywności funkcjonalnej. Przeciwciało chimeryczne wykazywało aktywność przeciwnowotworową równoważną mysiemu przeciwciału, zob. Fig. 22.

P r z y k ł a d 55:

Bibliotekę siRNA transfekowano do komórek, komórki poddano działaniu liganda TRAIL i przebadano je pod względem zmienionej zdolności do przeżycia w porównaniu do ich zachowania przy nieobecności liganda. Komórki o zmienionej zdolności do przeżycia użyto następnie w celu zidentyfikowania siRNA transfekowanego do komórek, w ten sposób określając gen hamowany przez siRNA, zob. Rysunki 26 i 27.

Na fig. 28 przedstawiono produkty genów odpowiadające cząsteczkom siRNA zidentyfikowanym na podstawie badania. Produkty genów, których hamowanie przy użyciu siRNA prowadzi do niskiego stosunku TRAIL (+/-) to inhibitory apoptozy indukowanej przez TRAIL.

W Tabeli 1 zamieszczono dodatkowe informacje, z włączeniem numeru dostępu Banku Genów dla produktów genów z fig. 28.

T a b e l a 1

Komentarz	nr dostępu	symbol	bez TRAIL	z TRAIL	stos.	p
1	2	3	4	5	6	7
Aktywatory apoptozy indukowanej przez TRAIL
H.s. pleksyna B1 (PLXNB1), mRNA''	NM_002673	PLXNB1	73,85	5,96	0,081	6,27E-05
H.s. białko zawierające domenę SET 7 (SET7), mRNA	NM_030648	SET7	79,06	7,30	0,092	0,000266
H.s. kinaza kinazy aktywowanej przez mitogen 5 (mAp3K5)	NM_005923	MAP3K5	86,84	8,58	0,099	0,000585
H.s. kinaza podobna do STE20 (JIK), mRNA	NM_016281	JIK	86,41	8,67	0,102	0,000727
H.s. kinaza serynowo-treoninowa oddziałująca z kinazą MAP 1 (MKNK1)	NM_003684	MKNK1	76,61	8,13	0,105	0,000755
H.s. przypuszczalne białko retikulum endoplazmatycznego (RFT1)	NM_052859	RFT1	77,39	7,99	0,105	0,000892

PL 210 174 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7
Ludzka kinaza-5 fosfatydyloinozy-
tolo-4-fosforanu, typu I, gamma	XM_047620	PIP5K1C	83,06	8,88	0,107	0,001498
(PIP5K1C)
H.s. kinaza białkowa aktywowana		MAP-
przez kinazę MAP 2 (MAPKAPK2), wariant 1 transkryptu	NM_004759	KAPK2	77,71	8,44	0,113	0,002227
H.s. kinaza kinazy białkowej akty-
wowanej przez mitogen 5	NM_002757	MAP2K5	94,66	11,24	0,119	0,00381
(MAP2K5)
H.s. cyklinozależna kinaza 6	NM 001259	CDK6	84,10	10,52	0,125	0,006206
(CDK6), mRNA
H.s. receptor aktywiny A podobny	NM 000020	ACVRL1	84,64	10,40	0,128	0,006776
do typu II, 1 (ACVRL1), mRNA
H.s. homolog onkogenu wirusa kociego mięśniaka GardnerRasheeda (v-fgr) (FGR), mRNA	NM_005248	FGR	106,43	13,45	0,129	0,007914
H.s. hipotetyczne białko FLJ21802	NM 024644	FLJ21802	96,15	12,46	0,133	0,006866
(FLJ21802), mRNA
H.s.receptorowa kinaza tyrozynowa swoista dla mięśni szkieleto-	NM_005592	MUSK	96,32	12,17	0,127	0,008166
wych (MUSK), mRNA”””
H.s. otwarta ramka odczytu chromosomu 20, 88 (C20orf88), mR-	NM_080820	C20orf88	76,58	10,09	0,132	0,009842
NA
H.s. pączkowanie niehamowane przez benzoimidazole 1 (homolog	NM_004336	BUB1	75,76	9,65	0,133	0,009722
drożdży) (BUB1), mRNA”””
H.s. rybosomalna kinaza białkowa
S6, 90kD, polipeptyd 5 (RPS6KA5), mRNA”””	NM_004755	RPS6KA5	77,84	10,22	0,132	0,010693
H.s. homolog onkogenu spokrew-
nionego z wirusem mięsaka	NM_002350	LYN
Yamaguchi v-yes-1 (LYN), mR-
NA”””
H.s. kinaza białkowa aktywowana	NM 002749 1	MAPK7
przez mitogen 7 (MAPk7), mRNA
H.s. homolog onkogenu wirusa
grasiczaka mysiego v-akt 1	NM_005163	AKT
(AKT1), mRNA”””
H.s. cząstka rozpoznająca sygnał	NM 006947	SRP72	77,23	71,11	0,946	0,00073
72kD (SRP72), mRNA
Inhibitory apoptozy indukowanej przez TRAIL
Kaspaza-8	NM_001228	CASP8	99,30	84,45	0,850	0,002444
Bid	NM_001196	Bid	110,50	91,95	0,832	0,003027
receptor DR4/trail 1	NM_003844	DR4	87,26	70,90	0,807	0,003725
H.s. B-limfoidalna kinaza tyrozy-	NM 001715	BLK	98,04	77,87	0,801	0,004003
nowa (BLK), mRNA
izozym M2, podobny do kinazy pirogronianowej (lOc148283)	XM_086132	PKM2like	83,15	60,32	0,778	0,006752

PL 210 174 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7
H.s. kinaza syntazy glikogenu 3 alfa (GSK3A), mRNA	NM_019884	GSK3A	104,20	76,91	0,740	0,008469
hipotetyczne białko FLJ32312 (FLJ32312)	NM_144709	FLJ32312	88,32	65,01	0,751	0,010144
H.s. kinaza białkowa aktywowana przez ,otogen, 10 (MAPK10), mRNA	NM-002753	MAPK10/J NK3
TCF4: czynnik transkrypcyjny 4, nr lokusu: 6926	NM_003199	TCF4
H.s. homolog onkogenu wirusa białaczki mysiej Abelsona v-abl 2 (arg, gen spokrewniony z onkogenem Abelsona) (ABL2), transkrypt	NM_005158	ABL2
H.s. homolog onkogenu wirusa ptasiego mięsaka UR2, v-ros, 1 (ROS1), mRNA”	NM_002944	ROS1
homolog onkogenu wirusa ptasich nacieków mielocytowych V-myc	NM_002467	MYC

P r z y k ł a d 56:

Wykryto, że siRNA swoiście hamują ekspresję Gsk3α lub GSK3e, co umożliwia określenie wpływu dowolnego produktu genu na apoptozę indukowaną przez TpAIL. Jak pokazano na fig. 29, hamowanie Gsk3α, ale nie Gsk3e, powoduje obniżenie aktywności kaspazy w komórkach w porównaniu z próbą kontrolną. Zatem Gsk3α jest aktywatorem apoptozy indukowanej przez TRAIL. Podobnie, wykryto, że dwa inne produkty genów, SRP72 i FLJ32312, są także aktywatorami apoptozy.

Związki między różnymi komponentami przedstawiono na fig. 30. Fig. ilustruje relacje i wpływ (np. aktywator lub inhibitor apoptozy) różnych składników ścieżki apoptozy indukowanej przez TRAIL.

P r z y k ł a d 57:

Bibliotekę siRNA ukierunkowaną na 510 genów umieszczonych w 384 studzienkach przeniesiono do komórek Hela na drodze transfekcji, Komórki inkubowano przez 48 godzin w celu umożliwienia docelowego wyciszenia i podziałano na niektóre z nich ligandem TRAIL. Przeżywalność zmierzono 20 godzin po dodaniu liganda TRAIL przy użyciu błękitu alamara. Stosunek wrażliwości wyznaczono dla każdego siRNA w celu porównania z 60 wartościami otrzymanymi dla kontrolnych siRNA. W przypadku komórek Hela, na które podziałano ligandem TRAIL, nastąpił 40% spadek zdolności do przeżycia w porównaniu z próbkami w kontrolnych studzienkach, co określono za pomocą testów MTT. Zidentyfikowano siRNA, które w istotny sposób hamowały lub wzmagały śmierć komórek, zob. Tabele 2 i 3.

T a b e l a 2 - siRNA hamujące apoptozę

Numer dostępu	Symbol	Stos. wrażl.	Wartość p
1	2	3	4
NM_006947	SRP72	0,94	8,5E-22
NM_001715	BLK	0,79	5,9E-16
XM_086132	PKM2-like	0,75	3,6E-14
NM_019884	GSK3A	0,73	3,6E-14
NM_144709	FLJ32312	0,72	1,8E-12
NM_002467	C-MYC	0,69	5,3E-11
NM_025133	FLJ2673	0,65	2,9E-09
NM-002944	ROS1	0,61	2,5E-08
NM_005158	ABL2	0,61	2,9E-08

PL 210 174 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4
NM_004705	DAP4	0,61	3,2E-08
NM_002753	JNK3	0,60	7,8E-08
NM_003199	TCF4	0,59	2,0E-07
NM_022575	VPS16	0,59	2,1E-07
NM_000858	GUK1	0,59	3,3E-07
NM_006257	PRKCQ	0,55	8,9E-06
NM_006252	PRKAA2	0,54	5,3E-05
AK074085	FLJ00156	0,53	8,6E-05
NM_006254	PRKCD	0,53	1,0E-04
NM_001569	IRAK1	0,52	1,3E-04
NM_004422	DVL2	0,52	1,3E-04

T a b e l a 3 - siRNA wzmagające apoptozę

Numer dostępu	Symbol	Stos. wrażl.	Wartość p
NM_012290	TLK1	0,15	3,7E-21
NM_016231	NLK	0,15	5,7E-22
NM_015071	GRAF	0,14	1,4E-21
NM_000162	GCK	0,14	2,5E-22
NM_005163	AKT1	0,14	1,1E-22
NM_002749	ERK5	0,14	6,8E-23
NM_002350	LYN	0,14	3,0E-24
NM_004755	RPS6KA5	0,13	5,6E-24
NM_004336	BUB1	0,13	8,2E-27
NM_005592	MUSK	0,12	3,2E-27
NM_024644	FLJ21802	0,12	9,5E-28
NM_005248	FGR	0,12	2,2E-28
NM_000020	ACVRL1	0,12	3,4E-28
NM_002757	MEKK5	0,11	1,4E-28
XM_047620	PIP5K1C	0,11	2,8E-33
NM_004759	MAPKAPK2	0,10	1,9E-18
NM_052859	RFT1	0,10	7,8E-35
NM_003684	MKNK1	0,10	9,3E-37
NM_016281	JIK	0,09	4,4E-37
NM_002673	PLXNB1	0,08	2,7E-38

Zmierzono zdolność kilku siRNA, wzmagających śmierć komórek, co określono na podstawie testów przeżywaIności, do zwiększania aktywacji kaspazy w obecności przeciwciał agonistycznych DR5. Przeciwciało anty-DR5 zmiareczkowano w celu zminimalizowania aktywacji kaspazy wyznaczanej przy użyciu fluorogenicznych peptydów (DEVD-afc). siRNA ukierunkowane przeciwko nsrna, nsurf, PAK1, stk12, Ask1 i JIK przeniesiono do komórek Hela na drodze transfekcji i następnie podziałano na nie przeciwciałami anty-DR5. W kontrolnej próbce z siRNA (nsrna) nie zaobserwowano istotnego efektu, podczas gdy zidentyfikowane wcześniej siRNA znacząco podwyższały aktywność kaspazy.

PL 210 174 B1

Kilka dodatkowych (różnych od tych przebadanych wcześniej w badaniu skriningowym) siRNA ukierunkowanych na PAK1 przetestowano pod względem ich wpływu na zdolność do przeżycia komórek w obecności i nieobecności przeciwciała anty-DR5. Przebadano następujące siRNA:

siPAK1-0 AGAGCTGCTACAGCATCAA siPAK1-1 GACAUCCAACAGCCAGAAA siPAK1-2 GAGAAAGAGCGGCCAGAGA hPAK1-6 UACCAGCACUAUGAUUGGA siPAK1-7 UCUGUAUACACACGGUCUG

PAK1-1 i PAK1-2 istotnie obniżały przeżywalność (test MTT) w linii komórek raka okrężnicy HCT116 bax +/- mierzonej po 24 i 48 godzinach.

Komórki HCT116 bax -/- miały usunięte obie kopie bax, co uodparnia komórki na leczenie chemioterapeutykami, z włączeniem TRAILI i przeciwciał anty-DR5. Jednakże PAK1 siRNA okazały się skuteczne w obniżaniu przeżywaIności komórek. Podobne efekty zaobserwowano w komórkach raka okrężnicy DLD1.

W celu określenia, czy wyciszanie lub hamowanie PAK1 jest szkodliwe dla normalnych komórek, przebadano PAK1 siRNA na linii normalnych komórek nabłonka jajnika IOSE80. Wyniki pokazały, że siRNA ukierunkowane przeciwko PAK1 nie obniża przeżywalność normalnych komórek. Zatem można tak powiedzieć o PAK1 i innych produktach genów.

Ponadto, siPAK1 nie obniża znacząco przeżywaIności normalnych komórek nabłonka linii HMEC, podczas gdy silnie wzmacnia obniżanie przeżywaIności indukowane przez DR5 i DR4 w linii komórek raka okrężnicy HCT15.

P r z y k ł a d 58:

Synergistyczny efekt antagonisty UbcH10 i przeciwciała anty-DR5

W niniejszym przykładzie opisano synergistyczny efekt antagonisty ludzkiego enzymu sprzęgającego ubikwitynę UbcH10 (UBE2C) i przeciwciała anty-DR5 w indukowaniu apoptozy komórek nowotworowych. UbcH10 ulega nadekspresji w komórkach nowotworu złośliwego obejmującego różne miejsca ciała, szczególnie piersi, żołądek/przełyk, jelito grube, płuca i jajniki. Dane wskazują, że UbcH10 odgrywa istotną rolę w rozwoju nowotworu. Przebadano możliwości hamowania UbcH10 w leczeniu raka.

Hamowanie wzrostu komórek poprzez wyciszanie ekspresji UbcH10. Najpierw przebadano skutki wyciszania genów w komórkach nowotworowych mających wysoki poziom UbcH10. Zaprojektowano sekwencje dla trzech różnych i niepokrywających się małych interferujących RNA (siRNA) (UbcH10-495, UbcH10-378, UbcH10-412). Wszystkie siRNA testowano na dwóch liniach komórkowych T3M4 (raka trzustki) i DLD-1 (raka jelita grubego). Wszystkie trzy siRNA ukierunkowane na UbcH10 powodowały skuteczne obniżenie poziomu białka UbcH10, co korelowało z ich zdolnością do hamowania wzrostu komórek. Takiego wyniku nie osiągnięto w przypadku kontrolnego siRNA. Dane te podkreślają specyficzność UbcH10 siRNA i wskazują, iż uzyskane wyniki nie są związane z efektami przypadkowymi. Ponieważ kompleks UbcH10-APC kontroluje degradację cykliny B1, zbadano także poziom cykliny B1 stosując analizę Western Blot po wyciszeniu UbcH10. Wyniki ujawniły odwrotną korelację między poziomem białka UbcH10 w komórkach, na które działano siUbcH10 i poziomem cykliny B1. Ponadto, analiza cyklu komórkowego po podziałaniu na nie siUbcH10 wykazała zatrzymanie fazy-M (danych nie pokazano), co jest zgodne z danymi ze stanu techniki. Mikroskopowo, regulacja „w dół (down-regulacja) UbcH10 nie indukuje żadnych zmian w morfologii komórek wskazujących na apoptozę, takich jak zaokrąglenie, oderwanie, kondensacja jąder lub wytwarzanie ciał apoptotycznych. Ponadto, leczenie siUbcH10 nie spowodowało proteolitycznego przetworzenia dwóch kaspaz - egzekutorów sygnału śmierci, kaspazy-3 i -17 (14), na co wskazywały wyniki analizy Western Blot i pomiary fluorescencyjne aktywności kaspazy.

Regulacja „w dół (down-regulacja) UbcH10 i podawanie standardowych środków chemioterapeutycznych daje efekt addytywny: UbcH10 ulega nadekspresji w ludzkich komórkach nowotworowych w porównaniu z większością normalnych komórek. W celu wykrycia efektów występujących po wyciszeniu UbcH10 i określenia możliwości leczenia przeciwnowotworowego ukierunkowanego na UbcH10, zbadano działanie kilku znanych chemioterapeutyków i molekularnie ukierunkowanego środka. W badaniach zastosowano środki o rożnym działaniu: paklitaksel stabilizujący mikrotubule, inhibitor wrzeciona, winblastynę, środek alkilujący DNA, mitomycynę c i funkcjonalnie agonistyczne przeciwciało zdolne do wywoływania apoptozy, w której pośredniczy DR5/TRAIL. Na dwie linie komórek trzustki, T3M4 i Panc-1, linie komórek raka prostaty niezależnej od androgenów, CWR-RV1, działano

PL 210 174 B1 siUbcH10 przez 48 godzin, a następnie komórki inkubowano z winblastyną, paklitakselem, mitomycyną c i anty-DR5 przez kolejne 24 godziny. Wyniki wskazują, że skojarzone leczenie ze środkami działającymi szkodliwie na mitozę i uszkadzającymi DNA podawanymi po wyciszeniu UbcH10 powoduje dodatkowe obniżenie zdolności do przeżycia komórek nowotworowych wielu badanych linii (Rys. 31). Początkowe działanie siUbcH10 w ciągu 48 godzin na komórki nowotworowe spowodowało 50% zmniejszenie liczebności żywych komórek. Dalsze obniżenie liczebności uzyskano w wyniku dodawania środków cytotoksycznych przez kolejne 24 godziny. Po unormowaniu liczebności komórek wyciszonych przy użyciu UbcH10, stężenia IC90 lub IC50 były identyczne, co wskazywało na efekt addytywny. Wszystkie trzy niezależne siRNA ukierunkowane na UbcH10 wywierały podobny efekt jak TRAIL w komórkach T3M4 i Panc-1. Dane stanowią średnią z trzech próbek i podobne wyniki otrzymano w czterech niezależnych eksperymentach.

Regulacja „w dół UbcH10 uwrażliwia komórki na indukujące apoptozę TRAIL i przeciwciało anty-DR5: Na normalne ludzkie fibroblasty (BJ), ludzkie komórki nabłonka sutka (HMEC) i komórki T3M4 działano kolejno siUbcH10 (siUbcH10-495) przez 48 godzin, a następnie przeciwciałami anty-DR5 (500 ng/ml) przez kolejne 6 godzin. W celu zapewnienia jednakowej wydajności transfekcji wszystkich linii komórkowych z włączeniem komórek BJ i HMEC, użyto kontrolnych siRNA znakowanych znacznikami fluoresencyjnymi (FITC). Komórki analizowano mikroskopowo. Wyniki zamieszczono na fig. 31 i 32. Jak wynika z Rysunków, wstępne działanie na komórki T3M4 i Panc-1 siUbcH10 powoduje istotny wzrost stopnia apoptozy indukowanej przez przeciwciała anty-DR5 w porównaniu do leczenia samym siRNA lub samym anty-DR5. Wpływ na komórki CWR-RV1, które są niewrażliwe na TRAIL, był nieznaczny (Rys. 31). Dane wskazywały, że inkubacja komórek nowotworowych różnych linii, w szczególności T3M4, z przeciwciałem anty-DR5 przed działaniem siUbcH10, radykalnie wzmaga apoptozę. Efektu tego nie stwierdzono w przypadku normalnych ludzkich fibroblastów skóry (BJ) lub komórek nabłonka sutka (HMEC) (Rysunki 31 i 32). Obserwacja ta odzwierciedla typowe zachowanie, ponieważ inne linie komórek nowotworowych opornych na TRAIL jak i normalne komórki nie uwrażliwiły się na TRAIL w wyniku regulacji „w dół UbcH10.

P r z y k ł a d 59:

Działanie synergiczne agonistów anty-DR4 lub anty-DR5 i inhibitorów proteasomów na komórki nowotworowe z defektem proapoptycznego białka Bax.

Uszkodzenia systemu naprawy DNA (naprawa niedopasowanych zasad (MMR)) prowadzi do ogólnej niestabilności z powodu nienaprawionych błędów replikacyjnych. Ten rodzaj genetycznej niestabilności jest czynnikiem kluczowym w progresywnym wzroście dziedzicznego niepolipowatego raka jelita grubego (HNPCC) i innych rzadziej występujących raków okrężnicy, a w przypadku krótkich powtarzających się sekwencji, takich jak te w genach TGFbetaRII i BAX, częstość mutacji jest szczególnie wysoka. Zatem defekt białka Bax umożliwia przetrwanie komórkom nowotworowym i blokuje naturalną i indukowaną chemioterapeutykami apoptozę.

Z fig. 34 wynika, że utrata Bax jest źródłem oporności na ligand TRAIL. Jednakże hamowanie proteasomu przywraca wrażliwość na TRAIL. Hamowanie proteasomu przez inhibitory peptydylowe MG-132 lub MG262, bądź laktacystynę - związek pochodzenia naturalnego, całkowicie przywraca wrażliwość na ligand TRAIL w komórkach ubogich w Bax, zob. Fig. 34.

Inhibitory proteasomów naprawiają defekty w mitochondrialnej ścieżce apoptozy. Zależnie od rodzaju komórek, aktywna kasapaza-8 prowadzi do aktywacji egzekucyjnych kaspaz efektorowych jak kaspaza-3 (tzw. komórki typu-I). W komórkach typu II (większość komórek z włączeniem komórek HCT116), dwie ścieżki, zewnętrzna (receptora śmierci) i wewnętrzna (mitochondrialna) są połączone ze sobą poprzez rozszczepienie proapoptytocznego białka Bid z rodziny bcl-2, w którym pośredniczy kaspaza 8 i co aktywuje uwolnienie cytochromu c i SMAC z mitochondrium. Po uwolnieniu do cytoplazmy, cytochrom c wiąże się z Apaf-1 i pro-kaspazą-9 tworząc „apoptosom, co prowadzi do aktywacji pro-kaspazy-9 i dalszej aktywacji kaspazy efektorowej, takiej jak kaspaza-3. Z drugiej strony cytosolowy SMAC wiąże się do białka z rodziny lAP (inhibitora apoptozy) i w ten sposób zapobiega hamowaniu kaspazy-3 i -9 przez lAP.

Efekty te zostały zaobserwowane przy użyciu analizy Western Blot w komórkach Bax +/poddanych działaniu liganda TRAIL (nie pokazano uwalniania Smac i cytochromu c), zob. Fig. 34. Podobnie, w komórkach Bax -/- poddanych działaniu liganda TRAIL (T), przetwarzanie kaspazy-8 i białka Bid postępowało normalnie, czego nie można było powiedzieć o przetwarzaniu kasapazy-9 i zupełnej obróbce kaspazy-3 (linie 2, 3 i 4). Zjawisko to było możliwe do przewidzenia, ponieważ utrata białka Bax zapobiega rozszczepieniu Bid - powstały proapoptotyczny fragment Bid wymaga do tego

PL 210 174 B1 obecności Bax. TRAIL (T) + MG-262 (M) całkowicie przywracają ścieżkę mitochondrialną, w wyniku której następuje przetwarzanie kaspazy-9 i kasapazy-3 oraz aktywacja prowadząca do śmierci komórki. MG-262 (M) sam z siebie nie wpływa na szlak proteolityczny. Te i inne dane wskazują, iż w wyniku hamowania proteasomu, komórki nowotworowe zawierające defekty mitochondrialnej ścieżki apoptozy ponownie uwrażliwiają się na indukujących apoptozę agonistów receptora TRAIL.

Claims (30)

1. Sposób indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych, znamienny tym, że obejmuje skontaktowanie komórek z: (i) przeciwciałem anty-DR5 oraz (ii) środkiem indukującym apoptozę, wybranym z grupy złożonej z:

(i) środka zapobiegającego lub zmniejszającego ekspresję BCL-2;

(ii) inhibitora proteasomów; 7 (iii) inhibitora białka hamującego apoptozę (lAP);

(iv) antagonisty PAK1;

(v) antagonisty polipeptydu wybranego z grupy złożonej z nsurf i JIK; oraz (vi) siRNA, przy czym przeciwciało anty-DR5 zawiera zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający sekwencję nr 6 oraz zmienny region lekkiego łańcucha o sekwencji nr 8.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciałem jest przeciwciało jednołańcuchowe.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że środek zapobiegający lub zmniejszający ekspresję BCL-2 zapobiega aktywacji NFkB.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że środek zapobiegający aktywacji NFkB zapobiega degradacji IkB.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inhibitor proteasomów jest wybrany z grupy złożonej z PS-341, MG-262 i MG-132.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inhibitorem białka hamującego apoptozę (lAP) jest SMAC lub mimetyk SMAC.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórkami nowotworowymi są komórki raka okrężnicy lub komórki raka trzustki.

9. Przeciwciało anty-DR5 do zastosowania do indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych przy podawaniu wspólnie ze środkiem indukującym apoptozę, wybranym z grupy złożonej z:

(i) środka zapobiegającego lub zmniejszającego ekspresję BCL-2 lub UbcH10;

(ii) inhibitora proteasomów;

(iii) inhibitora białka hamującego apoptozę (lAP);

(iv) antagonisty PAK1;

(v) antagonisty polipeptydu wybranego z grupy złożonej z UbcH10, nsurf i JIK; oraz (vi) SiRNA, przy czym przeciwciało anty-DR5 zawiera zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający sekwencję nr 6 oraz zmienny region lekkiego łańcucha o sekwencji nr 8.

10. Przeciwciało anty-DR5 według zastrz. 9, znamienne tym, że jest przeznaczone do podawania osobno w stosunku do środka indukującego apoptozę.

11. Przeciwciało anty-DR5 według zastrz. 9, znamienne tym, że jest przeznaczone do podawania w postaci mieszaniny ze środkiem indukującym apoptozę.

12. Przeciwciało anty-DR5 według zastrz. 9, znamienne tym, że jest przeciwciałem humanizowanym.

13. Przeciwciało anty-DR5 według zastrz. 9, znamienne tym, że jest przeciwciałem jednołańcuchowym.

14. Przeciwciało anty-DR5 według zastrz. 9, znamienne tym, że jest przeznaczone do podawania wspólnie ze środkiem zapobiegającym lub zmniejszającym ekspresję BCL-2 lub UbcH10, przy czym ten środek zapobiega aktywacji NFkB.

15. Przeciwciało anty-DR5 według zastrz. 14, znamienne tym, że środek zapobiegający aktywacji NFkB zapobiega degradacji IkB.

PL 210 174 B1

16. Przeciwciało anty-DR5 według zastrz. 9, znamienne tym, że jest przeznaczone do podawania wspólnie z inhibitorem proteasomów wybranym z grupy złożonej z PS-341, MG-262 i MG-132.

17. Przeciwciało anty-DR5 według zastrz. 9, znamienne tym, że jest przeznaczone do podawania wspólnie z inhibitorem białka hamującego apoptozę (lAP) którym jest SMAC lub mimetyk SMAC.

18. Przeciwciało anty-DR5 według zastrz. 9, znamienne tym, że jest przeznaczone do zastosowania do indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych, którymi są komórki raka okrężnicy lub komórki raka trzustki.

19. Kompozycja farmaceutyczna o działaniu niszczącym nowotwory, zawierająca terapeutycznie skuteczną ilość (i) przeciwciała anty-DR5 oraz (ii) środka indukującego apoptozę, wybranym z grupy złożonej z:

(i) środka zapobiegającego lub zmniejszającego ekspresję BCL-2 lub UbcH10;

(ii) inhibitora proteasomów;

(iii) inhibitora białka hamującego apoptozę (lAP);

(iv) antagonisty PAK1;

(v) antagonisty polipeptydu wybranego z grupy złożonej z UbcH10, nsurf i JIK; oraz (vi) siRNA, przy czym przeciwciało anty-DR5 zawiera zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający sekwencję nr 6 oraz zmienny region lekkiego łańcucha o sekwencji nr 8.

20. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że przeciwciałem jest przeciwciało humanizowane.

21. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że przeciwciałem jest przeciwciało jednołańcuchowe.

22. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że środek zapobiegający lub zmniejszający ekspresję BCL-2 lub UbcH10 zapobiega aktywacji NFkB.

23. Kompozycja według zastrz. 22, znamienna tym, że środek zapobiegający aktywacji NFkB zapobiega degradacji IkB.

24. Kompozycja według zastrz. 19, znamienna tym, że inhibitorem białka hamującego apoptozę (lAP) jest SMAC lub mimetyk SMAC.

25. Przeciwciało anty-DR5 zawierające zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający sekwencję nr 6 oraz zmienny region lekkiego łańcucha o sekwencji nr 8.

26. Przeciwciało według zastrz. 25, znamienne tym, że jest przeciwciałem humanizowanym.

27. Przeciwciało według zastrz. 25, znamienne tym, że jest przeciwciałem jednołańcuchowym.

28. Komórka zwierzęca wykazująca ekspresję kwasu nukleinowego kodującego przeciwciało określone w zastrzeżeniu 25.

29. Przeciwciało według zastrz. 25, znamienne tym, że jest przeciwciałem tetramerowym.

30. Sposób indukowania in vitro apoptozy komórek nowotworowych, znamienny tym, że obejmuje skontaktowanie komórek z przeciwciałem anty-DR5 zawierającym zmienny region ciężkiego łańcucha zawierający sekwencję nr 6 oraz zmienny region lekkiego łańcucha o sekwencji nr 8.