TWI756633B - 具有改善的同質性的抗體－藥物綴合物、其藥物組合物、用途和製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及用於製備具有改善的同質性的抗體-藥物綴合物(ADC)的可應用的生物綴合方法。與常規綴合方法相比，由該生物綴合方法製備的抗體-藥物綴合物(ADC)產物的同質性可以顯著改善。特別是，在藉由本發明的方法製備的ADC中，D0+D8的含量低於10wt%並且D6的含量低於10wt%。此外，D4的含量通常高於65wt%，例如高於70wt%，和高於77wt%，而在藉由常規綴合方法製備的ADC中D4含量通常低於40wt%。

Description

具有改善的同質性的抗體-藥物綴合物、其藥物組合物、 用途和製備方法 優先權資訊
本申請要求於2019年2月15日提交的PCT/CN2019/075217的權益，其藉由引用完全結合在本文中。
本發明涉及一種製備抗體-藥物綴合物(ADC)的方法。具體地，本發明涉及用於製備具有改善的同質性的抗體-藥物綴合物(ADC)的生物綴合方法。
抗體對於靶細胞和分子表面上的特定抗原的特異性已使它們被廣泛用作各種各樣的診斷劑和治療劑的載體。例如，與標記物和報導基團如螢光團、放射性同位素和酶綴合的抗體用在標記和成像應用中，同時與細胞毒性劑和化療劑的綴合允許將這些藥劑標靶遞送至特定組織或結構，例如特定細胞類型或生長因數，將對於正常健康組織的影響最小化，並且顯著降低與化療相關的副作用。抗體-藥物綴合物(ADC)是抗體和藥物的綴合物，並且在數個疾病領域中、特別是在癌症中具有廣泛的潛在治療應用，並且成為用於疾病治療的新的標靶藥物。ADC含有用於標靶的抗體、用於藥物連接的連接物或接頭和作為效應物的高效力有效負載(例如，藥物)。自從US FDA在2011年批准Adcetris和在2013年批准Kadcyla，ADC藥物開發已經廣泛擴展用於治療癌症。
特別地，抗體-藥物綴合物(ADC)是一類重要的高度有效的生物製藥學藥物，其設計作為標靶療法用於治療癌症受試者。ADC是複雜分子，由與生物學活性的細胞毒性(例如，抗癌)藥物連接的抗體組成。ADC將抗體和細胞毒性藥物兩者的理想性質組合：將有效的細胞毒性藥物標靶表達抗原的細胞，由此增強其標靶細胞毒性活性。與傳統的化學治療劑藥物相比，抗體-藥物綴合物僅標靶癌細胞，由此健康細胞受到影響的嚴重性較低(Dijoseph,JF；Armellino,DC；Boghaert,ER；Khandke,K；Dougher,MM；Sridharan,L；Kunz,A；Hamann,PR；Gorovits,B；Udata,C；Moran,JK；Popplewell,AG；Stephens,S；Frost,P；Damle,NK(2004)，“Antibody-targeted chemotherapy with CMC-544：A CD22-targeted immunoconjugate of calicheamicin for the treatment of B-lymphoid malignancies(使用CMC-544的抗體標靶化療：用於治療B-淋巴細胞惡性腫瘤的標靶CD22的卡奇黴素的免疫綴合物)”.Blood.103(5)：1807-14，和Mullard,Asher(2013)，“Maturing antibody-drug conjugate pipeline hits 30(將抗體-藥物綴合物管線成熟化達到30)”Nature Reviews Drug Discovery.12(5)：329-32.)。
在開發抗體-藥物綴合物過程中，將抗癌藥物與抗體偶聯，該抗體特異性地標靶某個腫瘤標記物(例如，理想地僅在腫瘤細胞之中或之上發現的蛋白)。抗體追蹤體內的這些蛋白並且將它們自身附著於癌細胞表面。抗體和靶蛋白(即，抗原)之間的生物化學反應觸發了腫瘤細胞中的信號，其然後將抗體以及細胞毒素一起吸收或內化。在ADC被內化後，細胞毒性藥物被釋放並且殺死腫瘤細胞(Chari,Ravi V.J.；Martell,Bridget A.；Gross,Jonathan L.；Cook,Sherrilyn B.；Shah,Sudhir A.；Blättler,Walter A.；McKenzie,Sara J.；Goldmacher,Victor S.(1992)，“Immunoconjugates containing novel maytansinoids: promising anticancer drugs（含有新的美登素類化合物的免疫綴合物：有希望的抗癌藥物）”. Cancer Research. 52 (1): 127–31.)。由於這種標靶，所以理想地ADC具有比其他化學治療劑更低的副作用並且提供更寬的治療窗。
對於藥物連接，利用對於抗體和接頭-有效負載（即，接頭-藥物）兩者都具有高度反應性和穩定性的官能團進行偶聯，以形成穩定的共價鍵。常規的連接方式，即將藥物部分與抗體經由接頭共價結合，通常導致異質分子混合物，其中藥物部分連接在抗體的數個位點上。例如，細胞毒性藥物已經典型地藉由抗體中通常含有的複數賴氨酸殘基綴合於抗體，產生異質的抗體-藥物綴合物混合物。
例如，抗體-藥物綴合物通常藉由兩種常規化學策略產生：基於賴氨酸的綴合和基於半胱氨酸的綴合，該半胱氨酸來自鏈間硫鍵還原。對於賴氨酸殘基上的伯胺基團的反應而言，最廣泛使用的接頭-有效負載上的連接物是NHS酯（即，N-羥基琥珀醯亞胺）。但是NHS酯在抗體-藥物綴合物生產中的應用受限於其固有性質，例如NHS酯和伯胺之間的反應在酸性條件下非常慢，因此綴合需要在高pH值(即>7.0 )的緩衝液中進行，然而高pH值對於抗體有時並不友好，並且NHS傾向於在鹼性條件下水解，這使得綴合後游離藥物的純化和鑒定變得更複雜。此外，由於NHS酯與抗體上的伯胺的低反應性，反應需要在高溫(即22℃)下進行。此外，由於低溶解度，藉由NHS酯(即SMCC-DM1)製備的接頭-有效負載需要更多的有機溶劑來完全溶解於反應體系中，這增加了抗體聚集的風險。對於基於來自鏈間硫鍵還原的半胱氨酸的綴合，它包括在各種還原劑（如TCEP, DTT等等）的存在下打開鏈間二硫鍵的步驟，接著發生巰基的親核反應。在該綴合過程中，抗體-藥物綴合物典型地如下形成：將一個或複數抗體半胱氨酸巰基與一個或複數與藥物結合的接頭部分綴合，由此形成抗體-接頭-藥物複合物。與大多數胺（其在pH 7附近質子化和較不親核）不同，半胱氨酸巰基在中性pH下具有反應性。由於游離巰基（RSH，硫氫基）基團相對具有反應性，所以具有半胱氨酸的蛋白經常以它們的氧化形式作為二硫鍵連接的寡聚物存在或者具有內部橋連的二硫鍵。與抗體胺或羥基相比，抗體半胱氨酸巰基對於親電綴合試劑通常是更具反應性的，即更親核的。藉由將蛋白的複數氨基酸殘基突變為半胱氨酸而對半胱氨酸巰基進行改造是可能有問題的，特別是在未配對的（游離Cys）殘基或對於反應或氧化而言相對可及的那些的情況下。在濃縮的蛋白溶液中，無論在大腸桿菌的周質、培養物上清液，還是部分或完全純化的蛋白中，蛋白表面上的未配對的Cys殘基可以配對和氧化以形成分子間二硫鍵，並且因此可以形成蛋白二聚體或多聚體形式。二硫鍵二聚體形成使得新Cys對於與藥物、配體或其他標記的綴合不起反應。此外，如果蛋白在新改造的Cys和已有的Cys殘基之間氧化形成分子內二硫鍵，則兩個Cys基團都不能用於活性位點參與和相互作用。另外，藉由錯誤折疊或者喪失三級結構，可以使得蛋白無活性或者非特異性的(Zhang 等 (2002) Anal. Biochem. 311: 1-9)。
開發新的作為治療劑的ADC是非常重要的。然而，常規的綴合方法總是導致異質分子混合物，其中藥物部分連接於抗體上的數個位點。取決於反應條件，異質混合物典型地含有具有從0至約8或更多的連接的藥物部分的抗體分佈。另外，在具有特定整數比率的藥物部分/單個抗體的每個綴合物亞類中，存在其中藥物部分與抗體的各個位元點連接的潛在的異質混合物。分析和製備方法不足以分離和表徵由綴合反應獲得的異質混合物中抗體-藥物綴合物種類。異質混合物是如此複雜以致於表徵和純化是困難和昂貴的。在這樣的混合物中的每個綴合產物可能具有不同藥動學、分佈、毒性和功效曲線，並且非特異性綴合還經常導致受損的抗體功能。抗體是大的複雜的和結構多樣的生物分子，經常具有許多反應性官能團。抗體與接頭試劑和藥物-接頭中間體的反應性取決於諸如pH、濃度、鹽濃度和助溶劑的因素。此外，由於控制反應條件和表徵反應物和中間體的困難，多步綴合方法可能是不可重複的。
抗體-藥物綴合物典型地如下形成：將一個或複數抗體半胱氨酸巰基與一個或複數與藥物結合的接頭部分綴合，由此形成抗體-接頭-藥物複合物。與大多數胺（其在pH 7附近質子化和較不親核）不同，半胱氨酸巰基在中性pH下具有反應性。由於游離巰基（RSH，硫氫基）基團相對具有反應性，所以具有半胱氨酸的蛋白經常以它們的氧化形式作為二硫鍵連接的寡聚物存在或者具有內部橋連的二硫鍵。與抗體胺或羥基相比，抗體半胱氨酸巰基對於親電綴合試劑通常是更具反應性的，即更親核的。藉由將蛋白的複數氨基酸殘基突變為半胱氨酸而對半胱氨酸巰基進行改造是可能有問題的，特別是在未配對的（游離Cys）殘基或對於反應或氧化而言相對可及的那些的情況下。在濃縮的蛋白溶液中，無論在大腸桿菌的周質、培養物上清液，還是部分或完全純化的蛋白中，蛋白表面上的未配對的Cys殘基可以配對和氧化以形成分子間二硫鍵，並且因此可以形成蛋白二聚體或多聚體。二硫鍵二聚體形成使得新Cys對於與藥物、配體或其他標記的綴合不起反應。此外，如果蛋白在新改造的Cys和已有的Cys殘基之間氧化形成分子內二硫鍵，則兩個Cys基團都不能用於活性位點參與和相互作用。另外，藉由錯誤折疊或者喪失三級結構，可以使得蛋白無活性或者非特異性的(Zhang 等 (2002) Anal. Biochem. 311: 1-9)。
此外，與單個抗體分子偶聯的藥物的數目是獲得的ADC的功效和安全性的一個重要因素。例如，在基於天然鏈間二硫鍵還原的綴合方法中，鏈間S-S鍵比其他二硫鍵對於溶劑更可及。因此，鏈間二硫鍵可以用作藥物(或藥物-接頭)與抗體偶聯的結合位點。通常，屬於IgG1或IgG4亞類的一個治療劑抗體分子具有4個鏈間S-S鍵，每個由兩個-SH基團形成，因此與單個抗體分子偶聯的藥物的數目是2、4、6或8。如果與單個抗體分子偶聯的藥物的數目是0，則產物稱為D0。因此，D2是指兩個藥物分子與一個單個抗體分子偶聯的ADC，其中兩個藥物分子可以與藉由還原重鏈和輕鏈之間的S-S鍵產生的-SH基團偶聯，或者可以與藉由還原重鏈和重鏈之間的S-S鍵產生的-SH基團偶聯。D4是指其中四個藥物分子與一個單個抗體分子偶聯的ADC。D6是指其中六個藥物分子與一個單個抗體分子偶聯的ADC。並且D8是指其中八個藥物分子與一個單個抗體分子偶聯的ADC，即一個抗體分子中的所有四個S-S鍵被還原成八個-SH基團並且每個-SH基團連接一個藥物分子。通常，藉由常規綴合方法產生的ADC分子的異質混合物是D0、D2、D4、D6和D8的混合物。本領域公知，異質ADC產物通常是不穩定的並且具有低免疫原性。它們之中，D0不具有ADC功效，並且由於它們的由有效負載 (即藥物)分子誘導的疏水性，D6+D8被認為是不穩定性和低免疫原性的原因。儘管抗體-藥物綴合物體外功效已經顯示直接依賴於藥物負載(Hamblett KJ等, Clin Cancer Res. 2004 Oct 15；10(20):7063-70)，但是每分子具有四個藥物的抗體-藥物綴合物(D4)的體內抗腫瘤活性比得上相同mAb劑量的每分子具有八個藥物的綴合物(D8)，即使該綴合物每個mAb含有一半量的藥物。藥物-負載還影響血漿清除，D8綴合物的清除是D4綴合物的3倍快，並且是D2綴合物的5倍快。通常，D4的水準代表了抗體-藥物綴合物的同質性。即，如果D4在混合物中的含量高，則ADC被認為具有高同質性。具有改善的同質性的抗體-藥物綴合物提供了治療益處，例如較高的治療指數，改善功效和降低藥物毒性。同質抗體綴合物還提供了診斷和成像應用中更準確和一致的測量。因此，製備具有高同質性的ADC的新方法是高度理想的和長期追求的。
對於最佳化功效和確保劑量之間恆定，重要的是每個抗體的綴合藥物部分的數目相同並且每個部分與每個抗體中相同氨基酸殘基特異性綴合。因此，已經開發了許多方法來改善抗體-藥物綴合物的同質性。在這方面，數種位元點特異性標記技術已經被開發和應用於製備用於臨床前和臨床研究的ADC。例如，已經開發了改善的抗體-藥物綴合物THIOMAB™，其藉由在以下位點的半胱氨酸置換提供了藥物與抗體的位點特異性綴合，在該位點改造的半胱氨酸可用於綴合但是不干擾免疫蛋白折疊和組裝或者不改變抗原結合和效應子功能(Junutula等, 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932； Dornan等 (2009) Blood 114(13):2721-2729； US 7521541； US 7723485； WO2009/052249)。這些THIOMAB™抗體然後可以藉由改造的半胱氨酸巰基綴合於細胞毒性藥物，以獲得具有一致的化學計量的THIOMAB™ 藥物綴合物 (TDC)（例如，在具有單個改造的半胱氨酸位點的抗體中每個抗體可達2個藥物）。使用針對不同抗原的複數抗體的研究已經顯示，在異種移植物模型中TDC與常規的抗體-藥物綴合物一樣有效，並且在相關臨床前模型中耐受更高劑量。已經改造THIOMAB™抗體，用以將藥物連接於抗體的不同位置（例如，輕鏈-Fab、重鏈-Fab和重鏈-Fc內的特定氨基酸位置（即位點））。由於它們的同質性和與細胞毒性藥物的位點特異性綴合，THIOMAB™抗體的體外和體內穩定性、功效和PK性質提供了相對於常規抗體-藥物綴合物的獨特優勢。然而，那些技術涉及蛋白改造和/或酶催化，因而那些技術具有一些缺點，諸如抗體表達水準低，純化複雜和成本高。
WO 2006/065533認識到抗體-藥物綴合物的治療指數可以藉由將抗體的藥物負載化學計量降低至低於8個藥物分子/抗體來改善，並且揭露了具有用於化學計量藥物連接的預定位點的改造的抗體。參與鏈間二硫鍵形成的親本抗體的8個半胱氨酸殘基各自用另一個氨基酸殘基系統地替換，以產生具有6、4或2個剩餘的可及半胱氨酸殘基的抗體變體。具有4個剩餘半胱氨酸殘基的抗體變體然後用於產生顯示確定化學計量(4個藥物/抗體)和藥物連接位元點的綴合物，其顯示與先前方法獲得的更異質的“部分負載的”4個藥物/抗體綴合物相似的抗原結合親和力和細胞毒性活性。儘管WO 2006/065533的抗體產生具有改善的收率的同質綴合物，但是認為天然鏈間二硫鍵的消除可以破壞抗體的四級結構，由此擾亂抗體的體內行為，包括改變抗體的效應子功能(Junutula JR等，Nat Biotechnol. 2008 Aug；26(8):925-32)。
WO 2008/141044涉及其中抗體的一個或複數氨基酸被半胱氨酸氨基酸置換的抗體變體。該改造的半胱氨酸氨基酸殘基是游離氨基酸並且不是鏈內或鏈間二硫鍵的一部分，允許藥物以確定的化學計量和在不破壞天然二硫鍵的情況下綴合。然而，仍然存在以下風險：將游離半胱氨酸殘基改造到抗體分子中可能導致在抗體折疊和組裝期間的重排和與分子中現有半胱氨酸殘基的混雜反應，或者藉由與另一個抗體分子中的游離半胱氨酸殘基的反應而導致二聚化，導致受損的抗體功能或聚集。
因此，存在對於開發新的生物綴合方法的持續需要，該新的生物綴合方法能夠產生具有改善的同質性的ADC並且具有簡單的操作和降低的成本。
本發明的目的是開發新的生物綴合方法，該方法能夠產生具有改善的同質性的ADC並且具有簡單的操作和降低的成本。藉由本發明的生物綴合方法產生的具有改善的同質性的ADC進一步具有最佳化的安全性和功效。
本發明涉及用於製備具有改善的同質性的抗體-藥物綴合物 (ADC)的新的生物綴合方法。與涉及使用還原劑和巰基的親核反應的常規綴合方法相比，由本發明的生物綴合方法產生的抗體-藥物綴合物(ADC)的同質性可以得到顯著改善。
用於製備具有改善的同質性的抗體-藥物綴合物 (ADC)的生物綴合方法包括以下步驟： (a) 將還原劑 (例如，三(2-羧乙基)膦(TCEP))和待綴合的抗體在有效量的過渡金屬離子(例如，Zn2+ 等)的存在下在緩衝體系(例如，Hepes、組氨酸緩衝液、PBS、MES等)中溫育，以選擇性地還原抗體內鏈間二硫鍵； (b) 將過量的攜帶有反應性基團的有效負載（例如，馬來醯亞胺連接的藥物）與步驟(a)得到的還原的巰基基團反應；以及 (c) 加入有效量的氧化劑(例如，脫氫抗壞血酸(DHAA))以將未反應的巰基再氧化，然後回收獲得的抗體-藥物綴合物。
在本發明中，過渡金屬離子產生二硫鍵還原中的選擇性。在過渡金屬離子的存在下，Fab區域中的兩個鏈間S-S鍵被選擇性還原。因此，四個攜帶反應性基團的有效負載(即四個藥物-接頭複合物)與一個抗體連接以形成D4。在獲得的ADC中高含量的D4無疑改善了ADC的同質性。
還原劑可以是TCEP。反應溶液中還原劑的濃度可以是0.04 mM– 0.4 mM。步驟(c)中加入的氧化劑可以是DHAA。反應溶液中氧化劑的濃度可以是0.08mM– 0.8 mM。
適合用於本發明的生物綴合方法中的過渡金屬離子可以包括但不限於Zn2+ 、Cd2+ 、Hg2+ 等。其中，由於其容易可獲得和低成本，使用Zn2+ 。例如，在步驟(a)中可以加入適當的過渡金屬鹽，只要它們在反應溶液中可溶以便游離過渡金屬離子可以釋放到反應溶液中即可。在這方面，作為適當的鋅鹽可以提及ZnCl2 、Zn(NO3 )2 、ZnSO4 、Zn(CH3 COO)2 、ZnI2 、ZnBr2 、甲酸鋅和四氟硼酸鋅。同樣，可以提及在反應溶液中可溶並且可以釋放游離Cd2+ 或Hg2+ 離子的其他過渡金屬鹽，其可以包括但不限於：CdCl2 、 Cd(NO3 )2 、CdSO4 、Cd(CH3 COO)2 、CdI2 、CdBr2 、甲酸鎘、和四氟硼酸鎘； HgCl2 、Hg(NO3 )2 、HgSO4 、Hg(CH3 COO)2 、HgBr2 、甲酸汞(II) 、和四氟硼酸汞(II)； 等等。
在一個實施方案中，步驟(a)中過渡金屬離子的濃度為0.01mM – 0.2 mM。
藉由使用EDTA作為螯合劑，在純化步驟中去除過渡金屬離子，該螯合劑將在隨後的滲析、超濾或凝膠過濾中濾去。
取決於過渡金屬離子，對於步驟(a)中的反應，本領域技術人員可以選擇適當的緩衝體系，包括但不限於Hepes、組氨酸緩衝液、PBS、MES等。
反應的最適pH將典型地在大約5.5和大約8之間，例如約5.5至7.5。最適反應條件當然將取決於所採用的特定反應物。
基於待綴合的特定抗體，本領域技術人員可以確定溫育時間和溫度。反應的最適溫度可以典型地在大約-10℃和37℃之間。例如，反應可以在大約0℃和20℃之間的溫度下過夜進行。
對於可以藉由使用本發明的生物綴合方法與接頭-藥物綴合的抗體，沒有特別限制。抗體的選擇取決於藉由抗體-藥物綴合物 (ADC)治療的疾病或病症(例如，癌症)。抗體可以特異性地結合在癌細胞上表達的相應的抗原(也稱為腫瘤相關抗原(TAA))、病毒抗原或微生物抗原，具有抗體依賴性細胞介導的吞噬作用(ADCP)活性，並且具有體內抗腫瘤、抗病毒或抗微生物活性。抗體中的鏈間S-S鍵是連接藥物-接頭複合物的位點。
在一些實施方案中，抗體可以包括但不限於單殖株抗體或多殖株抗體。抗體的具體實例包括人抗體，人源化抗體或嵌合抗體。在某些實施方案中，抗體是單殖株抗體，例如，人抗體或人源化抗體。作為本發明抗體的同種型，可以例舉例如IgG (IgG1、IgG2、IgG3 、或IgG4)。在一個具體實施方案中，抗體是IgG1單殖株抗體。在另一個具體實施方案中，抗體是IgG4單殖株抗體。例如，在實施例中例舉的三種抗體，Herceptin (曲妥珠單抗)，Rituxan (利妥昔單抗)和Erbitux (西妥昔單抗)是代表性的IgG1型抗體。實施例的結果顯示，本發明的生物綴合方法至少適用於IgG1型抗體。此外，本發明的生物綴合方法還可適合於IgG4型抗體。
對於待綴合到所選抗體上的攜帶反應性基團的有效負載，其通常具有藥物-接頭的形式。對於可以用於本發明的生物綴合方法中的藥物和接頭沒有特別限制，只要藥物分子具有所需的（例如，細胞毒性、抗腫瘤，或標記等）效果和具有允許與接頭結構連接的至少一個取代基團或部分結構，並且該接頭含有至少兩個反應性基團，其中一個可以共價結合藥物分子並且另一個能夠共價偶聯抗體。
本領域已知的各種各樣的診斷劑、治療劑和標記劑已經與抗體分子綴合。例如，在最廣泛意義上，待綴合的藥物可以包括診斷劑，藥物分子，例如，細胞毒性劑，毒素，放射性核素，螢光劑(例如胺衍生的螢光探針諸如5-二甲基氨基萘-1-(N-(2-氨基乙基))磺醯胺-丹醯乙二胺, Oregon Green® 488屍胺(cadaverine) (目錄號O-10465, Molecular Probes), 丹磺醯屍胺, N-(2-氨乙基)-4-氨基-3,6-二硫-l,8-萘亞胺, 二鉀鹽(螢光黃乙二胺), 或羅丹明B乙二胺(目錄號L- 2424, Molecular Probes), 或巰基衍生化螢光探針例如BODIPY® FLL-半胱氨酸(目錄號B-20340, Molecular Probes))。
取決於所需藥物和所選接頭，本領域技術人員可以選擇適當的方法將它們偶聯在一起。例如，一些常規的偶聯方法，諸如胺偶聯法，可以用於形成所需的藥物-接頭複合物，其仍然含有用於藉由共價連接與抗體綴合的反應性基團。將藥物-馬來醯亞胺複合物 (即馬來醯亞胺連接的藥物)當作本發明中攜帶反應性基團的有效負載的一個實例。該藥物可以包括但不限於細胞毒性劑，諸如化療劑、免疫治療劑等、抗病毒劑或抗微生物劑。最常見的能夠在ADC製備中與巰基鍵合的反應性基團是馬來醯亞胺。另外，還經常使用有機溴化物、碘化物。
對於步驟(c)，本領域技術人員能夠選擇適當的純化方法來回收獲得的抗體-藥物綴合物。本領域公知許多ADC純化方法。例如，獲得的抗體-藥物綴合物可以藉由使用脫鹽柱、尺寸排阻層析等進行純化。
藉由使用相同步驟而在步驟(a)中不加入過渡金屬離子的綴合方法作為陰性對照(參見US7659241B2)，本發明人成功地證明瞭過渡金屬離子是負責獲得的ADC中高水準的D4和低水準的D0、D6和D8的關鍵因素。此外，本發明人還證實該新方法產生了具有高Fab偏好性的ADC產物。該方法已經用數種商業治療劑抗體進行了證實並且顯示出極大的一致性。
藉由使用本發明的生產抗體-藥物綴合物的方法，抗體-藥物綴合物的同質性高於藉由常規綴合方法生產的那些。具體地，在藉由本發明的方法製備的ADC中，D0+D8的含量低於10wt%並且D6的含量低於10wt%。此外，D4的含量通常超過65wt%，並且例如超過70wt%，而在藉由常規綴合方法製備的ADC中D4的含量通常低於40 wt%。
本發明的方法迴避了對蛋白改造或酶催化的任何需要，而是基於天然的鏈間二硫鍵和僅需要過渡金屬離子。因此，與常規的製備ADC的方法相比，本發明的方法複雜性較低，並且得到的抗體-藥物綴合物的同質性顯著改善，並且成本大大降低。
本發明的上述和其他特徵將從以下參考附圖進行的數個實施方案的詳述中變得更明顯。
儘管本發明可以以許多不同形式實現，但是本文揭露的是其具體闡述的實施方案，其例舉了本發明的原理。應當強調的是本發明不限於闡述的具體實施方案。此外，本文所用的任何區段標題僅僅是用於組織目的，而不應理解為限制所描述的主題。
通常，與本文所述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白和核酸化學和雜交連同使用的命名和技術是本領域公知和常用的那些。除非另外指出，本發明的方法和技術通常根據本領域公知的以及如貫穿本說明書引用和討論的各個一般和更具體的參考文獻中所述的常規方法進行。參見，例如Abbas 等, Cellular and Molecular Immunology, 第6版, W.B. Saunders Company (2010)； Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 冷泉港, N.Y. (2000)； Ausubel 等, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002)； Harlow and Lane Using Antibody: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 冷泉港, N.Y. (1998)； 和Coligan 等, Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)。與本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥物化學連同使用的命名和實驗室步驟與技術是本領域公知和常用的那些。此外，本文使用的任何小節標題僅僅是用於結構組織目的，而不應理解為限制所描述的主題。 定義
為了更好地理解本發明，以下提供了相關術語的定義和解釋。
除非另外指出，與本發明結合使用的科學術語和技術術語應當具有本領域普通技術人員通常理解的意思。此外，除非上下文另外要求，單數術語應當包括複數並且複數術語應當包括單個。更具體地，如本說明書和後附請求項中使用，單數形式“一個”、“一種”和“該”包括複數所指物，除非上下文有其他明確規定。因此，例如，對於“一種抗體”的指代包括複數抗體；對於“一種過渡金屬離子”的指代包括過渡金屬離子的混合物，等等。在本申請中，“或”的使用是指“和/或”，除非另外指出。
貫穿本申請，除非上下文有其他要求，措詞“包括”、“包含”和“含有”應當理解為暗含包括該步驟或元素或一組步驟或元素，但是不排除任何其他步驟或元素或一組步驟或元素。“由…組成”是指包括並且局限於短語“由…組成”後跟著的元素。因此，短語“由…組成”表示所列元素是必需的或強制性的，並且不可以存在其他元素。“基本上由…組成”是指包括該短語後列出的任何元素，並且限制於不干擾或促進在本發明中對於所列元素指定的活性或作用的其他元素。因此，短語“基本上由…組成”表示所列元素是必需的或強制性的，但是其他元素是任選的並且可以存在或可以不存在，這取決於它們是否影響所列元素的活性或作用。
如本文所用，術語“約”或“近似”是指一個數量、水準、值、數量、頻率、百分比、維度、尺寸、量、重量或長度，其相對於參考數量、水準、值、數量、頻率、百分比、維度、尺寸、量、重量或長度變化可達30%、25%、20%、25%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在具體實施方案中，術語“約”或“近似”在數值之前時表示該值加或減15%、10%、5%或1%的範圍。
貫穿本發明對於“一個實施方案”、“一個具體實施方案”、“一個相關實施方案”、“某個實施方案”、“另外的實施方案”或“另一個實施方案”或它們的組合的指代是指連同該實施方案描述的具體特徵、結構或特點被包括在本發明的至少一個實施方案中。因此，上述短語在整個本說明書的各個位置的出現並不一定都是指相同的實施方案。此外，該具體特徵、結構或特點可以以任何適當方式在一個或複數實施方案中組合。
“抗體-藥物綴合物”或ADC是指藉由將藥物與抗體經由一個或複數適當的接頭直接或間接共價偶聯形成的綴合物。ADC通常為“抗體-接頭-藥物綴合物”的形式。抗體-藥物綴合物將抗體和細胞毒性藥物兩者的理想性質結合，藉由將有效的細胞毒性藥物標靶表達抗原的腫瘤細胞，由此增強它們的抗腫瘤活性。
本文所用的術語“藥物”是指具有抗腫瘤效果和允許連接至接頭結構的至少一個取代基團或部分結構的任何細胞毒性分子。藥物可以殺死癌細胞和/或抑制癌細胞的生長、增殖或轉移，由此減少、緩解或消除疾病或病症的一個或複數症狀。
本文所用的術語“接頭”是指這樣的反應性分子，其含有至少兩個反應性基團，其中一個可以共價鍵合至藥物分子並且另一個可以共價偶聯至抗體。
本文所用的術語“抗體”包括與特定抗原結合的任何免疫球蛋白、單殖株抗體、多殖株抗體、多特異性抗體、或雙特異性（二價）抗體。天然完整抗體包括兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈由可變區(“HCVR”)和第一、第二和第三恆定區(CH1, CH2和CH3)組成，而每條輕鏈由可變區(“LCVR”)和恆定區(CL)組成。哺乳動物重鏈分類為α、δ、ε、γ和μ，並且哺乳動物輕鏈分類為λ或κ。抗體具有“Y”形，其中Y的莖幹由經由二硫鍵結合在一起的兩條重鏈的第二和第三恆定區組成。Y的每個臂包括單個重鏈的可變區和第一恆定區以及與該單個重鏈結合的單個輕鏈的可變區和恆定區。輕鏈和重鏈的可變區負責抗原結合。兩條鏈中的可變區通常含有三個高度可變的環，稱為互補性決定區 (CDR) (輕(L)鏈CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3, 重(H)鏈CDR包括HCDR1、HCDR2和HCDR3)。抗體的CDR界限可以藉由Kabat, Chothia, 或Al-Lazikani規則定義或鑒定(Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997)； Chothia, C. 等, J Mol Biol. Dec 5；186(3):651-63 (1985)； Chothia, C.和Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987)； Chothia, C. 等, Nature. Dec 21-28； 342(6252):877-83 (1989)； Kabat E.A. 等, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。三個CDR介於相鄰的稱為構架區(FR)的區段之間，該構架區比CDR更高度保守並且形成支架來支持高度可變環。每個HCVR和LCVR包括四個FR，並且CDR和FR從氨基端至羧基端按如下順序排列: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4。重鏈和輕鏈的恆定區不參與抗原結合，而是顯示各種效應子功能。抗體基於它們重鏈的恆定區的氨基酸序列被指定為各種類別。抗體的五種主要類別或同種型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分別藉由α、δ、ε、γ和μ重鏈的存在來表徵。數種主要抗體類別被分成諸如以下的亞類：IgG1 (γ1重鏈) ，IgG2 (γ2重鏈) ，IgG3 (γ3重鏈) ， IgG4 (γ4重鏈) ， IgA1 (α1重鏈) ， 或IgA2 (α2重鏈)。
“抗體片段”包括全長抗體的一部分，通常是其抗原結合或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段； 雙抗體(diabodies) ；線性抗體；微型抗體(minibodies) (Olafsen 等 (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323)，藉由Fab表達文庫產生的片段, 抗獨特型(抗-Id)抗體，CDR (互補性決定區)，和本文所述的任何結合表位的片段（其免疫特異性地結合癌細胞抗原、病毒抗原或微生物抗原），單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。
本文所用的關於抗體的術語“可變結構域”是指包含一個或複數CDR的抗體可變區或其片段。儘管可變結構域可以包含完整的可變區(諸如HCVR或LCVR)，但是也可以包含小於完整的可變區但仍然保留結合抗原或形成抗原結合位點的能力。
本文所用的術語“抗原結合部分”是指由抗體的包含一個或複數CDR的部分形成的抗體片段，或者結合抗原但是不包含完整的天然抗體結構的任何其他抗體片段。抗原結合部分的實例包括但不限於可變結構域，可變區，雙抗體(diabody)，Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv片段，二硫鍵穩定化的Fv片段(dsFv)，(dsFv)2，雙特異性dsFv (dsFv-dsFv’)，二硫鍵穩定化的雙抗體(ds diabody)，多特異性抗體，駱駝源化單結構域抗體，奈米抗體，結構域抗體，和二價結構域抗體。抗原結合部分能夠結合與親本抗體所結合的相同的抗原。在某些實施方案中，抗原結合部分可以包括一個或複數來自特定人抗體的CDR，其移接於來自一個或複數不同人抗體的構架區。關於抗原結合部分的更多和詳細形式，描述於Spiess 等, 2015 (上文)和Brinkman 等, mAbs, 9(2), pp.182–212 (2017)，其完整地結合於此。
關於抗體的“Fab”是指抗體的以下部分，其由與單個重鏈的可變區和第一恆定區藉由二硫鍵結合的單個輕鏈（可變區和恆定區兩者）組成。在某些實施方案中，輕鏈和重鏈兩者的恆定區都被TCR恆定區替代。
“Fab’’是指包括鉸鏈區的一部分的Fab片段。
“F(ab’)2”是指Fab’二聚體。
關於抗體的“困難片段(fragment difficult，Fd)”是指重鏈片段的氨基末端一半部分，其可以與輕鏈組合形成Fab。
關於抗體的“Fc”是指由第一重鏈的第二恆定區(CH2)和第三恆定區(CH3)組成的抗體部分，該第一重鏈與第二重鏈的第二和第三恆定區經由二硫鍵結合。抗體的Fc部分負責各種效應子功能，如ADCC和CDC，但是不在抗原結合中起作用。
關於抗體的“鉸鏈區”包括重鏈分子的連接CH1結構域和CH2結構域的一部分。該鉸鏈區包括大約25個氨基酸殘基並且是柔性的，由此允許兩個N-末端抗原結合區獨立地運動。
本文所用的術語“單殖株抗體”是指獲自基本上同質的抗體群體的抗體，即，除了可能天然存在的突變（其可能微量存在）以外，組成該群體的單個抗體是相同的。單殖株抗體是高度特異的，針對單個抗原性位點。此外，與包括針對不同決定簇（表位）的不同抗體的多殖株抗體製劑相反，每個單殖株抗體針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性以外，單殖株抗體是有利的，因為它們可以合成而不被其他抗體污染。修飾語“單殖株”表示抗體是獲自基本上同質抗體群體的特性，而不應理解為要求抗體群體藉由任何特定方法獲得。例如，按照本發明使用的單殖株抗體可以藉由首先由Kohler 等 (1975) Nature 256:495描述的雜交瘤方法製備，或者可以藉由重組DNA方法(參見例如: US 4816567； US 5807715)製備。單殖株抗體還可以使用例如在Clackson 等 (1991) Nature, 352:624-628； Marks 等 (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597中描述的技術，從噬菌體抗體文庫分離。
本文的單殖株抗體特別包括：“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的抗體的相應序列相同或同源，而該一條或多條鏈的剩餘部分與來自另一個物種或屬於另一個抗體類別或亞類的抗體的相應序列相同或同源；以及該抗體的片段，只要它們顯示所需生物學活性(US 4816567； 和Morrison 等 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855)。本文的目標嵌合抗體包括“靈長類化”抗體，其包含來源於非人靈長類（例如，舊大陸猴，猿等）的可變結構域抗原結合序列和人恆定區序列。
本文的“完整抗體”是這樣的抗體，其包含VL和VH結構域，以及輕鏈恆定區(CL)和重鏈結構域CH1、CH2和CH3。恆定結構域可以是天然序列恆定結構域（例如，人天然序列恆定結構域）或其氨基酸序列變體。完整抗體可以具有一個或複數“效應子功能”，其是指可歸因於抗體的Fc恆定區（天然序列Fc區域或氨基酸序列變體Fc區域）的那些生物學活性。抗體效應子功能的實例包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；和細胞表面受體諸如B細胞受體和BCR的下調。
取決於它們重鏈的恆定結構域的氨基酸序列，完整抗體可以指定為不同“類別”。存在五個主要類別的完整免疫球蛋白抗體: IgA, IgD, IgE, IgG和IgM，並且這些中的數種可以被進一步分成以下“亞類” (同種型)，例如，IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 和IgA2。對應於不同類別的抗體的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結構和三維構型是公知的。Ig形式包括鉸鏈修飾或無鉸鏈形式(Roux 等 (1998) J. Immunol. 161 :4083-4090； Lund 等 (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256； US 2005/0048572； US 2004/0229310)。
抗體的“類別”是指其重鏈具有的恆定結構域或恆定區的類型。存在五種主要類別的抗體：IgA, IgD, IgE, IgG和IgM，並且這些中的數種可以進一步分成亞類(同種型), 例如，IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1和IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。
術語“嵌合”抗體是指其中重鏈和/或輕鏈的一部分來源於特定來源或物種而重鏈和/或輕鏈的其餘部分來源於不同的來源或物種的抗體。
“人抗體”是指具有這樣的氨基酸序列的抗體，該氨基酸序列對應於由人或人細胞生產的或來源於利用人抗體庫或其他編碼人抗體的序列的非人來源的抗體的氨基酸序列。人抗體的這種定義特別排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
“人源化”抗體是指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體將包含基本上全部或至少一個和典型地兩個可變結構域，其中所有或基本上所有HVR (例如，CDR)對應於非人抗體的那些，並且所有或基本上所有FR對應於人抗體的那些。人源化抗體任選地可以包括來源於人抗體的抗體恆定區的至少一部分。抗體（例如，非人抗體）的“人源化形式”是指已經進行了人源化的抗體。
“分離的抗體”是指已經從其自然環境的組分分離的抗體。在一些實施方案中，抗體被純化至大於95%或99%的純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE，等電聚焦(IEF) ，毛細管電泳)或色譜法(例如，離子交換或反相HPLC)確定的。對於評估抗體純度的方法的綜述，參見例如Flatman 等, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
“天然抗體”是指具有不同結構的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是大約150,000道爾頓的雜合四聚體糖蛋白，由二硫鍵鍵合的兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成。從N-至C-端，每條重鏈具有可變區(VH)，也稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域，接著是三個恆定結構域(CH1, CH2, 和CH3)。類似地，從N-至C-端，每條輕鏈具有可變區(VL)，也稱為可變輕鏈結構域或者輕鏈可變結構域，接著是恆定輕鏈(CL)結構域。基於其恆定結構域的氨基酸序列，抗體的輕鏈可以指定為兩種類型（稱為κ和λ）之一。
“半胱氨酸改造的抗體”或“半胱氨酸改造的抗體變體”是指其中一個或複數抗體殘基被半胱氨酸置換的抗體。根據本發明，半胱氨酸改造的抗體的巰基可以與卡奇黴素綴合以形成THIOMAB™抗體（即，THIOMAB™ 藥物綴合物 (TDC)，其中根據本發明藥物是卡奇黴素衍生物）。在具體實施方案中，置換的殘基存在於抗體的可及位點上。藉由用半胱氨酸置換那些殘基，反應性巰基由此位於抗體的可及位點上並且可以用於將抗體與藥物部分綴合以產生免疫綴合物，如本文進一步描述。例如，THIOMAB™抗體可以是在輕鏈中(例如，根據Kabat編號G64C，K149C或R142C)或在重鏈中(例如，根據Kabat編號D101C或V184C或T205C)非半胱氨酸天然殘基單突變為半胱氨酸的抗體。在特定實施例中，THIOMAB™抗體在重鏈或輕鏈中具有單個半胱氨酸突變，使得每個全長抗體（即，具有兩條重鏈和兩條輕鏈的抗體）具有兩個改造的半胱氨酸殘基。半胱氨酸改造的抗體和製備方法被US 2012/0121615 A1（藉由引用完整地結合於此）揭露。
“二硫鍵”是指具有R-S-S-R’結構的共價鍵。氨基酸半胱氨酸包含巰基，其可以與例如來自另一個半胱氨酸殘基的第二巰基形成二硫鍵。二硫鍵可以在分別位於兩條多肽鏈上的兩個半胱氨酸殘基的巰基之間形成，由此形成鏈間橋或鏈間鍵。
本文所用的術語“特異性結合”或“特異性地結合”是指兩個分子（諸如例如抗體和抗原）之間的非隨機結合反應。在某些實施方案中，本文提供的多肽複合物和雙特異性多肽複合物以≤ 10-6 M (例如，≤ 5x10-7 M, ≤ 2x10-7 M, ≤ 10-7 M, ≤ 5x10-8 M, ≤ 2x10-8 M, ≤ 10-8 M, ≤ 5x10-9 M, ≤ 2x10-9 M, ≤ 10-9 M, 或≤ 10-10 M)的結合親和力(KD )結合抗原。本文所用的KD 是指解離速率與締合速率的比率(koff/kon)，可以使用表面等離子共振方法例如使用儀器如Biacore來確定。
本文所用的術語“過渡金屬”是指第4-11族的元素，其藉由它們的典型化學驗證，即大範圍的處在各種氧化狀態的複合物離子，有色複合物，和作為元素或作為離子（或兩者）的催化性質。第3族的Sc和Y通常也被認為是過渡金屬。
如上討論，抗體-藥物綴合物的混合物藉由常規的綴合方法或本發明的生物綴合方法來產生。通常，一個屬於IgG1或IgG4亞類的抗體分子具有4個鏈間S-S鍵，每個由兩個-SH基團形成。抗體分子可以進行一個或複數鏈間S-S鍵的部分或完全還原以形成2n個（n為選自1, 2, 3或4的整數）反應性-SH基團，因此與單個抗體分子偶聯的藥物的數目是2, 4, 6或8。根據與單個抗體分子偶聯的藥物的數目，含有不同數目的藥物分子的不同的綴合物被命名為D0, D2, D4, D6和D8。如果與單個抗體分子偶聯的藥物的數目是0，則產物稱為D0。因此，D2是指其中兩個藥物分子與單一抗體分子偶聯的ADC，其中兩個藥物分子可以經由接頭與藉由還原重鏈和輕鏈之間的S-S鍵產生的-SH基團偶聯，或可以經由接頭與藉由還原重鏈和重鏈之間的S-S鍵產生的-SH基團偶聯。D4是指其中四個藥物分子與單一抗體分子偶聯的ADC，其中四個藥物分子可以經由接頭與藉由還原重鏈和輕鏈之間的兩個S-S鍵產生的四個-SH基團偶聯（該ADC稱為D4-1），或四個藥物分子可以經由接頭與藉由還原重鏈和重鏈之間的兩個S-S鍵產生的四個-SH基團偶聯（該ADC稱為D4-2），或兩個藥物分子可以經由接頭與藉由還原重鏈和輕鏈之間的一個S-S鍵產生的兩個-SH基團偶聯並且另外兩個藥物分子可以經由接頭與藉由還原重鏈和重鏈之間的一個S-S鍵產生的兩個-SH基團偶聯（該ADC稱為D4-3）。D6是指其中六個藥物分子與單一抗體分子偶聯的ADC，其中四個藥物分子可以經由接頭與藉由還原重鏈和輕鏈之間的兩個S-S鍵產生的四個-SH基團偶聯並且兩個藥物分子可以經由接頭與藉由還原重鏈和重鏈之間的一個S-S鍵產生的兩個-SH基團偶聯（該ADC稱為D6-1），或者四個藥物分子可以經由接頭與藉由還原重鏈和重鏈之間的兩個S-S鍵產生的四個-SH基團偶聯並且兩個藥物分子可以經由接頭與藉由還原重鏈和輕鏈之間的一個S-S鍵產生的兩個-SH基團偶聯（該ADC稱為D6-2）。D8是指其中八個藥物分子與單一抗體分子偶聯的ADC，即一個抗體分子中所有四個S-S鍵被還原成八個-SH基團並且每個-SH基團連接一個藥物分子。通常，藉由常規綴合方法或本發明的生物綴合方法產生的ADC分子的異質混合物是D0、D2、D4、D6和D8的混合物。因此，抗體-藥物綴合物的“同質性”是用於描述一種特定類型的抗體-藥物綴合物（即，選自D0、D2、D4、D6和D8綴合物的一種類型）在一個抗體-藥物綴合物的給定混合物中的優勢性質。儘管已經顯示抗體-藥物綴合物體外功效直接依賴於藥物負載 (Hamblett KJ等, Clin Cancer Res. 2004 Oct 15；10(20):7063-70)，但是在相同mAb劑量下，每分子具有四個藥物的抗體-藥物綴合物(D4)的體內治療活性(例如，抗腫瘤)可比得上每分子具有八個藥物的綴合物(D8)，儘管該綴合物每mAb含有一半量的藥物。藥物-負載還影響血漿清除，D8綴合物的清除是D4綴合物的3倍快，並且是D2綴合物的5倍快。通常，如果D4在混合物中的含量高，則ADC被認為具有高同質性。在本發明中，抗體-藥物綴合物的“同質性”是指在抗體-藥物綴合物的混合物中具有高水準的D4。
因此，如本文所用的ADC的“改善的同質性”是指與藉由常規綴合方法產生的ADC混合物相比，藉由本發明的方法產生的抗體-藥物綴合物混合物中具有高水準的D4。在藉由本發明的方法製備的ADC中，D4的含量通常超過65wt%，例如超過70wt%，而在藉由常規綴合方法製備的ADC中D4的含量通常低於40%。
如本文所用的術語“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”是指一種形式的細胞毒性，其中分泌的Ig與某些細胞毒性細胞（例如，自然殺傷(NK)細胞，嗜中性白細胞，和巨噬細胞）上存在的Fc受體(FcR)結合，使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞和隨後用細胞毒素殺死靶細胞。抗體“臂”和細胞毒性細胞對於這樣的殺死是絕對必需的。用於介導ADCC的主要細胞，即NK細胞，僅表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在造血細胞上的FcR表達總結在Ravetch和Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)的第464頁上的表3中。為了評估目標分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定，諸如在美國專利號5,500,362或5,821,337中描述的測定。用於該測定的有用效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。備選地，或另外地，目標分子的ADCC活性可以進行體內評估，例如在動物模型中，諸如在Clynes 等 PNAS (USA) 95:652-656 (1998)中揭露的動物模型。
術語“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”是指在補體存在下靶細胞的裂解。經典補體途徑的啟動是藉由將補體系統的第一組分(C1q)與(適當亞類的)抗體的結合來引發的，該抗體與它們的相關抗原結合。為了評估補體啟動，可以進行CDC測定，例如如在Gazzano-Santoro 等, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)中描述的。
術語“藥用”表示指定的載體、媒介物、稀釋劑、賦形劑和/或鹽通常是在化學和/或物理上與構成製劑的其他成分相容，並且與其接受體在生理學上相容。
“藥用載體”是指藥物製劑中除了活性成分以外的成分，其對於受試者而言是生物活性可接受的和非毒性的。用於本文所述的藥物組合物中的藥用載體可以包括例如藥用液體、凝膠或固體載體，水性媒介物，非水性媒介物，抗微生物劑，等滲劑，緩衝劑，抗氧化劑，麻醉劑，懸浮/分配劑，掩蔽劑或螯合劑，稀釋劑，輔劑，賦形劑，或非毒性輔助物質，本領域已知的其他組分，或其各種組合。
術語“受試者”包括任何人或非人動物，例如人類。
本文所用的術語“癌症”是指任何或一種腫瘤或惡性細胞生長、增殖或轉移介導的實體瘤和非實體瘤如白血病，並且引發醫學病症。“腫瘤”包括一種或多種癌細胞。癌症實例包括但不限於上皮細胞癌(carcinoma)，淋巴瘤，胚芽瘤(blastema)，肉瘤，和白血病或淋巴樣惡性腫瘤(lymphoid malignancies)。此類癌症的更具體實例包括鱗狀細胞癌（例如，上皮鱗狀細胞癌），肺癌，包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌(“NSCLC”)，肺腺癌和肺鱗癌，腹膜癌，肝細胞癌，胃癌，包括胃腸癌，胰腺癌，成膠質細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞癌(hepatoma)，乳腺癌，結腸癌，直腸癌，結直腸癌，子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺癌，腎癌或腎臟癌，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，肝細胞性癌(hepatic carcinoma)，肛門癌，陰莖癌，以及頭頸癌。
在治療病症的上下文中本文使用的術語“治療”通常是指治療或療法，無論是對人還是動物，其中實現了某種期望的治療效果，例如抑制病症進展，並且包括進展速度的降低，進展速度的停止，病症的消退，病症的改善，和病症的治癒。還包括作為預防措施（即預防，防止）的治療。對於癌症，“治療”可以是指抑制或減緩腫瘤或惡性細胞生長、增殖或轉移，或者其某種組合。對於腫瘤，“治療”包括去除所有或部分腫瘤，抑制或減緩腫瘤生長和轉移，抑制或延遲腫瘤發展，或其某種組合。
抗體針對腫瘤相關抗原(TAA)、負責生產自身免疫抗體的細胞抗原、病毒或微生物抗原。腫瘤相關抗原是本領域已知的，並且使用本領域公知的方法和資訊，可以製備腫瘤相關抗原用於生產抗體。在發現用於癌症診斷和治療的有效腫瘤靶標的嘗試中，研究人員已經尋求鑒定與一種或多種正常非癌細胞相比特異性表達在一種或多種特定類型的癌細胞表面上的跨膜或者腫瘤相關多肽。經常地，與非癌細胞的表面上相比，這樣的腫瘤相關多肽更豐富地表達在癌細胞表面上。這樣的腫瘤相關細胞表面抗原多肽的鑒定已經產生了特異性標靶癌細胞以藉由基於抗體的治療進行破壞的能力。
腫瘤相關抗原TAA的實例包括但不限於本文列出的TAA (1)- (53)。為了方便，本文列出了涉及這些抗原的資訊，其全部是本領域已知的，並且包括名稱、備用名、Genbank登記號和主要參考文獻，接著是國家生物技術資訊中心(NCBI)的核酸和蛋白序列鑒定規定(參見WO2017068511A1，其藉由引用完整地結合於此)。對應於TAA (1)-(53)的核酸和蛋白序列在公共資料庫如GenBank中可獲得。抗體標靶的腫瘤相關抗原包括所有氨基酸序列變體和同種型，其相對於所引用參考文獻中鑒定的序列具有至少大約70%、80%、85%、90%或95%序列同一性，或者與具有所引用參考文獻中發現的序列的TAA顯示基本上相同的生物學性質或特性。例如，具有變體序列的TAA通常能夠特異性結合抗體，該抗體特異性結合具有所列對應序列的TAA。本文特別引用的參考文獻中的序列和揭露內容藉由參考明確結合在本文中。 腫瘤相關抗原(TAA)
(1) BMPR1B (1B型骨形態發生蛋白受體，Genbank登記號NM_001203) ten Dijke, P., 等 Science 264 (5155): 101-104 (1994), Oncogene 14 (11): 1377- 1382 (1997))； WO2004063362 (請求項2)；WO2003042661 (請求項12)；US2003134790-A1 (第38-39頁)；WO2002102235 (請求項13； 第296頁)；WO2003055443 (第91-92頁)；WO200299122 (實施例2；第528-530頁)；WO2003029421 (請求項6)；WO2003024392 (請求項2；圖112)； WO200298358 (請求項1；第183頁)；WO200254940 (第100-101頁)； WO200259377(第349-350頁)；WO200230268 (請求項27；第376頁)； WO200148204 (實施例；圖4) NP_001194骨形態發生蛋白受體，IB型/pid=NP_001194.1 – 交叉引用: MIM:603248； NP_001194.1； AY065994；
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, Genbank登記號 NM_003486) Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., 等 (1992) J. Biol. Chem. 267 (16): 11267-11273)； WO2004048938 (實施例2)；WO2004032842 (實施例IV) ；WO2003042661 (請求項12)；WO2003016475 (請求項1)；WO200278524 (實施例2)； WO200299074 (請求項19；第127-129頁) ；WO200286443 (請求項27； 第222, 393頁) ；WO2003003906 (請求項10； 第293頁) ； WO200264798 (請求項33； 第93-95頁)；WO200014228 (請求項5；第133-136頁) ；US2003224454 (圖3) ；WO2003025138 (請求項12；第150頁) ； NP_003477溶質載體家族7 (陽離子氨基酸轉運蛋白，y+系統)，成員5 /pid=NP_003477.3 – 智人交叉引用： MIM:600182； NP_003477.3； NM_015923； NM_003486_1；
(3) STEAP1 (前列腺六跨膜上皮抗原，Genbank登記號 NM_012449) Cancer Res. 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., 等 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25): 14523-14528)；WO2004065577 (請求項6)； WO2004027049 (圖1L)； EP1394274 (實施例11)；WO2004016225 (請求項2) ；WO2003042661 (請求項12)；US2003157089 (實施例5)；US2003185830 (實施例5)；US2003064397 (圖2)；WO200289747 (實施例5；第618-619頁)； WO2003022995 (實施例9；圖13A， 實施例53；第173頁，實施例2；圖2A)； NP_036581前列腺六跨膜上皮抗原，交叉引用: MIM:604415；NP_036581.1； NM_012449_1；
(4) 0772P (CA125, MUC16,Genbank登記號 AF361486) J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001))；WO2004045553(請求項14)； WO200292836 (請求項6；圖12) ；WO200283866 (請求項15；第116-121頁) ； US2003124140(實施例16)；US 798959；叉引用: GI:34501467； AAK74120.3； AF361486_1；
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 巨核細胞集落刺激因數(megakaryocyte potentiating factor)，間皮素，Genbank登記號 NM_005823)， Yamaguchi, N., 等 Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20): 11531-11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1): 136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995))； WO2003101283 (請求項14) ；WO2002102235 (請求項13；第287-288頁) ；WO2002101075 (請求項4；第308-309頁) ；WO200271928 (第320-321頁) ；WO9410312 (第52-57頁) ；交叉引用: MIM:601051；NP_005814.2；NM_005823_1；
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 溶質載體家族34 (磷酸鈉)， 成員2，II型鈉依賴性磷酸鹽轉運蛋白3b，Genbank登記號 NM_006424) J. Biol. Chem. 277 (22): 19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), J.A., 等 (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582) ； WO2004022778 (請求項2) ；EP1394274 (實施例11)；WO2002102235 (請求項13；第326頁)；EP875569 (請求項1；第17-19頁)；WO200157188 (請求項20；第329頁)；WO2004032842 (實施例IV) ；WO200175177 (請求項24；第139-140頁) ；交叉引用：MIM:604217； NP_006415.1； NM_006424_1；
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaphorin 5b Hlog，sema結構域，七個血小板反應蛋白重複(1型和1型樣), 跨膜結構域(TM)和短的細胞質結構域, (semaphorin) 5B, Genbank登記號 AB040878) Nagase T., 等 (2000) DNA Res. 7 (2): 143-150)； WO2004000997 (請求項1) ；WO2003003984 (請求項1)；WO200206339 (請求項1；第50頁)； WO200188133 (請求項1；第41-43，48-58頁)；WO2003054152 (請求項20)； WO2003101400(請求項11)；登記號: Q9P283； EMBL；AB040878； BAA95969.1. Genew； HGNC: 10737；
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12基因, Genbank登記號 AY358628)；Ross 等 (2002) Cancer Res. 62:2546-2553；US2003129192 (請求項2)；US2004044180 (請求項12)；US2004044179 (請求項11)；US2003096961 (請求項11)；US2003232056 (實施例5)；WO2003105758 (請求項12) ； US2003206918 (實施例5)；EP1347046 (請求項1)；WO2003025148 (請求項20)；交叉引用: GE37182378；AAQ88991.1；AY358628_1；
(9) ETBR (內皮素B型受體, Genbank登記號 AY275463)； Nakamuta M., 等 Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991；Ogawa Y., 等 Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991； Arai H., 等 Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992；Arai H., 等 J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993； Sakamoto A., Yanagisawa M., 等 Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991； Elshourbagy N.A., 等 J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993； Haendler B., 等 J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992； Tsutsumi M., 等 Gene 228, 43-49, 1999； Strausberg R.L., 等 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002； Bourgeois C, 等 J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997； Okamoto Y., 等 Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997； Verheij J.B., 等 Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002； Hofstra R.M.W., 等 Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997； 例如Puffenberger等 Cell 79, 1257-1266, 1994； Attie T., 等, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995； Auricchio A., 等 Hum. Mol. Genet. 5 :351-354, 1996； Amiel J., 等 Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996； Hofstra R.M.W., 等 Nat. Genet. 12, 445-447, 1996； Svensson P.J., 等 Hum. Genet. 103, 145-148, 1998； Fuchs S., 等 Mol. Med. 7, 115-124, 2001； Pingault V., 等 (2002) Hum. Genet. Ill, 198-206 ；WO2004045516 (請求項1)；WO2004048938 (實施例2)；WO2004040000 (請求項151)；WO2003087768 (請求項1)；WO2003016475(請求項1)；WO2003016475(請求項1)；WO200261087 (圖1)；WO2003016494 (圖6)；WO2003025138 (請求項12；第144頁) ；WO200198351 (請求項1；第124-125頁)；EP522868 (請求項8；圖2) ； WO200177172 (請求項1；第297-299頁)；US2003109676 ；US6518404 (圖3) ；US5773223 (請求項1a； Col 31-34)； WO2004001004；
(10) MSG783 (RNF124, 假想蛋白FLJ20315, Genbank登記號 NM_017763)；WO2003104275 (請求項1)；WO2004046342 (實施例2)； WO2003042661 (請求項12)；WO2003083074 (請求項14；第61頁)； WO2003018621 (請求項1)；WO2003024392 (請求項2； 圖93)； WO200166689 (實施例6)；交叉引用: LocusID: 54894； NP_060233.2； NM_017763_1；
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 前列腺癌相關基因1, 前列腺癌相關蛋白1, 六跨膜前列腺上皮抗原2, 六跨膜前列腺蛋白, Genbank登記號 AF455138)；Lab. Invest. 82 (11): 1573-1582 (2002)；WO2003087306；US2003064397 (請求項1；圖1)； WO200272596 (請求項13；第54-55頁)；WO200172962 (請求項1； 圖4B)； WO2003104270 (請求項11)；WO2003104270 (請求項16)； US2004005598 (請求項22)； WO2003042661 (請求項12)； US2003060612 (請求項12；圖10)； WO200226822 (請求項23；圖2)； WO200216429 (請求項12；圖10)； 交叉引用: GE22655488； AAN04080.1； AF455138_1；
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 暫態受體電位陽離子通道, 子家族M, 成員4, Genbank登記號 NM_017636) Xu, X.Z., 等 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19): 10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813-30820 (2003))； US2003143557 (請求項4)；WO200040614 (請求項14； 第100-103頁)；WO200210382 (請求項1； 圖9A)；WO2003042661 (請求項12)；WO200230268 (請求項27； 第391頁)； US2003219806 (請求項4)；WO200162794 (請求項14； 圖1A至圖1D)； 交叉引用: MIM:606936； NP_060106.2； NM_017636_1；
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 畸胎瘤衍生生長因數, Genbank登記號 NP_003203或NM_003212) Ciccodicola, A., 等 EMBO J. 8 (7): 1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991))； US2003224411 (請求項1)；WO2003083041 (實施例1)；WO2003034984 (請求項12)；WO200288170 (請求項2；第52-53頁)；WO2003024392 (請求項2； 圖58)；WO200216413 (請求項1； 第94-95，105頁)； WO200222808 (請求項2；圖1)； US5854399 (實施例2；Col 17-18)； US5792616 (圖2)； 交叉引用: MIM: 187395； NP_003203.1； NM_003212_1；
(14) CD21 (CR2 (補體受體2)或C3DR (C3d/EB病毒受體)或Hs.73792 Genbank登記號 M26004) Fujisaku 等 (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118- 2125)； Weis J.J., 等 J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988； Moore M., 等 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194-9198, 1987； Barel M., 等 Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998； Weis J.J., 等 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639-5643, 1986； Sinha S.K., 等 (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320； WO2004045520 (實施例4)； US2004005538 (實施例1)；WO2003062401 (請求項9)；WO2004045520(實施例4)； WO9102536 (圖9.1-9.9)； WO2004020595 (請求項1)；登記號：P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004； AAA35786.1；
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (免疫球蛋白相關β), B29, Genbank登記號 NM_000626或11038674) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller 等 (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6)：1621-1625)；WO2004016225(請求項2，圖140)； WO2003087768, US2004101874 (請求項1，第102頁)； WO2003062401 (請求項9)；WO200278524 (實施例2)；US2002150573 (請求項5，第15頁)； US5644033；WO2003048202 (請求項1，第306和309頁)；WO 99/558658, US6534482 (請求項13，圖17A/B)； WO200055351 (請求項11，第1145-1146頁)； 交叉引用: MIM: 147245； NP_000617.1； NM_000626_1；
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (含有SH2結構域的磷酸酶錨定蛋白1a), SPAP1B, SPAP1C, Genbank登記號 NM_030764, AY358130) Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., 等 (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775； WO2004016225 (請求項2)； WO2003077836； WO200138490 (請求項5；圖18D-1-18D-2)； WO2003097803 (請求項12)； WO2003089624 (請求項25)； 交叉引用: MIM:606509； NP_110391.2； NM_030764_1；
(17) HER2 (ErbB2, Genbank登記號 M11730) Coussens L., 等 Science (1985) 230(4730): 1132-1139)； Yamamoto T., 等 Nature 319, 230-234, 1986； Semba K., 等 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497-6501, 1985； Swiercz J.M., 等 J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004； Kuhns J.J., 等 J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999； Cho H.-S., 等 Nature 421, 756-760, 2003； Ehsani A., 等 (1993) Genomics 15, 426-429； WO2004048938 (實施例2)； WO2004027049 (圖II)；WO2004009622；WO2003081210；WO2003089904 (請求項9)； WO2003016475 (請求項1)；US2003118592；WO2003008537 (請求項1)； WO2003055439 (請求項29； 圖1A-B)；WO2003025228 (請求項37； 圖5C)； WO200222636 (實施例13； 第95-107頁)；WO200212341 (請求項68； 圖7)； WO200213847 (第71-74頁)；WO200214503 (第114-117頁)；WO200153463 (請求項2；第41-46頁)；WO200141787 (第15頁)； WO200044899 (請求項52； 圖7)； WO200020579 (請求項3；圖2)； US5869445 (請求項3；Col 31-38)； WO9630514 (請求項2； 第56-61頁)； EP 1439393 (請求項7)； WO2004043361 (請求項7)；WO2004022709；WO200100244 (實施例3；圖4)； 登記號： P04626； EMBL； M11767； AAA35808.1. EMBL； M11761； AAA35808.1；
(18) NCA (CEACAM6, Genbank登記號 M18728)； Barnett T., 等 Genomics 3, 59-66, 1988； Tawaragi Y., 等 Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988； Strausberg R.L., 等 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 16899-16903, 2002；WO2004063709；EP1439393 (請求項7)； WO2004044178 (實施例4)；WO2004031238；WO2003042661 (請求項12)；WO200278524 (實施例2)；WO200286443 (請求項27；第427頁)；WO200260317 (請求項2)； 登記號：P40199； Q14920； EMBL； M29541； AAA59915.1. EMBL； M18728；
(19) MDP (DPEP1, Genbank登記號 BC017023) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002))；WO2003016475 (請求項1)； WO200264798 (請求項33；第85-87頁)； JP05003790 (圖6-8)； W09946284 (圖9)； 交叉引用: MIM: 179780； AAH17023.1； BC017023_1；
(20) IL20Rα (IL20Rα, ZCYTOR7, Genbank登記號 AF184971)； Clark H.F., 等 Genome Res. 13, 2265-2270, 2003； Mungall A.J., 等 Nature 425, 805-811, 2003； Blumberg H., 等 Cell 104, 9-19, 2001； Dumoutier L., 等 J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001； Parrish-Novak J., 等 J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002； Pletnev S., 等 (2003) Biochemistry 42: 12617-12624； Sheikh F., 等 (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010； EP1394274 (實施例11)； US2004005320 (實施例5)；WO2003029262 (第74-75頁)；WO2003002717 (請求項2； 第63頁)；WO200222153 (第45-47頁)；US2002042366 (第20-21頁)； WO200146261 (第57- 59頁)；WO200146232 (第63-65頁)；W09837193 (請求項1；第55-59頁)；登記號：Q9UHF4；Q6UWA9； Q96SH8； EMBL； AF184971； AAF01320.1；
(21) Brevican (BCAN, BEHAB, Genbank登記號 AF229053) Gary S.C., 等 Gene 256, 139-147, 2000； Clark H.F., 等 Genome Res. 13, 2265-2270, 2003； Strausberg R.L., 等 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899-16903, 2002； US2003186372 (請求項11)；US2003186373 (請求項11)；US2003119131 (請求項1；圖52)；US2003119122 (請求項1；圖52)；US2003119126 (請求項1)； US2003119121 (請求項1；圖52)；US2003119129 (請求項1)；US2003119130 (請求項1)；US2003119128 (請求項1；圖52)；US2003119125 (請求項1)；WO2003016475 (請求項1)；WO200202634 (請求項1)；
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, Genbank登記號 NM_004442) Chan, J.和Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196: 177-244 (2000))；WO2003042661 (請求項12)； WO200053216 (請求項1；第41頁)；WO2004065576 (請求項1)；WO2004020583 (請求項9)； WO2003004529 (第128-132頁)；WO200053216 (請求項1；第42頁)； 交叉引用: MIM: 600997； NP_004433.2； NM_004442_1；
(23) ASLG659 (B7h, Genbank登記號 AX092328) US20040101899 (請求項2)； WO2003104399 (請求項11)； WO2004000221 (圖3)； US2003165504 (請求項1)；US2003124140 (實施例2)； US2003065143 (圖60)； WO2002102235 (請求項13；第299頁)；US2003091580 (實施例2)； WO200210187 (請求項6；圖10)；WO200194641 (請求項12；圖7b)； WO200202624 (請求項13；圖1A-1B)；US2002034749 (請求項54； 第45-46頁)；WO200206317 (實施例2；第320-321頁，請求項34；第321-322頁)； WO200271928 (第468-469頁)；WO200202587(實施例1；圖1)； WO200140269 (實施例3；第190-192頁)；WO200036107 (實施例2；第205-207頁)； WO2004053079 (請求項12)；WO2003004989 (請求項1)； WO200271928 (第233-234，452-453頁)； WO 0116318；
(24) PSCA (前列腺幹細胞抗原前體, Genbank登記號 AJ297436) Reiter R.E., 等 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735-1740, 1998； Gu Z., 等 Oncogene 19, 1288-1296, 2000； Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788； WO2004022709； EP1394274 (實施例11)；US2004018553 (請求項17)；WO2003008537 (請求項1)；WO200281646 (請求項1；第164頁)； WO2003003906 (請求項10；第288頁)；WO200140309 (實施例1；圖17)；US2001055751 (實施例1；圖1b)；WO200032752 (請求項18；圖1)； WO9851805 (請求項17；第97頁)；W09851824 (請求項10；第94頁)； WO9840403 (請求項2；圖1B)； 登記號：043653； EMBL； AF043498； AAC39607.1；
(25) GEDA (Genbank登記號AY260763)； AAP14954 脂肪瘤HMGIC融合-配偶體樣蛋白/pid= AAP14954.1 – 智人物種: 智人(人) WO2003054152 (請求項20)；WO2003000842 (請求項1)；WO2003023013 (實施例3, 請求項20)；US2003194704 (請求項45)；交叉引用: GI:30102449； AAP14954.1； AY260763_1；
(26) BAFF-R (B細胞啟動因數受體, BLyS受體3, BR3, Genbank登記號 AF116456)； BAFF受體/pid=NP_443177.1 – 智人 Thompson, J.S., 等 Science 293 (5537), 2108-2111 (2001)；WO2004058309；WO2004011611； WO2003045422 (實施例；第32-33頁)；WO2003014294 (請求項35；圖6B)； WO2003035846 (請求項70；第615-616頁)；WO200294852 (Col 136-137)； WO200238766 (請求項3；第133頁)； WO200224909 (實施例3；圖3)； 交叉引用: MIM: 606269； NP_443177.1； NM_052945_1； AF132600；
(27) CD22 (B-細胞受體CD22-B同種型, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, Genbank登記號 AK026467)； Wilson 等 (1991) J. Exp. Med. 173: 137-146； WO2003072036 (請求項1；圖1)； 交叉引用: MIM: 107266； NP_001762.1； NM_001771_1；
(28) CD79a (CD79A, CD79α, 免疫球蛋白相關α, B細胞特異性蛋白，其與Ig β (CD79B)共價相互作用並且在表面上與Ig M分子形成複合物，轉導參與B-細胞分化的信號), pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] Gene Chromosome: 19ql3.2, Genbank登記號 NP_001774.10) WO2003088808, US20030228319； WO2003062401 (請求項9)； US2002150573 (請求項4, 第13-14頁)；W09958658 (請求項13，圖16)；WO9207574 (圖1)； US5644033； Ha 等 (1992) J. Immunol. 148(5): 1526-1531；Mueller 等 (1992) Eur. J. Biochem. 22: 1621-1625；Hashimoto 等 (1994) Immunogenetics 40(4):287-295； Preud’homme 等 (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1): 141-146；Yu 等 (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637；Sakaguchi 等 (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464；
(29) CXCR5 (伯基特淋巴瘤受體1, G蛋白偶聯受體，其被CXCL13趨化因數活化，在淋巴細胞遷移和體液防禦中發揮功能，在HIV-2感染和可能AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的發展中發揮作用)； 372 aa, pI: 8.54 MW: 41959 TM: 7 [P] Gene Chromosome: 11q23.3, Genbank登記號 NP_001707.1) WO2004040000； WO2004015426； US2003105292 (實施例2)； US6555339 (實施例2)；WO200261087 (圖1)；WO200157188 (請求項20，第269頁)； WO200172830 (第12-13頁)；WO200022129 (實施例1，第152-153頁，實施例2，第254-256頁)；W09928468 (請求項1，第38頁)； US5440021 (實施例2，col 49-52)；W09428931 (第56-58頁)；W09217497 (請求項7， 圖5)； Dobner 等 (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795- 2799； Barella 等 (1995) Biochem. J. 309:773-779；
(30) HLA-DOB (II類MHC分子的β亞基(Ia抗原)，其結合肽並且將它們呈遞到CD4+ T淋巴細胞)； 273 aa, pI: 6.56 MW: 30820 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 6p21.3, Genbank登記號 NP_002111.1) Tonnelle 等 (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847； Jonsson 等 (1989) Immunogenetics 29(6):411-413； Beck 等 (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441； Strausberg 等 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-16903； Servenius 等 (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766； Beck 等 (1996) J. Mol. Biol. 255: 1-13； Naruse 等 (2002) Tissue Antigens 59:512-519； W09958658 (請求項13，圖15)； US6153408 (Col 35-38)； US5976551 (col 168-170)； US6011146 (col 145-146)； Kasahara 等 (1989) Immunogenetics 30(1):66-68； Larhammar 等 (1985) J. Biol. Chem. 260(26): 14111-14119；
(31) P2X5 (嘌呤能受體P2X配體門控離子通道5, 藉由胞外ATP門控的離子通道，可參與突觸傳遞和神經發生，缺乏其可促進特發性逼尿肌不穩定的病理生理學)； 422 aa, pI: 7.63, MW: 47206 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 17p13.3, Genbank登記號 NP_002552.2) Le 等 (1997) FEBS Lett. 418(1-2): 195-199；WO2004047749；WO2003072035 (請求項10)； Touchman 等 (2000) Genome Res. 10: 165-173；WO200222660 (請求項20)； WO2003093444 (請求項1)；WO2003087768 (請求項1)；WO2003029277 (第82頁)；
(32) CD72 (B-細胞分化抗原CD72, Lyb-2，PROTEIN SEQUENCE Full maeaity...tafrfpd (1..359； 359 aa), pI: 8.66, MW: 40225 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 9p13.3, Genbank登記號NP_001773.1) WO2004042346 (請求項65)；WO2003026493 (第51-52頁, 57-58)；WO200075655 (第105-106頁)；Von Hoegen 等 (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877；Strausberg 等 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-16903；
(33) LY64 (淋巴細胞抗原64 (RP105), 富含亮氨酸重複序列的I型膜蛋白(LRR)家族，調節B-細胞活化和凋亡，功能喪失與系統性紅斑狼瘡患者增加的疾病活動相關)；661 aa, pI: 6.20, MW: 74147 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 5q12, Genbank登記號NP_005573.1) US2002193567； WO9707198 (請求項11, 第39-42頁)；Miura 等 (1996) Genomics 38(3)：299- 304； Miura 等 (1998) Blood 92:2815-2822； WO2003083047；W09744452 (請求項8，第57-61頁)；WO200012130 (第24-26頁)；
(34) FcRH1 (Fc受體樣蛋白1，一種對於免疫球蛋白Fc結構域的假定受體，其含有C2型Ig樣和ITAM結構域，可以在B-淋巴細胞分化中起作用)； 429 aa, pI: 5.28, MW: 46925 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 1q21-1q22, Genbank登記號 NP_443170.1) WO2003077836； WO200138490 (請求項6，圖18E-1-18-E-2)；Davis 等(2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777；WO2003089624 (請求項8)；EP1347046 (請求項1)；WO2003089624 (請求項7)；
(35) IRTA2 (免疫球蛋白超家族受體易位相關2, 一種假定的免疫受體，在B細胞發育和淋巴瘤發生中可能起作用； 藉由易位的基因下調發生在一些B細胞惡性腫瘤中)； 977 aa, pI: 6.88 MW: 106468 TM: 1 [P] Gene Chromosome: 1q21, Genbank登記號人:AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085；小鼠: AK089756, AY158090, AY506558；NP_112571.1. WO2003024392 (請求項2，圖97)；Nakayama 等 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1): 124-127； WO2003077836； WO200138490 (請求項3，圖18B-1至18B-2)；
(36) TENB2 (TMEFF2, tomoregulin, TPEF, HPP1, TR, 假定的跨膜蛋白聚糖，涉及生長因數和卵泡抑素的EGF/heregulin家族)； 374 aa, NCBI 登記號：AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276； NCBI基因: 23671； OMIM: 605734； SwissProt Q9UIK5； Genbank登記號 AF179274； AY358907, CAF85723, CQ782436 WO2004074320 (SEQ ID NO 810)； JP2004113151 (SEQ ID NOS 2, 4, 8)； WO2003042661 (SEQ ID NO 580)； WO2003009814 (SEQ ID NO 411)； EP1295944 (第69-70頁)； WO200230268 (第329頁)； WO200190304 (SEQ ID NO 2706)； US2004249130； US2004022727； WO2004063355； US2004197325； US2003232350； US2004005563； US2003124579； Horie 等 (2000) Genomics 67: 146-152；Uchida 等 (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593-602； Liang 等 (2000) Cancer Res. 60:4907-12； Glynne-Jones 等 (2001) Int J Cancer. Oct 15； 94(2): 178-84；
(37) PMEL17 (銀同源物(silver homolog)； SILV； D12S53E； PMEL17； SI； SIL)； ME20； gp100) BC001414； BT007202； M32295； M77348； NM_006928； McGlinchey, R.P. 等 (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (33), 13731-13736； Kummer, M.P. 等 (2009) J. Biol. Chem. 284 (4), 2296-2306；
(38) TMEFF1 (具有EGF-樣和兩個卵泡抑素樣結構域的跨膜蛋白1； Tomoregulin-1)； H7365； C9orf2； C90RF2； U19878； X83961； NM_080655； NM_003692； Harms, P.W. (2003) Genes Dev. 17 (21), 2624-2629；Gery, S. 等 (2003) Oncogene 22 (18):2723-2727；
(39) GDNF-Ra1 (GDNF家族受體α1； GFRA1； GDNFR； GDNFRA； RETL1； TRNR1； RET1L； GDNFR-α1； GFR-Α-1)； U95847； BC014962； NM 145793 NM_005264； Kim, M.H. 等 (2009) Mol. Cell. Biol. 29 (8), 2264-2277； Treanor, J.J. 等 (1996) Nature 382 (6586):80-83；
(40) Ly6E (淋巴細胞抗原6複合物, 基因座E； Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1)； NP_002337.1； NM_002346.2； de Nooij-van Dalen, A G. 等 (2003) Int. J. Cancer 103 (6), 768-774； Zammit, D.J. 等 (2002) Mol. Cell. Biol. 22 (3):946-952；
(41) TMEM46 (shisa同源物2 (爪蟾(Xenopus laevis))； SHISA2)； NP_001007539.1； NM_001007538.1； Furushima, K. 等 (2007) Dev. Biol. 306 (2), 480-492； Clark, H.F. 等 (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270；
(42) Ly6G6D (淋巴細胞抗原6複合物, 基因座G6D； Ly6-D, MEGT1)； NP_067079.2； NM_021246.2； Mallya, M. 等 (2002) Genomics 80 (1): 113-123； Ribas, G. 等 (1999) J. Immunol. 163 (1):278-287；
(43) LGR5 (含有富含亮氨酸的重複序列的G蛋白偶聯受體5； GPR49, GPR67)； NP_003658.1； NM_003667.2； Salanti, G. 等 (2009) Am. J. Epidemiol. 170 (5):537- 545； Yamamoto, Y. 等 (2003) Hepatology 37 (3):528-533；
(44) RET (ret 原癌基因； MEN2A； HSCR1； MEN2B； MTC1； PTC； CDHF12； Hs.168114； RET51； RET-ELE1)； NP_066124.1； NM_020975.4； Tsukamoto, H. 等 (2009) Cancer Sci. 100 (10): 1895-1901； Narita, N. 等 (2009) Oncogene 28 (34):3058-3068；
(45) LY6K (淋巴細胞抗原6複合物, 基因座K； LY6K； HSJ001348； FLJ35226)； NP_059997.3； NM_017527.3； Ishikawa, N. 等 (2007) Cancer Res. 67 (24): 11601-11611； de Nooij-van Dalen, A G. 等 (2003) Int. J. Cancer 103 (6):768-774；
(46) GPR19 (G蛋白偶聯受體19； Mm.4787)； NP_006134.1； NM_006143.2； Montpetit, A.和Sinnett, D. (1999) Hum. Genet. 105 (1-2): 162-164； O’Dowd, B.F. 等 (1996) FEBS Lett. 394 (3):325-329；
(47) GPR54 (KISS1受體； KISS1R； GPR54； HOT7T175； AXOR12)； NP_115940.2； NM_032551.4； Navenot, J.M. 等 (2009) Mol. Pharmacol. 75 (6): 1300-1306； Hata, K. 等 (2009) Anticancer Res. 29 (2) :617-623；
(48) ASPHD1 (含天冬氨酸β羥化酶結構域蛋白1（aspartate beta-hydroxylase domain containing 1）； LOC253982)； NP_859069.2； NM_181718.3； Gerhard, D.S. 等 (2004) Genome Res. 14 (10B):2121-2127；
(49) 酪氨酸酶(TYR； OCAIA； OCA1A； 酪氨酸酶； SHEP3)； NP_000363.1； NM_000372.4； Bishop, D.T. 等 (2009) Nat. Genet. 41 (8):920-925； Nan, H. 等 (2009) Int. J. Cancer 125 (4):909-917；
(50) TMEM118 (環指蛋白, 跨膜2； RNFT2； FLJ14627)； NP_001103373.1； NM_001109903.1； Clark, H.F. 等 (2003) Genome Res. 13 (10):2265-2270； Scherer, S.E. 等 (2006) Nature 440 (7082):346-351；
(51) GPR172A (G蛋白偶聯受體172A； GPCR41； FLJ11856； D15Ertd747e)； NP_078807.1； NM_024531.3； Ericsson, T.A. 等 (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (l l):6759-6764； Takeda, S. 等 (2002) FEBS Lett. 520 (1-3):97-101；
(52) CD33，一個結合唾液酸的免疫球蛋白樣凝集素家族成員，是67-kDa的糖基化的跨膜蛋白。CD33表達在大多數骨髓和單核白血病細胞以及定向的髓單核細胞和紅系祖細胞之上。其在最早多能幹細胞、成熟粒細胞、淋巴樣細胞或非造血細胞上沒有發現(Sabbath 等, (1985) J. Clin. Invest. 75:756-56； Andrews 等, (1986) Blood 68: 1030-5)。CD33在其胞質尾部含有兩個酪氨酸殘基，這兩個酪氨酸殘基各自後接著疏水殘基，類似於在許多抑制性受體中看到的免疫受體基於酪氨酸的抑制基序(ITIM)；
(53) CLL-1 (CLEC12A, MICL, 和DCAL2)，編碼C-型凝集素/C-型凝集素樣結構域(CTL/CTLD)超家族的一個成員。該家族的成員共有一個共同的蛋白折疊並且具有不同功能，諸如細胞黏附、細胞-細胞信號轉導、糖蛋白轉換，並且在炎症和免疫應答中具有作用。該基因編碼的蛋白是粒細胞和單核細胞功能的負調控物。已經描述了該基因的數種可變剪接的轉錄物變體，但是這些變體中的一些的全長性質還未確定。該基因與染色體12p13上自然殺傷基因複合物區域中的其他CTL/CTLD超家族成員緊密相關(Drickamer K (1999) Curr. Opin. Struct. Biol. 9 (5):585-90； van Rhenen A, 等, (2007) Blood 110 (7):2659-66； Chen CH, 等 (2006) Blood 107 (4): 1459-67； Marshall AS, 等 (2006) Eur. J. Immunol. 36 (8):2159-69； Bakker AB, 等 (2005) Cancer Res. 64 (22): 8443-50； Marshall AS, 等 (2004) J. Biol. Chem. 279 (15): 14792-802)。已經顯示CLL-1是II型跨膜受體，其含有單個C-型凝集素樣結構域(預測其不結合鈣或糖)、莖部區域、跨膜結構域和含有ITIM基序的短的胞質尾部。 本發明的綴合方法
在第一方面，本發明涉及製備具有改善的同質性的抗體-藥物綴合物 (ADC)的方法，其包括以下步驟： (a) 將還原劑和待綴合的抗體在有效量的過渡金屬離子的存在下在緩衝體系中溫育，以選擇性地還原抗體內鏈間二硫鍵； (b) 將過量的攜帶有反應性基團的有效負載與步驟(a)得到的還原的巰基基團反應；以及 (c) 加入有效量的氧化劑以將未反應的巰基再氧化，然後回收獲得的抗體-藥物綴合物。
過渡金屬離子產生在二硫鍵還原中的選擇性。在過渡金屬離子的存在下，Fab區中的兩個鏈間S-S鍵被選擇性還原，並且因此四個攜帶反應性基團的有效負載(即四個藥物-接頭複合物)被連接於一個抗體以形成D4。獲得的ADC中高含量的D4無疑改善了ADC的同質性。
在一些實施方案中，還原劑可以是TCEP。反應溶液中還原劑的濃度可以是0.04 mM - 0.4 mM。在步驟(c)中加入的氧化劑可以是DHAA。反應溶液中氧化劑的濃度可以是0.08 mM - 0.8mM。
在一些實施方案中，適合用於本發明的生物綴合方法的過渡金屬離子可以包括但不限於Zn2+ 、Cd2+ 和Hg2+ 等。其中，由於Zn2+ 容易獲得和低成本，使用Zn2+ 。例如，在步驟(a)中可以加入適當的過渡金屬鹽，只要它們在反應溶液中可溶以便游離過渡金屬離子可以釋放到反應溶液中。在這方面，作為適當的鋅鹽可以提及ZnCl2 、Zn(NO3 )2 、ZnSO4 、Zn(CH3 COO)2 、ZnI2 、ZnBr2 、甲酸鋅和四氟硼酸鋅。同樣，可以提及在反應溶液中可溶並且可以釋放游離Cd2+ 或Hg2+ 離子的其他過渡金屬鹽，其可以包括但不限於CdCl2 、Cd(NO3 )2 、CdSO4 、Cd(CH3 COO)2 、CdI2 、CdBr2 、甲酸鎘和四氟硼酸鎘； HgCl2 , 、Hg(NO3 )2 、HgSO4 、Hg(CH3 COO)2 、HgBr2 、甲酸汞(II)和四氟硼酸汞(II)； 等等。本領域技術人員可以從作為過渡金屬離子源的上述過渡金屬鹽中進行選擇。
在一個實施方案中，在步驟(a)中使用Zn2+ 。可獲得水溶性的鋅鹽。例如，可以在步驟(a)中加入ZnCl2 作為Zn2+ 源。
在步驟(a)中反應溶液中過渡金屬離子的濃度是0.01 mM - 0.2 mM。 藉由使用EDTA作為螯合劑，在純化步驟中去除過渡金屬離子，該螯合劑將在隨後的滲析、超濾或凝膠過濾中濾除。
取決於過渡金屬離子，對於步驟(a)中的反應，本領域技術人員可以選擇適當的緩衝體系，包括但不限於Hepes、組氨酸緩衝液、PBS、MES等。在一個具體實施方案中，在步驟(a)中使用的緩衝體系是PBS。
反應的最適pH將典型地在大約5.5和大約8之間，例如大約5.5至7.5。最適反應條件當然將取決於所採用的特定反應物。
在一個實施方案中，緩衝液是pH值為7的PBS。
反應的最適溫度可以典型地在大約-10℃和37℃之間。例如，反應可以在大約0℃和20℃之間的溫度下過夜進行。
本領域技術人員應當理解，步驟(a)中的溫育時期和溫度取決於待綴合的特定抗體。基於特定抗體的溫育時期和溫度的確定在本領域普通技術人員的能力之內。例如，待綴合的抗體典型地與還原劑在過渡金屬離子的存在下在4℃溫育過夜。
在一些實施方案中，反應中抗體濃度為0.01 mM – 0.1 mM。在一個特定實施方案中，抗體濃度為0.02 mM。
例如，待綴合的抗體、過渡金屬離子和還原劑可以在反應混合物中以1:2:4比率的莫耳濃度存在。在一個實施方案中，將0.02 mM抗體與0.08 mM TCEP和0.04 mM ZnCl2 在4℃溫育過夜。本領域技術人員應當理解，莫耳濃度也可以轉換為“eq”，並且在本發明上下文中1 mM可以轉換為0.5 eq。例如，“0.04 mM ZnCl2 ”可以轉換為“2 eq ZnCl2 ”。
對於待綴合的抗體，沒有特別限制。根據與疾病或病症相關的抗原（例如，特定的腫瘤相關抗原，病毒抗原，或微生物抗原），本領域技術人員可以選擇適當的用於本發明的生物綴合方法中的抗體。在一些實施方案中，抗體是這樣的抗體，其結合一種或多種腫瘤相關抗原或細胞表面受體（如本文其他部分描述的）。抗體可以包括但不限於單殖株抗體，多殖株抗體，單特異性抗體，多特異性抗體，或抗體衍生物。
在一個實施方案中，抗體是單殖株抗體。在另一個實施方案中，抗體是人抗體，人源化抗體或嵌合抗體。在另一個實施方案中，抗體是抗體片段，例如，Fv、Fab、Fab’ 、scFv、雙抗體(diabody) 、或F(ab’)2片段。在另一個實施方案中，抗體是基本上全長抗體，例如，IgG1抗體、IgG4抗體或其他抗體種類或同種型，如本文定義。在一個具體實施方案中，抗體是IgG1抗體。
在一些其他實施方案中，抗體選自：Herceptin (曲妥珠單抗)，Rituxan (利妥昔單抗)，Erbitux (西妥昔單抗)，或針對下述任一種抗原的抗體：BMPR1B, E16, STEAP1, MUC16, MPF, Napi2b, Sema 5b, PSCA hlg, ETBR, MSG783, STEAP2, TrpM4, CRIPTO, CD21, CD79b, FcRH2, HER2, NCA, MDP, IL20Ra, Brevican, EphB2R, ASLG659, PSCA, GEDA, BAFF-R, CD22, CD79a, CXCR5, HLA-DOB, P2X5, CD72, LY64, FcRH1, FcRH5, TENB2, PMEL17, TMEFF1, GDNF-Ra1, Ly6E, TMEM46, Ly6G6D, LGR5, RET, Ly6K, GPR19, GPR54, ASPHD1, 酪氨酸酶, TMEM118, GPR172A, CD33和CLL-1。
有用的多殖株抗體是來源於經免疫的動物的血清的異質群體的抗體分子。本領域公知的各種方法可以用於製備針對目標抗原的多殖株抗體。例如，為了製備多殖株抗體，藉由用目標抗原或其衍生物注射，可以免疫各種宿主動物，包括但不限於兔、小鼠、大鼠和豚鼠。
有用的單殖株抗體是針對特定抗原（例如，癌細胞抗原，病毒抗原，微生物抗原，其與第二分子共價連接）的同質群體的抗體。藉由使用本領域已知的任何技術，可以製備針對目標抗原的單殖株抗體(mAb)，該技術藉由在培養物中的連續細胞系提供抗體分子的生產。這些包括但不限於最初由Kohler和Milstein (1975, Nature 256, 495497)描述的雜交瘤技術，人B細胞雜交瘤技術(Kozbor 等, 1983, Immunology Today 4: 72)，和EBV-雜交瘤技術(Cole 等, 1985, Monoclonal Antibody and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)。抗體可以屬於任何免疫球蛋白類別，包括IgG、IgM 、IgE 、 IgA、和IgD和其任何亞類。本發明使用的產生mAb的雜交瘤可以在體外或體內培養。
有用的單殖株抗體包括但不限於人單殖株抗體或嵌合人-小鼠（或其他物種）單殖株抗體。人單殖株抗體可以藉由本領域已知的許多技術(例如，Teng 等, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 7308-7312； Kozbor 等, 1983, Immunology Today 4, 72-79； 和Olsson 等, 1982, Meth. Enzymol. 92, 3-16)中的任一種製備。
本領域存在各種製備人抗體的方法。例如，藉由將免疫原施用於轉基因動物可以製備人抗體，該轉基因動物已經被改造來回應抗原攻擊而生產完整的人抗體或具有人可變區的完整抗體。關於從轉基因動物獲得人抗體的方法的綜述，參見Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005)。還參見例如，美國專利號6,075,181和6,150,584，它們描述了XENOMOUSE™技術； 美國專利號5,770,429，其描述了HUMAB®技術； 美國專利號7,041,870，其描述了K-M MOUSE®技術, 和美國專利申請公開號US 2007/0061900，其描述了VELOCIMOUSE®技術。
人抗體還可以藉由基於雜交瘤的方法製備。已經描述了人骨髓瘤和小鼠-人雜交骨髓瘤(heteromyeloma)細胞系用於製備人單殖株抗體(參見, 例如，Kozbor J. Immunol, 133: 3001 (1984)； Brodeur 等,單殖株 Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)； 和Boerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991))。藉由人B細胞雜交瘤技術產生的人抗體也在Li 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)中描述。另外的方法包括例如在美國專利號7,189,826 (描述了從雜交瘤細胞系中製備單殖株人IgM抗體)和Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (描述了人-人雜交瘤)中描述的那些。人雜交瘤技術(Trioma技術)也在Vollmers和Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)以及Vollmers和Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005)中描述。
人抗體還可以如下產生：分離Fv殖株可變結構域序列，其從人源噬菌體展示文庫中選擇。然後，該可變結構域序列可以與所需的人恆定區結構域組合。從抗體文庫中選擇人抗體的技術是本領域公知的。
另外，重組抗體，諸如嵌合和人源化單殖株抗體是有用的配體，該抗體包含人和非人部分兩者，可以使用標準重組DNA技術製備。嵌合抗體是這樣的分子，其中不同部分來源於不同動物物種，諸如具有來源於鼠單殖株的可變區和人免疫球蛋白恆定區的那些。(參見，例如，Cabilly 等, 美國專利號4,816,567； 和Boss 等, 美國專利號4,816,397，它們藉由引用完整地結合於此)。人源化抗體是來源於非人物種的抗體分子，其具有一個或複數來自非人物種的互補性決定區 (CDR)和來自人免疫球蛋白分子的構架區。(參見，例如，Queen, 美國專利號5,585,089，其藉由引用完整地結合於此)。這樣的嵌合和人源化單殖株抗體可以藉由本領域已知的重組DNA技術製備，例如使用以下中描述的方法：國際公開號WO 87/02671； 歐洲專利公開號184,187； 歐洲專利公開號171,496； 歐洲專利公開號173,494； 國際公佈號 WO 86/01533； 美國專利號4,816,567； 歐洲專利公開號125,023； Berter 等, 1988, Science 240:1041-1043； Liu 等, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443； Liu 等, 1987, J. Immunol. 139:3521-3526； Sun 等, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218； Nishimura 等, 1987, Canc. Res. 47:999-1005； Wood 等, 1985, Nature 314:446-449； 和Shaw 等, 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559； Morrison, 1985, Science 229:1202-1207； Oi 等, 1986, BioTechniques 4:214； 美國專利號5,225,539； Jones 等, 1986, Nature 321:552-525； Verhoeyan 等 (1988) Science 239:1534； 和Beidler 等, 1988, J. Immunol. 141:4053-4060； 它們每一個藉由引用完整地結合於此。
在一個特定實施方案中，將用於治療或預防癌症的已知的抗體用於本發明中。對於癌細胞抗原免疫特異性的抗體可以商購獲得或者藉由本領域技術人員已知的任何方法諸如例如化學合成或重組表達技術來製備。編碼對於癌細胞抗原免疫特異性的抗體的核苷酸序列可以獲得自例如GenBank資料庫或者類似於其的資料庫，文獻出版物，或藉由常規殖株和測序獲得。可用於癌症治療的抗體的實例包括但不限於：HERCEPTIN (曲妥珠單抗； Genentech, CA)，其為人源化抗HER2單殖株抗體，用於治療患有轉移性乳腺癌的患者 (Stebbing, J., Copson, E., 和O’Reilly, S. “Herceptin (trastuzamab) in advanced breast cancer” Cancer Treat Rev. 26, 287-90, 2000)； RITUXAN (利妥昔單抗； Genentech)，其為嵌合抗-CD20單殖株抗體，用於治療患有非霍奇金氏淋巴瘤的患者；Erbitux (西妥昔單抗； Merck)，其為針對EGF受體的IgG1單殖株抗體並且用於治療結直腸癌；OvaRex (AltaRex Corporation, MA)，其為用於治療卵巢癌的鼠抗體； Panorex (Glaxo Wellcome, NC)，其為用於治療結直腸癌的鼠IgG2a抗體；BEC2 (ImClone Systems Inc., NY)，其為用於治療肺癌的鼠IgG抗體；IMC-C225 (Imclone Systems Inc., NY)，其為用於治療頭頸癌的嵌合IgG抗體；Vitaxin (MedImmune, Inc., MD)，其為用於治療肉瘤的人源化抗體；Campath I/H (Leukosite, MA)，其為用於治療慢性淋巴細胞白血病(CLL)的人源化IgG1抗體；Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA)，其為用於治療急性髓細胞性白血病(AML)的人源化IgG抗體；LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ)，其為用於治療非霍奇金氏淋巴瘤的人源化IgG抗體；Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA)，其為用於治療非霍奇金氏淋巴瘤的人源化抗體；Oncolym (Techniclone, Inc., CA)，其為用於治療非霍奇金氏淋巴瘤的鼠抗體；Allomune (BioTransplant, CA)，其為用於治療霍奇金氏病或非霍奇金氏淋巴瘤的人源化抗-CD2 mAb；抗-VEGF (Genentech, Inc., CA)，其為用於治療肺癌和結直腸癌的人源化抗體；CEAcide (Immunomedics, NJ)，其為用於治療結直腸癌的人源化抗-CEA抗體；IMC-1C11 (ImClone Systems, NJ)，其為用於治療結直腸癌、肺癌和黑素瘤的抗-KDR嵌合抗體；和Cetuximab (ImClone, NJ)，其為用於治療表皮生長因數陽性癌症的抗-EGFR嵌合抗體。
用於治療癌症的其他抗體包括但不限於針對以下抗原的抗體：CA125 (卵巢癌), CA15-3 (癌), CA19-9 (癌), L6 (癌), Lewis Y (癌), Lewis X (癌), α 胎蛋白(癌), CA 242 (結直腸癌), 胎盤鹼性磷酸酶(癌), 前列腺特異性抗原(前列腺癌), 前列腺酸性磷酸酶(前列腺癌), 上皮生長因數(癌), MAGE-1 (癌), MAGE-2 (癌), MAGE-3 (癌), MAGE 4 (癌), 抗-轉鐵蛋白受體(癌), p97 (黑素瘤), MUC1-KLH (乳腺癌), CEA (結直腸癌), gp100 (黑素瘤), MART1 (黑素瘤), PSA (前列腺癌), IL-2受體(T-細胞白血病和淋巴瘤), CD20 (非霍奇金氏淋巴瘤), CD52 (白血病), CD33 (白血病), CD22 (淋巴瘤), 人絨毛膜促性腺激素(癌), CD38 (多發性骨髓瘤), CD40 (淋巴瘤), 黏蛋白(癌), P21 (癌), MPG (黑素瘤), 和Neu癌基因產物(癌)。一些具體的有用抗體包括但不限於：BR96 mAb (Trail, P. A., Willner, D., Lasch, S. J., Henderson, A. J., Hofstead, S. J., Casazza, A. M., Firestone, R. A., Hellström, I., Hellström, K. E., “Cure of Xenografted Human Carcinomas by BR96-Doxorubicin Immunoconjugates” Science 1993, 261, 212-215), BR64 (Trail, Pa., Willner, D, Knipe, J., Henderson, A. J., Lasch, S. J., Zoeckler, M. E., Trailsmith, M. D., Doyle, T. W., King, H. D., Casazza, A. M., Braslawsky, G. R., Brown, J. P., Hofstead, S. J., Greenfield, Ill. S., Firestone, R. A., Mosure, K., Kadow, D. F., Yang, M. B., Hellstrom, K E., 和Hellstrom, I. “Effect of Linker Variation on the Stability, Potency, and Efficacy of Carcinoma-reactive BR64-Doxorubicin Immunoconjugates” Cancer Research 1997, 57, 100-105), 針對CD40抗原的mAb，諸如S2C6 mAb (Francisco, J. A., Donaldson, K. L., Chace, D., Siegall, C. B., 和Wahl, A. F. “Agonistic properties and in vivo antitumor activity of the anti-CD-40 antibody, SGN-14” Cancer Res. 2000, 60, 3225-3231), 針對CD70抗原的mAb, 諸如1F6 mAb, 和針對CD30抗原的mAb, 諸如AC10 (Bowen, M. A., Olsen, K. J., Cheng, L., Avila, D., 和Podack, E. R. “Functional effects of CD30 on a large granular lymphoma cell line YT” J. Immunol., 151, 5896-5906, 1993)。許多其他結合腫瘤相關抗原的內化抗體可以用於本發明，並且已有相關綜述(Franke, A. E., Sievers, E. L., 和Scheinberg, D. A., “Cell surface receptor-targeted therapy of acute myeloid leukemia: a review” Cancer BiotherRadiopharm. 2000, 15,459-76； Murray, J. L., “Monoclonal antibody treatment of solid tumors: a coming of age” Semin Oncol. 2000, 27, 64-70； Breitling, F., 和Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley, & Sons, New York, 1998)。
在另一個具體實施方案中，用於治療或預防自身免疫疾病的已知的抗體按照本發明的方法使用。負責生產自身免疫抗體的針對細胞抗原的免疫特異性抗體可以獲自任何組織（例如，大學科學家或公司，諸如Genentech）或者藉由本領域技術人員已知的任何方法諸如例如化學合成或重組表達技術來製備。在另一個實施方案中，對於自身免疫疾病治療免疫特異性的有用配體抗體包括但不限於：抗-核抗體；抗dsDNA； 抗ssDNA, 抗心磷脂抗體 IgM, IgG；抗磷脂抗體 IgK, IgG；抗SM抗體；抗線粒體抗體；甲狀腺抗體；微粒體抗體，甲狀腺球蛋白抗體，抗SCL-70；抗-Jo；抗-U1RNP；抗-La/SSB；抗SSA；抗SSB；抗Perital細胞抗體；抗組蛋白； 抗RNP；C-ANCA；P-ANCA；抗著絲粒；抗-纖維蛋白，和抗GBM抗體。
在另一個具體實施方案中，對於病毒抗原或微生物抗原免疫特異性的有用抗體是單殖株抗體。例如，對於病毒抗原或微生物抗原而言免疫特異性的抗體可以是人源化或人單殖株抗體。如本文所用，術語“病毒抗原”包括但不限於能夠引發免疫應答的任何病毒肽、多肽蛋白(例如HIV gp120， HIV nef，RSV F糖蛋白，流感病毒神經氨酸酶，流感病毒血凝素，HTLV tax，單純皰疹病毒糖蛋白(例如gB, gC, gD和gE)和乙型肝炎表面抗原)。如本文所用，術語“微生物抗原”包括但不限於能夠引發免疫應答的任何微生物肽、多肽、蛋白、糖、多糖或脂質分子(例如，細菌，真菌，致病原生動物或酵母多肽，包括例如LPS和莢膜多糖5/8)。
對於病毒抗原或微生物抗原免疫特異性的抗體可以商購獲得，例如獲自Genentech (San Francisco, Calif.)，或藉由本領域技術人員已知的任何方法製備，該方法諸如例如化學合成或重組表達技術。編碼對於病毒抗原或微生物抗原免疫特異性的抗體的核苷酸序列可以獲得自例如GenBank資料庫或類似於它的資料庫，文獻出版物，或藉由常規殖株和測序獲得。
在具體實施方案中，有用的抗體是用於治療或預防病毒或微生物感染的那些。可供用於治療病毒感染或微生物感染的抗體實例包括但不限於：SYNAGIS (MedImmune, Inc., MD)，其為人源化抗呼吸道合胞病毒(RSV)單殖株抗體，用於治療具有RSV感染的患者；PRO542 (Progenics)，其為用於治療HIV感染的CD4融合抗體；OSTAVIR (Protein Design Labs, Inc., CA)，其為用於治療乙型肝炎病毒的人抗體；PROTVIR (Protein Design Labs, Inc., CA)，其為用於治療巨細胞病毒(CMV)的人源化IgG1抗體；和抗-LPS抗體。
用於治療傳染病的其他抗體包括但不限於針對來自以下的抗原的抗體：致病細菌菌株(化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrheae)，腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)，白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)，破傷風梭菌(Clostridium tetani)，流感嗜血桿菌(Hemophilus influenza)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia) ，產酸克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenas) ，鼻硬結克雷伯氏菌(Klebsiella rhinoscleromotis) ，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ，霍亂弧菌(Vibrio colerae) ，大腸桿菌(Escherichia coli) ，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ，胎兒彎曲桿菌（弧菌）(Campylobacter (Vibrio) fetus), 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda），小腸結腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）， 鼠疫桿菌（Yersinia pestis），假結核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis），痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae），弗氏志賀菌（Shigella flexneri），宋內志賀菌（Shigella sonnei），鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），蒼白密螺旋體（Treponema pallidum），雅司螺旋體（Treponema pertenue），斑點病密螺旋體(Treponema carateum) ，奮森疏螺旋體（Borrelia vincentii），伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi），出血性黃疸鉤端螺旋體（Leptospira icterohemorrhagiae），結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis），卡氏肺孢子蟲（Pneumocystis carinii），土拉文氏桿菌(Francisella tularensis)，流產布氏桿菌（Brucella abortus），豬布氏桿菌（Brucella suis），瑪律他布氏桿菌（Brucella melitensis），支原體屬（Mycoplasma spp.），斑疹傷寒立克次體（Rickettsia prowazeki），恙蟲病立克次體(Rickettsia tsutsugumushi) ，披衣菌屬(Chlamydia spp .))；致病真菌(粗球孢子菌(Coccidioides immitis)，煙麯黴(Aspergillus fumigatus)，白色念珠菌(Candida albicans)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)，新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)，莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum))；原生生物(赤痢變形蟲(Entomoeba histolytica)，弓形蟲(Toxoplasma gondii)，口腔毛滴蟲(Trichomonas tenas)，人毛滴蟲(Trichomonas hominis)，陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)，剛比亞錐蟲(Tryoanosoma gambiense)，德西亞錐蟲(Trypanosoma rhodesiense)，克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)，黑熱病利什曼原蟲(Leishmania donovani)，熱帶利什曼原蟲(Leishmania tropica)，巴西利什曼原蟲(Leishmania braziliensis)，肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia)，間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)，惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)，瘧原蟲(Plasmodium malaria))；或蠕蟲(蟯蟲(Enterobius vermicularis)，鞭蟲(Trichuris trichiura)，蛔蟲(Ascaris lumbricoides)，旋毛蟲(Trichinella spiralis)，糞擬圓蟲(Strongyloides stercoralis)，日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)，曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)，埃及血吸蟲(Schistosoma haematobium)，及鉤蟲(hookworms))。
在本發明中用於治療病毒性疾病的其他抗體包括但不限於針對病原性病毒的抗原的抗體，該病毒作為實例和非限制性地包括：痘病毒科(Poxviridae)，皰疹病毒科(Herpesviridae)：1型單純皰疹病毒 (Herpes Simplex virus 1)、2型單純皰疹病毒(Herpes Simplex virus 2)，腺病毒科(Adenoviridae)，乳多瘤病毒科(Papovaviridae)，腸道病毒科(Enteroviridae)，小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，小DNA病毒科(Parvoviridae)，呼腸孤病毒科(Reoviridae)，反轉錄病毒科(Reoviridae)，流感病毒(influenza viruses)，副流感病毒(parainfluenza viruses)，流行性腮腺炎(mumps)，麻疹(measles)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)，風疹(rubella)，蟲媒病毒科(Arboviridae)，彈狀病毒科(Rhabdoviridae)，沙粒病毒科(Arenaviridae)，A型肝炎病毒(Hepatitis A virus)，B型肝炎病毒(Hepatitis B virus)，C型肝炎病毒(Hepatitis C virus)，E型肝炎病毒(Hepatitis E virus)，非A型/非B型肝炎病毒(Non A/Non B Hepatitis virus)，鼻病毒科(Rhinoviridae)，冠狀病毒科(Coronaviridae)，輪狀病毒科(Rotoviridae)，及人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)。
適合用於本文提供的生物綴合方法的抗體可以藉由本領域已知的合成抗體的任何方法來製備，特別是藉由化學合成或藉由重組表達，並且例如藉由重組表達技術製備。
對於待綴合到所選抗體上的攜帶反應性基團的有效負載，其通常具有藥物-接頭的形式。對於可以用於本發明的生物綴合方法中的藥物和接頭沒有特別限制，只要藥物分子具有抗腫瘤、抗病毒或抗微生物效果並且含有允許與接頭結構連接的至少一個取代基團或部分結構，並且該接頭含有至少兩個反應性基團，其中一個可以共價結合藥物分子並且另一個能夠共價偶聯抗體。
取決於所需藥物和所選接頭，本領域技術人員可以選擇適當的方法將它們偶聯在一起。例如，一些常規的偶聯方法，諸如胺偶聯法，可以用於形成所需的藥物-接頭複合物，該藥物-接頭複合物仍然含有用於藉由共價連接與抗體綴合的反應性基團。將藥物-馬來醯亞胺複合物 (即馬來醯亞胺連接的藥物)當作本發明中攜帶反應性基團的有效負載的一個實例。
在一個實施方案中，藥物可以包括但不限於細胞毒性劑，諸如化療劑，免疫治療劑等，抗病毒劑或抗微生物劑。在一個實施方案中，與抗體綴合的藥物可以選自但不限於MMAE (單甲基奧利斯他汀E (monomethyl auristatin E)), MMAD (單甲基奧利斯他汀D), MMAF (單甲基奧利斯他汀F)等。
在ADC製備中能夠結合巰基的最常見的反應性基團是馬來醯亞胺。此外，有機溴化物、碘化物也是經常使用的。
藥物負載由ADC分子中每個抗體的藥物部分的數目表示。對於某些抗體-藥物綴合物，藥物負載可以受限於抗體上連接位元點的數目。例如，當連接是半胱氨酸巰基時，如在本文描述的某些例舉性實施方案中，藥物負載可以在0至8個藥物部分/抗體範圍內。在某些實施方案中，較高的藥物負載，例如p ≥5，可以導致聚集，不溶性，毒性，或喪失某些抗體-藥物綴合物的細胞穿透性。在某些實施方案中，抗體-藥物綴合物的平均藥物負載的範圍為1至大約8；大約2至大約6；或大約3至大約5。實際上，已經顯示對於某些抗體-藥物綴合物，每個抗體的藥物部分的最適比率可以是4 (參見，例如，WO2013190292)。
應當理解，當超過一個親核基團與藥物反應時，那麼得到的產物是抗體-藥物綴合物化合物的混合物，具有一個或複數與抗體連接的藥物部分的分佈。每個抗體的藥物的平均數目可以藉由雙重ELISA抗體測定從混合物中計算，該雙重ELISA抗體測定對於抗體是特異性的並且對於藥物是特異性的。藉由質譜法可以鑒定混合物中單個抗體-藥物綴合物分子，並且可以藉由HPLC（例如，疏水相互作用色譜法）分離(參見，例如，McDonagh等(2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307； Hamblett等(2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070； Hamblett, K.J.等“Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate（藥物負荷對於抗-CD30抗體-藥物綴合物的藥理學、藥動學和毒性的影響）”，摘要編號 624, American Association for Cancer Research（美國癌症研究協會），2004年年會，3月27-31日，2004 ，Proceedings of the AACR，卷45，2004年3月；Alley, S.C., 等“Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates（控制抗體-藥物綴合物中藥物連接的位置）” ， 摘要編號 627，American Association for Cancer Research（美國癌症研究協會），2004年年會，3月27-31日， 2004，Proceedings of the AACR， 卷45, 2004年3月)。在某些實施方案中，藉由電泳或色譜法可以從綴合混合物中分離具有單一負載值的同質抗體-藥物綴合物。
改善ADC的同質性要求分離在綴合過程中具有特定藥物負載或選擇性的藥物部分與抗體的連接的ADC。然而，分離具有特定藥物負載的ADC將導致複雜的操作和高成本。將使用相同步驟但是在步驟(a)中不加入過渡金屬離子的綴合方法作為陰性對照(參見US7659241B2)，本發明人成功地顯示了過渡金屬離子是負責獲得的ADC中高水準的D4和低水準的D0、D6和D8的關鍵因素。此外，本發明人還證實該新方法產生了具有高Fab偏好的ADC產物。藉由使用本發明的生產抗體-藥物綴合物的方法，抗體-藥物綴合物的同質性高於藉由常規綴合方法生產的那些。具體地，在藉由本發明的方法製備的ADC中，D0+D8的含量低於10wt%並且D6的含量低於10wt%。此外，D4的含量通常超過65wt%，並且例如超過70wt%，而在藉由常規綴合方法製備的ADC中D4的含量通常低於40 wt%。
在一個實施方案中，得到的抗體-藥物綴合物藉由任何適當的純化方法回收，諸如使用脫鹽柱、尺寸排阻層析、超濾、滲析、UF-DF等等。 具有改善的同質性的抗體-藥物綴合物。
在第二方面，本發明涉及藉由第一方面的方法製備的具有改善的同質性的抗體-藥物綴合物。ADC的改善的同質性藉由得到的ADC中高水平的D4表示。
在一個實施方案中，測量藉由第一方面的方法產生的抗體-藥物綴合物的同質性，並且與藉由常規綴合方法產生的對應的對照抗體-藥物綴合物的同質性進行比較。
可以使用各種分析方法來確定抗體-藥物綴合物的收率和異構體混合物。例如，在一個實施方案中，HIC是用於確定獲得的抗體-藥物綴合物 (例如，對於D4綴合物)的收率和異構體混合物。該技術能夠分離負載有各種數目的藥物的抗體。藥物負荷水平可以基於例如在250 nm和280 nm的吸光度的比率來確定。例如，如果藥物可以在250 nm吸收而抗體在280 nm吸收。因此，250/280比率隨著藥物負載而增加。使用本文該的生物綴合方法，通常具有偶數數目的藥物的抗體被觀察到與抗體綴合，因為二硫鍵的還原產生偶數數目的游離半胱氨酸巰基。圖1、圖3和圖5分別顯示了藉由本發明的方法製備的Herceptin-MC-VC-PAB-MMAE綴合物、Rituxan-MC-VC-PAB-MMAE綴合物和Erbitux-MC-VC-PAB-MMAE綴合物的HIC分離，並且圖2、圖4圖和圖6分別顯示了藉由常規綴合方法（無過渡金屬離子）製備的對應物的HIC分離。表1顯示了從HIC圖總結的產物分佈，清楚地顯示了D4的含量分別為73.5wt% (圖1), 75 wt% (圖3), 和77.9wt% (圖5)。
與藉由常規綴合方法產生的相應對照抗體-藥物綴合物相比，藉由第一方面的方法產生的抗體-藥物綴合物具有改善的同質性，其由獲得的ADC中增加的D4含量所表示。在一個實施方案中，如表1所示，藉由本發明方法產生的抗體-藥物綴合物中D4含量高於65wt%，例如高於70wt%，高於77wt%，而藉由常規綴合方法產生的抗體-藥物綴合物中D4含量通常低於40wt%。 藥物組合物
在第三方面，本發明涉及藥物組合物，其包含：有效量的藉由第一方面的方法製備的具有改善的同質性的ADC；和藥用載體或媒介物。該組合物適合於獸醫或人施用。
本發明的組合物可以是允許將組合物施用於動物的任何形式。例如，組合物可以是固體、液體或氣體（氣溶膠）形式。施用的典型途徑包括但不限於口服、局部、腸胃外、舌下、直腸、陰道、眼和鼻內。腸胃外給藥包括皮下注射，靜脈內、肌內、胸骨內注射或輸注技術。例如，組合物可以腸胃外施用。本發明的藥物組合物可以配製成允許本發明的ADC在將組合物給藥於動物後可生物利用。組合物可以採取一個或複數劑量單位的形式，其中例如，片劑可以是單個劑量單位，並且用於氣溶膠形式的本發明的ADC的容器可以容納複數劑量單位。
用於製備藥物組合物的材料可以在使用量下是非毒性的。本領域普通技術人員將明白藥物組合物中一種或多種活性組分的最適劑量將取決於各種因素。相關因素包括但不限於動物類型（例如，人）、本發明ADC的具體形式、給藥方式和所用的組合物。
適當的組分可以包括例如抗氧化劑，填料，黏合劑，崩解劑，緩衝劑，防腐劑，潤滑劑，調味劑，增稠劑，著色劑，乳化劑或穩定劑如糖和環糊精。適當的抗氧化劑可以包括例如甲硫氨酸，抗壞血酸，EDTA，硫代硫酸鈉，鉑，過氧化氫酶，檸檬酸，半胱氨酸，硫代甘油，巰基乙酸，硫代山梨糖醇，丁基化羥基茴香醚，丁基化羥基甲苯，和/或沒食子酸丙酯。如本文所揭露，在本文提供的藥物組合物中包括一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸降低了多肽複合物或雙特異性多肽複合物的氧化。這種氧化的減少防止或降低了結合親和力的喪失，由此改善了蛋白穩定性和將貨架期最大化。因此，在某些實施方案中，提供包含本文揭露的多肽複合物或雙特異性多肽複合物和一種或多種抗氧化劑如甲硫氨酸的組合物。
為了進一步闡述，藥用載體可以包括例如水性媒介物如氯化鈉注射液，林格氏注射液，等滲葡萄糖注射液，無菌水注射液，或葡萄糖和乳酸化林格氏注射液，非水性媒介物諸如植物來源的不揮發性油，棉籽油，玉米油，芝麻油，或花生油，抑制細菌或抑制真菌濃度的抗微生物劑，等滲劑諸如氯化鈉或葡萄糖，緩衝液諸如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液，抗氧化劑諸如硫酸氫鈉，局部麻醉劑如鹽酸普魯卡因，懸浮劑和分散劑如羧甲基纖維素鈉，羥丙基甲基纖維素，或聚乙烯吡咯烷酮，乳化劑如聚山梨醇酯80 (吐溫-80)，掩蔽劑或螯合劑如EDTA (乙二胺四乙酸)或EGTA (乙二醇四乙酸)，乙醇，聚乙二醇，丙二醇，氫氧化鈉，鹽酸，檸檬酸，或乳酸。用作載體的抗微生物劑可以加入多劑量容器中的藥物組合物，包括苯酚或甲酚，汞劑，苯甲醇，氯代丁醇，對羥基苯甲酸甲酯和丙酯，硫柳汞，苯紮氯銨和苄索氯銨。適當的賦形劑可以包括例如水，鹽水，葡萄糖，甘油，或乙醇。適當的非毒性輔助物質可以包括例如潤濕劑或乳化劑，pH緩衝劑，穩定劑，溶解度增強劑，或諸如乙酸鈉、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精的試劑。
藥物組合物可以是液體溶液劑，混懸劑，乳劑，丸劑，膠囊，片劑，緩釋製劑或粉末劑。口服製劑可以包括標準載體如藥物級甘露醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。
在某些實施方案中，將藥物組合物配製成注射劑組合物。注射劑藥物組合物可以以任何常規形式製備，諸如例如液體溶液，混懸液，乳液或適合產生液體溶液、混懸液或乳液的固體形式。注射用製劑可以包括無菌和/或非熱原注射備用溶液，無菌乾燥可溶產品，諸如凍乾粉末，準備好剛好在使用前與溶劑組合，包括皮下注射用片劑，注射備用的無菌混懸劑，準備好剛好在使用前與媒介物組合的無菌乾燥不溶性產品，和無菌和/或非熱原乳劑。溶液可以是水性或非水性的。
在某些實施方案中，將單位劑量的腸胃外製劑包裝在安瓿管、小瓶或具有針頭的注射器中。腸胃外給藥的所有制劑應當是無菌的和非熱原的，如在本領域已知的和實踐的。
在某些實施方案中，藉由將本文揭露的ADC溶解在適當溶劑中來製備無菌凍乾粉末。該溶劑可以含有改善粉末或從粉末製備的重構溶液的穩定性或其他藥理學成分的賦形劑。可以使用的賦形劑包括但不限於水，葡萄糖（dextrose），山梨糖醇，果糖，玉米糖漿，木糖醇，甘油，葡萄糖，蔗糖或其他適當試劑。溶劑可以含有緩衝劑，諸如檸檬酸鹽，磷酸鈉或磷酸鉀或本領域技術人員已知的其他此類緩衝劑，其在一個實施方案中為大約中性pH下。隨後無菌過濾溶液，接著在本領域技術人員已知的標準條件下凍乾，提供了所需製劑。在一個實施方案中，獲得的溶液將被分配到小瓶中進行凍乾。每個小瓶可以含有單個劑量或複數劑量的本文提供的ADC或其組合物。用超過一個劑量或一組劑量所需的少量（例如，大約10%）過量裝填小瓶是可接受的，以便促進準確的樣品取出和準確的劑量給藥。凍乾粉末可以在適當條件下（諸如約4 °C至室溫）保存。
用注射用水重構凍乾粉末提供了用於腸胃外給藥的製劑。在一個實施方案中，對於重構無菌和/或非熱原水或其他液體，將適當載體加入凍乾粉末。精確量取決於被給予的所選治療，並且可以憑經驗測定。
另外，抗體-藥物綴合物或藥物組合物可以製備成試劑盒，包括插頁（insert），其指示應用信息，諸如適應症、使用量、給藥途徑等。 具有改善的同質性的抗體-藥物綴合物的用途
在第四方面，本發明涉及藉由第一方面的方法製備的具有改善的同質性的抗體-藥物綴合物在製備用於治療受試者的病症或疾病的藥物組合物或試劑盒中的應用。
受試者可以是哺乳動物，例如人。
被治療的病症或疾病可以是腫瘤、癌症、自身免疫疾病或傳染病。在特定實施方案中，傳染病可以是病毒或微生物感染。
在第五方面，本發明還涉及一種治療患有病症或疾病的受試者的方法，包括：向有此需要的受試者施用治療有效量的藉由第一方面的方法製備的具有改善的同質性的ADC或治療有效量的包含藉由第一方面的方法製備的具有改善的同質性的ADC的藥物組合物，由此治療或預防該病症或疾病。
在某些實施方案中，受試者已經被鑒定為患有可能響應於本文提供的ADC的病症或疾病。
受試者可以是哺乳動物，例如人。
待治療的病症或疾病可以是腫瘤、癌症、自身免疫疾病或傳染病。在特定實施方案中，傳染病可以是病毒或微生物感染。
本文提供的ADC的治療有效量將取決於本領域已知的各種因素，諸如例如受試者的體重、年齡、過往醫療史、目前藥物、健康狀態和可能的交叉反應、變態反應、敏感性和不利的副作用、以及給藥途徑和疾病發展程度。由這些和其他情況或要求所指示，本領域普通技術人員（例如，醫師或獸醫師）可以按比例地減少或增加劑量。
在某些實施方案中，本文提供的ADC或藥物組合物可以以下述治療有效量施用：大約0.01 mg/kg至大約100 mg/kg (例如，大約0.01 mg/kg，大約0.5 mg/kg，大約1 mg/kg，大約2 mg/kg，大約5 mg/kg，大約10 mg/kg，大約15 mg/kg，大約20 mg/kg，大約25 mg/kg，大約30 mg/kg，大約35 mg/kg， 大約40 mg/kg，大約45 mg/kg，大約50 mg/kg，大約55 mg/kg，大約60 mg/kg， 大約65 mg/kg，大約70 mg/kg，大約75 mg/kg，大約80 mg/kg，大約85 mg/kg大約90 mg/kg大約95 mg/kg，或大約100 mg/kg)。在這些實施方案中的某個中，本文提供的ADC或藥物組合物以大約50 mg/kg或以下的劑量施用，並且在這些實施方案中的某個中，劑量是10 mg/kg或以下，5 mg/kg或以下，1 mg/kg或以下， 0.5 mg/kg或以下，或0.1 mg/kg或以下。在某些實施方案中，給藥劑量可以在治療期間變化。例如，在某些實施方案中，初始給藥劑量可以高於隨後的給藥劑量。在某些實施方案中，給藥劑量可以依據受試者的反應在治療期間改變。
可以調整劑量方案以提供最適所需反應(例如，治療反應)。例如，可以施用單個劑量，或者可以隨時間施用數個分劑量。
本文提供的ADC或藥物組合物可以藉由本領域公知的任何途徑施用，該途徑諸如例如腸胃外（例如，皮下，腹膜內，靜脈內，包括靜脈內輸注，肌內，或皮內注射）或非腸胃外（例如，口服，鼻內，眼內，舌下，直腸，或局部）途徑。
在某些實施方案中，本文提供的ADC或藥物組合物治療的病症或疾病是癌症或癌性病症，自身免疫疾病或傳染病。
癌症可以是抗原陽性癌，包括肺癌、乳腺癌、結癌腸、卵巢癌和胰腺癌的那些，例如，與在“腫瘤相關抗原(TAA)”標題下(1)-(53)列出的腫瘤相關抗原相關的癌症。
可以用本文提供的ADC或藥物組合物治療的其他具體類型的癌症包括但不限於實體瘤，包括但不限於：纖維肉瘤，黏液肉瘤，脂肪肉瘤，軟骨肉瘤，骨源性肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，內皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管內皮肉瘤，滑膜瘤，間皮瘤，尤因氏瘤，平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，結腸癌，結直腸癌，腎癌，胰腺癌，骨癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，食管癌，胃癌，口腔癌，鼻癌，喉癌，鱗狀細胞癌，基底細胞癌，腺癌，汗腺瘤，皮脂腺癌，乳頭狀癌，乳頭狀腺癌，囊腺癌，髓樣癌，支氣管癌，腎細胞癌，肝細胞瘤，膽管癌，絨毛膜癌，精原細胞瘤，胚胎性癌，Wilms’瘤，宮頸癌，子宮癌，睾丸癌，小細胞肺癌，膀胱癌，肺癌，上皮癌，膠質瘤，多形性膠質母細胞瘤，星形細胞瘤，髓母細胞瘤，顱咽管瘤，室鼓膜瘤，松果體瘤，成血管細胞瘤，聽神經瘤，少突神經膠質瘤，腦膜瘤，皮膚癌，黑素瘤，成神經細胞瘤，成視網膜細胞瘤；血源性癌症，包括但不限於：急性淋巴細胞性白血病 “ALL”， 急性淋巴細胞性B-細胞白血病，急性淋巴細胞性T-細胞白血病，急性髓性白血病“AML” ， 急性早幼粒細胞性白血病“APL”， 急性單核細胞性白血病，急性紅白血病性白血病，急性巨核細胞性白血病 ，急性髓單核細胞性白血病，急性非淋巴細胞性白血病， 急性未分化白血病，慢性髓性白血病 “CML” ，慢性淋巴細胞性白血病 “CLL” ，毛細胞白血病，多發性骨髓瘤；淋巴瘤： B細胞淋巴瘤，任選地霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤，其中非霍奇金淋巴瘤包括：瀰漫性大B細胞淋巴瘤 (DLBCL) ，濾泡型淋巴瘤，邊緣區B細胞淋巴瘤(MZL) ，黏膜相關淋巴組織淋巴瘤 (MALT) ，小淋巴細胞性淋巴瘤 (慢性淋巴細胞性白血病，CLL) ，或套細胞淋巴瘤 (MCL) ，急性淋巴細胞性白血病(ALL) ，或瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom’s Macroglobulinemia，WM)。
自身免疫疾病可以包括但不限於活動性慢性肝炎，阿狄森氏病(Addison’s Disease)，變應性肺泡炎，變態反應，變應性鼻炎，Alport’s綜合徵(Alport’s Syndrome)，過敏反應(Anaphlaxis)，強直性脊柱炎，抗磷脂綜合徵，關節炎，蛔蟲病，麯黴病，特應性變態反應，特應性皮炎，特應性鼻炎，貝赫切特綜合徵（Behcet’s Disease），養鳥人肺（Bird-Fancier’s Lung），支氣管哮喘，卡布蘭綜合徵(Caplan’s Syndrome)，心肌病，乳糜瀉，南美洲錐蟲病（Chagas’ Disease），慢性腎小球腎炎，科根綜合徵（Cogan’s Syndrome），冷凝集素病，先天性風疹感染，CREST綜合徵，克羅恩病，冷球蛋白血症，庫欣綜合徵(Cushing’s Syndrome)，皮肌炎，盤狀狼瘡（Discoid Lupus），心肌梗死後綜合徵（Dressler’s Syndrome），伊-蘭綜合徵（Eaton-Lambert Syndrome），埃可病毒感染（Echovirus Infection），腦脊髓炎（Encephalomyelitis），內分泌性視丘腦病（Endocrine opthalmopathy），EB病毒感染（Epstein-Barr Virus Infection），馬慢性肺氣腫（Equine Heaves），紅斑狼瘡（Erythematosis），埃文斯綜合徵（Evan’s Syndrome），費爾蒂綜合徵（Felty’s Syndrome），纖維肌痛（Fibromyalgia），富克斯睫狀體炎（Fuch’s Cyclitis），胃萎縮，胃腸過敏反應，巨細胞性動脈炎，腎小球性腎炎，古德帕斯徹綜合徵（Goodpasture’s Syndrome），移植物抗宿主病（Graft v. Host Disease），格雷夫斯病（Graves’ Disease），Guillain-Barre病，橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s Thyroiditis），溶血性貧血（Hemolytic Anemia），亨諾赫-舍恩萊因紫癜（Henoch-Schonlein Purpura），特發性腎上腺萎縮（Idiopathic Adrenal Atrophy），特發性肺原纖維炎（Idiopathic Pulmonary Fibritis），IgA腎病，炎性腸病，胰島素依賴性糖尿病，青少年型關節炎（Juvenile Arthritis），青少年糖尿病（I型），蘭-伊綜合徵（Lambert-Eaton Syndrome），蹄葉炎，扁平苔蘚（Lichen Planus），狼瘡狀肝炎（Lupoid Hepatitis），狼瘡，淋巴細胞減少，梅尼埃病（Meniere’s Disease），混合性結締組織病（Mixed Connective Tissue Disease），多發性硬化，重症肌無力，惡性貧血，多腺性綜合徵（Polyglandular Syndromes），早老性癡呆（Presenile Dementia），原發性無丙種球蛋白血症（Primary Agammaglobulinemia），原發性膽汁性肝硬化（Primary Biliary Cirrhosis），銀屑病，銀屑病關節炎，雷諾現象（Raynauds Phenomenon），復發性流產(recurrent abortion) ，賴特綜合徵（Reiter’s Syndrome），風濕熱，類風濕性關節炎，Sampter’s綜合徵（Sampter’s Syndrome），血吸蟲病，施密特綜合徵，硬皮病，舒爾曼綜合徵（Shulman’s Syndrome），斯耶格倫綜合徵（Sjorgen’s Syndrome），僵人綜合徵，交感性眼炎，系統性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erythematosis），Takayasu’s動脈炎，顳動脈炎，甲狀腺炎，血小板減少症，甲狀腺毒症，中毒性表皮壞死松解症（Toxic Epidermal Necrolysis），B型胰島素抗性，I型糖尿病，潰瘍性結腸炎，葡萄膜炎，白癜風，瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症（Waldenstrom’s Macroglobulemia），韋格納肉芽腫病（Wegener’s Granulomatosis）。
可以用本發明的ADC或藥物組合物治療的傳染病的具體類型包括但不限於細菌病：白喉，百日咳，隱性菌血症（Occult Bacteremia），尿路感染，胃腸炎，蜂窩織炎，會厭炎，氣管炎，腺樣體肥大（Adenoid Hypertrophy），咽後膿腫，膿皰病，深膿皰，肺炎，心內膜炎，膿毒性關節炎，肺炎球菌（Pneumococcal），腹膜炎，菌血症（Bactermia），腦膜炎，急性化膿性腦膜炎，尿道炎，子宮頸炎，直腸炎，咽炎，輸卵管炎，附睾炎，淋病，梅毒，李斯特菌病（Listeriosis），炭疽（Anthrax），諾卡菌病（Nocardiosis），沙門氏菌屬（Salmonella），傷寒症（Typhoid Fever），痢疾，結膜炎，竇炎，布魯菌病（Brucellosis），土拉菌病（Tullaremia），霍亂，腹股溝淋巴結鼠疫（Bubonic Plague），破傷風，壞死性腸炎，放線菌病，混合性厭氧感染（Mixed Anaerobic Infections），梅毒，回歸熱，鉤端螺旋體病，萊姆病，鼠咬熱（Rat Bite Fever），結核病，淋巴結炎，麻風，衣原體（Chlamydia），衣原體肺炎，沙眼，包涵體性結膜炎（Inclusion Conjunctivitis）；系統性真菌病：組織胞漿菌病（Histoplamosis），環孢子菌病（Coccicidiodomycosis），芽生菌病，孢子絲菌病，隱球菌病 ( Cryptococcsis)，系統性念珠菌病，麯黴病，毛黴病，足菌腫，廣色黴菌病（Chromomycosis）；立克次體病：斑疹傷寒，落磯山斑點熱（Rocky Mountain Spotted Fever），犬艾利希體症(Ehrlichiosis) ，東方蜱傳立克次體（Eastern Tick-Borne Rickettsioses），立克次氏體痘（Rickettsialpox），Q熱，巴爾通體病（Bartonellosis）；寄生蟲病：瘧疾，巴貝蟲病（Babesiosis），非洲昏睡病（African Sleeping Sickness），南美洲錐蟲病（Chagas' Disease），利什曼病，黑熱病（Dum-Dum Fever），弓形體病，腦膜腦炎，角膜炎，阿米巴病，賈第蟲病，隱孢子蟲病（Cryptosporidiasis），等孢球蟲病（Isosporiasis），環孢子蟲病（Cyclosporiasis），微孢子蟲病，蛔蟲病，鞭蟲感染，鉤蟲感染，蟯蟲感染，眼幼蟲移行症（Ocular Larva Migrans），旋毛蟲病，麥地那龍線蟲病（Guinea Worm Disease），淋巴絲蟲病（Lymphatic Filariasis），羅阿絲蟲病，河盲症（River Blindness），犬心絲蟲感染（Canine Heartworm Infection），血吸蟲病，游泳者癢（Swimmer’s Itch），東方肺吸蟲（Oriental Lung Fluke），片吸蟲病，薑片蟲病（Fasciolopsiasis），後睾吸蟲病（Opisthorchiasis），絛蟲感染，包蟲病（Hydatid Disease），泡狀棘球囊病（Alveolar Hydatid Disease）；病毒病：麻疹，亞急性硬化性全腦炎，感冒（Common Cold），腮腺炎，風疹，薔薇疹，傳染性紅斑（Fifth Disease），水痘，呼吸道合胞病毒感染，哮吼（Croup），細支氣管炎，傳染性單核細胞增多症，脊髓灰質炎，皰疹性咽峽炎，手足口病，博恩霍爾姆病（Bornholm Disease），生殖器皰疹，生殖器疣，無菌性腦膜炎(Aseptic Meningitis)，心肌炎，心包炎，胃腸炎，獲得性免疫缺陷綜合徵(AIDS)，雷亥綜合徵（Rey’s Syndrome），川崎綜合徵（Kawasaki Syndrome），流行性感冒，支氣管炎，雙下肺病毒性肺炎(Viral “Walking” Pneumonia)，急性發熱性呼吸系統疾病，急性咽結膜熱，流行性角結膜炎，單純皰疹病毒1型(HSV-1)，單純皰疹病毒2型(HSV-2)，帶狀皰疹，巨細胞包涵體病（Cytomegalic Inclusion Disease），狂犬病，進行性多灶性白質腦病（Progressive Multifocal Leukoencephalopathy），庫魯病（Kuru），致命性家族性失眠症（Fatal Familial Insomnia），克-雅病（Creutzfeldt-Jakob Disease），格-施-沙病（Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease），熱帶痙攣性癱瘓(Tropical Spastic Paraparesis)，西方馬腦炎，加利福尼亞腦炎，聖路易腦炎（St. Louis Encephalitis），黃熱病，登革熱，淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎，拉沙熱，出血熱，漢他病毒肺綜合症（Hantvirus Pulmonary Syndrome），馬爾堡病毒感染（Marburg Virus Infections），伊波拉病毒感染，天花。
在一個實施方案中，本發明包括一種治療受試者中疾病或病症的方法，包括向該受試者施用有效量的本文提供的ADC或藥物組合物和另一種治療劑。
在一些實施方案中，治療劑是抗癌劑。適當的抗癌劑包括但不限於氨甲蝶呤，泰素（taxol），L-天冬醯胺酶，巰基嘌呤，硫鳥嘌呤，羥基脲，阿糖胞苷，環磷醯胺，異環磷醯胺，亞硝基脲，順鉑，卡鉑，絲裂黴素，達卡巴嗪，丙卡巴肼，拓撲替康，氮芥類，環磷醯胺製劑（cytoxan），依託泊苷（etoposide），5-氟尿嘧啶，BCNU，伊立替康（irinotecan），喜樹鹼，博來黴素，多柔比星，伊達比星（idarubicin），柔紅黴素（daunorubicin），放線菌素D，普卡黴素，米托蒽醌，天冬醯胺酶，長春鹼，長春新鹼，長春瑞濱（vinorelbine），紫杉醇和多西他賽（docetaxel）。
在一些實施方案中，治療劑是抗自身免疫病試劑。適當的抗自身免疫病試劑包括但不限於環孢菌素，環孢菌素A，麥考酚酸嗎乙酯（mycophenylate mofetil），西羅莫司（Sirolimus），他克莫司（tacrolimus），依那西普（etanercept），潑尼松（prednisone），硫唑嘌呤（azathioprine），甲氨蝶呤環磷醯胺，潑尼松，氨基己酸，氯喹，羥基氯喹，氫化可的松，地塞米松，苯丁酸氮芥，DHEA，達那唑，溴隱亭，美洛昔康（meloxicam），和英利昔單抗(infliximab)。
在一些實施方案中，治療劑是抗傳染病試劑。在一個實施方案中，抗傳染病試劑是但不限於抗微生物劑：[β]-內醯胺抗生素：青黴素G，青黴素V，氯唑西林，雙氯青黴素，甲氧西林，萘夫西林，苯唑西林，氨苄青黴素，阿莫西林，巴卡西林，阿洛西林，羧苄青黴素，美洛西林，呱拉西林，替卡西林；氨基糖苷類：丁胺卡那黴素，慶大黴素，卡那黴素，新黴素，乙基西梭黴素，鏈黴素，妥布黴素；大環內酯：阿奇黴素（Azithromycin），克拉黴素（Clarithromycin），紅黴素，林可黴素，克林黴素；四環素類：地美環素，強力黴素，米諾環素，土黴素（Oxytetracyclinem），四環素；喹諾酮類：西諾沙星，萘啶酸；氟喹啉酮：環丙沙星，依諾沙星，格帕沙星，左氧氟沙星，洛美沙星，諾氟沙星，氧氟沙星，司氟沙星（Sparfloxacin），曲伐沙星 （Trovafloxicin）；多肽類：桿菌肽，黏菌素，多黏菌素B；磺胺類：硫代異噁唑（Sulfisoxazole），磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole），磺胺嘧啶（Sulfadiazine），磺胺甲二唑（Sulfamethizole），乙醯磺胺；雜類抗微生物試劑：甲氧苄啶（Trimethoprim），磺胺二甲唑（Sulfamethazole），氯黴素，萬古黴素，甲硝唑，奎奴普丁（Quinupristin），達福普丁（Dalfopristin），利福平，大觀黴素，呋喃妥因；抗病毒劑：通用抗病毒劑：碘苷，阿糖腺苷，三氟尿苷，阿昔洛韋（Acyclovir），泛昔洛韋(Famcicyclovir)，盤尼昔洛韋(Pencicyclovir)，伐昔洛韋（Valacyclovir），格西昔洛韋(Gancicyclovir)，膦甲酸鈉（Foscarnet），病毒唑（Ribavirin），金剛胺（Amantadine），金剛乙胺（Rimantadine），西多福韋（Cidofovir），反義寡核苷酸，免疫球蛋白，干擾素；用於HIV感染的藥物：齊多夫定，去羥肌苷（Didanosine），紮西他濱（Zalcitabine），司他夫定（Stavudine），拉米夫定（Lamivudine），奈韋拉平（Nevirapine），地拉韋定（Delavirdine），沙奎那韋（Saquinavir），利托那韋（Ritonavir），茚地那韋（Indinavir），奈非那韋（Nelfinavir）。
在一個具體實施方案中，為了證明本發明的方法，選擇三種抗體，Herceptin、Rituxan和Erbitux（分別根據揭露的相應蛋白序列，藉由用於製備單殖株抗體的標準方法，由WuXi Biologics製備）以進行與MC-VC-PAB-MMAE (可商購自Lenena, biopharma)的綴合。典型的一罐法方式的綴合實驗步驟如下：首先，將ZnCl2 (0.04 mM)和TCEP (0.08 mM)順序加入抗體溶液中（即，選自Herceptin、Rituxan或Erbitux的一種，0.02 mM，在磷酸鹽緩衝液中，pH7, 20 mM），以獲得反應混合物。使得反應混合物在4℃靜置過夜。然後，引入在DMA (二甲基乙醯胺，可商購自Aldrich Sigma)中的MC-VC-PAB-MMAE (0.12 mM)，並且反應在4℃持續2小時；之後，加入半胱氨酸(0.08 mM)以耗盡過量的MC-VC-PAB-MMAE；隨後，加入EDTA (0.08 mM)以捕獲Zn2+ 並且加入DHAA (可商購自Aldrich Sigma) (0.16 mM)以氧化過量的巰基。最後，使用脫鹽柱將反應混合物進行純化，使用HIC-HPLC分析藥物/抗體比率(DAR)和產物分佈。結果顯示在表1和圖1至圖6中。
提供以下實施例以更好地舉例說明本發明，其不應當理解為限制本發明的範圍。以下描述的所有的具體組合物、材料和方法在整體或部分上都落入本發明的範圍內。這些具體組合物、材料和方法不意欲限制本發明，而是僅僅為了舉例說明落入本發明範圍內的具體實施方案。在不使用創造性能力和不悖離本發明的範圍的情況下，本領域技術人員可以開發等價的組合物、材料和方法。應當理解，在本文描述的方法中可以進行許多變化，同時仍然保持在本發明的界限內。本發明人的目的是在本發明的範圍內包括這些變化。 實施例
現在參照以下實施例詳細闡述本發明。然而，本領域技術人員應當理解，以下實施例僅僅提供用於舉例說明，而不意欲以任何方式限制本發明。 實施例1. 藉由使用本發明的方法製備Herceptin-MC-VC-PAB-MMAE綴合物以及該綴合物的同質性
Herceptin-MC-VC-PAB-MMAE綴合物以一罐法反應製備： (1) 將ZnCl2 (0.04 mM)和TCEP (0.08 mM)加入Herceptin的溶液（根據揭露的相應蛋白序列，藉由用於製備單殖株抗體的標準方法，由WuXi Biologics製備，0.02 mM，在磷酸鹽緩衝液中，pH7, 20 mM）並且使得反應混合物在4℃靜置過夜； (2) 引入在DMA (二甲基乙醯胺, 可商購自Aldrich Sigma) 中的MC-VC-PAB-MMAE (可商購自Lenena, biopharma, 0.12 mM)，並且反應在4℃持續2小時； (3) 加入半胱氨酸(0.08 mM)以耗盡過量的MC-VC-PAB-MMAE； (4) 加入EDTA (0.08 mM)以捕獲Zn2+並且加入DHAA (可商購自Aldrich Sigma, 0.16 mM)以氧化過量的巰基； (5) 使用脫鹽柱(類型: 40K, 0.5 mL, REF: 87766, Lot # SJ251704, 製造商: Thermo)將反應混合物進行純化。
作為對照，在0.05 mM TCEP存在下但沒有ZnCl2情況下以相同步驟進行反應。
同質性測定。最後，使用HIC-HPLC分析藥物/抗體比率(DAR)和產物分佈。在Toyopearl苯基650M HIC柱(Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA)上以10 mL/min的流速在環境溫度下藉由疏水相互作用色譜法(HIC)進行D0、D2、D4、D6和D8的純化。柱大小為1 mL/7.5 mg ADC。溶劑A為2.0 M NaCl和50 mM磷酸鈉pH 7。溶劑B為80% v/v 50 mM磷酸鈉pH 7和20% v/v乙腈。該柱預先用5個柱體積的溶劑A平衡。將ADC與0.67體積的5 M NaCl (最終2.0 M)混合並且施加到該柱上。該柱不保留D0。不同的負載藥物的物質藉由順序的分級梯度來洗脫：D2用35%溶劑B洗脫，D4用70%溶劑B洗脫，D6用95%溶劑B洗脫，並且D8用100%溶劑B洗脫。
結果顯示在表1和圖1至圖2中 表1
樣品名稱 D0 (wt%) D2 (wt%) D4 (wt%) D6 (wt%) D8 (wt%) HIC-DAR
Herceptin-MMAE ( 有 ZnCl2 , 圖 1) 2.3 10.1 73.5 7.7 6.3 4.1
Herceptin-MMAE ( 無 ZnCl2 , 圖 2) 6.2 28.4 38.3 20.7 6.4 3.9
實施例2. 藉由使用本發明的方法製備Rituxan-MC-VC-PAB-MMAE綴合物以及該綴合物的同質性
Rituxan-MC-VC-PAB-MMAE綴合物以一罐法反應製備： (1) 將ZnCl2 (0.04 mM)和TCEP (0.08 mM)順序加入Rituxan的溶液（根據揭露的相應蛋白序列，藉由用於製備單殖株抗體的標準方法，由WuXi Biologics製備，0.02 mM，在磷酸鹽緩衝液中，pH7, 20 mM）並且使得反應混合物在4℃靜置過夜； (2) 引入在DMA (可商購自Aldrich Sigma) 中的MC-VC-PAB-MMAE (可商購自Lenena, biopharma, 0.12 mM)，並且反應在4℃持續2小時； (3) 加入半胱氨酸(0.08 mM)以耗盡過量的MC-VC-PAB-MMAE； (4) 加入EDTA (0.08 mM)以捕獲Zn2+ 並且加入DHAA (可商購自Aldrich Sigma, 0.16 mM)以氧化過量的巰基； (5) 使用脫鹽柱(類型: 40K, 0.5 mL, REF: 87766, Lot # SJ251704, 製造商: Thermo)將反應混合物進行純化。
作為對照，在0.05 mM TCEP存在下但沒有ZnCl2 情況下以相同步驟進行反應。
同質性測定。最後，使用HIC-HPLC分析藥物/抗體比率(DAR)和產物分佈。在Toyopearl苯基650M HIC柱(Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA)上以10 mL/min的流速在環境溫度下藉由疏水相互作用色譜法(HIC)進行D0、D2、D4、D6和D8的純化。柱大小為1 mL/7.5 mg ADC。溶劑A為2.0 M NaCl和50 mM磷酸鈉pH 7。溶劑B為80% v/v 50 mM磷酸鈉pH 7和20% v/v乙腈。該柱預先用5個柱體積的溶劑A平衡。將ADC與0.67體積的5 M NaCl (最終2.0 M)混合並且施加到該柱上。該柱不保留D0。不同的負載藥物的物質藉由順序的分級梯度來洗脫：D2用35%溶劑B洗脫，D4用70%溶劑B洗脫，D6用95%溶劑B洗脫，並且D8用100%溶劑B洗脫。
結果顯示在表2和圖3至圖4中。 表2
樣品名稱 D0 (wt%) D2 (wt%) D4 (wt%) D6 (wt%) D8 (wt%) HIC-DAR
Rituxan-MMAE ( 有 ZnCl2 , 圖 3) 1.4 12.6 75.0 6.1 4.9 4.0
Rituxan-MMAE ( 無 ZnCl2 , 圖 4) 4.6 24.4 38.4 24.1 8.5 4.2
實施例3. 藉由使用本發明的方法製備Erbitux-MC-VC-PAB-MMAE綴合物以及該綴合物的同質性
Erbitux-MC-VC-PAB-MMAE綴合物以一罐法反應製備： (1) 將ZnCl2 (0.04 mM)和TCEP (0.08 mM)順序加入Erbitux的溶液（根據揭露的相應蛋白序列，藉由用於製備單殖株抗體的標準方法，由WuXi Biologics製備，0.02 mM，在磷酸鹽緩衝液中，pH7, 20 mM）並且使得反應混合物在4℃靜置過夜； (2) 引入在DMA (可商購自Aldrich Sigma) 中的MC-VC-PAB-MMAE (可商購自Lenena, biopharma, 0.12 mM)，並且反應在4℃持續2小時； (3) 加入半胱氨酸(0.08 mM)以耗盡過量的MC-VC-PAB-MMAE； (4) 加入EDTA (0.08 mM)以捕獲Zn2+ 並且加入DHAA (可商購自Aldrich Sigma, 0.16 mM)以氧化過量的巰基； (5) 使用脫鹽柱(類型: 40K, 0.5 mL, REF: 87766, Lot # SJ251704, 製造商: Thermo)將反應混合物進行純化。
作為對照，在0.05 mM TCEP存在下但沒有ZnCl2 情況下以相同步驟進行反應。
同質性測定。最後，使用HIC-HPLC分析藥物/抗體比率(DAR)和產物分佈。在Toyopearl苯基650M HIC柱(Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA)上以10 mL/min的流速在環境溫度下藉由疏水相互作用色譜法(HIC)進行D0、D2、D4、D6和D8的純化。柱大小為1 mL/7.5 mg ADC。溶劑A為2.0 M NaCl和50 mM磷酸鈉pH 7。溶劑B為80% v/v 50 mM磷酸鈉pH 7和20% v/v乙腈。該柱預先用5個柱體積的溶劑A平衡。將ADC與0.67體積的5 M NaCl (最終2.0 M)混合並且施加到該柱上。該柱不保留D0。不同的負載藥物的物質藉由順序的分級梯度來洗脫：D2用35%溶劑B洗脫，D4用70%溶劑B洗脫，D6用95%溶劑B洗脫，並且D8用100%溶劑B洗脫。
結果顯示在表3和圖5至圖6中。 表3
樣品名稱 D0 (wt%) D2 (wt%) D4 (wt%) D6 (wt%) D8 (wt%) HIC-DAR
Erbitux-MMAE ( 有 ZnCl2, 圖 5) 1.6 9.8 77.9 6.5 4.2 4.0
Erbitux-MMAE ( 無 ZnCl2, 圖 6) 8.1 28.5 35.5 21.0 6.8 3.8
如表1-3和圖1、圖3和圖5中所示，結果證明：D4的含量通常超過65 wt%，例如超過70 wt%，並且超過77 wt%(圖1、圖3和圖5)。相比之下，藉由在沒有過渡金屬離子的情況下的對照綴合方法製備的ADC中D4含量通常少於40 wt%(圖2、 圖4和圖6)。這些結果清楚地表明，使用過渡金屬離子藉由本發明的方法製備的ADC具有顯著改善的同質性。
本領域技術人員將進一步理解，在不悖離本發明的實質或中心屬性的情況下本發明可以以其他具體形式體現。因為本發明的上述說明僅揭露了其例舉性實施方案，應當理解其他變型落入本發明的範圍內。因此，本發明不限於本文已經詳細描述的具體實施方案。相反，應當參照後附請求項作為本發明範圍和內容的指示。
無
圖1. 藉由本發明的方法製備的Herceptin-MMAE綴合物的HIC。 圖2. 藉由使用常規方法製備的Herceptin-MMAE綴合物的HIC。 圖3. 藉由本發明的方法製備的Erbitux-MMAE綴合物的HIC。 圖4. 藉由使用常規方法製備的Erbitux-MMAE綴合物的HIC。 圖5. 藉由本發明的方法製備的Rituxan-MMAE綴合物的HIC。 圖6. 藉由使用常規方法製備的Rituxan-MMAE綴合物的HIC。

Claims (26)

  1. 一種製備抗體-藥物綴合物(ADC)的方法，其包括以下步驟：(a)將還原劑和待綴合的抗體在過渡金屬離子的存在下在緩衝體系中溫育，以選擇性地還原抗體內鏈間二硫鍵產生還原的巰基基團，其中該過渡金屬離子是Zn2+；(b)將過量的具有反應性基團的有效負載與步驟(a)得到的還原的巰基基團反應；和(c)加入氧化劑以將未反應的巰基再氧化，然後回收獲得的抗體-藥物綴合物。
  2. 如請求項1所述的方法，其中步驟(a)中使用的緩衝體系是Hepes、組氨酸緩衝液、PBS、或MES，並且該緩衝體系的pH值為5.5至8。
  3. 如請求項1所述的方法，其中步驟(a)中的該抗體的濃度為0.01-0.1mM。
  4. 如請求項1所述的方法，其中步驟(a)在大約-10℃至37℃的溫度下進行。
  5. 如請求項4所述的方法，其中步驟(a)在大約0℃至20℃下進行。
  6. 如請求項1所述的方法，其中步驟(a)中的還原劑為TCEP。
  7. 如請求項1所述的方法，其中步驟(c)中的氧化劑為DHAA。
  8. 如請求項1所述的方法，其中該有效負載包含馬來醯亞胺部分、溴化物或碘化物。
  9. 如請求項1所述的方法，其中該抗體是單殖株抗體或多殖株抗體。
  10. 如請求項9所述的方法，其中該抗體是單殖株抗體。
  11. 如請求項1所述的方法，其中該抗體選自人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或它們的抗原結合部分。
  12. 如請求項1所述的方法，其中該抗體是IgG1或IgG4同種型。
  13. 如請求項1所述的方法，其中該有效負載包括診斷劑、治療劑或標記試劑。
  14. 如請求項1所述的方法，其中基於D0、D2、D4、D6和D8的總重量，該抗體-藥物綴合物中D4的含量高於65wt%。
  15. 如請求項14所述的方法，其中基於D0、D2、D4、D6和D8的總重量，該抗體-藥物綴合物中D4的含量高於70wt%。
  16. 如請求項1所述的方法，其中基於D0、D2、D4、D6和D8的總重量，該抗體-藥物綴合物中D0與D8的總含量低於10wt%，並且D6的含量低於10wt%。
  17. 如請求項1所述的方法，其中步驟(b)中，該有效負載選擇性地與該抗體的Fab區中的還原巰基反應。
  18. 一種藉由請求項1-17中任一項所述的方法製備的一抗體-藥物綴合物，其中基於D0、D2、D4、D6和D8的總重量，該抗體-藥物綴合物中D4的含量高於65wt%。
  19. 如請求項18所述的抗體-藥物綴合物，其中基於D0、D2、D4、D6和D8的總重量，該抗體-藥物綴合物中D4的含量高於70wt%。
  20. 如請求項18所述的抗體-藥物綴合物，其中基於D0、D2、D4、D6和D8的總重量，該抗體-藥物綴合物中D0與D8的總含量低於10wt%，並且D6的含量低於10wt%。
  21. 一種藥物組合物，其包含如請求項18-20中任一項所述的抗體-藥物綴合物和藥用載體或媒介物。
  22. 一種如請求項18-20中任一項所述的抗體-藥物綴合物在製備用於治療一受試者中的病症或疾病的藥物組合物或試劑盒中的用途。
  23. 如請求項22所述的用途，其中該病症或疾病是腫瘤、癌症、自身免疫病或傳染病。
  24. 如請求項23所述的用途，其中該傳染病是病毒性或微生物感染。
  25. 如請求項22所述的用途，其中該受試者是哺乳動物。
  26. 如請求項25所述的用途，其中該受試者是人。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210379193A1 (en) * 2019-02-15 2021-12-09 WuXi Biologics Ireland Limited Process for preparing antibody-drug conjugates with improved homogeneity
WO2023036137A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-16 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Process for preparing highly homogenous antibody-drug conjugates for engineered antibodies
WO2022078524A2 (en) * 2021-11-03 2022-04-21 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Specific conjugation of an antibody
WO2023222108A1 (zh) * 2022-05-20 2023-11-23 上海迈晋生物医药科技有限公司 抗体-药物偶联物的制备方法
US20240108744A1 (en) 2022-07-27 2024-04-04 Mediboston Limited Auristatin derivatives and conjugates thereof
WO2024041543A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Suzhou Bioreinno Biotechnology Limited Company A method of preparing an antibody with thiol group site-specific modifications and use of tcep
WO2024041544A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Suzhou Bioreinno Biotechnology Limited Company A method of preparing an antibody with site-specific modifications
CN117257977A (zh) * 2023-11-07 2023-12-22 正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司 用于制备抗体药物偶联物的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107922477A (zh) * 2015-06-29 2018-04-17 第三共株式会社 用于选择性制造抗体‑药物缀合物的方法

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
EP0247091B1 (en) 1985-11-01 1993-09-29 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
JP3878550B2 (ja) 2000-08-04 2007-02-07 株式会社ルネサステクノロジ 半導体装置の製造方法
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
JP4741838B2 (ja) 2002-07-31 2011-08-10 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド 癌、自己免疫疾患または感染症を治療するための薬物結合体およびその使用
CA2499300A1 (en) 2002-10-31 2004-05-21 Genentech, Inc. Methods and compositions for increasing antibody production
US7575893B2 (en) 2003-01-23 2009-08-18 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
AU2005218642B2 (en) 2004-03-02 2011-04-28 Seagen Inc. Partially loaded antibodies and methods of their conjugation
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
KR20140085544A (ko) * 2006-05-30 2014-07-07 제넨테크, 인크. 항체 및 면역접합체 및 이들의 용도
EP2144628B1 (en) 2007-05-08 2012-10-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
MY188455A (en) 2007-10-19 2021-12-09 Genentech Inc Cysteine engineered anti-tenb2 antibodies and antibody drug conjugates
JP6184695B2 (ja) 2009-12-04 2017-08-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性抗体、抗体アナログ、組成物、及び方法
WO2012074757A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
US20150125473A1 (en) 2012-06-19 2015-05-07 Polytherics Limited Novel process for preparation of antibody conjugates and novel antibody conjugates
PE20150891A1 (es) 2012-11-07 2015-06-11 Pfizer Anticuerpos anti-receptor de il-13 alfa 2 y conjugados de anticuerpo farmaco
BR112015030514A2 (pt) 2013-06-04 2017-08-29 Cytomx Therapeutics Inc Composições e métodos para conjugação de anticorpos ativáveis
JP2016531915A (ja) 2013-08-28 2016-10-13 ステムセントリックス， インコーポレイテッド 部位特異的抗体コンジュゲーション方法および組成物
EP3088419B1 (en) * 2013-12-25 2018-10-10 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-trop2 antibody-drug conjugate
CA2938450C (en) 2014-02-11 2023-10-17 Seattle Genetics, Inc. Selective reduction of proteins
CN110845615B (zh) 2014-03-21 2023-10-20 艾伯维公司 抗-egfr抗体及抗体药物偶联物
TWI745021B (zh) * 2014-04-10 2021-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗her3抗體-藥物結合物之製造方法
WO2015157595A1 (en) 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune, Llc Conjugated compounds comprising cysteine-engineered antibodies
KR20240011258A (ko) 2014-09-02 2024-01-25 이뮤노젠 아이엔씨 항체 약물 컨쥬게이트 조성물의 제형화 방법
WO2016141585A1 (zh) 2015-03-12 2016-09-15 华为技术有限公司 一种天线模式选择方法、装置及系统
DK3334760T3 (da) 2015-08-12 2021-04-19 Pfizer Antistofcysteiner med kappe og uden kappe, og deres anvendelse i antistof-lægemiddel-konjugering
MA45326A (fr) 2015-10-20 2018-08-29 Genentech Inc Conjugués calichéamicine-anticorps-médicament et procédés d'utilisation
RU2744860C2 (ru) 2015-12-30 2021-03-16 Кодиак Сайенсиз Инк. Антитела и их конъюгаты
US10814009B2 (en) 2016-02-12 2020-10-27 Byondis B.V. Selective reduction of cysteine-engineered antibodies
JP7244987B2 (ja) * 2016-12-14 2023-03-23 シージェン インコーポレイテッド 多剤抗体薬物コンジュゲート
KR20200010491A (ko) 2017-05-23 2020-01-30 신톤 바이오파머슈티칼즈 비.브이. 항체-약물 접합체를 제조하기 위한 이중 접합 방법
US20210379193A1 (en) * 2019-02-15 2021-12-09 WuXi Biologics Ireland Limited Process for preparing antibody-drug conjugates with improved homogeneity
CA3133802A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Immunogen, Inc. Methods of preparing cell-binding agent-drug conjugates

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107922477A (zh) * 2015-06-29 2018-04-17 第三共株式会社 用于选择性制造抗体‑药物缀合物的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mikael Erlandsson and Mattias Hallbrink "Metallic Zinc Reduction of Disulfide Bonds between Cysteine Residues in Peptides and Proteins" International Journal of Peptide Research and Therapeutics, Vol. 11, No. 4, 2005, pp. 261–265 *

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Publication number Publication date
JP2022520260A (ja) 2022-03-29
WO2020164561A1 (en) 2020-08-20
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US11478553B2 (en) 2022-10-25

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