JP2018502822A - Ｆａｐ及びｄｒ５に特異的な二重特異性抗体と化学療法剤との併用療法 - Google Patents

Ｆａｐ及びｄｒ５に特異的な二重特異性抗体と化学療法剤との併用療法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体、ＤＲ５に特異的な抗体に関し、特に、そのような二重特異性抗体と化学療法剤とを採用する併用療法、及びがんの治療のためのこれらの併用療法の使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な第１の抗原結合部位及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体と化学療法剤とを採用する併用療法、並びにがんの治療用のこれらの併用療法の使用に関する。
モノクローナル抗体は、がんの治療での強力な治療剤である。なぜならば、モノクローナル抗体は、がん細胞上で特異的に発現される抗原を選択的に標的とするからである。アゴニストモノクローナル抗体による、がん細胞上のＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシスを誘導するリガンド）デスレセプターの標的化は、標的とする細胞のアポトーシスを直接的に誘導することができることから、モノクローナル抗体療法の新たな創出を意味する。
ＴＲＡＩＬの結合時には、ＤＲ４及びＤＲ５等のＴＮＦＲ−ＳＦファミリーのデスレセプターは三量体化される。三量体化は、外因性アポトーシス経路、及びカスパーゼ活性化等の事象の複合カスケードを誘導し、このことにより、最終的に標的細胞が死滅する。アポトーシスの誘導は、ＤＲ５の高クラスター化（即ち、多数の三量体のクラスター化）が起こる場合に更に高められる。デスレセプターは様々な細胞タイプ上で広く発現されるが、外因性経路を介したアポトーシスの誘導は腫瘍細胞に限定される。抗体に結合するアゴニストＤＲ４又はＤＲ５はデスレセプターに架橋し、そのためアポトーシスを誘導することができることから、これらの受容体は、がん治療での標的として興味深い。少なくとも８種のデスレセプター標的分子が臨床開発に入っており、結腸直腸がん又は肺がんのような進行性の固形腫瘍等の様々な症状の治療になる可能性に関して臨床試験で評価されている。さらに、リンパ腫及び多発性骨髄腫等のその他の症状を治療しようと試みられている。
ＵＳ２００７／００３１４１４及び国際公開第２００６／０８３９７１号に記載の完全ヒトＤＲ５アゴニスト抗体であるドロジツマブは、高濃度で架橋することなく、ある程度のインビトロアポトーシス活性を示す。しかしながら、インビボでのデータから、下記の異なる作用機序が明らかとなった：ＦｃγＲ変異マウスにおいては（又はＦｃγＲ結合の阻害で抗体変異体が使用された場合に）、ドロジツマブは、この分子のインビボ活性がＦｃγＲ媒介性の架橋に主に依存することを示す不活性であった。この分子を第二相臨床まで試験しており、安全であると思われた（ＭＴＤは２０ｍｇ／ｋｇを超えていた）が、有意な有効性を全く示さなかった。
コナツムマブ（欧州１９２２３３７Ａ号に記載されている）は、別の完全ヒトＤＲ５アゴニスト抗体である。コナツムマブの活性は、Ｆｃ受容体による架橋に厳密に依存している。ドロジツマブとは対照的に、この抗体は非リガンド阻害である。この分子はまた、臨床試験において非常に限られた有効性を示すのみであった。
キメラＤＲ５抗体であるＬＢＹ−１３５は、架橋依存性の活性及び非リガンド阻害特性に関してコナツムマブと同様の特性を示しており、単剤療法では有意な有効性を全く示さなかった。さらに、ＬＢＹ−１３５は、第一相治験の登録患者の一部において免疫原性の兆候を示した。
ＤＲ４及びＤＲ５の組換えにより産生された天然型リガンド（ＴＲＡＩＬ）であるデュラネルミンは、臨床治験において限られた目的の反応を示すのみであった。天然型リガンドの使用には、下記の何らかの不都合がある：ＴＲＡＩＬはデスレセプター受容体及びデコイ受容体の両方等の多数の受容体を標的とし、したがって選択性が重要である。さらに、ＴＲＡＩＬの、用量及びスケジュールパラメータに影響を及ぼす因子である血液半減期は、モノクローナル抗ＤＲ抗体と比べてはるかに短い。ＴＲＡＩＬの血液半減期が非常に短いことから、モノクローナル抗ＤＲ抗体と比べて多量の及び頻繁な投与が必要である。さらに、組換えＴＲＡＩＬの産生は非常に難しくて退屈なものである。
上記に記載の３種全てのＤＲ５アゴニスト抗体及びリガンドの開発は中断された。
２種の更なる完全ヒト抗体であるマパツムマブ（抗ＤＲ４）及びレクサツムマブ（抗ＤＲ５）は依然として開発されているが、これらの分子も単剤療法では有望な有効性を示さなかった。
ティガツズマブは、言うまでも無く全身性の毒性問題のリスクを持つ二次架橋の非存在下において、（既に低濃度で）インビトロで活性であるといわれているヒト化ＤＲ５アゴニスト抗体である。しかしながら、全てのその他の記載したアゴニストＤＲ５抗体のように、この分子もこれまでＰｈＩ／ＰｈＩＩの研究において説得力のある有効性を示しておらず、最大耐用量であるＭＴＤは８ｍｇ／ｋｇ以下を示すのみであった。
デスレセプターを標的化することによりアポトーシスを誘導するための様々な手法が、四量体ＤＲ５結合ナノボディである分子ＴＡＳ２６６により続行されている（国際公開第２０１１／０９８５２０号）。ＤＲ５結合部分の四価構造に起因して、ＤＲ５の架橋は標準的な二価抗体と比べて増加すると考えられ、このことにより、活性が高まる可能性がある。しかしながら、分子ＴＡＳ２６６の小さいサイズに起因して、この分子は、（抗体と比べて）予想以上に短い半減期という欠点を有する。さらに、全身性の毒性のリスクが高くなる。なぜならば、この四量体分子は腫瘍を標的としないからである。
ＤＲ５抗体ドロジツマブと腫瘍抗原結合部分又は二重特異性抗体プラットフォームにおける腫瘍を囲む間質に存在する抗原との結合は、下記の２つの効果を達成するための新規の手法として本出願の発明者らにより説明されている。第１に、ＤＲ５結合抗体は、（特に架橋に非依存的な活性を示すＤＲ５抗体を使用する場合に）潜在的な全身性の毒性問題を避けることができる腫瘍部位を標的とすることができる。第２に、その結果、この腫瘍又は腫瘍間質を標的とする部分は、ＤＲ５過剰クラスター化を誘導し、その後に腫瘍部位特異的アポトーシスを誘導する架橋単位としても作用する。様々な腫瘍タイプを標的とするドロジツマブ＿ｓｃＦｖ融合分子を使用する基本概念が証明されている（国際公開第２０１１／０３９１２６号を参照されたい）。
ＤＲ５及びヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ５１６６８）に結合することができる二重特異性抗体が提唱されている。ヒトＦＡＰは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｆ１９を使用する線維芽細胞の培養において最初に同定された（国際公開第９３／０５８０４号に記載されている、ＡＴＣＣ番号ＨＢ ８２６９）。このタンパク質の相同物がマウス等のいくつかの種で発見された（Niedermeyer等, Int J Cancer 71, 383-389 (1997), Niedermeyer等, Eur J Biochem 254, 650-654 (1998)；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＨ１９１９０）。ＦＡＰは下記の独特な組織分布を有する：ＦＡＰの発現は、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、卵巣癌及び乳癌等の全ての原発性の及び転移性の上皮腫瘍の９０％超の反応性間質線維芽細胞で高度に上方制御されることが発見されたが、正常な成体組織では一般的に見られない（Rettig等, Proc Natl Acad Sci USA 85, 3110-3114 (1988)；Garin-Chesa等, Proc Natl Acad Sci USA 87, 7235-7239 (1990)）。その後の報告から、ＦＡＰは間質線維芽細胞中で発現されるだけでなく上皮起源のいくつかのタイプの悪性細胞中でも発現されており、ＦＡＰ発現は悪性の表現型と直接関連があることが分かった（Jin等, Anticancer Res 23, 3195-3198 (2003)）。
上記に記載した従来のＤＲ５標的分子の活性は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）媒介性の過剰クラスター化に依存しており、腫瘍中での免疫性の湿潤及び活性化状態による影響を受ける（Li及びRavetch, PNAS 2012；Wilson, Cancer Cell 2011；国際公開第２０１１／０９８５２０号）。Ｆｃ／ＦｃＲ相互作用を生理的なヒトＩｇＧレベルまで低下させることができる。そのため、従来のＤＲ５標的分子の活性は、わずかな湿潤性細胞に制限されることが多い（Moessner, Blood 2010）。ＤＲ５及びＦＡＰの両方を標的とする二重特異性抗体を使用することによって、ＦＡＰによる過剰架橋により敏感な腫瘍細胞の割合を著しく増加させることができ、ＤＲ５アゴニストに対する固有の耐性のリスクを低下させる。新規のＤＲ５結合部分はＦＡＰとの架橋後にのみ活性であり、これにより、ＤＲ５バインダーであるドロジツマブ及びティガツズマブと比較して安全性及び毒性プロファイルが改善される可能性がある。これまで試験されているＤＲ５アゴニストは臨床において安全であったが、この臨床プログラムは、ＤＲ５標的分子の低い有効性により妨げられている。
ＤＲ５アゴニスト抗体を使用してがんを標的とするための有効な治療法を発見することが、当該技術分野における課題であり続けている。
概して、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）を標的とする抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする第２の抗原結合部位とを組み合わせる二重特異性抗体、及び更なる化学療法剤を組み合わせたそれらの使用に関する。本発明に従って採用される二重特異性抗体は、デスレセプターを架橋された状態にし、標的化された腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができる。従来のデスレセプター標的抗体に対する利点は、ＦＡＰが発現される部位のみでのアポトーシスの誘導の特異性であり、更にＤＲ５の過剰クラスター化の誘導に起因するこの二重特異性抗体のより高い力価である。
したがって、一態様では、本発明は、がんの治療方法において併用療法として使用するための、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤と組み合わせて使用される、二重特異性抗体を提供する。
好ましくは、化学療法剤は、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される。一実施形態では、二重特異性抗体は、イリノテカンと組み合わせて使用される。そのような一実施形態のでは、治療しようとするがんは、結腸直腸がんである。一実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせて使用される。そのような一実施形態では、治療しようとするがんは、結腸直腸がんである。一実施形態では、二重特異性抗体は、ドキソルビシンと組み合わせて使用される。そのような一実施形態では、治療しようとするがんは、肉腫である。一実施形態では、二重特異性抗体は、ドキソルビシン、イホスファミドと組み合わせて使用される。そのような一実施形態では、治療しようとするがんは、肉腫である。
一実施形態では、二重特異性抗体は、ゲムシタビン及びアブラキサンと組み合わせて使用される。そのような一実施形態では、治療しようとするがんは、膵臓がんである。
一実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ＲＧ７３８８である。
一実施形態では、Ｂｃｌ−２阻害剤は、ＡＢＴ１９９である。
一実施形態では、ＰＡＲＰ阻害剤は、ＰＪ３４である。
一実施形態では、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブである。
一実施形態では、本発明は、がんの治療方法において併用療法として使用するための、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、がんが、結腸直腸がん、肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、乳がん、膵臓がん、胃がん、非小細胞肺癌、小細胞肺がん及び中皮腫である、二重特異性抗体を提供する。
一実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。
一実施形態では、肉腫は、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、消化管間質腫瘍、線維肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫又は悪性線維性組織球腫である。
一実施形態では、本発明は、がんの治療方法において併用療法として使用するための、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、二重特異性抗体及び化学療法剤が、任意選択的に組合せ製剤として、一緒に投与される、二重特異性抗体を提供する。
一実施形態では、二重特異性抗体及び化学療法剤は、交互に投与される。
一実施形態では、化学療法剤は、二重特異性抗体の前に投与される。
一実施形態では、化学療法剤は、二重特異性抗体の後に投与される。
一実施形態では、組合せは、約１週間から３週間のインターバルで投与される。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位が、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２；及び
（ｆ）配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、二重特異性抗体を採用する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位が、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２；及び
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、二重特異性抗体を採用する。
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号７及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１５及び配列番号１６の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含むＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２；（ｆ）配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位と、（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２；（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位とを含む。
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１８、１９及び２０のアミノ酸配列を含むか、又は二重特異性抗体は、配列番号１７、１９及び２０のアミノ酸配列を含む。
本発明の全ての態様において、前記二重特異性抗体は、有利には、ヒトであるか又はヒト化されている。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメイン、それぞれＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片、及びそれぞれＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片を含む。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＤＲ５及びＦＡＰの両方に関して二価である。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個又は複数個のＦａｂ断片を含み、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域が交換されている。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメイン、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片、及びＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片を含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、
Ｆｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続している前記Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに可変重鎖（ＶＨ）のＮ末端で接続している２個のＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、前記Ｆａｂ断片の少なくとも１個が、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインに接続している。
一実施形態では、前記二重特異性抗体はＦｃドメインを含み、該Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１個又は複数個のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、前記１個又は複数個のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される１箇所又は複数箇所である。一実施形態では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を消失させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである。
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体と、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤とを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載の二重特異性抗体、ゲムシタビン及びパクリタキセル又はアブラキサンを含む。
一実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ＲＧ７３８８である。
一実施形態では、Ｂｃｌ−２阻害剤は、ＡＢＴ１９９である。
一実施形態では、ＰＡＲＰ阻害剤は、ＰＪ３４である。
一実施形態では、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブである。
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体と、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤とを含む薬学的組成物を提供する。
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体及びイリノテカンを含む薬学的組成物を提供する。
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体、パクリタキセル及びゲムシタビン又はアブラキサンを含む薬学的組成物を提供する。
更なる態様では、本発明は、がんの治療用の医薬の製造におけるデスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体と化学療法剤との組合せの使用であって、二重特異性抗体が、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ１９９、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤と組み合わせて使用される、使用を提供する。一態様では、本発明は、がんの治療用の医薬の製造における、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体と、パクリタキセル及びアブラキサンとの組合せの使用を提供する。
更なる態様では、本発明は、がんの治療用の医薬の製造におけるデスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体と化学療法剤との組合せの使用であって、二重特異性抗体が、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７３８８、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ１９９、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤と組み合わせて使用される、使用を提供する。
更なる態様では、本発明は、
（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体を含む組成物を含む第１の容器と、
（ｉｉ）イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤を含む組成物を含む第２の容器と
を含むキットを提供する。
更なる態様では、本発明は、
（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体を含む組成物を含む第１の容器と、
（ｉｉ）イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７３８８、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ１９９、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤を含む組成物を含む第２の容器と
を含むキットを提供する。
更なる態様では、本発明は、
（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体を含む組成物を含む第１の容器と、
（ｉｉ）アブラキサンを含む第２の容器と、
（ｉｉｉ）ゲムシタビンを含む第３の容器と
を含むキットを提供する。
更なる態様では、本発明は、治療的組合せを、組合せ製剤として、又は交互に哺乳動物に投与することを含む、がんの治療のための方法であって、治療的組合せが、治療的有効量の、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体と、治療的有効量の、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤とを含む、方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、治療的組合せを、組合せ製剤として、又は交互に哺乳動物に投与することを含む、がんの治療のための方法であって、治療的組合せが、治療的有効量の、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体と、治療的有効量の、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７３８８、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ１９９、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤とを含む、方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、治療的組合せを、組合せ製剤として、又は交互に哺乳動物に投与することを含む、がんの治療のための方法であって、治療的組合せが、治療的有効量の、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体と、治療的有効量のアブラキサンと、治療的有効量のゲムシタビンとを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、がんは、結腸直腸がん、肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、乳がん、膵臓がん、胃がん、非小細胞肺癌、小細胞肺がん、線維形成性黒色腫及び中皮腫である。一実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。他の実施形態では、肉腫は、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、消化管間質腫瘍、線維肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫又は悪性線維性組織球腫である。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体及び化学療法剤は、任意選択的に組合せ製剤として、一緒に投与される。代替として、二重特異性抗体及び化学療法剤は、化学療法剤が二重特異性抗体の前に投与されるか、又は化学療法剤が二重特異性抗体の後に投与されるかの何れかで交互に投与されてもよい。組合せは、臨床実践に従って投与されてもよく、例えば、約１週間から３週間のインターバルで投与される。
ここで本発明の実施形態を、添付の図面を参照しながら、例として且つ非限定的に説明する。しかしながら、本発明の様々な更なる態様及び実施形態は、本発明の開示を考慮すれば当業者には明らかであると予想される。
「及び／又は」は、本明細書において使用される場合、他方を伴う又は伴わない、２つの特定された特徴又は成分の各々の具体的な開示として解釈されるものとする。例えば「Ａ及び／又はＢ」は、各々が本明細書で個々に述べられているのとまったく同様に、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として解釈されるものとする。
文脈により別段の指示がない限り、上述した特徴の記載及び定義は、本発明のいかなる特定の態様又は実施形態にも限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
ＦＡＰ−ＤＲ５二重特異性抗体分子の設計及び作用機序の概略図である。 複数の濃度のＤＲ５抗体＋ＦＣ単独及び１０μＭのイリノテカンとの組合せの、３日におけるＨＴ２９ ＣＲＣ細胞の％阻害のプロット（細胞生存率アッセイ）である。 複数の濃度のＤＲ５抗体＋ＦＣ単独及び２０ｎＭアブラキサン（Ｎａｂ−パクリタキセル）との組合せの、３日におけるＢｘＰＣ３細胞の％阻害のプロット（細胞生存率アッセイ）である。 複数の濃度のＤＲ５抗体＋ＦＣ単独及び２０ｎＭボルテゾミブとの組合せの、３日におけるＣａｐａｎ２ ＰＤＡＣ細胞の％阻害のプロット（細胞生存率アッセイ）である。 ビヒクル、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１及び１０ｍｇ／ｋｇ）又はドロジツマブＬＡＬＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）の何れかで処置したＤＬＤ−１ ＣＲＣ異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、９から２０日目まで、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体で４回及びドロジツマブＬＡＬＡで週１回処置した。ＤＲ５−ＦＡＰでの処置の腫瘍増殖阻害は、それぞれ８９％（１０ｍｇ／ｋｇ）及び７９％（１．０ｍｇ／ｋｇ）と計算された。 ビヒクル、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、イリノテカン（１５ｍｇ／ｋｇ）又はＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体及びイリノテカンの組合せの何れかで処置したＤＬＤ−１ ＣＲＣ異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、週１回のＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体を５回、及び５日毎のイリノテカンを合計３回で処置した。ＤＲ５−ＦＡＰ及びイリノテカンの組合せでの処置の腫瘍縮小は、７２％と計算された。 ビヒクル、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、イリノテカン（１５ｍｇ／ｋｇ）又は平行して若しくは逐次的に適用されたＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体及びイリノテカンの組合せの何れかで処置したＤＬＤ−１ ＣＲＣ異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、７日目から、週１回、静脈内に、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体で５回（７、１４、２１、２８、３５日目）、及びイリノテカンで、腹腔内に、５日間の合計３サイクル（７〜１１、１９〜２３、３３〜３６日目）処置した。 ビヒクル、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、イリノテカン（１５ｍｇ／ｋｇ）又はＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体及びイリノテカンの組合せの何れかで処置したＨＣＴ１１６ ＣＲＣ異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、７日目から、週１回、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体で３回、及び５日毎に、イリノテカンで合計２回処置した。ＤＲ５−ＦＡＰでの処置の腫瘍増殖阻害は、４６％と計算され、腫瘍縮小は、イリノテカンとの組合せで誘導された（ＴＧＩ＞１００％）。 ビヒクル、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、オキサリプラチン（５ｍｇ／ｋｇ）又はＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体及びオキサリプラチンの組合せの何れかで処置したＨＣＴ１１６ ＣＲＣ異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、７日目から、週１回、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体で３回（７、１４、２１日目）、及び腹腔内に、オキサリプラチンで合計２サイクル（７〜１０、２１〜２３日目）処置した。ＤＲ５−ＦＡＰ及びオキサリプラチンの組合せでの処置の腫瘍増殖阻害は、６７％と計算された。 ビヒクル、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）又はドロジツマブＬＡＬＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）の何れかで処置したＬＯＸ−ＩＭＶＩ線維形成性黒色腫異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、１３から２０日目まで、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体又はドロジツマブＬＡＬＡで２回処置した。ＤＲ５−ＦＡＰでの処置の腫瘍増殖阻害は、１００％超と計算され、一方でドロジツマブＬＡＬＡでの処置は、６５％と計算された。 ビヒクル又はＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（３０ｍｇ／ｋｇ）の何れかで処置した患者由来のＣｏ５８９６ ＣＲＣ異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、１８から３４日目まで、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体で６回処置した。ＤＲ５−ＦＡＰでの処置の腫瘍増殖阻害は、７６％と計算された。 ビヒクル、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（３０ｍｇ／ｋｇ）、イリノテカン（１５ｍｇ／ｋｇ）又はＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体及びイリノテカンの組合せの何れかで処置した患者由来のＣｏ５８９６ ＣＲＣ異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、週１回のＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体を４回、イリノテカンと共に１５〜１９日目で処置した。ＤＲ５−ＦＡＰ及びイリノテカンの組合せでの処置は、全ての動物において（１０／１０）完全な腫瘍縮小をもたらした。 患者由来のＣｏ５８９６ ＣＲＣ異種移植片を有するマウスにおけるＦＡＰ＋間質を示すＩＨＣ画像である。 ビヒクル又はＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）の何れかで処置した患者由来のＳａｒｃ４６０５肉腫異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、１０から３１日目まで、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体で４回処置した。ＤＲ５−ＦＡＰでの処置の腫瘍増殖阻害は、１００％超と計算された。 ビヒクル、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＡｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）の組合せの何れかで処置したＤＬＤ−１ ＣＲＣ異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。両方の抗体を、週１回、８、１５及び２２日目に与えた。単一の薬剤としてのＤＲ５−ＦＡＰ抗体での処置は有意な腫瘍増殖阻害を引き起こしたが（ＴＧＩ８７％）、抗Ａｎｇ／ＶＥＧＦ Ｍａｂとの組合せは相加的な効果があり、腫瘍増殖阻害を９４％に増加させた。Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ抗体単独での処置は、７５％で腫瘍増殖を阻害した。 ビヒクル、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）又はドキソルビシン（５ｍｇ／ｋｇ）又はＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）及びドキソルビシン（５ｍｇ／ｋｇ）の組合せの何れかで処置したＬＯＸ−ＩＭＶＩ線維形成性黒色腫異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、８から１５日目まで、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体又は組合せで２回処置した。単一の薬剤としてのＤＲ５−ＦＡＰ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、８及び１５日目）での処置は腫瘍の停止状態を引き起こしたが（ＴＧＩ９７％）、ドキソルビシンとの組合せは、単に相加的な効果があるだけでなく、異なる腫瘍縮小をもたらした（９３％）。ドキソルビシン単独での処置は、７７％で腫瘍増殖を阻害した。 ビヒクル、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、ドキソルビシン（５ｍｇ／ｋｇ）、又はＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）及びドキソルビシン（５ｍｇ／ｋｇ）の組合せの何れかで処置した患者由来のＳａｒｃ４６０５肉腫異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、２０から４１日目まで、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体又は組合せで４回処置した。単一の薬剤としてのＤＲ５−ＦＡＰ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、２０、２７、３４及び４１日目）での処置は腫瘍の停止状態を引き起こしたが（ＴＧＩ９９％）、ドキソルビシンとの組合せは、単に相加的な効果があるだけでなく、異なる腫瘍縮小をもたらした（８３％）。ドキソルビシン単独での処置は、７７％で腫瘍増殖を阻害した。 ビヒクル、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、ゲムシタビン（４０ｍｇ／ｋｇ）、ゲムシタビン（４０ｍｇ／ｋｇ）及びｎａｂ−パクリタキセル（６ｍｇ／ｋｇ）、又はＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）及びゲムシタビン（４０ｍｇ／ｋｇ）及びｎａｂ−パクリタキセル（６ｍｇ／ｋｇ）の組合せの何れかで処置した患者由来のＰＡ１１７８ＰＤＡＣ異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、３２から８１日目まで、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体又は組合せで７回処置した。単一の薬剤としてのＤＲ５−ＦＡＰ抗体での処置は９６％の腫瘍増殖阻害を引き起こしたが、３種の組合せは有効であり、完全な腫瘍の寛解をもたらした。 ビヒクル、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、イホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ）、又はＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）及びイホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ）の組合せの何れかで処置した患者由来のＳａｒｃ４６０５肉腫異種移植片を有するマウスにおける、インビボにおける中央値腫瘍体積の経時的な変化のプロットである。動物を、２０から４１日目まで、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体又はアルキル化薬のイホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄ×２）と組み合わせた組合せ（１０ｍｇ／ｋｇ）で４回処置した。ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄ×８）単独での処置は強い腫瘍縮小を引き起こし（９６％であり、８０％が腫瘍なし）、それに対してイホスファミドとの組合せはそれよりわずかに有効であった（８６％が腫瘍なし）。加えて、腫瘍縮小の反応速度は、組合せにおいてより速かった。 単一の薬剤である二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ；ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）での処置後のＬｕｍｉｎｅｘデータを示す図である。二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体は、ＤＬＤ−１／３Ｔ３異種移植片に対して、時間に伴う強い腫瘍細胞のアポトーシスを誘導した。抗体処置の直後に（６時間）強い作用が観察された。 単一の薬剤である二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ；ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）又はドキソルビシンとの組合せ（１０ｍｇ／ｋｇ）での処置後のＬｕｍｉｎｅｘデータを示す図である。二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体は、時間に伴う様式で腫瘍細胞のアポトーシスを強く誘導する。腫瘍細胞のアポトーシス誘導は、ドキソルビシンを共に用いた二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体の併用治療の場合に優れている。Ａ：切断型カスパーゼ−３（エフェクターカスパーゼ）の誘導の分析。Ｂ：活性化カスパーゼ−８（外因性のアポトーシス経路）の誘導の分析。Ｃ：活性化カスパーゼ−９（固有のアポトーシス経路）の誘導の分析。 単一の薬剤である二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ；ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）又はイリノテカン（１５ｍｇ／ｋｇ）若しくはオキサリプラチン（５ｍｇ／ｋｇ）との組合せでの処置後のＬｕｍｉｎｅｘデータを示す図である。二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体は、時間に伴う様式で腫瘍細胞のアポトーシスを強く誘導する。腫瘍細胞のアポトーシス誘導は、イリノテカン又はオキサリプラチンを共に用いた二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体の併用治療の場合に優れている。Ａ：切断されたＰＡＲＰの誘導の分析、Ｂ：カスパーゼ−３（エフェクターカスパーゼ）の誘導の分析、Ｃ：活性化カスパーゼ−９（固有のアポトーシス経路）の誘導の分析、Ｄ：活性化カスパーゼ−８（外因性のアポトーシス経路）の誘導の分析。
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークのことである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、同じアミノ酸配列を含むことができる、又は該アクセプターヒトフレームワークはアミノ酸配列の変更を含むことができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸の変更の数は１０個以下である、９個以下である、８個以下である、７個以下である、６個以下である、５個以下である、４個以下である、３個以下である、又は２個以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して配列が同一である。
「親和性」は、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を意味する。別途指示がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体及び抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子ＸのパートナーＹに対する該分子Ｘの親和性を一般的に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。本明細書に記載の方法等の当該技術分野で既知の一般的な方法によって、親和性を測定することができる。結合親和性の測定の具体的な説明であって例示的な実施形態を下記に記載する。
「親和性成熟」抗体は、１個又は複数個の超可変領域（ＨＶＲ）における１個又は複数個の改変がない親抗体と比較して、そのような改変を有する抗体を意味しており、そのような改変により、抗原に対する抗体の親和性が改善される。
用語「デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する二重特異性抗体」は、ＤＲ５及びＦＡＰを発現する細胞を標的とする診断薬及び／又は治療薬として抗体が有用であるのに十分な親和性でＤＲ５及びＦＡＰに結合することができる二重特異性抗体を意味する。具体的には、「デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する二重特異性抗体」は、腫瘍細胞上のＤＲ５及び前記腫瘍を囲む間質中のＦＡＰを標的とする二重特異性抗体を意味する。一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する二重特異性抗体の無関係の非ＦＡＰタンパク質又は非ＤＲ５タンパク質への結合の程度は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイ（例えばＢｉａｃｏｒｅ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で測定した場合に抗体のＤＲ５又はＦＡＰへの結合の約１０％未満である。ある実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する二重特異性抗体は、≦１μＭの、≦１００ｎＭの、≦１０ｎＭの、≦１ｎＭの、≦０．１ｎＭの、≦０．０１ｎＭの又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的に結合する二重特異性抗体は、様々な種由来のＤＲ５又はＦＡＰで保存されているＤＲ５又はＦＡＰのエピトープに結合する。好ましくは、前記二重特異性抗体は、ヒトの及びカニクイザルのＤＲ５と、ヒトの、カニクイザルの及びマウスのＦＡＰとに結合する。
用語「デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的に結合する抗体」は、ＤＲ５を発現する細胞を標的とする診断薬及び／又は治療薬として抗体が有用であるのに十分な親和性でＤＲ５に結合することができる抗体を意味する。一実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的に結合する抗体の無関係の非ＤＲ５タンパク質への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で測定した場合に抗体のＤＲ５への結合の約１０％未満である。ある実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的に結合Ｄする抗体は、≦１μＭの、≦１００ｎＭの、≦１０ｎＭの、≦１ｎＭの、≦０．１ｎＭの、≦０．０１ｎＭの又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある実施形態では、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的に結合する抗体は、様々な種由来のＤＲ５で保存されているＤＲ５のエピトープに結合する。好ましくは、前記抗体は、ヒトの及びカニクイザルのＤＲ５に結合する。用語「デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的に結合する抗体」は、ＤＲ５及び別の抗原に結合することができる二重特異性抗体も包含する。
用語「抗体」は本明細書において最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含しており、該抗体構造として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体断片が挙げられるがこれらに限定されない。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二重特異性抗体、クロス−Ｆａｂ断片；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるがこれらに限定されない。ｓｃＦｖ抗体は、例えばＨｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−９６）に記載されている。さらに、抗体断片は、ＶＨドメインの特性を有する単鎖ポリペプチド、即ちＶＬドメインと共に集合して機能性抗原結合部位となり、それにより完全長抗体の抗原結合特性をもたらすことができる単鎖ポリペプチド、又はＶＬドメインの特性を有する単鎖ポリペプチド、即ちＶＨドメインと共に集合して機能性抗原結合部位となり、それにより完全長抗体の抗原結合特性をもたらすことができる単鎖ポリペプチドを含む。
本明細書で使用する場合、「Ｆａｂ断片」は、軽鎖のＶＬドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む抗体断片を意味する。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている少なくとも１個のＦａｂ断片を含む。可変領域又は定常領域のどちらかの交換により、前記Ｆａｂ断片は「クロス−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。クロスオーバーＦａｂ分子の下記の２種の異なる鎖組成物が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方では、Ｆａｂの重鎖の可変領域と軽鎖のＦａｂ軽鎖の可変領域とが交換されている、即ち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されているペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されているペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称される。他方では、Ｆａｂの重鎖の定常領域と軽鎖の定常領域とが交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも称される。クロスオーバーＦａｂ断片を含む二重特異性抗体フォーマットは、例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号及び国際公開第２０１３／０２６８３１号で説明されている。
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向で下記の順の内の１つを有し：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ、ここで、前記リンカーは少なくとも３０個のアミノ酸のポリペプチドであり、好ましくは３２から５０個のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然のジスルフィド結合により安定化されている。さらに、これら単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、カバット番号付けによる、可変重鎖における４４位及び可変軽鎖における１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって更に安定化される場合がある。用語「Ｎ末端」はＮ末端の最後のアミノ酸を表す。用語「Ｃ末端」はＣ末端の最後のアミノ酸を表す。
「融合」又は「接続」が意味するのは、成分（例えばＦａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合により直接的に又は１個若しくは複数個のペプチドリンカーを介して結合することである。
用語「リンカー」は本明細書で使用する場合、ペプチドリンカーを意味しており、好ましくは、少なくとも５個のアミノ酸の長さ、好ましくは５から１００個の長さ、より好ましくは１０から５０個のアミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドである。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここでＧ＝グリシンであり、Ｓ＝セリンであり、（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５若しくは６及びｍ＝０、１、２若しくは３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４若しくは５及びｍ＝０、１、２若しくは３）であり、好ましくはｘ＝４であり、ｎ＝２又は３であり、より好ましくはｘ＝４であり、ｎ＝２である。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を意味する。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２本の軽鎖と２本の重鎖とから構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へ、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。免疫グロブリンの重鎖を、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプ内の１つに割り当てることができ、これらの内のいくつかをサブタイプに、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に更に分割することができる。免疫グロブリンの軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの内の一方に割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して結合している２個のＦａｂ分子及びＦｃドメインから本質的に成る。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする抗体を意味しており、逆に言うと、競合アッセイにおいて抗体のその抗原への結合を参照抗体が５０％以上ブロックする。例示的な競合アッセイを本明細書に記載する。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全てに特異的に結合し該一部又は全てに対して相補的である領域を含む抗原結合分子の部分を意味する。抗原が大きい場合、抗原結合分子は抗原の特定の部分にのみ結合することができ、この部分はエピトープと呼ばれている。抗原結合ドメインは、例えば１個又は複数個の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によってもたらされ得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが、通常は組換えＤＮＡ技法により調製される異なる供給源又は種に由来する抗体を意味する。ウサギ可変領域とヒト定常領域とを含むキメラ抗体が好ましい。本発明に包含される「キメラ抗体」のその他の好ましい形態は、本発明に係る特性を生じさせるために、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明に係る特性を生じさせるために、定常領域が元の抗体の定常領域から修飾されている又は変更されている形態である。そのようなキメラ抗体は「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリンの可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、免疫グロブリンの定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む免疫グロブリン遺伝子の発現産物である。キメラ抗体を産生する方法は、当該技術分野で公知である従来の組換えＤＮＡ技法及び遺伝子トランスフェクション技法を含む。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１−６８５５；米国特許第５２０２２３８号及び米国特許第５２０４２４４号を参照されたい。
用語「細胞傷害性薬剤」は本明細書で使用する場合、細胞の機能を阻害する若しくは阻止する及び／又は細胞の死滅若しくは破壊を引き起こす物質を意味する。細胞傷害性薬剤として、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は化学療法薬（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又はその他の挿入剤）；増殖阻害剤；酵素及びこの断片、例えば核酸分解酵素；抗生物質；小分子毒素等の毒素又は細菌起源、真菌起源、植物起源若しくは動物起源の酵素活性毒素（この断片及び／又は変異体を含む）；並びに下記に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗がん剤が挙げられるがこれらに限定されない。
「エフェクター機能」は、抗体アイソタイプにより変化する、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を意味する。抗体のエフェクター機能の例として、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込み；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御並びにＢ細胞活性化が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」は、天然に存在する又は組み替えのポリペプチド又はこの断片の、ペプチド骨格の任意の操作又は翻訳後修飾を含むと見なす。操作として、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾が挙げられ、これらの手法の組み合わせも更に挙げられる。
用語「アミノ酸変異」は本明細書で使用する場合、アミノ酸の置換、欠失、挿入及び修飾を包含することを意味する。置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組み合わせにより最終的なコンストラクトに到達することができるが、但し、最終的なコンストラクトは、所望の特徴、例えばＦｃ受容体への結合性の低下又は別のペプチドとの結合の増加を有する。アミノ酸配列の欠失及び挿入として、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失並びにアミノ酸の挿入が挙げられる。特定のアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えばＦｃ領域の結合特性を変更する目的のために、非保存的アミノ酸置換、即ち１個のアミノ酸を異なる構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸に置き換えることが特に好ましい。アミノ酸置換として、２０種の標準的なアミノ酸の天然に存在しないアミノ酸又は天然に存在するアミノ酸誘導体（例えば４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリシン）による置き換えが挙げられる。アミノ酸変異を、当該技術分野で公知の遺伝学的方法又は化学的方法を使用して生じさせることができる。遺伝学的方法として、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を挙げることができる。遺伝子操作以外の方法によりアミノ酸の側鎖基を改変する方法、例えば化学的修飾も有用であることができることが意図される。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために様々な名称を使用することができる。例えば、Ｆｃドメインの３２９位でのプロリンからグリシンへの置換を３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示すことができる。
薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに必要な投与量及び期間での有効な量を意味する。
本明細書では、用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」を、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンの重鎖のＣ末端領域を定義するために使用する。この用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。ＩｇＧの重鎖のＦｃ領域の境界は若干異なる可能性があるが、ヒトＩｇＧの重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸びていると定義される。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端のリシン（Ｌｙｓ４４７）が存在していてもよいし存在していなくてもよい。本明細書では別途明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されているように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従っている。Ｆｃドメインの「サブユニット」は本明細書で使用する場合、ダイマーＦｃドメインを形成する２個のポリペプチドの内の一方、即ち、安定した自己結合が可能な、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの結合を促進する修飾」とは、ホモダイマーを形成するために、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの同一のポリペプチドとの結合を減少させる又は阻止するペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾のことである。本明細書で使用する場合、結合を促進する修飾として、結合が所望される２種のＦｃドメインサブユニット（即ち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニット）それぞれに対して行われる別々の修飾が特に挙げられ、これらの修飾は、２種のＦｃドメインサブユニットの結合を促進するように互いに相補的である。例えば、結合を促進する修飾により、その結合を立体的に又は静電気的にそれぞれ有利にするようにＦｃドメインサブユニットの内の一方又は両方の構造又は電荷が変更され得る。そのため、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で生じており、これらのポリペプチドは、各サブユニットに融合した更なる成分（例えば抗原結合部分）が同じではないという意味で同一ではない可能性がある。いくつかの実施形態では、結合を促進する修飾はＦｃドメイン中にアミノ酸変異を含み、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、結合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２種のサブユニットそれぞれにおいて別々のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは一般的に、下記の４種のＦＲドメインからなる：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中に下記の配列で現われる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
本明細書では、用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」を、天然型抗体の構造と実質的に同じ構造を有する抗体又は本明細書で定義するＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を意味するために互換的に使用する。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を意味しており、そのような細胞の子孫も含む。宿主細胞として「形質転換体」及び「形質転換細胞」が挙げられ、これらには、最初の形質転換細胞と、継代の数に関係なく該形質転換細胞に由来する子孫とが含まれる。子孫は、親細胞と核酸含有量が完全に同一ではない可能性があるが突然変異を含むことができる。これには、最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされた又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が含まれる。
「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体、又はヒト抗体のレパートリー若しくはその他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体のことである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。本発明に係るキメラ抗体及びヒト化抗体に関して述べてもいるように、用語「ヒト抗体」は本明細書で使用する場合、例えば「クラススイッチング（ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）」、即ちＦｃ部分の変更又は突然変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４へ及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）によって、本発明に係る特性、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関する本発明に係る特性を生じさせるために定常領域において修飾されているそのような抗体も含む。
用語「組換えヒト抗体」は本明細書で使用する場合、組換え手段により調製されている、発現されている、作成されている又は単離されている全てのヒト抗体、例えばＮＳ０細胞若しくはＣＨＯ細胞等の宿主細胞から又はヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、又は宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体を含むことを意図する。そのような組換えヒト抗体は、再配置された形で可変領域及び定常領域を有する。本発明に係る組換えヒト抗体はインビボでの体細胞超変異に曝されている。そのため、組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＶＨ配列及びＶＬ配列に由来する及び関連するがインビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然に存在しない可能性がある配列である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンのＶＬフレームワーク配列又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークのことである。一般的に、ヒト免疫グロブリンのＶＬ配列及びＶＨ配列は可変ドメイン配列のサブグループから選択される。一般的に、配列のサブグループは、
Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）、ｖｏｌｓ．１−３でのサブグループである。一実施形態では、ＶＬの場合、サブグループはＫａｂａｔ等（上記参照）でのサブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨの場合、サブグループはＫａｂａｔ等（上記参照）でのサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を意味する。ある実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１個の、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含むことができ、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のＨＶＲに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を任意選択的に含むことができる。抗体の「ヒト化型」、例えば非ヒト抗体は、ヒト化されている抗体を意味する。本発明に包含される「ヒト化抗体」のその他の形態は、本発明に係る特性、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関する本発明に係る特性を生じさせるために、定常領域が更に修飾されている又は元の抗体の定常領域から変更されている形態である。
用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は本明細書で使用する場合、配列が超可変である及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を意味する。一般的に、天然型４鎖抗体は６個のＨＶＲ、即ちＶＨ中に３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ中に３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは一般的に、超可変ループ及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲは最高の配列可変性である、及び／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４−３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０−５６、Ｌ３のアミノ酸残基８９−９７、Ｈ１のアミノ酸残基３１−３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０−６５及びＨ３のアミノ酸残基９５−１０２で生じる。（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。超可変領域（ＨＶＲ）は相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称されており、本明細書ではこれらの用語を、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して互換的に使用する。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）により説明されており、定義には、互いを比較した場合にアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体又はこの変異体のＣＤＲを意味する何れかの定義の適用は、本明細書において定義される及び使用される用語の範囲内であることを意図している。上記の各引用文献によって定義されているＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を比較として下記の表Ａに記載する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて変わるであろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を付与する特定のＣＤＲを含む残基を常套的に決定することができる。
Ｋａｂａｔ等は、あらゆる抗体に適用可能である可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者は、配列自体以外のあらゆる実験データに頼ることなく、あらゆる可変領域配列に、「カバット番号付け」であるこのシステムを一義的に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「カバット番号付け」は、Ｋａｂａｔ等、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）に記載されている番号付けシステムを意味する。別途明記しない限り、抗体可変領域中の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及はカバット番号付けシステムに従っている。
ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮−ＣＤＲ又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１−３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０−５５、Ｌ３のアミノ酸残基８９−９６、Ｈ１のアミノ酸残基３１−３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０−５８及びＨ３のアミノ酸残基９５−１０２で生じる。（Almagro及びFransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照されたい）。別途指示がない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及びその他の残基（例えばＦＲ残基）は本明細書において、Ｋａｂａｔ等（上記参照）に従って番号付けされている。
「イムノコンジュゲート」とは１個又は複数個の異種分子にコンジュゲートした抗体のことであり、イムノコンジュゲートとして細胞傷害性薬剤が挙げられるがこれに限定されない。
「個体」又は「対象」とは哺乳動物のことである。哺乳動物として、家畜（例えば雌ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えばヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）ウサギ並びにげっ歯類（例えばマウス及びラット）が挙げられるがこれらに限定されない。ある実施形態では、個体又は対象はヒトである。
「単離された」抗体とは、その天然の環境の成分から分離されている抗体のことである。いくかの実施形態では、抗体は、例えば電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えばイオン交換ＨＰＬＣ又は逆相ＨＰＬＣ）により測定した場合に９５％超の又は９９％超の純度に精製されている。抗体純度の評価の方法に関する概説として、例えばＦｌａｔｍａｎ等、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
「単離された」核酸は、その天然の環境の成分から分離されている核酸分子を意味する。単離された核酸として、通常は核酸分子を含む細胞に含まれている核酸分子が挙げられるが、この核酸分子は、染色体外に又は該核酸分子の天然の染色体上の位置とは異なる染色体の位置に存在する。
「ＤＲ５及びＦＡＰ抗体に特異的に結合する二重特異性抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はこれらの断片）をコードする１種又は複数種の核酸分子を意味しており、この核酸分子として、単一のベクター又は別々のベクター中のそのような核酸分子（１種又は複数種）、及び宿主細胞中の１つ又は複数の位置で存在するそのような核酸分子（１種又は複数種）が挙げられる。
用語「モノクローナル抗体」は本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味しており、即ち、例えば天然に存在する変異を含む又はモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる可能な変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合し、そのような変異体は一般的に少量で存在している。様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。そのため、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用しようとするモノクローナル抗体を様々な技法によって作成することができ、この技法として、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージ提示法及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法が挙げられるがこれらに限定されず、そのような方法及びモノクローナル抗体を作成するためのその他の例示的な方法を本明細書に記載する。
「ネイキッド抗体」は、異種部分（例えば細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を意味する。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在することができる。
「天然型抗体」は、様々な構造を有する、天然に存在する免疫グロブリン分子を意味する。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２本の同一の軽鎖及び２本の同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へ、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、続いて３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、続いて定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプの内の一方に割り当てることができる。
用語「添付文書」を、指示、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌に関する情報及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の市販のパッケージに慣習的に含まれる使用説明書を意味するために使用する。
「実質的に交差反応がない」とは、分子（例えば抗体）が、特に標的抗原と比較した場合に、該分子の実際の標的抗原とは異なる抗原（例えば、標的抗原に密接に関連する抗原）を認識しない又は該抗原に特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗体は、実際の標的抗原とは異なる抗原に約１０％未満から約５％未満で結合することができる、又は実際の標的抗原とは異なる抗原の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．２％未満又は約０．１％未満からなる、好ましくは約２％未満、約１％未満又は約０．５％未満からなる、最も好ましくは約０．２％未満又は約０．１％未満からなる量で、実際の標的抗原とは異なる前記抗原に結合することができる。
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」を、配列を位置合わせし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義し、あらゆる保存的置換を配列同一性の一部であると考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための位置合わせを、当該技術分野の技術内である様々な手段で実現することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して実現することができる。当業者は、比較する配列の完全長にわたり最大の位置合わせを実現するのに必要なあらゆるアルゴリズム等の、配列の位置合わせに適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、％アミノ酸配列同一性の値を、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により書かれており、ソースコードがユーザー文書と共に米国著作権局、ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９に提出されており、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコから公的に入手可能である、又はソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムを、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄ等のＵＮＩＸオペレーティングシステム上で使用するためにコンパイルしなければならない。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変化しない。
アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ−２を利用する状況では、所与のアミノ酸配列Ａの所与のアミノ酸配列Ｂに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対していくつかの％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することができる）を下記のように算出する。
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列位置合わせプログラムＡＬＩＧＮ−２によるＡ及びＢの位置合わせの場合に、該プログラムにより同一性の一致として記録されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中におけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性がＡに対するＢの％のアミノ酸配列同一性と等しくないことが認識されるだろう。別途明確に述べない限り、本明細書で使用する全ての％アミノ酸配列同一性の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して直前の段落で記載したように得られる。
用語「薬学的製剤」は、含まれる有効成分の生物活性が有効となるような形態であり、この製剤が投与される対象に対して許容しがたいほどの毒性である追加の成分を含まない調製物を意味する。
「薬学的に許容される担体」は、薬学的製剤中における有効成分以外の、対象に対して無毒の成分を意味する。薬学的に許容される担体として、バッファー、賦形剤、安定剤又は防腐剤が挙げられるがこれらに限定されない。
別途指示がない限り、用語「デスレセプター５（ＤＲ５）」は本明細書で使用する場合、霊長類（例えばヒト）並びにげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源のあらゆる天然型ＤＲ５を意味する。この用語は、「完全長で」未処理のＤＲ５を包含し、細胞中でのプロセシングから生じるあらゆる形態のＤＲ５を更に包含する。この用語は、ＤＲ５の天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。例示的なヒトＤＲ５のアミノ酸配列は国際公開第２０１１／０３９１２６号に開示される。
別途指示がない限り、用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は本明細書で使用する場合、霊長類（例えばヒト）並びにげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源のあらゆる天然型ＦＡＰを意味する。この用語は、「完全長で」未処理のＦＡＰを包含し、細胞中でのプロセシングから生じるあらゆる形態のＦＡＰを更に包含する。この用語は、ＦＡＰの天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ抗体はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。ヒトＦＡＰの配列を含む、例示的なＦＡＰポリペプチド配列のアミノ酸配列は、国際公開第２０１２／０２０００６号に開示されている。
本明細書で使用する場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びこの文法上の変形、例えば「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、治療する個体の自然経過を変更しようと試みる臨床的介入を意味しており、予防のために又は臨床病理学の経過中のどちらかで実施することができる。治療の望ましい効果として、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患のあらゆる直接的な又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行速度を遅らせること、病態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体を使用して、疾患の発症を遅延させる、又は疾患の進行を遅らせる。
がんという用語は本明細書で使用する場合、増殖性疾患、例えばがんを指し、例えば、結腸直腸がん、肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、乳がん、膵臓がん、胃がん、非小細胞肺癌、小細胞肺がん及び中皮腫であり、上記のがんの何れかの難治性型、又は上記のがんの１種又は複数の組合せを含む。一実施形態では、がんは、結腸直腸がんであり、任意選択的に化学療法剤は、イリノテカンである。「肉腫」は本明細書で使用する場合、結合組織で増殖するがんのタイプを指す。肉腫としては、消化管間質腫瘍（一般的にＧＩＳＴとして公知の、胃及び腸に見出される軟組織肉腫のタイプ）、軟組織肉腫（例えば平滑筋肉腫、線維芽細胞肉腫、脂肪肉腫、カポジ肉腫（ＫＳ）、血管肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、滑膜肉腫、横紋筋肉腫）及び骨肉腫（例えば軟骨肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、脊索腫）が挙げられる。
がんが肉腫である実施形態では、肉腫は、任意選択的に、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、消化管間質腫瘍、線維肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫又は悪性線維性組織球腫である。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを意味する。天然型抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、各ドメインが４個の保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３個の超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似の構造を一般的に有する。（例えばKindt等, Kuby Immunology, 6th ed., W. H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照されたい）。単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であることができる。さらに、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリをスクリーニングするために、抗原に結合する抗体由来のＶＨドメイン又はＶＬドメインを使用して、特定の抗原に結合する抗体を単離することができる。例えばＰｏｒｔｏｌａｎｏ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
用語「抗体の抗原結合部位」は本明細書で使用する場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」、即ち「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域、即ち「ＦＲ」領域は、本明細書で定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する及び抗体の特性を定義する領域である。ＣＤＲ領域及びＦＲ領域は、Ｋａｂａｔ等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）の標準定義に従って決定される、及び／又は「超可変ループ」由来の残基である。
抗体特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を意味する。例えば、天然型抗体は単一特異的である。本発明に係る「二重特異性抗体」とは、２種の異なる抗原結合特異性を有する抗体のことである。本発明の抗体は２種の異なる抗原、即ち第１の抗原としてのＤＲ５及び第２の抗原としてのＦＡＰに対して特異的である。
用語「単一特異性」抗体は本明細書で使用する場合、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１個又は複数個の結合部位を有する抗体を表す。
用語「二重特異性」抗体は本明細書で使用する場合、同じ抗原の異なるエピトープ又は異なる抗原にそれぞれ結合する少なくとも２個の結合部位を有する抗体を表す。
本明細書で提供する抗体は多重特異性抗体であり、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２種の異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。本明細書では、ＦＡＰ及びＤＲ５に対する結合特異性を有する二重特異性抗体が提供される。ある実施形態では、二重特異性抗体はＤＲ５の２種の異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体を使用して、ＤＲ５を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局所化することもできる。二重特異性抗体を、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を製作するための技法として、異なる特異性を有する２種の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein及びCuello, Nature 305:537 (1983)）、国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655 (1991)を参照されたい）並びに「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」操作（例えば米国特許第５７３１１６８号を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。抗体Ｆｃ−ヘテロダイマー分子を製作するために静電ステアリング効果を操作することにより（国際公開第２００９／０８９００４号）、２個以上の抗体又は断片を架橋することにより（例えば米国特許第４６７６９８０号及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照されたい）、二重特異性抗体を産生するためにロイシンジッパーを使用することにより（例えばKostelny等, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照されたい）、二重特異性抗体断片を製作するために「ダイアボディ」技法を使用することにより（例えばHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照されたい）、及び単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ダイマーを使用することにより（例えばGruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい）、及び例えばＴｕｔｔ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているように三重特異性抗体を調製することにより、多重特異性抗体を製作することもできる。
「オクトパス抗体」等の、３個以上の機能性抗原結合部位を有する操作抗体も本明細書に含まれる（例えばＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
抗体又は断片は本明細書において、ＦＡＰ又はＤＲ５に結合し、別の異なる抗原にも更に結合する少なくとも１個の抗原結合部位を含む「二重作用Ｆａｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えばＵＳ２００８／００６９８２０を参照されたい）。
用語「価」は本出願内で使用する場合、抗体分子中における特定の数の結合部位の存在を表す。したがって、用語「二価」、「四価」及び「六価」はそれぞれ、抗体分子中における２個の結合部位の存在、４個の結合部位の存在及び６個の結合部位の存在を表す。本発明に係る二重特異性抗体は少なくとも「二価」であり、「三価」又は「多価」（例えば「四価」若しくは「六価」）であることができる。
本発明の抗体は２個又はそれ以上の結合部位を有しており、二重特異性である。即ち、２個を超える結合部位が存在する（即ち抗体が三価又は多価である）場合、この抗体は二重特異性であることができる。本発明の二重特異性抗体として、多価の単鎖抗体、二特異性抗体及び三特異性抗体が挙げられ、１個又は複数個のペプチドリンカーを介して更なる抗原結合部位（例えば単鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン及び／若しくはＶＬドメイン、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）２）が結合している完全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体が更に挙げられる。抗体は、単一種由来の完全長であることができる、又は抗体をキメラ化若しくはヒト化することができる。
用語「ベクター」は本明細書で使用する場合、該ベクターが結合している別の核酸を伝播することができる核酸分子を意味する。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターを含み、ベクターが導入されている宿主細胞のゲノムに取り込まれたベクターを更に含む。ある種のベクターは、該ベクターが作動可能に結合している核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを本明細書では「発現ベクター」と称する。
用語「アミノ酸」は本出願内で使用する場合、アラニン（三文字表記：ａｌａ、一文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を表す。
本明細書で使用する場合、語句「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」を互換的に使用し、そのような指定は全て子孫も含む。そのため、単語「トランスフェクタント」及び「トランスフェクトされた細胞」は、最初の対象細胞とトランスファーの数に関係なくそれに由来する培養物とを含む。意図的な又は不慮の突然変異に起因して、全ての子孫のＤＮＡの内容が厳密に同一でなくてもよいことも理解されるだろう。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。
「親和性」は、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を意味する。別途指示がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体及び抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子ＸのパートナーＹに対する該分子Ｘの親和性を一般的に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。本明細書に記載の方法等の当該技術分野で既知の一般的な方法によって、親和性を測定することができる。結合親和性の測定の具体的な説明であって例示的な実施形態を下記に記載する。
本明細書で使用する場合、用語「結合する」又は「特異的に結合する」は、インビトロアッセイにおける、好ましくは表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）における、抗原のエピトープに対する抗体の結合を意味する。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の結合に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）により定義される。結合する又は特異的に結合するは、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下の、好ましくは１０−９Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）を意味する。
デスレセプターへの抗体の結合を、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）により調べることができる。この結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体の結合の速度定数）、ｋＤ（解離定数）及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）により定義される。
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができるあらゆるポリペプチド決定基を含む。ある実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル等の分子の化学的に活性な表面のグループ分けを含み、ある実施形態では、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。
本明細書で使用する場合、特に接頭辞「グリコ」を有する用語「操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」並びに「グリコシル化操作」は、天然に存在する又は組み替えのポリペプチド又はこの断片のグリコシル化パターンのあらゆる操作を含むと見なす。グリコシル化操作として、細胞で発現される糖タンパク質のグリコシル化の変更を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝的操作等の、細胞のグリコシル化装置の代謝的操作が挙げられる。さらに、グリコシル化操作には、グリコシル化での突然変異及び細胞環境の作用が含まれる。一実施形態では、グリコシル化操作は、グリコシルトランスフェラーゼ活性の変更である。特定の実施形態では、この操作により、グルコサミニルトランスフェラーゼ活性及び／又はフコシルトランスフェラーゼ活性が変更される。
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、例えばがんの治療用の、ＴＲＡＩＬデスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な第１の抗原結合部位及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な第２の抗原結合部位を含む二重特異性抗体と、更なる化学療法剤との治療的組合せの使用に基づく。
Ａ．ＦＡＰ及びＤＲ５に特異的な二重特異性抗体の併用療法
概して、本発明は、デスレセプター５（ＤＲ５）を標的とする抗原結合部位を、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする第２の抗原結合部位と組み合わせた二重特異性抗体、及び更なる化学療法剤を組み合わせたそれらの使用に関する。本発明に従って採用される二重特異性抗体は、デスレセプターを架橋された状態にし、標的化された腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができる。従来のデスレセプターを標的とする抗体を超える利点は、ＦＡＰが発現される部位にのみアポトーシスを誘導する特異性に加えて、ＤＲ５の過剰なクラスター化を誘導することによるこれらの二重特異性抗体のより高い力価である。
したがって、一態様では、本発明は、がんの治療方法において併用療法として使用するための、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤と組み合わせて使用される、二重特異性抗体を提供する。
好ましくは、化学療法剤は、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される。一実施形態では、化学療法剤は、イリノテカン、ドキソルビシン又はオキサリプラチンから選択される。一実施形態では、二重特異性抗体は、イリノテカンと組み合わせて使用される。一実施形態では、二重特異性抗体は、パクリタキセル及びゲムシタビンと組み合わせて使用される。一実施形態では、二重特異性抗体は、イホスファミドと組み合わせて使用される。
イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））は、がんの治療に使用される薬物である。イリノテカンは、トポイソメラーゼ１の阻害によりＤＮＡの巻き戻しを防ぐ。イリノテカンは、天然アルカロイドであるカンプトテシンの半合成のアナログであり、（Ｓ）−４，１１−ジエチル−３，４，１２，１４−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−３，１４−ジオキソ１Ｈ−ピラノ［３’，４’：６，７］−インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−９−イル−［１，４’ビピペリジン］−１’−カルボキシレートと命名される。イリノテカンは、以下の構造を有する。

ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））は、多様ながんの治療で使用する化学療法剤である。ドキソルビシンは、ＤＮＡに介入してＤＮＡ合成の阻害を引き起こし、トポイソメラーゼ２に干渉し、ＤＮＡ複製を予防し、フリーラジカル産生を増加させ、その細胞傷害性に寄与する。ドキソルビシンは、天然ダウノマイシンに密接に関連するアントラサイクリン系抗生物質であり、（７Ｓ，９Ｓ）−７−［（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｓ）−４−アミノ−５−ヒドロキシ−６−メチルオキサン−２−イル］オキシ−６，９，１１−トリヒドロキシ−９−（２−ヒドロキシアセチル）−４−メトキシ−８，１０−ジヒドロ−７Ｈ−テトラセン−５，１２−ジオンと命名される。ドキソルビシンは、以下の構造を有する。

オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）は、がん、特定には結腸直腸がんの治療に使用される白金系化学療法薬である。生理溶液中で、オキサリプラチンは、活性な誘導体への非酵素的な変換を受け、ＤＮＡの架橋を引き起こし、ＤＮＡの合成及び転写を阻害する。オキサリプラチンは、［（１Ｒ，２Ｒ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン］（エタンジオエート−Ｏ，Ｏ’）白金（ＩＩ）と命名され、以下の構造を有する。

５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）は、がんの治療で広く使用される。５−ＦＵは、ウラシルのアナログであり、細胞に輸送されて活性代謝産物に変換される。これらの代謝産物はＲＮＡ合成を妨害し、チミジル酸シンターゼ酵素を阻害して、ＤＮＡの複製及び修理に必要なチミジンの合成をブロックする。５−ＦＵは、５−フルオロ−１Ｈ，３Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンと命名され、以下の構造を有する。

ＭＤＭ２阻害剤は、ｐ５３−ＭＤＭ２の結合をブロックし、ｐ５３経路の活性化をもたらして、細胞周期の停止及び／又はアポトーシスを引き起こす。一実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ＲＧ７３８８である。
ＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７３８８は、がんの治療における臨床調査を受けた小分子のピロリジン化合物である（Dingら、J. Med. Chem. 56（14）： 5979〜5983、2013）。ＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７３８８は、４−（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−３−（３−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−（４−クロロ−２−フルオロフェニル）−４−シアノ−５−ネオペンチルピロリジン−２−カルボキサミド）−３−メトキシ安息香酸と命名され、以下の構造を有する。
別の実施形態では、ＭＤＭ２阻害剤は、ＭＫ−８２４２である。他のＭＤＭ２阻害剤は、当該技術分野において公知であり、例えばＳｗａｔｕ Ｐａｌｉｔ Ｄｅｂ及びＳｕｍｉｔｒａ Ｄｅｂ：Ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ ａｎｄ ＭＤＭ２ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ、Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８５、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（ＩＳＢＮ９７８−９４−０１７−９２１１−０）で説明されている。
Ｂｃｌ−２（Ｂ細胞リンパ腫２）阻害剤は、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質を標的とし、がん細胞のアポトーシス促進性のシグナルに対する感受性を回復させることが意図されている。一実施形態では、Ｂｃｌ−２阻害剤は、ＡＢＴ１９９である。
Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ１９９は、ＧＤＣ−０１９９としても公知であり、がんの治療における臨床調査を受けた選択的阻害剤である（Souersら、(2013) Nat. Med. 19(2)：202〜208）。これは、アポトーシスの調節において重要なＢｃｌ−２タンパク質上に存在するＢＨ３の構造的要素の結合を模擬するように設計された。ＡＢＴ１９９は、（４−（４−｛［２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロヘキサ−１−エン−１−イル］メチル｝ピペラジン−１−イル）−Ｎ−（｛３−ニトロ−４−［（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルメチル）アミノ］フェニル｝スルホニル）−２−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イルオキシ）ベンズアミド）と命名され、以下の構造を有する。

タキサン（パクリタキセル及びアブラキサン）は、タイヘイヨウイチイの木であるタクスス・ブレウィフォリア（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）の小枝、針状葉及び樹皮に由来する薬物である。これらは、様々な腫瘍タイプにおいて実証済みの抗腫瘍活性を有する。タキサンは、それらの構造を過剰に安定化することにより微小管成長を妨害し、細胞分裂中にその細胞骨格を使用する細胞の能力を破壊して、異常な細胞機能及び最終的な細胞死を引き起こすことにより機能する。パクリタキセルは、ヒマシ油の毒性誘導体であるクレモフォールと呼ばれる溶媒中に溶解した細胞に送達される。アルブミンに結合したパクリタキセル（商標名アブラキサン、ｎａｂ−パクリタキセルとも呼ばれる）は、パクリタキセルがアルブミンナノ粒子に結合している代替の製剤であり、これは、代替のより毒性が低い送達薬剤である。パクリタキセルは、（２Ｒ，３Ｓ）−Ｎ−ベンゾイル−３−フェニルイソセリンとの５β，２０−エポキシ−１，２α，４，７β，１０β，１３α−ヘキサヒドロキシタキサ−１１−エン−９−オン４，１０−ジアセテート２−安息香酸１３−エステルと命名され、以下の構造を有する。
ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））は、がんの治療で使用される治療的プロテアソーム阻害剤である。ボルテゾミブは、ＰＳ−３４１としても公知であり、がん細胞の生存に不可欠な様々なタンパク質の分解に関与する酵素複合体である２６Ｓプロテアソームのトレオニン残基を特異的及び可逆的に阻害する。これらのタンパク質の分解を阻害することにより、細胞はアポトーシスに対して感受性になる。ボルテゾミブは、［（１Ｒ）−３−メチル−１−［（２Ｓ）−３−フェニル−２−（ピラジン−２−イルホルムアミド）プロパンアミド］ブチル］ボロン酸と命名され、以下の構造を有する。

ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））は、ＤＮＡ合成を経た細胞を死滅させる化学療法剤である。ゲムシタビンは、ヌクレオシドキナーゼによってヌクレオシド二リン酸及び三リン酸に代謝されるヌクレオシドのアナログである。ゲムシタビン二リン酸は、ＤＮＡ合成に必要な酵素であるリボヌクレオチドレダクターゼを阻害し、ゲムシタビン三リン酸は、ＤＮＡへの取り込みに関してデオキシシチジンと競合する。ゲムシタビンは、４−アミノ−１−（２−デオキシ−２，２−ジフルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）ピリミジン−２（１Ｈ）−オンと命名され、以下の構造を有する。

シクロパミンは、有望ながん治療として調査中の天然アルカロイドである。ヘッジホッグ経路の不適切な活性化は、腫瘍の形成及び増殖と関連がある。シクロパミンは、平滑化受容体に直接結合してヘッジホッグシグナル伝達経路を崩壊させることにより、がん細胞を死滅させることができる。シクロパミンは、（３β，２３Ｒ）−１７，２３−エポキシベラトラマン−３−オールと命名され、以下の構造を有する。

ＰＡＲＰ阻害剤は、酵素ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の薬理学的阻害剤のグループである。
一実施形態では、ＰＡＲＰ阻害剤は、ＰＪ３４である。
ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４は、ＰＡＲＰ１非依存性のｐ２１依存性の有糸分裂停止を引き起こす。Ｍａｄｉｓｏｎら、ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）．２０１１年１０月１０日；１０（１０）：１００３〜１３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｎａｒｅｐ．２０１１年７月６日．Ｅｐｕｂ ２０１１年８月１２日を参照されたい。ＰＪ３４は、ＰＡＲＰ−１の活性をブロックし、傷害を受けたＤＮＡを含有する細胞の一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔａｎｄ）切断の修復を防ぎ、細胞死を引き起こす。ＰＪ３４は、Ｎ−（５，６−ジヒドロ−６−オキソ−２−フェナントリジニル）−２−アセトアミド塩酸塩と命名され、以下の構造を有する。
一実施形態では、ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブである。オラパリブは、ＤＮＡ修復に関与する酵素であるポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の阻害剤である。これは、多くの卵巣がん、乳がん及び前立腺がんなどの、遺伝性のＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２突然変異を有するヒトにおけるがんに作用する。オラパリブは、４−［（３−［（４−シクロプロピルカルボニル）ピペラジン−４−イル］カルボニル）−４−フルオロフェニル］メチル（２Ｈ）フタラジン−１−オンと命名され、以下の構造を有する。
イホスファミドは、がんの治療で使用されるナイトロジェンマスタードアルキル化剤であり、Ｎ−３−ビス（２−クロロエチル）−１，３，２−オキサザホスフィナン−２−アミド−２−酸化物という分類名を有し、例えば商標名Ｉｆｅｘとしても公知であり、以下の構造を有する。
イホスファミドは、睾丸がん、肉腫及び一部のタイプのリンパ腫などの様々ながんを治療するのに使用される化学療法薬である。
本発明の二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体との治療的組合せで採用され得る化学療法剤の更なるクラスは、抗ＶＥＧＦ抗体である。抗ＶＥＧＦ抗体の例としては、抗ＶＥＧＦ抗体又は血管新生を促進する成長因子受容体に標的化されたペプチド−抗体融合体、例えばベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ（登録商標））、イクルクマブ、ＨｕＭＶ８３３、２Ｃ３、アフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））及びＩＭＣ−１Ｃ１１が挙げられる。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））である。抗ＶＥＧＦ抗体の更なる例は、国際公開第２０１０／０４０５０８号及び国際公開第２０１１／１１７３２９号に記載されるような抗ＶＥＧＦ Ａｎｇ２二重特異性抗体である。
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体と、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤とを含む薬学的組成物を提供する。
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体と、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７３８８、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ１９９、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤とを含む薬学的組成物を提供する。更なる態様では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗体及びアブラキサン及びゲムシタビンを含む薬学的組成物を提供する。
更なる態様では、本発明は、
（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体を含む組成物を含む第１の容器と、
（ｉｉ）イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤を含む組成物を含む第２の容器と
を含むキットを提供する。
更なる態様では、本発明は、
（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体を含む組成物を含む第１の容器と、
（ｉｉ）イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７３８８、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ１９９、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤を含む組成物を含む第２の容器と
を含むキットを提供する。
更なる態様では、本発明は、
（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体を含む組成物を含む第１の容器と、
（ｉｉ）イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７３８８、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ１９９、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤を含む組成物を含む第２の容器と
を含むキットを提供する。
更なる態様では、本発明は、
（ｉ）本明細書に記載の二重特異性抗体を含む組成物を含む第１の容器と、
（ｉｉ）パクリタキセル又はアブラキサンを含む第２の容器と、
（ｉｉｉ）ゲムシタビンを含む第３の容器と
を含むキットを提供する。
更なる態様では、本発明は、がんの治療用の医薬の製造におけるデスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体と化学療法剤との組合せの使用であって、二重特異性抗体が、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ１９９、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤と組み合わせて使用される、使用を提供する。
更なる態様では、本発明は、がんの治療用の医薬の製造におけるデスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体と化学療法剤との組合せの使用であって、二重特異性抗体が、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７３８８、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ１９９、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤と組み合わせて使用される、使用を提供する。
更なる態様では、本発明は、がんの治療用の医薬の製造におけるデスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体と化学療法剤との組合せの使用であって、二重特異性抗体が、イリノテカンと組み合わせて使用される、使用を提供する。１つのそのような態様では、治療しようとするがんは、結腸直腸がんである。
更なる態様では、本発明は、がんの治療用の医薬の製造におけるデスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体と化学療法剤との組合せの使用であって、二重特異性抗体が、抗ＶＥＧＦ抗体、好ましくはベバシズマブと組み合わせて使用される、使用を提供する。１つのそのような態様では、治療しようとするがんは、結腸直腸がんである。
更なる態様では、本発明は、がんの治療用の医薬の製造におけるデスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体と化学療法剤との組合せの使用であって、二重特異性抗体が、ドキソルビシンと組み合わせて使用される、使用を提供する。１つのそのような態様では、治療しようとするがんは、肉腫である。
更なる態様では、本発明は、がんの治療用の医薬の製造におけるデスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体と化学療法剤との組合せの使用であって、二重特異性抗体が、イホスファミドと組み合わせて使用される、使用を提供する。１つのそのような態様では、治療しようとするがんは、肉腫である。
更なる態様では、本発明は、がんの治療用の医薬の製造におけるデスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体と化学療法剤との組合せの使用であって、二重特異性抗体が、アブラキサン及びゲムシタビンと組み合わせて使用される、使用を提供する。１つのそのような態様では、治療しようとするがんは、膵臓がんである。
更なる態様では、本発明は、治療的組合せを、組合せ製剤として、又は交互に哺乳動物に投与することを含む、がんの治療のための方法であって、治療的組合せが、治療的有効量の、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体と、治療的有効量の、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤とを含む、方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、治療的組合せを、組合せ製剤として、又は交互に哺乳動物に投与することを含む、がんの治療のための方法であって、治療的組合せが、治療的有効量の、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体と、治療的有効量の、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤ＲＧ７３８８、Ｂｃｌ−２阻害剤ＡＢＴ１９９、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤とを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、がんは、結腸直腸がん、肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、乳がん、膵臓がん、胃がん、非小細胞肺癌、小細胞肺がん、線維形成性黒色腫及び中皮腫である。一実施形態では、がんは、結腸直腸がんである。他の実施形態では、肉腫は、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、消化管間質腫瘍、線維肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫又は悪性線維性組織球腫である。
更なる態様では、本発明は、治療的組合せを、組合せ製剤として、又は交互に哺乳動物に投与することを含む、がんの治療のための方法であって、治療的組合せが、治療的有効量の、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体と、治療的有効量のイリノテカンとを含む、方法を提供する。１つのそのような態様では、治療しようとするがんは、結腸直腸がんである。
更なる態様では、本発明は、治療的組合せを、組合せ製剤として、又は交互に哺乳動物に投与することを含む、がんの治療のための方法であって、治療的組合せが、治療的有効量の、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体と、治療的有効量の抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブとを含む、方法を提供する。１つのそのような態様では、治療しようとするがんは、結腸直腸がんである。
更なる態様では、本発明は、治療的組合せを、組合せ製剤として、又は交互に哺乳動物に投与することを含む、がんの治療のための方法であって、治療的組合せが、治療的有効量の、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体と、治療的有効量のアブラキサンと、治療的有効量のゲムシタビンとを含む、方法を提供する。１つのそのような態様では、治療しようとするがんは、膵臓がんである。
更なる態様では、本発明は、治療的組合せを、組合せ製剤として、又は交互に哺乳動物に投与することを含む、がんの治療のための方法であって、治療的組合せが、治療的有効量の、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体と、治療的有効量のドキソルビシンとを含む、方法を提供する。１つのそのような態様では、治療しようとするがんは、肉腫である。
更なる態様では、本発明は、治療的組合せを、組合せ製剤として、又は交互に哺乳動物に投与することを含む、がんの治療のための方法であって、治療的組合せが、治療的有効量の、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体と、治療的有効量のイホスファミドとを含む、方法を提供する。１つのそのような態様では、治療しようとするがんは、肉腫である。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体及び化学療法剤は、任意選択的に組合せ製剤として、一緒に投与される。代替として、二重特異性抗体及び化学療法剤は、化学療法剤が二重特異性抗体の前に投与されるか、又は化学療法剤が二重特異性抗体の後に投与されるかの何れかで交互に投与されてもよい。組合せは、臨床実践に従って投与されてもよく、例えば、約１週間から３週間のインターバルで投与される。
Ｂ．ＤＲ５及びＦＡＰに結合する例示的な二重特異性抗体
一態様では、本発明は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する、単離された二重特異性抗体を提供する。ＦＡＰ結合部分は国際公開第２０１２／０２０００６号に記載されており、その全体が出典明示により援用される。ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体で使用しようとする特定の対象のＦＡＰ結合部分を、下記の実施形態で概説する。
ある実施形態では、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体はデスレセプターを特異的に架橋し、標的細胞のアポトーシスが誘導される。これらの二重特異性のデスレセプターアゴニスト抗体の、従来のデスレセプターを標的とする抗体に対する利点は、ＦＡＰが発現される部位のみでのアポトーシスの誘導の特異性である。上記で概説したように、本発明の発明者らは、新規で有利なＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体に組み込まれ得る既知のＤＲ５バインダーと比較して優れた特性を有するＤＲ５結合部分を開発した。
一態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、
（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と
を含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体を含む治療的組合せを提供する。
一実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
好ましい一実施形態では、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号２０を含む二重特異性抗体が提供される。別の実施形態では、配列番号１７、配列番号１９及び配列番号２０を含む二重特異性抗体が提供される。
別の態様では、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、配列番号７のアミノ酸配列に対して９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５の可変重鎖及び配列番号１６の可変軽鎖を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
ある実施形態では、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の又は９９％以上の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＦＡＰ及びＤＲ５に結合する能力を保持する配列を含む。ある実施形態では、配列番号７において合計で１から１０個のアミノ酸が置換されている、挿入されている、及び／又は欠失されている。ある実施形態では、ＨＶＲ外の領域（即ちＦＲ）で置換、挿入又は欠失が起こる。任意選択的に、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は配列番号７でのＶＨ配列を含み、該ＶＨ配列はこの配列の翻訳後修飾を含む。
別の態様では、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、配列番号８のアミノ酸配列に対して９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５の可変重鎖及び配列番号１６の可変軽鎖を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む。
ある実施形態では、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の又は９９％以上の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する能力を保持する配列を含む。ある実施形態では、配列番号８において合計で１から１０個のアミノ酸が置換されている、挿入されている、及び／又は欠失されている。ある実施形態では、ＨＶＲ外の領域（即ちＦＲ）で置換、挿入又は欠失が起こる。任意選択的に、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は配列番号８でのＶＬ配列を含み、該ＶＬ配列はこの配列の翻訳後修飾を含む。
別の態様では、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、配列番号８の可変軽鎖及び配列番号７の可変重鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１５のアミノ酸配列に対して９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体が提供される。ある実施形態では、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の又は９９％以上の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＦＡＰ及びＤＲ５に結合する能力を保持する配列を含む。ある実施形態では、配列番号１５において合計で１から１０個のアミノ酸が置換されている、挿入されている、及び／又は欠失されている。ある実施形態では、ＨＶＲ外の領域（即ちＦＲ）で置換、挿入又は欠失が起こる。任意選択的に、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は配列番号１５でのＶＨ配列を含み、該ＶＨ配列はこの配列の翻訳後修飾を含む。
別の態様では、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、配列番号８の可変軽鎖及び配列番号７の可変重鎖を含む、ＤＲ５に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と、配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、ＦＡＰに特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む二重特異性抗体が提供される。ある実施形態では、９０％以上の、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の又は９９％以上の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する能力を保持する配列を含む。ある実施形態では、配列番号１６において合計で１から１０個のアミノ酸が置換されている、挿入されている、及び／又は欠失されている。ある実施形態では、ＨＶＲ外の領域（即ちＦＲ）で置換、挿入又は欠失が起こる。任意選択的に、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は配列番号１６でのＶＬ配列を含み、該ＶＬ配列はこの配列の翻訳後修飾を含む。
別の態様では、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、上記実施形態の内の何れかでのＶＨと、上記実施形態の内の何れかでのＶＬとを含む二重特異性抗体が提供される。一実施形態では、この抗体は、配列番号７及び配列番号８並びに配列番号１５及び配列番号１６それぞれでのＶＨ配列及びＶＬ配列を含み、該ＶＨ配列及びＶＬ配列はこれらの配列の翻訳後修飾を含む。
本発明の更なる態様では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、モノクローナル抗体であり、該モノクローナル抗体としてキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体が挙げられる。一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する前記二重特異性抗体は、ヒト抗体である。
Ｃ．ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体の例示的なフォーマット
一実施形態では、ＤＡ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、抗体断片、例えばＦｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ断片、ｘＦａｂ断片、ｓｃＦａｂ断片、ダイアボディ断片又はＦ（ａｂ’）２断片を含む。別の実施形態では、この抗体は、完全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体又は本明細書で定義するその他の抗体クラス若しくはアイソタイプを含む。
本発明に係る二重特異性抗体は少なくとも二価であり、三価又は多価であることができ、例えば四価又は六価であることができる。
本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
別の実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片とを含み、Ｆａｂ断片の少なくとも１個が重鎖（ＶＨＣＨ１）を介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに接続している。
実施形態の内の何れかでは、Ｆａｂ断片を、直接的に又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに又は互いに融合させることができ、該ペプチドリンカーは１個又は複数個のアミノ酸を含み、典型的には約２−２０個のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当該技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。好適な非免疫原性ペプチドリンカーとして、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカー、（ＳＧ４）ｎペプチドリンカー、（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカー又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は一般的には１と１０との間の数であり、典型的には２と４との間の数である。第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とを互いに融合させるのに特に好適なペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖とを接続させるのに好適な例示的ペプチドリンカーは、ＥＰＫＳＣ（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２である。さらに、リンカーは免疫グロブリンのヒンジ領域（の一部）を含むことができる。特に、抗原結合部分がＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、抗原結合部分を、更なるペプチドリンカーの有無に関わらず免疫グロブリンのヒンジ領域又はこの一部を介して融合させることができる。
好ましい前記二重特異性抗体は、２個の結合部位それぞれがＦＡＰ及びＤＲ５それぞれを標的とする四価である（２＋２フォーマット）。別の実施形態では、前記二重特異性抗体は、３個の結合部位がＤＲ５用であり１個の結合部位がＦＡＰ用である四価である（３＋１フォーマット）。例えば、ＦＡＰを標的とする１個のＦａｂ断片とＤＲ５を標的とする１個のＦａｂ断片とを、２個のＤＲ５結合部位を有するＩｇＧ分子の重鎖のＣ末端に融合させることにより、３＋１フォーマットを実現することができる。このことを、下記でより詳細に概説する。
別の好ましい実施形態では、前記二重特異性抗体は、２個の結合部位それぞれがＤＲ５を標的とし、１個の結合部位がＦＡＰを標的とする三価（２＋１フォーマット）である。例えば、ＦＡＰを標的とするＦａｂ断片を、２個のＤＲ５結合部位を有するＩｇＧ分子の重鎖のＣ末端に融合させることにより、２＋１フォーマットを実現することができ、第１の抗体のＦｃ部分は、下記に概説するノブ・イントゥ・ホール戦略に従って修飾されている。
別の好ましい実施形態では、前記二重特異性抗体は二価（１＋１フォーマット）であり、即ち、ＤＲ５及びＦＡＰそれぞれに対して一価である。本発明の二価抗体は、ＤＲ５を標的とする１個の結合部位と、ＦＡＰを標的とする１個の結合部位とを有する。例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１１；１０８：１１１８７−９２に記載されており、下記で概説するクロスｍａｂ技法により、１＋１フォーマットを実現することができる。
本明細書では、上記実施形態の内の何れかに係る配列の内の何れかを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する様々な二重特異性抗体のフォーマットが提供される。
１．２＋２フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と
を含み、
少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
上記二重特異性抗体はＦＡＰ及びＤＲ５の両方に対して二価であり、２個の結合部位それぞれがＦＡＰ用及びＦＲ５用であることから、このフォーマットは「２＋２」フォーマットとも称される。２＋２フォーマットを有する二重特異性抗体の例示的な構造を図１に示す。可変領域又は定常領域のどちらかの交換に起因して、上記Ｆａｂ断片は、「クロス−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
別の実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片であって、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
別の実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片であって、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域の交換に起因して、ＦＡＰに特異的なクロスオーバーＦａｂ断片はそれぞれ、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖とを含む。これらのクロスオーバーＦａｂ断片はクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称され、ＶＬＣＨ１鎖及びＶＨＣＬ鎖をそれぞれ含む。
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
別の実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片であって、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域の交換に起因して、ＦＡＰに特異的なクロスオーバーＦａｂ断片はそれぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖とを含む。これらのクロスオーバーＦａｂ断片はクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも称され、ＶＨＣＬ鎖及びＶＬＣＨ１鎖を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する前記二重特異性抗体は、２個のＦａｂ断片がＮ末端に融合しており２個のＦａｂ断片がＣ末端に融合しているＦｃドメインを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。一実施形態では、２個のＦａｂ断片は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合している。一実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域である。一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。その他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
一実施形態では、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインに接続している。一実施形態では、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に接続している。そのような一実施形態では、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む前記Ｆａｂ断片は、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３鎖）のＣ末端に接続している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する前記二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（即ち、ＤＲ５に特異的な２個のＦａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
別の実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されており、２個のＦａｂ断片が前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は前記ＩｇＧ分子の定常重鎖のＣ末端に融合している。一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに対して可変重鎖（ＶＨ）のＮ末端に融合している。
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は前記ＩｇＧ分子の定常重鎖のＣ末端に融合している。一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに対して定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端に融合している。一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は前記ＩｇＧ分子の定常重鎖のＣ末端に融合している。一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに対して定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端に融合している。一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
更に好ましい実施形態では、ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより、好ましくは約１０−３０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより、ＩｇＧ分子に融合している。好ましくは、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２リンカー又は（Ｇ４Ｓ）４リンカーである。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片がペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖のＣ末端に融合している。一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに対して定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端に融合している。
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片がペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖のＣ末端に融合している。
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに対して可変重鎖（ＶＨ）のＮ末端に融合している。
一実施形態では、前記２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃドメインと、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片と、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片とを含み、Ｆａｂ断片の少なくとも１個が重鎖（ＶＨＣＨ１）を介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに融合している。
一実施形態では、二重特異性抗体は、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに可変重鎖（ＶＨ）のＮ末端で接続している２個のＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、二重特異性抗体は、
ａ）Ｆｃドメインと、
ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端で接続しているＦａｂ断片と、
ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）に可変軽鎖（ＶＬ）のＮ末端で接続している２個のＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む前記２個のＦａｂ断片は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインにそれぞれ融合している。具体的な実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域である。一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。その他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
一実施形態では、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインに接続している。
２＋２フォーマットを有する例示的抗体
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含む免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含むＦａｂ断片と
を含み、
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片がペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含む免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含むＦａｂ断片と
を含み、
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片がペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖を含む免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片がペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖を含む免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片がペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
別の実施形態では、本発明の前記二重特異性抗体は、下記で概説するように、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に修飾を含む。
一実施形態では、２本の配列番号１８のＶＨ（ＤＲ５）−Ｆｃ部分−ＶＨ（ＦＡＰ）−ＣＬ鎖と、２本の配列番号１９のＶＬ（ＤＲ５）−カッパ軽鎖と、２本の配列番号２０のＶＬＣＨ１（ＦＡＰ）鎖とを含む、上記に記載の２＋２フォーマットを有する二重特異性抗体が提供される。
一実施形態では、２本の配列番号１７のＶＨ（ＤＲ５）−Ｆｃ部分−ＶＨ（ＦＡＰ）−ＣＬ鎖と、２本の配列番号１９のＶＬ（ＤＲ５）−カッパ軽鎖と、２本の配列番号２０のＶＬＣＨ１（ＦＡＰ）鎖とを含む、上記に記載の２＋２フォーマット有する二重特異性抗体が提供される。
２．２＋１フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と
を含み、
少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
上記二重特異性抗体は三価であり、１個の結合部位がＦＡＰ用であり２個の結合部位がＤＲ５用であることから、このフォーマットは「２＋１」フォーマットとも称される。したがって、このセクションで提供される二重特異性抗体は、ＤＲ５に対して二価でありＦＡＰに対して一価である。可変領域又は定常領域のどちらかの交換に起因して、上記Ｆａｂ断片は、「クロス−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域の交換に起因して、ＦＡＰに特異的なクロスオーバーＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ断片はクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称され、ＶＬＣＨ１鎖及びＶＨＣＬ鎖を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む２個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む両方のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域の交換に起因して、ＦＡＰに特異的なクロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ断片はクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも称され、ＶＨＣＬ鎖及びＶＬＣＨ１鎖を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する前記二重特異性抗体は、２個のＦａｂ断片がＮ末端に融合しているＦｃドメインを含む。
一実施形態では、２個のＦａｂ断片は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合している。一実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域である。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。その他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
ＦＡＰバインダーがＣ末端に融合している２＋１フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体
一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。一実施形態では、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に融合している。そのような一実施形態では、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む前記Ｆａｂ断片は、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３鎖）のＣ末端に融合している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されており、Ｆａｂ断片が前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、ｂ）のＦＡＰに特異的な前記Ｆａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に融合している。一実施形態では、ｂ）の前記Ｆａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、Ｆａｂ断片が前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、ｂ）のＦＡＰに特異的な前記Ｆａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に融合している。一実施形態では、ｂ）の前記Ｆａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、Ｆａｂ断片が前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、ｂ）のＦＡＰに特異的な前記Ｆａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に融合している。一実施形態では、ｂ）の前記Ｆａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
ＦＡＰバインダーがＮ末端に融合している２＋１フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体
別の実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む別のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介して、ＩｇＧ分子のＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片のＮ末端に融合している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な１個の結合部位（Ｆａｂ断片）及びＦＡＰに特異的な１個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、ＦＡＰに特異的なＦａｂ断片がクロスＦａｂ断片である（即ち、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な１個の結合部位及びＦＡＰに特異的な１個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、ＦＡＰに特異的なＦａｂ断片がクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）断片である（即ち、重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な１個の結合部位及びＦＡＰに特異的な１個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、ＦＡＰに特異的なＦａｂ断片がクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）断片である（即ち、重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な１個の結合部位及びＦＡＰに特異的な１個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、ＦＡＰに特異的なＦａｂ断片がクロスＦａｂ断片である（即ち、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片であって、ＩｇＧ分子の可変重鎖又は可変軽鎖のＮ末端に融合しているＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な１個の結合部位（Ｆａｂ断片）及びＦＡＰに特異的な１個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、ＦＡＰに特異的なＦａｂ断片がクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）断片である（即ち、重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片であって、ＩｇＧ分子の可変重鎖又は可変軽鎖のＮ末端に融合しているＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、ｂ）のＤＲ５に特異的なＦａｂ断片は、ａ）のＤＲ５に特異的なＦａｂ断片の可変重鎖又は可変軽鎖のＮ末端に融合している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ａ）ＤＲ５に特異的な１個の結合部位及びＦＡＰに特異的な１個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、ＦＡＰに特異的なＦａｂ断片がクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）断片である（即ち、重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片であって、ＩｇＧ分子の可変重鎖又は可変軽鎖のＮ末端に融合しているＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、ｂ）のＤＲ５に特異的なＦａｂ断片は、ａ）のＤＲ５に特異的なＦａｂ断片の可変重鎖又は可変軽鎖のＮ末端に融合している。
更に好ましい実施形態では、ＤＲ５に特異的なＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより、好ましくは約１０−３０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより、ＩｇＧ分子に融合している。好ましくは、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２リンカー又は（Ｇ４Ｓ）４リンカーである。
別の実施形態では、前記本発明の二重特異性抗体は、下記で概説するように、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に修飾を含む。
３．３＋１フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む３個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と
を含み、
少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
上記二重特異性抗体は四価であり、１個の結合部位がＦＡＰ用であり３個の結合部位がＤＲ５用であることから、このフォーマットは「３＋１」フォーマットとも称される。したがって、このセクションに記載の二重特異性抗体は、ＤＲ５に対して三価でありＦＡＰに対して一価である。可変領域又は定常領域のどちらかの交換に起因して、上記Ｆａｂ断片は、「クロス−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む３個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む３個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域の交換に起因して、ＦＡＰに特異的なクロスオーバーＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ断片はクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称され、ＶＬＣＨ１鎖及びＶＨＣＬ鎖を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位をそれぞれ含む３個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域の交換に起因して、ＦＡＰに特異的なクロスオーバーＦａｂ断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されるペプチド鎖とをそれぞれ含む。このクロスオーバーＦａｂ断片はクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも称され、ＶＨＣＬ鎖及びＶＬＣＨ１鎖を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する前記二重特異性抗体は、２個のＦａｂ断片がＮ末端に融合しており２個のＦａｂ断片がＣ末端に融合しているＦｃドメインを含み、ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
一実施形態では、２個のＦａｂ断片は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合している。一実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域である。一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。その他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含む。
任意選択的に、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含み、
ｂ）及びｃ）のＦａｂ断片が前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に融合している。
一実施形態では、前記ｂ）及びｃ）の２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含み、
ｂ）及びｃ）のＦａｂ断片が前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットのＣ末端に融合している。
一実施形態では、前記ｂ）及びｃ）の２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位（Ｆａｂ断片）を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な１個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と、
ｃ）ＤＲ５に特異的な１個のＦａｂ断片と
を含み、
ｂ）及びｃ）のＦａｂ断片が前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第１の又は第２のサブユニットに融合している。
一実施形態では、前記ｂ）及びｃ）の２個のＦａｂ断片は、前記ＩｇＧ分子のＦｃドメインの第２のサブユニット（ＣＨ３）のＣ末端に融合している。
更に好ましい実施形態では、このセクションに記載の実施形態の内の何れかのｂ）及びｃ）の２個のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーにより、好ましくは約１０−３０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより、ＩｇＧ分子に融合している。好ましくは、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２リンカー又は（Ｇ４Ｓ）４リンカーである。
別の実施形態では、本発明の前記二重特異性抗体は、下記で概説するように、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に修飾を含む。
４．１＋１フォーマットの二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と
を含み、
少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
上記二重特異性抗体は二価であり、１個の結合部位がＦＡＰ用であり１個の結合部位がＤＲ５用であることから、このフォーマットは「１＋１」フォーマットとも称される。したがって、このセクションに記載の二重特異性抗体は、ＤＲ５に対して一価でありＦＡＰに対して一価である。可変領域又は定常領域のどちらかの交換に起因して、上記Ｆａｂ断片は、「クロス−Ｆａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」とも称される。１＋１フォーマットでのＩｇＧ分子は、クロスｍａｂフォーマットとも称される（Schaefer等, Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108:11187-92を参照されたい）。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
Ｆｃドメインと、
ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片と、
ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む１個のＦａｂ断片であって、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する前記二重特異性抗体は、２個のＦａｂ断片がＮ末端に融合しているＦｃドメインを含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。一実施形態では、２個のＦａｂ断片は、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合している。一実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域はヒトＩｇＧ１のヒンジ領域である。一実施形態では、ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子はＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。更により特定の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。その他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５に特異的な１個の結合部位とＦＡＰに特異的な１個の結合部位とを有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含み、ＩｇＧ分子の１本のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５に特異的な１個の結合部位とＦＡＰに特異的な１個の結合部位とを有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含み、ＩｇＧ分子の１本のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている。この抗体フォーマットはクロスＭａｂ（ＶＨＶＬ）とも称される。
一実施形態では、ＦＡＰに特異的な結合部位を含むＩｇＧ分子の１本のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５に特異的な１個の結合部位とＦＡＰに特異的な１個の結合部位とを有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含み、ＩｇＧ分子の１本のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている。この抗体フォーマットはクロスＭａｂ（ＣＨ１ＣＬ）とも称される。
一実施形態では、ＦＡＰに特異的な結合部位を含むＩｇＧ分子の１本のアーム（Ｆａｂ断片）の重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５に特異的な１個の結合部位とＦＡＰに特異的な１個の結合部位とを有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含み、ＩｇＧ分子の１本のアーム（Ｆａｂ断片）の完全なＶＨ−ＣＨ１ドメイン及びＶＬ−ＣＬドメインが交換されている。このことは、Ｆａｂ断片の少なくとも１個が軽鎖（ＶＬＣＬ）を介してＦｃドメインのＮ末端に融合していることを意味する。一実施形態では、その他のＦａｂ断片が、重鎖（ＶＨＣＨ１）を介してＦｃドメインのＮ末端に融合している。
この抗体フォーマットはクロスＭａｂＦａｂとも称される。一実施形態では、両方のＦａｂ断片が、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのＮ末端に融合している。
Ｄ．Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、Ｆｃ部分が修飾されている免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含む。修飾されたＦｃ部分は、野生型のＦｃ部分と比較してＦｃγ受容体に対する結合親和性が低下している。
本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む１対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインはダイマーであり、該ダイマーの各サブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３のＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２個のサブユニットは、互いに安定して結合することができる。
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインはＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。別の実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（カバット番号付け）でのアミノ酸置換を含む、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。このアミノ酸置換により、ＩｇＧ４抗体のインビボＦａｂアーム交換が減少する（Stubenrauch等, Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照されたい）。更に特定の実施形態では、Ｆｃドメインはヒトである。Ｆｃドメインは、標的組織における良好な蓄積及び好ましい組織−血液分配比率に寄与する長い血清半減期等の好ましい薬物動態学的特性を本発明の二重特異性抗体に付与する。しかしながら、同時期に、好ましい抗原保有細胞よりもむしろＦｃ受容体を発現する細胞への本発明の二重特異性抗体の所望されない標的化が引き起こされ得る。したがって、特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。そのような一実施形態では、Ｆｃドメイン（若しくは前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）は、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（若しくは天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）と比較して、Ｆｃ受容体に対する５０％未満の、好ましくは２０％未満の、より好ましくは１０％未満の、最も好ましくは５％未満の結合親和性を示す、及び／又は天然型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（若しくは天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）と比較して、５０％未満の、好ましくは２０％未満の、より好ましくは１０％未満の、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一実施形態では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない、及び／又はエフェクター機能を実質的に誘導しない。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は阻害性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃｇＲＩＩＢである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の内の１種又は複数種である。特定の実施形態では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較した場合、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）が天然型ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超を、具体的には約８０％超を、より具体的には約９０％超を示す場合に実現される。
ある実施形態では、Ｆｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較した場合に、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下している及び／又はエフェクター機能が低下しているように操作されている。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１個又は複数個のアミノ酸突然変異を含む。典型的には、同一の１個又は複数個のアミノ酸突然変異が、Ｆｃドメインの２個のサブユニットそれぞれに存在する。一実施形態では、アミノ酸突然変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる。一実施形態では、アミノ酸突然変異は、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を２倍以上、５倍以上又は１０倍以上低下させる。ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる複数個のアミノ酸突然変異が存在する実施形態では、これらのアミノ酸突然変異の組み合わせにより、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を１０倍以上、２０倍以上又は更に５０倍以上低下させることができる。一実施形態では、操作型Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、非操作型Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体を比較した場合に、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の２０％未満を示し、具体的には１０％未満を示し、より具体的には５％未満を示す。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は阻害性Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は阻害性ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃｇＲＩＩＢである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具外的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体それぞれに対する結合が低下している。いくつかの実施形態では、補体成分に対する結合親和性、特にＣ１ｑに対する結合親和性も減少している。一実施形態では、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低下していない。ＦｃＲｎの実質的に同様の結合、即ちＦｃドメインの前記受容体に対する結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）が、非操作型のＦｃドメイン（又は前記非操作型のＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超を示す場合に実現される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、そのような親和性の約８０％超を示すことができ、更に約９０％超を示すことができる。ある実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較した場合にエフェクター機能が低下しているように操作されている。エフェクター機能の低下として、下記の内の１種又は複数種を挙げることができるがこれらに限定されない：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性の抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、直接的シグナル伝達を誘導するアポトーシスの低下、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下。一実施形態では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の内の１種又は複数種である。特定の実施形態では、エフェクター機能の低下はＡＤＣＣの低下である。一実施形態では、ＡＤＣＣの低下は、非操作型Ｆｃドメイン（又は非操作型Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
一実施形態では、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸突然変異はアミノ酸置換である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置でのアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ２３９の位置でのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。そのような一実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位でのアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、アミノ酸置換はＰ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇであり、特にＰ３２９Ｇである。一実施形態では、ＦｃドメインはＰ３２９位でのアミノ酸置換と、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２３９及びＰ３３１から選択される位置での更なるアミノ酸置換とを含む。より具体な実施形態では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位、Ｌ２３４位及びＬ２３５位でのアミノ酸置換を含む。更に特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。そのような一実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。
出典明示により全体が本明細書に援用される国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように、アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせにより、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのＦｃγ受容体結合がほとんど完全に消失する。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、そのような変異型Ｆｃドメインを調製する方法、及び該変異型Ｆｃドメインの特性、例えばＦｃ受容体結合又はエフェクター機能を測定する方法も記載されている。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を示す。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインであり、特にヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである。一実施形態では、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、Ｓ２２８位でのアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を更に低下させるために、一実施形態では、ＩｇＧ４のＦｃドメインはＬ２３５位でのアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の実施形態では、ＩｇＧ４のＦｃドメインはＰ３２９位でのアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施形態では、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、Ｓ２２８位、Ｌ２３５位及びＰ３２９位でのアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。そのようなＩｇＧ４のＦｃドメイン変異及びこれらのＦｃγ受容体結合特性は、出典明示により全体が本明細書に援用される国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
特定の実施形態では、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである。
ある実施形態では、ＦｃドメインのＮ−グリコシル化が除かれている。そのような一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｎ２９７位でのアミノ酸突然変異を含み、特に、アスパラギンをアラニンに置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギンをアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む。
上記及び国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下しているＦｃドメインとして、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の内の１個又は複数個の置換を有するＦｃドメインも挙げられる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体として、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体等の、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位及び３２７位の内の２個又はそれ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられる（米国特許第７３３２５８１号）。
当該技術分野で公知の遺伝学的方法又は化学的方法を使用するアミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾により、変異型Ｆｃドメインを調製することができる。遺伝学的方法として、ＤＮＡ配列のコーディング、ＰＣＲ、遺伝子合成等の部位特異的突然変異誘発を挙げることができる。正しいヌクレオチド変化を例えば配列決定により検証することができる。
例えばＥＬＩＳＡにより、又は標準的な器具、例えばＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、Ｆｃ受容体への結合を容易に測定することができ、そのようなＦｃ受容体を組換え発現により得ることができる。そのような好適な結合アッセイが本明細書に記載されている。あるいは、Ｆｃドメインの結合親和性又はＦｃ受容体に対するＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性を、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価することができる。
当該技術分野で既知の方法により、Ｆｃドメインのエフェクター機能又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能を測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例が、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９−７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ等、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１−１３６１（１９８７）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、マウンテンビュー）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、マディソン）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは又は加えて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２−６５６（１９９８）に開示されている動物モデル等の動物モデルにおいて、目的の分子のＡＤＣＣ活性をインビボで評価することができる。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインの補体成分への結合、具体的にはＣ１ｑへの結合が低下している。したがって、エフェクター機能が低下するようにＦｃドメインが操作されているいくつかの実施形態では、前記エフェクター機能の低下としてＣＤＣの低下が挙げられる。本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、そのためＣＤＣ活性を有するかどうかを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実行することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Gazzano-Santoro等, J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg等, Blood 101, 1045-1052 (2003)並びにCragg及びGlennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照されたい）。
下記のセクションには、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾を含む本発明の二重特異性抗体の好ましい実施形態が記載されている。
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインが、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１個又は複数個のアミノ酸置換を含む、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、前記１個又は複数個のアミノ酸置換が、Ｌ２３４位、Ｌ２３５位及びＰ３２９位の内の１個又は複数個である、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
好ましい一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されている、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体及び阻害性Ｆｃ受容体への結合並びに／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合並びに／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号１からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合並びに／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、
配列番号９の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２、
配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３
を含み、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖を含み、
Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖を含み、
Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、
ａ）ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子であって、
配列番号７の可変重鎖及び配列番号８の可変軽鎖を含み、
Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性型Ｆｃ受容体若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子と、
ｂ）ＦＡＰに特異的な２個のＦａｂ断片であって、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、２個のＦａｂ断片が、ペプチドリンカーにより前記ＩｇＧ分子の定常重鎖に融合している、Ｆａｂ断片と
を含む。
Ｅ．ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明の二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体は、Ｆｃドメインの２個のサブユニットの内の一方又は他方に融合している異なる抗原結合部分を含み、そのため、Ｆｃドメインの２個のサブユニットは典型的には、２個の同一でないペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化により、２種のポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換えによる産生における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を改善するために、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインに所望のポリペプチドの結合を促進する修飾を導入することが有利となるだろう。
したがって、特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの結合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの２個のサブユニット間の最も広範囲のタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中である。そのため、一実施形態では、前記修飾はＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中である。
具体的な実施形態では、前記修飾はいわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２個のサブユニットの内の一方で「ノブ」修飾を含み、Ｆｃドメインの２個のサブユニットの内のもう一方で「ホール」修飾を含む。
ノブ・イントゥ・ホール技法は、例えば米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ等、Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９、６１７−６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８、７−１５（２００１）に記載されている。
一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの接触面で突起（「ノブ」）を導入し、第２のポリペプチドの接触面に、対応する空洞（「ホール」）を導入し、その結果、ヘテロダイマー形成を促進してホモダイマー形成を妨げるように突起が空洞中に位置することができることを含む。第１のポリペプチドの接触面からの小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより、突起を構築することができる。大きなアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えばアラニン又はトレオニン）で置き換えることにより、突起と同一の又は同様のサイズの代償的空洞を第２のポリペプチドの接触面に生じさせる。
したがって、特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、アミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられており、これにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞中に位置することができる突起が作られており、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられており、これにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置することができる空洞が作られている。
突起及び空洞を、ポリペプチドをコードする核酸を例えば部位特異的突然変異誘発によって変更することにより又はペプチド合成により作ることができる。
具体的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、３６６位のトレオニン残基がトリプトファン残基に置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインでは、４０７位のチロシン残基がバリン残基に置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一実施形態では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットでは更に、３６６位のトレオニン残基がセリン残基に置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位でのロイシン残基がアラニン残基に置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）。
更なる実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて更に、３５４位のセリン残基がシステイン残基に置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３４９位のチロシン残基がシステイン残基に置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２個のシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの２個のサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、ダイマーが更に安定化される（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
代替実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの結合を促進する修飾は、例えば国際公開第２００９／０８９００４号に記載の、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般的に、この方法は、２個のＦｃドメインのサブユニットの接触面の１個又は複数個のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基に置き換え、その結果、ホモダイマー形成が静電気的に好ましくないがヘテロ二量体化が静電気的に好ましくなることを含む。
一実施形態では、上記実施形態の内の何れかに係る、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体は、ＤＲ５に特異的な２個の結合部位を有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子を含み、第１の重鎖のＦｃ部分が第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分が第２の二量体化モジュールを含み、このことにより、ＩｇＧ分子の２本の重鎖のヘテロ二量体化が可能となる。
更に好ましい実施形態では、ノブ・イントゥ・ホール戦略に従って、第１の二量体化モジュールがノブを含み、第２の二量体化モジュールがホールを含む（Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996 , pp. 73-73(1)を参照されたい）。
Ｆ．核酸配列、ベクター及び産生方法
ＤＲ５及びＦＡＰに結合することができる二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドが、その産生のために使用され得る。本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを、完全な二重特異性抗原結合分子若しくはＤＲ５に結合する完全な抗体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される多数の（例えば２個又はそれ以上の）ポリヌクレオチドとして発現させることができる。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又はその他の手段により結合して、機能的な二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を形成することができる。例えば、Ｆａｂ断片の重鎖部分、Ｆｃドメインサブユニット及び任意選択的な別のＦａｂ断片（の一部）を含む二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の一部とは別のポリヌクレオチドにより、Ｆａｂ断片の軽鎖部分をコードすることができる。共発現される場合、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと結合してＦａｂ断片を形成することができる。別の例では、２個のＦｃドメインサブユニットの内の一方及び任意選択的な１個又は複数個のＦａｂ断片（の一部）を含む、本明細書に記載の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の一部を、２個のＦｃドメインサブユニットの内の他方及び任意選択的なＦａｂ断片（の一部）を含む、本明細書に記載の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の一部とは別のポリヌクレオチドによりコードすることができる可能性がある。共発現される場合、Ｆｃドメインサブユニットは結合してＦｃドメインを形成することができる。
ある実施形態では、このポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。その他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡであり、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＡＮ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖であることができる、又は二本鎖であることができる。
Ｇ．抗体変異体
ある実施形態では、上記に記載したものに加えて、本明細書に記載の二重特異性抗体及びＤＲ５に結合する抗体のアミノ酸変異体が意図される。例えば、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の結合親和性及び／又はその他の生物学的特性を改善することが望まれる場合がある。二重特異性抗体若しくはＤＲ５に結合する抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体のアミノ酸配列変異体を調製することができる。そのような修飾として、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は該残基への挿入、及び／又は該残基の置換が挙げられる。最終コンストラクトに到達するように欠失、挿入及び置換のあらゆる組み合わせを行うことができるが、但し、最終コンストラクトは所望の特性、例えば抗原結合を保持する。
１．置換変異体、挿入変異体及び欠失変異体
ある実施形態では、１個又は複数個のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発の対象の部位として、ＨＶＲ及びＦＲが挙げられる。保存的置換を、「保存的置換」という表題で表Ｂに示す。より実質的な変更を、「例示的な置換」という表題で表Ｂ記載し、アミノ酸側鎖のクラスを参照して下記で更に説明する。アミノ酸置換を目的の抗体に導入することができ、産物を、所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善に関してスクリーニングすることができる。
下記の共通の側鎖の特性に従ってアミノ酸を分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの内の１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴うことができる。
置換変異体の一種として、親抗体（例えばヒト化抗体又はヒト抗体）の１個又は複数個の超可変領域の残基を置換することが挙げられる。一般的には、更なる研究のために選択される、生じた変異体（１種若しくは複数種）は、親抗体と比較して、いくつかの生物学的特性の改変（例えば改善）（例えば親和性の増加、免疫原性の低下）を有することができる、及び／又は親抗体のいくつかの生物学的特性を実質的に保持することができる。例示的な置換変異体は親和性成熟抗体であり、該親和性成熟抗体を、例えば、ファージ提示に基づく親和性成熟技法を使用して、例えば本明細書に記載した親和性成熟技法を使用して簡便には生成することができる。簡潔に言うと、１個又は複数個のＨＶＲ残基を突然変異させて変異体抗体をファージ上に提示させ、特定の生物活性（例えば結合親和性）に関してスクリーニングする。
ＨＶＲ中で改変（例えば置換）を行って、例えば抗体の親和性を改善することができる。そのような改変を、ＨＶＲの「ホットスポット」、即ち体細胞成熟過程中に高頻度で突然変異を受けるコドンによりコードされる残基（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照されたい）及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、生じた変異体のＶＨ若しくはＶＬを結合親和性に関して試験する。二次ライブラリから構築して再選択することによる親和性成熟が、例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等、ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１−３７（O’Brien等編、Human Press, Totowa, NJ, (2001))に記載されている。親和性成熟に関するいくつかの実施形態では、成熟のために選択した可変遺伝子に、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング又はオリゴヌクレオチド指定突然変異）の内の何れかにより多様性を導入する。次いで、二次ライブラリを作成する。次いで、この二次ライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法として、いくつかのＨＶＲ残基（例えば同時に４−６個の残基）が無作為化されているＨＶＲ特異的手法を伴う。例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発又はモデル化を使用して、抗原結合に関与するＨＶＲ残基を具体的に同定することができる。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が標的となることが多い。
ある実施形態では、置換、挿入又は欠失は、そのような改変が抗体の抗原に結合する能力を実質的に低下させない限り、１個又は複数子のＨＶＲ内で起こることができる。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば本明細書に記載の保存的置換）をＨＶＲ中で行うことができる。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であることができる。上記に記載の変異体のＶＨ配列及びＶＬ配列に関するある実施形態では、各ＨＶＲは未改変である、又は１個以下の、２個以下の若しくは３個以下のアミノ酸置換を含むことができる。
突然変異誘発のために標的化することができる抗体の残基又は領域の同定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５により説明される「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕ等の荷電残基）を同定し、中性の又は負に荷電したアミノ酸（例えばアラニン又はポリアラニン）に置き換えて、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを確認する。最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置で更なる置換を導入することができる。あるいは又は加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基を、置換の候補として標的化することができる、又は除去することができる。変異体をスクリーニングして、変異体が所望の特定を含むかどうかを確認することができる。
アミノ酸配列の挿入として、１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲であるアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合が挙げられ、単一の又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入も更に挙げられる。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入変異体として、（例えばＡＤＥＰＴの場合は）酵素に対する抗体のＮ末端若しくはＣ末端への融合、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合が挙げられる。
２．グリコシル化変異体
ある実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を改変して、抗体がグリコシル化される程度を増加させる又は減少させる。アミノ酸配列を改変し、それにより１個又は複数個のグリコシル化部位を作る又は除去することにより、抗体へのグリコシル化部位の追加又はグリコシル化部位の欠失を簡便に実現することができる。
二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体がＦｃ領域を含む場合、該Ｆｃ領域に結合した炭化水素を改変することができる。哺乳動物細胞により産生される天然型抗体は典型的には、Ｎ結合によりＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般的に結合する、分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えばＷｒｉｇｈｔ等、ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖として、様々な炭化水素、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸を挙げることができ、二分岐オリゴ糖構造の「ステム」中のＧｌＮＡｃに結合したフコースも更に挙げることができる。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体におけるオリゴ糖の改変を行って、いくつかの特性が改善されている抗体変異体を作成することができる。
一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的に又は間接的に）結合したフコースを欠く炭化水素構造を有す二重特異性抗体変異体又はＤＲ５に結合する抗体の変異体が提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％又は２０％から４０％であることができる。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体構造、ハイブリッド構造及び高マンノース構造）の合計に対して、Ａｓｎ２９７での糖鎖中でのフコースの平均量を算出することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中においておよそ２９７（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を意味するが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体の小さな配列変異に起因して、２９７位の約±３個のアミノ酸の上流又は下流、即ち２９４位と３００位との間に位置することもできる。そのようなフコシル化変異体ではＡＤＣＣ機能が改善されている可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照されたい。「脱フコシル化」抗体変異体又は「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例として、ＵＳ２００３／０１５７１０８；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Ｏｋａｚａｋｉ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ等、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例として、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｅ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka等, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号、Ａｄａｍｓ等、特に実施例１１）、並びにノックアウト細胞株、例えばアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki等, Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); Kanda, Y.等, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）が挙げられる。
例えば二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体のＦｃ領域に結合している二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている、二分されたオリゴ糖を有する二重特異性抗体変異体又はＤＲ５に結合する抗体の変異体が更に提供される。そのような二重特異性抗体変異体又はＤＲ５に結合する抗体の変異体では、フコシル化が低減されている及び／又はＡＤＣＣ機能が改善されている可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ等）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａ等）及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ等）に記載されている。Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖中に少なくとも１個のガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体ではＣＤＣ機能が改善されている可能性がある。そのような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ等）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
３．システインにより操作された抗体変異体
ある実施形態では、システインにより操作された二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体、例えば二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の１個又は複数個の残基がシステイン残基で置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、残基の置換は、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、抗体の接近可能な部位に反応性チオール基が位置し、この反応性チオール基を使用して抗体をその他の部分、例えば薬物部分又はリンカー薬物部分とコンジュゲートさせ、イムノコンジュゲートを作成することができる。ある実施形態では、下記の残基の内の何れか１個又は複数個をシステインで置換することができる：軽鎖のＶ２０５（カバット番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システインにより操作された抗体を、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されているように生成することができる。
Ｈ．組換え方法及び組換え組成物
例えば固体状のペプチド合成（例えばメリフィールド固体相合成）又は組換え産生により、本発明の二重特異性抗体及びＤＲ５に結合する抗体を得ることができる。組換え産生の場合、例えば上述したような、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体（又は断片）をコードする１種又は複数種のポリヌクレオチドを単離し、更なるクローニング及び／又は宿主細胞中での発現のために１種又は複数種のベクターに挿入する。そのようなポリヌクレオチドを、従来の手順を使用して容易に単離して配列決定することができる。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチド内の１種又は複数種を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に公知である方法を使用して、二重特異性抗体（断片）又はＤＲ５に結合する抗体（断片）のコード配列を適切な転写／翻訳制御シグナルと共に含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法として、インビトロ組換えＤＮＡ技法、合成技法及びインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ等、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載されている技法を参照されたい。発現ベクターは、プラスミドの一部、ウイルスの一部であることができる、又は核酸断片であることができる。発現ベクターは、二重特異性抗体（断片）又はＤＲ５に結合する抗体（断片）をコードするポリヌクレオチド（即ちコード領域）がプロモーター及び／又はその他の転写若しくは翻訳の制御要素と作動可能に共にクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分のことである。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部であると見なすことができる。しかしながら、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域等の隣接領域は何れもコード領域の一部ではない。単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別々の（異なる）ベクター上に、２個又はそれ以上のコード領域が存在することができる。さらに、あらゆるベクターは単一のコード領域を含むことができ、又は２個若しくはそれ以上のコード領域を含むことができ、例えば、本発明のベクターは１種又は複数種のポリペプチドをコードすることができ、該ポリペプチドは、翻訳後に又は翻訳と同時に、タンパク質切断により最終タンパク質に分離される。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の二重特異性抗体（断片）又はＤＲ５に結合する抗体（断片）、これらの変異体又は誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合している又は融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域として、特殊化した要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。作動可能な結合とは、遺伝子産物、例えばポリペプチドの発現が調節配列（１種又は複数種）の影響下に又は制御下に置かれるように、遺伝子産物のコード領域が１種又は複数種の調節配列に結合している場合のことである。プロモーター機能の誘導により、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が生じ、２個のＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこのポリペプチドコード領域に結合したプロモーター）間の結合の性質が発現調節配列の遺伝子産物の発現を指示する能力に干渉しない又はＤＮＡ鋳型の転写される能力に干渉しない場合、２個のＤＮＡ断片が「作動的に結合している」。したがって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を生じさせることができた場合、プロモーター領域は、この核酸と作動可能に結合しているだろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであることができる。
プロモーター以外のその他の転写制御要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終止シグナルをポリヌクレオチドに作動可能に結合させて細胞特異的転写を指示させることができる。適切なプロモーター及びその他の転写制御領域を本明細書で開示する。様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらの転写制御領域として、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域が挙げられるがこれに限定されず、この転写制御領域として、サイトメガロウイルス由来のプロモーター断片及びエンハンサー断片（例えば、前初期プロモーター及びイントロンＡ）、シミアンウイルス４０由来のプロモーター断片及びエンハンサー断片（例えば初期プロモーター）、並びにレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス等）由来のプロモーター断片及びエンハンサー断片が挙げられるがこれらに限定されない。その他の転写制御領域として、脊椎動物遺伝子に由来する転写制御領域、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギａ−グロビンが挙げられ、真核細胞における遺伝子発現を制御可能なその他の配列も更に挙げられる。更なる適切な転写制御領域として、組織特異的なプロモーター及びエンハンサーが挙げられ、誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンを誘導可能なプロモーター）も更に挙げられる。同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に知られている。この翻訳制御要素として、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び翻訳終止コドン、並びにウイルスシステムに由来する要素（特に内部リボソーム浸入部位、即ちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも称される）が挙げられるがこれらに限定されない。発現カセットは、複製起点及び／又は染色体の組み込み要素、例えばレトロウイルス長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復配列（ＩＴＲ）等のその他の特徴を含むこともできる。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域を、分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができ、これらのペプチドは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を指示する。例えば、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の分泌が望まし場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗体若しくは本発明のＤＲ５に結合する抗体又はこれらの断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、伸長しているタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド配列又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが一般的に、このポリペプチドのＮ末端に融合しているシグナルペプチドを有し、翻訳されたポリペプチドから該シグナルペプチドが切断されて、分泌された又は「成熟した」形態のポリペプチドが産生されることを認識している。ある実施形態では、天然型シグナルペプチド、例えば免疫グロブリンの重鎖シグナルペプチド若しくは軽鎖シグナルペプチドが使用される、又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するこの配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はこの機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒトの組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスのβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
その後の精製を容易にするために使用される可能性がある短いタンパク質配列（例えばヒスチジンタグ）又は二重特異性抗体若しくはＤＲ５に結合する抗体の標識化に役立つ短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、二重特異性抗体（断片）又はＤＲ５に結合する抗体（断片）をコードするポリヌクレオチド内に又は該ポリヌクレオチドの端部に含ませることができる。
更なる実施形態では、本発明の１種又は複数種のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ある実施形態では、本発明の１種又は複数種のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関して本明細書に記載した特徴の内の何れかを単独で又は組み合わせて包含することができる。そのような一実施形態では、宿主細胞は、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、該ベクターにより形質転換されている又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、本発明の二重特異性抗体若しくはＤＲ５に結合する抗体又はこれらの断片を生成するように操作され得るあらゆる種類の細胞系を意味する。二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を複製するのに適した宿主細胞及びこれらの抗体の発現を支持するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で公知である。そのような細胞を、特定の発現ベクターにより適切にトランスフェクトする又は形質導入することができ、大規模な発酵槽に播種するために大量のベクター含有細胞を増殖させて、臨床応用に十分な量の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を得ることができる。適切な宿主細胞として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等の様々な真核細胞が挙げられる。例えば、特にグリコシル化が必要でない場合には、細菌中でポリペプチドを産生することができる。発現後、ポリペプチドを細菌細胞ペーストから単離して可溶画分を更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の真核微生物は、ポリペプチドをコードするベクターに適したクローニング宿主又は発現宿主であり、この真核微生物として、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、それにより部分的な又は完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドが産生される真菌株及び酵母株が挙げられる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２、１４０９−１４１４（２００４）及びＬｉ等、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４、２１０−２１５（２００６）を参照されたい。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例として、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクション用に、昆虫細胞と共に使用することができる多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、米国特許第６０４０４９８号、米国特許第６４２０５４８号、米国特許第７１２５９７８号及び米国特許第第６４１７４２９号（トランスジェニック植物中で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技法を説明している）を参照されたい。脊椎動物細胞を宿主として使用することもできる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞も有用であることができる。有用な哺乳動物宿主細胞株のその他の例は、ＳＶ４０により形質転換されているサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎臓株（例えばGraham等, J Gen Virol 36, 59 (1977)に記載されている２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばMather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されているＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Mather等, Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載されている）、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞である。その他の有用な哺乳動物宿主細胞株として、ｄｈｆｒ− ＣＨＯ細胞（Urlaub等, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)）等のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；並びにミエローマ細胞、例えばＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適したいくつかの哺乳動物宿主細胞の概説に関して、例えばＹａｚａｋｉ及びＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞として、培養細胞、例えばほんの一部として哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養された植物組織若しくは動物組織に含まれる細胞も挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は真核細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ系細胞（例えばＹ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２０細胞）である。
これらの系において外来遺伝子を発現させるための標準的な技法は、当該技術分野で公知である。抗体等の抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のどちらかを含むポリペプチドを発現する細胞を、その他の抗体鎖も発現するように操作し、その結果、発現産物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であることができる。
一実施形態では、本発明に係る二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を産生する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の発現に適した条件下で、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞（又は宿主細胞の培地）から二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を回収することを含む。
二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の成分は、互いに遺伝子学的に融合する。二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を、その成分が互いに直接的に又はリンカー配列を介して間接的に融合するように設計することができる。リンカーの組成及び長さを、当該技術分野で公知の方法に従って決定することができ、有効性に関して試験することができる。二重特異性抗体の様々な成分間のリンカー配列の例は、本明細書に記載の配列中に見出される。必要に応じて融合の個々の成分を分離すべく切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を組み込むために、更なる配列を含めることもできる。
ある実施形態では、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の一部を形成するＦａｂ断片は、抗原決定基に結合することができる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体又はこの断片の一部を形成し、これらに由来することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は当該技術分野で公知である（例えばHarlow及びLane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい）。非天然に存在する抗体を、固体相−ペプチド合成を使用して構築することができる、組換えにより産生することができる（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載されている）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリのスクリーニングにより得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照されたい）。
あらゆる動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体で使用することができる。本発明において有用である非限定的な抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス起源、霊長類起源又はヒト起源であることができる。二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体がヒトでの使用を目的とする場合、抗体の定常領域がヒトに由来するキメラ形態の抗体を使用することができる。ヒト化形態又は完全ヒト形態の抗体を、当該技術分野で公知の方法に従って調製することもできる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照されたい）。ヒト化を様々な方法により実現することができ、この方法として、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば良好な抗原結合親和性若しくは抗体機能を保持するのに重要であるフレームワーク残基）の有無に関わらず、非ヒト（例えばドナー抗体）ＣＤＲをヒト（例えばレシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域にグラフトすること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ若しくはａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフトすること、又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインを移植するが表面残基の置き換えによりヒト様断片でそれらを「覆う」ことが挙げられるがこれらに限定されない。ヒト化抗体及びこれらの作製方法は、例えばＡｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １３，１６１９−１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ ３３２、３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６、１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、米国特許第７５２７７９１号、米国特許第６９８２３２１号及び米国特許第７０８７４０９号；Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２１、５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１、６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ、Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４、６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３）、１６９−２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６、２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）のグラフィティングを説明している）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８、４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を説明している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６、４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を説明している）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６、６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ等、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３、２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチを説明している）に更に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域を、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生することができる。ヒト抗体は一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５、３６８−７４（２００１）並びにＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、４５０−４５９（２００８）に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法により生成されるヒトモノクローナル抗体の一部を形成し、これに由来することができる（例えばMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域を、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されているトランスジェニック動物に免疫源を投与することにより調製することもできる（例えばLonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域を、ヒト由来ファージ提示ライブラリから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することもできる（例えばHoogenboom等. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, 2001);及びMcCafferty等, Nature 348, 552-554; Clackson 等, Nature 352, 624-628 (1991)を参照されたい）。ファージは典型的には、抗体断片を単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のどちらかとして提示する。
ある実施形態では、本発明において有用なＦａｂ断片を、例えば、内容全体が出典明示により援用される米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法に従って結合親和性を高めるように操作する。本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の特定の抗原決定基に結合する能力を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られているその他の技法、例えば表面プラズモン共鳴技法（ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００システムで解析される）（Liljeblad等, Glyco J 17, 323-329 (2000)）及び従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）の何れかにより測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合に関して参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを同定することができる。ある実施形態では、そのような競合する抗体は、参照抗体により結合されるのと同じエピトープ（例えば直鎖エピトープ又は立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする詳細で例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）に記載されている。例示的な競合アッセイでは、固定化されている抗原を、抗原に結合する第１の標識された抗体と、抗原への結合に関して第１の抗体と競合する能力を試験する第２の未標識の抗体とを含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在することができる。コントロールとして、固定化されている抗原を、第１の標識された抗体を含むが第２の未標識の抗体を含まない溶液中でインキュベートする。
第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でのインキュベーション後、過剰な未結合の抗体を除去し、固定化されている抗原と結合した標識の量を測定する。固定化されている抗原と結合した標識の量が、コントロール試料と比べて試験試料中で実質的に減少している場合、このことは、抗原への結合に関して第２の抗体が第１の抗体と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照されたい。
本明細書に記載されているように調製された二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を、当該技術分野で既知の技法、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用する実際の条件は、正味の荷電、疎水性、親水性等の因子にある程度依存しており、当業者には明らかであるだろう。アフィニティークロマトグラフィー精製の場合には、二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の二重特異性抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製の場合には、プロテインＡ又はプロテインＧを有するマトリックスを使用することができる。逐次的なプロテインＡ又はプロテインＧのアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、本質的には実施例に記載されるように二重特異性抗体を単離することができる。二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の純度を、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー等の様々な公知の分析法の内の何れかにより測定することができる。
Ｉ．アッセイ
本明細書に記載のＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体並びにＤＲ５に結合する抗体を、当該技術分野で既知の様々なアッセイにより、それらの物理的な／化学的な特性及び／又は生物学的活性に関して同定することができる、スクリーニングすることができる、又はこれらの特徴を明らかにすることができる。
１．親和性アッセイ
本明細書に記載の二重特異性抗体及びＤＲ５に結合する抗体のＤＲ５及び／ＦＡＰに対する親和性を、標準的な器具類、例えばＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により実施例に記載の方法に従って測定することができ、受容体又は標的タンパク質等を、組換え発現により得ることができる。あるいは、本明細書に記載の二重特異性抗体及びＤＲ５に結合する抗体のＤＲ５及び／又はＦＡＰへの結合を、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。
２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機械（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴によりＫＤを測定することができる。Ｆｃ部分とＦｃ受容体との間の相互作用を分析するために、Ｈｉｓタグを付けた組換えＦｃ受容体を、ＣＭ５チップ上に固定化されている抗Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）により捕捉し、二重特異性コンストラクトを被分析物として使用する。簡潔に言うと、カルボキシルメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化する。抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、結合タンパク質が約６５００反応単位（ＲＵ）になるように５μｌ／分の流速で注入する。リガンドの注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して未反応の群を阻害する。続いて、Ｆｃ受容体を４ｎＭ又は１０ｎＭで６０秒にわたり捕捉する。動力学的測定のために、二重特異性コンストラクトの４倍段階希釈液（５００ｎＭから４０００ｎＭの範囲）を、１２０秒にわたり３０μｌ／分の流速、２５℃でＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で注入する。
標的抗原に対する親和性を測定するために、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体に関して記載したように、二重特異性コンストラクトを、活性化ＣＭ５−センサーチップ表面上に固定化されている抗ヒトＦａｂ特異性抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により捕捉する。結合タンパク質の最終的な量は約１２０００ＲＵである。二重特異性コンストラクトを３００ｎＭで９０秒にわたり捕捉する。標的抗原は、３０μｌ／分の流速、２５０から１０００ｎＭの範囲の濃度で１８０秒にわたりフローセルを通過する。解離を１８０秒にわたりモニタリングする。
バルクの屈折率の差を、参照フローセルで得た応答を引くことにより補正する。定常状態の応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形曲線フィッティングにより解離定数ＫＤを導き出した。結合センサーグラムと解離センサーグラムとを同時にフィットさせるにより単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．１）を使用して、結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Ｃｈｅｎ等、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３、８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
一態様では、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体を、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット等の既知の方法により抗原結合活性に関して試験する。
別の態様では、競合アッセイを使用して、ＦＡＰ又はＤＲ５それぞれへの結合に関して特定の抗ＦＡＰ抗体又は特定の抗ＤＲ５抗体と競合する抗体を同定することができる。ある実施形態では、そのような競合する抗体は、特定の抗ＦＡＰ抗体又は特定の抗ＤＲ５抗体により結合されるのと同じエピトープ（例えば直鎖エピトープ又は立体配座エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする詳細で例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）に記載されている。更なる方法が実施例セクションに記載されている。
３．活性アッセイ
一態様では、生物活性を有する、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体又はＤＲに結合する抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物活性として、例えばＤＮＡ断片化、アポトーシスの誘導及び標的細胞の溶解を挙げることができる。そのような生物活性をインビボで及び／又はインビトロで有する抗体も提供される。
ある実施形態では、本発明の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体をそのような生物活性に関して試験する。（例えばＬＤＨ放出の測定による）細胞溶解を検出するためのアッセイ又は（例えばＴＵＮＥＬアッセイを使用する）アポトーシスを検出するためのアッセイは、当該技術分野で公知である。ＡＤＣＣ又はＣＤＣを測定するためのアッセイが国際公開第２００４／０６５５４０号（実施例１を参照されたい）にも記載されており、国際公開第２００４／０６５５４０号の内容全体が出典明示により本明細書に援用される。
Ｊ．薬学的製剤
本明細書に記載のＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する抗体の薬学的製剤を、所望の程度の純度を有するそのような二重特異性抗体又は抗体と、１種又は複数種の任意選択的な薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.編(1980)）とを混合することにより、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で調製する。薬学的に許容される担体は一般的に、採用する投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、該担体として下記のものが挙げられるがこれらに限定されない：バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニン等の抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール若しくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベン若しくはプロピルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０個の残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース若しくはデキストリン等のその他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；塩を形成する対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体として、可溶型の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）等の間質性薬物分散剤、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶型ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が更に挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０等のいくつかの例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法が、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び米国特許公開第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１種又は複数種の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと混合される。
例示的な凍結乾燥抗体製剤が米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤として、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されたものが挙げられ、後者の製剤としてヒスチジン−酢酸塩バッファーが挙げられる。
本明細書における製剤は、治療される特定の症状に必要な複数種の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する有効成分を含むこともできる。そのような有効成分は、意図する目的に有効である量での組み合わせで適切に存在する。
有効成分を、例えばコアセルベーション技法により又は界面重合により調製されているマイクロカプセル中に、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルション中に封入することができる。そのような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．編（１９８０）に開示されている。
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例として、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、この半透性マトリックスは、造形品の形態、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
インビボ投与のために使用する製剤は一般的に無菌である。無菌状態を、例えば滅菌濾過膜に通す濾過により容易に実現することができる。
Ｋ．治療方法及び治療用組成物
本明細書で提供されるＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体の１種又は複数及び更なる化学療法剤を含む治療的組合せは、治療方法で使用され得る。
一態様では、医薬として使用するためのＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体が、更なる化学療法剤と組み合わせて使用するために提供される。ある実施形態では、更なる化学療法剤と組み合わせて使用するためのＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体が、治療方法で使用するために提供される。ある実施形態では、本発明は、有効量の、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法において使用するためのＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体を提供する。そのような一実施形態では、この方法は、例えば下記に記載する、有効量の少なくとも１種の追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。上記実施形態の内の何れかに係る「個体」は、好ましくはヒトである。好ましい一実施形態では、前記がんは膵がん、肉腫又は結腸直腸癌である。他の実施形態では、がんは、結腸直腸がん、肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、乳がん、膵臓がん、胃がん、非小細胞肺癌、小細胞肺がん又は中皮腫である。がんが乳がんである実施形態では、乳がんは、トリプルネガティブ乳がんであってもよい。
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体及び更なる化学療法剤を含む治療的組合せの使用を提供する。一実施形態では、医薬はがんの治療用である。更なる実施形態では、医薬は、有効量の医薬を、がんを有する個体に投与することを含む、がんを治療する方法における使用のためである。そのような一実施形態では、この方法は、例えば下記に記載する、有効量の少なくとも１種の追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。上記実施形態の内の何れかに係る「個体」はヒトであることができる。
更なる態様では、本発明は、がんを治療する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、更なる化学療法剤と組み合わせて使用するための、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体を含む治療的組合せの有効量を、がんを有する個体に投与することを含む。そのような一実施形態では、この方法は、下記に記載する、有効量の少なくとも１種の追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。上記実施形態の内の何れかに係る「個体」はヒトであることができる。好ましい一実施形態では、前記がんは膵がん、肉腫又は結腸直腸癌である。好ましい一実施形態では、前記がんは、膵臓がん、肉腫又は結腸直腸癌である。他の実施形態では、がんは、結腸直腸がん、肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、乳がん、膵臓がん、胃がん、非小細胞肺癌、小細胞肺がん又は中皮腫である。
更なる態様では、本発明は、例えば、上記の治療方法、及び更なる化学療法剤の何れかで使用するための、本明細書で提供されるＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体の何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施形態では、薬学的製剤は、本明細書に記載のＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体の内の何れかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の実施形態では、薬学的製剤は、本明細書に記載のＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体の内の何れかと、例えば下記に記載する、少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。
二重特異性抗体を、非経口投与、肺内投与及び鼻腔内投与、並びに局所的治療が望ましい場合には病巣内投与等のあらゆる適切な手段により投与することができる。非経口注入として、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与が挙げられる。投与が短期間であるか又は慢性的であるかにある程度依存して、あらゆる適切な経路により、例えば静脈内注射又は皮下注射等の注射により投薬することができる。様々な時点での単回投与又は複数回投与、ボーラス投与及びパルス点滴が挙げられるがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが本明細書において考慮される。
二重特異性抗体は、医学行動規範と一致した様式で製剤化され、投薬され、及び投与され得る。この状況で考慮される因子として、治療する個々の障害、治療する個々の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング及び医療施術者に既知のその他の因子が挙げられる。二重特異性抗体は、そうする必要はないが選択的に、問題となっている障害を予防する又は治療するために現在使用される１種又は複数種の薬剤と共に製剤化される。そのようなその他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療のタイプ、及び上記で論じたその他の因子に依存する。その他の薬剤は一般的に、本明細書に記載したのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１から９９％で、又は任意の投与量で、又は適切であると実験的に／診療的に確認されている任意の経路により使用される。
疾患の予防又は治療の場合、二重特異性抗体の適切な投与量は、治療しようとする疾患のタイプ、抗体のタイプ、二重特異性抗体を予防目的で投与するか又は治療目的で投与するかに関わらず疾患の重症度及び経過、過去の治療、患者の病歴及び二重特異性抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するだろう。二重特異性抗体は、単回又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性抗体又はＤＲ５に結合する新規の抗体は、例えば１回若しくは複数回の投与によるか又は連続的注入によるかに関わらず、患者への投与のための最初の候補の投与量であることができる。１つの典型的な１日の投与量は、上述した因子に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲の可能性がある。数日又はより長い期間にわたる反復投与の場合、状態に応じて、治療は一般的に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで継続されるだろう。二重特異性の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であるだろう。そのため、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの内の１種又は複数種の投与量を患者に投与することができる。そのような用量を、断続的に、例えば毎週又は３週毎に（例えば、二重特異性抗体を患者に約２回から約２０回投与するように、又は例えば二重特異性抗体を約６回投与するように）投与することができる。最初により高い負荷の用量で、続いて１回又は複数回のより低い用量を投与することができる。しかしながら、その他の投与レジメンも有用であることができる。この治療の経過は、従来の技法及びアッセイで容易にモニタリングされる。
ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体の代わりに又はこれらの抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使用して上記製剤又は治療法の内の何れかを実行することができることが理解される。
Ｌ．製造品
本発明の別の態様では、上記した障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、該容器上の又は該容器に関連するラベル又は添付文書とを含む。適切な容器として、例えばボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が挙げられる。ガラス又はプラスチック等の様々な材料で容器を形成することができる。容器は、単独で、又は疾患を治療する、予防する及び／若しくは診断するのに効果的な別の組成物と混合されている組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下注射針により穿刺可能なストッパを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであることができる）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、二重特異性抗体であり、追加の活性薬剤は、本明細書に記載されるような更なる化学療法剤である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択された疾患を治療するために使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）組成物が入っている第１の容器であって、該組成物が、二重特異性抗体を含む、第１の容器と、（ｂ）組成物が入っている第２の容器であって、該組成物が、更なる細胞傷害性の又は治療用の薬剤を含む、第２の容器とを含むことができる。本発明の本実施形態における製造品は、組成物を使用して特定の疾患を治療することができることを示す添付文書を更に含むことができる。あるいは又は加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に含むことができる。その他のバッファー、希釈液、フィルタ、針及びシリンジ等の商業上又は使用者の観点から望ましいその他の物質を更に挙げることができる。
上記製品の内の何れかは、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体の代わりに又はこれらの抗体に加えて本発明のイムノコンジュゲートを含むことができることが理解される。
ＩＩＩ．
実施例以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上に示した一般的な説明を考慮に入れ、多様な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
前述の発明は、理解の明確性の目的で一部の詳細において実例及び例として記載されているが、これらの説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書中に引用されている全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明白に組み込まれている。
実施例１： ＤＲ５−ＦＡＰデスレセプターアゴニスト二重特異性抗体
（腫瘍細胞によって発現される抗原を介した架橋結合とは別に）ＤＲ５としてのデスレセプターの架橋結合によるアポトーシスの誘導の１つの手法は、腫瘍を取り囲んでいる間質を標的とすることである。この場合には、標的化された抗原は、腫瘍細胞によって直接提示されるのではなく、第２の、異なる細胞型による。この種の抗原の一例は、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）であろう。このタンパク質は活性化された線維芽細胞上で発現されるが、これらの細胞は腫瘍間質内で見出される。
新規のＤＲ５バインダーをファージディスプレイによって同定した。ファージディスプレイにより得られたＤＲ５バインダーを、アポトーシス誘導、特異性、種の交差反応性、及びエピトープ特異性に関してスクリーニングした。ＤＲ５バインダー５Ｅ１１を選択し、四価の二重特異性分子に変換した。これらの二重特異性抗体は、それぞれＤＲ５及びＦＡＰに対する２個の結合部分を含有する。ＦＡＰ結合部分は、国際公開第２０１２／／０２０００６号で説明されている。二重特異性抗体を２＋２フォーマットで提供する（Ｇ４Ｓ）４コネクターを使用して、２８Ｈ１クロスＦａｂドメイン（ＶＨＣＬ）を抗ＤＲ５重鎖のＣ末端に融合した。
ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性分子は、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞において産生され、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製された。得られた産物収量は、合理的な範囲内にあった（約２０ｍｇ／Ｌ）。最終精製ステップ後のモノマー含有量は、全ての分子について９６％を超えた。
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）による標的結合分析により、２＋２フォーマットの二重特異性抗体は、組換えＤＲ５及びＦＡＰ（ヒト及びマウス）に同時に結合できたことが明らかにされた。
ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性分子がＭＤＡ−ＭＢ−２３１標的細胞株のアポトーシスを誘導することができるかを評価するために、続いて添加される二重特異性抗体を介しての標的細胞上でのＤＲ５の架橋結合のために９６ウェルプレートを組換えヒトＦＡＰでコーティングした。標的細胞（ＭＤＡ−ＭＢ ２３１）の添加及び２４時間のインキュベーションの後に、標準的なＤＮＡ断片化ＥＬＩＳＡアッセイによってアポトーシス誘導を決定した。ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性分子は、プレート上にコーティングされたＦＡＰの存在下においてアポトーシス誘導活性を提示したが、これは、この活性が組換えＦＡＰを介した架橋に依存することを表している。
実施例２： ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体は、異なる標的細胞上でアポトーシスを誘導することができる
ＦＡＰ ２８Ｈ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ部分に融合した、新たに単離されたＤＲ５バインダーを含んでいる２＋２フォーマットのＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体を、ＧＭ０５３８９ヒトＦＡＰ＋線維芽細胞との共培養アッセイにおける２種の異なる細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＧ４０１）上でのアポトーシスの誘導についての実験において試験した。これらの二重特異性抗体を、０．０００７−７ｎＭの濃度範囲にわたって試験した。ＤＮＡ断片化アッセイの結果は、試験した二重特異性抗体は、両方の細胞系上で良好なアポトーシス誘導活性を示したことを示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で得られた結果により、二重特異性２＋２フォーマットのこれらの抗体は、高濃度で活性における低下を示さず、最大濃度まで一定に保たれた又はさらにより増強された。ＧＭ０５３８９線維芽細胞との共培養でＧ４０１細胞を用いた実験において、０．０７ｎＭの濃度ですでに最高のアポトーシス誘導が達成され、その後一定に保たれた。この設定では、全ての分子が、アポトーシス誘導レベルに関して同様に機能した。
実施例３： ヒト腫瘍内でのＦＡＰ分布
二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体の可能性のある臨床的使用についての理解を得るために、ヒト腫瘍内でのＦＡＰの分布をＩＨＣによって評価した。
Ｖｉｔａｔｅｘからのラット抗ヒトセプラーゼ抗体（ＩｇＧ２ａ、クローンＤ８）（ＭＡＢＳ１００１）を使用して、多様な腫瘍徴候からの２，５μｍのＦＦＰＥＴ切片をＶｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ上で免疫染色した。切片に標準的なＣＣ１処理を行い、次いで、抗体を、Ｄａｋｏ抗体希釈液（Ｓ３０２２）中に５μｇ／ｍＬの濃度で３７℃で６０’間インキュベートし、Ｕｌｔｒａｖｉｅｗ ＤＡＢ検出系（Ｖｅｎｔａｎａ ＃７６０−４４５６）を使用して陽性の染色を検出した。Ａｂｃａｍからの適合したアイソタイプ抗体（ａｂ１８４５０）を陰性コントロールとして使用した。
二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（表２）について潜在的に興味深い臨床徴候を示している、ＳＣＬＣを含むヒト腫瘍の異なる徴候において、ＦＡＰ＋間質浸潤が存在した。
ＦＡＰ−ＤＲ５に関する別の興味深い臨床的な指標は、肉腫のサブタイプ全体の症例のおよそ５０％において間質ではなく悪性細胞それ自体でＦＡＰが発現される肉腫である（表３）。
実施例４： インビトロにおける組合せの研究
ＦＡＰ−ＤＲ５と様々な抗がん薬との組合せの可能性を評価するために、ＤＲ５抗体（ドロジツマブ、ＵＳ２００７／００３１４１４で説明される）＋抗Ｆｃ抗体を介した架橋を、インビトロにおけるＦＡＰ＋細胞非存在下における架橋の代用として使用した。インビトロにおける細胞培養実験でのＦＡＰ架橋とＦｃ架橋との優れた相関が、原理の証明のための細胞株のサブセットにおいて確認された（データ示さず）。ＣＲＣ及びＰＤＡＣ細胞株のパネルを評価し、それぞれの腫瘍の指標について有望な臨床的関連を有する組合せパートナーを、組合せの作用を評価するために使用した（ＣＲＣ：イリノテカン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤（ＲＧ７３８８）、Ｂｃｌ−２阻害剤（ＡＢＴ１９９）；ＰＤＡＣ：アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ＭＤＭ２ｉ（ＲＧ７３８８）、Ｂｃｌ２ｉ（ＡＢＴ１９９）、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤（ＰＪ３４））。表４及び表５並びに図２〜４に結果を記載する。
化合物のＩＣ５０値の決定
細胞を透明な平底を有する黒色の９６−ウェルマイクロプレートに播種し（数は細胞株に応じて様々である）、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞の接着／密集度をチェックした後、培地を除去し、対応する化合物を含有する新鮮な培地１００μｌを各ウェルに添加した。化合物（ｎ＝３）１つ当たり８つの濃度の連続希釈系列（１：４）を使用した。コントロールとして、対応するＤＭＳＯ濃度及び培地単独を使用した。
３７℃及び５％ＣＯ２で３日間インキュベートした後、ウェル１つ当たり１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をプレートに添加した。室温で３０分かき混ぜた後、発光を測定した。ＩＣ５０値を、ＸＬ−Ｆｉｔソフトウェアで計算した。１つの化合物を用いた実験のそれぞれを少なくとも２回繰り返した。
ＤＲ５抗体の組み合わせ：
細胞を透明な平底を有する黒色の９６−ウェルマイクロプレートに播種し（数は細胞株に応じて様々である）、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞の接着／密集度をチェックした後、培地を除去し、対応する化合物又は組合せを含有する新鮮な培地１００μｌを各ウェルに添加した。
ドロジツマブ／抗ヒト−Ｆｃの９つの濃度の一連の連続的な１：３希釈を、９６−ウェルのＰＰ−Ｖ−底部のマイクロプレート（ｎ＝６）で行った。ドロジツマブ／抗ヒトＦｃを希釈する前、これを、ドロジツマブ／抗ヒトＦｃについては０〜２８ｎＭの範囲の等モル濃度及び化学療法剤については８００ｎＭで混合した。次いで、２５μｌ／ウェルのドロジツマブ／抗ヒト−Ｆｃ系列を細胞に移した。次いで最終濃度を、化合物については１×ＩＣ５０濃度、及びドロジツマブ／抗ヒト−Ｆｃの最大濃度については７ｎＭ又は２００ｎＭの何れかにした。
３７℃及び５％ＣＯ２で３日間インキュベートした後、ウェル１つ当たり１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をプレートに与えた。室温で３０分かき混ぜた後、発光を測定した。
ドロジツマブ／抗ヒト−Ｆｃ及びドロジツマブ／抗ヒト−Ｆｃ＋化合物の各濃度を同じプレートで３連にして、各実験を少なくとも２回繰り返した。
実施例５： 化学療法剤と組み合わせたＦＡＰ−ＤＲ５のインビボでの抗腫瘍有効性
二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）のインビボでの抗腫瘍有効性は、ヌードマウスに移植した様々な腫瘍源（例えば、ＣＲＣ、膵臓がん、線維形成性黒色腫及び肉腫）の細胞及び断片に基づく患者由来（ＰＤＸ）モデルで検出することができた。二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）と、固有のアポトーシス経路を活性化する化学療法剤との組合せの有効性に関する実施例データを、ＣＲＣ異種移植モデルＤＬＤ−１及びＨＣＴ１１６（細胞株に基づく、共注入モデル）並びにＣｏ５８９６（断片に基づく）について示す。
試験用薬剤
二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）は、Ｒｏｃｈｅ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙからストック溶液として提供された。抗体バッファーには、ヒスチジンが含まれていた。抗体溶液は、注入前にストックからバッファー中に適切に希釈された。従来技術のＤＲ５特異的抗体ドロジツマブのＦｃ突然変異体は、Ｒｏｃｈｅ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙからストック溶液として提供された。この抗体は、活性化若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を消失させるＦｃドメインに３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである。このドロジツマブのＦｃ突然変異体はまた、「ドロジツマブＬＡＬＡ」とも称される。
細胞株及び培養条件
ＤＬＤ−１及びＨＣＴ１１６ヒトＣＲＣ細胞は、元はＡＴＣＣから得られた。ＬＯＸ−ＩＭＶＩヒト線維形成性黒色腫細胞は、元はＮＣＩで確立され、ＡＴＣＣから購入した。これらの腫瘍細胞株を、１０％のウシ胎仔血清、２．０ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳで補った、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ高グルコース培地中、５％のＣＯ２の水飽和雰囲気中で３７℃で通常通りに培養した。３日毎に分割して、トリプシン／ＥＤＴＡ １×で培養継代を行った。さらに、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３をＡＴＣＣから購入し、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％のＦＣＳ及び２．０ｍＭのＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ高グルコース中で培養した。
患者由来の異種移植モデル（ＰＤＸ）
ＣＲＣ腫瘍異種移植片Ｃｏ５８９６、肉腫腫瘍異種移植片Ｓａｒｃ４６０５、並びに膵管腺癌（ＰＤＡＣ）腫瘍異種移植片ＰＡ１１７８及びＰＡ３１３７は、元は患者から得られ、安定な増殖パターンの確立まで約３から５回継代した。その後のインビボでの研究のために、Ｃｏ５８９６、Ｓａｒｃ４６０５、ＰＡ１１７８及びＰＡ３１３７腫瘍断片を、ヌードマウスにおいて連続継代中の異種移植片から得た。腫瘍を、ドナーマウスから除去した後に、断片（直径４−５ｍｍ）に切断し、皮下移植までＰＢＳ中に入れておいた。イソフルオラン麻酔下のマウスに、側腹部に片側の皮下腫瘍移植を行った。
動物
ヌードマウスを、ブリーダー（例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、約束されたガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、特定の病原体のない条件下で、１２時間照明／１２時間暗所の１日のサイクルで飼養した。実験用の試験手順は、地方行政機関によって確認され承認された。到着後、新しい環境に慣らすため及び観察のために、動物を、動物施設の検疫部門で１週間維持した。連続的な健康状態のモニタリングを定期的に行った。食餌（Ｐｒｏｖｉｍｉ Ｋｌｉｂａ ３３３７）及び（酸性化されたｐＨ２．５−３の）水は、自由に与えられた。
モニタリング
臨床症状及び有害作用の検出について、動物を毎日管理した。モニタリングのために、実験の全体にわたって動物の体重を記録した。
動物の処置
細胞又は断片の移植後、中央値腫瘍サイズが約１００−２００ｍｍ３であったときに、動物を無作為化した後に動物の処置を開始した。抗体を、モデルによって、静脈内に１．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇで単剤として、週に１回又は２回で数週間投与した。これに相当するビヒクルを同一の日に投与した。
抗体有効性
ＤＬＤ−１及びＨＣＴ１１６ ＣＲＣ共注入細胞株に基づく異種移植モデル
ＤＬＤ−１ ＣＲＣ異種移植を有しているマウスを、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）で試験９日目から２０日目までに１０及び１．０ｍｇ／ｋｇの投与量で４回処置した。結果として、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）での処置により、用量に関連した有意な抗腫瘍有効性が示され、皮下ＤＬＤ−１異種移植に対して強力な抗腫瘍有効性が示された。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を、それぞれ８９％（１０ｍｇ／ｋｇ）及び７９％（１．０ｍｇ／ｋｇ）で算出した。対照的に、ＤＲ５ Ｆｃ変異抗体ドロジツマブ、ＬＡＬＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、週１回）での処置後には、抗腫瘍有効性は認められなかった（図５）。さらに組合せにおいて、ＤＬＤ−１腫瘍を有するマウスを、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）（１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内に週１回、５回）及びイリノテカン（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内に５日間、３回）で処置した。併用治療は、それぞれの単一の薬剤と比較して優れた有効性を示し、７２％の腫瘍縮小が達成された（図６）。イリノテカン処置の５日前、その後、又はそれと同時の、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）でのＤＬＤ−１腫瘍を有するマウスの処置を試験した。同時の組合せの処置は、２種の薬剤の逐次的な処置と比較して優れた有効性を示した（図７）。更なる前臨床研究において、ＤＬＤ−１腫瘍を有するマウスは、国際公開第２０１１／１１７３２９号で説明されるように、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）（１０ｍｇ／ｋｇ）と抗ＶＥＧＦ抗体Ｂ２０（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＡｎｇ２／ＶＥＧＦ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）との併用治療を受けた。両方の抗体を、週１回、８、１５及び２２日目に与えた。単一の薬剤としてのＤＲ５−ＦＡＰ抗体での処置は有意な腫瘍増殖阻害を引き起こしたが（ＴＧＩ８７％）、抗Ａｎｇ／ＶＥＧＦ Ｍａｂとの組合せは相加的な効果があり、腫瘍増殖阻害を９４％に増加させた。Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ抗体単独での処置は、７５％で腫瘍増殖を阻害した（図１５）。
第２の細胞株に基づくＣＲＣモデル（ＨＣＴ１１６）において、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）（１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内に、週１回、３回）とイリノテカン（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内に、５日、２回）及びオキサリプラチン（５ｍｇ／ｋｇ）との組合せを評価した。移植の７日後に処置を開始したところ、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）での単剤療法が４６％ＴＧＩをもたらした。イリノテカンとの組合せは優れた有効性を示し、腫瘍縮小をもたらした（図８）。さらに二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）とオキサリプラチンとの併用療法は、有効性を６７％ＴＧＩに改善した（図９）。
ＬＯＸ−ＩＭＶＩ線維形成性黒色腫細胞株に基づく異種移植モデル
ＬＯＸ−ＩＭＶＩ異種移植片を有するマウスを、研究の１３から２０日目に、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）で、２時間で１０ｍｇ／ｋｇの投与量で処置した。腫瘍を有するマウスの別のグループは、ＤＲ５を標的化するＦｃ変異抗体ドロジツマブＬＡＬＡによる１０ｍｇ／ｋｇでの処置（１３及び２０日目）を受けた。結果として、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）での処置は、皮下注射のＬＯＸ−ＩＭＶＩ異種移植片に対して有意な強い抗腫瘍有効性（腫瘍の停止状態）を示した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）の場合、１００％超（１０ｍｇ／ｋｇ）と計算され、それに対してドロジツマブＬＡＬＡでの処置はそれより低い有効性であった（ＴＧＩ６５％）（図１０）。加えて、ＬＯＸ−ＩＭＶＩを有するマウスを、アントラサイクリン系のドキソルビシン（アドリアマイシン、５ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄ）と組み合わせた二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。単一の薬剤としてのＤＲ５−ＦＡＰ抗体での処置（１０ｍｇ／ｋｇ、８及び１５日目）は腫瘍の停止状態（ＴＧＩ９７％）を引き起こしたが、ドキソルビシンとの組合せは、単に相加的な効果があるだけでなく、異なる腫瘍縮小をもたらした（９３％）。ドキソルビシン単独での処置は、７７％で腫瘍増殖を阻害した（図１６）。
Ｃｏ５８９６ ＣＲＣ断片に基づく患者由来異種移植モデル（ＰＤＸ）
Ｃｏ５８９６ ＣＲＣ異種移植片を有するマウスを、研究の１８から３４日目に、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）で、単一の薬剤として６時間で３０ｍｇ／ｋｇの用量で処置した（図１１を参照）。結果として、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）での処置は有意な抗腫瘍有効性を示し、皮下注射のＣｏ５８９６患者由来異種移植片に対して強い抗腫瘍有効性を示した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、７６％と計算された。加えて、組合せの研究において、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）（３０ｍｇ／ｋｇ）を、研究の１５日目から単一の薬剤として週１回（４回）及びイリノテカンと組み合わせて（１５ｍｇ／ｋｇ、１５〜１９日目）与えた。優れた有効性が二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体とイリノテカンとの組合せで観察され、結果として全ての動物において完全な腫瘍縮小がもたらされた（１０／１０が腫瘍なし）（図１２）。
Ｃｏ５８９６患者由来異種移植片の間質におけるＦＡＰの存在をＩＨＣによって確認した（図１３）。
Ｓａｒｃ４６０５肉腫断片に基づく患者由来異種移植モデル（ＰＤＸ）
Ｓａｒｃ４６０５肉腫異種移植片を有するマウスを、研究の１０から３１日目まで、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）で、単一の薬剤として４回の１０ｍｇ／ｋｇの用量で処置した（図１４）。結果として、二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）での処置は有意な抗腫瘍有効性を示し、皮下注射のＳａｒｃ４６０５患者由来異種移植片に対して強い抗腫瘍有効性（腫瘍の停止状態）を示した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、１００％超と計算された。加えて、Ｓａｒｃ４６０５腫瘍を有するマウスを、アントラサイクリン系のドキソルビシン（アドリアマイシン、５ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄ）と組み合わせた二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。単一の薬剤としてのＤＲ５−ＦＡＰ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、２０、２７、３４及び４１日目）での処置は腫瘍の停止状態を引き起こしたが（ＴＧＩ９９％）、ドキソルビシンとの組合せは、単に相加的な効果があるだけでなく、異なる腫瘍縮小をもたらした（８３％）。ドキソルビシン単独での処置は、７７％で腫瘍増殖を阻害した（図１７）。
さらにＳａｒｃ４６０５腫瘍を有するマウスを、アルキル化薬のイホスファミド（１００ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄ×２）と組み合わせた二重特異性抗体ＤＲ５−ＦＡＰ（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、ｑ７ｄ×８）単独での処置は強い腫瘍縮小を引き起こした（９６％であり、８０％が腫瘍なし）それに対してイホスファミドとの組合せはそれよりわずかに有効であった（８６％が腫瘍なし）。加えて、腫瘍縮小の反応速度が、組合せにおいてより速かった（図１９）。
ＰＡ１１７８及びＰＡ３１３７ＰＤＡＣ断片に基づく異種移植モデル（ＰＤＸ）
ＰＡ１１７８異種移植片を有するマウスを、研究の３２から８１日目まで、二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）で、単一の薬剤として７回の１０ｍｇ／ｋｇの用量で、及びゲムシタビン及びｎａｂ−パクリタキセルと組み合わせて処置した（図１８を参照）。二重特異性抗体を、単一の薬剤として１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に週１回投与した。同じ日に対応するビヒクルを投与した。ゲムシタビンを数週間にわたり４０ｍｇ／ｋｇで週２回腹腔内投与し、ｎａｂ−パクリタキセルを、６ｍｇ／ｋｇで連続４日の２サイクルで静脈内に投与した。
結果として、ＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）での処置は、単一の薬剤として有意な抗腫瘍有効性を示し、皮下注射のＰＡ１１７８患者由来異種移植片に対して強い抗腫瘍有効性を示した。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、コントロールと比較して９６％と計算された。さらにＤＲ５−ＦＡＰ二重特異性抗体（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）をゲムシタビン及びｎａｂ−パクリタキセル（アブラキサン）と組み合わせて与えた。３種の組合せは有効であり、全ての処置された動物において完全な腫瘍の寛解をもたらし、これはゲムシタビン／ｎａｂ−パクリタキセルの２種の組合せが投与されたグループでは達成されなかった。
第２の断片に基づくＰＤＡＣ ＰＤＸモデル（ＰＡ３１３７）において、二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内に、週１回×８）の有効性を、単一の薬剤として、並びにゲムシタビン（腹腔内に週１回、４０ｍｇ／ｋｇ）及びｎａｂ−パクリタキセル（６ｍｇ／ｋｇ、４日連続、静脈内に）と組み合わせて評価した。移植の３１日後から６６日目まで、動物の処置を開始した。単剤療法で二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）を用いた有効性は、４０％ＴＧＩをもたらした。二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）とゲムシタビン及びｎａｂ−パクリタキセル（アブラキサン）との組合せは、優れた有効性を示し、ほとんど完全な腫瘍の寛解を示した（データ示さず）。
実施例６： 前臨床薬力学的バイオマーカー及び組合せ戦略
前臨床トランスレーショナル研究を行い、目的通りの作用機序を実証し、最大活性を確認し、有望な耐性メカニズムを解明するための薬力学的（ＰＤ）分析を導いた。
材料及び方法
線維芽細胞を共注入した結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞株に基づく異種移植モデル（ＤＬＤ−１）で反応速度研究を設計した。二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）（１０ｍｇ／ｋｇ）の単一の薬剤処置の６、１６、７２及び１６８時間後に腫瘍を外植し、アポトーシスマーカー、例えば切断型カスパーゼ３（ｃｃ３）、切断型ＰＡＲＰ並びに活性化カスパーゼ８及び９の免疫組織化学的（ＩＨＣ）及びＥＬＩＳＡに基づくタンパク質分析のために回収した。切断型カスパーゼ３のレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）プラットフォームのためのアポトーシスヒト３−Ｐｌｅｘパネル（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で決定し、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ７−Ｐｌｅｘを使用して、リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）、Ｂａｄ（Ｓｅｒ１１２）、Ｂｃｌ−２（Ｓｅｒ７０）、ｐ５３（Ｓｅｒ４６）、活性カスパーゼ−８（Ａｓｐ３８４）及び活性カスパーゼ−９（Ａｓｐ３１５）の変化を決定した。
ＩＨＣ分析のために、腫瘍を３．８％緩衝化ホルムアルデヒド溶液中で最大４８時間固定し、パラプラストに包埋した。常套的なＩＨＣ染色プロトコールの後、Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴスライド染色装置を使用して切断型カスパーゼ−３に対するウサギポリクローナル抗体（Ａｓｐ１７５；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を適用した。
ドキソルビシン（５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせた二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）（１０ｍｇ／ｋｇ）処置の分析のために、ＦＡＰ陽性線維形成性黒色腫細胞株由来モデル（ＬＯＸ−ＩＭＶＩ）を使用した。処置の３、６、１６、７２及び１６８時間後に腫瘍を外植した。
結果
本発明者らは、間質でＦＡＰを発現する異種移植片腫瘍における、又は直接的に腫瘍細胞におけるＩＨＣ及びＥＬＩＳＡによって、二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体での処置での有意な時間依存性のアポトーシス誘導を観察した。ＩＨＣによって、処置後の初期に、ビヒクルコントロールと比較してｃｃ３などのアポトーシスマーカーの高い一過性のレベルが観察された。ＥＬＩＳＡによる同等の組織溶解物の分析によっても、ＤＬＤ−１ ＣＲＣ異種移植モデルにおいて、単剤療法でのｃｃ３、切断型ＰＡＲＰ並びに活性化カスパーゼ８及び９の急速な誘導が明らかになり、これは、ＬＯＸ−ＩＭＶＩ線維形成性黒色腫モデルにおいてドキソルビシンと共に与えられた場合により優れていた。ＥＬＩＳＡによる同等の組織溶解物の分析によって、ＤＬＤ−１ ＣＲＣ異種移植モデルにおける単剤療法でのｃｃ３、切断型ＰＡＲＰ並びに活性化カスパーゼ８及び９の急速な誘導が明らかになり、これは、イリノテカン又はオキサリプラチンと共に与えられた場合により優れていた。
図２０は、単一の薬剤である二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）での処置後のＬｕｍｉｎｅｘデータ（ＥＬＩＳＡ）を示す。二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体は、ＤＬＤ−１／３Ｔ３異種移植片に対して、時間に伴う強い腫瘍細胞のアポトーシスを誘導した。抗体処置の直後に（６時間）強い作用が観察された。
図２１は、単一の薬剤である二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）又はドキソルビシン（１０ｍｇ／ｋｇ）との組合せでの処置後のＬｕｍｉｎｅｘデータ（ＥＬＩＳＡ）を示す。二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体は、時間に伴う様式で腫瘍細胞のアポトーシスを強く誘導する。腫瘍細胞のアポトーシス誘導は、ＬＯＸ−ＩＭＶＩ線維形成性黒色腫モデルにおけるドキソルビシンを共に用いた二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体の併用治療の場合に優れている。
図２２は、単一の薬剤である二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ；ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）又はイリノテカン（１５ｍｇ／ｋｇ）若しくはオキサリプラチン（５ｍｇ／ｋｇ）との組合せでの処置後のＬｕｍｉｎｅｘデータ（ＥＬＩＳＡ）を示す。二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体は、ＤＬＤ−１ ＣＲＣ異種移植モデルにおいて時間に伴う様式で腫瘍細胞のアポトーシスを強く誘導する。腫瘍細胞のアポトーシス誘導は、イリノテカン又はオキサリプラチンを共に用いた二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体の併用治療の場合に優れている。
本発明者らは、二重特異性ＤＲ５−ＦＡＰ抗体（ＤＲ５バインダー：ＶＨ配列番号７、ＶＬ配列番号８、ＦＡＰバインダー：ＶＨ配列番号１５、ＶＬ配列番号１６）は、腫瘍間質上又は腫瘍細胞でＦＡＰが発現されたかどうかに関係なく、注入の直後にインビボで腫瘍細胞のアポトーシスを強く誘導することを確認し、最適な薬力学的なマーカー並びにサンプリング及び分析のためのタイムポイントを発見した。
配列
本発明の現在好ましい実施形態を記載及び示しているが、本発明が、これに限定されるのではなく、これ以外の場合にも添付の特許請求の範囲の範囲内で多様に実施され（embodied／practiced）得ることは明確に理解されるべきである。

Claims (44)

  1. がんの治療方法において併用療法として使用するための、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体であって、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤と組み合わせて使用される、二重特異性抗体。
  2. 化学療法剤が、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される、請求項１に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  3. 化学療法剤が、抗ＶＥＧＦ抗体から選択される、請求項１又は２に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  4. イリノテカンと組み合わせて使用される、請求項１から３の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  5. がんが、結腸直腸がんである、請求項３又は４に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  6. ゲムシタビン及びアブラキサンと組み合わせて使用される、請求項１に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  7. がんが、膵臓がんである、請求項６に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  8. ドキソルビシン又はイホスファミドと組み合わせて使用される、請求項１に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  9. がんが、肉腫である、請求項８に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  10. がんが、結腸直腸がん、肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、乳がん、膵臓がん、胃がん、非小細胞肺癌、小細胞肺がん及び中皮腫である、請求項１から４、６及び８の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  11. 肉腫が、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、消化管間質腫瘍、線維肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫又は悪性線維性組織球腫である、請求項９又は１０に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  12. 二重特異性抗体及び化学療法剤が、任意選択的に組合せ製剤として、一緒に投与される、請求項１から１１の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  13. 二重特異性抗体及び化学療法剤が、交互に投与される、請求項１から１１の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  14. 化学療法剤が、二重特異性抗体の前に投与される、請求項１３に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  15. 化学療法剤が、二重特異性抗体の後に投与される、請求項１３に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  16. 組合せが、約１週間から３週間のインターバルで投与される、請求項１から１５の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  17. ＤＲ５に特異的な抗原結合部位が、
    （ａ）配列番号１の重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
    （ｂ）配列番号２の重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；
    （ｃ）配列番号３の重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；
    （ｄ）配列番号４の軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
    （ｅ）配列番号５の軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；及び
    （ｆ）配列番号６の軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
    を含む、請求項１から１６の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  18. ＦＡＰに特異的な抗原結合部位が、
    （ａ）配列番号９の重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
    （ｂ）配列番号１０の重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；
    （ｃ）配列番号１１の重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）；
    （ｄ）配列番号１２の軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；
    （ｅ）配列番号１３の軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；及び
    （ｆ）配列番号１４の軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）
    を含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  19. ＤＲ５に特異的な抗原結合部位が、配列番号７及び配列番号８の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含む、請求項１から１８の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  20. ＦＡＰに特異的な抗原結合部位が、配列番号１５及び配列番号１６の群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含む、請求項１から１９の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  21. ＤＲ５に特異的な抗原結合部位が、（ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２の重鎖ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３の重鎖ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２；（ｆ）配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位が、（ａ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ２；（ｆ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１から２０の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  22. ＤＲ５に特異的な抗原結合部位が、配列番号７のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ＦＡＰに特異的な抗原結合部位が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１から２１の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  23. 配列番号１８、１９及び２０のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１７、１９及び２０のアミノ酸配列を含む、請求項１から２２の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  24. ヒトである、請求項１から２３の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  25. ヒト化されている、請求項１から２４の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  26. Ｆｃドメイン、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片、及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片を含む、請求項１から２５の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体。
  27. Ｆｃドメイン、それぞれデスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片、及びそれぞれ線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片を含む、請求項１から２６の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体。
  28. デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の両方に関して二価である、請求項１から２７の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体。
  29. 線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な抗原結合部位を含むＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、請求項１から２８の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体。
  30. Ｆｃドメイン、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片、及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１個のＦａｂ断片を含み、少なくとも１個のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている、請求項１から２９の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体。
  31. ａ）Ｆｃドメイン、
    ｂ）ＤＲ５に特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、定常重鎖（ＣＨ１）のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットに融合している、Ｆａｂ断片、
    ｃ）ＦＡＰに特異的な抗原結合部位を含む２個のＦａｂ断片であって、可変重鎖（ＶＨ）のＮ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットに接続している、Ｆａｂ断片
    を含む、請求項１から３０の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  32. Ｆａｂ断片の少なくとも１個が、ペプチドリンカーを介してＦｃドメインに接続している、請求項２６から３１の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  33. Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１個又は複数個のアミノ酸置換を含む、請求項２６から３２の何れか一項に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  34. 前記１個又は複数個のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９の群から選択される１個又は複数個の位置にある、請求項３３に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  35. Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性化若しくは阻害性Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる３個のアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである、請求項３４に記載の治療方法で使用するための、化学療法剤と組み合わせた、デスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体。
  36. 請求項１から３５の何れか一項に記載の二重特異性抗体と、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤とを含む薬学的組成物。
  37. 請求項１から３５の何れか一項に記載の二重特異性抗体を含む組成物を含む第１の容器と、
    イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤を含む組成物を含む第２の容器と
    を含むキット。
  38. がんの治療用の医薬の製造における、請求項１から３５の何れか一項に記載のデスレセプター５（ＤＲ５）及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に結合する二重特異性抗体と化学療法剤との組合せの使用であって、二重特異性抗体が、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤と組み合わせて使用される、使用。
  39. 医薬が、結腸直腸がん、肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、乳がん、膵臓がん、胃がん、非小細胞肺癌、小細胞肺がん及び中皮腫の治療用である、請求項３８に記載の使用。
  40. 肉腫が、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、消化管間質腫瘍、線維肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫又は悪性線維性組織球腫である、請求項３９に記載の使用。
  41. 治療的組合せを、組合せ製剤として、又は交互に哺乳動物に投与することを含む、がんの治療のための方法であって、治療的組合せが、治療的有効量の、デスレセプター５（ＤＲ５）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位と線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位とを含む、ＤＲ５及びＦＡＰに結合する二重特異性抗体と、治療的有効量の、イリノテカン、ドキソルビシン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ＭＤＭ２阻害剤、ａＢｃｌ−２阻害剤、アブラキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、シクロパミン、ＰＡＲＰ阻害剤、イホスファミド又は抗ＶＥＧＦ抗体から選択される化学療法剤とを含む、方法。
  42. 医薬が、結腸直腸がん、肉腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、乳がん、膵臓がん、胃がん、非小細胞肺癌、小細胞肺がん及び中皮腫の治療用である、請求項４１に記載の方法。
  43. 肉腫が、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、消化管間質腫瘍、線維肉腫、骨肉腫、脂肪肉腫又は悪性線維性組織球腫である、請求項４２に記載の方法。
  44. 特に上記実施例に関連して、本明細書に記載されている発明。
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