KR20050094811A - 암세포에서 아팝토시스를 유도하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

암세포에서 아팝토시스를 유도하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암세포에서 아팝토시스를 상승적으로 유도하는, 아팝토시스-유도제와 배합된 항-DR4 또는 항-DR5 항체 효능제에 관한 것이다.

Description

암세포에서 아팝토시스를 유도하기 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR INDUCING APOPTOSIS IN CANCER CELLS}
관련된 특허출원에 대한 상호-참조
본 출원은 각각이 그대로 모든 목적으로 참고로 포함되어 있는 4개의 미합중국 가특허출원, 즉 2003년 9월 22일에 출원된 60/504,901 호; 2003년 8월 12일에 출원된 60/494,714 호; 2003년 2월 21일에 출원된 60/448,960 호; 및 2002년 11월 27일에 출원된 60/429,842 호에 대한 이점을 특허청구한다.
발명의 배경
아팝토시스(apoptosis)는 모든 후생동물 유기체의 발육 및 조직 항상성에 필수적인 고도로 보존된 세포 자살 프로그램이다. 정상적인 세포 교체 (cell turnover)를 방해하거나 지연시키는 아팝토시스 경로로의 변화는 세포주기의 조절에서 비정상인 경우에서와 마찬가지로 질병의 병인론에서 중요할 수 있다. 세포주기 조절단백질들 사이의 복잡한 상호작용을 통해서 조절되는 세포분열과 마찬가지로, 아팝토시스는 세포사를 방해하거나 유도하는 유전자 생성물들의 상호작용에 의해 정상적인 환경 하에서 유사하게 조절된다.
TNF-관련 아팝토시스-유도성 리간드 (TRAIL, 또한 Apo2L이라고도 불림)는 TNF 사이토카인 족의 구성원이다. TNF 수용체 거대족 (super family)의 두개의 구성원인 DR4 또는 DR5에 결합하면 TRAIL은 아팝토시스에 의해서 세포사를 유도한다 (참조예: Pan et al., Science 277:815-8 (1997); Sheridan, et al., Science 277:818-21 3 (1997); Walczak et al., EMBO J. 16:5386-97 4 (1997)). 시험관내에서 TRAIL은 종양세포를 사멸시키는 것으로 나타났지만, 정상세포에 대해서는 비교적 비독성이다.
암을 치료하기 위해서는 추가의 치료법이 필요하다. 본 발명은 이러한 문제 및 그밖의 문제를 역점을 두어 다룬다.
발명의 간단한 요약
본 발명은 암세포에서 아팝토시스를 유도하는 방법을 제공한다. 몇가지 구체예에서, 이 방법은 세포를 (i) 항-DR4 또는 항-DR5 친화성제 효능제 (affinity agent agonist); 및 (ii) 아팝토시스-유도제와 접촉시키는 것을 포함한다. 몇가지 구체예에서, 효능제는 항-DR5 항체이다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 결합특이성을 갖는다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 항체 A (Antibody A; ATCC 기탁번호 ). 몇가지 구체예에서, 효능제는 항-DR4 항체이다.
몇가지 구체예에서는, 세포를 항-DR4 항체 효능제 및 항-DR5 항체 효능제와 접촉시킨다.
몇가지 구체예에서, 효능제는 인간화 항체이다. 몇가지 구체예에서, 효능제는 단일쇄 항체이다.
몇가지 구체예에서, 유도제는 BCL-2 또는 UbcH10의 발현을 방지하거나 감소시킨다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 NFκB의 활성화를 방지한다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 IκB의 분해를 방지한다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 프로테아좀 (proteasome) 억제제이다. 몇가지 구체예에서, 프로테아좀 억제제는 PS-341, MG-262 및 MG-132로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
몇가지 구체예에서, 유도제는 아팝토시스 억제제 (IAP) 단백질의 억제제이다. 몇가지 구체예에서, 억제제는 SMAC 또는 SMAC 모방체 (mimetic)이다.
몇가지 구체예에서, 유도제는 플렉신 B1 (PLXNB1), SET 도메인-함유 단백질 7 (SET7), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 키나아제 키나아제 5 (MAP3K5), STE20-유사 키나아제 (JIK), MAP 키나아제-상호작용성 세린/트레오닌 키나아제 1 (MKNK1), 추정 소포체 다중통과 막횡단 단백질 (putative endoplasmic reticulum multispan transmembrane protein; RFT1), 5-키나아제, I형, 감마 (PIP5K1C), 미토젠-활성화 단백질 키나아제-활성화 단백질 키나아제 2 (MAPKAPK2), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 키나아제 5 (MAP2K5), 사이클린-의존성 키나아제 6 (CDK6), 액티빈 A 수용체 II형-유사 1 (ACVRL1), 가드너-라쉬드 고양이 육종 바이러스 (v-fgr) 종양유전자 상동체 (Gardner-Rasheed fekine sarcoma viral oncogene homolog; FGR), 가상 단백질 FLJ21802 (FLJ21802), 근육, 골격, 수용체 티로신 키나아제 (MUSK), 염색체 20 오픈 리딩 프레임 88 (chromosome 20 open reading frame 88; C20orf88), 벤즈이미다졸에 의해서 억제되지 않는 출아 (budding) 1 (효모 상동체)(BUB1), 리보솜 단백질 S6 키나아제, 90kD, 폴리펩티드 5 (RPS6KA5), v-yes-1 야마구찌 육종 바이러스 관련 종양유전자 상동체 (Yamaguchi sarcoma viral related oncogene homolog)(LYN), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 7 (MAPK7) 및 v-akt 쥐 흉선종 바이러스 종양유전자 상동체 1 (AKT1)로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드의 억제제이다.
몇가지 구체예에서, 유도제는 신호 인식 입자 (signal recognition particle) 72kD (SRP72), 카스파제 (Caspase)-8, Bid, 림프 티로신 키나아제 (BLK), 피루베이트 키나아제와 유사한 유전자 생성물, M2 이소자임 (LOC148283), 글리코겐 신타아제 키나아제 3 알파 (GSK3A), 가상 단백질 FLJ32312 (FLJ32312), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 10 (MAPK10), TCF4: 전사인자 4, v-abl 아벨슨 쥐 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체 2 (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 2)(arg, 아벨슨-관련 유전자)(ABL2), v-ros 조류 UR2 육종 바이러스 종양유전자 상동체 1 (ROS1) 및 v-myc 조류 골수세포종증 (myelocytomatosis) 바이러스 종양유전자 상동체로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드의 활성화제이다.
몇가지 구체예에서, 암세포는 결장암 세포 또는 췌장암 세포이다.
몇가지 구체예에서, 유도제는 PAK1의 길항제이다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 UbcH10, nsurf, stk12, Ask1 및 JIK로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드의 길항제이다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 siRNA 분자이다.
본 발명은 또한, 필요한 개체에서 암세포 내의 아팝토시스를 유도하는 방법을 제공한다. 몇가지 구체예에서, 이 방법은 개체에게 치료 유효량의 (i) 항-DR4 또는 항-DR5 친화성제 효능제; 및 (ii) 아팝토시스-유도제를 투여하는 것을 포함한다.
몇가지 구체예에서, 효능제 및 유도제는 개별적으로 투여된다. 몇가지 구체예에서, 효능제 및 유도제는 혼합물로 투여된다. 몇가지 구체예에서, 효능제는 항-DR5 항체이다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 결합특이성을 갖는다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 항체 A (ATCC 기탁번호 )이다. 몇가지 구체예에서, 효능제는 항-DR4 항체이다. 몇가지 구체예에서는 세포를 항-DR4 항체 효능제 및 항-DR5 항체 효능제와 접촉시킨다.
몇가지 구체예에서, 효능제는 인간화 항체이다. 몇가지 구체예에서, 효능제는 단일쇄 항체이다.
몇가지 구체예에서, 유도제는 BCL-2 또는 UbcH10의 발현을 방지하거나 감소시킨다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 NFκB의 활성화를 방지한다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 IκB의 분해를 방지한다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 프로테아좀 억제제이다. 몇가지 구체예에서, 프로테아좀 억제제는 PS-341, MG-262 및 MG-132로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
몇가지 구체예에서, 유도제는 아팝토시스 억제제 (IAP) 단백질의 억제제이다. 몇가지 구체예에서, 억제제는 SMAC 또는 SMAC 모방체이다.
몇가지 구체예에서, 암세포는 결장암 세포 또는 췌장암 세포이다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 PAK1의 길항제이다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 UbcH10, nsurf, stk12, Ask1 및 JIK로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드의 길항제이다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 siRNA 분자이다.
본 발명은 또한, 치료 유효량의 (i) 항-DR4 또는 항-DR5 항체 효능제; 및 (ii) 아팝토시스-유도제를 포함하는 생리적 조성물을 제공한다. 몇가지 구체예에서, 효능제는 항-DR5 항체이다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 결합특이성을 갖는다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 항체 A (ATCC 기탁번호 )이다. 몇가지 구체예에서, 효능제는 항-DR4 항체이다. 몇가지 구체예에서는 세포를 항-DR4 항체 효능제 및 항-DR5 항체 효능제와 접촉시킨다.
몇가지 구체예에서, 효능제는 인간화 항체이다. 몇가지 구체예에서, 효능제는 단일쇄 항체이다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 BCL-2 또는 UbcH10의 발현을 방지하거나 감소시킨다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 NFκB의 활성화를 방지한다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 IκB의 분해를 방지한다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 프로테아좀 억제제이다. 몇가지 구체예에서, 프로테아좀 억제제는 PS-341, MG-262 및 MG-132로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
몇가지 구체예에서, 유도제는 아팝토시스 억제제 (IAP) 단백질의 억제제이다. 몇가지 구체예에서, 억제제는 SMAC 또는 SMAC 모방체이다.
몇가지 구체예에서, 유도제는 PAK1의 길항제이다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 UbcH10, nsurf, stk12, Ask1 및 JIK로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드의 길항제이다. 몇가지 구체예에서, 유도제는 siRNA 분자이다.
본 발명은 또한, 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 결합특이성을 갖는 친화성제를 제공한다. 몇가지 구체예에서, 친화성제는 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체이다.
본 발명은 또한, 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 발현하는 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 결합특이성을 갖는 친화성제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 암세포에서 아팝토시스를 유도하는 방법을 제공한다. 몇가지 구체예에서, 효능제는 항-DR5 항체이다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 결합특이성을 갖는다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 항체 A (ATCC 기탁번호 )이다.
정의
"항체"는 항원을 특이적으로 결합시키고 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편으로부터의 골격 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 인식된 면역글로불린 유전자에는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 (constant region) 유전자, 및 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자가 포함된다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 이것은 다시 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 면역글로불린 클래스를 정의한다.
천연적으로 존재하는 면역글로불린은 두개의 동일한 경쇄 (약 24 kD) 및 두개의 동일한 중쇄 (약 55 또는 70 kD)가 테트라머 (tetramer)를 형성하는 공통의 핵 구조를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 가변 (V) 영역으로 공지되어 있으며, 각각의 쇄의 나머지의 더욱 보존된 불변 (C) 영역으로부터 구별될 수 있다. 경쇄의 가변 영역 내에는 J 영역으로 공지된 C-말단 부분이 있다. 중쇄의 가변 영역 내에는 J 영역 이외에도 D 영역이 있다. 면역글로불린에서 아미노산 서열 변이의 대부분은 항원 결합에 직접적으로 관련되는 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 공지된 V 영역 내의 3개의 별개의 위치로 제한된다. 아미노-말단으로부터 진행하여 이들 영역은 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지정된다. CDR은 더욱 보존된 골격 영역 (FR)에 의해서 제자리에 유지된다. 아미노-말단으로부터 진행하여 이들 영역은 각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 지정된다. CDR 및 FR 영역의 위치 및 넘버링 시스템은 예를들어, 카배트 (Kabat) 등에 의해서 정의되었다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)).
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조적 유니트는 테트라머를 포함한다. 각각의 테트라머는 두개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 N-말단은 항원 인식을 주로 책임지는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 규정한다. 용어 가변성 경쇄 (VL) 및 가변성 중쇄 (VH)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 의미한다.
항체는 예를들어, 완전 면역글로불린으로서, 또는 다양한 펩티다제에 의한 분해에 의해서 생산된 잘-특정화된 다수의 단편으로 존재한다. 따라서, 예를들어 펩신은 힌지 (hinge) 영역에서 디설파이드 결합 아래에서 항체를 분해하여 그 자체가 디설파이드 결합에 의해서 VH-CH1에 경쇄 연결되는 Fab의 다이머인 F(ab)'2를 생성시킨다. F(ab)'2는 온화한 조건 하에서 환원되어 힌지 영역에서 디설파이드 결합을 파괴시킴으로써 F(ab)'2 다이머를 Fab' 모노머로 전환시킬 수 있다. Fab' 모노머는 본질적으로 힌지 영역의 일부분을 갖는 Fab이다 (참조: Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993)). 다양한 항체 단편은 완전 항체의 분해와 관련하여 규정되지만, 전문가라면 이러한 단편이 화학적으로, 또는 재조합 DNA 방법에 의해서 새로 합성될 수도 있음을 인식할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에서 사용된 것으로 용어 항체는 또한, 전체 항체의 변형에 의해서 생산된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 새로 합성된 것, 또는 파아지 디스플레이 라이브러리 (phage display library)를 사용하여 동정된 것을 포함한다 (참조예: McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)).
모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 제조를 위해서는 본 기술분야에서 공지된 어떠한 기술이라도 사용될 수 있다 (참조예: Kohler ＆ Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). "모노클로날" 항체는 단일 클론으로부터 유도된 항체를 의미한다. 단일쇄 항체의 생산을 위한 기술 (미합중국 특허 제 4,946,778 호)은 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 적합할 수 있다. 또한, 유전자 도입 마우스 (transgenic mice), 또는 그밖의 다른 포유동물과 같은 그밖의 유기체를 사용하여 인간화 항체를 발현시킬 수도 있다. 대용으로, 파아지 디스플레이 기술을 사용하여 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 헤테로머성 Fab 단편을 동정할 수도 있다 (참조예: McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)).
"키메라 항체 (chimeric antibody)"는 (a) 불변 영역 또는 그의 일부분이 항원 결합 영역 (가변 영역)이 상이하거나 변형된 클래스, 효과기 (effector) 작용기 및(또는) 종의 불변 영역, 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예를들어 효소, 독소, 호르몬, 성장인자, 약물 등에 연결되도록 변형, 치환 또는 교환되거나; (b) 가변 영역 또는 그의 일부분이 상이하거나 변형된 항원 특이성을 갖는 가변 영역에 의해서 변형, 치환 또는 교환된 항체 분자이다.
"인간화" 항체는 인간에게서 면역원성은 낮으면서 비-인간 항체의 반응성을 보유하는 항체이다. 이것은 예를들어, 비-인간 CDR 영역을 보유시키고 항체의 나머지 부분들을 그들의 인간 대응물 (counterpart)로 치환시킴으로써 수득될 수 있다 [참조예: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)].
항체에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하는" 또는 단백질 또는 펩티드를 언급하는 경우에 "~와 특이적으로 (또는 선택적으로) 면역반응성인"이라는 문구는 단백질과 그밖의 다른 생물학적 제제의 불균질 집단에서 단백질의 존재에 대한 결정인자인 결합반응을 의미한다. 따라서, 지정된 면역시험 조건 하에서, 특정화된 항체는 배경 (background)의 적어도 두배의 특정 단백질에 결합하며, 실질적으로는 샘플 내에 존재하는 다른 단백질에 대하여는 유의적인 양으로 결합하지 않는다. 이러한 조건 하에서 항체에 대한 특이적 결합은 특정한 단백질에 대한 그의 특이성에 대하여 선택된 항체를 필요로 할 수 있다. 이러한 선택은 예를들어 DR5 분자와 교차-반응하는 항체를 다른 종들로부터 제외시킴으로써 이루어질 수 있다. 다양한 면역시험 형식을 사용하여 특정의 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택할 수 있다. 예를들어, 일상적으로 고체상 ELISA 면역시험을 사용하여 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선택한다 (참조예: 특이적 면역반응성을 결정하기 위해서 사용될 수 있는 면역시험 형식 및 조건의 설명에 관하여 Harlow ＆ Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)). 일반적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 노이즈 (noise)의 적어도 두배일 수 있으며, 더욱 일반적으로 배경의 10 내지 100배를 초과할 수 있다.
용어 "펩티도모방체 (peptidomimetic)" 및 "모방체"는 천연적이거나 비-천연적으로 존재하는 폴리펩티드 (예를들어, SMAC)와 실질적으로 동일한 구조 및 기능적 특징을 갖는 합성 화학적 화합물을 의미한다. 펩티드 상동체는 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 약제산업에서 통상적으로 사용된다. 이들 유형의 비-펩티드 화합물을 "펩티드 모방체" 또는 "펩티도모방체"라 부른다 (본 발명에 참고로 포함된 Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); 및 Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)). 치료에 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체를 사용하여 동등하거나 증진된 치료적 또는 예방적 효과를 제공할 수 있다. 일반적으로, 펩티도모방체는 흥미가 있는 폴리펩티드에서 확인되는 것과 같은 패러다임 (paradigm) 폴리펩티드 (즉, 생물학적 또는 약물학적 활성을 갖는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하지만, 예를들어 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로 구성된 그룹으로부터 선택된 결합에 의해서 임의로 치환된 하나 또는 그 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 이러한 모방체는 온전히 아미노산의 합성, 비-천연 상동체로 구성될 수 있거나, 부분적으로는 천연 펩티드 아미노산이고 부분적으로는 아미노산의 비-천연 상동체인 키메라 분자이다. 모방체는 또한, 천연 아미노산 보존적 치환을 이러한 치환이 모방체의 구조 및(또는) 활성을 실질적으로 변화시키지 않은 한은 어떠한 양으로도 포함할 수 있다. 예를들어, 모방체 조성물이 흥미가 있는 폴리펩티드의 적어도 하나의 결합 또는 효소적 활성을 수반할 수 있다면 이것도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
"siRNA"는 간섭을 야기시킬 수 있으며, 세포, 예를들어 포유동물 세포 (인간 세포를 포함)에서, 및 신체, 예를들어 포유동물 신체 (인간을 포함)에서 특정 유전자의 전사후 무증상 (post-transcriptional silencing)을 야기시킬 수 있는 작은 간섭성 RNA를 의미한다. RNA 간섭의 현상은 문헌 (Bass, Nature 411: 428-29 (2001); Elbahir et al., Nature 411: 494-98 (2001); 및 Fire et al., Nature 391: 806-11 (1998); 및 간섭성 RNA를 제조하는 방법이 또한 거론되어 있는 WO 01/75164)에 기술되고 거론되어 있다. 본 발명에 기술된 유전자 생성물을 코딩하는 서열 및 핵산을 기재로 하는 siRNA는 일반적으로 100개 보다 적은 염기쌍을 가지며, 예를들어 약 30 bp 또는 그 보다 더 짧을 수 있으며, 상보적 DNA 가닥 또는 합성 방법을 사용하는 것을 포함하여 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 만들 수 있다. siRNA는 간섭을 야기시킬 수 있으며, 세포, 예를들어 포유동물 세포 (인간 세포를 포함)에서, 및 신체, 예를들어 포유동물 신체 (인간을 포함)에서 특정 유전자의 전사후 무증상을 야기시킬 수 있다. 본 발명에 따르는 예시적인 siRNA는 29 bp, 25 bp, 22bp, 21 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp, 5 bp 또는 대략 그 정도이거나 그들 사이의 정수까지의 bp를 가질 수 있다. 최적의 억제성 siRNA를 디자인하기 위한 도구에는 DNA엔진 인코포레이티드 (DNAengine Inc.; Seattle, WA) 및 앰비온, 인코포레이티드 (Ambion, Inc.; Austin, TX)로부터 이용할 수 있는 것이 포함된다.
한가지 RNAi 기술은 그 안에 센스 및 안티센스 서열이 공여체 및 수용체 스플라이싱 (splicing) 영역에 의해서 적절한 스플라이싱 배향에서 인트론 서열의 측면에 있는 영역에 배치되는 유전자 작제물을 사용한다. 대용으로, 다양한 길이의 스페이서 (spacer) 서열을 사용하여 작제물 내에서 서열의 자체-상보성 영역을 분리시킬 수도 있다. 유전자 작제물 전사의 과정 중에, 인트론 서열은 제거되어 센스 및 안티센스 서열 및 스플라이스 접합서열 (splice junction sequence)이 결합하여 이중-나선 RNA를 형성할 수 있도록 한다. 그후, 선택된 리보뉴클레아제는 이중-나선 RNA에 결합하여 이것을 절단시킴으로써 특정한 mRNA 유전자 서열의 분해를 유도하는 사건들의 단계를 개시시키고, 특정 유전자를 무증상화시킬 수 있다.
"핵산"은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 단일- 또는 이중-나선 형태인 그의 폴리머를 의미한다. 이 용어에는 합성, 천연적으로 존재 및 비-천연적으로 존재하며, 참조 핵산과 유사한 결합특성을 가지며, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 공지의 뉴클레오티드 상동체 또는 변형된 골격구조 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산이 포함된다. 이러한 상동체의 예에는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)가 포함되나, 제한되지는 않는다.
다른 식으로 지적되지 않는 한은, 특정의 핵산 서열은 또한 내재적으로, 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를들어, 변성 코돈 치환) 및 상보적 서열, 및 명백하게 지적된 서열을 포함한다. 구체적으로, 변성 코돈 치환은 하나 또는 그 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합된-염기 및(또는) 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 이루어질 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 용어 "핵산"은 용어 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본 발명에서 아미노산 잔기의 폴리머를 언급하는데 상호교환적으로 사용된다. 이 용어들은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연적으로 존재하는 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 폴리머, 및 천연적으로 존재하는 아미노산 폴리머 및 비-천연적으로 존재하는 아미노산 폴리머에 적용된다.
용어 "아미노산"은 천연적 존재 및 합성 아미노산, 및 천연적으로 존재하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 상동체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연적으로 존재하는 아미노산은 유전자 코드에 의해서 코딩된 것, 및 후에 변형된 이들 아미노산, 예를들어 하이드록시프롤린, 감마-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 상동체는 천연적으로 존재하는 아미노산과 동일한 기본 화학구조, 즉 수소, 카복실기, 아미노기 및 R기, 예를들어 호모세린, 노르루이신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄에 결합된 알파 탄소를 갖는 화합물을 의미한다. 이러한 상동체는 변형된 R기 (예를들어, 노르루이신) 또는 변형된 펩티드 골격구조를 갖지만, 천연적으로 존재하는 아미노산과 동일한 기본 화학구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학구조와는 상이한 구조를 갖지만, 천연적으로 존재하는 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 의미한다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘다에 적용된다. 특정의 핵산 서열에 관하여, 보존적으로 변형된 변이체는 필수적으로 동일한 서열에 대한 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하거나, 그에 대한 아미노산 서열을 코딩하지 않는 이들 핵산을 의미한다. 유전자 코드의 변성으로 인하여, 기능적으로 동일한 다수의 핵산이 소정의 단백질을 코딩한다. 예를들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두가 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 하나의 코돈에 의해서 명시된 모든 위치에서 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변화시키지 않으면서 기술된 상응하는 코돈 중의 어떤 것으로도 변화될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한가지 종인 "무증상 변이 (silent variation)"이다. 여기에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 무증상 변이를 또한 기술하는 것이다. 숙련된 전문가들은 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)을 변형시켜 기능적으로 동일한 분자를 수득할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 무증상 변이는 각각의 기술된 서열에 내재하는 것이다.
아미노산 서열과 관련하여, 숙련된 전문가는 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변화시키거나, 부가하거나 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 각각의 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"이며, 여기에서 변화는 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 제공한다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 (interspecies homolog) 및 대립인자에 추가되며, 이들을 제외시키지 않는다.
다음의 8가지 그룹 각각은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:
1) 알라닌 (A), 글리신 (G);
2) 아스파르트산 (D), 글루타민산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 라이신 (K);
5) 이소루이신 (I), 루이신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);
6) 페닐알라닌 (f), 티로신 (Y), 트립토판 (W);
7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및
8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (참조예: Creighton, Proteins (1984)).
"서열 동일성의 백분율"은 두개의 최적으로 배열된 서열들을 비교창 (comparison window) 상에서 비교함으로써 결정되며, 여기에서 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 두개의 서열의 최적 배열을 위한 부가 또는 결실을 포함하지 않는, 참조서열 (예를들어, 본 발명의 폴리펩티드)과 비교한 것으로서의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 둘다의 서열에 존재하는 위치의 수를 측정하여 매치된 위치의 수를 얻고, 매치된 위치의 수를 비교창 내의 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산될 수 있다.
두개 또는 그 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 같은 서열인 두개 또는 그 이상의 서열 또는 서브서열 (subsequence)을 의미한다. 두개의 서열이 비교창에서 최대 상응성을 위해서 비교하고 배열한 경우에, 또는 이하의 서열 비교 알고리즘 (algorithm) 중의 하나를 사용하거나 수동 배열하고 시각적으로 검사하여 측정한 영역을 지정한 경우에, 같은 것 (즉, 명시된 영역에 대해서, 또는 명시되지 않은 경우에는 전서열에 대해서 60％ 동일성, 임의로 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％ 또는 95％ 동일성)인 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 규정된 백분율을 갖는다면, 두개의 서열은 "실질적으로 동일한" 것이다. 본 발명은 본 발명에 예시된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 (예를들어, 도 23-25에 예시된 CDR) 각각에 대해 실질적으로 동일한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 임의로, 동일성은 적어도 약 50 뉴클레오티드 길이의 영역에 대해서, 또는 더욱 바람직하게는 길이가 100 내지 500, 또는 1000 또는 그 이상의 뉴클레오티드인 영역에 대해서 존재한다.
서열 비교를 위해서, 일반적으로 하나의 서열은 참조서열로 작용하며, 이에 대비하여 시험서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘이 사용되는 경우에는, 시험 및 참조서열을 컴퓨터에 입력시키고, 필요한 경우에 서브서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라메터를 지정한다. 디폴트 (default) 프로그램 파라메터가 사용될 수 있거나, 대용 파라메터가 지정될 수 있다. 그후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라메터를 기준으로 하여 참조서열에 대비한 시험서열의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다.
본 발명에서 사용된 것으로 "비교창"은 20 내지 600, 통상적으로는 약 50 내지 약 200, 더욱 통상적으로는 약 100 내지 약 150개로 구성된 그룹으로부터 선택된 다수의 인접한 위치들 중의 어떤 하나의 절편에 대한 표준을 포함하며, 여기에서는 두개의 서열을 최적으로 배열한 후에 서열을 동일한 수의 인접한 위치의 표준서열에 대해서 비교한다. 비교를 위한 서열의 배열방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은 예를들어, 스미스와 워터만 (Smith and Waterman (1970), Adv. Appl. Math. 2:482c)의 국소 상동성 (local homology) 알고리즘에 의해서, 니들맨과 운쉬 (Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443)의 상동성 배열 알고리즘에 의해서, 피어슨과 리프만 (Pearson and Lipman (1988), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)의 유사성 방법에 대한 탐색에 의해서, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 임플리멘테이션 (implementation)(Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해서, 또는 수동 배열 및 시각적 검사 (참조예: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement))에 의해서 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트를 결정하는데 적합한 알고리즘의 두가지 예는 문헌 (각각 Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402) 및 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)에 기술된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 내쇼날 센터 훠 바이오테크놀로지 인포메이션 (the National Center for Biotechnology Information)으로부터 공공연지 입수할 수 있다. 이 알고리즘은 데이타베이스 서열에서 동일한 길이의 워드로 배열하는 경우에 조회할 서열에서 어느 정도의 양성-값 역치 스코어 T에 부합하거나 충족시키는 길이 W의 짧은 워드 (word)를 확인함으로써 일차적으로 높은 스코어 서열쌍 (HSP)을 동정하는 것을 포함한다. T는 인접한 워드 스코어 역치로 불린다 (Altschul et al., 상기 참조). 이들 초기의 인접한 워드 히트 (hit)는 이들을 함유하는 더 긴 HSPs를 찾기 위한 검색을 개시하기 위한 시드 (seed)로 작용한다. 워드 히트는 누적 배열 스코어가 증가할 수 있을 때까지 각각의 서열을 따라서 양방향으로 연장된다. 뉴적 스코어는 뉴클레오티드 서열의 경우에는 파라메터 M (매칭 잔기의 쌍에 대한 리워드 (reward) 스코어; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 페날티 (penalty) 스코어; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우에는, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 각각의 방향으로의 워드 히트의 연장은 누적 배열 스코어가 도달된 그의 최고값으로부터 양 X까지 떨어지거나; 하나 또는 그 이상의 음성-스코어링 잔기 배열의 축적으로 인하여 누적 스코어가 0 또는 그 이하가 되거나; 또는 서열의 말단에 도달하는 경우에 정지된다. BLAST 알고리즘 파라메터 W, T 및 X는 배열의 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 11의 워드길이 (W), 5의 기대치 (expectation; E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우에 BLASTP 프로그램은 3의 워드길이, 10의 기대치 (E), 및 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (참조: Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) 배열 (B), 10의 기대치 (E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 두개의 서열 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다 (참조예: Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). BLAST 알고리즘에 의해서 제공된 유사성의 하나의 척도는 두개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 나타날 수 있는 확률의 지표를 제공하는 최소 확률합 (smallest sum probability)(P(N))이다. 예를들어, 핵산은 시험 핵산을 참고 핵산에 비교한 최소 확률합이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 참고 서열과 유사한 것으로 간주된다.
두개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 지적은 제 1 핵산에 의해서 코딩된 폴리펩티드가 이하에 기술하는 바와 같이 제 2 핵산에 의해서 코딩된 폴리펩티드에 대해서 야기된 항체와 면역학적으로 교차반응성이 있다는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 일반적으로, 예를들어 두개의 펩티드가 단지 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 제 2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 두개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지적은 두개의 분자 또는 그들의 보체가 후술하는 바와 같이 절박한 조건 하에서 서로에 대해 하이브리드화하는 것이다. 두개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지적은 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.
용어 "친화성제 효능제"는 완전 또는 부분 수용체-매개된 반응을 유도하도록 수용체를 활성화시킬 수 있는 친화성제 (즉, 표적분자를 특이적으로 결합시키는 분자)를 의미한다. 예를들어, DR4 또는 DR5의 효능제는 DR4 또는 DR5에 결합하여 DR4 또는 DR5-매개된 신호전달을 유도한다. 몇가지 구체예에서, DR4 또는 DR5 친화성제 효능제는 DR4 또는 DR5에 결합하는 그의 능력에 의해서 동정될 수 있으며, Jurkat 세포에 접촉하는 경우에 아팝토시스를 유도할 수 있다. "항체 효능제"는 친화성제가 항체인 경우의 상황을 의미한다.
용어 "아팝토시스-유도제"는 세포 유형에 접촉하는 경우에 적어도 하나의 세포 유형에서 아팝토시스를 유도하거나 촉진시키는 화합물을 의미한다. 예시적인 아팝토시스-유도제에는 예를들어 SMAC, Bax, Bik, Bok, Bim, Bak, Bid, Noxa, Puma, Hrk, 또는 Bad; BH3, p53, TRAIL 리간드, Fadd, Myc 및 Mekk1, 신호 인식 입자 72 kD (SRP72), 카스파제-8, Bid, B 림프 티로신 키나아제 (BLK), 피루베이트 키나아제와 유사한 유전자 생성물, M2 이소자임 (LOC148283), 글리코겐 신타아제 키나아제 3 알파 (GSK3A), 가상 단백질 FLJ32312 (FLJ32312), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 10 (MAPK10), TCF4; 전사인자 4, v-abl 아벨슨 쥐 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체 2 (arg, 아벨슨-관련 유전자)(ABL2), v-ros 조류 UR2 육종 바이러스 종양유전자 상동체 1 (ROS1) 및 v-myc 조류 골수세포종증 바이러스 종양유전자 상동체와 같은 효능제 또는 모방체; 및 26S 프로테아좀 억제제, c-플립 (flip), NFκB 경로, IAP 족 구성원 (예를들어, XIAP, cIAP1, cIAP2, NAIP, MLIAP/리빈 (Livin), 서바이빈 (survivin)), 프로테아좀 경로 구성원 (예를들어, E1, E2 및 E3); 키나아제 PI3, Akt1, 2 및 3, Rip, Nik; CD40; Bcl2 족 구성원 (예를들어, Bcl2, Bcl-x1, A1, Mcl1), 유비퀴틴 컨쥬가제 (conjugase) UbcH10, 오스테오프로테그린, 플렉신 B1 (PLXNB1), SET 도메인-함유 단백질 7 (SET7), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 키나아제 키나아제 5 (MAP3K5), STE20-유사 키나아제 (JIK), MAP 키나아제-상호작용성 세린/트레오닌 키나아제 1 (MKNK1), 추정 소포체 다중통과 막횡단 단백질 (RFT1), 5-키나아제, I형, 감마 (PIP5K1C), 미토젠-활성화 단백질 키나아제-활성화 단백질 키나아제 2 (MAPKAPK2), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 키나아제 5 (MAP2K5), 사이클린-의존성 키나아제 6 (CDK6), 액티빈 A 수용체 II형-유사 1 (ACVRL1), 가드너-라쉬드 고양이 육종 바이러스 (v-fgr) 종양유전자 상동체 (FGR), 가상 단백질 FLJ21802 (FLJ21802), 근육, 골격, 수용체 티로신 키나아제 (MUSK), 염색체 20 오픈 리딩 프레임 88 (C20orf88), 벤즈이미다졸에 의해서 억제되지 않는 출아 1 (효모 상동체)(BUB1), 리보솜 단백질 S6 키나아제, 90kD, 폴리펩티드 5 (RPS6KA5), v-yes-1 야마구찌 육종 바이러스 관련 종양유전자 상동체 (LYN), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 7 (MAPK7) 및 v-akt 쥐 흉선종 바이러스 종양유전자 상동체 1 (AKT1), PAK1 (예를들어, 이하의 P21(CDKN1A)-활성화 키나아제 1, PAKA, P65-PAK, P68-PAK, 알파-PAK, MUK2, PAK1B (p21 활성화 키나아제 1B), P21/Cdc42/Rac1-활성화 키나아제 1 (효모 Ste20-관련), Cdc42/Rac 효과기 키나아제 PAK-A, 단백질 키나아제 MUK2 중의 어떤 것을 포함), nsurf, stk12 (예를들어, 세린/트레오닌 키나아제 12, 오로라 (aurora)-관련 키나아제 2, 오로라/IPL1-유사 키나아제 2, AIK2, ARK2, AIM-1 및 AIMI을 포함), 아팝토시스 신호-조절 키나아제 1 (Ask1), TLK1 (예를들어, 기탁번호 NM_012290), NLK (예를들어, 기탁번호 NM_016231), GRAF (예를들어, 기탁번호 NM_015071), GCK (예를들어, 기탁번호 NM_000162), ERK5 (예를들어, 기탁번호 NM_002749), FGR (예를들어, 기탁번호 NM_005248), ACVRL1 (예를들어, 기탁번호 NM_000020), MEKK5 (예를들어, 기탁번호 NM_002757), PIP5KIC (예를들어, 기탁번호 XM_047620), MAPKAPK2 (예를들어, 기탁번호 NM_004759), RFT1 (예를들어, 기탁번호 NM_052859), MKNK1 (예를들어, 기탁번호 NM_003684), PLXNB1 (예를들어, 기탁번호 NM_002673)과 같은 길항제 또는 억제제가 포함된다. 추가의 예시적인 아팝토시스-유도제에는 예를들어, DR5 및 DR4 발현 및(또는) 안정성을 증진시키는 약제, 카스파제 활성 또는 안정성을 증진시키는 약제, 및 DNA 손상반응을 유도하거나 증진시키는 약제가 포함된다. 상기 리스트의 효능제 또는 모방체에는 유전자 생성물 그 자체가 포함되며, 예를들어 p53은 p53 효능제이다. 길항제에는 활성을 직접적으로 억제하는 약제, 및 표적분자 mRNA (예를들어, siRNA) 또는 단백질의 발현 또는 안정성을 감소시킴으로써 활성을 간접적으로 억제하는 약제가 포함된다.
단백질의 "발현을 방지하거나 감소시키는" 약제는 예를들어, 결합하여 자극을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 발현을 감소, 방지 또는 지연시키는 화합물을 의미한다. 단백질의 발현은 적어도, 예를들어 5％, 10％, 25％, 50％, 75％, 90％, 95％ 또는 100％까지 감소될 수 있다.
"NFκB의 활성화"는NFκB의 핵 국재화, NFκB에 의한 DNA 결합, 또는 NFκB에 의한 DNA 결합으로 인한 전사의 유도를 의미한다.
"IκB의 분해를 방지"하는 것은 프로테아좀에 의한 IκB의 분해에 의해서 NFκB를 유리시켜 세포 핵에 도입시키는 것을 의미한다.
"프로테아좀 억제제"는 프로테아좀-유비퀴틴 경로를 억제함으로써 IκB의 분해 및 이어서 IκB의 파트너인 NFκB의 핵 국재화를 방지하는 약제를 의미한다. 프로테아좀에는 예를들어, 26S 프로테아좀 복합체가 포함된다.
"아팝토시스 억제제 (IAP) 단백질"은 카스파제 활성을 억제하는 단백질 족의 폴리펩티드를 의미한다. 공지의 IAP 단백질 중의 하나를 제외하고 모두는 특징적인 서열 모티브 (motif)의 2배 또는 3배 반복인 바큘로바이러스 억제성 반복 (Baculovirus Inhibitory Repeat (BIR); ~70 잔기; 서바이빈 (survivin)은 하나의 BIR 영역을 함유하는 최근에 개발된 인간 IAP이다)을 공유한다. 이러한 BIR 영역은 컨센서스 (consensus) 서열인 R-X(20-23)-G-X(11)-C-X(16)-H-X)6)-C와 함게 다수의 보존된 잔기를 함유한다. IAP의 예로는 예를들어, 아팝토시스의 X 염색체 결합된 억제제 (XIAP; 진뱅크 (Genbank) 기탁번호 U32974), 세포성 IAP 단백질 (c-IAP-1/HIAP-2/hMIHB 및 c-IAP-2/HIAP-1/hMIHC;Liston et al., Nature 379:349-353 (1996); Rothe et al., Cell 83:1243-1252 (1995)); 뉴론성 아팝토시스 억제단백질 (NAIP; Roy et al., Cell 80:167-178 (1995)); 및 서바이빈 (Ambrosini et al., Nature Med. 3:917-921 (1997))이 포함된다 (참조예: 미합중국 특허출원 제 2002/0132786 및 2002/0009757 호, 및 미합중국 특허 제 6,187,557 호).
"SMAC"는 아팝토시스성 자극에 대한 반응으로 미토콘드리아로부터 사이토크롬 c와 함께 유리되는 미토콘드리아성 폴리펩티드를 의미한다. SMAC는 IAP를 결합시키고 중화시킴으로써 카스파제 활성화를 촉진시킨다 (참조예: Du et al., Cell 102:33-42 (2000); Verhagen et al., Cell 102:43-53 (2000)).
본 발명에서 "변조제 (modulator)"는 유전자 생성물을 발현시키는 활성을 억제하거나 증진시키는 분자를 의미하는 것으로 사용된다. "길항제" 또는 "억제제"는 예를들어, 유전자 생성물의 발현을 억제하거나, 유전자 생성물에 결합하여 자극을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 유전자 생성물의 활성화를 감소, 방지 또는 지연시키거나, 유전자 생성물을 불활성화시키거나, 탈감작시키거나, 하향 조절하거나, 유전자 생성물이 결합하는 수용체를 결합시키거나 하향 조절하는 화합물이다. "효능제" 또는 "활성화제"는 예를들어, 유전자 생성물의 발현을 유도하거나 활성화시키거나, 유전자 생성물에 결합하여 자극시키거나, 증가시키거나, 개방하거나, 활성화시키거나, 촉진시키거나, 유전자 생성물의 활성을 증진시키거나, 유전자 생성물을 감작시키거나, 유전자 생성물의 활성을 상향 조절하거나, 유전자 생성물이 결합하는 수용체를 결합시키거나 상향 조절하는 화합물이다. 효능제 또는 길항제는 예를들어, 항체, 유기 소분자 (예를들어, 1500 달톤 미만), 유전자 생성물 그 자체의 유전적으로 변형된 변형체 등을 포함할 수 있다. 길항제에는 예를들어, 유전자 생성물을 코딩하는 전사체의 발현을 감소시키는 siRNA 분자가 포함된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 Jurkat 세포에서 TRAIL 유도된 아팝토시스를 나타낸다.
도 2는 DR5 기능성 항체의 특이성을 나타낸다.
도 3은 Jurkat 세포에 대한 3개의 상이한 DR5 항체 효능제의 효과를 나타낸다.
도 4는 처리된 Jurkat 세포에서의 카스파제-3 활성을 설명하는 것이다.
도 5는 결장 및 흑색종 암세포주에 대한 DR4/DR5 기능성 항체의 효과를 설명하는 것이다.
도 6은 유방암 세포주에 대한 DR4/DR5 기능성 항체의 효과를 설명하는 것이다.
도 7은 정상세포 및 종양세포에서 DR5 항체 효능제에 대한 투여량 반응을 설명하는 것이다.
도 8은 카스파제-3 활성화에 관한 DR5 항체 효능제 "A"를 설명하는 것이다.
도 9는 Colo 205 종양 부피에 대한 DR5 항체 효능제 효과를 설명하는 것이다.
도 10은 COLO205 피하 모델에서의 항-DR5 투여량 반응을 설명하는 것이다.
도 11은 생체내에서 DR5 모노클로날 항체의 종양제거 활성을 설명하는 것이다.
도 12는 카스파제 활성화 및 아팝토시스에 대한 경로를 설명하는 것이다.
도 13은 SMAC 모방체의 존재하에 A2058 세포 내에서 항-DR4 또는 항-DR5-유도된 아팝토시스를 설명하는 것이다.
도 14는 정상세포 및 종양세포에 대한 SMAC 모방체의 효과를 설명하는 것이다.
도 15는 SMAC 모방체의 Pk 및 PD 시험을 설명하는 것이다.
도 16은 NFκB 경로 및 프로테아좀에 대한 그의 관계를 설명하는 것이다.
도 17은 프로테아좀 억제제 MG132가 DR5 항체-유도된 아팝토시스를 증진시키는 것을 설명하는 것이다.
도 18은 다양한 프로테아좀 억제제를 예시하는 것이다.
도 19는 A2058에 대한 프로테아좀 억제제의 효과를 설명하는 것이다.
도 20은 간암 세포주에 대한 프로테아좀 억제제의 효과를 설명하는 것이다.
도 21은 정상적인 유방세포에 대한 프로테아좀 억제제의 효과를 설명하는 것이다.
도 22는 마우스-인간 키메라 DR5 항체의 발현을 설명하는 것이다.
도 23은 항체 A의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 뉴클레오티드 서열을 설명하는 것이다.
도 24는 항체 A에 대한 중쇄 가변 영역을 설명하는 것이다.
도 25는 항체 A에 대한 경쇄 가변 영역을 설명하는 것이다.
도 26은 siRNA를 도입시킴으로써 TRAIL-유도된 아팝토시스를 매개하여 세포-기반 분석에서 특이적 유전자 발현을 녹아웃 (knockout)시키는 유전자 생성물을 동정하는 스크리닝 방법을 설명하는 것이다.
도 27은 siRNA를 도입시킴으로써 TRAIL-유도된 아팝토시스를 매개하여 세포-기반 분석에서 특이적 유전자 발현을 녹아웃시키는 유전자 생성물을 동정하는 스크리닝 방법을 설명하는 것이다.
도 28은 상술한 siRNA 스크린에서 확인된 히트의 리스트를 제공한다. "비율 (ratio)"은 TRAIL의 부재와 비교하여 TRAIL의 첨가에 따른 생존세포 (즉, 비-아팝토시스성)의 비율을 의미한다. 낮은 비율 (50 이하)은 유전자 생성물이 아팝토시스를 저해한 것을 나타낸다. 높은 비율 (50보다 큼)은 유전자 생성물이 아팝토시스에 기여하는 것을 나타낸다.
도 29는 Gsk3α 및 Gsk3β에 대한 siRNA 데이타를 설명하는 것이다. 도면의 상단은 siRNA가 Gsk3α 또는 Gsk3β에 대해 특이적임을 설명하는 것이다. 도면 하단의 막대도표는 TRAIL의 존재 또는 부재하에서 siRNA의 도입에 따른 카스파제 활성을 설명하는 것이다.
도 30은 TRAIL-유도된 아팝토시스에 대한 조절 네트워크를 설명한 것이다. 특히, myc는 전-아팝토시스성 (pro-apototic)이다. 따라서, myc의 억제는 TRAIL-유도된 아팝토시스 및 myc 상승적으로 활성화된 TRAIL 또는 항-DR4 또는 항-DR5-유도된 아팝토시스의 활성화를 억제한다.
도 31은 종양세포를 사멸시키는데 있어서 고전적인 세포독성 항암제에 대한 siUbcH10의 상가적 효과를 나타낸다. 도면은 또한, siUbcH10에 의한 종양세포의 전처리가 항-DR5 항체에 의해서 유도된 아팝토시스를 현저하게 증가시켰음을 나타낸다.
도 32는 siUbcH10에 의한 UbcH10의 하향-조절은 종양세포를 TRAIL/DR5-매개된 세포 사멸에 대해 감작시켰음을 나타낸 것이다.
도 33은 26S 프로테아좀 억제제 MG-132, MG-262 또는 락타시스틴 (LC)과 배합된 TRAIL 리간드에 대한 HCT116 세포 또는 그의 Bax-의 감작을 설명하는 것이다.
도 34는 다양한 미토콘드리아성 아팝토시스 경로 단백질에 대한 프로테아좀 억제제 MG-262의 효과를 설명하는 것이다.
도 35는 항체 A의 경우의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대한 대용 서열을 예시한 것이다.
발명의 상세한 설명
I. 서론
본 발명은 아팝토시스-유도제와 함께 투여된 항-DR4 또는 항-DR5 항체 효능제가 상승적 방식으로 암세포에서 아팝토시스를 유도한다는 놀라운 결과를 입증한다. 따라서, 이들 성분들 중의 하나에 의한 처리에 대해 내성인 암세포는 항-DR4 또는 항-DR5 효능제 항체 및 제 2 아팝토시스-유도제에 의해서 접촉시킨 경우에도 마찬가지로 사멸될 수 있다. 또한, 상기 열거된 성분들 중의 하나와 접촉시키면 아팝토시스를 겪는 세포들 중에서, 항-DR4 또는 항-DR5 효능제 항체 및 아팝토시스-유도성 단백질과의 접촉은 아팝토시스의 더 빠른 유도를 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 높은 역가의 DR5 효능제 항체, 및 암세포에서 아팝토시스를 유도하기 위한 그들의 용도를 제공한다.
II. 항-DR4 또는 DR5 항체
1. 서론
어떤 항-DR4 또는 항-DR5 항체 효능제라도 본 발명의 방법에 따라서 사용될 수 있다. DR4 (또한, 사멸 수용체 (Death Receptor) 4라고도 불림) 및 DR5 (또한, 사멸 수용체 5라고도 불림)는 리간드 TRAIL의 두개의 수용체이다 (참조예: Pan et al., Science 277:815-8 (1997); Sheridan, et al., Science 277:818-21 3 (1997); Walczak et al., EMBO J. 16:5386-97 4 (1997)). 항-DR5 항체는 예를들어, PCT WO 01/83560 (항체 TRA-8; ATCC PTA-1428) 및 PCT WO 02/079377에 이미 기술되었다. 또한, 항-DR5 항체 효능제도 여기에 기술되어 있다. 예시된 항-DR5 항체 효능제의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 도 23-25에 제공되어 있다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 DR5에 결합시키기 위해 예시된 항체와 경쟁적이다. 몇가지 구체예에서, DR5 항체 효능제는 도 24, 25 또는 둘다에 예시된 CDR과 실질적으로 유사한 CDR을 갖는다.
어떠한 유형의 항체 효능제라도 본 발명의 방법에 따라서 사용될 수 있다. 일반적으로, 사용된 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 본 기술분야에서 공지된 어떤 방법에 의해서라도 생성될 수 있다 (예를들어, 하이브리도마, 재조합체 발현 및(또는) 파아지 디스플레이를 사용함).
본 발명의 항체는 투여하기 전에 교차결합시키거나 다른 식으로 처리할 필요가 없다. 그러나, 몇가지 구체예에서는 본 발명의 항체를 교차결합시킨다. 교차결합 (예를들어, 헤테로- 또는 호모-이관능성 화학적 교차결합제를 사용)은 본 기술분야에서 잘 공지되어 있다. 대용으로, 안정한 다가 Fabs (예를들어, 트라이머 또는 테트라머 등)가 투여될 수 있다 (참조예: PCT WO 99/27964).
항-DR5 항체의 예로는 도 24 및 25에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체의 특이성을 갖는 것이 포함된다. 몇가지 구체예에서, 항체는 항체 A (ATCC 기탁번호 )이다.
다수의 구체예에서, 본 발명의 항-DR5 항체는 다른 폴리펩티드에 결합하지 않는다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 TNF 수용체 족 (예를들어 TNFR2, TNFR3, OX40, CD40, FAS, DcR3, CD27, CD30, CD137, DR4, DcR1, DcR2, RANK, OPG, DR3, TR2, NGFR, TNFR1 및 TAC1) 내의 어떤 다른 수용체에도 결합하지 않는다. 몇가지 구체예에서, 항-DR5 항체는 DR4, DTR1, DTR2 또는 OPG에 결합하지 않는다.
본 발명의 항-DR4 또는 항-DR5 항체는 매우 강력할 수 있다. 예를들어, 몇가지 구체예로서 표준 피하 종양 제거시험에서 본 발명의 항체는 2주일 동안 주 3회씩 동물에게 투여하는 경우에 1 ㎎/㎏ 체중 또는 그 미만의 농도에서 종양 크기를 50％까지 감소시킬 수 있으며, 그 양의 10배가 사용되는 경우에 종양을 완전히 제거한다.
일부의 경우에, 본 발명의 항-DR4 또는 항-DR5 항체는 감소된 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)이 결여되거나 갖도록 디자인된다. 예를들어, 몇가지 구체예에서 본 발명의 항체는 IgG-1, IgG-2, IgG-2A, IgG3 또는 IgG-4 영역을 포함한다.
다수의 상이한 합성분자 스캐폴드 (scaffold)를 사용하여 도 24 및 25에 도시된 가변성 경쇄 및 중쇄 서열을 나타낼 수 있다. 그위에서 CDR을 포함한 펩티드를 나타내도록 하는 특이적 분자 스캐폴드로서 피브로넥틴 III형 도메인 (FN3)의 사용을 기술한 문헌은 다음과 같다: Koide, A. et al. J. Mol. Biol. 284:1141-1151 (1988). 그밖의 다른 스캐폴딩 대용물에는 예를들어, "미니바디 (minibody)" (Pessi, A. et al., Nature 362:367-369 (1993)), 텐다미스태트 (tendamistat)(McConnell, S.J. and Hoess, R.H. J. Mol. Biol. 250:460-470 (1995)), 및 "카멜화된 (camelized)" VH 도메인 (Davies J. and Riechmann, L. BioTechnology 13:475-479 (1995))이 포함된다. 면역글로불린-유사 접힌 구조를 기본으로 하지 않는 그밖의 다른 스캐폴드는 문헌 (Nygren, P.A. and Uhlen, M. Curr. Opin. Struct. Biol. 7:463-469 (1997))에서 검토되었다. 미합중국 특허 제 6,153,380 호는 추가의 스캐폴드를 기술하고 있다. 용어 "친화성제"는 본 발명에 기술된 항체에 대한 특이성을 포함하는, DR4 또는 DR5에 대한 결합특이성을 갖는 결합 도메인을 나타내기 위한 상술한 것과 같은 합성 분자 스캐폴드를 포함하는 분자를 포함한다.
2. 인간화 항체
몇가지 구체예에서, 본 발명에 따라 사용된 항체는 인간 항체의 영역과 함께 비-인간 항-DR4 또는 항-DR5 항체 효능제로부터 유래하는 영역으로 구성된 키메라 (예를들어, 마우스/인간) 항체이다. 예를들어, 키메라 H 쇄는 인간 중쇄 불변 영역의 적어도 일부분에 결합된 비-인간 항체의 중쇄 가변 영역 (예를들어, 도 24 또는 도 35에 나타낸 서열)의 항원 결합 영역을 포함할 수 있다. 이러한 인간화 또는 키메라 중쇄는 인간 경쇄 불변 영역의 적어도 일부분에 결합된 비-인간 항체의 경쇄 가변 영역 (예를들어, 도 25 또는 도 35에 나타낸 서열)의 항원 결합 영역을 포함하는 키메라 L 쇄 조합될 수 있다. 몇가지 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgM 또는 IgA 항체일 수 있다.
본 발명의 키메라 항체는 일가, 이가 또는 다가 면역글로불린일 수 있다. 예를들어, 일가 키메라 항체는 상기한 바와 같이 디설파이드 브릿지를 통해서 키메라 L 쇄와 결합된 키메라 H 쇄에 의해 형성된 다이머 (HL)이다. 2가 키메라 항체는 적어도 하나의 디설파이드 브릿지를 통해서 결합된 두개의 HL 다이머에 의해서 형성된 테트라머 (H2L2)이다. 다가 키메라 항체는 쇄의 집합을 기본으로 한다.
예시적인 항-DR5 항체 효능제의 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 22-24에 제공된다. 본 발명의 항체의 DNA 서열은 본 기술분야에서 잘 알려져 있는 절차에 의해서 동정하고, 분리하고, 클로닝하여 발현을 위해 원핵 또는 진핵세포에 전이시킬 수 있다. 이러한 절차는 일반적으로 샘브룩 등의 문헌 (Sambrook et al., 상기 참조) 및 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., 1989)에 기술되어 있다. 특히 재조합 항체 및 인간화 항체의 발현에 적합한 발현벡터 및 숙주세포는 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 이하의 문헌들은 본 발명을 수행하는데 이용될 수 있는 재조합 면역글로불린의 발현에 적합한 방법 및 벡터의 대표적인 것이다: Weidle et al., Gene, 51: 21-29 (1987); Dorai et al., J. Immunol., 13(12): 4232-4241 (1987); De Waele et al., Eur. J. Biochem., 176: 287-295 (1988); Colcher et al., Cancer Res., 49:1738-1745 (1989); Wood et al., J. Immunol., 145(a):3011-3016 (1990); Bulens et al., Eur. J. Biochem., 195:235-242 (1991); Beggington et al., Biol. Technology, 10:169 (1992); King et al., Biochem. J., 281:317-323 (1992); Page et al., Biol. Technology, 2:64 (1991); King et al., Biochem. J., 290:723-729 (1993); Chaudary et al., Nature, 339:394-397 (1989); Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Benhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:12051-12055 (1994); Singer et al., J. Immunol., 150:2844-2857 (1993); Cooto et al., Hybridoma, 13(3):215-219 (1994); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989); Caron et al., Cancer Res., 32:6761-6767 (1992); Cotoma et al., J. Immunol. Meth., 152:89-109 (1992). 또한, 재조합 항체의 발현에 적합한 벡터는 시판품으로 이용할 수 있다.
기능성 면역글로불린을 발현할 수 있는 숙주세포에는 예를들어 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포와 같은 포유동물 세포; COS 세포; NSO 및 SP2/O 세포와 같은 골수종 세포; 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)와 같은 박테리아; 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모 세포; 및 그밖의 다른 숙주세포가 포함된다.
3. 단일쇄 항체
몇가지 구체예에서, 본 발명의 항체는 단일쇄 항체이다. 단일쇄 Fvs 및 항체를 생산하는데 사용할 수 있는 기술의 예로는 미합중국 특허 제 4,946,778 및 5,258,498 호; 및 문헌 (Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988))에 기술된 것이 포함된다.
4. 인간 항체
몇가지 구체예에서는, 인간 항체가 본 발명에 따라 사용된다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유도된 항체 라이브러리를 사용하는 파아지 디스플레이 방법을 사용하는 것을 포함하여 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법에 의해서 만들어질 수 있다 (참조예: Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995), 미합중국 특허 제 4,444,887 및 4,716,111 호; 및 PCT 공개 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10714 호; 이들 각각은 본 발명에 그대로 참고로 포함된다).
몇가지 구체예에서, 본 발명의 항체는 파아지 디스플레이를 사용하여 생성된다. 예를들어, 기능성 항체 도메인은 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수반하는 파아지 입자의 표면 상에 표시된다. 이러한 파아지는 레퍼토리 (repertoire) 또는 조합 (combinatorial) 항체 라이브러리 (예를들어, 인간 또는 쥐)로부터 발현된 항체-결합 도메인을 표시하는데 사용될 수 있다. DR4 또는 DR5를 결합시킨 항원 결합 도메인을 발현하는 파아지는 DR4 또는 DR5에 의해서, 예를들어 표지된 DR4 또는 DR5를 사용하여 선택하고 동정될 수 있다. 이들 방법에서 사용된 파아지는 일반적으로, 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 디설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 파아지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함한 필라멘트상 파아지이다. 본 발명의 항체를 만드는데 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예로는 문헌 (Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT 출원 제 PCT/GB91/01134; PCT 공개 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미합중국 특허 제 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108 호; 이들 각각은 그대로 본 발명에 참고로 포함된다).
5. 효능제 항체의 생성
효능제 항체는 항-DR4 또는 항-DR5 항체를 생성시킨 다음에 각각의 항체를 DR4 또는 DR5 매개된 현상을 유발하는 능력, 예를들어 암세포에서 아팝토시스를 유도하는 능력에 대하여 시험함으로써 동정될 수 있다. 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법을 사용하여 아팝토시스의 유도를 검출할 수 있다.
한가지 시험방법에서는, DOHH-2 또는 Jurkat 세포를 후보 항체 효능제와 접촉시킨 다음에, 항체 농도의 함수로서 생존능에 대하여 모니터한다. 증가된 항체 농도에 따른 감소된 세포 생존능 (예를들어, 증가된 아팝토시스에 의해서 야기됨)은 항체가 효능제임을 나타내는 것이다. 세포 생존능은 죽지 않은 생존 세포의 존재하에서 형광을 발하는 알라마르 블루 (Alamar blue)를 첨가함으로써 시험할 수 있다. 실시예에 기술된 바와 같이, 효능제 항체는 DR4 또는 DR5에 대해서 야기된 하이브리도마를 스크리닝한 다음에, DOHH-2 또는 Jurkat 세포에서 아팝토시스를 유도하는 능력에 대하여 하이브리도마 상등액을 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 적절한 양성 및 음성 대조군을 사용하여 결과를 확인할 수 있다. 예를들어, DR4 또는 DR5-매개된 TRAIL 유도된 아팝토시스를 일으키지 않은 세포주는 후보 항-DR4 또는 항-DR5 항체에 대한 반응으로 아팝토시스를 일으키지는 않아야 한다.
III. 아팝토시스-유도제
본 발명은 항-DR4 또는 항-DR5 친화성제 효능제와 제 2 아팝토시스-유도제의 상승적 효과를 제공한다. 아팝토시스-유도제에는 세포 내에서 아팝토시스를 유도하는 어떠한 약제라도 포함된다. 몇가지 구체예에서, 아팝토시스-유도제는 비-암세포에 대비하여 암세포에서 우선적으로 아팝토시스를 유도한다. 전형적으로, 아팝토시스-유도제는 아팝토시스의 효능제 또는 활성화제, 또는 아팝토시스의 억제제의 길항제이다.
아팝토시스-유도제의 예로는 예를들어 SMAC, Bax, Bik, Bok, Bim, Bak, Bid, Noxa, Puma, Hrk, 또는 Bad; BH3, p53, TRAIL 리간드, Fadd, Myc 및 Mekk1, 신호 인식 입자 72 kD (SRP72), 카스파제-8, Bid, B 림프 티로신 키나아제 (BLK), 피루베이트 키나아제와 유사한 유전자 생성물, M2 이소자임 (LOC148283), 글리코겐 신타아제 키나아제 3 알파 (GSK3A), 가상 단백질 FLJ32312 (FLJ32312), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 10 (MAPK10), TCF4; 전사인자 4, v-abl 아벨슨 쥐 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체 2 (arg, 아벨슨-관련 유전자)(ABL2), v-ros 조류 UR2 육종 바이러스 종양유전자 상동체 1 (ROS1) 및 v-myc 조류 골수세포종증 바이러스 종양유전자 상동체와 같은 효능제 또는 모방체; 및 26S 프로테아좀 억제제, c-플립, NFκB 경로, IAP 족 구성원 (예를들어, XIAP, cIAP1, cIAP2, NAIP, MLIAP/리빈, 서바이빈), 프로테아좀 경로 구성원 (예를들어, E1, E2 및 E3); 키나아제 PI3, Akt1, 2 및 3, Rip, Nik; CD40; Bcl2 족 구성원 (예를들어, Bcl2, Bcl-x1, A1, Mcl1), 유비퀴틴 컨쥬가제 UbcH10 (인간 UbcH10의 폴리뉴클레오티드 서열 코딩 변이체에는 예를들어 기탁번호 NM_181803, NM_181802, NM_181801, NM_181800, NM_181799, NM_007019 및 BC050736이 포함된다), 오스테오프로테그린, 플렉신 B1 (PLXNB1), SET 도메인-함유 단백질 7 (SET7), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 키나아제 키나아제 5 (MAP3K5), STE20-유사 키나아제 (JIK), MAP 키나아제-상호작용성 세린/트레오닌 키나아제 1 (MKNK1), 추정 소포체 다중통과 막횡단 단백질 (RFT1), 5-키나아제, I형, 감마 (PIP5K1C), 미토젠-활성화 단백질 키나아제-활성화 단백질 키나아제 2 (MAPKAPK2), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 키나아제 5 (MAP2K5), 사이클린-의존성 키나아제 6 (CDK6), 액티빈 A 수용체 II형-유사 1 (ACVRL1), 가드너-라쉬드 고양이 육종 바이러스 (v-fgr) 종양유전자 상동체 (FGR), 가상 단백질 FLJ21802 (FLJ21802), 근육, 골격, 수용체 티로신 키나아제 (MUSK), 염색체 20 오픈 리딩 프레임 88 (C20orf88), 벤즈이미다졸에 의해서 억제되지 않는 출아 1 (효모 상동체)(BUB1), 리보솜 단백질 S6 키나아제, 90kD, 폴리펩티드 5 (RPS6KA5), v-yes-1 야마구찌 육종 바이러스 관련 종양유전자 상동체 (LYN), 미토젠-활성화 단백질 키나아제 7 (MAPK7) 및 v-akt 쥐 흉선종 바이러스 종양유전자 상동체 1 (AKT1), PAK1 (예를들어, 이하의 P21(CDKN1A)-활성화 키나아제 1, PAKA, P65-PAK, P68-PAK, 알파-PAK, MUK2, PAK1B (p21 활성화 키나아제 1B), P21/Cdc42/Rac1-활성화 키나아제 1 (효모 Ste20-관련), Cdc42/Rac 효과기 키나아제 PAK-A, 단백질 키나아제 MUK2 중의 어떤 것을 포함), nsurf, stk12 (예를들어, 세린/트레오닌 키나아제 12, 오로라-관련 키나아제 2, 오로라/IPL1-유사 키나아제 2, AIK2, ARK2, AIM-1 및 AIMI을 포함), 아팝토시스 신호-조절 키나아제 1 (Ask1), TLK1 (예를들어, 기탁번호 NM_012290), NLK (예를들어, 기탁번호 NM_016231), GRAF (예를들어, 기탁번호 NM_015071), GCK (예를들어, 기탁번호 NM_000162), ERK5 (예를들어, 기탁번호 NM_002749), FGR (예를들어, 기탁번호 NM_005248), ACVRL1 (예를들어, 기탁번호 NM_000020), MEKK5 (예를들어, 기탁번호 NM_002757), PIP5KIC (예를들어, 기탁번호 XM_047620), MAPKAPK2 (예를들어, 기탁번호 NM_004759), RFT1 (예를들어, 기탁번호 NM_052859), MKNK1 (예를들어, 기탁번호 NM_003684), PLXNB1 (예를들어, 기탁번호 NM_002673)과 같은 길항제 또는 억제제가 포함된다. 추가의 예시적인 아팝토시스-유도제에는 예를들어, DR5 및 DR4 발현 및(또는) 안정성을 증진시키는 약제, 카스파제 활성 또는 안정성을 증진시키는 약제, 및 DNA 손상반응을 유도하거나 증진시키는 약제가 포함된다. 상기 리스트의 효능제 또는 모방체에는 유전자 생성물 그 자체 (예를들어, p53은 p53 효능제이다) 및 효능제 항체가 포함된다. 길항제에는 활성을 직접적으로 억제하는 약제 (예를들어, 길항제 항체), 및 표적분자 mRNA (예를들어, siRNA) 또는 단백질의 발현 또는 안정성을 감소시킴으로써 활성을 간접적으로 억제하는 약제가 포함된다.
이들 유전자 생성물을 표적화시킴으로써 동정될 수 있는 아팝토시스-유도제에는 다양한 화학적 성질의 화합물이 포함된다. 예를들어, 이들 유전자 생성물의 변조제는 폴리펩티드, 베타-턴 (beta-turn) 모방체, 폴리사카라이드, 포스포리피드, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀, 올리고머성 N-치환된 글리신, 올리고카바메이트, 폴리펩티드, 사카라이드, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 그의 유도체, 구조적 유사체 또는 배합물의 라이브러리에 의해서 스크리닝될 수 있다.
몇가지 구체예에서, 아팝토시스-유도제는 폴리뉴클레오티드이다. 예를들어, TRAIL-유도된 아팝토시스를 억제하는 유전자를 표적화하는 siRNA일 수 있다 (예를들어, UbcH10 또는 도 27의 첫번째 부분에서 열거된 분자). 몇가지 구체예에서, 아팝토시스-유도제는 소분자 화합물 (예를들어, 1500 달톤 미만, 및 일부의 경우에는 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는 분자)이다. 예를들어, 아팝토시스-유도제는 TRAIL-유도된 아팝토시스를 억제하는 유전자 생성물의 발현 또는 활성을 억제하는 소분자 화합물일 수 있다 (예를들어, UbcH10 또는 도 27의 첫번째 부분에서 열거된 분자). 아팝토시스-유도제는 또한, TRAIL-유도된 아팝토시스를 촉진시키는 유전자 생성물의 발현 또는 활성을 증진시키는 소분자 화합물일 수도 있다 (예를들어, UbcH10 또는 도 27의 하부 부분에서 열거된 분자). 유전자 및 그의 코딩된 폴리펩티드의 변조제 (소분자 변조제를 포함)를 스크리닝하는 방법, 및 siRNA 또는 공지의 유전자의 그밖의 억제성 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법도 모두 본 기술분야에서 잘 알려져 있다 (참조예: 미합중국 특허 제 6,573,099 및 6,506,559 호; Principles and Practice of High Throughput Screening, K. Murray (Ed.), CRC Press (2003); High Throughput Screening: Methods and Protocols, W. Janzen (Ed.), Humana Press (2002); PCT 공개 WO 95/35503, WO 95/30642 및 WO 91/18980 호; Schultz et al., Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414, 1998; 및 Weller et al., Mol Divers. 3:61-70, 1997). 이들 유전자의 변조제를 스크리닝하기 위해서 사용될 수 있는 추가의 방법 및 그들의 생성물은 예를들어, 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 3rd Ed. (2000); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York (1999))에 기술되어 있다.
몇가지 구체예에서, 아팝토시스-유도제는 항-DR4 또는 항-DR5 항체 효능제에 컨쥬게이트된다. 또 다른 구체예에서, 아팝토시스-유도제는 항-DR4 또는 항-DR5 항체 효능제에 컨쥬게이트되지 않는다.
몇가지 구체예에서, 아팝토시스-유도제는 TNF-알파, TNF-베타, AIM I, AIM II, Fas 리간드, 또는 VEGI는 아니다.
1. SMAC
몇가지 구체예에서, 아팝토시스-유도제는 SMAC/디아블로 (Diablo) 또는 SMAC 모방체 또는 효능제이다. SMAC/디아블로는 아팝토시스 단백질의 억제제 (IAP)를 결합시킴으로써 카스파제 활성을 촉진시킨다 (참조예: Du et al., Cell 102:33-42 (2000); Verhagen et al., Cell 102:43-53, 2000; 미합중국 특허출원 제 2002/0110851 호). 세포에서 SMAC의 투여 또는 발현은 본 발명에 포함된다. SMAC의 N-말단 펩티드 (예를들어, N-말단 테트라 또는 헵타펩티드 (Guo et al., Blood 99(9):3419-3426 (2002); Srinivasula et al., J. Biol. Chem. 275:36152-36157 (2000))와 같은 SMAC 단편도 또한 발현되거나 투요될 수 있다 (또한, 미합중국 특허출원 제 2002/0132786 호를 참조).
또한, SMAC 모방체 화합물을 본 발명에 따라 사용할 수도 있다. 이들 화합물은 유용한 약제학적 특성을 가질 수 있으며, 그 자체로 항-DR4 또는 항-DR5 항체와 함께 투여하기에 더욱 효율적일 수 있다. SMAC 모방체의 예로는 예를들어, 화학식 X1X2X3X4 (여기에서 X1은 A이고, X2는 V, T 또는 I이며, X3는 P 또는 A이고, X4는 F, Y, I 또는 V이다)의 테트라펩티드를 포함하여, IAP의 BIR 도메인 내의 표면 그루브 (groove)에 결합하는 테트라펩티드를 포함하는 펩티드 또는 그밖의 다른 SMAC 펩티드, PCT WO 02/26775에 기술된 효능제 또는 펩티도모방체가 포함된다. 그밖의 다른 SMAC 모방체의 예로는 LBP672가 포함된다 (참조예: 도 15 및 실시예 54).
2. 26S 프로테아좀 억제제
몇가지 구체예에서, 아팝토시스-유도제는 26S 프로테아좀 억제제이다. 프로테아좀 억제제는 프로테아좀-유비퀴틴 경로를 억제함으로써 IκB의 분해 및 이어서 IκB의 파트너인 NFκB의 핵 국재화를 방지하는 약제이다. 프로테아좀은 두개의 기능성 성분, 즉 20S 코어 촉매적 서브유니트 및 19S 조절성 서브유니트를 갖는다. 20S 및 19S 서브유니트는 유비퀴틴의 첨가에 의한 분해에 대해서 표적화된 단백질을 분해시키는 26S 복합체를 형성한다. 프로테아좀 억제제의 예로는 예를들어, PS-341 (NSC no. 681239, 보르테조미브 (bortezomib)로도 공지됨) 및 그의 상동체 (참조예: Adams, Cur. Opin. Chem. Biol. 6:493-500 (2002))가 포함된다. 본 발명의 방법에 따라 유용한 PS-341 및 그밖의 프로테아좀 억제제는 본 발명에 참고로 포함된 미합중국 특허 제 5,780,454 호에 기술되어 있다.
프로테아좀 억제제의 추가의 예로는 예를들어 락타시스틴, PS-273 (NSC no. 681226); PS-293 (NSC no. 681227); PS-296 (NSC no. 681228); PS-303 (NSC no. 681229); PS-305 (NSC no. 681231); PS-313 (NSC no. 681234); PS-321 (NSC no. 681236); PS-334 (NSC no. 681237); PS-364 (NSC no. 681242); PS-325 (NSC no. 683086); PS-352 (NSC no. 683094); PS-383 (NSC no. 683098), YU101 (ac-hFLFL-에폭사이드)(참조예: Elofsson, et al., Chem. Biol. 6:811-822 (1999)), MG262, MG132, MG115, PSI (프로테아좀 억제제 N-벤질옥시카보닐-Ile-Glu(O-3급-부틸)-Ala-로이시날)이 포함된다. 프로테아좀 억제제를 동정하는 시험은 예를들어, 디스커벅스 (Discoverx; Fremont, CA)로부터 시판품을 이용할 수 있다.
26S 프로테아좀 억제제와 DR4 또는 DR5 효능제 (예를들어, 본 발명의 항-DR4 또는 항-DR5 항체)의 배합물은 광범한 고증식성 질환을 위한 효과적인 치료법일 수 있지만, 이 배합물은 미토콘드리아성 아팝토시스 경로의 Bax 또는 그밖의 다른 성분들 (예를들어, Bcl-x1 또는 Bcl-2)에 결함이 있는 암세포에 대해서 특히 효과적일 수 있다. 예를들어, 결장암 환자는 종종 Bax 결핍성인 종양세포를 갖는다. 따라서, DR4 또는 DR5 길항제와 배합된 프로테아좀 억제제는 Bax 또는 그밖의 다른 미토콘드리아성 아팝토시스 결함이 연루된 결장암을 치료하는데 특히 효과적이다.
몇가지 구체예에서, 프로테아좀 억제제는 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 염이다:
상기 식에서,
R1은 비치환되거나 치환된 아릴; 아릴 부분이 비치환되거나 치환된 아릴알킬카보닐; 비치환되거나 치환된 헤테로사이클릴; 또는 헤테로사이클릴 부분이 비치환되거나 치환된 헤테로사이클릴알킬카보닐이고;
R2는 비치환되거나 치환된 아릴 또는 비치환되거나 치환된 헤테로아릴이며;
R3는 수소, 비치환되거나 치환된 아릴, 또는 비치환되거나 치환된사이클로알킬, 비치환되거나 치환된 아릴, 또는 적어도 하나의 질소 원자를 포함하는 비치환되거나 치환된 헤테로아릴에 의해서 비치환되거나 치환된 알킬이고;
R4는 하기 화학식 IA의 잔기이며,
여기에서 A1 및 A2는 하이드록시 또는 치환된 하이드록시이거나, 결합한 붕소 원자 및 두개의 결합성 산소 원자와 함께 화학식 IA*의 환 (ring)을 형성하며,
여기에서 W는 알킬렌, 치환된 알킬렌, 비치환되거나 치환된 사이클로알킬렌, 비치환되거나 치환된 비사이클로알킬렌 또는 비치환되거나 치환된 트리사이클로알킬렌이고;
R5는 비치환되거나 치환된 알킬, 비치환되거나 치환된 아릴, 비치환되거나 치환된 헤테로사이클릴, 또는 비치환되거나 치환된 사이클로알킬이다.
화학식 I과 관련하여 사용된 일반적 용어는 다음의 의미를 갖는다:
아릴은 바람직하게는 20개를 초과하지 않는 탄소 원자, 특히 12개를 초과하지 않는 탄소 원자의 환 시스템을 가지며, 바람직하게는 모노-, 비- 또는 트리-사이클릭이고, 비치환되거나 치환되며, 바람직하게는 각각의 경우에 비치환되거나 치환된 페닐 또는 (특히 1- 또는 2-)나프틸이고, 여기에서 하나 또는 그 이상의 치환체는 바람직하게는 지방족 라디칼; 유리, 에테르화 또는 에스테르화 하이드록시; 유리 또는 에스테르화 카복시; 포르밀; 알카노일; 비치환, 일치환 또는 이치환된 아미노; 머캅토; 설포; 알킬-티오; 카바모일; N-알킬-카바모일; N,N-디알킬-카바모일; 페닐; 나프틸; 헤테로사이클릴, 특히 피리딜; 시아노 및 니트로로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, 더욱 바람직하게는 알킬, 예를들어 메틸, 에틸 또는 프로필; 알콕시, 예를들어 메톡시 또는 에톡시; 이치환된 아미노, 예를들어 디메틸아미노; 할로겐, 예를들어 클로로 또는 브로모; 할로겐-알킬, 예를들어 트리플루오로메틸; 및 페닐, (특히 1- 또는 2-)나프틸, 및 특히 이하에 정의하는 바와 같은 헤테로사이클릴, 특히 피리딜, 예를들어 3-, 4- 또는 특히 2-피리딜 (이들은 각각, 특히 바로 언급된 다른 아릴 치환체로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상, 특히는 3개 까지의 치환체에 의해서 치환되거나 비치환된다)로부터 선택된다. 아릴 R1은 더욱 바람직하게는 비페닐릴, 특히 2-, 4- 또는 바람직하게는 3-비페닐릴, 피리딜페닐, 특히 4-, 3- 또는 가장 특히는 2-피리딜-(2-, 4- 또는 바람직하게는 3-)페닐, 또는 저급 알킬-페닐, 특히 2-, 4- 또는 특히는 3-이소프로필페닐과 같은 프로필-페닐이다. 아릴알킬카보닐 R1 (비치환되거나, 바람직하게는 치환된 아릴을 가짐)은 바람직하게는 상기 정의한 바와 같은 아릴을 갖는 아릴-저급 알킬카보닐, 더욱 바람직하게는 페닐-저급 알킬옥시-페닐-저급 알킬카보닐, 특히 2-, 4- 또는 바람직하게는 3-벤질옥시-페닐-아세틸 또는 -프로피오닐, 피리딜-저급 알킬옥시페닐-저급 알킬카보닐, 특히 2-, 4- 또는 바람직하게는 3-(피리딘-2-, -4- 또는 바람직하게는 -3-)-아세틸 또는 -프로피오닐, 또는 페닐-저급 알킬카보닐, 특히 페닐-2- 또는 바람직하게는 3-페닐-프로피오닐 또는 페닐아세틸이며, 여기에서 페닐은 비치환되거나, 저급 알콕시, 특히 메톡시, 할로겐, 특히 플루오로 또는 클로로, 또는 트리플루오로메틸과 같은 할로겐-저급 알킬로부터 독립적으로 선택된 3개 까지의 치환체에 의해서 치환된다. 비치환되거나 치환된 아릴 R2 또는 (독립적으로) R3는 바람직하게는, 특히 아릴에 대해 언급한 치환체로부터, 특히 하이드록시, 저급 알콕시 (가장 바람직함), 바람직하게는 메톡시, 할로겐, 바람직하게는 플루오로 또는 클로로, 및 할로겐-저급 알킬, 바람직하게는 트리플루오로메틸로부터 독립적으로 선택된 4개 까지의 치환체에 의해서 치환된 일-, 이- 또는 삼치환된 페닐, 특히 3개 까지의 저급 알콕시, 바람직하게는 메톡시 치환체에 의해서 치환된 페닐이거나, R3의 경우에는 비치환된 페닐, 또는 추가의 비치환되거나 치환된 나프틸, 특히는 아릴에 대해 언급한 치환체로부터, 특히 하이드록시, 저급 알콕시 (가장 바람직함), 바람직하게는 메톡시, 할로겐, 바람직하게는 플루오로 또는 클로로, 및 할로겐-저급 알킬, 바람직하게는 트리플루오로메틸로부터 독립적으로 선택된 4개까지의 치환체에 의해서 치환되거나 비치환된 1- 또는 2-나프틸이다.
비치환된 헤테로사이클릴은 바람직하게는, 결합 환에서 불포화되거나, 포화되거나, 부분적으로 포화되고, 바람직하게는 모노사이클릭이거나, 더 넓은 개념에서는 비사이클릭 또는 트리사이클릭 환이고, 3 내지 24개, 더욱 바람직하게는 4 내지 16개의 환 원자를 갖는 헤테로사이클릭 라디칼이며, 여기에서 적어도 화학식 I의 분자의 라디칼에 결합하는 환에서 상응하는 아릴 라디칼의 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 1 내지 4개, 특히 1 또는 2개의 탄소 원자는 질소, 산소 및 황으로 구성된 그룹으로부터 선택된 헤테로원자에 의해서 치환되고, 결합 환은 바람직하게는 4 내지 12개, 특히5 내지 7개의 환 원자를 가지며; 헤테로아릴은 치환된 아릴의 치환체로 상기 정의된 치환체로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상, 특히는 1 내지 3개의 치환체에 의해서 치환되거나 비치환되며, 특히는 이미다졸릴, 티에닐, 푸릴, 테트라하이드로푸릴, 피라닐, 티안트레닐, 이소벤조푸라닐, 벤조푸라닐, 크로메닐, 2H-피롤릴, 피롤릴, 피롤리닐, 피롤리디닐, 이미다졸릴, 이미다졸리디닐, 벤즈이미다졸릴, 피라졸릴, 피라졸리디닐, 피라니올, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피페리딜, 피페라지닐, 피리다지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 인돌릴, 인다졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 퓨리닐, 4H-퀴놀리지닐, 이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 테트라하이드로퀴놀릴, 테트라하이드로이소퀴놀릴, 데카하이드로퀴놀릴, 옥타하이드로이소퀴놀릴, 벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살릴, 퀴나졸리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프테리디닐, 카바졸릴, β-카볼리닐, 페난트리디닐, 아크리디닐, 페리미디닐, 페난트롤리닐, 푸라자닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 이소크로마닐 및 크로마닐로 구성된 그룹으로부터 선택된 헤테로아릴 라디칼이고, 이들 각각의 라디칼은 저급 알킬, 특히 메틸 또는 3급-부틸, 저급 알콕시, 특히 메톡시, 및 할로, 특히 브로모 또는 클로로로 구성된 그룹으로부터 선택된 1 내지 2개의 라디칼에 의해서 치환되거나 비치환되며; 피리딜, 특히 2- 또는 3-피리딜, 또는 인돌릴이 특히 바람직하고, 더 넓은 관점에서는 저급 알킬-피리딜, 피리미디닐 또는 저급 알킬피리미디닐, 할로-저급 알킬피리딜, 저급 알콕시-피리딜, 디-저급 알킬-피리딜 또는 할로-피리딜이다. 헤테로사이클릴은 아릴에 대해서 상기 언급된 것 (여기에서 헤테로사이클릴의 치환체로서의 헤테로사이클릴은 피리딜 또는 인돌릴 이외의 추가의 헤테로사이클릴 치환체를 갖지 않는다)으로부터, 및 상기 정의한 바와 같은 아릴, 특히 페닐, 특히 바람직한 것으로 언급된 것으로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 3개까지의 치환체에 의해서 치환되거나 비치환된다. 비치환된 헤테로사이클릴이 바람직하다.
헤테로사이클릴알킬카보닐 R1에서, 헤테로사이클릴 부분은 상기 언급한 바와 같이 바람직하게는 치환되거나, 특히 비치환된 헤테로사이클릴이며; 바람직한 것은 특히 말단 치환되거나 바람직하게는 비치환된 헤테로사이클릴, 상술한 바와 같은 헤테로사이클릴을 갖는 치환되거나 바람직하게는 비치환된 헤테로사이클릴-저급 알킬이고; -아세틸 또는 -프로피오닐과 같은 피리딜-저급 알킬카보닐이 바람직하다.
R1으로는 비치환되거나 치환된 아릴 또는 치환된 아릴-저급 알킬카보닐이 바람직하다.
헤테로아릴 R2는 바람직하게는 상기 언급한 바와 같은 비치환되거나 치환된 헤테로아릴, 특히 치환된 아릴에 대해 상기 언급한 것으로부터, 특히 하이드록시, 저급 알콕시 (가장 바람직함), 바람직하게는 메톡시, 할로겐, 바람직하게는 플루오로 또는 클로로, 및 할로겐-저급 알킬, 바람직하게는 트리플루오로메틸로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상, 특히 3개까지의 치환체에 의해서 비치환되거나 치환된 인돌릴이다.
R2는 바람직하게는 치환된 아릴이다.
지방족 라디칼은 바람직하게는 12개까지의 탄소 원자, 바람직하게는 7개까지의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 4개까지의 탄소 원자를 가지며, 비치환되거나 치환된 알키닐, 알케닐 또는 바람직하게는 알킬 라디칼과 같은 지방족 탄화수소 라디칼, 더욱 바람직하게는 저급 알킬, 특히 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 2급-부틸, 이소-부틸 또는 3급-부틸이다.
분지되거나 직선일 수 있는 알킬은 바람직하게는 12개까지의 탄소 원자를 가지며, 더욱 바람직하게는 저급 알킬이다. 알킬 R3는 바람직하게는 저급 알킬, 특히 이소부틸이다.
접두어 "저급"은 7개까지, 바람직하게는 4개까지의 탄소 원자를 갖는 라디칼을 의미한다.
저급 알킬은 바람직하게는 n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실 또는 n-헵틸, 바람직하게는 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 이소프로필, 에틸 또는 메틸, 가장 바람직하게는 이소프로필, 에틸 또는 메틸이다.
에테르화 하이드록시는 예를들어 알콕시, 특히 에톡시 또는 메톡시와 같은 저급 알콕시, 아릴옥시, 특히 페닐옥시, 아릴-저급 알콕시, 특히 페닐-저급 알콕시, 헤테로사이클릴옥시, 특히 피리딜옥시, 또는 헤테로사이클릴-저급 알콕시, 특히 피리딜-저급 알콕시 (아릴 및 헤테로사이클릴은 바람직하게는 상기에 제시된 의미를 갖는다)이다.
에스테르화 하이드록시는 바람직하게는 알카노산과 같은 유기 카복실산에 의해서 에스테르화된 하이드록시, 예를들어 저급 알카노일옥시이다.
에스테르화 카복시는 예를들어, 알콕시카보닐, 특히 예를들어, 메톡시카보닐과 같은 저급 알콕시카보닐이다.
일치환 또는 이치환된 아미노는 바람직하게는 N-알킬아미노 또는 N,N-디알킬아미노, 특히 N-메틸아미노 또는 N,N-디메틸아미노와 같은 N-저급 알킬아미노 또는 저급 N,N-디-저급 알킬아미노이다.
할로겐은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드, 바람직하게는 불소, 염소 또는 브롬이다.
비치환되거나 치환된 사이클로알킬은 바람직하게는 12개까지, 더욱 바람직하게는 3 내지 8개의 환 카보닐 원자를 가지며, 치환된 아릴에 대해 언급된 것으로부터 독립적으로 선택된 한개 또는 그 이상, 특히 3개까지의 치환체에 의해서 치환되거나, 바람직하게는 비치환된다. 바람직한 것은 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 사이클로헵틸이다.
비치환되거나 치환된 사이클로알킬에 의해서 치환된 알킬 R3에서 알킬은 바람직하게는 상기에서 정의한 바와 같고, 더욱 바람직하게는 저급 알킬, 특히 이소프로필이며, 상기 정의한 바와 같은 사이클로알킬에 의해서 (바람직하게는 말단적으로) 치환된다.
비치환되거나 치환된 아릴에 의해서 치환된 알킬 R3에서, 알킬은 바람직하게는 마지막 단락에서 정의한 바와 같으며, 아릴은 상기 정의한 바와 같고, 치환된 아릴에 대해서 언급된 것들로부터 독립적으로 선택된 한개 또는 그 이상, 특히 3개까지의 치환체에 의해서 치환되거나, 비치환되며; 특히 아릴은 할로겐, 특히 플루오로, 하이드록시 또는 저급 알콕시, 특히 메톡시로부터 독립적으로 선택된 한개 또는 그 이상, 특히 3개까지의 치환체에 의해서 치환된 페닐이거나, 또는 이것은 비치환된 페닐이다.
비치환되거나 치환된 헤테로사이클릴에 의해서 치환된 알킬 R3에서, 알킬은 바람직하게는 사이클로알킬에 의해서 치환된 알킬 R3에 대해서 정의된 바와 같으며, 헤테로사이클릴은 상기 정의한 바와 같고, 치환된 헤테로사이클릴에 대해 언급된 것들로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상, 특히 3개까지의 치환체에 의해서 치환되거나, 비치환된다.
A1 및 A2가 각각 치환된 하이드록시인 경우에, 치환된 하이드록시는 바람직하게는 알킬옥시, 특히 저급 알킬옥시, 특히 상기 정의한 바와 같은 비치환되거나 치환된 아릴을 갖는 아릴옥시, 또는 상기 정의한 바와 같은 비치환되거나 치환된 사이클로알킬을 갖는 사이클로알킬옥시이다.
A1 및 A2가 결합 붕소 원자 및 산소 원자와 함께 환 또는 상기에 나타낸 화학식 IA*를 형성하는 경우에, W는 바람직하게는 공간적으로 가깝거나 이웃한 탄소 원자, 특히 인접하거나 ("1,2-") 또는 "1,3"-위치 (서로에 대해 상대적으로)에 있는 두개의 상이한 탄소 원자 상의 붕소 원자에 결합된 두개의 산소 원자를 보유한다.
알킬렌은 바람직하게는 바로 위에 기술된 바와 같은 두개의 상이한 탄소 원자, 바람직하게는 인접하거나 "1,3"-위치의 탄소 원자를 통해서 결합된 분지되지 않은 C2-C12-, 바람직하게는 C2-C7 알킬렌 잔기, 예를들어 에틸렌 또는 프로필렌, 넓은 관점에서 부틸렌, 펜틸렌 또는 헥실렌이다. 붕소 원자에 결합하는 산소 원자에 결합되지 않은 하나 또는 그 이상, 특히 하나의 탄소 원자는, 예를들어 1,5-(3-아자-펜틸렌)에서와 같이 O, S 또는 바람직하게는 N (각각의 경우에 필요한 수의 H 원자를 보유한다)으로부터 선택된 헤테로원자에 의해서 치환될 수 있다.
치환된 알킬렌은 바람직하게는 메틸 또는 에틸과 같은 저급 알킬 (예를들어 1-메틸에틸렌, 1,2-디메틸에틸렌의 경우), 하이드록시 (예를들어, 2-하이드록시-프로필렌의 경우), 또는 하이드록시메틸과 같은 하이드록시-저급 알킬 (예를들어, 1-하이드록시메틸-에틸렌의 경우)로부터 바람직하게 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상, 특히 3개까지의 치환체에 의해서 치환되거나 비치환된 상기 정의한 바와 같은 분지되지 않은 저급 알킬렌 잔기이다.
비치환되거나 치환된 사이클로알킬렌은 바람직하게는 W에 대해 기술된 바와 같이 두개의 상이한 탄소 원자를 통해서, 바람직하게는 인접하거나 "1,3"-위치의 탄소 원자를 통해서 결합된 사이클로헥실렌 또는 사이클로펜틸렌과 같은 C3-C12-, 더욱 바람직하게는 C3-C8-사이클로알킬렌이며, 여기에서 붕소 원자에 결합하는 산소 원자에 결합되지 않은 하나 또는 그 이상, 특히 하나의 탄소 원자는, 예를들어 테트라하이드로푸릴렌 또는 테트라하이드로피라닐렌에서와 같이 O, S 또는 N (각각의 경우에 필요한 수의 H 원자를 보유한다)으로부터 선택된 헤테로원자에 의해서 치환될 수 있고, 메틸 또는 에틸과 같은 저급 알킬, 하이드록시, 메톡시와 같은 하이드록시-저급 알킬, 또는 산소 원자를 통해서 결합된 모노- 또는 올리고사카리딜 ("올리고사카리딜"은 바람직하게는 5개까지의 사카리딜 잔기를 포함한다)로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상, 특히 3개까지의 치환체에 의해서 비치환되거나 치환될 수 있다.
비치환되거나 치환된 비사이클로알킬렌은 바람직하게는 W에 대해 기술된 바와 같이 두개의 상이한 탄소 원자를 통해서, 바람직하게는 인접하거나 "1,3"-위치의 탄소 원자를 통해서 결합된 C5-C12-비사이클로알킬렌이며, 여기에서 붕소 원자에 결합하는 산소 원자에 결합되지 않은 하나 또는 그 이상, 특히 하나의 탄소 원자는 O, S 또는 N (각각의 경우에 필요한 수의 H 원자를 보유한다)으로부터 선택된 헤테로원자에 의해서 치환될 수 있고, 메틸 또는 에틸과 같은 저급 알킬, 하이드록시, 및 메톡시와 같은 하이드록시-저급 알킬로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상, 특히 3개까지의 치환체에 의해서 비치환되거나 치환될 수 있다. 바람직한 것은 핀아닐렌 (2,3-(2,6,6-트리메틸-비사이클로[3.1.1]헵탄이다.
비치환되거나 치환된 트리사이클로알킬렌은 바람직하게는 W에 대해 기술된 바와 같이 두개의 상이한 탄소 원자를 통해서, 바람직하게는 인접하거나 "1,3"-위치의 탄소 원자를 통해서 결합된 C8-C12-트리사이클로알킬렌이며, 여기에서 붕소 원자에 결합하는 산소 원자에 결합되지 않은 하나 또는 그 이상, 특히 하나의 탄소 원자는 O, S 또는 N (각각의 경우에 필요한 수의 H 원자를 보유한다)으로부터 선택된 헤테로원자에 의해서 치환될 수 있고, 메틸 또는 에틸과 같은 저급 알킬, 하이드록시, 및 메톡시와 같은 하이드록시-저급 알킬로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상, 특히 3개까지의 치환체에 의해서 비치환되거나 치환될 수 있다.
가장 바람직하게는 R4는 -B(OH)2 또는 2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일, 특히 (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일이다.
비치환되거나 치환된 알킬 R5에서, 분지되거나 직쇄일 수 있는 알킬은 바람직하게는 12개까지의 탄소 원자를 가지며, 더욱 바람직하게는 저급 알킬이다. 알킬 R5는 바람직하게는 저급 알킬, 특히 이소프로필이다. 하나 또는 그 이상, 특히 2개까지 존재할 수 있는 치환체는 각각 상기 정의한 바와 같은 비치환되거나 치환된 아릴 (특히 페닐 또는 하이드록시페닐), 비치환되거나 치환된 헤테로사이클릴 (특히 이미다졸릴 또는 인돌릴), 비치환되거나 치환된 사이클로알킬; 하이드록시 (바람직함), 카복시 (바람직함), 카바모일, 머캅토, 저급 알킬티오, 예를들어 메틸티오, 페닐, 하이드록시페닐, 인돌릴, 이미다졸릴, 아미노, 트리-저급 알킬아미노, 예를들어 트리메틸아미노, 저급 알카노일아미노, 예를들어 아세틸아미노, 구아니디노, N-저급 알킬구아니디노, 예를들어 N-메틸구아니디노, 또는 R5를 포함하는 아미노산을 완성하는 그밖의 다른 치환체로부터 독립적으로 선택된다. 바람직하게는 R5는 메틸, 이소프로필, 이소부틸, 2급-부틸, 머캅토메틸, 2-메틸티오에틸, 페닐메틸, 하이드록시페닐메틸, 인돌-3-일메틸, 하이드록시메틸, 1-하이드록시에틸, 2-하이드록시에틸, 카바모일메틸, 2-카바모일에틸, 4-아미노부틸, 3-구아니디노프로필, 5-이미다졸릴메틸, 카복시메틸 또는 2-카복시에틸일 수 있다.
화학식 I의 화합물의 존재하는 비대칭 탄소 원자는 (R), (S), (R,S) 배위로, 바람직하게는 (R) 또는 (S) 배위로, 가장 바람직하게는 이하의 화학식 I*에서 지정된 배위로 존재할 수 있다. 이중결합 또는 환에서의 치환은 시스- (= Z-) 또는 트랜스 (= E-) 형태로 존재할 수 있다. 따라서, 화합물은 이성체의 혼합물로서, 또는 바람직하게는 순수한 이성체로 존재할 수 있다.
화학식 I의 화합물에서 염-형성 기는 염기성 또는 산성 특성을 갖는 기 또는 라디칼이다. 적어도 하나의 염기성 기 또는 적어도 하나의 염기성 라디칼, 예를들어 아미노, 펩티드 결합을 형성하지 않는 이급 아미노기 또는 피리딜 라디칼을 갖는 화합물은 예를들어, 염산, 황산 또는 인산과 같은 무기산에 의해서, 또는 적합한 유기 카복실산 또는 설폰산, 예를들어 트리플루오로아세트산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 석신산, 말레산, 푸마르산, 하이드록시말레산, 말산, 타르타르산, 시트르산 또는 옥살산과 같은 지방족 모노- 또는 디-카복실산, 또는 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산, 벤조산, 2-페녹시-벤조산, 2-아세톡시-벤조산, 살리실산, 4-아미노살리실산과 같은 방향족 카복실산, 만델산 또는 신남산과 같은 방향족-지방족 카복실산, 니코틴산 또는 이소니코틴산과 같은 헤테로방향족 카복실산, 메탄-, 에탄- 또는 2-하이드록시에탄설폰산과 같은 지방족 설폰산, 또는 방향족 설폰산, 예를들어 벤젠-, p-톨루엔- 또는 나프탈렌-2-설폰산에 의해서 산부가염을 형성할 수 있다. 몇개의 염기성 기가 존재하는 경우에는 모노- 또는 폴리-산부가염이 형성될 수 있다.
산성 기, 예를들어 유리 보론산 기 (-B(OH)2, 즉 화학식 IA*에서 A1 및 A2가 각각 하이드록시인 경우) 또는 카복시기를 갖는 화학식 I의 화합물은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘 또는 칼슘 염, 또는 3급 모노아민, 예를들어 트리에틸아민 또는 트리-(2-하이드록시에틸)-아민, 또는 헤테로사이클릭 염기, 예를들어 N-에틸-피페리딘 또는 N,N'-디메틸피페라진과 같은 암모니아 또는 적합한 유기 아민에 의한 암모늄 염과 같은 금속 또는 암모늄 염을 형성할 수 있다. 염의 혼합물도 또한 가능하다.
산성 및 염기성 기 모두를 갖는 화학식 I의 화합물은 내부염을 형성할 수 있다.
화학식 I의 화합물의 예로는 R1이 치환된 아릴-저급 알킬카보닐 또는 비치환되거나 치환된 아릴이고, R2가 비치환된 아릴 또는 비치환되거나 치환된 헤테로사이클릴이며, R3는 저급 알킬, 비치환되거나 치환된 아릴, 또는 비치환되거나 치환된 아릴에 의해서 치환된 저급 알킬이고, R4는 A1 및 A2가 하이드록시, 저급 알킬옥시, 비치환되거나 치환된 아릴을 갖는 아릴옥시, 또는 비치환되거나 치환된 사이클로알킬을 갖는 사이클로알킬옥시이거나, A1 및 A2가 결합성 붕소 원자 또는 두개의 결합성 산소 원자와 함께, W가 공간적으로 가깝거나 인접한, 특히 인접하거나, 서로에 대해 상대적으로 "1,3"-위치에 존재하는 두개의 상이한 탄소 원자를 통해서 결합된 비치환되거나 치환된 저급 알킬렌인 상기 제시된 화학식 IA*의 환을 형성하는 상기 제시된 화학식 IA의 잔기이며, R5는 저급 알킬인 화합물, 또는 그의 염이 포함된다.
화학식 I의 화합물의 예로는 R1이 페닐옥시페닐-저급 알킬카보닐; 페닐-저급 알콕시페닐-저급 알킬카보닐; 피리딜옥시페닐-저급 알킬카보닐; 저급 알콕시, 특히 메톡시, 할로겐, 특히 플루오로 또는 클로로, 또는 할로겐-저급 알킬, 특히 트리플루오로메틸에 의해서 치환된 페닐-저급 알킬카보닐; 또는 바람직하게는 비치환되거나 치환된 페닐 또는 나프틸이며, 여기에서 두 경우에 존재하는 치환체는 저급 알킬, 하이드록시, 저급 알콕시, 저급 알카노일옥시, 카복시, 저급 알콕시카보닐, 포르밀, 저급 알카노일, 아미노, N-저급 알킬아미노, N,N-디-저급 알킬아미노, 머캅토, 설포, 저급 알킬-티오, 카바모일, N-저급 알킬-카바모일, N,N-디-저급 알킬-카바모일, 페닐 나프틸, 피리딜, 시아노 및 니트로로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상, 특히 1 내지 3개의 치환체이고, 더욱 바람직하게는 저급 알콕시 알콕시, 특히 메톡시 또는 에톡시이며; R2는 하이드록시, 저급 알콕시, 특히 메톡시, 할로겐, 특히 플루오로 또는 클로로, 및 할로겐-저급 알킬, 특히 트리플루오로메틸로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상, 특히는 1 내지 3개의 잔기에 의해서 치환된 페닐이고; R3는 저급 알킬, 특히 이소부틸, 페닐, 또는 하이드록시, 저급 알콕시, 특히 메톡시, 할로겐, 특히 플루오로 또는 클로로, 및 할로겐-저급 알킬, 특히 트리플루오로메틸로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상, 특히 3개까지의 치환체에 의해서 치환된 페닐이며; R4는 -B(OH)2 (특히 바람직함) 또는 2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일, 특히 (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일이고; R5는 저급 알킬, 특히 이소프로필인 화합물 또는 그의 염이 포함된다.
화학식 I의 화합물의 예로는 R1이 페닐옥시페닐아세틸, 벤질옥시페닐아세틸, 피리딜옥시페닐아세틸, 비페닐릴, 피리딜페닐, 저급 알킬페닐 또는 치환된 페닐프로피오닐옥시이며, 여기에서 페닐 치환체는 메톡시, 플루오로, 클로로 및 트리플루오로메틸로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된 3개까지의 치환체이고; R2는 3개까지의 메톡시 치환체에 의해서 치환된 페닐, 특히 2,3,4-트리메톡시페닐 또는 3,4,5-트리메톡시페닐이며; R3는 이소부틸, 또는 하이드록시, 플루오로 및 메톡시로부터 독립적으로 선택된 3개까지의 잔기에 의해서 치환되거나 비치환된 페닐이고; R4는 (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일이며; R5는 이소프로필인 화합물 또는 그의 염이 포함된다.
화학식 I의 화합물의 예로는 R1이 비페닐릴, 저급 알킬-페닐, 페닐-저급 알킬-카보닐, 페녹시-페닐-저급 알킬-카보닐, 페닐-저급 알콕시-페닐-저급 알킬-카보닐 또는 피리딜-페닐이고; R2는 1 내지 3개의 저급 알콕시 라디칼에 의해서 치환된 페닐, 또는 페닐-저급 알콕시-페닐이며; R3는 저급 알킬 또는 페닐-저급 알킬이고; R4는 4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일; (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일 또는 -B(OH)이며; R5는 저급 알킬인 화합물 또는 그의 염이 포함된다.
그밖의 다른 예의 화학식 I의 화합물 또는 그의 염에는 입체화학이 하기 화학식 I*에 도시된 화합물이 포함된다:
여기에서, 도시된 배위는 절대배위를 나타내며, R1, R2, R3, R4 및 R5는 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 의미, 특히 바람직한 것으로 상술한 의미를 갖는다.
그밖의 다른 예의 화학식 I의 화합물 또는 그의 염에는 입체화학이 하기 화학식 I**에 도시된 화합물이 포함된다:
여기에서, 도시된 배위는 절대배위를 나타내며, R1, R2, R3, R4 및 R5는 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 의미, 특히 바람직한 것으로 상술한 의미를 갖는다.
그밖의 또 다른 예의 화학식 I의 화합물 또는 그의 염에는 입체화학이 하기 화학식 I***에 도시된 화합물이 포함된다:
여기에서, 도시된 배위는 절대배위를 나타내며, R1, R2, R3, R4 및 R5는 화학식 I의 화합물에 대해 정의된 의미, 특히 바람직한 것으로 상술한 의미를 갖는다.
가장 특히 바람직한 것은 실시예에 기술된 화학식 I의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염이다.
화학식 I의 화합물 또는 그의 염은 공지된 방법에 따라서 제조된다. 이 방법은 바람직하게는 a) 화학식 II의 디펩티드 상동체를 화학식 III의 아미노산 또는 그의 반응성 유도체와 반응시키거나, 또는 b) R1이 아릴알킬카보닐 또는 헤테로사이클릴알킬카보닐이고 다른 잔기 R2 내지 R5가 화학식 I에 대해 제시된 의미를 갖는 화학식 I의 화합물을 제조하기 위해서는 화학식 IV의 아미노 화합물을 화학식 V의 카본산 또는 그의 반응성 유도체와 반응시키고, 필요에 따라서 방법 a) 또는 b)에 의해서 수득된 화학식 I의 화합물을 화학식 I의 또 다른 화합물로 전환시키고, 수득된 화학식 I의 유리 화합물을 염으로 전환시키고, 수득된 화학식 I의 화합물의 염을 다른 염 또는 그의 유리 형태로 전환시키고(시키거나), 화학식 I의 이성체 화합물의 혼합물을 개별 이성체로 분리시키는 것을 포함한다:
여기에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 화학식 I에 대해 제시된 의미를 가지며;
단 화학식 V에서 R1은 아릴알킬카보닐 또는 헤테로사이클릴알킬카보닐이고;
반응에 참여하는 기을 제외하고 화학식 II 및(또는) III의 화합물, 및 화학식 IV 및(또는) V의 화합물에 존재하는 관능기는 필요에 따라, 용이하게 제거가능한 보호기로 보호되고, 존재하는 보호기는 제거된다.
화학식 I의 화합물의 존재가능한 상이한 입체이성체는 적절한 배위를 갖는 유리체 (educt)를 사용하여 제조할 수 있다. 예를들어, 화학식 I* 의 화합물 또는 그의 염은 a) 화학식 II*의 디펩티드 상동체를 화학식 III*의 아미노산 또는 그의 반응성 유도체와 반응시키거나, 또는 b) R1이 아릴알킬카보닐 또는 헤테로사이클릴알킬카보닐이고 다른 잔기 R2 내지 R5가 화학식 I에 대해 제시된 의미를 갖는 화학식 I*의 화합물을 제조하기 위해서는 화학식 IV*의 아미노 화합물을 화학식 V의 카본산 또는 그의 반응성 유도체와 반응시키고, 필요에 따라서 방법 a) 또는 b)에 의해서 수득된 화학식 I*의 화합물을 화학식 I*의 또 다른 화합물로 전환시키고, 수득된 화학식 I*의 유리 화합물을 염으로 전환시키거나, 수득된 화학식 I*의 화합물의 염을 다른 염 또는 그의 유리 형태로 전환시키는 것을 포함한다:
[화학식 V]
여기에서,
R1, R2, R3, R4 및 R5는 화학식 I에 대해 제시된 의미를 가지며;
단 화학식 V에서 R1은 아릴알킬카보닐 또는 헤테로사이클릴알킬카보닐이고;
반응에 참여하는 기를 제외하고 화학식 II 및(또는) III의 화합물, 및 화학식 IV 및(또는) V의 화합물에 존재하는 관능기는 필요에 따라, 용이하게 제거가능한 보호기로 보호되고, 존재하는 보호기는 제거된다.
화학식 I의 최종생성물은, 예를들어 R4가 -B(OH)2가 아닌 경우에 화학식 I의 또 다른 최종생성물의 제조를 위한 출발물질에서 보호기로 사용될 수도 있는 치환체를 함유할 수도 있다. 따라서, 문맥이 다른 식으로 지적하지 않는 한, 이와 관련한 범위 내에는 화학식 I의 특정한 목적하는 최종생성물의 구성성분이 아닌 용이하게 제거가능한 기 만이 "보호기"로 지정된다.
이러한 보호기에 의한 관능기의 보호, 보호기 그 자체, 및 그들의 분해반응은 예를들어, 표준문헌 (예를들어, J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973, in T.W. Greene and P.G. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Third edition, Wiley, New York 1999, in "The Peptides"; Volume 3 (editors: E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981, in "Methoden der organischen Chemie" (Methods of Organic Chemistry), Houben Weyl, 4th edition, Volume 15/I, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, in H.-D. Jakubke and H. Jescheit, "Aminosauren, Peptide, Proteine" (Amino acids, Peptides, Proteins), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982, and in Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate; Monosaccharide und Derivate" (Chemistry of Carbohydrates: MOnosaccharides and Derivatives), Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974)에 기술되어 있다.
보호기의 특징은 이들이 예를들어, 가용매분해, 환원, 광분해에 의해서, 또는 대용으로 생리적 조건 하에서 (예를들어, 효소적 분해에 의해서) 용이하게 (즉, 원치 않는 이차반응이 발생되지 않으면서) 제거될 수 있다는 점이다.
-B(OH)2-기에 대한 보호기의 제거 (R4가 -B(OH)2인 화학식 I의 화합물을 수득하기 위함)는 바람직하게는 0 내지 50℃의 온도에서, 예를들어 실온에서, 적절한 용매, 예를들어 메탄올과 같은 저급 알칸올 또는 헥산과 같은 저급 알칸, 또는 이들의 혼합물 중에서 산, 예를들어 염산을 사용하여 수행된다.
화학식 I의 프로테아좀 억제제를 합성하기 위해서는 적어도 두가지 방법이 사용될 수 있다. 방법 "a"에서 반응은 화학식 II 및 III의 화합물을 적합한 용매, 예를들어 N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸-2-피롤리돈, 메틸렌 클로라이드, 또는 두가지 또는 그 이상의 이러한 용매의 혼합물에 용해시키고, 적합한 염기, 예를들어 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민 (DIEA) 또는 N-메틸모르폴린, 및 반응계 내에서 화학식 III의 카본산의 바람직한 반응성 유도체를 형성시키는 적합한 커플링제, 예를들어 디사이클로헥실카보디이미드/1-하이드록시벤조트리아졸 (DCC/HOBT); O-(1,2-디하이드로-2-옥소-1-피리딜)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 테트라플루오로보레이트 (TPTU); O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU); 또는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC)를 첨가함으로써 수행된다. 그밖의 다른 이용가능한 커플링제에 대한 검토는 문헌 (참조예: Klauser, Bodansky, Synthesis 1972, 453-463)에서 볼 수 있다. 반응혼합물은 바람직하게는 약 -20 내지 50℃ 사이의 온도, 특히 0℃ 내지 실온 사이의 온도에서 교반하여 화학식 I의 화합물을 수득한다. 이 반응은 바람직하게는 불활성 가스, 예를들어 질소 또는 아르곤 하에서 수행된다.
방법 "b"에서 반응은 바람직하게는 방법 a)에 대해 기술된 것과 유사한 조건 하에서 수행된다.
염-형성 기를 갖는 화학식 I의 화합물의 염은 그 자체가 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 따라서, 화학식 I의 화합물의 산부가염은 산으로, 또는 적합한 음이온교환제로 처리함으로써 수득될 수 있다.
염은 통상적으로, 예를들어 적합한 염기성제, 예를들어 알칼리 금속 카보네이트, 하이드로겐카보네이트, 또는 하이드록사이드, 대표적으로는 탄산칼륨 또는 수산화나트륨으로 처리함으로써 유리화합물로 전환될 수 있다.
입체이성체 혼합물, 예를들어 부분입체이성체의 혼합물은 적합한 분리방법을 이용함으로써 그 자체가 공지된 방식으로 그들의 상응하는 이성체로 분리될 수 있다. 부분입체이성체 혼합물은 예를들어, 분별결정, 크로마토그래피, 용매 분배, 및 유사한 절차를 이용함으로써 그들의 개개 부분입체이성체로 분리될 수 있다. 이러한 분리는 출발화합물 중의 하나의 수준에서, 또는 화학식 I의 화합물 그 자체 내에서 일어날 수 있다. 에난티오머는 예를들어, 에난티오머-순수 키랄 산에 의한 염 형성에 의해서, 또는 크로마토그래피를 이용함으로써, 예를들어 키랄 리간드를 갖는 크로마토그래피 기질을 사용한 HPLC에 의해서 부분입체이성체 염을 형성시킴으로써 분리될 수 있다.
R4거 -B(OH)2가 아닌 화학식 I의 화합물은 표준방법에 따라서, 예를들어, 바람직하게는 0 내지 50℃ 범위의 온도, 예를들어 실온에서 물/메탄올/헥산 혼합물 중의 산, 특히 하이드로할산의 존재 하에 이소부틸-보론산 (i-BuB(OH)2)을 사용하여 R4가 -B(OH)2인 화학식 I의 화합물로 전환될 수 있다.
방법 a) 및 b) 둘다에서 중간체 또는 출발물질의 전환 또는 합성을 위해서는 해당 반응에 적합하게 선택될 수 있는 용매에는 공정의 설명에서 달리 언급되지 않는 한, 예를들어 물, 에스테르, 일반적으로 저급 알킬-저급 알카노에이트, 예를들어 디에틸 아세테이트, 에테르, 일반적으로 지방족 에테르, 예를들어 디에틸에테르, 또는 사이클릭 에테르, 예를들어 테트라하이드로푸란, 액체 방향족 하이드로카본, 일반적으로 벤젠 또는 톨루엔, 알콜, 일반적으로 메탄올, 에탄올 또는 1- 또는 2-프로판올, 니트릴, 일반적으로 아세토니트릴, 할로겐화 하이드로카본, 일반적으로 디클로로메탄, 산 아미드, 일반적으로 디메틸포름아미드, 염기, 일반적으로 헤테로사이클릭 질소 염기, 예를들어 피리딘, 카복실산, 일반적으로 저급 알칸카복실산, 예를들어 아세트산, 카복실산 무수물, 일반적으로 저급 알칸 산 무수물, 예를들어 아세트산 무수물, 사이클릭, 선형 또는 분지된 하이드로카본, 일반적으로 사이클로헥산, 헥산 또는 이소펜탄, 또는 이들 용매의 혼합물, 예를들어 수용액이 포함된다. 이러한 용매 혼합물은 또한, 예를들어 크로마토그래피 또는 분배를 통한 처리 시에도 사용될 수 있다.
신규의 출발물질 및(또는) 중간체, 및 그들의 제조방법도 마찬가지로 본 발명의 대상이다. 바람직한 구체예에서는, 바람직한 화합물의 제조가 가능하도록 하는 것과 같은 목적으로 반응조건을 선택하고 이러한 출발물질을 사용한다.
화학식 II 내지 V의 출발물질 또는 그들의 전구체는 공지되어 있거나, 공지된 방법에 따라 제조될 수 있거나, 또는 시판품으로 이용할 수 있으며; 특히 이들은 실시예에 기술된 것과 동일하거나 유사한 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
치환체가 화학식 I에 대하여 상기에서 정의한 바와 같은 화학식 II의 화합물은 예를들어, 다음의 반응에 의해서 수득할 수 있다:
우선, 예를들어 이하의 화학식 VI*에 지시된 바와 같은 배위를 포함하는 이하의 화학식 VI의 아미노산의 보론산 상동체, 또는 그의 산부가염, 특히 그의 트리플루오로아세트산과의 염을 상기의 반응 a) (또한, 바람직하게는 활성 카본산 유도체의 동일 반응계 형성에 의한 축합반응)에 기술된 것과 유사한 반응조건 하에서 이하의 화학식 VII*에 지시된 바와 같은 배위를 포함하는 이하의 화학식 VII의 아미노산, 또는 그의 반응성 유도체와 축합시킴으로써 N-보호된 형태의 화학식 II의 화합물을 수득한 다음에, 예를들어 상기 언급된 표준 교과서에 기술된 조건을 사용하여, 3급-부톡시카보닐아미노의 경우에는 예를들어 적절한 용매, 예를들어 디옥산 및(또는) 메틸렌 클로라이드 중에서 염산으로 N-탈보호시켜 방법 a)에서 직접적으로 사용될 수 있는 화학식 II의 화합물을 제공한다:
상기 식에서, R3는 화학식 I의 화합물에 대해 상기에서 제시된 의미를 가지며, R4는 화학식 I의 화합물에 대해 상기에서 언급된 -B(OH)2 이외의 의미를 가지고, 특히 (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일이며, R5는 화학식 I의 화합물에 대하여 상기에서 제시된 의미를 가지고, Pr1은 보호된 아미노기, 바람직하게는 3급-부톡시카보닐아미노이다.
화학식 VI의 보론산은 공지되어 있으며, 시판품을 이용할 수 있고(있거나) 공지된 방법에 따라서 합성될 수 있다. 예를들어, R3가 저급 알킬, 특히 이소부틸이고, R4가 화학식 VI의 화합물에 대해 기술된 바와 같은, 바람직하게는 (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일인 화학식 VI의 화합물은 화학식 VIII의 화합물을 적절한 용매, 예를들어 메틸렌 클로라이드 중에서 n-저급 알킬 리튬, 특히 n-부틸리튬과 반응시키고, 이어서 염화아연과 반응시켜 화학식 IX의 화합물을 수득함으로써 제조할 수 있다:
상기 식에서, R4는 화학식 VIII에서는 상기에서 바로 기술된 바와 같은 의미를 가지며, 화학식 IX에서는 상기의 화학식 VI에서 제시된 의미를 갖는다. 생성된 화합물은 그후에 LiN(SiCH3)2로 처리하고, 이어서 생성된 화학식의 화합물을 트리플루오로아세트산의 존재 하에서 반응시켜 화학식 X의 염을 수득하는데, 이 화합물은 화학식 VI의 화합물이며, 상기 제시된 바와 같은 화학식 VII의 화합물과의 반응에 직접적으로 사용될 수 있다:
상기 식에서, R4는 화학식 VI에서 제시된 의미를 갖는다.
화학식 III의 화합물은 공지되어 있으며, 시판품을 이용할 수 있고(있거나) 표준방법에 따라서 수득될 수 있다.
예를들어, R1이 아릴, 특히 비페닐릴인 화학식 III의 화합물은 공지되어 있으며 시판품을 이용할 수 있거나 표준방법에 따라서 수득할 수 있는, 예를들어 화학식 XI*에 지시된 것과 같은 배위를 포함하는 화학식 XI의 화합물을 불활성 가스, 예를들어 질소 또는 아르곤 하에 50 내지 100℃ 사이의 온도, 예를들어 90℃에서 염기, 특히 알칼리 금속 카보네이트, 예를들어 탄산칼륨의 존재 하에 적절한 용매, 예를들어 디메틸포름아미드 중에서 화학식 XII의 화합물과 반응시킴으로써 제조될 수 있다:
상기 식에서, R2는 화학식 I의 화합물에 대해 제시된 의미를 가지며, R1은 아릴이고, X는 할로겐, 특히 브로모이다. 이것은 직접적으로 화학식 III의 상응하는 화합물을 수득한다.
화학식 VII의 아미노산 유도체는 공지되어 있으며, 시판품을 이용할 수 있거나 표준방법에 따라 수득할 수 있다. 이들은 바람직하게는, 유리 아미노기 대신에, 예를들어 3급-부톡시카보닐아미노에 의해서 아미노 보호된 형태로 사용된다.
화학식 IV의 화합물은 예를들어, 방법 a)에서 정의한 바와 같이, 예를들어 화학식 II*에 지시된 바와 같은 배위를 포함하는 화학식 II의 화합물을 상기의 방법 a)에 기술된 바와 같은 바람직한 축합반응 조건 하에서, 예를들어 화학식 XIII*에 제시된 바와 같은 배위를 포함하는 화학식 XIII의 N-보호된 아미노산 또는 그의 반응성 유도체과 반응시킴으로써 수득될 수 있다:
상기 식에서, R2는 화학식 I에 대해 정의한 바와 같으며, Pr2는 보호된 아미노, 특히 3급-부톡시카보닐아미노이다. 생성된 화합물인 N-말단 아미노기가 보호된 형태로 존재하는 화학식 IV의 화합물로부터 이어서 N-말단 보호기를 제거하는데, 예를들어 3급-부톡시카보닐아미노는 디옥산 중에서 염화수소를 사용하여 제거한다.
또 다른 구체예에서, 아팝토시스-유도제는 화합물의 2,4-디아미노-3-하이드록시카복실산 족으로부터 유래하는 프로테아좀 억제제이다 (참조예: PCT WO 00/64863). 예를들어, 몇가지 구체예에서 프로테아좀 억제제는 화학식 XIV의 2,4-디아미노-3-하이드록시카복실산이다:
상기 식에서,
A 및 B는 독립적으로 결합 또는 비치환되거나 치환된 아미노아실 잔기를 나타내며;
R1은 수소; 아미노 보호기; 또는 화학식 R5Y-의 기를 나타내고, 여기에서
R5는 수소 또는 비치환되거나 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 헤테로사이클릴 또는 헤테로사이클릴알킬기를 나타내며;
Y는 -CO-, -NH-CO-, -NH-CS-, -SO2-, -O-CO- 또는 -O-CS-를 나타내고;
R2는 천연 아미노산의 측쇄; 알킬, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬 또는 사이클로알킬알킬기; 또는 트리메틸실릴메틸, 2-티에닐메틸 또는 스틸리메틸을 나타내며;
R3은 할로겐, 알킬, 알콕시 또는 하이드록시알콕시를 나타내고;
R4는 2(R)-하이드록시인단-1(S)-일; (S)-2-하이드록시-1-페닐에틸; 또는 메톡시에 의해서 4 위치에서 치환되거나 비치환된 2-하이드록시-벤질을 나타내며;
여기에서 2,4-디아미노-3-하이드록시카복실산은 유리 형태이거나, 그의 약제학적으로 허용되는 염이거나, 또는 약제학적 조성물 형태이다.
비치환되거나 치환된 알킬은 바람직하게는 1 내지 5개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 예를들어 메틸, 에틸, 이소프로필 또는 3급-부틸이며, 이것은 특히 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다. 치환체는 예를들어, 페녹시, 하이드록시 또는 보호되거나 비보호된 아미노이다.
비치환되거나 치환된 아릴알킬은 예를들어, 벤질 또는 2-페닐에틸과 같이 모두 함께 7 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 페닐알킬이다. 이것은 아릴 또는 알킬 잔기에서 예를들어, 벤질-CH(OH)- 또는 페닐-CH(CH2OH)-와 같이 하이드록시에 의해서, 알킬, 아미노 또는 알킬아미노에 의해 치환 또는 비치환되거나, 또는 이것은 예를들어 알킬렌 부분에 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 나프틸알킬, 특히 나프틸메틸이다.
아미노 보호기는 바람직하게는 벤질옥시카보닐, 사이클로알킬알콕시카보닐, 특히 사이클로헥실메톡시카보닐, 또는 3급-부톡시카보닐이다. 비치환되거나 치환된 헤테로아릴알킬은 바람직하게는 피리딜알킬, 특히 2-피리딜메틸 및 4-피리딜메틸이다.
아릴, 헤테로아릴, 및 아릴알킬 및 헤테로아릴알킬의 아릴 부분은 예를들어 피리딜, 나프틸, 9-플루오레닐메톡시카보닐 (FMOC) 또는 벤즈-이미다졸릴과 같은 모노- 또는 폴리사이클릭일 수 있다. 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬의 알킬렌 부분은 예를들어, 하이드록시에 의해서 치환될 수도 있다.
헤테로사이클릴기, 및 헤테로사이클릴알킬기의 헤테로사이클릴 부분은 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 갖는 포화된 헤테로사이클릭기이다. 이것은 바람직하게는 5 또는 6개의 환 구성원자, 및 바람직하게는 3개까지의 헤테로원자를 갖는다.
사이클로알킬알킬은 바람직하게는 사이클로헥실알킬이며; 이것은 바람직하게는 알킬렌 부분에 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다.
할로겐은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드, 바람직하게는 염소 또는 브롬이다.
알킬 및 알콕시는 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자, 특히 1 또는 2개의 탄소 원자를 가지며, 더욱 특히는 메틸 또는 메톡시이다.
하이드록시알콕시는 바람직하게는 탄소 원자수 2 내지 4의 ω-하이드록시알콕시, 특히 2-하이드록시에톡시이다.
염은 예를들어, 하이드로클로라이드와 같은 산부가염이다.
화학식 I의 화합물은 몇개의 키랄 중심을 가지며, 따라서 다양한 입체이성체로 존재할 수 있다. 본 발명은 다른 식으로 명시되지 않은 한은 모든 입체이성체 및 라세미성 혼합물을 제공한다. 이성체는 통상적인 기술, 예를들어 크로마토그래피에 의해서 분할 또는 분리될 수 있다. 화학식 I로부터 나타나는 바와 같이, 2 위치의 탄소 원자에서의 배위는 R이며, 3 및 4 위치에서는 S이다.
R1은 바람직하게는 수소, 피리딜알콕시카보닐, 나프틸알콕시카보닐, 나프틸알킬카보닐, 벤질-CH(OH)-카보닐, 페녹시메틸카보닐, 페닐알킬카보닐, 또는 아미노 보호기, 예를들어 3급-부톡시카보닐, 사이클로알킬알콕시카보닐, 특히 사이클로헥실메톡시카보닐, 또는 알킬 또는 아미노에 의해서 치환되거나 비치환된 벤질옥시카보닐이며; 이것은 특히 나프틸메톡시카보닐, 나프틸메틸카보닐, 피리딜메톡시카보닐, 페닐프로피오닐, 아미노페닐프로피오닐, 3급-부톡시카보닐, 아미노벤질옥시카보닐, 알킬벤질옥시카보닐, 디알킬벤질옥시카보닐 또는 벤질옥시카보닐이며, 더 더욱 바람직하게는 벤질옥시카보닐이다.
A가 비치환되거나 치환된 아미노아실 잔기인 경우에, 이것은 바람직하게는 알라닌, 루이신, 이소루이신, 아스파라긴, 발린, 3급-부틸글리신, 3급-루이신 또는 히스티딘과 같은 비치환되거나 치환된 α-아미노아실 잔기이다. 이것은 바람직하게는 천연 α-아미노산의, 바람직하게는 단백질의 정상 구성부분인 아미노산 또는 텐트 (tent) 루이신의 보호되거나 비보호된 잔기이다. 이것은 바람직하게는 L 배위를 갖는다. A는 특히 글리신, L-발린, L-3급-루이신 또는 결합, 더 더욱 바람직하게는 L-3급-루이신이다.
R2는 바람직하게는 천연 아미노산의, 바람직하게는 α-아미노산의, 바람직하게는 단백질의 정상 구성부분인 아미노산의 측쇄이다. 이것은 예를들어 이소프로필, 아미노카보닐메틸, 메틸, 1-메틸프로필, 벤질, 4-하이드록시벤질 또는 이소부틸, 바람직하게는 벤질이다.
B가 비치환되거나 치환된 아미노아실 잔기인 경우에, 이것은 바람직하게는 페닐알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 알라닌 또는 아스파라긴과 같은 비치환되거나 치환된 α-아미노아실 잔기이다. 이것은 바람직하게는 천연 α-아미노산의, 바람직하게는 단백질의 정상 구성부분인 아미노산의 비치환되거나 치환된 잔기이다. 이차 카복실기를 갖는 α-아미노산, 예를들어 글루타민산은 바람직하게는 C1-C3 알콜, 특히 메탄올로 에스테르화된다. 이것은 바람직하게는 L-배위를 갖는다. B는 특히 L-발린, L-글루타민산 메틸 에스테르 또는 결합, 더 더욱 바람직하게는 L-발린이다.
R3는 바람직하게는 할로겐, 메틸 또는 메톡시, 특히 메톡시이다.
R4는 바람직하게는 2(R)-하이드록시인단-1(S)-일 또는 상기에서 정의한 바와 같이 치환되거나 비치환된 2-하이드록시벤질, 특히 2-하이드록시-4-메톡시-벤질이다.
Y는 바람직하게는 -CO- 또는 -O-CO-, 특히 -O-CO-이다.
R5는 바람직하게는 비치환되거나 치환된 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬기, 특히 알킬이며; 이것이 비치환되거나 치환된 헤테로아릴알킬인 경우에 이것은 바람직하게는 피리딜알킬, 특히 2-피리딜메틸이고; 이것이 비치환되거나 치환된 아릴알킬인 경우에 이것은 바람직하게는 벤질-CH(OH)-이며; 이것이 치환된 알킬인 경우에 이것은 바람직하게는 페녹시메틸이다.
몇가지 구체예에서, 프로테아좀 억제제는 2-아미노-3-하이드록시-4-3급-로이실-아미노-5-페닐-펜타노산 아미드 유도체이다 (참조예: PCT 01/89282).
예를들어, 몇가지 구체예에서 본 발명의 프로테아좀 억제제는 화학식 XV의 화합물 또는 그의 염에 관한 것이다:
상기 식에서,
n은 0 또는 1이며;
R1 및 R2는 서로 독립적으로, 각각의 라디칼이 20개 이하의 탄소 원자를 갖는 지방족 라디칼, 방향족, 방향족-지방족, 사이클로지방족, 사이클로지방족-지방족, 헤테로사이클릭 또는 헤테로사이클릭-지방족 라디칼이고;
R3은 수소, 옥사-알킬, 지방족 라디칼 또는 20개까지의 탄소 원자를 갖는 화학식 -(Y)m-R6의 라디칼이며, 여기에서 Y는 알킬이고, m은 0 또는 1이며, R6는 질소, 산소 및 황으로 구성된 그룹으로부터 선택된 3개까지의 헤테로 원자를 함유하는 5 또는 6개의 환 구성원을 갖는 비치환되거나 치환된 모노사이클릭 라디칼이고, 여기에서 상기의 모노사이클릭 라디칼은 또한 벤조 환에 융합될 수도 있으며;
R4 및 R5는 수소; 지방족 라디칼; 유리, 에테르화 또는 에스테르화 하이드록시; 유리 또는 에스테르화 카복시; 포르밀; 알칸올; 비치환되거나 일치환 또는 이치환된 아미노; 머캅토; 설포; 알킬-티오; 카바모일; N-알킬-카바모일; N,N-디알킬-카바모일; 시아노 및 니트로로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되고, 여기에서 탄소 함유 라디칼 R4 및 R5는 12개까지의 탄소 원자를 가지며, 단 n이 1이고, R1이 벤질 또는 3급-부틸이며, R2가 벤질 또는 4-메톡시-벤질이고, R3가 이소프로필이며, X가 산소인 경우에 R4 및 R5는 둘다 수소가 아니고, n이 0이며, R2가 4-메톡시-벤질이고, R3가 수소이며, X가 산소인 경우에 R4는 메톡시가 아니고;
X는 질소, 산소 또는 황이다.
2-아미노-3-하이드록시-4-3급-로이실-아미노-5-페닐-펜타노산 아미드 유도체와 관련하여 이전 및 이후에 사용된 일반적 용어는 바람직하게는 다음의 의미를 갖는다: n은 0 또는 1, 바람직하게는 0이다.
지방족 라디칼은 12개까지의 탄소 원자, 바람직하게는 7개까지의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 4개까지의 탄소 원자를 가지며, 그러한 비치환되거나 치환된 지방족 하이드로카본 라디칼, 즉 그러한 비치환되거나 치환된 알키닐, 알케닐 또는 바람직하게는 알킬 라디칼이고, 하나 또는 그 이상의 치환체는 바람직하게는 유리, 에테르화 또는 에스테르화 하이드록시; 유리 또는 에스테르화 카복시; 포르밀; 알칸올; 비치환되거나 일치환 또는 이치환된 아미노; 구아니디노; 머캅토; 설포; 알킬-티오; 카바모일; N-알킬-카바모일; N,N-디알킬-카바모일; 시아노 및 니트로로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
지방족 라디칼 R1은 바람직하게는 특히 3급-부틸과 같은 저급 알킬이다.
지방족 라디칼 R3는 바람직하게는 비치환된 저급 알킬, 또는 하이드록시, 카복시, 아미노, 카바모일, 구아니디노, 머캅토 또는 알킬-티오에 의해서 치환된 저급 알킬이며, 가장 바람직하게는 아미노산 알라닌, 루이신, 이소루이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르테이트, 글루타메이트, 리신 또는 아르기닌, 특히 발린의 측쇄이다.
지방족 라디칼 R4는 바람직하게는 메톡시이다.
방향족 라디칼 R1 또는 R2는 20개 이하의 탄소 원자, 특히 12개 이하의 탄소 원자를 가지며, 비치환되거나 치환되고, 바람직하게는 비치환되거나 치환된 페닐 또는 나프틸, 특히 1-나프틸인 각각의 경우에 하나 또는 그 이상의 치환체는 바람직하게는 지방족 라디칼; 유리, 에테르화 또는 에스테르화 하이드록시; 유리 또는 에스테르화 카복시; 포르밀; 알칸올; 비치환되거나, 일치환 또는 이치환된 아미노; 머캅토; 설포; 알킬-티오; 카바모일; N-알킬-카바모일; N,N-디알킬-카바모일; 시아노 및 니트로로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되며, 더욱 바람직하게는 알킬, 예를들어 메틸, 에틸 또는 프로필; 알콕시, 예를들어 메톡시 또는 에톡시; 이치환된 아미노, 예를들어 디메틸아미노; 할로겐, 예를들어 클로로 또는 브로모; 및 할로겐-알킬, 예를들어 트리플루오로메틸로부터 선택된다.
20개 이하의 탄소 원자를 갖는 방향족-지방족 라디칼 R1 또는 R2에서 방향족 잔기는 상기 정의한 바와 같으며, 지방족 잔기는 바람직하게는, 특히 바람직하게는 방향족 라디칼에 대해 정의한 바와 같이 치환되거나, 바람직하게는 비치환된 C1-C2 알킬과 같은 저급 알킬이다. 방향족-지방족 라디칼 R1은 바람직하게는 벤질 또는 나프탈렌-1-일메틸이다. 방향족-지방족 라디칼 R2는 바람직하게는 벤젠 잔기에서 1-5개, 바람직하게는 1-3개의 메톡시기에 의해서 치환된 벤질; 벤젠 잔기에서, 바람직하게는 4 위치에서 디메틸-아미노기에 의해서 치환된 벤질; 또는 나프탈렌-1-일메틸이다. 가장 바람직하게는, 방향족-지방족 라디칼 R2는 2,3,4- 또는 3,4,5-트리메톡시-벤질이다.
사이클로지방족 라디칼 R1 또는 R2는 20개까지, 특히 10개까지의 탄소 원자를 가지며, 모노- 또는 폴리-사이클릭이고, 바람직하게는 방향족 라디칼에 대해 정의한 바와 같이 치환되거나, 바람직하게는 비치환되며, 예를들어 사이클로알킬 라디칼, 특히 바람직하게는 사이클로헥실과 같은 그러한 5- 또는 6-원 사이클로알킬 라디칼이다.
20개 이하의 탄소 원자를 갖는 사이클로지방족-지방족 라디칼 R1 또는 R2에서 사이클로지방족 잔기는 상기에서 정의한 바와 같으며, 지방족 잔기는 바람직하게는 특히, 바람직하게는 방향족 라디칼에 대해 정의한 바와 같이 치환되거나, 바람직하게는 비치환된 C1-C2 알킬과 같은 저급 알킬이고, 예를들어 사이클로헥실-메틸이다.
헤테로사이클릭 라디칼 R1 또는 R2는 20개까지의 탄소 원자, 일반적으로는 12개까지의 탄소 원자를 함유하며, 바람직하게는 방향족 라디칼에 대해 정의한 바와 같이 치환되거나, 비치환되고, 바람직하게는 질소, 산소 및 황으로 구성된 그룹으로부터 바람직하게 선택된 1 내지 3개의 헤테로 원자 및 5 또는 6개의 환 구성원를 갖는 포화 또는 불포화된 모노사이클릭 라디칼, 예를들어 티에닐 또는 피리딜, 또는 비- 또는 트리-사이클릭 라디칼이며, 여기에서 예를들어 벤젠 라디칼은 언급된 모노사이클릭 라디칼에 융합되고, 특히 예를들어 5-인돌릴과 같은 인돌릴, 또는 8-키놀릴과 같은 키놀릴이다.
20개 이하의 탄소 원자를 갖는 헤테로사이클릭-지방족 라디칼 R1 또는 R2에서, 헤테로사이클릭 잔기는 상기 정의한 바와 같으며, 지방족 잔기는 바람직하게는 특히, 바람직하게는 방향족 라디칼에 대해 정의한 바와 같이 치환되거나, 바람직하게는 비치환된 C1-C2 알킬과 같은 저급 알킬이다. 헤테로사이클릭-지방족 라디칼 R1 또는 R2는 예를들어 인돌릴-메틸, 특히 5-인돌릴-메틸, 또는 키놀릴-메틸, 특히 8-키놀릴-메틸이다.
옥사-알킬 R3는 화학식 -G(O-CH2-CH2)t-R7의 라디칼이며, 여기에서 G 및 R7은 알킬, 바람직하게는 저급 알킬이고, t는 1 내지 3, 바람직하게는 2이며, 특히 2-(1,4-디옥사-헥실)-에틸이다.
20개까지의 탄소 원자를 갖는 화학식 -(Y)m-R6의 라디칼에서, Y는 알킬, 바람직하게는 저급 알킬이고, m은 0 또는 1이며, 라디칼 R6는 5 또는 6개의 환 구성원 및 질소, 산소 및 황으로 구성된 그룹으로부터 선택된 3개까지의 헤테로 원자를 가지며, 대용으로 융합된 벤조 환을 함유하는 포화 또는 불포화된 모노사이클릭 라디칼이고, 이러한 라디칼은 바람직하게는 방향족 라디칼에 대해 정의된 바와 같이 치환되거나, 바람직하게는 비치환된다.
라디칼 R6는 바람직하게는 환 탄소 원자를 경유하여 Y에 결합되며, 예를들어 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로펜타디에닐, 페닐, 피롤리딜, 피라졸리딜, 이미다졸리딜, 테트라하이드로푸릴, 피페리딜, 피페라지닐, 모르폴리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 푸릴, 티에닐, 피리딜, 피라지닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 인데닐, 나프틸, 인돌릴 및 키놀릴로 구성된 그룹으로부터 선택된 비치환되거나 치환된 구성원이다.
가장 바람직하게는 화학식 -(Y)m-R6의 라디칼은 피페리딜, 특히 4-피페리딜, 피페라진-에틸, 특히 피페라진-1-일에틸, 모르폴리닐-에틸, 특히 모르폴린-4-일에틸, 2-, 3- 또는 4-피리딜-메틸과 같은 피리딜-메틸, 또는 아미노산 페닐알라닌, 티로신, 트리프토판 또는 히스티딘의 측쇄이다.
X는 바람직하게는 산소 (-O-)이다.
알킬은 바람직하게는 저급 알킬이다.
접두어 "저급"은 7개 이하, 바람직하게는 4개 이하의 탄소 원자를 갖는 라디칼을 나타낸다.
저급 알킬은 예를들어 n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2급-부틸 3급-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실 또는 n-헵틸, 바람직하게는 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 이소프로필, 에틸 또는 메틸, 가장 바람직하게는 이소부틸, 에틸 또는 메틸이다.
에테르화 하이드록시는 예를들어 알콕시, 특히 에톡시 또는 메톡시와 같은 저급 알콕시이다. 에스테르화 하이드록시는 바람직하게는 알카노산과 같은 유기 카복실산, 또는 하이드로할산과 같은 무기산, 예를들어 저급 알카노일옥시 또는 특히 요오드 또는 특히 불소, 염소 또는 브롬과 같은 할로겐에 의해서 에스테르화된 하이드록시이다.
에스테르화 카복시는 예를들어, 알콕시카보닐, 특히 예를들어, 메톡시카보닐과 같은 저급 알콕시카보닐이다.
알칸올은 예를들어 알킬카보닐, 특히 예를들어, 아세틸과 같은 저급 알킬카보닐이다.
일치환 또는 이치환된 아미노는 예를들어, N-알킬아미노 또는 N,N-디알킬아미노, 특히 예를들어, N-메틸아미노 또는 N,N-디메틸아미노와 같은 N-저급 알킬아미노 또는 저급 N,N-디저급 알킬아미노이다.
할로겐은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드, 바람직하게는 불소, 염소 또는 브롬이다.
상기에 나타낸 바와 같은 화학식 XV의 구조는 절대 배위를 나타낸다.
화학식 XV의 화합물에서 염-형성 기는 염기성 또는 산성 특성을 갖는 기 또는 라디칼이다. 적어도 하나의 염기성 기 또는 적어도 하나의 염기성 라디칼, 예를들어 유리 아미노기, 피라지닐 라디칼 또는 피리딜 라디칼을 갖는 화합물은 예를들어, 염산, 황산 또는 인산과 같은 무기산에 의해서, 또는 적합한 유기 카복실산 또는 설폰산, 예를들어 트리플루오로아세트산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 석신산, 말레산, 푸마르산, 하이드록시말레산, 말산, 타르타르산, 시트르산 또는 옥살산과 같은 지방족 모노- 또는 디-카복실산, 또는 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산, 벤조산, 2-페녹시-벤조산, 2-아세톡시-벤조산, 살리실산, 4-아미노살리실산과 같은 방향족 카복실산, 만델산 또는 신남산과 같은 방향족-지방족 카복실산, 니코틴산 또는 이소니코틴산과 같은 헤테로방향족 카복실산, 메탄-, 에탄- 또는 2-하이드록시에탄설폰산과 같은 지방족 설폰산, 또는 방향족 설폰산, 예를들어 벤젠-, p-톨루엔- 또는 나프탈렌-2-설폰산에 의해서 산부가염을 형성할 수 있다. 몇개의 염기성 기가 존재하는 경우에는 모노- 또는 폴리-산부가염이 형성될 수도 있다.
산성 기, 예를들어 라디칼 Rio 내의 유리 카복실기를 갖는 화학식 XV의 화합물은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘 또는 칼슘 염, 또는 암모니아 또는 3급 모노아민과 같은 적합한 유기 아민, 예를들어 트리에틸-아민 또는 트리-(2-하이드록시에틸)-아민, 또는 헤테로사이클릭 염기, 예를들어 N-에틸-피페리딘 또는 N,N'-디메틸-피페라진과의 암모늄염과 같은 금속 또는 암모늄 염을 형성할 수 있다.
산성 및 염기성 기 둘다를 갖는 화학식 XV의 화합물은 내부염을 형성할 수 있다.
중간체로서 더 사용되는 화합물의 경우에서뿐 아니라 분리 또는 정제를 목적으로 하는 경우에는 약제학적으로 허용되지 않는 염을 사용하는 것도 또한 가능하다.
그러나, 약제학적으로 허용되는 무독성 염 만이 치료 목적으로 사용되며, 따라서 이들 염이 바람직하다.
예를들어, 신규 화합물의 정제 시에 또는 그의 동정을 위해서 중간체로 사용될 수 있는 염을 포함한 염 형태의 신규 화합물과 유리 형태의 신규 화합물 사이의 밀접한 관계로 인하여, 이전 및 이하에서 유리 화합물에 대해 언급하는 것은 어떤 것이라도 적절하고 유리한 경우에 상응하는 염을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
VII. 투여 및 약제학적 조성물
본 발명의 항체 및 항원은 치료를 위해서, 예를들어 다음과 같은 암을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 고증식성 질환의 치료를 위해서 포유동물 피검자에게 직접 투여될 수 있다: 암종, 신경교종, 중피종, 흑색종, 림프종, 백혈병, 선암, 유방암, 난소암, 경부암, 신경교아세포종, 백혈병, 림프종, 전립선암, 및 버킷 림프종 (Burkitt's lymphoma), 두경부암, 결장암, 결장직장암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 식도암, 위암, 췌장암, 간담낭암, 담낭암, 소장암, 직장암, 신장암, 방광암, 전립선암, 음경암, 요도암, 고환암, 경부암, 질암, 자궁암, 난소암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 췌장내분비암, 카시노이드암 (carcinoid cancer), 골암, 피부암, 망막아세포종, 다발성 골수종, 호지킨 (Hodgkin) 림프종, 및 비-호지킨 림프종 (추가의 암에 대하여 Cancer:Principles and Practice (DeVita, V.T. et al. eds 1997)를 참고로 한다).
본 발명의 조성물의 투여는 화학요법적 화합물이 궁극적으로 치료할 조직과 접촉하도록 유도하기 위해서 통상적으로 사용되는 어떤 경로에 의해서도 이루어진다. 항체 및 유도제는 임의로 약제학적으로 허용되는 캐리어와 함께, 어떤 적합한 방식으로도 투여된다. 이러한 항체 및 유도제를 투여하는데 적합한 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가가 이용할 수 있고 잘 알려져 있으며, 하나를 초과하는 경로를 사용하여 특정의 조성물을 투여할 수 있지만, 특정의 경로는 종종 또 다른 경로 보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 캐리어는 투여될 특정의 조성물에 의해서, 및 조성물을 투여하기 위해서 사용된 특정의 방법에 의해서 부분적으로 결정된다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 제제에는 광범한 종류가 있다 (참조예: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985).
항체 및 유도제는 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 함께 흡입에 의해서 투여될 에어로졸 제제로 만들 수 있다 (즉, 이들은 "분무화"될 수 있다). 에어로졸 제제는 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같이 가압화된 허용되는 추진제 내에 배치시킬 수 있다.
투여에 적합한 제제에는 수성 및 비수성 용액, 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제제를 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 등장성 멸균용액, 및 현탁화제, 가용화제, 농조화제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁제가 포함된다. 본 발명을 실시하는 경우에 조성물은 예를들어, 경구적으로, 국소적으로, 정맥내로, 복강내로, 방광내로, 또는 수막강내로 투여될 수 있다. 임의로, 조성물은 비내로 투여된다. 화합물의 제제는 앰플 및 바이알과 같은 단일-투여량 또는 수회-투여량의 밀봉된 용기 내에 존재할 수 있다. 용액 및 현탁액은 이미 기술된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 변조제는 또한 제조된 식품 또는 약물의 일부분으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한, 목적하는 치료 또는 효과에 따라서 하나 또는 그 이상의 추가의 활성제 (예를들어, 화학요법제)와 함께 효과적으로 사용될 수도 있다.
본 발명과 관련하여 환자에게 투여되는 투약량은 시간이 경과함에 따라 피검자에게서 유익한 효과를 일으키는데 충분하여야 한다. 투약량은 사용된 특정 변조제의 효능 및 피검자의 상태, 및 체중 및 치료할 영역의 표면적에 의해서 결정될 수 있다. 투약량의 크기는 또한, 특정 피검자에게서 특정 화합물 또는 벡터의 투여에 수반되는 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해서 결정될 수 있다. 투여는 단일 또는 분할된 투약량에 의해서 이루어질 수 있다.
항체 효능제 및 아팝토시스-유도제는 혼합물로 함께 투여될 수 있거나, 각각 개별적으로 투여될 수 있다. 항체 효능제 및 아팝토시스 유도제는 동시에 투여될 수 있지만, 동시 투여가 필요하지는 않다.
VIII. 아팝토시스의 억제제
본 발명에 기술된 바와 같이, 다양한 유전자 생성물은 TRAIL-유도된 (및 항-DR4 또는 항-DR5-유도된) 아팝토시스를 억제하거나 (예를들어, 도 27의 첫번째 부분에 열거된 분자; 및 UbcH10), 또는 촉진시킨다 (예를들어, 도 27의 아래 부분에 열거된 분자). TRAIL-유도된 아팝토시스를 억제하는 이들 유전자 생성물은 TRAIL에 의해서 유도된 아팝토시스를 상승적으로 증가시키는 억제제, 항-DR4 또는 항-DR5 항체에 의해서 표적화될 수 있다. 유사하게, TRAIL-유도된 아팝토시스를 촉진시키는 이들 유전자 생성물은 TRAIL에 의해서 유도된 아팝토시스를 상승적으로 증가시키는 활성화제, 항-DR4 또는 항-DR5 항체에 의해서 표적화될 수 있다.
대용으로, TRAIL-유도된 아팝토시스를 억제하는 유전자 생성물의 활성화제를 사용하여 아팝토시스가 해로운 경우에 아팝토시스를 감소시킬 수 있다. 유사하게, TRAIL-유도된 아팝토시스를 촉진시키는 이들 유전자 생성물의 억제제를 또한 사용하여 아팝토시스가 해로운 경우에 아팝토시스를 감소시킬 수 있다. 이러한 질환의 한가지는 혈전성 혈소판감소성 자반병 (thrombic thrombocytopenic purpura; TTP)이다 (Kwaan, H.C., Semin. Hematol., 24:71 (1987); Thompson et al., Blood, 80:1890 (1992)). TPP-관련 사망율이 증가하는 것은 질병 제어를 위한 미합중국 센터 (U.S. Centers for Disease Control)에 의해서 보고되었다 (Torok et al., Am. J. Hematol. Am. J. Hematol. 50:84, 1995).
TTP를 앓고 있는 환자 (HIV+ 및 HIV- 환자를 포함)로부터 유래하는 혈장을 피부의 미소혈관계 기원의 인간 내피세포의 아팝토시스를 유도한다. 따라서 TTP 환자의 혈장은 직접 또는 간접적으로 아팝토시스를 유도하는 하나 또는 그 이상의 인자들을 함유하는 것으로 생각된다. PCT 출원 제 WO 97/01633 호 (본 발명에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이, TRAIL은 TTP 환자의 혈청 내에 존재하며, 미소혈관계 내피세포의 아팝토시스를 유도하는데 있어서 역할을 담당할 수 있다.
또 다른 혈전성 미소혈관증은 용혈성-요독성 증후군 (HUS)이다 (Moake, J.L., Lancet, 343-393 (1994); Melnyk et al., Arch. Intern. Med. 155:2077, (1995)). 본 발명의 한가지 구체예는 (비록 소아에게도 마찬가지로 일어날 수 있지만) 종종 "성인 HUS"로 불리는 상태를 치료하는데 관한 것이다. 소아/설사-관련 HUS로 알려진 질환은 성인 HUS로부터의 병인론과는 다르다.
그밖의 다른 상태는 소혈관의 응혈을 특징으로 한다. 이러한 상태에는 다음과 같은 것이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다: 소아과 AIDS 환자의 약 5-10％에서 나타나는 심장 문제는 소혈관의 응혈이 연루되는 것으로 믿어진다. 심장에서 미소혈관계의 파괴는 다발성 경화증 환자에서 보고되고 있다. 추가의 예로는 전신 홍반성 낭창 (SLE)의 치료가 고려된다.
IX. 항-DR5 항체에 의한 항암치료의 예상 효과
본 발명자들은, 유전자 생성물 Myc의 발현이 종양 세포에서 아팝토시스를 유도하는 항-DR5 항체의 효능에 필요한 것이지만 충분하지는 않은 것을 발견하였다. 따라서, 종양 세포 (예를들어, 조직생검으로부터 유래)에서 Myc의 발현은 DR5-표적화된 치료법에 대해 반응할 것 같지 않은 세포 (및 이에 따라 피검자)를 동정하기 위한 마커 (marker)를 제공한다. 구체적으로, 종양 세포가 야생형 세포보다 Myc를 덜 발현한다면, 이것은 Myc가 야생형 발현량과 같거나 그 이상으로 발현되는 경우에 비해서 DR5-표적화된 치료법이 덜 효과적일 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명은 피검자로부터 종양 세포의 샘플을 수득하고, 세포에서 Myc의 발현량을 검출함으로써 항-DR5 효능제 항체-기반 치료법의 효능을 결정하는 방법을 제공하는데, 여기에서 야생형 발현량보다 더 낮은 Myc의 발현량은 치료법이 종양 세포를 사멸시키는데 감소된 효능을 갖거나 효능이 없음을 시사하는 것이다.
실시예
이하의 실시예는 본 발명을 더 설명하기 위해서 제공되며, 그의 범위를 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 그밖의 다른 변형은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 용이하게 명백할 것이며, 첨부된 특허청구범위에 포함된다.
약어:
abs. 절대
i-BuB(OH)2 이소부틸-보론산
DIEA N-에틸디이소프로필아민
DMF N,N-디메틸포름아미드
equiv 당량
ES-MS 전기분무 질량분광분석
EtOAc 에틸 아세테이트
h 시간
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
MeOH 메탄올
min 분
m.p. 융점
MPLC 중압 액체 크로마토그래피
Rf 실리카겔 60 F254 (Merck, Darmstadt) 상에서의 TLC에 의해서 수득된 프론트 값 (front value)의 비
rt 실온
TBTU O-(벤조트리아롤-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄 테트라플루오로보레이트
TFA 트리플루오로아세트산
TLC 박층 크로마토그래피
tR 체류시간
융출제 및 그밖의 다른 용매 혼합물의 비는 다른 식으로 언급되지 않는다면 부피 대 부피 기준 (v/v)으로 제시된다.
TLC의 명시화:
UV-조사에 의해서 검출할 수 없는 최종 화합물 또는 중간체의 TLC 스폿은 과망간산칼륨 염색용액에 이어서 플레이트를 가열함으로써 명시화시킨다.
과망간산칼륨 염색용액의 조성: 800 ㎖의 H2O 및 200 ㎖의 1 N H2SO4 중의 2.5 g의 KMnO4 (과망간산칼륨)(Fluka, Buchs, Switzerland)
분석용 HPLC 조건:
시스템 1
10 min + 2 min 100％ CH3CN (0.1％ TFA) 중의 선형 구배 2-100％ CH3CN (0.1％ TFA) 및 H2O (0.1％ TFA); 215 ㎜에서 검출, 25℃에서 유속 0.7 ㎖/min. 칼럼: 뉴클레오실 (Nucleosil) 120-3 C18 (125×3.0 ㎜).
시스템 2
7 min + 2 min 100％ CH3CN (0.1％ TFA) 중의 선형 구배 20-100％ CH3CN (0.1％ TFA) 및 H2O (0.1％ TFA); 215 ㎜에서 검출, 30℃에서 유속 1 ㎖/min. 칼럼: 뉴클레오실 100-3 C18HD (125×4 ㎜).
시스템 3
7 min + 2 min 100％ CH3CN (0.1％ TFA) 중의 선형 구배 20-100％ CH3CN (0.1％ TFA) 및 H2O (0.1％ TFA); 215 ㎜에서 검출, 30℃에서 유속 1 ㎖/min. 칼럼: 뉴클레오실 (Nucleosil) 100-3 C8HD (125×4 ㎜).
(실시예 1 및 2):
실시예 1: (S)-2-[(S)-2-(비페닐릴-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-부티르아미드
단계 A: 디옥산 중의 HCl의 4 N 용액 (5.7 ㎖, 22.77 mMol, 30 equiv)을 아르곤 대기 하에서 CH2Cl2 abs. (5.5 ㎖) 중의 {(S)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르 (반응식 1에서 (A))(0.352 g, 0.759 mMol)의 냉 (0℃) 용액에 첨가한다. 생성된 혼합물을 rt로 가온하고, 10 min 동안 교반한다. 추가의 4 N HCl (1.9 ㎖, 7.59 mMol, 10 equiv)을 첨가한다. 반응혼합물을 10 min 동안 교반하고, 농축시켜 황색 포움으로서 조 하이드로클로라이드를 수득한다.
단계 B: DIEA abs. (0.72 ㎖, 4.14 mMol, 5 equiv)를 아르곤 대기 하에서 DMF abs. (3.0 ㎖) 중의 조 하이드로클로라이드 (0.331 g, 0.828 mMol), (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (반응식 1에서 (B))(0.518 g, 0.994 mMol, 1.2 equiv) 및 TBTU (0.292 g, 0.910 mMol, 1.1 equiv)의 냉 (0℃) 용액에 적가한다 (1.9 ㎖/min). 반응혼합물을 rt로 가온하고, 40 min 동안 교반하고, 0℃ H2O (45 ㎖)에 붓는다. 생성된 침전물을 진공 여과에 의해서 수집하여, EtOAc에 용해시키고, H2O로 세척한다. 유기상을 건조시키고 (Na2SO4), 여과하여 농축시킨다. 잔류물을 실리카겔 (25 g) 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2/MeOH, 90/10)에 의해서 정제하여 황색 포움으로서 표제 화합물을 수득한다.
출발물질은 다음과 같이 제조한다:
(a) (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (단계 B의 경우)
표제 화합물은 DMF abs. (10.6 ㎖) 중의 3-브로모-비페닐 (1.47 ㎖, 8.54 mMol, Aldrich 25,538-6), (S)-2-아미노-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (3,4,5-OCH3-phe-OH)(3.27 g, 12.81 mMol), K2CO3 (1.18 g, 8.54 mMol) 및 CuI (163 ㎎, 0.854 mMol)의 현탁액을 아르곤 대기 하에 90℃에서 24 h 동안 가열함으로써 제조한다. 생성된 혼합물을 rt로 냉각시킨 다음에, 진공 중에서 농축시키고, MPLC (CH3CN/H2O/TFA)에 의해서 정제하여 표제 화합물을 수득한다.
(b) (S)-2-아미노-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (L-3,4,5-트리메톡시-페닐알라닌)
표제 화합물은 시판품으로 이용할 수 있는 3,4,5-트리메톡시벤즈알데히드 및 N-아세틸글리신으로부터 문헌 방법 (E.M. Oltz, R.C. Bruening, M.J. Smith, K. Kustin and K. Makanishi in J. Am. Chem. 1998, 110(18), 6162-6172)에 따라 제조한다. 라세믹 N-아세틸-3,4,5-트리메톡시-페닐알라닌 메틸 에스테르의 분할은 문헌 (J.J. Nestor, Jr., T.L. Ho, R.A. Simpson, B.L. Horner, G.H. Jones, G.I. McRase and B.H. Vickery in J. Med. Chem. 1982, 25(7), 795-801; 또는 O.D. Tyagi ＆ P.M. Boll in Indian J. Chem. 1992, pp. 851-854)에 기술된 바와 같이 알칼라제 (Alcalase™; Novo Nordisk)를 사용한 L-에스테르의 효소-촉매화된 가수분해에 의해서 수행된다.
(c) {(S)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르
표제 화합물은 (S)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸암모늄 트리플루오로아세테이트 (반응식 1의 (c))(제조방법에 대한 참조: Kettner, C.A. and Shenvi, A.B. J. Biol. Chem. 1984, 259, p. 15106-15114 및 Matteson, D.S. and Sadhu, K.M. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, p. 5241-5242)(2.395 g, 6.32 mMol), Boc-L-발린 (1.373 g, 6.32 mMol), TBTU (2.23 g, 6.95 mMol, 1.1 equiv), DIEA (3.3 ㎖, 18.95 mMol, 3.0 equiv) 및 DMF (24 ㎖)를 사용하여 실시예 1의 단계 B에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 2: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐릴-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-부티릴아미노}-3-메틸-부틸보론산
i-BuB(OH)2를 (S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸]-부티르아미드, 메탄올 (4.3 ㎖), 헥산 (4.3 ㎖) 및 1 N HCl (1.45 ㎖)의 혼합물에 첨가한다. 반응혼합물을 rt에서 2 h 동안 교반하고, 메탄올 (8 ㎖) 및 헥산 (8 ㎖)으로 희석한다. 두층을 분리시킨다. 메탄올 층을 헥산으로 2회 세척하고, CH2Cl2로 희석하고, H2O로 세척하고, 건조시키고 (Na2SO4), 여과하여 농축시킨다. 잔류물을 CH2Cl2에 용해시키고, 실리카겔 (20 g) 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2/MeOH, 80/20)에 의해서 정제하여 연황색 포움으로서 표제 화합물을 수득한다.
표제 화합물: ES-MS: 618.2 [M-H]-; Rf= 0.03 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).
(실시예 3 및 4):
실시예 3: (S)-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-2-[(S)-2-[2-(3-페녹시-페닐)-아세틸아미노]-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-부티르아미드
표제 화합물은 (S)-2-3급-부톡시카보닐아미노-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (반응식 2의 (D)) 및 (3-페녹시-페닐)-아세트산 (반응식 2의 (F))(Trans World Chemicals, Inc.; Rockville, MD, USA)을 각각의 커플링 반응 (실시예 1, 단계 B)에서 각각의 파트너로 사용하여 실시예 1에 기술된 2-단계 (탈보호/커플링) 방법을 반복함으로써 {(S)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르 (반응식 2에서 (A))로부터 제조된다. 표제 화합물은 백색 고체로 수득된다.
단계 3.1: (S)-2-아미노-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (L-2,3,4-트리메톡시-페닐알라닌)
표제 화합물은 (S)-2-아미노-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (실시예 1)에 대해 기술된 바와 같이 제조한다.
단계 3.2: (S)-2-3급-부톡시카보닐아미노-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온산
표제 화합물은 (S)-2-아미노-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온산으로부터 출발하여 본 기술분야에서 공지된 방법 (M. Bodanszky in Principles of Peptide Synthesis, Akad.-Verlag, 1984)에 따라 합성한다.
실시예 4: (R)-3-메틸-1-{(S)-3-메틸-2-[(S)-2-[2-(3-페녹시-페닐)-아세틸아미노]-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-부티릴아미노}-부틸보론산
실시예 5: (S)-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-2-[(S)-2-(3-페닐-프로피오닐-아미노)-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-부티르아미드
표제 화합물은 (S)-2-(3급-부톡시카보닐-아미노)-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온산 및 3-페닐-프로피온산 (Fluka, Buchs, Switzerland)을 각각의 커플링 반응 (실시예 1, 단계 B)에서 각각의 파트너로 사용하여 실시예 1에 기술된 2-단계 (탈보호/커플링) 방법을 반복함으로써 {(S)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르로부터 제조된다.
실시예 6: (R)-3-메틸-1-{(S)-3-메틸-2-[(S)-2-(3-페닐-프로피오닐아미노)-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-부티릴아미노}-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 7: (S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-부티르아미드
표제 화합물은 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술한 바와 같이 제조된다.
단계 7.1: (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-프로피온산
표제 화합물은 O-페닐-L-티로신 (Bachem)을 사용하여 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (실시예 1)에 대해 기술한 바와 같이 제조된다. MPLC (CH3CN/H2O/TFA)에 의한 정제로 표제 화합물을 수득한다.
실시예 8: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-부티릴아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 9: (S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4-디메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-부티르아미드
표제 화합물은 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4-디메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술한 바와 같이 제조된다.
단계 9.1: (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4-디메톡시-페닐)-프로피온산
표제 화합물은 3-(3,4-디메톡시페닐)-L-알라닌 (Aldrich)을 사용하여 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (실시예 1)에 대해 기술한 바와 같이 제조된다. MPLC (CH3CN/H2O/TFA)에 의한 정제로 표제 화합물을 수득한다.
실시예 10: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4-디메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-부티릴아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 11: (S)-2-[(S)-2-(3-이소프로필-페닐아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-부티르아미드
표제 화합물은 (S)-2-(3-이소프로필-페닐아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술한 바와 같이 제조된다.
단계 11.1: (S)-2-(3-이소프로필-페닐아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산
표제 화합물은 1-브로모-3-이소프로필벤젠 (Lancaster)을 사용하여 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (실시예 1)에 대해 기술한 바와 같이 제조된다. MPLC (CH3CN/H2O/TFA)에 의한 정제로 표제 화합물을 수득한다.
실시예 12: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(3-이소프로필-페닐아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-부티릴아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 13: (S)-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-2-[(S)-2-(3-피리딘-2-일-페닐아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-부티르아미드
표제 화합물은 (S)-2-(3-피리딘-2-일-페닐아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술한 바와 같이 제조된다.
단계 13.1: 2-(3-브로모-페닐)-피리딘
표제 화합물은 이하의 문헌 방법에 따라 제조된다.
단계 13.2: (S)-2-(3-피리딘-2-일-페닐아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산
표제 화합물은 2-(3-브로모-페닐)-피리딘을 사용하여 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (실시예 1)에 대해 기술한 바와 같이 제조된다. MPLC (CH3CN/H2O/TFA)에 의한 정제로 표제 화합물을 수득한다.
실시예 14: (R)-3-메틸-1-{(S)-3-메틸-2-[(S)-2-(3-피리딘-2-일-페닐아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-부티릴아미노}-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 15: (S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-부티르아미드
표제 화합물은 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술한 바와 같이 제조된다.
단계 15.1: (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온산
표제 화합물은 (S)-2-아미노-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (실시예 1)에 대해 기술한 바와 같이 제조된다. MPLC (CH3CN/H2O/TFA)에 의한 정제로 표제 화합물을 수득한다.
실시예 16: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-부티릴아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 17: (S)-2-[(S)-3-(4-벤질옥시-페닐)-2-(비페닐-3-일아미노)-프로피오닐아미노]-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-부티르아미드
표제 화합물은 (S)-3-(4-벤질옥시-페닐)-2-(비페닐-3-일아미노)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술한 바와 같이 제조된다.
단계 17.1: (S)-3-(4-벤질옥시-페닐)-2-(비페닐-3-일아미노)-프로피온산
표제 화합물은 (S)-2-아미노-3-(4-벤질옥시-페닐)-프로피온산 (O-벤질-L-티로신)을 사용하여 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (실시예 1)에 대해 기술한 바와 같이 제조된다. MPLC (CH3CN/H2O/TFA)에 의한 정제로 표제 화합물을 수득한다.
실시예 18: (R)-1-{(S)-2-[(S)-3-(4-벤질옥시-페닐)-2-(비페닐-3-일아미노)-프로피오닐아미노]-3-메틸-부티릴아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 19: (R)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-부티르아미드
표제 화합물은 {(R)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르를 사용하여 실시예 1에 기술한 바와 같이 제조된다.
단계 19.1: {(R)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르
표제 화합물은 Boc-D-발린 (Fluka)을 사용하여 {(S)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르 (실시예 1(c))에 대해 기술한 바와 같이 제조된다.
실시예 20: (R)-1-{(R)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-부티릴아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 21: (S)-2-[(R)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-부티르아미드
표제 화합물은 (R)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술한 바와 같이 제조된다.
단계 21.1: (R)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산
표제 화합물은 (R)-2-아미노-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (3,4,5-OCH3-phe-OH)을 사용하여 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (실시예 1)에 대해 기술한 바와 같이 제조된다.
(R)-2-아미노-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산의 합성에 대해서는 실시예 1을 참고로 한다.
효소적 분할한 후에 잔류 D-아미노산-메틸 에스테르를 본 기술분야에서 공지된 프로토콜을 사용하여 가수분해 및 탈아세틸화시킨다.
실시예 22: (R)-1-{(S)-2-[(R)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-부티릴아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 23: (S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-N-[3-메틸-1-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-부틸]-부티르아미드
표제 화합물은 {(S)-2-메틸-1-[3-메틸-1-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르를 사용하여 실시예 1에 기술한 바와 같이 제조된다.
단계 23.1: {(S)-2-메틸-1-[3-메틸-1-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-부틸카바모일]-프로필}-키빔산 3급-부틸 에스테르
표제 화합물은 {(S)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르 (실시예 1(c))의 합성과 유사하게 제조된다.
실시예 24: 1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-부티릴아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 25: (S)-2-{(S)-3-(3,4-디메톡시-페닐)-2-[2-(3-페녹시-페닐)-아세틸아미노]-프로피오닐아미노}-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-부티르아미드
표제 화합물은 Boc-L-3,4-디메톡시페닐알라닌 (Synthetech) 및 (3-페녹시-페닐)-아세트산 (Trans World Chemicals, Inc.; Rockville, MD, USA)을 각각의 커플링 반응 (실시예 1, 단계 B)에서 각각의 파트너로 사용하여 실시예 1에 기술된 2-단계 (탈보호/커플링) 방법을 반복함으로써 {(S)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르로부터 제조된다. 표제 화합물은 포움으로서 수득된다.
실시예 26: (R)-1-((S)-2-{(S)-3-(3,4-디메톡시-페닐)-2-[2-(3-페녹시-페닐)-아세틸아미노]-프로피오닐아미노}-3-메틸-부티릴아미노)-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술한 바와 같이 제조된다.
실시예 27: (S)-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-2-[(S)-2-[2-(3-페녹시-페닐)-아세틸아미노]-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-부티르아미드
표제 화합물은 (S)-2-3급-부톡시카보닐아미노-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산 및 (3-페녹시-페닐)-아세트산 (Trans World Chemicals, Inc.; Rockville, MD, USA)을 각각의 커플링 반응 (실시예 1, 단계 B)에서 각각의 파트너로 사용하여 실시예 1에 기술된 2-단계 (탈보호/커플링) 방법을 반복함으로써 {(S)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르로부터 제조된다. 표제 화합물은 황색 포움으로서 수득된다.
단계 27.1: (S)-2-3급-부톡시카보닐아미노-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산
표제 화합물은 (S)-2-아미노-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산으로부터 출발하여 (S)-2-3급-부톡시카보닐아미노-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (실시예 3)에 대해 기술한 바와 같이 합성한다.
실시예 28: (R)-3-메틸-1-{(S)-3-메틸-2-[(S)-2-[2-(3-페녹시-페닐)-아세틸아미노]-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-부티릴아미노}-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 29: (S)-2-{(S)-3-(4-벤질옥시-페닐)-2-[2-(3-벤질옥시-페닐)-아세틸아미노]-프로피오닐아미노}-3-메틸-N-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-부티르아미드
표제 화합물은 (S)-3-(4-벤질옥시-페닐)-2-3급-부톡시카보닐아미노-프로피온산 및 (3-페녹시-페닐)-아세트산 (Trans World Chemicals, Inc.; Rockville, MD, USA)을 각각의 커플링 반응 (실시예 1, 단계 B)에서 각각의 파트너로 사용하여 실시예 1에 기술된 2-단계 (탈보호/커플링) 방법을 반복함으로써 {(S)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르로부터 제조된다. 표제 화합물은 베이지색 포움으로서 수득된다.
단계 29.1: (S)-3-(4-벤질옥시-페닐)-2-3급-부톡시카보닐아미노-프로피온산
표제 화합물은 O-벤질-L-티로신 (Fluka)으로부터 출발하여 (S)-2-3급-부톡시카보닐아미노-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온산 (실시예 3)에 대해 기술한 바와 같이 합성한다.
실시예 30: (R)-1-((S)-2-{(S)-3-(4-벤질옥시-페닐)-2-[2-(3-벤질옥시-페닐)-아세틸아미노]-프로피오닐아미노}-3-메틸-부티릴아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 31: (S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-4-메틸-펜타노산 [(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-아미드
표제 화합물은 {(S)-3-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-부틸}-카밤산 3급-부틸 에스테르를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된다.
단계 31.1: {(S)-3-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸카바모일]-부틸}-카밤산 3급-부틸 에스테르
표제 화합물은 Boc-L-루이신을 사용하여 {(S)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르 (실시예 1(c))에 대해 기술한 바와 같이 제조된다.
실시예 32: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-4-메틸-펜타노일아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 33: (S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4-디메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-4-메틸-펜타노산 [(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-아미드
표제 화합물은 {(S)-3-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-부틸}-카밤산 3급-부틸 에스테르 및 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4-디메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 34: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-4-메틸-펜타노일아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 35: (S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-4-메틸-펜타노산 [(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸]-아미드
표제 화합물은 {(S)-3-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-부틸}-카밤산 3급-부틸 에스테르 및 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 36: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-4-메틸-펜타노일아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 37: (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-N-{(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온아미드
표제 화합물은 {(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-카밤산 3급-부틸 에스테르를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된다.
단계 37.1: {(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-카밤산 3급-부틸 에스테르
표제 화합물은 Boc-L-알라닌 (Fluka)을 사용하여 {(S)-2-메틸-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르 (실시예 1, 단계 1.1)에 대해 기술한 바와 같이 제조된다.
실시예 38: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-프로피오닐아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 39: (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-N-{(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온아미드
표제 화합물은 {(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-카밤산 3급-부틸 에스테르 및 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 40: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-프로피오닐아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 41: (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-N-{(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-프로피온아미드
표제 화합물은 {(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-카밤산 3급-부틸 에스테르 및 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 42: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-프로피오닐아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 43: (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4-디메톡시-페닐)-N-{(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-프로피온아미드
표제 화합물은 {(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-카밤산 3급-부틸 에스테르 및 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4-디메톡시-페닐)-프로피온산를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 44: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4-디메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-프로피오닐아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 45: (S)-2-(3-이소프로필-페닐아미노)-N-{(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온아미드
표제 화합물은 {(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-카밤산 3급-부틸 에스테르 및 (S)-2-(3-이소프로필-페닐아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 46: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(3-이소프로필-페닐아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-프로피오닐아미노}-3-메틸-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 47: (S)-N-{(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-2-(3-페닐-프로피오닐아미노)-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온아미드
표제 화합물은 (S)-2-아미노-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피온산 및 3-페닐-프로피온산 (Fluka)을 각각의 커플링 반응 (실시예 1, 단계 B)에서 각각의 파트너로 사용하여 실시예 1에 기술된 2-단계 (탈보호/커플링) 방법을 반복함으로써 {(S)-1-[(R)-3-메틸-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-에틸}-카밤산 3급-부틸 에스테르로부터 제조된다.
실시예 48: (R)-3-메틸-1-{(S)-2-[(S)-2-(3-페닐-프로피오닐아미노)-3-(2,3,4-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-프로피오닐아미노}-부틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 49: (S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-N-[(R)-2-페닐-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-에틸]-부티르아미드
표제 화합물은 {(S)-2-메틸-1-[(R)-2-페닐-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-에틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된다.
단계 49.1: {(S)-2-메틸-1-[(R)-2-페닐-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-에틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르
표제 화합물은 {(S)-2-메틸-1-[(R)-3-페닐-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-부틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르 (실시예 1(c))의 합성과 유사하게 제조된다.
실시예 50: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(3,4,5-트리메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-부티릴아미노}-2-페닐-에틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 51: (S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-N-[(R)-2-페닐-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.0 2,6 ]데크-4-일)-에틸]-부티르아미드
표제 화합물은 {(S)-2-메틸-1-[(R)-2-페닐-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-트리메틸-3,5-디옥사-4-보라-트리사이클로[6.1.1.02,6]데크-4-일)-에틸카바모일]-프로필}-카밤산 3급-부틸 에스테르 및 (S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-프로피온산을 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 52: (R)-1-{(S)-2-[(S)-2-(비페닐-3-일아미노)-3-(4-메톡시-페닐)-프로피오닐아미노]-3-메틸-부티릴아미노}-2-페닐-에틸보론산
표제 화합물은 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된다.
실시예 53: 20S 프로테아좀의 키모트립신-유사 활성의 억제
화학식 I의 화합물에 대하여 상술한 시험에 따라 측정된 IC50 값의 예는 이하에 제시되어 있다 (표 A).
실시예 54
항-DR5 스크린을 위해 개발된 본 발명자들의 시험방법의 일부분으로서, 본 발명자들은 TRAIL 리간드를 클로닝하고, 발현시키고, 정제한 다음에, 이것을 Jurkat 세포 상에서 시험하여 리간드에 의해서 세포를 사멸시킬 수 있는지 여부를 측정하였다. 이 시험방법은 생존세포가 염료를 환원시키는 경우에 형광을 발하는 산화환원 염료인 알라마르 블루를 포함하였다. 세포가 아팝토시스에 의해서 사멸하는 경우에, 나타나는 환경은 산화성이고, 염료는 환원되지 않으며, 형광은 검출될 수 없다. 도 1에 예시된 바와 같이, TRAIL는 Jurkat 세포에서 아팝토시스를 유도하였다.
항체 효능제에 대한 스크린이 수행되었다. 마우스를 DR5 수용체로 면역시키고, B 세포를 골수종에 융합시켰다. 생성된 하이브리도마를 384 웰 플레이트에 정렬하고, 수일 동안 성장시킨 후에 20 ㎕의 상등액과 교차결합성 항체를 Jurkat 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다. 24시간 후에, 알라마르 블루 염료를 첨가하고, 24시간 후에 악퀘스트 (Acquest)를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 양성으로 반응하는 항체를 함유하는 몇개의 양성 웰을 확인하였다.
양성 항체의 특이성을 시험하였다. 시험에서 양성 신호를 나타낸 3개의 하이브리도마를 서브-클로닝하고, 증량시켜 정제하였다. 수용체를 웰 상에 코팅하고, 3개의 항체를 ELISA 분석에 적용하였다. 그 결과는 항체는 단지 DR5와 반응하였음을 나타내었으며, 따라서 매우 특이적이었다 (참조: 도 2).
도 3은 투여량 반응 분석을 나타낸다. 3개의 항체 효능제는 Jurkat 세포 사멸에 대하여 상이한 투여량 반응을 나타낸다. 항체 A (ATCC 기탁번호 )는 최상의 효력을 가졌으며, 따라서 추가의 시험을 위해서 선택되었다. 임제넥스 (Imgenex)-257은 기능적 활성을 갖지 않는 DR5 특이적 항체이다.
카스파제 3 활성화가 측정되었다. 항체가 일부의 간접 또는 비-특이적 기전에 의해서가 아니라 아팝토시스에 의해서 세포를 사멸시켰는지 여부를 측정하기 위해서, 본 발명자들은 카스파제-3 활성시험을 수행하였다. 항체 또는 리간드를 다양한 농도로 세포와 혼합시키고, 처리된 세포로부터 세포 추출물을 생성시켰다. 형광성 기질을 용해물에 첨가하고, 이것을 사용하여 아팝토시스의 지표인 활성 카스파제 3에 대하여 시험하였다. 항체는 리간드와 유사한 양식으로 아팝토시스를 촉진시켰다. 도 4는 그 결과를 나타낸 것이다.
결장 및 흑색종 세포주에 대한 DR5 항체의 효과를 측정하였다. 도 5는 부착된 다양한 종양 세포주에 대한 투여량 반응 곡선을 나타낸다. 아팝토시스를 수행할 수 없는 HCT 116 bax/bax- 세포주를 제외하고 모든 세포주는 DR5 아팝토시스 유도성 항체에 대하여 민감하다.
도 6은 다양한 유방암 세포주에 대하여 수행된 동일한 실험을 나타낸 것이다. T47D 및 ZR-75-1은 둘다 DR5의 종양제거 활성에 대해서 저항성인 반면에, MCF-7 및 MDA-MB-231은 감수성이다.
도 7은 종양 세포가 항체의 작용에 대해 민감하며, 정상세포, 인간 폐 섬유아세포 (HLF) 및 인간 제대정맥 상피세포 (HUVEC)는 그들의 투여량 반응이 결여되는 것으로 나타나는 바와 같이 저항성이었다.
정상세포는 항체에 의해서 사멸하지 않는다는 점을 더 입증하기 위하여, 인간 폐 섬유아세포, 인간 유방 상피세포 및 정상적인 원발성 인간 간세포를 DR5 항체로 처리한 후에 카스파제 3 활성에 대하여 시험하였다. 정상세포 중의 어떤 것도 활성을 나타내지 않는 반면에, DOHH2 소포성 림프종 및 Jurkat 세포는 아팝토시스와 관련된 카스파제 활성화를 나타내었다 (참조: 도 8).
또한, 난소암 세포주인 CaOV3을 항체에 의해서 파괴되는 반면에, 정상 HLF 및 HMEC는 DR5 항체에 의해서 전혀 영향을 받지 않는다.
항체의 생체내 효능도 시험하였다. 10마리의 마우스에게 5×106 colo 205 (결장종양 세포)를 0일에 피하로 주사하였다. DR5 항체 (400 ㎍)에 의한 처리는 11일에 시작하였다. 400 ㎍의 DR5를 2회 주사한 후에 5마리의 처리된 동물은 종양의 증거를 나타내지 않은 반면에, PBS를 투여한 5마리의 마우스는 모두 큰 종양을 가졌다. 따라서, 항체는 생체내에서 효과적인 것으로 보인다.
시험은 32일까지 계속되었다. 미처리 마우스는 큰 종양을 가졌거나, 사망하였다. 처리된 마우스는 질병을 나타내지 않았다. 실험은 50일에 종료되었다. 미처리된 동물은 모두 사망하였다. 처리된 동물 중의 어떤 것도 50일째에 재발을 나타내지 않았다. 도 9는 그래프로 나타낸 Colo 205 효능시험을 나타낸 것이다. 화살표는 처리일을 나타내는 것이다.
이전의 실험은 1회 투여량 시험을 나타낸 것이다. 항체의 역가를 측정하기 위해서 본 발명자들은 대용량 반응 시험을 수행하였다. 그룹의 크기는 그룹당, 8 마리의 마우스로 증가시켰으며, 50, 200 및 400 ㎍의 투여량을 이전의 1회 투여량 시험에서 기술한 바와 같이 투여하였다. 그 결과는 항체가 저용량 (예를들어, 50 ㎍)으로 효과적임을 시사한다 (참조: 도 10).
새로운 종양 모델인 흑색종 세포주 A2058에 대한 소용량 반응 시험도 또한 수행되었다. 이 세포주는 시험관내에서 항체에 대해 더 저항성이었다. 그룹 크기는 2마리의 마우스였다. 처리된 마우스 (400 ㎍)는 생체내 종양제거 활성을 나타내는 반면에, 20 ㎍ 또는 PBS로 처리된 마우스는 큰 종양을 나타내었다 (참조: 도 11).
상이한 세포주는 DR5 항체에 대하여 다양한 정도의 민감도를 나타내기 때문에, 본 발명자들은 항체의 작용에 대해 저항성이거나 활발하게 저항성인 세포주를 감작시키는 소분자 상승제의 개발을 탐구하였다. 본 발명자들은 아팝토시스성 경로를 분석하고, 어디에서 아팝토시스가 잠재적으로 차단될 수 있는지, 그리고 어떤 형태의 소분자 상승제가 성질상 전-아팝토시스성일 수 있는지를 측정함으로써 이 문제에 접근하였다.
도 12는 아팝토시스를 위한 외부 및 내부 경로를 도시한 것이다. 주안점은 종양 세포가 아팝토시스의 억제제 (IAP), 및 미토콘드리아로부터 주된 전-아팝토시스성 단백질 (Cyto-C 및 SMAC)의 유리를 차단하는 Bc12를 과다발현시킨다는 점이다. 이들 단백질에 의해서 이루어지는 차단은 SMAC의 첨가에 의해서 극복될 수 있다. SMAC는 IAP를 억제한다. LB 672라고 불리는 SMAC 모방체는 DR5 효능제의 작용에 대해 종양 세포를 감작시키는 그의 가능한 상승적 효과에 대하여 시험하였다.
도 13은 A2058 흑색종 세포에 대한 SMAC 모방체의 효과를 나타낸 것이다. 이미 본 발명자들은 이들 세포가 항체에 대하여 부분적으로 민감하다는 것을 나타내었다. 이 그래프는 SMAC 및 DR5 항체로 처리된 세포는 완전히 제거되는 반면에, 672 화합물은 실질적으로 그 자체에 대한 활성을 갖지 않음을 보여준다.
도 14는 A2058 흑색종 세포에 대한 다양한 농도의 SMAC의 효과를 나타내는 투여량 반응 그래프를 나타낸다. 또한, 이들 종양 세포는 부분적으로 저항성이 있으며, 낮은 양의 SMAC (50-100 nM)에 대해 감작된다. 그러나, 더욱 중요하게는 HMEC도 HLF도 SMAC 모방체 LB672에 의해서 감작되지 않는다는 점이다.
도 15는 SMAC의 약력학적 특성을 나타낸다.
제 2의 상승제 전략을 사용하여 DR4/DR5 상승제로서 프로테아좀 억제제의 사용을 시험하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 프로테아좀 억제제는 프로테아좀이 IκB를 분해하는 것을 방해한다. 이것은 다시 NFκB의 유리를 방해한다. NFκB는 핵에 전이하여, BCL2, IAP 및 그밖의 다른 항-아팝토시스성 인자의 전사를 개시시키는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 우선, 시판품으로 이용할 수 있는 약한 프로테아좀 억제제인 MG132를 첨가함으로써 프로테아좀 억제제가 DR5에 대해 종양 세포를 감작시킬 수 있는지 여부를 시험하였다. 도 17은 합리적으로 높은 농도에서 MG132는 항체의 작용에 대하여 저항성 SW 480 결장세포를 감작시켰음을 나타낸다.
본 발명자들은 또한, 몇가지 강력한 프로테아좀 억제제를 수득하였다. 최상의 효과를 나타낸 화합물들은 보로네이트였다. 최대 허용용량은 이들 화합물이 비교적 독성이 있으며, 따라서 생체내에서 독성과 종양제거 효능 사이에는 좁은 창이 있음을 나타낸다 (참조: 도 18).
프로테아좀 억제제는 DR5 항체에 대해서 A2058-LUC를 감작시켰다 (참죄 도 19). 프로테아좀 억제제는 항체에 대하여 저항성 간암 세포주 HUH-7을 역시 감작시켰다 (참조: 도 20). 그러나, 어떠한 화합물도 정상 HMEC 세포에 대하여는 효과를 갖지 않았다. 또한, 이들 세포는 항체의 작용에 대하여 감작되지 않았다 (참조: 도 21).
DR5 마우스 항체 A로부터의 가변 영역을 클로닝하여, SP20 발현 시스템 내에 삽입하였다. 이들 벡터는 인간 IgG 1 Fc를 코딩한다. 생성된 인간 키메라는 80％ 인간이고 20％ 마우스이다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 핵산 서열은 도 22에 나타내었다. 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 24 또는 도 35에 나타내며, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 25 또는 도 35에 나타낸다. 키메라는 SP2/0 세포에서 20 pg/세포/일로 발현되었다. 생성된 인간 키메라 항체를 염소 항-인간 Fc와 교차-결합시키고, 기능적 활성에 대하여 시험하였다. 키메라는 마우스 항체와 동등한 기능성 종양제거 활성을 가졌다 (참조: 도 21).
실시예 55
siRNA 분자의 라이브러리를 세포 내로 형질감염시키고, 세포를 TRAIL과 접촉시키고, TRAIL의 부재에 대비한 변화된 생존능에 관하여 세포를 스크리닝하였다. 그후에, 변화된 생존능을 갖는 세포를 사용하여 세포 내에 형질감염된 특정의 siRNA룰 동정함으로써 siRNA에 의해서 억제된 유전자를 결정하였다 (참조: 도 26 및 27).
도 28은 스크린을 기본으로 하여 선택된 siRNA에 상응하는 유전자 생성물을 설명하는 것이다. siRNA에 의한 유전자 생성물의 억제가 낮은 TRAIL (+/-) 비를 제공하는 유전자 생성물이 TRAIL-유도된 아팝토시스의 억제제이다.
표 1은 도 28에 나타낸 유전자 생성물에 대하여 진뱅크 (Genbank) 기탁번호를 포함한 추가의 정보를 제공한다.
실시예 56
siRNA는 Gsk3α 또는 GSK3β의 발현을 특이적으로 억제함으로써 TRAIL-유도된 아팝토시스에 대한 유전자 생성물의 효과를 측정할 수 있도록 하는 것으로 확인되었다. 도 29에 설명한 바와 같이, Gsk3β가 아닌 Gsk3α의 억제는 대조군에 비해서 세포에서 카스파제 활성을 감소시킨다. 따라서, Gsk3α는 TRAIL-유도된 아팝토시스의 활성화제이다. 마찬가지로, 두가지 다른 유전자 생성물 SRP72 및 FLJ32312도 또한 아팝토시스의 활성화제로서 확인되었다.
본 발명에서 동정된 다양한 성분들의 관계는 도 30에 제공된다. 도면은 TRAIL-유도된 아팝토시스 경로의 다양한 성분들의 관계 및 효과 (예를들어, 아팝토시스 활성화제 또는 억제제)를 설명한다.
실시예 57
384 웰 포맷 (format)에 정렬된 510 유전자 표적화 siRNA 라이브러리를 HeLa 세포 내로 형질감염시켰다. 세포를 48시간 동안 배양하여 표적이 붕괴되도록 하고, TRAIL의 존재 또는 부재 하에 처리하였다. 생존능은 알라마르 블루를 사용한 TRAIL 처리 후, 20시간에 측정하였다. 감수성 비는 대조 siRNA에 의해서 수득된 총 60개의 값과의 비교를 위해서 각각의 siRNA에 대해서 측정되었다. TRAIL 리간드로 처리한 Hela 세포는 대조 웰에서 MTT 시험에 의해서 측정된 것으로 생존능에서 ~40％ 감소를 나타내었다. 세포 사멸을 현저하게 억제하거나 증진시킨 siRNA를 동정하였다 (참조: 각각 표 2 및 3).
스크린에서 동정된 것으로, 생존능 분석에 의해서 측정된 바와 같이 세포 사멸을 증진시킨 몇개의 siRNA를 DR5 기능성 항체에 의해 카스파제 활성화를 증진시키는 그들의 능력에 대하여 시험하였다. DR5 항체를 적정하여 형광발생성 펩티드 (DEVD-afc)에 의해서 측정된 것으로서 카스파제 활성화의 최소량을 생성시켰다. nsrna, nsurf, PAK1, stk12, Ask1 및 JIK에 대해 지향된 siRNA를 Hela 세포에 형질감염시킨 다음에, DR5 항체로 처리하였다. 대조 siRNA (nsrna)는 작은 효과를 갖는 반면에, 동정된 siRNA는 카스파제 활성을 현저하게 증진시켰다.
PAK1에 대해 지향된 몇개의 추가의 (스크린에 동정된 것과는 구별됨) siRNA를 디자인하여 DR5 항체의 존재 또는 부재 하에서 생존능에 대한 그들의 효과를 시험하였다. siRNA에는 다음이 포함되었다:
PAK1-1 및 PAK1-2는 24시간 및 48시간째 둘다에서 결장암 세포주 HCT116 bax +/-에서의 생존능 (MTT 시험)을 강력하게 감소시켰다.
HCT116 bax +/- 세포는 결실된 bax의 카피 둘다를 가지고 있어서 이들 세포가 TRAIL1 및 DR5 항체에 대한 것을 포함하여 화학요법적 치료에 대해서 매우 저항성을 갖도록 한다. 이들 동일한 결과는 또한, 결장암 DLD1 세포에서도 관찰되었다.
PAK1의 무증상화 또는 억제가 정상세포에 대하여 독성인지 여부를 측정하기 위해서 본 발명자들은 원발성 난소 상피세포주 IOSE80에 대하여 PAK1 siRNA를 시험하였다. 그 결과는 PAK1에 대해서 지향된 siRNA가 정상세포의 생존능을 감소시키지 않음을 나타낸다. 따라서, PAK1 및 그밖의 다른 유전자 생성물.
또한, siPAK1은 원발성 ("정상") 상피세포주 HMEC에서 생존능을 현저하게 감소시키지 않은 반면에, 이것은 결장암 세포주 HCT15에서 DR5 및 DR4 유도된 생존능 감소를 강력하게 증진시킨다.
실시예 58: UbcH19 길항제 및 항-DR5 항체의 상승적 효과
본 실시예는 종양 세포에서 아팝토시스를 감소시키는데 있어서 인간 유비퀴틴 컨쥬가제 UbcH10 (UBE2C)과 항-DR5 항체의 상승적 효과를 기술한 것이다. UbcH10은 세포 사이클 조절에서 필수적인 역할을 나타낸다. 유전자 발현 및 면역조직화학의 전반적인 분석을 이용하여 본 발명자들은 UbcH10이 다수의 해부학적 위치, 현저하게는 유방, 위/식도, 결장직장, 폐 및 난소의 암종에서 과다발현되는 것을 발견하였다. 데이타는 UbcH10이 종양 발생에서 중요한 역할을 나타내는 것을 시사한다. 그래서 암의 치료시에 UbcH10을 억제하는 치료적 잠재성이 검사되었다.
UbcH10 발현의 RNAi-매개된 무증상에 의한 세포 성장의 감소. 본 발명자들은 우선 높은 UbcH10 양을 갖는 종양 세포에서 유전자 무증상의 결과를 조사하였으며, 3가지의 상이하며 비-중복성인 작은 간섭성 RNA (siRNA) (UbcH10-495, UbcH10-378, UbcH10-412)에 대한 서열을 디자인하였다. 각각의 siRNA는 일차적으로 2가지 세포주, 즉 T3M4 (췌장암으로부터 유도됨) 및 DLD-1 (결장직장암으로부터 유도됨)에서 시험하였다. 대조 siRNA가 아닌 UbcH10에 대해 표적화된 siRNA 3가지 모두는 UbcH10 단백질의 효율적인 감퇴를 제공하였으며, 이것은 세포 성장을 억제하는 그들의 능력과 상호관련이 있다. 이들 데이타는 UbsH10 siRNA의 특이성을 강조하는 것이며, 결과는 "오프-타겟 (off-target)" 효과에 기인하는 것이 아님을 시사한다. UbcH10-APC 복합체는 사이클린 B1 분해를 조절하기 때문에, 본 발명자들은 또한, UbcH10 무증상에 이어서 웨스턴 블럿 분석에 의해서 사이클린 B1의 양을 검사하였다. 본 발명자들의 결과는 siUbcH10으로 처리한 세포에서 UbcH10 단백질의 양과 사이클린 B1의 양 사이의 역상관관계를 나타내었다. 또한, siUbcH10 처리 후의 세포주기 분석은 본 기술분야에서 밝혀진 것과 일치하는 M-상에서의 정지를 나타내었다 (데이타는 나타내지 않음). 현미경적으로, UbcH10의 하향-조절은 아팝토시스성 물체의 라운딩 (rounding), 탈착, 핵 응축 또는 생성과 같이 아팝토시스를 나타내는 세포 형태학에서의 어떠한 변화도 유도하지 않았다. 또한, siUbcH10 처리는 웨스턴 블럿 분석 및 형광성 카스파제 활성 시험에 의해서 측정한 것으로서 두개의 수행체 (executioner) 카스파제인 카스파제-3 및 -7 (14)의 단백분해과정을 야기시키지 않았다.
하향-조절성 UbcH10은 표준 화학요법제의 효과에 대해 상가적이다: UbcH10은 대부분의 정상조직에 비해서 인간의 암에서 크게 과다발현된다. UbcH10을 표적화하는 치료적 잠재성을 측정하기 위해서 본 발명자들은 몇가지 공지된 화학요법제 및 UbcH10 무증상화에 이은 잠재적 종양-특이적 효과에 대해 분자적으로 표적화된 약제를 조사하였다. 이들 시험을 위해서, 본 발명자들은 미소관-안정화제인 파클리탁셀, 스핀들 (spindle) 억제제, 빈블라스틴, DNA 알킬화제, 미토마이신 c, 및 DR5/TRAIL-매개된 아팝토시스를 유발시킬 수 있는 기능적으로 작용적인 항체를 사용하여 다양한 작용기전을 갖는 약제들의 스펙트럼이 포함되도록 하였다. 두가지 췌장암 세포주인 T3M4 및 Panc-1, 및 안드로겐-비의존성 전립선암 세포주 CWR-RV1을 48시간 동안 siUbcH10으로 처리하고, 이어서 추가로 24시간 동안 빈블라스틴, 파클리탁셀, 미토마이신 c 및 항-DR5와 함께 배양하였다. 그 결과는 UbcH10 무증상 이후에 유사분열성 독물과 DNA-손상 약물의 공동-치료가 본 발명자들이 시험한 다수의 종양세포주에서 세포 생존능의 추가의 감소를 제공하였음을 나타낸다 (도 31). 48시간 동안 siUbcH10에 의한 암세포의 초기 치료는 생존세포의 양을 > 50％까지 감소시켰으며, 이것은 추가로 24시간 동안 세포독성제를 첨가함으로써 더 감소되었다. UbcH10-무증상화 세포의 수를 정규화시킨 후에 Ic50 또는 Ic90 농도는 동일하였으며, 이것은 상가적 효과를 나타내는 것이다. UbcH10에 대해 표적화된 3가지 비의존성 siRNA 모두는 T3M4 및 Panc-1 세포에서 TRAIL과 유사한 효과를 나타내었다. 데이타는 3개의 평균치이며, 4개의 비의존적 실험에서도 유사한 결과가 수득되었다.
하향-조절성 UbcH10은 TRAIL/DR5-매개된 세포 사멸에 대해서 세포를 감작시킨다. 원발성 인간 섬유아세포 (BJ), 인간 유방 상피세포 (HMEC) 및 T3M4 세포를 순차적으로 siUbcH10 (siUbcH10-495)로 48시간 동안 처리하고, 이어서 추가로 6시간 동안 기능성 항-DR5 항체 (500 ng/㎖)로 처리하였다. 형광 (FITC)-표지된 대조용 siRNA를 사용하여 BJ 및 HMEC 세포를 포함한 모든 세포주의 동등한 형질감염 효능을 보장하였다. 세포는 현미경으로 분석하였다. 결과는 도 31 및 32에서 나타내었다. 도면에 나타낸 바와 같이, siUbcH10에 의한 T3M4 및 Panc-1 세포의 전-처리는 siRNA 또는 항-DR5 처리 만을 행한 경우와 비교하여 항-DR5 항체에 의해서 유도된 아팝토시스를 현저하게 증가시킨 반면에, 이것은 TRAIL 무감성인 CWR-RV1 세포에서는 무시할 수 있는 효과를 가졌다 (도 31). 이 데이타는, 암세포주, 가장 현저하게는 T3M4를 항-DR5 항체와 함께 배양하고, 이어서 siUbcH10으로 처리하면 현격하게 증진된 아팝토시스가 나타났음을 시사하였다. 이것은 원발성 인간 피부 섬유아세포 (BJ) 또는 유방 상피세포 (HMEC)에서는 나타나지 않았다 (도 31 및 32). 정상세포뿐만 아니라 그밖의 다른 TRAIL 저항성 종양세포주는 UbcH10의 하향-조절에 의해서 TRAIL에 대해 민감하게 되지 못하였기 때문에, 이러한 관찰은 일반적인 현상을 반영하는 것으로 보인다.
실시예 59: Bax-결여성 종양세포에 대한 항-DR4 또는 항-DR5 효능제와 프로테아좀 억제제의 상승작용
복제 이상이 보정되지 않았기 때문에 DNA 복구 시스템에서의 결함 (미스매치 복구 (MMR))은 유전자 불안정성을 유도한다. 이러한 유형의 유전자 불안정성은 유전적으로 비-폴립증 (non-polyposis) 결장직장암 (HNPCC)의 악성 진행에서 주요 현상이며, 돌연변이 비율은 TGF베타RII 및 BAX 유전자에 함유된 것과 같은 짧은 반복성 서열에서 특히 높다. 따라서, 이들 종양에서 Bax 손실은 아팝토시스의 자연적 및 화학요법적 유도에 대해서 심각한 생존적 이점을 제공한다.
도 34는 Bax의 손실이 TRAIL 리간드에 대한 저항성을 부여하는 것을 나타낸다. 그러나, 프로테아좀 억제는 TRAIL에 대한 민감성을 복구시킨다. 펩티딜-기재 억제제인 MG-132 또는 MG262 또는 락타시스틴, 천연 화합물에 의한 프로테아좀 억제는 Bax가 결핍되어 있는 세포에서 TRAIL에 대한 민감성을 복구시킨다 (참조: 도 34).
프로테아좀 억제제는 미토콘드리아성 아팝토시스 경로에서의 결함을 회피한다. 세포의 형태에 따라서, 활성 카스파제-8은 직접적으로 카스파제-3과 같은 하류 효과기 카스파제의 활성화를 유도할 수 있다 (소위 I형-세포). II형-세포 (HCT116을 포함한 대부분의 세포)에서 두가지 기본형적 경로인 외부 (사멸-수용체) 및 내부 (미토콘드리아) 경로는 전-아팝토시스성 bcl-2 족 구성원인 Bid의 카스파제-8-매개된 절단에 의해서 상호연결되며, 이것은 사이토크롬 c와 SMAC의 미토콘드리아성 유리를 촉진시킨다. 일단 세포질 내로 유리되면, 사이토크롬 c는 "아팝토좀 (apoptosome)"을 형성하는 프로-카스파제-9 및 Apaf-1과 결합하며, 이것은 프로-카스파제-9의 활성화 및 이어서 카스파제-3-과 같은 효과기 카스파제의 활성화를 유도한다. 한편, 사이토졸 (cytosolic) SMAC는 IAP (아팝토시스의 억제제) 단백질 족의 구성원에 결합함으로써 카스파제-3 및 -9의 IAP 억제를 방지한다.
이들 현상은 TRAIL-처리된 Bax+/- 세포에서 웨스턴 블럿 분석에 의해서 용이하게 관찰되었다 (SMAC 및 사이토크롬-c 유리는 도시되지 않음)(참조: 도 34). 마찬가지로, TRAIL (T)로 처리된 Bax -/- 세포에서 카스파제-8 처리과정 및 Bid 처리과정은 정상으로 나타났으나, 카스파제-9 및 완전 카스파제-3 처리과정 및 성숙은 그렇지 않다 (레인 2, 3 및 4). Bax 손실은 Bid 절단 하류의 현상을 방지하는 것이기 때문에 예상되는 바와 같이, 이것은 Bid의 생성된 전-아팝토시스성 단편은 이들 현상을 위해서 Bax를 필요로 하기 때문이다. TRAIL (T) + MG-262 (M)는 미토콘드리아성 경로를 완전히 복구시킴으로써 세포 사멸을 유도하는 카스파제-9 및 카스파제-3 처리과정 및 활성화를 야기시킨다. MG-262 (M) 그 자체로는 이러한 단백분해적 단계에 효과를 갖지 않는다. 이들 및 그밖의 다른 데이타는, 프로테아좀 억제가 TRAIL 수용체 효능제에 의해서 유도된 아팝토시스에 대한 미토콘드리아성 아팝토시스 경로에서 결합을 함유하는 종양세포를 재감작시키는데 유용함을 시사하는 것이다.
전술한 본 발명은 이해를 명백히 할 목적으로 설명 및 실시예를 이용하여 다소 상세히 기술되어 있지만, 첨부된 특허청구범위의 의의 또는 범주를 벗어남이 없이 이들에 대한 어떤 변화 및 변형이 이루어질 수 있음은 본 발명의 지침에 비추어 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 쉽게 명백해 질 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌, 데이타베이스, 진뱅크 서열, 특히 및 특허출원은 각각이 참고로 포함되도록 구체적으로 및 개별적으로 나타낸 것처럼 본 발명에 참고로 포함되어 있다.

Claims (64)

  1. 암세포를 i) 항-DR4 또는 항-DR5 친화성제 효능제; 및 ii) 아팝토시스(apoptosis)-유도제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암세포에서 아팝토시스를 유도하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 효능제가 항-DR5 항체인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 항-DR5 항체가 도 24 또는 도 35에 도시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 도시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 결합 특이성을 갖는 것인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 항-DR5 항체가 도 24 또는 도 35에 도시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 도시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 항-DR5 항체가 항체 A (ATCC 기탁번호 )인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 효능제가 항-DR4 항체인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 세포를 항-DR4 항체 효능제 및 항-DR5 항체 효능제와 접촉시키는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 효능제가 인간화 항체인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 효능제가 단일쇄 항체인 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 유도제가 BCL-2의 발현을 방지 또는 감소시키는 것인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 유도제가 NFκB의 활성화를 방지하는 것인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 유도제가 IκB의 분해를 방지하는 것인 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 유도제가 프로테아좀 억제제인 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 프로테아좀 억제제가 PS-341, MG-262 및 MG-132로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 유도제가 아팝토시스 억제제 (IAP) 단백질의 억제제인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 억제제가 SMAC 또는 SMAC 모방체(mimetic)인 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 암세포가 결장암 세포 또는 췌장암 세포인 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 유도제가 PAK1의 길항제인 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 유도제가 nsurf 및 JIK로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드의 길항제인 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 유도제가 siRNA인 방법.
  21. 암세포에서의 아팝토시스 유도가 필요한 개체에게 치료 유효량의 i) 항-DR4 또는 항-DR5 친화성제 효능제; 및 ii) 아팝토시스-유도제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 암세포에서 아팝토시스를 유도하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 효능제 및 유도제를 개별적으로 투여하는 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 효능제 및 유도제를 혼합물로 투여하는 방법.
  24. 제 21 항에 있어서, 효능제가 항-DR5 항체인 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 항-DR5 항체가 도 24 또는 도 35에 도시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 도시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 결합 특이성을 갖는 것인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 항-DR5 항체가 도 24 또는 도 35에 도시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 도시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 항-DR5 항체가 항체 A (ATCC 기탁번호 )인 방법.
  28. 제 21 항에 있어서, 효능제가 항-DR4 항체인 방법.
  29. 제 21 항에 있어서, 세포를 항-DR4 항체 효능제 및 항-DR5 항체 효능제와 접촉시키는 방법.
  30. 제 21 항에 있어서, 효능제가 인간화 항체인 방법.
  31. 제 21 항에 있어서, 효능제가 단일쇄 항체인 방법.
  32. 제 21 항에 있어서, 유도제가 BCL-2 또는 UbcH10의 발현을 방지 또는 감소시키는 것인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 유도제가 NFκB의 활성화를 방지하는 것인 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 유도제가 IκB의 분해를 방지하는 것인 방법.
  35. 제 21 항에 있어서, 유도제가 프로테아좀 억제제인 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 프로테아좀 억제제가 PS-341, MG-262 및 MG-132로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  37. 제 21 항에 있어서, 유도제가 아팝토시스 억제제 (IAP) 단백질의 억제제인 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 억제제가 SMAC 또는 SMAC 모방체인 방법.
  39. 제 21 항에 있어서, 암세포가 결장암 세포 또는 췌장암 세포인 방법.
  40. 제 21 항에 있어서, 유도제가 PAK1의 길항제인 방법.
  41. 제 21 항에 있어서, 유도제가 UbcH10, nsurf 및 JIK로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드의 길항제인 방법.
  42. 제 21 항에 있어서, 유도제가 siRNA인 방법.
  43. 치료 유효량의 i) 항-DR4 또는 항-DR5 친화성제 효능제; 및 ii) 아팝토시스-유도제를 포함하는 생리적 조성물.
  44. 제 43 항에 있어서, 효능제가 항-DR5 항체인 생리적 조성물.
  45. 제 44 항에 있어서, 항-DR5 항체가 도 24 또는 도 35에 도시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 도시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 결합 특이성을 갖는 것인 생리적 조성물.
  46. 제 45 항에 있어서, 항-DR5 항체가 도 24 또는 도 35에 도시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 도시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 생리적 조성물.
  47. 제 46 항에 있어서, 항-DR5 항체가 항체 A (ATCC 기탁번호 )인 생리적 조성물.
  48. 제 43 항에 있어서, 효능제가 항-DR4 항체인 생리적 조성물.
  49. 제 43 항에 있어서, 세포를 항-DR4 항체 효능제 및 항-DR5 항체 효능제와 접촉시키는 조성물.
  50. 제 43 항에 있어서, 효능제가 인간화 항체인 생리적 조성물.
  51. 제 43 항에 있어서, 효능제가 단일쇄 항체인 생리적 조성물.
  52. 제 43 항에 있어서, 유도제가 BCL-2 또는 UbcH10의 발현을 방지 또는 감소시키는 것인 생리적 조성물.
  53. 제 52 항에 있어서, 유도제가 NFκB의 활성화를 방지하는 것인 생리적 조성물.
  54. 제 53 항에 있어서, 유도제가 IκB의 분해를 방지하는 것인 생리적 조성물.
  55. 제 43 항에 있어서, 유도제가 프로테아좀 억제제인 생리적 조성물.
  56. 제 43 항에 있어서, 유도제가 아팝토시스 억제제 (IAP) 단백질의 억제제인 생리적 조성물.
  57. 제 56 항에 있어서, 억제제가 SMAC 또는 SMAC 모방체인 생리적 조성물.
  58. 제 43 항에 있어서, 유도제가 PAK1의 길항제인 생리적 조성물.
  59. 제 43 항에 있어서, 유도제가 UbcH10, nsurf 및 JIK로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드의 길항제인 생리적 조성물.
  60. 제 43 항에 있어서, 유도제가 siRNA인 생리적 조성물.
  61. 도 24 또는 도 35에 도시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 도시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 결합 특이성을 갖는 친화성제.
  62. 제 62 항에 있어서, 도 24 또는 도 35에 도시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 도시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체인 친화성제.
  63. 제 62 항의 항체를 발현하는 세포.
  64. 세포를, 도 24 또는 도 35에 도시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 도 25 또는 도 35에 도시된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 결합특이성을 갖는 친화성체와 접촉시키는 것을 포함하는, 암세포에서 아팝토시스를 유도하는 방법.
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