JP2021501181A - 単一特異性抗体から多重特異性抗体をインビボ生成させるための方法 - Google Patents

単一特異性抗体から多重特異性抗体をインビボ生成させるための方法 Download PDF

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Abstract

正確に組み立てられた二重特異性または多重特異性の全長抗体の生成を助長する非対称の撹乱変異によって片側の半分において不安定化された2種の2/3-IgGまたは2種の2/3-BiFabの間の半抗体交換反応によって、作用部位において細胞表面上で直接、多重特異性抗体を生成するための方法が、本明細書中に報告される。本法は、出発2/3-IgGまたは出発2/3-BiFabにおけるヒンジ領域ジスルフィド結合の非存在下で実施される。

Description

本明細書には、新規な半抗体交換法を用いる、例えば二重特異性抗体などの多重特異性抗体の、オンセル（on-cell）インビボ組み立てのための方法が掲載される。本方法は完全抗体、すなわちCH2-CH3ドメインを含みかつそれによりエフェクター機能を有するものにも適している。
発明の背景
単一特異性抗体誘導体を、組み立てられた二重特異性抗体へと生化学的に変換するための、現行最先端の方法では、（i）半抗体相補反応および（ii）IgG-IgG交換反応が利用される。
これらの技術は、例えばWO 2015/046467、Rispens et al.,J.Biol.Chem.289（2014）6098-6109、US 9,409,989、WO 2013/060867、WO 2011/131746、WO 2011/133886、WO 2011/143545、WO 2010/151792、Gunasekaran et al.,J.Biol.Chem.285（2010）19637-19646、WO 2009/041613、WO 2009/089004、WO 2008/119353、WO 2007/114325、US 8,765,412、US 8,642,745、WO 2006/047340、WO 2006/106905、WO 2005/042582、WO 2005/062916、WO 2005/000898、US 7,183,076、US 7,951,917、Segal,D.M.,et al.,Curr.Opin.Immunol.11（1999）558-562、WO 98/50431、WO 98/04592、Merchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16（1998）677-681、WO 96/27011、Carter,P.,et al.,Immunotechnol.2（1996）73、WO 93/11162およびKostelny,S.A.,et al.,J.Immunol.148（1992）1547-1553に開示されている。
単一特異性の抗体または抗体誘導体をbsAbに変換するための最先端の方法には、例えば、組立て後のbsAb調製物のためのプロセスおよび組立て後のbsAb調製物の組成に関する制約などといった短所がある。
例えば半抗体技術では、単一特異性一価抗体サイドを二価IgGに組み立てる。インプット分子の発現および交換反応は、それだけで、半抗体だけでなく、IgG様二価（単一特異性）抗体誘導体も生成する。インプット材料および組立て反応のアウトプットには凝集物も存在する。両者（二価単一特異性抗体と凝集物）を、組み立てられたbsAbから入念な精製アプローチによって定量的に除去する必要があるか、または（定量的除去をハイスループットに達成することは困難であるから）それらがbsAb調製物をある程度は「汚染」することになる。
Fabアーム交換技術では、例えば、単一特異性二価IgG誘導体から二重特異性二価IgGを組み立てる。したがって、交換反応へのインプットは二価であり、すなわちアビディティはデフォルトで有効になっている。アビディティスクリーンまたはアゴニスト抗体スクリーンに供される残存二価単一特異性インプット材料が交換反応中に全くないことを保証するには、あらゆる残存二価インプットの、そして交換反応中に形成されうるあらゆる凝集物の、完全な除去を保証する必要があるだろう。インプットとbsAbとは類似性が高いので、定量的除去のための入念な手順が必要になるか（これをハイスループットで達成することは極めて難しい）、または残存二価インプットおよび凝集物が最終bsAb調製物をある程度は汚染することになる。
Labrijn,A.F.らは、制御されたFabアーム交換による安定な二重特異性IgG1の効率のよい生成を開示した（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110（2013）5145-5150）。
WO 2014/081955はヘテロ二量体抗体および使用方法を開示している。
WO 2009/089004は、静電ステアリング効果（electrostatic steering effect）を使って抗体Fcヘテロ二量体分子を作製するための方法を開示した。そこには、ドメイン-ドメイン相互作用に関与する4つのユニークな荷電残基ペア（Asp356---Lys439'、Glu357--Lys370'、Lys392---Asp399'、Asp399---Lys409'）のうち、Lys409---Asp399'だけが、どちらの残基も構造的に保存されかつ埋没していたことから、工学的操作に適していることが開示されている。他の3つのペアに関して、パートナーの少なくとも一方が溶媒露出している（％ASA＞10）。
WO 2018/155611は、液体に混ぜた場合に、ホモ二量体よりも容易にヘテロ二量体を形成する、共有結合によって結合しない第1抗原結合分子と第2抗原結合分子との組合せを開示した。そこには一態様として、EUナンバリングシステムで226番目および229番目の一方または両方のシステイン残基における他のアミノ酸による置換が、第1CH3および第2CH3の一方または両方の、EUナンバリングシステムで357番目または397番目の少なくとも一方における他のアミノ酸による置換と組み合わされることが開示されている。
Mayer,K.ら（Int.J.Mol.Sci.16(2015)27497-27506）は、3価IgG型二重特異性抗体誘導体としてのTriFab、その設計、生成、特徴決定、およびターゲティングされたペイロードの送達のための適用を開示した。
標的細胞の表面上で直接、半抗体（half-antibody）交換反応によって、多重特異性抗体を生成する方法が、本明細書中に報告される。これは、とりわけ、意図された作用部位において直接、不活性プロ結合部位から機能性の結合部位が形成されることを可能にする。そのようなオンサイト（on-site）形成は、全身副反応のリスクを排除する。
重鎖-重鎖相互作用が、好ましくは、重鎖断片において、非対称の撹乱変異によって不安定化されており、ヒンジ領域ジスルフィド結合またはCH3ドメイン間ジスルフィド結合のような重鎖-重鎖間共有結合/ジスルフィド結合が存在しない、抗体軽鎖と抗体重鎖と抗体重鎖断片とを含む2/3-IgGまたは2/3-BiFabのような不完全抗体が、出発材料として有利であることが見出された。この非対称の撹乱変異は、一方で、出発不完全抗体の解離を助長し、他方で、正確に組み立てられた全長二重特異性抗体の生成を助長することが見出された。重鎖-重鎖間共有結合の欠如は、還元剤の非存在下で、即ち、インビボまたは生理学的条件下で、反応が実施され得ることを可能にする。
本発明による方法は、還元剤の非存在下で実施される。従って、出発抗体は、例えば、ヒンジ領域ジスルフィド結合のような重鎖-重鎖ジスルフィド結合を有していない。従って、本発明による鎖交換反応および方法は、初期の還元なしに二重特異性抗体の組み立てを可能にし、従って、この方法は、インビボ適用のために適当である。従って、出発分子の重鎖間の天然に存在する分子内ジスルフィド結合は、例えば、変異誘発PCRによって除去される。重鎖間の全ての分子間ジスルフィド結合の欠損にも関わらず、安定的な、即ち、単離可能な抗体の正確な形成が起こる。従って、これらの出発分子によって、還元なしの自発的な鎖交換反応を利用した二重特異性抗体のインビボ生成を実現することが可能であった。概して、本発明による還元なしの鎖交換方法は、インビボで細胞の表面上で直接、機能性の二重特異性抗体が効率的に生成されることを可能にする。
以下の工程を含む、（多重特異性）結合物質/多量体ポリペプチドを作製する方法が、本明細書中に報告される：
−（N末端からC末端に向かって）抗体可変ドメイン（直接的）、続いてヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメインを両方が含む第1の（単量体）ポリペプチドおよび第2の（単量体）ポリペプチドを含む、（単一特異性または二重特異性のヘテロマーである）第1の結合物質/多量体ポリペプチドであって、
（i）第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであるか、または（ii）第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、
（i）第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、
第1のポリペプチドが少なくとも1個の機能性の結合部位または結合部位の少なくとも一部を含み、
第2のポリペプチドが（E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される）少なくとも1個の/第1の撹乱変異をCH3ドメインに含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが相互に非共有結合で会合し/非共有結合性二量体を形成し/相互に非共有結合で会合しており/非共有結合性二量体である（それによって、第2のポリペプチドにおける撹乱変異が、第2のポリペプチドおよび第1のポリペプチドがヘテロ二量体を形成する時、不安定化する相互作用をもたらす）、
前記第1の結合物質/多量体ポリペプチド、ならびに
（N末端からC末端に向かって）直接的に抗体可変ドメイン、続いてヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメインを両方が含む第3の（単量体）ポリペプチドおよび第4の（単量体）ポリペプチドを含む、（単一特異性または二重特異性のヘテロマーである）第2の結合物質/多量体ポリペプチドであって、
（i）第3のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、第4のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであるか、または（ii）第3のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、第4のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、それによって、（i）第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第4のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、または（ii）第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第4のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、
（i）第3のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第4のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第3のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第4のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、それによって、（i）第1のポリペプチドがホール変異を含むケースにおいて、第4のポリペプチドがノブ変異を含むか、または（ii）第1のポリペプチドがノブ変異を含むケースにおいて、第4のポリペプチドがホール変異を含み、
第4のポリペプチドが少なくとも1個の機能性の結合部位または結合部位の少なくとも一部を含み、
第3のポリペプチドが（E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される）少なくとも1個の/第2の撹乱変異をCH3ドメインに含み、それに従って、第4のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第3のポリペプチドにおける変異が第2のポリペプチドにおける変異と異なる位置にあり、
第3のポリペプチドおよび第4のポリペプチドが相互に共有結合または非共有結合で会合し/共有結合性または非共有結合性の二量体を形成し/相互に非共有結合または共有結合で会合しており/非共有結合性または共有結合性の二量体であり（それによって、第3のポリペプチドにおける撹乱変異が、第3のポリペプチドおよび第4のポリペプチドがヘテロ二量体を形成する時、不安定化する相互作用をもたらし）、
第2のポリペプチドにおける（第1の）撹乱変異および第3のポリペプチドにおける（第2の）撹乱変異が、第2のポリペプチドおよび第3のポリペプチドがヘテロ二量体を形成する時、誘引性の相互作用をもたらす、
前記第2の結合物質/多量体ポリペプチド
をインキュベートする工程であって、第1のポリペプチドの可変ドメインおよび第4のポリペプチドの可変ドメインが機能性の（抗原結合コンピテントな）結合部位（抗体可変ドメインのペア（VH/VLペア））を形成し、第2のポリペプチドの可変ドメインおよび第3のポリペプチドの可変ドメインが非機能性の（抗原結合コンピテントでない）可変ドメインのペアを形成する、前記工程、ならびに
−第1のポリペプチドおよび第4のポリペプチドを含む結合物質を回収し、それによって、（多重特異性）結合物質/多量体ポリペプチドを作製する工程。
一つの態様において、第1〜第4のポリペプチドはそれぞれ、N末端からC末端に向かって、（i）アミノ酸配列DKTHTSPPS（SEQ ID NO:66）、（ii）ヒトIgG1可変ドメインに由来する抗体可変ドメイン、および（iii）ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメインを含む。
一つの態様において、（i）第1および第4のポリペプチドが、ヒトIgG1 CH1ドメインに由来するCH1ドメイン（（バリアント）ヒトIgG1 CH1ドメイン）および（相互に独立に）さらなる（重鎖もしくは軽鎖）可変ドメインを各々さらに含むか、または（ii）第1もしくは第4のポリペプチドが、ヒトIgG1 CH1ドメインに由来するCH1ドメイン（（バリアント）ヒトIgG1 CH1ドメイン）を含み、それぞれの他方のポリペプチドが、軽鎖定常ドメインに由来するドメイン（（バリアント）ヒトκもしくはλCLドメイン）を含み、各ポリペプチドが、さらなる可変ドメインをさらに含む。一つの態様において、第1のポリペプチドのさらなる可変ドメインおよび第4のポリペプチドのさらなる可変ドメインは、（異なる）重鎖可変ドメインである。一つの態様において、第1のポリペプチドのさらなる可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、第4のポリペプチドのさらなる可変ドメインが軽鎖可変ドメインであるか、またはその逆である。
一つの態様において、第1および第4のポリペプチドは、同一のまたは異なるN末端からC末端までの配列を有していてよく、第1および第4のポリペプチドが同一であるケースにおいて、それらは、N末端からC末端に向かって、以下のものを含むポリペプチドの群より選択され、第1および第4のポリペプチドが異なるケースにおいて、それらは、N末端からC末端に向かって、以下のものを含むポリペプチドの群より相互に独立に選択される。
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン。
一つの態様において、第1および第4のポリペプチドの一方は、N末端からC末端に向かって、第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、第3の重鎖可変ドメイン、第1の軽鎖定常ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメインを含み、第1および第4のポリペプチドの他方は、N末端からC末端に向かって、第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメインを含む。一つの態様において、2個の重鎖可変ドメインを含むポリペプチドを含む結合物質は、（第1の重鎖可変ドメインとペアになる）第1の軽鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖定常ドメインを含む第1の軽鎖、ならびに（第2の重鎖可変ドメインとペアになる）第2の軽鎖可変ドメインおよびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）を含む（ドメイン交換された）第2の軽鎖をさらに含み、他方の結合物質は、第1の軽鎖をさらに含む。
一つの態様において、第1および第4のポリペプチドの一方は、N末端からC末端に向かって、第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、第2の軽鎖可変ドメイン、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメインを含み、第1および第4のポリペプチドの他方は、N末端からC末端に向かって、第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメインを含む。一つの態様において、2個の可変ドメインを含むポリペプチドを含む結合物質は、（第1の重鎖可変ドメインとペアになる）第3の可変軽鎖ドメインおよび第1の軽鎖定常ドメインを含む第1の軽鎖、ならびに（第1の軽鎖可変ドメインとペアになる）第3の重鎖可変ドメインおよび第2の軽鎖定常ドメインを含む（ドメイン交換された）第2の軽鎖をさらに含み、他方の結合物質は、第1の軽鎖をさらに含む。
一つの態様において、第1および第2の結合物質は、抗体軽鎖をさらに含む。
一つの態様において、第1の結合物質は、
第1のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン
を含み、ノブ変異またはホール変異を含む、ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
第2のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
（i）第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
CH3ドメインが、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、かつ、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される第1の撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが相互に非共有結合で会合し/非共有結合性二量体を形成する（それによって、第2のポリペプチドにおける撹乱変異が、第2のポリペプチドおよび第1のポリペプチドがヘテロ二量体を形成する時、不安定化する相互作用をもたらす）、
前記ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
さらなる軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチドであって、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、前記第3のポリペプチドと
を含み、
第2の結合物質は、
第4のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインが、第2のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第2のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、かつ、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2の撹乱変異を含み、それに従って、第5のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第4のポリペプチドにおける撹乱変異が第2のポリペプチドにおける撹乱変異と異なる位置にある、
前記ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
第5のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインが、第4のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第4のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
（i）第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第4のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第4のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
第4のポリペプチドおよび第5のポリペプチドが相互に非共有結合で会合し/非共有結合性二量体を形成する（それによって、第4のポリペプチドにおける撹乱変異が、第4のポリペプチドおよび第5のポリペプチドがヘテロ二量体を形成する時、不安定化する相互作用をもたらす）、
前記ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第6のポリペプチドであって、ジスルフィド結合によって第4のポリペプチドと共有結合している、前記第6のポリペプチドと
を含む。
一つの態様において、インキュベーション工程は、還元剤の非存在下で行われる。
一つの態様において、（i）第2のポリペプチドおよび第3のポリペプチド、または（ii）第2のポリペプチドおよび第5のポリペプチドは、（C末端）タグをさらに含む。一つの態様において、タグは、アミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO:67）またはHHHHHHHH（SEQ ID NO:68）を有し、回収は、金属（ニッケル）キレートアフィニティクロマトグラフィカラム上でのクロマトグラフィーによる。
一つの態様において、第1の結合物質は、
第1のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン
を含み、ノブ変異またはホール変異を含む、ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
第2のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
（i）第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
CH3ドメインが、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、かつ、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される第1の撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが相互に非共有結合で会合し/非共有結合性を形成する（それによって、第2のポリペプチドにおける撹乱変異は、第2のポリペプチドおよび第1のポリペプチドがヘテロ二量体を形成する時、不安定化する相互作用をもたらす）、
前記ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチドであって、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、前記第3のポリペプチドと
を含み、
第2の結合物質は、
第4のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインが、第2のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第2のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、かつ、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される第2の撹乱変異を含み、それに従って、第5のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第4のポリペプチドにおける撹乱変異が第2のポリペプチドにおける撹乱変異と異なる位置にある、
前記ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
第5のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン
を含み、第4のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第4のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含むポリペプチドであって、
第4のポリペプチドおよび第5のポリペプチドが相互に非共有結合で会合し/非共有結合性二量体を形成し（それによって、第4のポリペプチドにおける撹乱変異が、第4のポリペプチドおよび第5のポリペプチドがヘテロ二量体を形成する時、不安定化する相互作用をもたらし）、
第1のポリペプチドの可変ドメインおよび第4のポリペプチドの可変ドメインが機能性の（抗原結合コンピテントな）結合部位（抗体可変ドメインのペア（VH/VLペア））を形成し、第2のポリペプチドの可変ドメインおよび第3のポリペプチドの可変ドメインが非機能性の（抗原結合コンピテントでない）可変ドメインのペアを形成する、
前記ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第6のポリペプチドであって、ジスルフィド結合によって第4のポリペプチドと共有結合している、前記第6のポリペプチドと
を含む。
本明細書中に報告される一つの局面は、
−第1の複数の結合物質より選択される第1の結合物質と第2の複数の結合物質より選択される第2の結合物質との各組み合わせを、本発明による方法に供することによって、複数の結合物質を作製する工程、
−作製された複数の結合物質の各結合物質の、少なくとも2種の抗原との同時結合（の量）を、ELISAアッセイにおいて個々に測定する工程、および
−ELISAの結果に基づき、複数の結合物質から結合物質を選択し、それによって、結合物質の組み合わせを同定する工程
を含む、結合物質の組み合わせを同定する方法である。
本明細書中に報告される一つの局面は、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む多量体ポリペプチドであって、
両方のポリペプチドが（N末端からC末端に向かって、相互の直後に、任意で、可変ドメインとCH3ドメインの間にペプチドリンカーを含んで）アミノ酸配列DKTHTSPPS（SEQ ID NO:66）、抗体可変ドメイン、およびヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメインを含み、
（i）第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
（i）第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、
第1のポリペプチドが少なくとも1個の機能性の結合部位または結合部位の少なくとも一部を含み、
第2のポリペプチドが（E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される）少なくとも1個の撹乱変異をCH3ドメインに含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが相互に非共有結合で会合し/非共有結合性二量体を形成し（それによって、第2のポリペプチドにおける撹乱変異が、第2のポリペプチドおよび第1のポリペプチドがヘテロ二量体を形成する時、不安定化する相互作用をもたらし）、
第1のポリペプチドの可変ドメインおよび第2のポリペプチドの可変ドメインが機能性のまたは非機能性の（抗原結合コンピテントでない）可変ドメインのペアを形成する、
前記多量体ポリペプチドである。
一つの態様において、第1のポリペプチドは、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン
を含み、（かつノブ変異またはホール変異を含む）ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドであり、
第2のポリペプチドは、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ノブ変異またはホール変異を含むヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドである。
一つの態様において、多量体ポリペプチドは、（さらなる）軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチドであって、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチド（のCH1ドメイン）と共有結合している、前記第3のポリペプチドをさらに含む。
本明細書中に報告される一つの局面は、
第1のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン
を含む、（ノブ変異またはホール変異を含む）ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
第2のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
（i）第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
CH3ドメインが、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、かつ、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
第3のポリペプチドとして、さらなる軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドであって、該第3のポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、ポリペプチドと
を含む、第1のヘテロ三量体ポリペプチド、ならびに
第1（第4）のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインが、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、かつ、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2の撹乱変異を含み、それに従って、第2（第5）のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第1（第4）のポリペプチドにおける撹乱変異が第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドにおける撹乱変異と異なる位置にある、
前記ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
第2（第5）のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン
を含み、第1（第4）のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1（第4）のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含むポリペプチドであって、
（i）第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第5のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第5のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである、
前記ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
第3（第6）のポリペプチドとして、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドであって、該第6のポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1（第4）のポリペプチドと共有結合している、前記ポリペプチドと
を含む、第2のヘテロ三量体ポリペプチド
を含む組成物であって、
（i）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、それによって、（i）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドがホール変異を含むケースにおいて、第2のヘテロ三量体の第2のポリペプチド（第5のポリペプチド）がノブ変異を含み、または（ii）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドがノブ変異を含むケースにおいて、第2のヘテロ三量体の第2のポリペプチド（第5のポリペプチド）がホール変異を含み、
第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドおよび第2のヘテロ三量体の第1のポリペプチド（第4のポリペプチド）が同一の位置に撹乱変異を含まず／異なる位置に撹乱変異を含み、
第1のポリペプチドの可変ドメインおよび第5のポリペプチドの可変ドメインが機能性の（抗原結合コンピテントな）結合部位（抗体可変ドメインのペア（VH/VLペア））を形成し、第2のポリペプチドの可変ドメインおよび第4のポリペプチドの可変ドメインが非機能性の（抗原結合コンピテントでない）可変ドメインのペアを形成する、
前記組成物である。
本明細書中に報告される一つの局面は、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む多量体ポリペプチドであって、
両方のポリペプチドがヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメインを含み、
（i）第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、
第1のポリペプチドが少なくとも1個の機能性の結合部位または結合部位の少なくとも一部を含み、
第2のポリペプチドが（E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される）少なくとも1個の撹乱変異をCH3ドメインに含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが相互に非共有結合または共有結合で会合し/非共有結合性または共有結合性の二量体を形成する（それによって、第2のポリペプチドにおける撹乱変異が、第2のポリペプチドおよび第1のポリペプチドがヘテロ二量体を形成する時、不安定化する相互作用をもたらす）、
前記多量体ポリペプチドである。
一つの態様において、第1のポリペプチドは、
N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、および第2ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（v）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（x）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、
（xi）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1の一部、任意で、第1のペプチドリンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、第2のペプチドリンカー、および結合ドメインの第2の一部であって、（同一のポリペプチドの）結合ドメインの第1の一部および結合ドメインの第2の一部が（会合しかつ）標的に特異的に結合する機能性の結合部位を形成し；一つの態様において、結合ドメインの第1の一部が抗体重鎖Fab断片（VH-CH1もしくはCH1-VH）であり、結合ドメインの第2の一部が軽鎖Fab断片（VL-CLもしくはCL-VL）であるか、またはその逆であるもの
を含み、かつノブ変異またはホール変異を含む、ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドであり、
第2のポリペプチドは、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含み、
CH3ドメインがノブ変異またはホール変異を含み、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドである。
一つの態様において、多量体ポリペプチドは、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチドをさらに含む。
本明細書中に報告される一つの局面は、
第1のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメインに由来する第1のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメインに由来する第2のCH1ドメイン、
（v）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメインに由来する第1のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメインに由来する第2のCH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（x）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、
（xi）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1の一部、任意で、第1のペプチドリンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、第2のペプチドリンカー、および結合ドメインの第2の一部であって、（同一のポリペプチド）の結合ドメインの第1の一部および結合ドメインの第2の一部が（会合しかつ）標的に特異的に結合する機能性の結合部位を形成し；一つの態様において、結合ドメインの第1の一部が抗体重鎖Fab断片（VH-CH1もしくはCH1-VH）であり、結合ドメインの第2の一部が軽鎖Fab断片（VL-CLもしくはCL-VL）であるか、またはその逆であるもの
を含み、ノブ変異またはホール変異を含む、ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第2のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含み、
第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含む、
ポリペプチド
の群より選択される、ポリペプチドと、
第3のポリペプチドとして、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドと
を含む、第1のヘテロ三量体ポリペプチド、ならびに
第1（第4）のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含み、
第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2の撹乱変異を含み、それに従って、第2（第5）のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第1（第4）のポリペプチドにおける撹乱変異が第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドにおける撹乱変異と異なる位置にある、
ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第2（第5）のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメインに由来する第1のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメインに由来する第2のCH1ドメイン、
（v）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメインに由来する第1のCH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメインに由来する第2のCH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（x）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、
（xi）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1の一部、任意で、第1のペプチドリンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、第2のペプチドリンカー、および結合ドメインの第2の一部であって、（同一のポリペプチドの）結合ドメインの第1の一部および結合ドメインの第2の一部が（会合し）標的に特異的に結合する機能性の結合部位を形成し；一つの態様において、結合ドメインの第1の一部が抗体重鎖Fab断片（VH-CH1もしくはCH1-VH）であり、結合ドメインの第2の一部が軽鎖Fab断片（VL-CLもしくはCL-VL）であるか、またはその逆であるもの
を含み、第1（第4）のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1（第4）のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含む、ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第3（第6）のポリペプチドとして、ジスルフィド結合によって第1（第4）のポリペプチドに共有結合している、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドであって、
（i）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、それによって、（i）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドがホール変異を含むケースにおいて、第2のヘテロ三量体の第2のポリペプチド（第5のポリペプチド）がノブ変異を含み、または（ii）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドがノブ変異を含むケースにおいて、第2のヘテロ三量体の第2のポリペプチド（第5のポリペプチド）がホール変異を含み、
第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドおよび第2のヘテロ三量体の第1のポリペプチド（第4のポリペプチド）が同一の位置に撹乱変異を含まず/異なる位置に撹乱変異を含む、
前記ポリペプチドと
を含む、第2のヘテロ三量体ポリペプチド
を含む組成物である。
本明細書中に報告される一つの局面は、本明細書中に記載される、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGを含むか、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabを含むか、または、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む、そのような2/3-IgGまたは2/3-BiFabを混合することによって調製された組成物を含む、薬学的製剤である。
本明細書中に報告される一つの局面は、医薬として使用するための、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物である。
本明細書中に報告される一つの局面は、医薬の製造または調製における、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物の使用である。
本明細書中に報告される一つの局面は、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物を、有効量、疾患を有する個体へ投与する工程を含む、疾患を処置する方法である。
一つの態様において、組成物は、第1、第2、および第3の単量体ポリペプチドを含む第1のヘテロ三量体ポリペプチド、ならびに第4、第5、および第6の単量体ポリペプチドを含む第2のヘテロ三量体ポリペプチドを含み（即ち、各ヘテロ三量体ポリペプチドは、3種の（非同一の）単量体ポリペプチドを含んでいる（全部で6種の（非同一の）単量体ポリペプチド（即ち、第1、第2、第3、第4、第5、および第6の非同一の単量体ポリペプチド）を含んでいる））、
ここで、第1、第2、第4、および第5の（単量体）ポリペプチドは、各々、（N末端からC末端に向かって）（i）アミノ酸配列DKTHTSPPS（SEQ ID NO:66）、（ii）第1の抗体可変ドメイン、および（iii）ヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメインを含み、（i）、（ii）、および（iii）は、相互に独立に、直接またはペプチドリンカーを介して相互にコンジュゲートされており、
（i）第1および第2の（単量体）ポリペプチド、ならびに（ii）第1および第5の（単量体）ポリペプチド、（iii）第2および第4の（単量体）ポリペプチド、ならびに（iv）第5および第4の（単量体）ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインは、VH/VLペアであり（即ち、第1の（単量体）ポリペプチドの第1の可変ドメインは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのいずれかであり、それによって、それが重鎖可変ドメインであるケースにおいて、第2および第5の（単量体）ポリペプチドの第1の可変ドメインは軽鎖可変ドメインであり、またはそれが軽鎖可変ドメインであるケースにおいて、第2および第5の（単量体）ポリペプチドの第1の可変ドメインは重鎖可変ドメインであり、第4の（単量体）ポリペプチドの第1の可変ドメインは、第5の（単量体）ポリペプチドの第1の可変ドメインが重鎖可変ドメインであるケースにおいて、軽鎖可変ドメインであり、または第5の（単量体ポリペプチド）の第1の可変ドメインが軽鎖可変ドメインであるケースにおいて、重鎖可変ドメインである）、
（i）第1および第5の（単量体）ポリペプチド、ならびに（ii）第1および第2の（単量体）ポリペプチド、（iii）第2および第4の（単量体）ポリペプチド、ならびに（iv）第5および第4の（単量体）ポリペプチドのCH3ドメインは、ノブイントゥホールペアであり（即ち、第1の（単量体）ポリペプチドのCH3ドメインは、ノブ変異またはホール変異のいずれかを含み、それによって、それがノブ変異を含むケースにおいて、第2および第5の（単量体）ポリペプチドのCH3ドメインはホール変異を含み、またはそれがホール変異を含むケースにおいて、第2および第5の（単量体）ポリペプチドのCH3ドメインはホール変異を含み、第4の（単量体）ポリペプチドのCH3ドメインは、第5の（単量体）ポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むケースにおいて、ノブ変異を含み、または第5（単量体ポリペプチド）のCH3ドメインがノブ変異を含む場合、ホール変異を含む）、
第1の（単量体）ポリペプチドおよび第5の（単量体）ポリペプチドは、相互に独立に、N末端およびC末端の一方または両方に、相互に独立に、scFvまたはscFabまたはFabを各々含み、
第2および第4の（単量体）ポリペプチドは、（E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される）少なくとも1個の撹乱変異をCH3ドメインに含み、それに従って、第1の（単量体）ポリペプチドは、第2の（単量体）ポリペプチドの撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第5の（単量体）ポリペプチドは、第4の（単量体）ポリペプチドの撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第2の（単量体）ポリペプチドにおける撹乱変異は、第4の（単量体）ポリペプチドにおける撹乱変異と同一のアミノ酸配列内の位置になく、それによって、第2の（単量体）ポリペプチドにおける撹乱変異および第4の（単量体）ポリペプチドにおける撹乱変異は、第2のポリペプチドおよび第4のポリペプチドがヘテロ二量体を形成する時、誘引性の（電荷）相互作用をもたらし、それによって、第2および第4の（単量体）ポリペプチドにおける撹乱変異は、それぞれ、第2の（単量体）ポリペプチドが第1の（単量体）ポリペプチドとヘテロ二量体を形成し、第4の（単量体）ポリペプチドが第5の（単量体）ポリペプチドとヘテロ二量体を形成する時、反発的な（電荷）相互作用をもたらし、
第1および第2の（単量体）ポリペプチドは、非共有結合性二量体を形成し、第4および第5の（単量体）ポリペプチドは、非共有結合性二量体を形成し、第3および第1の（単量体）ポリペプチドは、ジスルフィドによって連結された二量体を形成し、第6および第5の（単量体）ポリペプチドは、ジスルフィドによって連結された二量体を形成し、
第3および第6の（単量体）ポリペプチドは、抗体軽鎖である。
一つの態様において、第1の（単量体）ポリペプチドは、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン
を含むポリペプチド
の群より選択される。
一つの態様において、第2の（単量体）ポリペプチドは、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択され、
ここで、（i）第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインは重鎖可変ドメインであり、または（ii）第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインは軽鎖可変ドメインであり、
CH3ドメインは、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、かつ、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドは撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、
第3のポリペプチドとして、さらなる軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドを含み、ここで、該第3のポリペプチドは、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している。
一つの態様において、第4の（単量体）ポリペプチドは、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドの群より選択され、
ここで、CH3ドメインは、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、かつ、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2の撹乱変異を含み、それに従って、第2（第5）のポリペプチドは撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第1（第4）のポリペプチドにおける撹乱変異は第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドにおける撹乱変異と異なる位置にある。
一つの態様において、第5の（単量体）ポリペプチドは、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン（由来するCH1ドメイン）、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン（に由来するCH1ドメイン）、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン（に由来する軽鎖定常ドメイン）、および第3の重鎖可変ドメイン
を含み、第1（第4）のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1（第4）のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含む、ポリペプチド
の群より選択され、
ここで、（i）第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第5のポリペプチドの可変ドメインは重鎖可変ドメインであり、または（ii）第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第5のポリペプチドの可変ドメインは軽鎖可変ドメインである。
一つの態様において、第1のポリペプチドの可変ドメインおよび第5のポリペプチドの可変ドメインは、機能性の（抗原結合コンピテントな）結合部位（抗体可変ドメインのペア（VH/VLペア））を形成し、第2のポリペプチドの可変ドメインおよび第4のポリペプチドの可変ドメインは、機能性のまたは非機能性の（抗原結合コンピテントでない）可変ドメインのペアを形成する。
本発明の一つの局面は、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第1の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアより選択される第1の抗体可変ドメイン、ならびに（b）第1のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、ならびに
（ii）第1の抗体可変ドメインのN末端側または第1のCH3ドメインのC末端側のいずれかに位置する、第2の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペア
を含む、第1のポリペプチドと、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第3の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアより選択される第2の抗体可変ドメイン、ならびに（b）第2のヒト免疫グロブリンG CH3ドメインであって、
第1の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインであり；または第1の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインであり、かつ
第2のCH3ドメインが、D356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のCH3ドメインが
（a）撹乱変異がD356Kである場合、439位にアミノ酸残基K、または
（b）撹乱変異がE357Kである場合、370位にアミノ酸残基K、または
（c）撹乱変異がK370Eである場合、357位にアミノ酸残基E、または
（d）撹乱変異がK439Eである場合、356位にアミノ酸残基D
を含むもの、
ならびに
（ii）任意で、第2の抗体可変ドメインのN末端側または第2のCH3ドメインのC末端側のいずれかに位置する、第2の標的または第4の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであって、その位置が第1のポリペプチドの可変ドメインのペアの位置とは独立であるもの
を含む、第2のポリペプチドと
を含む（単離された）非共有結合性複合体/多量体ポリペプチドであって、全てのナンバリングがKabat EUインデックスに従う、前記非共有結合性複合体/多量体ポリペプチドである。
全ての局面の一つの態様において、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインは、ヘテロ二量体形成を促進するための本明細書中に開示されるアミノ酸変異、即ち、本明細書中の下記のセクション（D）ヘテロ二量体化において概説されるアミノ酸変異を含む。
全ての局面の一つの態様において、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインは、第1のCH3ドメインと第2のCH3ドメインとの間のヘテロ二量体形成を助長するための、前記撹乱変異とは異なるさらなる変異を含む。
全ての局面の一つの態様において、
第1のCH3ドメインは、
（a）変異T366W、または
（b）変異T366S/L368A/Y407V
を含み、
第2のCH3ドメインは、
（a）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含む場合、変異T366S/L368A/Y407V、または
（b）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含む場合、変異T366W
を含む。
本発明の一つの局面は、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第1の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアより選択される第1の抗体可変ドメイン、ならびに（b）第1のヒト免疫グロブリンG CH3ドメインであって、
第1のCH3ドメインが、
（a）変異T366Wまたは変異T366S/L368A/Y407V、および
（b）任意で、変異Y349CまたはS354C
を含むもの、
ならびに
（ii）第1の抗体可変ドメインのN末端側または第1のCH3ドメインのC末端側のいずれかに位置する、第2の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペア
を含む、第1のポリペプチドと、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第3の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアより選択される第2の抗体可変ドメイン、ならびに（b）第2のヒト免疫グロブリンG CH3ドメインであって、
第1の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインであり；または第1の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインであり、
第2のCH3ドメインが、
（a）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含む場合、変異T366S/L368A/Y407V、または
（b）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含む場合、変異T366W
を含み、
2のCH3ドメインがD356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のCH3ドメインが
（a）撹乱変異がD356Kである場合、439位にアミノ酸残基K、または
（b）撹乱変異がE357Kである場合、370位にアミノ酸残基K、または
（c）撹乱変異がK370Eである場合、357位にアミノ酸残基E、または
（d）撹乱変異がK439Eである場合、356位にアミノ酸残基D
を含むもの、
ならびに
（ii）任意で、第2の抗体可変ドメインのN末端側または第2のCH3ドメインのC末端側のいずれかに位置する、第2の標的または第4の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであって、その位置が第1のポリペプチドの可変ドメインのペアの位置とは独立であるもの
を含む、第2のポリペプチドと
を含む（単離された）非共有結合性複合体/多量体ポリペプチドであって、全てのナンバリングがKabat EUインデックスに従う、前記非共有結合性複合体/多量体ポリペプチドである。
本発明の一つの局面は、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第1のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、ならびに（b）第1の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアより選択される第1の抗体可変ドメイン、ならびに
（ii）第1の抗体CH3ドメインのN末端側または第1の抗体可変のC末端側のいずれかに位置する、第2の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペア
を含む、第1のポリペプチドと、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第2のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、ならびに（b）第3の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアより選択される第2の抗体可変ドメインであって、
第1の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインであり；または第1の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインであり、かつ
第2のCH3ドメインがD356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のCH3ドメインが
（a）撹乱変異がD356Kである場合、439位にアミノ酸残基K、または
（b）撹乱変異がE357Kである場合、370位にアミノ酸残基K、または
（c）撹乱変異がK370Eである場合、357位にアミノ酸残基E、または
（d）撹乱変異がK439Eである場合、356位にアミノ酸残基D
を含むもの、
ならびに
（ii）任意で、第2の可変ドメインのN末端側または第2のCH3ドメインのC末端側のいずれかに、第2の標的または第4の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであって、その位置が、第1のポリペプチドの可変ドメインのペアの位置とは独立であるもの
を含む、第2のポリペプチドと
を含む（単離された）非共有結合性複合体/多量体ポリペプチドであって、全てのナンバリングがKabat EUインデックスに従う、前記非共有結合性複合体/多量体ポリペプチドである。
全ての局面の一つの態様において、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインは、ヘテロ二量体形成を促進するための本明細書中に開示されるアミノ酸変異、即ち、本明細書中の下記のセクション（D）ヘテロ二量体化において概説されるアミノ酸変異を含む。
全ての局面の一つの態様において、第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインは、第1のCH3ドメインと第2のCH3ドメインとの間のヘテロ二量体形成を助長するための、前記撹乱変異とは異なるさらなる変異を含む。
全ての局面の一つの態様において
第1のCH3ドメインは、
（a）変異T366W、または
（b）変異T366S/L368A/Y407V
を含み、
第2のCH3ドメインは、
（a）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含む場合、変異T366S/L368A/Y407V、または
（b）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含む場合、変異T366W
を含む。
本発明の一つの局面は、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第1のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、ならびに（b）第1の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアより選択される第1の抗体可変ドメインであって、
第1のCH3ドメインが、
（a）変異T366Wまたは変異T366S/L368A/Y407V、および
（b）任意で、変異Y349CまたはS354C
を含むもの、
ならびに
（ii）第1の抗体CH3ドメインのN末端側または第1の抗体可変のC末端側のいずれかに位置する、第2の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペア
を含む、第1のポリペプチドと、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第2のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、ならびに（b）第3の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアより選択される第2の抗体可変ドメインであって、
第1の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインであり；または第1の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインであり、かつ
第2のCH3ドメインが
（a）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含む場合、変異T366S/L368A/Y407V、または
（b）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含む場合、変異T366W
を含み、かつ
第2のCH3ドメインがD356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のCH3ドメインが
（a）撹乱変異がD356Kである場合、439位にアミノ酸残基K、または
（b）撹乱変異がE357Kである場合、370位にアミノ酸残基K、または
（c）撹乱変異がK370Eである場合、357位にアミノ酸残基E、または
（d）撹乱変異がK439Eである場合、356位にアミノ酸残基D
を含むもの、
ならびに
（ii）任意で、第2のCH3ドメインのN末端側または第2の可変ドメインのC末端側のいずれかに、第2の標的または第4の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであって、その位置が第1のポリペプチドの可変ドメインのペアの位置とは独立であるもの
を含む、第2のポリペプチドと
を含む（単離された）非共有結合性複合体/多量体ポリペプチドであって、全てのナンバリングがKabat EUインデックスに従う、前記非共有結合性複合体/多量体ポリペプチドである。
本発明による全ての局面の一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、非共有結合性二量体である。
本発明による全ての局面の一つの態様において、第1の可変ドメインおよび第2の可変ドメインは、会合し/会合しており、非機能性の結合部位を形成する。
本発明による全ての局面の一つの態様において、第1および第2のポリペプチドはそれぞれ、第1のCH3ドメインが第1の可変ドメインのC末端側に位置するケースにおいて、第1および第2の可変ドメインの各々のN末端側に、または第1の可変ドメインが第1および第2のCH3ドメインのC末端側に位置するケースにおいて、第1および第2のCH3ドメインの各々のN末端側に、アミノ酸配列DKTHTSPPS（SEQ ID NO:66）またはDKTHT（SEQ ID NO:94）またはGGGS（SEQ ID NO:69）またはDKTHGGGGS（SEQ ID NO:97）を含む。
本発明による全ての局面の一つの態様において、ヒト免疫グロブリンGは、ヒトIgG1またはヒトIgG2またはヒトIgG3またはヒトIgG4である。本発明による全ての局面の一つの態様において、ヒト免疫グロブリンGは、ヒトIgG1である。
本発明による全ての局面の一つの態様において、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメインは、ヒトIgG1 CH3ドメインまたはヒトIgG2 CH3ドメインまたはヒトIgG3 CH3ドメインまたはヒトIgG4 CH3ドメインである。
本発明による全ての局面の一つの態様において
（i）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含み、439位にアミノ酸残基Kを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異D356Kおよび変異T366S/L368A/Y407Vを含むか、または
（ii）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含み、370位にアミノ酸残基Kを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異E357Kおよび変異T366S/L368A/Y407Vを含むか、または
（iii）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含み、357位にアミノ酸残基Eを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異K370Eおよび変異T366Wを含むか、または
（iv）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含み、356位にアミノ酸残基Dを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異K439Eおよび変異T366Wを含む。
本発明による全ての局面の一つの態様において、第1、第2、および第3の標的は、異なる。
本発明による全ての局面の一つの態様において、第1の標的または第3の標的は、ヒトCD3である。
本発明による全ての局面の一つの態様において、第2の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアは、Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、CrossFab、二重特異性Fab、sdAb、およびVHHからなる群より選択される。
本発明による全ての局面の一つの態様において、第4の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアは、第2の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアとは独立に、Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、CrossFab、二重特異性Fab、sdAb、およびVHHからなる群より選択される。
本発明の全ての局面の一つの態様において、第1のポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
抗体重鎖可変ドメインまたは抗体軽鎖可変ドメイン、
ヒト免疫グロブリンG CH1ドメインまたはヒト抗体軽鎖定常ドメイン、
任意で、さらなる抗体重鎖可変ドメインまたは抗体軽鎖可変ドメイン、およびさらなるヒト免疫グロブリンG CH1ドメインまたはヒト抗体軽鎖定常ドメイン、
SEQ ID NO:66またはSEQ ID NO:94またはSEQ ID NO:69またはSEQ ID NO:77またはSEQ ID NO:75またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:79またはSEQ ID NO:97のアミノ酸配列、
第1の抗体可変ドメイン、
任意で、ヒト免疫グロブリンG CH2ドメイン、
第1のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、
任意で、アミノ酸配列SEQ ID NO:69またはSEQ ID NO:77またはSEQ ID NO:75またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:79、
任意で、Fabまたはドメイン交換されたFabもしくはscFvもしくはscFab
を含む。
本発明の全ての局面の一つの態様において、第1のポリペプチドは、N末端からC末端に向かって、
抗体重鎖可変ドメインまたは抗体軽鎖可変ドメイン、
ヒト免疫グロブリンG CH1ドメインまたはヒト抗体軽鎖定常ドメイン、
任意で、さらなる抗体重鎖可変ドメインまたは抗体軽鎖可変ドメイン、およびさらなるヒト免疫グロブリンG CH1ドメインまたはヒト抗体軽鎖定常ドメイン、
SEQ ID NO:66またはSEQ ID NO:94またはSEQ ID NO:69またはSEQ ID NO:77またはSEQ ID NO:75またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:79またはSEQ ID NO:97のアミノ酸配列、
任意で、ヒト免疫グロブリンG CH2ドメイン、
第1のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、
第1の抗体可変ドメイン、
任意で、アミノ酸配列SEQ ID NO:69またはSEQ ID NO:77またはSEQ ID NO:75またはSEQ ID NO:76またはSEQ ID NO:79、
任意で、Fabまたはドメイン交換されたFabもしくはscFvもしくはscFab
を含む。
本発明の一つの局面は、第1の本発明による多量体ポリペプチドおよび第2の本発明による多量体ポリペプチドを含む組成物であって、
第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異D356Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異K439Eを含むか、または
第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異E357Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異K370Eを含み、かつ
第1の多量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第1の可変ドメインが第1の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、かつ
第1の多量体ポリペプチドの第2の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2の可変ドメインが第3の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、かつ
第2および第4の標的が相互に独立に細胞表面抗原である、
組成物である。
全ての組成物局面の一つの態様において、第1の多量体ポリペプチドの第1のCH3ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインは、ヘテロ二量体形成を助長するための同一の変異を含み、第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第1のCH3ドメインは、ヘテロ二量体形成を助長するための同一の変異を含む。
全ての組成物局面の一つの態様において、
第1のポリペプチドの第1のCH3ドメインは、
（a）変異T366W、または
（b）変異T366S/L368A/Y407V
を含み、
第1のポリペプチドの第2のCH3ドメインは、
（a）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含む場合、変異T366S/L368A/Y407V、または
（b）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含む場合、変異T366W
を含む。
本発明による一つの局面は、第1の本発明による多量体ポリペプチドおよび第2の本発明による多量体ポリペプチドを含む（薬学的）組成物であって、
第1の多量体ポリペプチドの第1のCH3ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインの両方が変異T366Wまたは変異T366S/L368A/Y407Vを含み、
第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異D356Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異K439Eを含むか、もしくはその逆であるか、または
第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異E357Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異K370Eを含むか、もしくはその逆であり、
任意で、
第1の多量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである場合、第2の多量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインであり、または
第1の多量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインである場合、第2の多量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインであり、
第1の多量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインが第1の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、
第1の多量体ポリペプチドの第2の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2の抗体可変ドメインが第3の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、
第2および第4の標的が相互に独立に細胞表面抗原である、
前記（薬学的）組成物である。
本発明による全ての局面の一つの態様において、第1の標的または第3の標的は、ヒトCD3である。
本発明の一つの局面は、医薬として使用するための、本発明による多量体ポリペプチドまたは（薬学的）組成物である。
本明細書中に報告される一つの局面は、本発明による多量体ポリペプチドまたは（薬学的）組成物を、そのような処置を必要とする患者へ投与する工程を含む、処置の方法である。
発明の詳細な説明
本発明は、重鎖-重鎖相互作用が、好ましくは、重鎖断片において、非対称の撹乱変異によって不安定化されており、撹乱変異が、一方で、出発不完全抗体の解離を助長し、他方で、正確に組み立てられた全長二重/多重特異性抗体の生成を促進する、抗体軽鎖と抗体重鎖と抗体重鎖断片とを含む2/3-IgGまたは2/3-BiFabのような不完全抗体を出発材料として使用した半抗体交換反応によって、多重特異性抗体を得ることができるという所見に少なくとも一部分基づく。重鎖-重鎖間ジスルフィド結合が出発不完全抗体から除去された場合、そのような出発化合物を使用することによって、還元剤の非存在下ですら本発明の方法を実施し得ることが、さらに見出された（それでも、出発材料の生成も、交換反応および多重特異性抗体の作製も、効率的に進む）。
より詳細には、本発明は、不完全な、即ち、二重特異的に結合しない抗体を出発材料として使用した半抗体交換反応によって、結合部位のオンセル活性化と組み合わせた多重特異性抗体を得ることができるという所見に少なくとも一部分基づく。出発分子はそれぞれ、相互に会合し二量体/多量体を形成している抗体CH3ドメインのペア、機能性の結合部位を形成しない抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインのペア、ならびにインビボ細胞表面ターゲティングのための少なくとも1個の機能性の結合部位を含む。従って、CH3ドメインのペアは、抗体重鎖のペア、融合ポリペプチドのペア等のようなより大きい分子の一部であり得る。本明細書中に概説される修飾を含むCH3ドメインのペアは、本発明による交換反応のために必要とされる最小構造要素を定義する。不完全な出発抗体においても、CH3ドメインは相互に会合する（二量体または多量体の形成をもたらす）が、CH3ドメインのペアの間の誘引は、CH3ドメインの一方にのみ存在する非対称の撹乱（電荷）変異によって低下している、即ち、不安定化されている。それぞれの他方のCH3ドメインは、会合した野生型CH3ドメインペアにおいて変異した位置と相互作用する位置に、未だ野生型残基を有する。撹乱変異は、第2の/さらなるよりよく適合する補完的な不完全抗体が存在するケースにおいてのみ、出発不完全抗体の解離を助長し、正確に組み立てられた完全二重特異性抗体の生成を促進する。
（i）CH3ドメインの間の不安定化変異の存在；および（ii）出発不完全二重特異性抗体のCH3ドメインを含む2本のポリペプチドの間のジスルフィド結合の欠如にも関わらず、不安定化された出発材料を細胞培養上清から単離することが可能であることが見出された。
本発明は、先に概説された出発化合物を使用することによって、交換反応および完全な機能性の二重特異性抗体の形成が、還元剤の非存在下で起こる、即ち、インビボで実施され得るというさらなる所見に少なくとも一部分基づく。即ち、出発分子のCH3ドメイン含有ポリペプチドの間のジスルフィド結合は、必要とされない。従って、ヒンジ領域ジスルフィド結合も、その他の重鎖-重鎖ジスルフィド結合も、出発不完全抗体から除去され得る。
I. 定義
本明細書において、重鎖および軽鎖のすべての定常領域および定常ドメインのアミノ酸位置は、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD（1991）に記載のKabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、これを本明細書では「ナンバリングはKabatに従う」という。具体的に述べると、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLには、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD（1991）のKabatナンバリングシステム（647〜660頁参照）を使用し、定常重鎖ドメイン（CH1、ヒンジ、CH2およびCH3）には、Kabat EUインデックスナンバリングシステム（661〜723頁参照）を使用する（この場合、本明細書では、「ナンバリングはKabat EUインデックスに従う」ということによって、これをさらに明確にする）。
抗体の重鎖におけるCH3ドメインは、例えばWO96/027011、Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng.9（1996）617-621およびMerchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16（1998）677-681にいくつか例を挙げて詳述されている「ノブ・イントゥ・ホールズ」（knob-into-holes）技術によって、改変することができる。この方法では、2つのCH3ドメインの相互作用面が、それら2つのCH3ドメインのヘテロ二量体化、およびそれによりそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化が増加するように、改変される。（2つの重鎖の）2つのCH3ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、その場合、他方は「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入はヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant,A.M.,et al,Nature Biotech.16（1998）677-681、Atwell,S.,et al,J.Mol.Biol.270（1997）26-35）、収率を増加させる。しかしこれは本発明の分子には存在しない。
抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366Wは「ノブ変異」または「変異ノブ」と表され、抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366S、L368A、Y407Vは「ホール変異」または「変異ホール」と表される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。CH3ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋も、例えば「ノブ変異」を持つ重鎖のCH3ドメインにS354C変異を導入すること（「ノブ-cys変異」または「変異ノブ-cys」と表示する）および「ホール変異」を持つ重鎖のCH3ドメインにY349C変異を導入すること（「ホール-cys変異」または「変異ホール-cys」と表示する）によって（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、使用することができる（Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16（1998）677-681）。しかしこれは本発明の分子には存在しない。
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD（1991）に与えられている。
本発明の実行に有用な方法および技法は、例えばAusubel,F.M.（ed.）,Current Protocols in Molecular Biology,Volumes I〜III（1997）、Glover,N.D.,and Hames,B.D.,ed.,DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes IおよびII（1985）,Oxford University Press、Freshney,R.I.（ed.）,Animal Cell Culture-a practical approach,IRL Press Limited（1986）、Watson,J.D.,et al,Recombinant DNA,Second Edition,CHSL Press（1992）、Winnacker,E.L.,From Genes to Clones;N.Y.,VCH Publishers（1987）、Celis,J.,ed.,Cell Biology,Second Edition,Academic Press（1998）、Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,second edition,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.（1987）に記載されている。
組換えDNA技術の使用により、核酸の誘導体を生成させることが可能になる。そのような誘導体は、例えば、個々のヌクレオチド位置またはいくつかのヌクレオチド位置が、置換、改変、交換、欠失または挿入によって修飾されたものであることができる。修飾および誘導体化は、例えば部位特異的変異誘発法を使って実行することができる。当業者は、そのような修飾を容易に実行することができる（例えばSambrook,J.,et al,Molecular Cloning:A laboratory manual（1999）Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA、Hames,B.D.,and Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization-a practical approach（1985）IRL Press,Oxford,England参照）。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含することに留意しなければならない。したがって例えば、「細胞」（a cell）と書いた場合、それは、複数のそのような細胞および当業者に公知のそれらの等価物を包含する、などとなる。同様に、「1つの」（「a」または「an」）、「1つまたは複数の」および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書では、相互可換的に使用されうる。「comprising」（を含む）、「including」（を包含する）および「having」（を有する）という用語が、相互可換的に使用されうることにも留意されたい。
「MHCFcRP」という用語は、野生型配列と比べて、ノブ変異またはホール変異のいずれかを含み、1個の（即ち、単一のおよび/または付加的な）反発電荷を導入する少なくとも1個の撹乱（即ち、不安定化）変異を含む免疫グロブリン定常ドメイン3（CH3）を少なくとも含む変異型重鎖Fc領域ポリペプチド（mutated heavy chain Fc-region polypeptide）を示す。即ち、MHCFcRPが、第2のCH3ドメイン含有ポリペプチドとペアになる時、第2のCH3ドメインは、撹乱変異におけるアミノ酸残基と（野生型免疫グロブリンにおいて）相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含む。一つの態様において、撹乱変異は、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366T（Kabat EUインデックスに従うナンバリング）からなる変異の群より選択される。一つの好ましい態様において、撹乱変異は、D356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される。
「BiFab」という用語は、相互に会合しているV1-C1/V2-C2のペアを2個含む分子を表し、ここで、Vは抗体可変ドメインを表し、Cは抗体定常ドメインを表す。例えば、ペアは、VH1-CH1/VL1-CLおよびVH2-CH31/VL2-CH32であり得る。同様に、「TriFab」という用語は、相互に会合しているV1-C1/V2-C2のペアを3個含む分子を表し、ここで、Vは抗体可変ドメインを表し、Cは抗体定常ドメインを表す。例えば、ペアは、VH1-CH1/VL1-CL、VH2-CH1/VL2-CL、およびVH3-CH31/VL3-CH32であり得る。
「約」という用語は、その後ろに続く数値の±20％の範囲を表す。一態様において、約という用語は、その後ろに続く数値の±10％の範囲を表す。一態様において、約という用語は、その後ろに続く数値の±5％の範囲を表す。
「アミノ酸置換」または「アミノ酸変異」という用語は、前もって決定された親アミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基を、異なる「置き換え」アミノ酸残基で置き換えることを表す。1つまたは複数の置換え残基は「天然のアミノ酸残基」（すなわち遺伝暗号によってコードされているもの）であってよく、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、システイン（Cys）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、およびバリン（Val）からなる群より選択されうる。一態様において、置換え残基はシステインではない。本明細書におけるアミノ酸置換の定義には、1つまたは複数の非天然アミノ酸残基による置換も包含される。「非天然アミノ酸残基」とは、ポリペプチド鎖中の隣接アミノ酸残基に共有結合的に結合することができる、上に列挙した天然アミノ酸残基以外の残基を表す。非天然アミノ酸残基の例としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、aibおよび他のアミノ酸残基類似体、例えばEllman,et al,Meth.Enzym.202（1991）301-336に記載されているものが挙げられる。そのような非天然アミノ酸残基を生成させるには、Norenら（Science 244（1989）182）および/またはEllmanら（前掲）の手法を使用することができる。簡単に述べると、これらの手法では、サプレッサーtRNAを非天然アミノ酸残基で化学的に活性化してから、インビトロ転写およびRNAの翻訳を行う。非天然アミノ酸は、化学ペプチド合成と、それに続くそれらのペプチドと組換え生産されたポリペプチド、例えば抗体または抗体断片との融合とによって、ペプチドに組み込むこともできる。
「抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）」という用語はFc受容体結合によって媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下で抗体Fc領域によって媒介される標的細胞の溶解を指す。ADCCは、一態様では、新鮮単離PBMC（末梢血単核球）などのエフェクター細胞の存在下または単球もしくはNK（ナチュラルキラー）細胞のようなバフィーコートからの精製エフェクター細胞の存在下で、標的を発現する赤血球系細胞（例えば組換え標的を発現するK562細胞）の調製物を、本明細書に掲載するFc領域を含むポリペプチドで処理することによって測定される。標的細胞をCr-51で標識してから、本明細書に掲載するポリペプチドと共にインキュベートする。標識細胞をエフェクター細胞と共にインキュベートし、放出されたCr-51について上清を分析する。対照には、標的内皮細胞をエフェクター細胞と共に、ただし本明細書に掲載するポリペプチドなしで、インキュベートすることを含める。このポリペプチドの、ADCCを媒介する初期段階を誘導する能力は、FcγRIおよび/またはFcγRIIAを組換え発現する細胞または（本質的にFcγRIIIAを発現する）NK細胞などといったFcγ受容体発現細胞への結合を測定することによって調べられる。好ましい一態様では、NK細胞上のFcγRへの結合が測定される。
「CH1ドメイン」という用語は、抗体重鎖ポリペプチドのうち、およそEU位置118からEU位置215まで（EUナンバリングシステム）にわたる部分を表す。一態様において、CH1ドメインは
Figure 2021501181
のアミノ酸配列を含む。
「CH2ドメイン」という用語は、抗体重鎖ポリペプチドのうち、およそEU位置231からEU位置340まで（KabatによるEUナンバリングシステム）にわたる部分を表す。一態様において、CH2ドメインは
Figure 2021501181
のアミノ酸配列を含む。CH2ドメインは、もう一つのドメインと密接にはペアを形成していない点でユニークである。むしろ、無傷のネイティブFc領域の2つのCH2ドメインの間には、2つのN結合型分岐糖質鎖が差し挟まれている。この糖質はドメイン-ドメインペア形成の代用物となっていて、CH2ドメインの安定化に役立つのだろうと推測されている。Burton,Mol.Immunol.22（1985）161-206。
「CH3ドメイン」という用語は、抗体重鎖ポリペプチドのうち、およそEU位置341からEU位置446までにわたる部分を表す。一態様において、CH3ドメインは
Figure 2021501181
のアミノ酸配列を含む。
「を含む」（comprising）という用語は「からなる」（consisting of）という用語も包含する。
「補体依存性細胞傷害（CDC）」という用語は、補体の存在下で、本明細書に掲載する抗体のFc領域によって誘導される細胞の溶解を指す。CDCは、一態様では、標的を発現するヒト内皮細胞を、補体の存在下で、本明細書に掲載されるポリペプチドで処理することによって測定される。一態様では、細胞をカルセインで標識する。ポリペプチドが30μg/mlの濃度で20％以上の標的細胞の溶解を誘導すれば、CDCが見いだされる。補体因子C1qへの結合はELISAにおいて測定することができる。そのようなアッセイでは、原則として、ある濃度範囲のポリペプチドでELISAプレートをコーティングし、そこに精製ヒトC1qまたはヒト血清を加える。C1q結合は、C1qに対する抗体とそれに続くペルオキシダーゼ標識コンジュゲートとによって検出される。結合の検出（最大結合Bmax）は、ペルオキシダーゼ基質ABTS（登録商標）（2,2'-アジノ-ジ-［3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホネート］）の場合は、405 nmにおける光学密度（OD405）として測定される。
本明細書中で使用されるように、「処置」（および「処置する」または「処置すること」のようなその文法上の変動）は、処置されている個体の自然経過を変更する試みにおける臨床的介入をさし、予防のために実施されてもよいし、または臨床病理の経過中に実施されてもよい。処置の望ましい効果には、疾患の発生もしくは再発の防止、症状の軽減、疾患の直接もしくは間接の病理学的結果の減弱、転移の防止、疾患進行の速度の減少、疾患状態の寛解もしくは緩和、および緩解、または予後の改善が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本明細書中に報告される抗体は、疾患の発症を遅延させるかまたは疾患の進行を緩徐化するために使用される。
「エフェクター機能」とは、抗体のFc領域に帰因する生物学的活性を指し、それが由来する抗体クラスによってさまざまである。抗体エフェクター機能の例として、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、貪食、細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）のダウンレギュレーション、ならびにB細胞活性化が挙げられる。
Fc受容体結合依存的エフェクター機能は、抗体のFc領域と、造血細胞上の特殊化した細胞表面受容体であるFc受容体（FcR）との相互作用によって媒介されうる。Fc受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の貪食による抗体被覆病原体の除去と、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）による、Fc領域を提示する赤血球および他のさまざまな細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解とを、どちらも媒介することが示されている（例えばVan de Winkel,J.G.and Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49（1991）511-524を参照されたい）。FcRは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特異性によって規定され、IgG型Fc領域に対するFc受容体はFcγRと呼ばれる。Fc受容体結合は、例えばRavetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9（1991）457-492、Capel,P.J.,et al.,Immunomethods 4（1994）25-34、de Haas,M.,et al.,J.Lab.Clin.Med.126（1995）330-341、Gessner,J.E.,et al.,Ann.Hematol.76（1998）231-248に記載されている。
IgGタイプの抗体のFc領域に対する受容体（FcγR）の架橋は、貪食、抗体依存性細胞性細胞傷害、および炎症性メディエーターの放出、ならびに免疫複合体クリアランスおよび抗体生産の調節を含む、多種多様なエフェクター機能の引き金を引く。ヒトでは、3つのFcγRクラスが特徴づけられており、それらは以下のとおりである。
・FcγRI（CD64）は、単量体IgGに高いアフィニティーで結合し、マクロファージ、単球、好中球および好酸球上に発現する。アミノ酸残基E233〜G236、P238、D265、N297、A327およびP329（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のうちの少なくとも1つにおけるIgGのFc領域中の修飾は、FcγRIへの結合を低減する。IgG2の233〜236番目の残基でIgG1中およびIgG4中の残基を置換すると、FcγRIへの結合は103分の1に低減し、抗体感作赤血球細胞に対するヒト単球応答は排除された（Armour,K.L.,et al,Eur.J.Immunol.29（1999）2613-2624）。
・FcγRII（CD32）は、複合体化したIgGに、中〜低アフィニティーで結合し、広く発現している。この受容体は2つのサブタイプFcγRIIAおよびFcγRIIBに分類することができる。FcγRIIAは、キリング（killing）に関与する多くの細胞（例えばマクロファージ、単球、好中球）に見いだされ、キリングプロセスを活性化することができるようである。FcγRIIBは、阻害プロセスにおいて役割を果たすと思われ、B細胞、マクロファージならびに肥満細胞および好酸球上に見いだされる。これは、B細胞上では、さらなる免疫グロブリン生産および例えばIgEクラスへのアイソタイプスイッチングを抑制する機能を果たすようである。FcγRIIBは、マクロファージ上では、FcγRIIAによって媒介される貪食を阻害するように作用する。好酸球および肥満細胞上では、IgEがその別個の受容体に結合することによって起こるこれらの細胞の活性化を抑制するのに、このB型が役立ちうる。FcγRIIAに対する結合の低減は、例えばアミノ酸残基E233〜G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292およびK414（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のうちの少なくとも1つに変異を持つIgG Fc領域を含む抗体に見いだされる。
・FcγRIII（CD16）は中〜低アフィニティーでIgGに結合し、2つのタイプとして存在する。FcγRIIIAはNK細胞、マクロファージ、好中球ならびに一部の単球およびT細胞上に見いだされ、ADCCを媒介する。FcγRIIIBは好中球に高発現している。FcγRIIIAへの結合の減少は、例えばアミノ酸残基E233〜G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338およびD376（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）のうちの少なくとも1つに変異を持つIgG Fc領域を含む抗体に見いだされる。
Fc受容体に対するヒトIgG1上の結合部位のマッピング、上述の変異部位ならびにFcγRIおよびFcγRIIAへの結合を測定するための方法は、Shields,R.L.,et al.J.Biol.Chem.276（2001）6591-6604に記載されている。
「ヒンジ領域」という用語は、抗体重鎖ポリペプチドのうち、野生型抗体重鎖中でCH1ドメインとCH2ドメインとを接合している部分、例えばKabatのEUナンバーシステム（number system）で約221番目から約230番目まで、またはKabatのEUナンバーシステムで約226番目から約230番目までを表す。他のIgGサブクラスのヒンジ領域は、IgG1サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基との整列によって決定することができる。
ヒンジ領域は、通常、同一のアミノ酸配列を持つ2つのポリペプチドからなる二量体分子である。ヒンジ領域は通常アミノ酸配列DKTHTCPXCP (SEQ ID NO: 30)（ここでXはSまたはPである）、またはHTCPXCP（SEQ ID NO:31）（ここでXはSまたはPである）、またはCPXCP（SEQ ID NO:32）（ここでXはSまたはPである）を有する。
一態様において、ヒンジ領域は内部ジスルフィド結合を有しない。これは、SEQ ID NO:32の配列中の（同様にSEQ ID NO:30および31中の）システイン残基をセリン残基によって置換することによって、またはSEQ ID NO:30、31または32のヒンジ領域からCPXCストレッチ（SEQ ID NO:95）を欠失させることによって、達成される。
「ペプチド性リンカー」という用語は、天然起源および/または合成起源のリンカーを表す。ペプチド性リンカーは、20種の天然アミノ酸を、ペプチド結合によってつながれるモノマービルディングブロックとする、アミノ酸の線状鎖からなる。この鎖は、1〜50アミノ酸残基、好ましくは1〜28アミノ酸残基、とりわけ好ましくは3〜25アミノ酸残基の長さを有する。ペプチド性リンカーは、反復アミノ酸配列または天然ポリペプチドの配列を含有しうる。ペプチド性リンカーは、融合ポリペプチドのドメインが正しく折りたたまれることおよびドメインが適正に提示されることを可能にすることによって、それらのドメインがそれぞれの生物学的活性を発揮できることを保証する機能を有する。好ましくは、ペプチド性リンカーは、グリシン、グルタミン、および/またはセリン残基に富むように設計された「合成ペプチド性リンカー」である。これらの残基は、例えば5アミノ酸までの小さな繰り返し単位、例えば
Figure 2021501181
に配置される。この小さな繰り返し単位は、2〜5回繰り返されて、例えば
Figure 2021501181
などの多量体単位を形成しうる。一態様において、ペプチド性リンカーはSEQ ID NO:69〜82のリンカーの群より選択される。一態様において、ペプチド性リンカーのそれぞれは、SEQ ID NO:69〜82からなるリンカーの群から、互いに独立して選択される。好ましい一態様において、ペプチド性リンカー/各ペプチド性リンカーは、SEQ ID NO:75〜81からなるリンカーの群より（互いに独立して）選択される。マルチマー単位のアミノ末端および/またはカルボキシ末端には、任意の天然アミノ酸を6個まで追加することができる。他の合成ペプチド性リンカーは、例えばリンカー
Figure 2021501181
中のセリンなど、10〜20回繰り返される単一アミノ酸で構成され、アミノ末端および/またはカルボキシ末端に任意の天然アミノ酸をさらに6個まで含みうる。すべてのペプチド性リンカーは核酸分子によってコードすることができるので、組換え発現させることができる。リンカーはそれ自体がペプチドであるから、抗融合性ペプチド（antifusogenic peptide）は、2つのアミノ酸の間に形成されるペプチド結合によって、リンカーにつながれる。
「抗体断片」とは、インタクト抗体以外の分子であって、インタクト抗体のうち、インタクト抗体が結合する抗原に結合する部分を含む分子を指す。抗体断片の例として、Fv、scFv、Fab、scFab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えばscFv）、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ある特定の抗体断片に関する総説として、Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9（2003）129-134を参照されたい。scFv断片の総説として、例えばPlueckthun,A.,In;The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore（eds.）,Springer-Verlag,New York（1994）,pp.269-315を参照されたい。また、WO93/16185;US5,571,894およびUS5,587,458も参照されたい。
ダイアボディは、二価であっても二重特異性であってもよい2つの抗原結合部位を持つ抗体断片である。例えばEP 0 404 097、WO 1993/01161、Hudson,P.J.et al.,Nat.Med.9（2003）129-134およびHolliger,P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90（1993）6444-6448を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもHudson,P.J.et al.,Nat.Med.9（20039 129-134）に記載されている。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Domantis,Inc.、マサチューセッツ州ウォルサム;例えばUS6,248,516参照）である。
抗体断片は、さまざまな技法によって、例えば限定するわけではないがインタクト抗体のタンパク質分解消化および組換え宿主細胞（例えば大腸菌（E.coli）またはファージ）による生産などによって、作成することができる。
「抗体断片」という用語は、2つの異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Fab」（Dual Acting Fab）、すなわち「DAF」も包含する（例えばUS 2008/0069820を参照されたい）。
「単一特異性抗体」とは、1つの抗原に対する単一の結合特異性を有する抗体を表す。単一特異性抗体は、完全長抗体もしくは抗体断片（例えばF（ab'）2）またはそれらの組合せ（例えば完全長抗体＋追加のscFvまたはFab断片）として調製することができる。
「多重特異性抗体」は、同じ抗原上または2つの異なる抗原上の少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を表す。多重特異性抗体は、完全長抗体もしくは抗体断片（例えばF（ab'）2二重特異性抗体）またはそれらの組合せ（例えば完全長抗体＋追加のscFvまたはFab断片）として調製することができる。2つ、3つまたはそれ以上（例えば4つ）の機能的抗原結合部位を持つ操作された抗体も報告されている（例えばUS 2002/0004587 A1参照）。多重特異性抗体の一つは二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、抗体Fc-ヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果を工学的に操作することによって作製することもできる（WO 2009/089004）。
「に結合する」という用語は、結合部位のその標的への結合、例えば抗体重鎖可変ドメインと抗体軽鎖可変ドメインとを含む抗体結合部位のそれぞれの抗原への結合を表す。この結合は、例えばBIAcore（登録商標）アッセイ（GE Healthcare、スウェーデン国ウプサラ）を使って、決定することができる。すなわち、「（抗原に）結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて抗体が結合することを表す。一態様において、結合は、抗体が表面に結合され、その抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定される結合アッセイにおいて、決定される。結合とは、例えば10-8 M以下の、いくつかの態様では10-13〜10-8 Mの、いくつかの態様では10-13〜10-9 Mの、結合アフィニティー（KD）を意味する。「結合する」という用語は「特異的に結合する」という用語も包含する。
結合はBIAcoreアッセイ（GE Healthcare Biosensor AB、スウェーデン国ウプサラ）によって調べることができる。結合のアフィニティーは、ka項（抗体/抗原複合体からの抗体の会合に関する速度定数）、kd項（解離定数）およびKD項（kd/ka）によって定義される。
例えば、BIAcore（登録商標）アッセイの考えうる一態様では、抗原を表面に結合し、表面プラズモン共鳴（SPR）によって抗体結合部位の結合を測定する。結合のアフィニティーは、ka項（会合定数:複合体を形成する会合に関する速度定数）、kd項（解離定数:複合体の解離に関する速度定数）項およびKD項（kd/ka）によって定義される。あるいは、SPRセンサーグラムの結合シグナルを、共鳴シグナルの高さおよび解離挙動に関して、リファレンスの応答シグナルと直接比較することができる。
「結合部位」という用語は、標的に対して結合特異性を示す任意のタンパク質性の実体を表す。これは、例えば受容体、受容体リガンド、アンチカリン、アフィボディ、抗体などであることができる。したがって、本明細書において使用する「結合部位」という用語は、第2のポリペプチドに特異的に結合しうるかまたは第2のポリペプチドによって特異的に結合されうるポリペプチドを表す。一態様において、結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメイン、抗体重鎖可変ドメインと抗体軽鎖可変ドメインのペア、受容体またはその機能的断片、受容体リガンドまたはその機能的断片、酵素またはその基質からなるポリペプチドの群より選択される。
抗体の場合、結合部位は、少なくとも3つのHVR（例えばVHHの場合）または6つのHVR（例えば天然の、すなわちネイティブな、抗体の場合）を含む。一般に、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基は結合部位を形成している。これらの残基は、通常、抗体重鎖可変ドメインとコグネイト抗体軽鎖可変ドメインのペアに含まれている。抗体の抗原結合部位は「超可変領域」または「HVR」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域、すなわち「FR」領域は、本明細書において定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。それゆえに、抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、N末端からC末端に向かって、以下の領域を含む:FR1、HVR1/CDR1、FR2、HVR2/CDR2、FR3、HVR3/CDR3およびFR4（免疫グロブリンフレームワーク）。とりわけ、重鎖可変ドメインのHVR3/CDR3領域は、抗原結合への寄与が最も大きく、抗体の結合特異性を規定する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に特異的に結合する能力を有する。「に特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて、一態様では結合アッセイにおいて、結合部位がその標的に結合することを表す。そのような結合アッセイは、結合事象を検出することができる限り、任意のアッセイであることができる。例えば、抗体が表面に結合され、抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定される結合アッセイ。あるいはブリッジングELISA（bridging ELISA）を使用することができる。結合とは、10-8 M以下の、いくつかの態様では10-13〜10-8 Mの、いくつかの態様では、10-13〜10-9 Mの、抗体（結合物質）からその標的への結合アフィニティー（KD）を意味する。
抗体の「クラス」とは、その重鎖が持つ定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には5つの主要クラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2に分類されうる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
「Fc領域」という用語は、ヒンジ領域の少なくとも一部、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を表す。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のAsp221から、またはCys226から、またはPro230から、カルボキシル末端までにわたる。ただし、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は存在しても存在しなくてもよい。Fc領域は、2つの重鎖Fc領域ポリペプチドで構成され、それら2つの重鎖Fc領域ポリペプチドは、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基によって互いに共有結合されうる。
本明細書に掲載する多量体ポリペプチド/結合物質は完全なFc領域を含み得、一態様ではヒト由来のFc領域を含み得るがヒンジ領域システイン残基を含まない。一態様において、Fc領域は、ヒト定常領域のすべてのパーツを含むがヒンジ領域システイン残基を含まない。抗体のFc領域は、補体活性化、C1q結合、C3活性化およびFc受容体結合に直接関与する。補体系に対する抗体の影響はある特定の条件に依存するが、C1qへの結合は、Fc領域中の所定の結合部位が引き起こす。そのような結合部位は、現在の技術水準では公知であり、例えばLukas,T.J.,et al,J.Immunol.127（1981）2555-2560、Brunhouse,R.,and Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16（1979）907-917、Burton,D.R.,et al,Nature 288（1980）338-344、Thommesen,J.E.,et al,Mol.Immunol.37（2000）995-1004、Idusogie,E.E.,et al,J.Immunol.164（2000）4178-4184、Hezareh,M.,et al.,J.Virol.75（2001）12161-12168、Morgan,A.,et al,Immunology 86（1995）319-324およびEP 0 307 434によって記載されている。そのような結合部位は、例えばL234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331およびP329（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）である。サブクラスIgG1、IgG2およびIgG3の抗体が、通常、補体活性化、C1q結合およびC3活性化を示すのに対し、IgG4は補体系を活性化せず、C1qに結合せず、C3を活性化しない。「抗体のFc領域」は、当業者には周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。一態様において、Fc領域はヒトFc領域である。一態様において、Fc領域は、変異S228Pおよび/またはL235E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を含むヒトIgG4サブクラスのFc領域である。一態様において、Fc領域は、変異L234AおよびL235Aを含み、任意でP329Gを含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、ヒトIgG1サブクラスのものである。
「完全長抗体」という用語は、ネイティブ抗体の構造に実質的に類似する構造を有する抗体を表す。完全長抗体は、それぞれが軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む2つの完全長抗体軽鎖と、それぞれが重鎖可変ドメイン、第1定常ドメイン、ヒンジ領域、第2定常ドメインおよび第3定常ドメインを含む2つの完全長抗体重鎖とを含む。完全長抗体は、例えば完全長抗体の鎖のうちの1つまたは複数にコンジュゲートされた追加のscFvまたはscFabなどといった、さらなるドメインを含みうる。これらのコンジュゲートも完全長抗体という用語に包含される。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」という用語は、相互可換的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を包含し、それらには、初代形質転換細胞とそこから派生する子孫とが継代数を問わず包含される。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全には同一でなくて、変異を含有してもよい。最初に形質転換された細胞において選別または選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫は、ここに包含される。
「に由来する（から誘導された）」（derived from）という用語は、変異体アミノ酸配列が親アミノ酸配列から、少なくとも1つの位置に改変/変異を導入することによって得られることを表す。したがって、誘導されたアミノ酸配列は、対応する親アミノ酸配列と少なくとも1つの対応する位置において異なる。一態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において1〜15個のアミノ酸残基が異なる。一態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において1〜10個のアミノ酸残基が異なる。一態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、対応する位置において1〜6個のアミノ酸残基が異なる。同様に、誘導されたアミノ酸配列は、その親アミノ酸配列に対して高いアミノ酸配列同一性を有する。一態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、80％以上のアミノ酸配列同一性を有する。一態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、90％以上のアミノ酸配列同一性を有する。一態様において、親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、95％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
一態様では、一方または両方の重鎖Fc領域ポリペプチドがSEQ ID NO:01のFc領域ポリペプチドに由来し、SEQ ID NO:01のFc領域ポリペプチドと比較して、少なくとも1つのアミノ酸変異または欠失を有する。一態様において、Fc領域ポリペプチドは、約1〜約10個のアミノ酸変異または欠失を、一態様では約1〜約5個のアミノ酸変異または欠失を、含む/有する。一態様において、Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO:01のヒトFc領域ポリペプチドと少なくとも約80％の相同性を有する。一態様において、Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO:01のヒトFc領域ポリペプチドと少なくとも約90％の相同性を有する。一態様において、Fc領域ポリペプチドは、SEQ ID NO:01のヒトFc領域ポリペプチドと少なくとも約95％の相同性を有する。
SEQ ID NO:01または02または03または04のヒトFc領域ポリペプチドに由来するFc領域ポリペプチドは、含まれているアミノ酸改変によって、さらに規定される。したがって、例えばP329Gという用語は、SEQ ID NO:01または02または03または04のヒトFc領域ポリペプチドとの比較で、アミノ酸位置329にプロリンからグリシンへの変異を持つ、ヒトFc領域ポリペプチド由来のFc領域ポリペプチドを表す。
ヒトIgG1 Fc領域ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
以下のFc領域は野生型ヒトIgG1 Fc領域由来の変異体である。
変異L234A、L235Aを持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
Y349C、T366S、L368AおよびY407V変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
S354C、T366W変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
L234A、L235A変異およびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
L234A、L235AおよびS354C、T366W変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
P329G変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
L234A、L235A変異およびP329G変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
P329G変異およびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
P329G変異およびS354C、T366W変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
L234A、L235A、P329GおよびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
L234A、L235A、P329G変異およびS354C、T366W変異を持つヒトIgG1 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
ヒトIgG4 Fc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
以下のFc領域は野生型ヒトIgG4 Fc領域に由来する変異体である。
S228PおよびL235E変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
S228P、L235E変異およびP329G変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
S354C、T366W変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
Y349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
S228P、L235EおよびS354C、T366W変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
S228P、L235EおよびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
P329G変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
P329GおよびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
P329GおよびS354C、T366W変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
S228P、L235E、P329GおよびY349C、T366S、L368A、Y407V変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
S228P、L235E、P329GおよびS354C、T366W変異を持つヒトIgG4 Fc領域由来のFc領域ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む:
Figure 2021501181
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRからのアミノ酸残基とヒトFRからのアミノ酸残基とを含む抗体を指す。ある特定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質上すべてを含み、その可変ドメインでは、HVR（例えばCDR）のすべてまたは実質上すべてが非ヒト抗体のものに対応し、FRのすべてまたは実質上すべてがヒト抗体のものに対応するであろう。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含みうる。抗体の、例えば非ヒト抗体の、「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書において使用する用語「超可変領域」または「HVR」は、抗体可変ドメインのうち、配列が超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」）かつ/または構造上明確なループ（「超可変ループ」）を形成しかつ/または抗原接触残基（「抗原コンタクト」（antigen contact））を含有するアミノ酸残基ストレッチを含む領域のそれぞれを指す。一般に抗体は、重鎖可変ドメインVH中に3つ（H1、H2、H3）と軽鎖可変ドメインVL中に3つ（L1、L2、L3）の、6つのHVRを含む。
HVRは、
（a）アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）および96〜101（H3）に存在する超可変ループ（Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196（1987）901-917）、
（b）アミノ酸残基24〜34（L1）、50〜56（L2）、89〜97（L3）、31〜35b（H1）、50〜65（H2）および95〜102（H3）に存在するCDR（Kabat,E.A.et al,Sequence of Proteins of Immunological Interest,5th ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD（1991）,NIH Publication 91-3242）、
（c）アミノ酸残基27c〜36（L1）、46〜55（L2）、89〜96（L3）、30〜35b（H1）、47〜58（H2）および93〜101（H3）に存在する抗原コンタクト（MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745（1996））、ならびに
（d）アミノ酸残基46〜56（L2）、47〜56（L2）、48〜56（L2）、49〜56（L2）、26〜35（H1）、26〜35b（H1）、49〜65（H2）、93〜102（H3）および94〜102（H3）を含む（a）、（b）および/または（c）の組み合わせ
を含む。
別段の表示がある場合を除き、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えばFR残基）は、本明細書では、前掲のKabatらに従ってナンバリングされる。
「軽鎖」という用語は、ネイティブIgG抗体の短い方のポリペプチド鎖を表す。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2タイプのうちの一方に割り当てうる。ヒトカッパ軽鎖定常ドメインについてはSEQ ID NO:33を、またヒトラムダ軽鎖定常ドメインについてはSEQ ID NO:34を参照されたい。
「パラトープ」という用語は、所与の抗体分子のうち、標的と結合部位の間の特異的結合に必要な部分を指す。パラトープは、連続的である場合、すなわち結合部位中に存在する隣り合ったアミノ酸残基によって形成される場合もあるし、不連続である場合、すなわち一次配列中で、例えばHVR/CDRのアミノ酸配列中で、配列上は異なる位置にあるが、結合部位がとる三次元構造では近接しているアミノ酸残基によって形成される場合もある。
「単離された」抗体とは、その自然環境の構成要素から分離された抗体である。いくつかの態様において、抗体は、例えば電気泳動（例えばSDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動、CE-SDS）またはクロマトグラフィー（例えばサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換もしくは逆相HPLC）による決定で、純度95％超または99％超まで精製される。抗体純度の評価方法を概観するには、例えばFlatman,S.et al.,J.Chrom.B 848（2007）79-87を参照されたい。
「単離された」核酸とは、その自然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、その核酸分子を通常含有する細胞に含まれている核酸分子であるが、染色体外に存在するか、その自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が包含される。
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、例えば天然の変異を含有する抗体変異体、またはモノクローナル抗体調製物の生産中に生じる抗体変異体などといった考えうる抗体変異体を除けば（そのような変異体の存在量は一般に少量である）、前記集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基を指向する。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示しているのであって、何か特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるものではない。例えば本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定するわけではないがハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン座位の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法などといった、さまざまな技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的方法は、本明細書において説明する。
「ネイティブ抗体」とは、さまざまな構造を持つ天然の免疫グロブリン分子を指す。例えばネイティブIgG抗体は、ジスルフィド結合された2つの同一軽鎖および2つの同一重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端に向かって、可変領域（VH）（可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインともいう）と、それに続く3つの定常ドメイン（CH1、CH2およびCH3）とを有する。同様に、各軽鎖は、N末端からC末端に向かって、可変領域（VL）（可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインともいう）と、それに続く定常軽鎖（CL）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2タイプのうちの一方に割り当てうる。
「薬学的製剤」という用語は、そこに含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを許すような形態にあって、その製剤を投与されることになる対象にとって許容できないほど毒性である追加の構成成分を含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤または保存剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において使用する「組換え抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、創製または単離されるすべての（キメラ、ヒト化およびヒト）抗体を表す。これには、NS0、HEK、BHKもしくはCHO細胞などの宿主細胞から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現プラスミドを使用して発現された抗体が含まれる。
本願において使用される用語「価」は、指定した数の結合部位が（抗体）分子中に存在することを表す。したがって「二価」、「四価」および「六価」という用語は、（抗体）分子中にそれぞれ2つの結合部位、4つの結合部位および6つの結合部位が存在することを表す。本明細書に掲載される二重特異性抗体は、好ましい一態様では、「三価」である。本明細書に掲載される三重特異性抗体は、好ましい一態様では、「三価」である。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の、その抗原への結合に関与する、抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインを指す。抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似する構造を有し、各ドメインは4つのフレームワーク領域（FR）と3つの超可変領域（HVR）とを含んでいる（例えばKindt,T.J.et al.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.（2007）91頁参照）。単一のVHドメインまたはVLドメインでも、抗原結合特異性を付与するには十分でありうる。さらにまた、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体からのVHドメインまたはVLドメインを使ってそれぞれ相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることによって、単離しうる。例えばPortolano,S.,et al.,J.Immunol.150（1993）880-887、Clackson,T.,et al.,Nature 352（1991）624-628を参照されたい。
「変異体」という用語は、親分子のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する分子を表す。通例、そのような分子は、1つまたは複数の改変、挿入または欠失を有する。一態様において、修飾抗体または修飾融合ポリペプチドは、自然には存在しないFc領域の少なくとも一部分を含むアミノ酸配列を含む。そのような分子は、親ドメインまたは親Fc領域と、100％未満の配列同一性を有する。一態様において、変異体は、親ドメインまたは親Fc領域のアミノ酸配列と、約75％〜100％未満の、とりわけ約80〜100％未満の、とりわけ約85％〜100％未満の、とりわけ約90％〜100％未満の、とりわけ約95％〜100％未満の、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。一態様において、親ドメインまたは親Fc領域と変異体ドメインまたは変異体Fc領域とは、1つ（単一）、2つまたは3つのアミノ酸残基が相違する。
本明細書において使用する用語「ドメイン交差」は、抗体重鎖VH-CH1断片とその対応するコグネイト抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体結合アームにおいて（すなわちFab断片において）、少なくとも1つの重鎖ドメインがその対応軽鎖ドメインで置換され、その逆の置換もなされている点で、ドメイン配列が天然配列から逸脱していることを表す。ドメイン交差には3つの一般的タイプ、（i）VL-CH1ドメイン配列を持つドメイン交差軽鎖とVH-CLドメイン配列を持つドメイン交差重鎖断片（またはVH-CL-ヒンジ-CH2-CH3ドメイン配列を持つ完全長抗体重鎖）とをもたらすCH1ドメインとCLドメインとの交差、（ii）VH-CLドメイン配列を持つドメイン交差軽鎖とVL-CH1ドメイン配列を持つドメイン交差重鎖断片とをもたらすVHドメインとVLドメインとのドメイン交差、および（iii）VH-CH1ドメイン配列を持つドメイン交差軽鎖とVL-CLドメイン配列を持つドメイン交差重鎖断片とをもたらす完全軽鎖（VL-CL）と完全VH-CH1重鎖断片とのドメイン交差（「Fab交差」）がある（上述のドメイン配列はいずれもN末からC末に向かう方向に示されている）。
対応する重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインに関して本明細書において使用する用語「互いに入れ替えられ」るとは、上述のドメイン交差を指す。したがって、CH1ドメインとCLドメインとが「互いに入れ替えられ」ている場合、それは、項目（i）で述べたドメイン交差と、その結果生じる重鎖および軽鎖ドメイン配列とを指す。したがって、VHとVLとが「互いに入れ替えられ」ている場合、それは、項目（ii）で述べたドメイン交差を指し、また、CH1ドメインとCLドメインが「互いに入れ替えられ」かつVH1ドメインとVLドメインとが「互いに入れ替えられ」ている場合、それは、項目（iii）で述べたドメイン交差を指す。ドメイン交差を含む二重特異性抗体は、例えばWO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254およびSchaefer,W.et al,Proc.Natl.Acad.Sci USA 108（2011）11187-11192に掲載されている。
本明細書に掲載する方法で生産される多重特異性抗体は、上記項目（i）で述べたCH1ドメインとCLドメインとのドメイン交差または上記項目（ii）で述べたVHドメインとVLドメインとのドメイン交差を含むFab断片を含みうる。同じ抗原に特異的に結合するFab断片は、同じドメイン配列を持つように構築される。したがって、あるドメイン交差を伴うFab断片が多重特異性抗体に2つ以上含まれている場合、それらのFab断片は同じ抗原に特異的に結合する。
II.本発明による交換反応による二重/多重特異性抗体の生成
（A）単一特異性1価IgG誘導体を二重特異性2価IgGへ変換する方法
以下に概説される交換方法は、単一特異性の（1価）抗体もしくは抗体断片の、2価二重特異性抗体（bsAb）への変換、または既に多重特異性である抗体の、より高次の多重特異性抗体への変換、例えば、二重特異性抗体の、三重特異性抗体もしくは四重特異性抗体への変換を達成することができる。
2個の非機能性の半抗体（即ち、細胞標的に対して単一特異性）が、出発材料として使用される。例示的に、2/3-IgGが使用され得る。2/3-IgGは、ノブイントゥホール（KiH）変異の第1のセットを有する重鎖、それと補完的な軽鎖、およびノブイントゥホール変異のそれぞれの補完的な第2のセットによって重鎖のFc領域と補完的にされたFc領域から構成される。補完的なFc領域は、例えば、Fc領域重鎖断片または（任意で、結合特異性を有しない）第2の重鎖であり得る。所望の二重（多重）特異性抗体の正確な組み立てをさらに助長するため、補完的なFc領域は、KiH変異の第2の補完的なセットに加えて、付加的な撹乱（不安定化）反発電荷変異を含む。さらに、補完的なFc領域は、その作製後に不要な遊離体および副生成物を効率的に除去するためのアフィニティタグ（例えば、His6タグまたはCタグ）を含んでいてよい。第2の非機能性の単一特異性抗体は、補完的な撹乱変異を含む。これらの2個の撹乱変異は、抗体の半分が、例えば、細胞表面上に結合したまま、相互作用することによって、相互に交換された後、誘引性の変異に変わる。
本発明による多量体分子によって実施され得るオンセル交換反応/方法は、
−（第1および第4のポリペプチドを含む）第3の多量体ポリペプチドならびに（第2および第3のポリペプチドを含む）第4の多量体ポリペプチドを形成させるため、第2および第3のポリペプチドをクロスに交換するため、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む第1の（出発）多量体ポリペプチドと、第3のポリペプチドおよび第4のポリペプチドを含む第2の（出発）多量体ポリペプチドとを、細胞の表面上で近接させる工程
を含み、ここで、
（i）第2のポリペプチドは、第2のポリペプチドにおける変異を除き、第1の多量体ポリペプチドと同一である（多量体）ポリペプチドと比較して、第1の多量体ポリペプチドの不安定化をもたらす（第1の撹乱）変異を含み、
（ii）第3のポリペプチドは、第3のポリペプチドにおける変異を除き、第2の（多量体）ポリペプチドと同一である多量体ポリペプチドと比較して、第2の多量体ポリペプチドの不安定化をもたらす（第2の撹乱）変異を含み、
（iii）第2のポリペプチドにおける（第1の撹乱）変異および第3のポリペプチドにおける（第2の撹乱）変異は、第1の（出発）多量体ポリペプチドおよび/または第2の（出発）多量体ポリペプチドと比較して、第2のポリペプチドおよび第3のポリペプチドを含む第3の（交換された）多量体ポリペプチドの安定化をもたらし、
（iv）第4の（交換された）多量体ポリペプチドは、第1の（出発）多量体ポリペプチドおよび/または第2の（出発）多量体ポリペプチドと比較して、より安定しており、
（v）第1の多量体ポリペプチドおよび第2の多量体ポリペプチドは、機能性でない、即ち、標的に結合することができない、1個または2個の新しい結合部位の一部のみを各々含み、
（vi）第3および/または第4の多量体ポリペプチドは、機能性の形態、即ち、それぞれの標的との特異的な結合を可能にする形態で、1個または2個の新しい結合部位を含み、それによって、1個または2個の新しい機能性の結合部位は、1個または2個の新しい機能性の結合部位を形成するための、第1の多量体ポリペプチドと第2の多量体ポリペプチドとの間の第2および第3のポリペプチドの交換によって、即ち、1個または2個の新しい結合部位の非機能性の一部の集合によって生成され/活性化される。
従って、本発明は、単独の（片側のペアになっていない）不安定化（撹乱）変異の（ヘテロ）多量体ポリペプチドへの付加が、1つの単独の（片側のペアになっていない）不安定化（撹乱）変異を同様に含む第2の（ヘテロ）多量体ポリペプチドとのポリペプチド鎖交換を助長するために十分であって、それは、不安定化変異が交換および組換えによって誘引性の変異に変わるため、新しく形成される交換された（ヘテロ）多量体ポリペプチドの両方が、出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドと比較して改善された安定性（即ち、より低いCH3-CH3結合自由エネルギー）を有するためであるという所見に少なくとも一部分基づく。従うべき唯一の条件は、それぞれのポリペプチドが相互に会合した後、相互に相互作用する位置に、不安定化（撹乱）変異が導入されることである。
この方法論は、先に概説された基準を満たす任意の（ヘテロ）多量体ポリペプチドに適用され得る。
それにも関わらず、本発明による方法は、薬学分野において特に有用である。
当技術分野からは、（ヘテロ）多量体ポリペプチドの生成のための種々の方法が公知である。出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドの形成のために必要とされる変異が、本発明による交換反応のために必要とされる（撹乱）不安定化変異に干渉せずオーバーラップしない限り、これらの方法のうちの任意のものを使用することができる。
薬学分野に戻って、抗体は、最も広く使用されている結合物質のクラスである。抗体は、定常領域における相互作用、特に、重鎖のCH3ドメインの間の相互作用を介して、二量体化する。
従って、本発明は、CH3ドメインのペアの一方のCH3ドメインへの単一の不安定化変異の導入が、本発明による方法を実施するために十分であるという所見に少なくとも一部分基づく。より詳細には、第1の出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドの1個のCH3ドメインのみにおける357位における第1の不安定化変異、および第2の出発ポリペプチドの1個のCH3ドメインのみにおける370位における第2の不安定化変異の導入が、2個の出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドが空間的に接近した時の、これらの出発ポリペプチドの間のポリペプチド鎖の自発的な交換を助長することが見出された。得られる交換されたポリペプチドのうちの一つは、それぞれ357位および370位に変異を含むCH3ドメインペアを含み、それが、交換された（ヘテロ）多量体の安定化をもたらす。356位および439位における変異によっても、同様のことが達成され得る。全ての位置のナンバリングが、Kabat のEUインデックスに従う。一つの好ましい変異のペアは、E357KおよびK370Eである。もう一つの好ましい変異のペアは、D356KおよびK439Eである。当該残基は高度に保存されているため、本発明による方法は、任意のIgGサブクラス、即ち、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4に適用され得る。一つの好ましい態様において、CH3ドメインは、IgG1サブクラスのものである。
本発明は、出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドの形成および単離を可能にするために、出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖が、例えば、ジスルフィド結合を介して、相互に共有結合で連結されている必要はないという所見に少なくとも一部分基づく。より詳細には、出発ポリペプチドは、既にヘテロ二量体であるため、これらは、ヘテロ二量体化のためのさらなる変異を含むであろう。これらの変異は、単一の片側の特異的な不安定化（撹乱）変異の存在下ですら、出発ヘテロ二量体を安定化するために十分であることが見出された。従って、出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドにおける鎖の共有結合性の連結は、もはや必要とされない。従って、一つの態様において、ヒンジ領域を含有している出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドのケースにおいて、これらのヒンジ領域は、変異C226SおよびC229Sを含むか、またはCPXC（SEQ ID NO:95）配列全体の欠失を含む（Kabat EUインデックスに従うナンバリング）。
（ヘテロ）多量体出発ポリペプチドのFc領域を含む鎖の間のジスルフィド結合の省略のため、交換反応を開始するために、還元剤は必要とされない。これは、交換反応が温和なインビボ条件の下で起こることを可能にする。さらに、交換反応に干渉する（CH3ドメインを含むポリペプチドを共に共有結合させる）ことがない限り、出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドに、例えば、Fab断片に、他のジスルフィド結合が存在してもよい。
本発明は、交換された（ヘテロ）多量体ポリペプチド、例えば、機能性およびターゲティング結合部位のみを含むものが、交換反応後のみの、ジスルフィド結合の形成によってさらに安定化されてもよいという所見に少なくとも一部分基づく。例えば、（ヘテロ）多量体抗体の形成のための十分に確立されている変異は、ノブイントゥホール変異である。これらには、2種のバリアント：付加的なジスルフィド結合を含まないもの、および含むものが存在する。従って、一つの代替的な出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドは、出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドの形成のためのノブイントゥホール変異を含み、ターゲティング結合部位を保有するポリペプチド鎖にのみノブイントゥホールシステイン残基を提供する。従って、両方のターゲティング結合部位を含む交換された（ヘテロ）多量体ポリペプチドにおいてのみ、ジスルフィド結合の形成のために必要とされる両方のシステイン残基が、対応する適合する位置に存在する。従って、交換された生成物においてのみ、ジスルフィド結合が形成される。これは、交換された標的（ヘテロ）多量体ポリペプチドのさらなる安定化をもたらし、解離および/または逆反応を防止する。
「（ヘテロ）多量体」という用語は、本明細書中で使用されるように、部分的にまたは完全にアミノ酸配列が同一でなく、本発明の必要条件を満たす、少なくとも2本のポリペプチド鎖を含むポリペプチドを表す。3本以上のポリペプチド鎖を含むポリペプチドも、そのうちの少なくとも2本が本発明による（ヘテロ）多量体である限り、その用語に包含される。「多量体」という用語は、少なくとも3本のポリペプチド鎖を含み、そのうちの少なくとも2本が（ヘテロ）多量体であり、本発明の必要条件を満たす、ポリペプチドを示す。
「撹乱変異」という用語は、（ヘテロ）二量体ポリペプチドの不安定化をもたらす変異を表す。この不安定化は、一般に、アミノ酸残基の電荷を変化させることによって、例えば、正の電荷を有するアミノ酸残基を、負の電荷を有するアミノ酸残基に交換するか、またはその逆によって達成される。そのような交換は、CH3-CH3ドメイン界面の相互作用位置に類似の電荷をもたらし、従って、電荷反発をもたらす。一つの好ましい変異のペアは、E357KおよびK370Eである。もう一つの好ましい変異のペアは、D356KおよびK439Eである。さらに、当該残基は高度に保存されているため、本発明による方法は、任意のIgGサブクラス、即ち、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4に適用され得る。一つの好ましい態様において、CH3ドメインは、IgG1サブクラスのものである。
二量体安定性に対するCH3ドメイン変異の効果を査定する方法は、（参照によって本明細書中に組み入れられる）WO 2009/089004に開示されている。そこには、CH3-CH3ドメイン結合自由エネルギーを推定するためにEGADソフトウェアを使用する方法が概説されている（参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる、Pokala,N.and Handel,T.M.,J.Mol.Biol.347(2005)203-227も参照すること）：
EGADは、CH3ドメイン界面において作成された様々な変異の結合自由エネルギーを概略的に比較するために使用され得る。変異体の結合自由エネルギーは、ΔΔGmut＝μ(ΔGmut-ΔGwt)として定義される（mut＝変異体、wt＝野生型）。ここで、μ（一般に、＝0.1）は、実験的エネルギーと比較する時に、1の傾きを有するよう結合親和性の予測された変化を標準化するために使用される調整因子である。解離の自由エネルギー（ΔG）は、複合体（ΔG結合）と遊離状態（ΔG遊離）との間のエネルギー差として定義される。
本発明を、以後、具体的な例示的な出発材料、即ち、2/3-IgGによって例示する。これは、一般的な基本的概念の例示として提示されるものであって、本発明の限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、特許請求の範囲に示される。
図1は、本発明による方法において例示的な出発化合物として使用される2/3-IgGの設計およびモジュール組成を示す。2/3-IgGは、3本の個々の鎖から構成される：1本の軽鎖（通常、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む全長軽鎖）、1本の重鎖（通常、重鎖可変ドメインおよび全ての重鎖定常ドメインを含み、システイン残基を含むかまたは含まないヒンジ領域を含む全長重鎖）、ならびに1本の補完的な重鎖Fc領域ポリペプチド（通常、ヒンジの少なくとも一部およびCH2-CH3を含む重鎖Fc領域断片、ヒンジ領域はシステイン残基を含まない）。軽鎖および重鎖の可変ドメインは、機能性の結合部位、即ち、VH/VLペアを形成する。
本発明による方法において例示的な出発化合物として使用され得る2/3-BiFabの設計およびモジュール組成は、類似している。2/3-BiFabは、3本の個々の鎖から構成される：1本の軽鎖（通常、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む全長軽鎖）、1本の重鎖（通常、第1の重鎖可変ドメイン、CH1ドメイン、第2の可変ドメイン、およびCH3ドメインを含み、システイン残基を含むかまたは含まないヒンジ領域を含むバリアント全長重鎖）、ならびに1本の補完的な重鎖ポリペプチド（通常、ヒンジ-可変ドメイン-CH3を含む重鎖断片、ヒンジ領域はシステイン残基を含むかまたは含まない）。軽鎖の可変ドメインおよび重鎖の第1の可変ドメインは、機能性の結合部位、即ち、VH/VLペアを形成し、重鎖の第2の可変ドメインおよび補完的な重鎖Fc領域ポリペプチドの可変ドメインも、通常、非機能性である、即ち、結合コンピテントでないVH/VLペアを形成する。
（通常、ヒトIgG1サブクラスの）重鎖は、ノブイントゥホールFc領域ヘテロ二量体の形成を可能にするため、（i）ノブ変異もしくはホール変異（抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366Wが、「ノブ変異」として表され、抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366S、L368A、およびY407Vが、「ホール変異」として表される（Kabat EUインデックスに従うナンバリング））、または（ii）ノブ-cys-変異もしくはホール-cys-変異（抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366WおよびS354Cが、「ノブ-cys-変異」として表され、抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366S、L368A、Y407V、Y349Cが、「ホール-cys-変異」として表され；逆の設定：T366W/Y349CおよびT366S/L368A/Y407V/S354Cも同様に可能である（Kabat EUインデックスに従うナンバリング））のいずれかをCH3ドメインに含有している。
補完的な重鎖Fc領域ポリペプチドまたは補完的な重鎖ポリペプチドは、「ダミーFc」または「ダミーHC」として表されてもよく、即ち、VHおよびCH1が欠損しているIgG1誘導体は、N末端において、ヒンジ領域配列（またはその断片）から始まり、その後にCH2ドメインまたは可変ドメインを含み、その後にCH3ドメインを含み、任意で、精製タグ、例えば、His6タグまたはHis8タグまたはCタグをC末端に含む。さらに、この補完的なポリペプチドは、重鎖における変異に依って、ノブ変異またはホール変異のいずれかをCH3ドメインに含有している。ノブ変異またはホール変異に加えて、補完的なポリペプチドは、野生型配列と比べて1個の（即ち、単一の付加的な）または複数個の反発電荷を導入する少なくとも1個の撹乱（即ち、不安定化）変異を含む。例えば、それぞれ、変異K370EまたはK439Eと組み合わせられた、それぞれ、変異D356KまたはE357K（図2を参照すること）。そのような変異型重鎖Fc領域ポリペプチドは、以後、MHCFcRPとして表される。
重鎖およびMHCFcRPは、その中のノブイントゥホール変異の分布に依って、2つの型のヘテロ二量体を形成することができる：
（i）重鎖-ノブ::MHCFcRP-ホール、および
（ii）重鎖-ホール::MHCFcRP-ノブ。
従って、2/3-IgGおよび2/3-BiFabは、軽鎖が会合しているヘテロ二量体、即ち、ヘテロ三量体である。しかしながら、MHCFcRPにおける電荷変異は、適合するカウンターパートを重鎖に有していないため、これらは何らかの「欠陥」を有し、重鎖に存在する場合、MHCFcRPの電荷撹乱変異は、適合する重鎖カウンターパートを有していない。
2/3-IgGは、通常のIgGと類似した収率で発現され精製され得る、1価の、二量体化しない/凝集しない、1アーム抗体誘導体である（図3を参照すること）。これは、出発材料の1価性を保証する。2価2/3-IgGが使用される場合、これは、単一特異性であってもよいし、二重特異性であってもよい。
しかしながら、それらの欠陥2/3-IgGを構成するポリペプチドは、図4に示されるように、二重特異性抗体へ再配置され得る。
2種の出発分子の間の交換反応は、KiH（ノブイントゥホール）重鎖（H鎖）のよりよい相互補完性（電荷反発がなく、任意で、遊離のシステイン残基が存在する場合、ジスルフィド結合が形成される）、および2個のMHCFcRPのよりよい相互補完性によって駆動される。反応中、2種の出発分子のFc領域複合体は、2種のより有利な複合体を形成するため、解離し、ポリペプチドを交換する。これは、以下のように反応を駆動する：
2/3-IgG(A)-タグ＋2/3-IgG(B)-タグ
（出発ヘテロ二量体ポリペプチド）
→
bsAb(AB)＋MHCFcRP(A)-MHCFcRP(B)-タグ
（交換されたヘテロ二量体ポリペプチド）。
図4に図示される例において、出発2/3-IgG Aの重鎖（ノブ-cys）および出発2/3-IgG Bの重鎖（ホール-cys）は、適合する二重特異性抗体ヘテロ四量体（2×HC＋2×LC）を形成する。
このオンセル/インビボ状況において、ヒンジ領域ジスルフィド結合なしの2/3-IgGが使用されるため、還元工程は必要とされない。鎖再配置は自発的に起こる。
同様のことが2/3-BiFabにも当てはまる。
実施例1〜5を参照すること。
（B）1価および/または2価の単一特異性または二重特異性のIgG誘導体を、2価、3価、または4価の二重特異性、三重特異性、または四重特異性の抗体へ変換する方法
本発明による方法によって、異なる結合特異性を組み合わせることが可能であるのみならず、同時に、異なるフォーマットにおいて、異なる結合価で、これらの組み合わせを作製することも可能である。これは、以前のセクションにおいて概説された方法において使用される出発材料を拡張することによって達成される。
例えば、以前のセクションにおいて概説された2/3-IgGから出発して、MHCFcRPは不変のまま維持されるが、重鎖が異なるフォーマットで使用される。そのようなフォーマットは、例えば、C末端もしくはN末端のいずれかに1個の結合部位を有するか、または2個の結合部位（N末端に1個およびC末端に1個）を有する鎖であり得る（例については、図9および10を参照すること）。
この例においては、（例えば、N末端の結合部位、C末端の結合部位、またはN末端およびC末端の結合部位を含む）異なる出発フォーマットが、本発明による方法において相互に組み合わせられ、異なる結合価、異なる幾何学、および異なる三次元配置/個々の結合部位の位置を有する異なる抗体フォーマットの生成を可能にする（本例において9種、図11を参照すること）。
多重特異性抗体の生成のための交換を駆動する原理（欠陥インプット分子の、適合するアウトプット分子への変換）は変化しない。MHCFcRPsも保持される。従って、重鎖のみが変化させられる。
例えば、図1および9〜10は、9種の異なる二重特異性フォーマットをもたらすため、交換反応において、即ち、本発明による方法において相互に組み合わせられる3種の異なる出発分子（N末端の結合部位を含む2/3-IgG、C末端の結合部位を含む2/3-IgG、ならびにN末端およびC末端の結合部位を含む2/3-IgG）を示す。これらは、結合価、幾何学、および個々の結合部位の位置について異なっている。
この理論によって拘束はされないが、2種の異なる2/3-IgGまたは2/3-BiFabの欠陥ヘテロ多量体の一時的な分離に基づく交換反応は、優先的に適合するFc領域ヘテロ二量体を含有している生成物をもたらすと仮定される。従って、交換は、2/3-IgGを（異なるフォーマットの）4本鎖IgG、および対応するFc領域ヘテロ二量体へ変換する。
インビトロで、ヒンジ領域ジスルフィド結合が存在する場合には、交換反応は、鎖間ヒンジ領域ジスルフィド結合を破壊する還元工程によって開始されるが、ヒンジ領域ジスルフィド結合がなければ、オンセル/インビボ状況において、それを省略することができる。鎖再配置は自発的に起こる。
実施例6および7を参照すること。
（C）Fc-Fc鎖間ジスルフィド結合なし還元工程なしの反応
重鎖間ジスルフィド結合は、抗体を安定化し、ヒンジに接続されているFabアームの可動性を定義する。ヒンジ領域を含む出発抗体の交換アプローチは、交換反応の前または途中のこれらのジスルフィドの還元を必要とし、交換反応の完了時の還元剤の除去も必要とする（実施例3および7を参照すること）。
従って、ヒンジ領域を有するが、鎖間ジスルフィド結合を有していない出発分子の交換反応が、本明細書中に報告される。
これを例示するため、Fc領域における全てのジスルフィド結合が排除された2/3-IgGおよび2/3-BiFabを作製した。そのようなジスルフィド枯渇型2/3-分子は、これらの鎖間ジスルフィド結合なしですら、効果的に作製され精製され得ることが見出された（例えば、図15および20を参照すること）。そのようなジスルフィド結合枯渇型2/3-分子を出発分子として使用する時には、還元工程がもはや必要でないため、本発明による方法をインビボで実行することが可能であり、従って、これらの分子は、オンセル交換反応およびインビボ適用のために特に適している。これらのジスルフィド結合枯渇型の2/3-IgGおよび2/3-BiFabから作製された多重特異性抗体は、機能性であり、安定的であり、鎖間ジスルフィドなしで非共有結合性Fc-Fc相互作用によって集合している（図15および16を参照すること）。
従って、Fc-Fc鎖間ジスルフィドの排除は、還元および再酸化の必要なしに、即ち、生理学的条件下で、対応するFc領域の不適合によって駆動される交換反応を可能にする。これは、調製および（ハイスループット）スクリーニングの手法を容易にする。これは、ドメイン交換反応が、生理学的条件下で、例えば、生細胞の表面上で起こることも可能にする。
実施例8を参照すること。
一つの態様において、ヒンジ領域はジスルフィド結合を含まない。ジスルフィド結合なしのヒンジ領域は、SEQ ID NO:32の配列においてシステイン残基の代わりにセリン残基を含む。
ジスルフィド結合の除去の他に、さらに、ヒンジ領域が短縮されてもよい。個々の結合部位の間の異なる距離を提供する、そのような修飾型ヒンジ領域を使用することによって、二重特異性抗体を得ることができる（図51を参照すること）。従って、一つの態様において、ヒンジ領域は、SEQ ID NO:31（HTCPXCP、X＝SもしくはP）またはSEQ ID NO:95（HTSPXSP、X＝SもしくはP）またはSEQ ID NO:94（HTPAPE；SEQ ID NO:31のCPXCが欠失している）またはDKTHGGGGS（SEQ ID NO:97）のアミノ酸配列を有する。
III.本発明による方法
細胞の表面上で直接、意図された作用の部位において、新しい機能性、好ましくは、治療効果を有する機能性を生成するための、2種のディファレンシャルにターゲティングされた抗体プロドラッグ誘導体のオンセル組み立て/半抗体交換の方法が、本明細書中に報告される。
本発明による方法を、以後、具体的な例示的な出発材料、即ち、2/3-IgGおよび2/3-BiFabによって例示する。これは、一般的な基本的概念の例示として提示されるに過ぎず、本発明の限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、特許請求の範囲において示される。
（A）1価単一特異性抗体の2価IgGへのオンセル変換
1価抗体は、2価抗体と比較して、細胞表面との低下した結合コンピテンスを呈示し得る。この理論によって拘束はされないが、その理由は、細胞表面との見かけの親和性の、2価性によって誘導される増強、即ち、アビディティ効果であると仮定される。アビディティによって増強された細胞表面との結合および/または保持は、抗体の2個の結合部位/2本のアームによる同一の抗原/エピトープとの結合によって達成され得る。この単一特異性の設定において、2価結合は、低い抗原密度（両方のアームが結合する確率の低下）を有する細胞と比較して、大量の同族抗原（両方のアームが結合する確率の増加）を保持している細胞との結合特異性を増加させることができる。
アビディティによって増強される細胞表面上の結合および/または保持は、二重特異性抗体の異なる結合部位/異なるアームによる2種の異なる抗原との結合によっても達成され得る。この理論によって拘束はされないが、この二重特異性の設定において、2価結合は、（1個の結合部位/1本のアームのみが結合することができる）抗原のうちの1種のみを提示しかつ/または発現する細胞と比較して、（両方の結合部位/両方のアームが結合する）両方の抗原を提示しかつ/または発現する細胞との結合特異性の増加をもたらすと仮定される。
アビディティによって媒介される結合の改善に取り組むための最新テクノロジーは、2種の標的を認識する予め形成されたbsAbを応用する。特異性を達成するためには、1価での十分な結合強度によってアビディティ効果が無効になることを回避するため、各1価アームのある程度低い親和性を有することが必要である。その必要条件が満たされる場合、bsAbは、両方の抗原を提示しかつ/または発現する細胞と、増加した特異性で結合することができる。
現在利用可能なアビディティによって駆動される結合改善の概念の一つの欠点は、細胞表面上の両方の抗原の密度が、（両方が存在しアクセス可能である限り）予め形成されたbsAb自体の結合のための必須の必要条件ではないかもしれない点である。抗原密度は、抗原を発現する細胞に結合するbsAbの量を決定するに過ぎないかもしれない。
従って、極めて高い効力（および/または可能性のある毒性課題）を有するエンティティは、両方の標的抗原を高レベルに提示/発現する細胞にも、低レベルに提示/発現する細胞にも、結合し、影響するというリスクを保持している。例えば、固有のまたは付加された細胞傷害機能性を有するbsAbは、高い抗原レベルを呈示する腫瘍細胞に影響するのみならず、低い抗原レベルを有する非標的正常細胞にも影響する。
二重特異性抗体が1価の単一特異性抗体のオンセル変換によって形成される、本明細書中に報告される方法は、交換反応が、2種の単一特異性交換パートナーの物理的相互作用を必要とするため、先に概説された問題に取り組むために適用され得る。そのような相互作用の確率は、濃度依存性である、即ち、低濃度では相互作用および交換の確率が低く、濃度が増加すると、相互作用および交換の確率が高くなる。従って、例えば、異なる特異性を有する単一特異性抗体の別々の（連続的な）適用は、より大量の両方の抗原を呈示する細胞において、両方の単一特異性成分の（低い親和性による）蓄積の増加をもたらす。その結果、そのような細胞は、増加した濃度の個々の抗体を蓄積するのみならず、はるかに効果的にそれらをbsAbに変換するであろう。次に、それらのbsAbは、細胞表面抗原との2個の結合部位による高アビディティ結合のため、標的細胞上に保持され、交換されていない前駆体抗体は、解離するであろう。
（B）プロドラッグ機能性を有するBiFabの生成および機能性TriFabへのオンセル変換
本明細書中に報告される交換反応の駆動力は、「欠陥」CH3界面を有する2種のインプット分子の、適合するCH3界面を有する2種の生成物への変換である。これらのCH3界面を指定する設計は、MHCFcRPの組成にある。MHCFcRPは、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。しかしながら、MHCFcRPの特別な組成に寄与する変異は、全て、CH3ドメインに位置する。従って、MHCFcRPのCH2ドメインも、会合した重鎖のCH2ドメインも、他の異なるドメインに交換することが可能である。それらは、「欠陥」分子を生成するための重鎖-MHCFcRPヘテロ二量体化を未だ可能に（または、さらには支持）しなければならない。
IgG様分子のCH2ドメインを、ヘテロ二量体化を可能にする他のドメインに交換することが可能であることが、TriFabフォーマットで示された（WO 2016/087416；図18を参照すること）。TriFabは、CH2ドメインのそれぞれVHおよびVLへの交換のため、二重特異性の機能性を呈示する。そのような分子のFc様「ステム領域」は、完全なKiH CH3ドメインによって集合している。KiH CH3ドメインは、MHCFcRPの修飾型CH3ドメインと適合性であるため、それらは、交換を可能にする特色を有するMHCFcRP含有2/3-BiFab類似体の生成も可能にすることができる。
一方のCH2ドメインがVHドメインに交換され、他方が補完的なVLドメインに交換されているため、TriFabは、Fc領域のCH2ドメインの代わりに機能性のFvを保有している。2/3-BiFab誘導体は、（元CH2の位置に）無関係の、即ち、非同族のVHドメインまたはVLドメインを含むMHCFcRPを含有しており、即ち、これらは標的に結合しない。2/3-BiFabは、1本の機能性の1価結合アームを保持しており、さらに、第3の結合部位の半分をステム領域に含有している（図18を参照すること）。2種の補完的な2/3-BiFab分子の交換反応は、TriFabフォーマットを再構成するのみならず、「ステム位置」における付加的な第3の結合機能性の再構成（CH2交換）ももたらす。従って、交換反応は、2種の2/3-BiFabプロドラッグを完全に機能性のTriFabに変換する。
前記の2/3-IgGについて記載されたようなFc-Fc鎖間ジスルフィド結合（ヒンジ領域およびCH3ドメイン）の排除は、調節された還元および再酸化の必要なしに、MHCFcRPによって駆動される交換反応を可能にする。従って、生理学的条件の下で、具体的には、個々の（単一特異性）エンティティが標的細胞表面に結合している条件の下で、そのような分子の交換反応が起こることが可能である。同一の原理を適用して、2/3-BiFabは、機能性Fabアーム/機能性結合部位の結合によって、標的細胞上に蓄積する。（いずれも、結合不活性であるが、相互に補完的なステム-Fvを保持している）2種の補完的な2/3-BiFabが、同一の細胞の表面に結合した場合、鎖交換反応が細胞の表面上で直接起こる。この交換は、オンセル/インサイチュー/インビボで、即ち、意図された作用の部位において、細胞表面上で直接、少なくとも二重またはさらには三重の特異性を有する完全に機能性のTriFabを生成する。2/3-BiFabに由来するプロドラッグの活性化の原理は、十分な密度で1種または複数種の標的抗原を発現する細胞の表面上でのみ結合機能性を生成する。これは、（極めて高い効力および/または可能性のあるPKもしくは毒性の課題を含む）機能性の生成を、所望の細胞でのみ可能にする。
本発明の方法によって、細胞上で直接、高親和性（high affine）アビディティ結合物質を生成し、同時に、治療的な結合部位を活性化するため、低親和性（low affine）単一特異性結合物質を使用することが可能である。
IV.本発明による方法において使用するための多重特異性分子
（A）多量体ポリペプチド
本発明によるオンセル交換反応/方法において使用される多量体ポリペプチドは、
− 第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドであって、各々が、免疫グロブリンCH3ドメインおよび結合部位の非機能性の一部を含み、それによって、この結合部位の非機能性の一部が、両方のポリペプチドにおいてCH3ドメインのN末端側またはC末端側のいずれかに位置しており；ポリペプチドの少なくとも一方が、細胞表面標的、好ましくは、内部移行しない細胞表面標的に特異的に結合する機能性の結合部位を含む、前記第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含むこと、
− 第2のポリペプチドにおける変異を除き、不安定化された多量体ポリペプチドと同一の（多量体）ポリペプチドと比較して、多量体ポリペプチドの不安定化をもたらす（撹乱）変異をCH3ドメインの一方にのみ含むこと、
− ヘテロ二量体の形成のための変異を含むこと、ならびに
− 第1および第2のポリペプチドの間のジスルフィド結合の欠如
によって定義される。
従って、本発明は、（ヘテロ）多量体ポリペプチドにおける単独の（片側のペアになっていない）不安定化（撹乱）変異の付加が、単独の（片側のペアになっていない）不安定化（撹乱）変異を同様に含む第2の（ヘテロ）多量体ポリペプチドとのポリペプチド鎖交換を助長するために十分であって、それは、不安定化変異が交換および組換えによって誘引性の変異に変わるため、新しく形成される交換された（ヘテロ）多量体ポリペプチドの両方が、出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドと比較して改善された安定性（即ち、より低いCH3-CH3結合自由エネルギー）を有するためであるという所見に少なくとも一部分基づく。従うべき唯一の条件は、それぞれのポリペプチドが相互に会合した後に相互に相互作用する位置に、不安定化（撹乱）変異が導入されることである。
この方法論は、先に概説された基準を満たす任意の（ヘテロ）多量体ポリペプチドに適用され得る。
従って、本発明による方法において使用される多量体ポリペプチドは、さらなるドメインまたはポリペプチドを含んでいてよい。
本発明による多量体ポリペプチドは、一つの態様において、第1および第2のポリペプチドにおけるCH3ドメインのN末端側（直接的）またはC末端側（直接的）のいずれかに、免疫グロブリンCH2ドメインをさらに含む。一つの好ましい態様において、付加的な免疫グロブリンCH2ドメインは、CH3ドメインのN末端側にある。
一つの態様において、多量体ポリペプチドは、ヒンジ領域ならびに変異C226SおよびC229Sを含むか、またはCPXCなしのヒンジ領域（SEQ ID NO:95）配列（Kabat EUインデックスに従うナンバリング）を含むか、またはヒンジ領域を含まない。
当技術分野からは、（ヘテロ）多量体ポリペプチドの生成のための種々の方法が公知である。出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドの形成のために必要とされる変異が、本発明による交換反応のために必要とされる（撹乱）不安定化変異に干渉せずオーバーラップしない限り、これらの方法のうちの任意のものを使用することができる。
従って、本発明は、CH3ドメインのペアの一方のCH3ドメインへの単一の不安定化変異の導入が、本発明による方法を実施するために十分であるという所見に少なくとも一部分基づく。より詳細には、第1の出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドの一方のCH3ドメインのみにおける357位における第1の不安定化変異の導入、および第2の出発ポリペプチドの一方のCH3ドメインのみにおける370位における第2の不安定化変異の導入が、2種の出発（ヘテロ）多量体ポリペプチドが空間的に接近した時の、これらの出発ポリペプチドの間のポリペプチド鎖の自発的な交換を助長することが見出された。得られる交換されたポリペプチドのうちの1種は、それぞれ357位および370位に変異を含むCH3ドメインペアを含み、それが、交換された（ヘテロ）多量体の安定化をもたらす。356位および439位における変異によっても、同様のことが達成され得る。全ての位置のナンバリングが、Kabat のEUインデックスに従う。一つの好ましい変異のペアは、E357KおよびK370Eである。もう一つの好ましい変異のペアは、D356KおよびK439Eである。当該残基は高度に保存されているため、本発明による方法は、任意のIgGサブクラス、即ち、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4に適用され得る。一つの好ましい態様において、CH3ドメインは、IgG1サブクラスのものである。
一つの態様において、多量体ポリペプチドは、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第1の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアより選択される第1の抗体可変ドメイン、ならびに（b）第1のヒト免疫グロブリンG CH3ドメインであって、
第1のCH3ドメインが
（a）変異T366W、または
（b）変異T366S/L368A/Y407V
を含むもの、
ならびに
（ii）第1の抗体可変ドメインのN末端側または第1のCH3ドメインのC末端側のいずれかに、第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペア
を含む、第1のポリペプチドと、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第3の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアより選択される第2の抗体可変ドメイン、ならびに（b）第2のヒト免疫グロブリンG CH3ドメインであって、
第1の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインであり；または第1の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインであり、
第2のCH3ドメインが
（a）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含む場合、変異T366S/L368A/Y407V、または
（b）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含む場合、変異T366W
を含み、
第2のCH3ドメインが、D356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のCH3ドメインが
（a）撹乱変異がD356Kである場合、439位にアミノ酸残基K、または
（b）撹乱変異がE357Kである場合、370位にアミノ酸残基K、または
（c）撹乱変異がK370Eである場合、357位にアミノ酸残基E、または
（d）撹乱変異がK439Eである場合、356位にアミノ酸残基D
を含むもの、
ならびに
（ii）任意で、第2の抗体可変ドメインのN末端側または第2のCH3ドメインのC末端側のいずれかに、第2または第4の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペア
を含む、第2のポリペプチドと
を含み、全てのナンバリングは、Kabat EUインデックスに従う。
一つの態様において、多量体ポリペプチドは、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第1のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、ならびに（b）第1の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアより選択される第1の抗体可変ドメインであって、
第1のCH3ドメインが、
（a）変異T366W、または
（b）変異T366S/L368A/Y407V
を含むもの、
ならびに
（ii）第1のCH3ドメインのN末端側または第1の可変ドメインのC末端側のいずれかに、第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペア
を含む、第1のポリペプチドと、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第2のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、ならびに（b）第3の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアより選択される第2の抗体可変ドメインであって、
第1の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインであり；または第1の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインであり、
第2のCH3ドメインが
（a）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含む場合、変異T366S/L368A/Y407V、または
（b）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含む場合、変異T366W
を含み、
第2のCH3ドメインが、D356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のCH3ドメインが
（a）撹乱変異がD356Kである場合、439位にアミノ酸残基K、または
（b）撹乱変異がE357Kである場合、370位にアミノ酸残基K、または
（c）撹乱変異がK370Eである場合、357位にアミノ酸残基E、または
（d）撹乱変異がK439Eである場合、356位にアミノ酸残基D
を含むもの、
ならびに
（ii）任意で、第2のCH3ドメインのN末端側または第2の可変ドメインのC末端側のいずれかに、第2または第4の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペア
を含む、第2のポリペプチドと
を含み、全てのナンバリングは、Kabat EUインデックスに従う。
本発明の全ての局面の一つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、非共有結合性二量体である。
本発明の全ての局面の一つの態様において、第1の可変ドメインおよび第2の可変ドメインは、非機能性の結合部位を形成する。
本発明の全ての局面の一つの態様において、第1および第2のポリペプチドはそれぞれ、第1および第2の可変ドメインのN末端側に、アミノ酸配列DKTHTSPPS（SEQ ID NO:66）またはDKTHT（SEQ ID NO:94）またはGGGS（SEQ ID NO:69）またはDKTHGGGGS（SEQ ID NO:97）を含む。
本発明の全ての局面の一つの態様において
（i）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含み、439位にアミノ酸残基Kを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異D356Kおよび変異T366S/L368A/Y407Vを含むか、または
（ii）第1のCH3ドメインが変異を含み、370位にアミノ酸残基Kを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異E357Kおよび変異T366S/L368A/Y407Vを含むか、または
（iii）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含み、357位にアミノ酸残基Eを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異K370Eおよび変異T366Wを含むか、または
（iv）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含み、356位にアミノ酸残基Dを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異K439Eおよび変異T366Wを含む。
本発明の全ての局面の一つの態様において、第1、第2、および第3の標的は、異なる。
本発明の全ての局面の一つの態様において、第1の標的または第3の標的は、ヒトCD3である。
全ての局面の一つの態様において、第2の標的、および、存在する場合、第4の標的は、同一であるかまたは異なり、いずれも、同一の（標的）細胞の表面に位置している。
本発明の全ての局面の一つの態様において、第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアは、Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、CrossFab、二重特異性Fab、sdAb、およびVHHからなる群より選択される。
本発明の全ての局面の一つの態様において、第4の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアは、第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアとは独立に、Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、CrossFab、二重特異性Fab、sdAb、およびVHHからなる群より選択される。
本発明の全ての局面の一つの態様において、第1および第2のポリペプチドは、CH3ドメインのN末端側に免疫グロブリンG CH2ドメインをさらに含む。
本発明の全ての局面の一つの態様において、ヒト免疫グロブリンGは、ヒトIgG1またはヒトIgG2またはIgG3またはヒトIgG4である。
（B）本発明による方法において使用するための組成物
本発明による2種の多量体分子を含む組成物によって実施され得るオンセル交換反応/方法は、
−第3の多量体ポリペプチドおよび第4の多量体ポリペプチドを形成させるため、第2および第3のポリペプチドをクロスに交換するため、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む第1の（出発）多量体ポリペプチドと第3のポリペプチドおよび第4のポリペプチドを含む第2の（出発）多量体ポリペプチドとを細胞の表面上で近接させる工程
を含み、ここで、
（i）第2のポリペプチドは、第2のポリペプチドにおける変異を除き、第1の多量体ポリペプチドと同一である（多量体）ポリペプチドと比較して、第1の多量体ポリペプチドの不安定化をもたらす（第1の撹乱）変異を含み、
（ii）第3のポリペプチドは、第3のポリペプチドにおける変異を除き、第2の（多量体）ポリペプチドと同一である多量体ポリペプチドと比較して、第2の多量体ポリペプチドの不安定化をもたらす（第2の撹乱）変異を含み、
（iii）第2のポリペプチドにおける（第1の撹乱）変異および第3のポリペプチドにおける（第2の撹乱）変異は、第1の（出発）多量体ポリペプチドおよび/または第2の（出発）多量体ポリペプチドと比較して、第2のポリペプチドおよび第3のポリペプチドを含む第3の（交換された）多量体ポリペプチドの安定化をもたらし、
（iv）第4の（交換された）多量体ポリペプチドは、第1の（出発）多量体ポリペプチドおよび/または第2の（出発）多量体ポリペプチドと比較して安定化されており、
（v）第1の多量体ポリペプチドおよび第2の多量体ポリペプチドは、機能性でない、即ち、標的に結合することができない、1個または2個の新しい結合部位の一部のみを各々含み、
（vi）第3および/または第4の多量体ポリペプチドは、1個または2個の新しい機能性の結合部位を形成させるための、第1の多量体ポリペプチドと第2の多量体ポリペプチドとの間のポリペプチドの交換によって、即ち、1個または2個の新しい結合部位の非機能性の一部の集合によって生成され/活性化された、機能性の形態、即ち、それぞれの標的との特異的な結合を可能にする形態の1個または2個の新しい結合部位を含む。
本発明の一つの局面は、第1の本発明による多量体ポリペプチドおよび第2の本発明による多量体ポリペプチドを含む組成物であり、ここで、
第1の多量体ポリペプチドの第1のCH3ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインは、変異T366Wまたは変異T366S/L368A/Y407Vを含み、
第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異D356Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインがK439Eを含むか、または
第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異E357Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインがK370Eを含み、
第1の多量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第1の可変ドメインは、第1の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、
第1の多量体ポリペプチドの第2の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2の抗体可変ドメインは、第3の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、
第2および第4の標的は、相互に独立に、細胞表面抗原である。
本発明の全ての局面の一つの態様において、第1および/または第3の標的は、ヒトCD3である。
本発明の全ての局面の一つの態様において、組成物は、薬学的組成物であり、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
本発明の全ての局面の一つの態様において、組成物は、医薬として使用するためのものである。
（C）Fc領域変異体
ある特定の態様では、本明細書で提供される本発明による多量体ポリペプチドのFc領域に1つまたは複数のさらなるアミノ酸修飾を導入することにより、Fc領域変異体を生成させうる。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトFc領域配列（例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域）を含みうる。
ある特定の態様において、本発明では、全部ではなく一部のエフェクター機能を保有する本発明による多量体ポリペプチドの変異体が考えられる。これは、その2/3-IgG変異体を、インビボ半減期は重要であるが、ある特定のエフェクター機能（例えば補体およびADCC）は不必要であるか有害であるような応用にとって、望ましい候補にする。CDC活性および/またはADCC活性の低減/枯渇を確認するために、インビトロおよび/またはインビボ細胞傷害性アッセイを行うことができる。例えば、本発明による多量体ポリペプチドがFcγR結合を欠く（それゆえにおそらくはADCC活性を欠く）が、FcRn結合能は保っていることを保証するために、Fc受容体（FcR）結合アッセイを行うことができる。ADCCを媒介するための主要細胞であるNK細胞がFcγRIIIだけを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch,J.V.and Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9（1991）457-492の464頁のTable 3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、US 5,500,362（例えばHellstrom,I.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83（1986）7059-7063、およびHellstrom,I.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82（1985）1499-1502参照）、US 5,821,337（Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166（1987）1351-1361参照）に記載されている。あるいは、非放射性のアッセイ方法を使用してもよい（例えばフローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology,Inc.、カリフォルニア州マウンテンビュー）およびCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega、ウィスコンシン州マディソン）参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核球（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が挙げられる。これに代えて、またはこれに加えて、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えばClynes,R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95（1998）652-656に開示されているような動物モデルで、評価することもできる。抗体がC1qに結合することができず、したがってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合アッセイを行うこともできる（例えばWO 2006/029879およびWO 2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい）。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行うことができる（例えばGazzano-Santoro,H.et al.,J.Immunol.Methods 202（1996）163-171、Cragg,M.S.et al.,Blood 101（2003）1045-1052およびCragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103（2004）2738-2743を参照されたい）。FcRn結合およびインビボクリアランス/半減期の決定も、当技術分野において公知の方法を使って行うことができる（例えばPetkova,S.B.et al.,Int.Immunol.18（2006:1759-1769参照）。
低減したエフェクター機能を持つFc領域を含む本発明による多量体ポリペプチドとしては、Fc領域残基238、265、269、270、297、327および329のうちの1つまたは複数の置換を持つものが挙げられる（US 6,737,056）。そのようなFc領域変異型としては、残基265および297がアラニンに置換されているいわゆる「DANA」Fc領域変異型（US 7,332,581）を含めて、アミノ酸位置265、269、270、297および327のうちの2つ以上に置換を持つFc領域変異型が挙げられる。
ある特定の本発明による多量体ポリペプチドはFcRへの結合が改良または縮減されているFc領域変異体を含む（例えばUS 6,737,056、WO 2004/056312およびShields,R.L.et al.,J.Biol.Chem.276（2001）6591-6604を参照されたい）。
ある特定の態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、ADCCを改良する1つまたは複数のアミノ酸置換、例えばFc領域の298、333および/または334番目（残基のEUナンバリング）に置換を持つ、Fc領域変異体を含む。
いくつかの態様では、例えばUS 6,194,551、WO 99/51642およびIdusogie,E.E.et al., J.Immunol.164（2000）4178-4184に記載されているように、C1q結合および/または補体依存性細胞傷害（CDC）の改変（すなわち改良または縮減のどちらか）をもたらす改変が、Fc領域に加えられる。
増加した半減期を持ち、胎児への母体IgGの移行の原因となる新生児型Fc受容体（FcRn）（Guyer, R.L. et al., J.Immunol. 117（1976）587-593およびKim, J.K. et al., J.Immunol. 24（1994）2429-2434）に対する結合が改良されている抗体が、US 2005/0014934に記載されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を改良する1つまたは複数の置換を持つFc領域を含む。そのようなFc領域変異体として、Fc領域残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424または434のうちの1つまたは複数に置換を持つもの、例えばFc領域残基434の置換を持つものが挙げられる（US 7,371,826）。
Fc領域変異体の他の例については、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322（1988）738-740、US5,648,260、US5,624,821およびWO94/29351も参照されたい。
すべての局面の一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、
（i）両Fc領域ポリペプチド中に変異P329G、L234AおよびL235Aを持つヒトIgG1サブクラスのFc領域、または
（ii）両Fc領域ポリペプチド中に変異P329G、S228PおよびL235Eを持つヒトIgG4サブクラスのFc領域、または
（iii）両Fc領域ポリペプチド中に変異P329G、L234A、L235A、I253A、H310A、およびH435Aを持つか、または両Fc領域ポリペプチド中に変異P329G、L234A、L235A、H310A、H433A、およびY436Aを持つ、ヒトIgG1サブクラスのFc領域、または
（iv）両Fc領域ポリペプチドが変異P329G、L234AおよびL235Aを含み、かつ
（a）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368AおよびY407Vを含むか、または
（b）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびY349Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびS354Cを含むか、または
（c）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびS354Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407VおよびY349Cを含む
ヒトIgG1サブクラスのヘテロ二量体Fc領域、または
（v）両Fc領域ポリペプチドが変異P329G、S228PおよびL235Eを含み、かつ
（a）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366Wを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368AおよびY407Vを含むか、または
（b）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびY349Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407V、およびS354Cを含むか、または
（c）一方のFc領域ポリペプチドが変異T366WおよびS354Cを含み、他方のFc領域ポリペプチドが変異T366S、L368A、Y407VおよびY349Cを含む、
ヒトIgG4サブクラスのヘテロ二量体Fc領域、または
（vi）（i）、（ii）および（iii）のうちの1つと（iv）および（v）のうちの1つとの組合せ
を含む（位置はいずれもKabatのEUインデックスに従う）。
本明細書に掲載するすべての局面の一態様において、CH3ドメインを含む本発明による多量体ポリペプチドは、追加のC末グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）を含む。本明細書に掲載するすべての局面の一態様において、CH3ドメインを含む本発明による多量体ポリペプチドは、追加のC末グリシン残基（G446、ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）を含む。
本発明による多量体ポリペプチドは、一態様において、変異PVA236、L234A/L235Aおよび/またはGLPSS331（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を持つヒトサブクラスIgG1のFc領域であるかサブクラスIgG4のFc領域であることを特徴とするFc領域を含む。さらなる一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、E233、L234、L235、G236、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331および/またはP329（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）に少なくとも1つの変異を含有する任意のIgGクラス（一態様ではIgG1またはIgG4サブクラス）であるFc領域を含むことを特徴とする。さらなる一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、変異S228Pを含有するか、変異S228PおよびL235Eを含有する、ヒトIgG4サブクラスのFc領域（Angal, S., et al, Mol. Immunol. 30（1993）105-108）（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を含む。
本発明による多量体ポリペプチドに含まれるFc領域ポリペプチドのC末端は、アミノ酸残基PGKで終わる完全なC末端であることができる。C末端は、C末端アミノ酸残基のうちの1つまたは2つが除去された短縮型C末端であることができる。好ましい一態様において、C末端は、アミノ酸残基PGで終わる短縮型C末端である。
（D）ヘテロ二量体化
ヘテロ二量体化をサポートすることを目的とするCH3修飾のためのいくつかのアプローチは、例えばWO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954、WO2013/096291に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
通例、当技術分野において公知のアプローチでは、1つの操作（engineered）CH3ドメインを含む重鎖が同じ構造のもう一つの重鎖とはもはやホモ二量体化できない（例えば、CH3操作第1重鎖はもう一つのCH3操作第1重鎖とはもはやホモ二量体化できず、CH3操作第2重鎖はもう一つのCH3操作第2重鎖とはもはやホモ二量体化できない）ように、第1重鎖のCH3ドメインと第2重鎖のCH3ドメインがどちらも相補的に操作される。これにより、1つの操作CH3ドメインを含む重鎖は、相補的に操作されたCH3ドメインを含むもう一つの重鎖とヘテロ二量体化する。この態様のために、第1重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインと第2重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインは、第1重鎖Fc領域ポリペプチドと第2重鎖Fc領域ポリペプチドとがヘテロ二量体化し、第1重鎖Fc領域ポリペプチドおよび第2重鎖Fc領域ポリペプチドが（例えば立体的理由で）もはやホモ二量体化しないように、アミノ酸置換によって相補的に操作される。
重鎖ヘテロ二量体化をサポートするための当技術分野において公知の異なるアプローチは、本明細書に掲載されるヘテロ二量体/多量体ポリペプチド（例えば2/3-IgG）の提供に使用される異なる代替アプローチとして考えられる。
本発明による多量体ポリペプチドのCH3ドメインは、例えばWO96/027011、Ridgway, J.B., et al, Protein Eng. 9（1996）617-621およびMerchant, A.M., et al, Nat. Biotechnol. 16（1998）677-681にいくつか例を挙げて詳述されている「ノブ・イントゥ・ホールズ」技術によって、改変することができる。この方法では、2つのCH3ドメインの相互作用面が、それら2つのCH3ドメインを含有する両重鎖Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化が増加するように、改変される。（2つの重鎖Fc領域ポリペプチドの）2つのCH3ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、その場合、他方は「ホール」である。ヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16（1998）677-681、Atwell, S., et al., J.Mol.Biol. 270（1997）26-35）、本発明の交換反応における収率を増加させるために、ジスルフィド架橋を追加して導入することもできる。
好ましい一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、「ノブズ鎖」のCH3ドメイン中にT366W変異を含み、「ホール鎖」のCH3ドメイン中にT366S、L368A、Y407V変異を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。例えばノブズ鎖のCH3ドメインの1つにY349C変異を導入し、ホール鎖のCH3ドメインの1つにE356C変異またはS354C変異を導入することなどによって、CH3ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋も使用することができる（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16（1998）677-681）（本発明の交換反応では2種の多量体が出発材料として使用され、追加のジスルフィド結合が交換済み生成物においてのみ形成されるように、該多量体のCH3ドメインの1つだけが追加のシステイン残基を含む）。したがって、別の好ましい一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、第1多量体のCH3ドメインの1つにY349CおよびT366W変異を含み、かつ第2多量体のそれぞれの相補的CH3ドメインにE356C、T366S、L368AおよびY407V変異を含むか、または本発明による多量体ポリペプチドは、第1多量体のCH3ドメインの1つにY349CおよびT366W変異を含み、かつ第2多量体のそれぞれの相補的CH3ドメインにS354C、T366S、L368AおよびY407V変異を含む（一方のCH3ドメイン中の追加Y349C変異と、対応するCH3ドメイン中の追加のE356CまたはS354C変異とが、鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
ただし、上記に代えてまたは上記に加えて、EP 1 870 459 A1に記載されている他のノブズ-イン-ホール技術を使用することもできる。一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、「ノブズ鎖」のCH3ドメインにR409DおよびK370E変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメインにD399KおよびE357K変異を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、「ノブズ鎖」のCH3ドメインにT366W変異を、また「ホール鎖」のCH3ドメインにT366S、L368AおよびY407V変異を含み、さらに「ノブズ鎖」のCH3ドメインにR409DおよびK370E変異を、また「ホール鎖」のCH3ドメインにD399KおよびE357K変異を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、CH3ドメインの1つにY349CおよびT366W変異を含み、かつ相補的CH3ドメインにS354C、T366S、L368AおよびY407V変異を含むか、または本発明による多量体ポリペプチドは、CH3ドメインの1つにY349CおよびT366W変異を含み、かつ相補的CH3ドメインにS354C、T366S、L368AおよびY407V変異を含み、さらに「ノブズ鎖」のCH3ドメインにR409DおよびK370E変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメインにD399KおよびE357K変異を含む（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
「ノブ・イントゥ・ホール技術」とは別に、本発明による多量体ポリペプチドの重鎖のCH3ドメインを修飾してヘテロ二量体化を強制するための他の技法も、当技術分野では公知である。これらの技術、とりわけWO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954およびWO 2013/096291に記載されているものは、本明細書では、本発明による多量体ポリペプチドとの組合せで、「ノブ・イントゥ・ホール技術」の代替的選択肢として考えられる。
本発明による多量体ポリペプチドの一態様では、本発明による多量体ポリペプチドの第1重鎖および第2重鎖のヘテロ二量体化をサポートするために、EP 1 870 459 A1に記載のアプローチが使用される。このアプローチは、両者間の、すなわち第1重鎖と第2重鎖の間の、CH3/CH3ドメイン界面における特別なアミノ酸位置に、反対の電荷を持つ荷電アミノ酸を導入することに基づく。
したがってこの態様は、多量体の三次構造において、第1重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインと第2重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインとが、それぞれのCH3ドメイン間に位置する界面を形成し、第1重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインと第2重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、本発明による多量体ポリペプチドの三次構造において、それぞれ、該界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメイン中の界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸は正電荷アミノ酸で置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメイン中の界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第2のアミノ酸は負荷電アミノ酸で置換されている、本発明による多量体ポリペプチドに関する。この態様による多量体ポリペプチドを、本明細書では、「CH3（＋/-）操作多量体ポリペプチド」ともいう（ここで「＋/-」はそれぞれのCH3ドメインに導入された反対に荷電したアミノ酸を意味する）。
本発明によるCH3（＋/-）操作多量体ポリペプチドの一態様において、前記正荷電アミノ酸はK、RおよびHから選択され、前記負荷電アミノ酸はEまたはDから選択される。
本発明によるCH3（＋/-）操作多量体ポリペプチドの一態様において、前記正荷電アミノ酸はKおよびRから選択され、前記負荷電アミノ酸はEまたはDから選択される。
本発明によるCH3（＋/-）操作多量体ポリペプチドの一態様において、前記正荷電アミノ酸はKであり、前記負荷電アミノ酸はEである。
本明細書に掲載するCH3（＋/-）操作2/3-IgGの一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、409番目のアミノ酸RはDで置換され、370番目のアミノ酸KはEで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、399番目のアミノ酸DはKで置換され、357番目のアミノ酸EはKで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
本発明による多量体ポリペプチドの一態様では、多量体ポリペプチドの第1重鎖Fc領域ポリペプチドと第2重鎖Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2013/157953に記載のアプローチが使用される。本発明による多量体ポリペプチドの一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはKで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸LはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。本発明による多量体ポリペプチドの別の一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはKで置換され、351番目のアミノ酸LはKで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸LはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
本発明による多量体ポリペプチドの別の一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはKで置換され、351番目のアミノ酸LはKで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸LはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。加えて、他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインには、次に挙げる置換のうちの少なくとも1つが含まれている:349番目のアミノ酸YはEで置換されている、349番目のアミノ酸YはDで置換されている、および368番目のアミノ酸LはEで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。一態様において、368番目のアミノ酸LはEで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
本発明による多量体ポリペプチドの一態様では、本発明による多量体ポリペプチドの第1Fc領域ポリペプチドと第2Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2012/058768に記載のアプローチが使用される。本発明による多量体ポリペプチドの一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸LはYで置換され、407番目のアミノ酸YはAで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはAで置換され、409番目のアミノ酸KはFで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。別の一態様では、上述の置換に加えて、他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、411番目（元々はT）、399番目（元々はD）、400番目（元々はS）、405番目（元々はF）、390番目（元々はN）および392番目（元々はK）のアミノ酸のうちの少なくとも1つが置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。好ましい置換は
・N、R、Q、K、D、EおよびWから選択されるアミノ酸による411番目のアミノ酸Tの置換（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
・R、W、YおよびKから選択されるアミノ酸による399番目のアミノ酸Dの置換（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
・E、D、RおよびKから選択されるアミノ酸による400番目のアミノ酸Sの置換（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
・I、M、T、S、VおよびWから選択されるアミノ酸による405番目のアミノ酸Fの置換（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
・R、KおよびDから選択されるアミノ酸による390番目のアミノ酸Nの置換（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、ならびに
・V、M、R、L、FおよびEから選択されるアミノ酸による392番目のアミノ酸Kの置換（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）
である。
（WO 2012/058768に従って操作された）本発明による多量体ポリペプチドの別の一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸LはYで置換され、407番目のアミノ酸YはAで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはVで置換され、409番目のアミノ酸KはFで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。本発明による多量体ポリペプチドの別の一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、407番目のアミノ酸YはAで置換されており、他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはAで置換され、409番目のアミノ酸KはFで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。最後に挙げた態様では、該他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、392番目のアミノ酸KはEで置換され、411番目のアミノ酸TはEで置換され、399番目のアミノ酸DはRで置換され、400番目のアミノ酸SはRで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
本発明による多量体ポリペプチドの一態様では、本発明による多量体ポリペプチドの第1Fc領域ポリペプチドと第2Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2011/143545に記載のアプローチが使用される。本発明による多量体ポリペプチドの一態様では、両重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおけるアミノ酸修飾は、368番目および/または409番目に導入される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
本発明による多量体ポリペプチドの一態様では、本発明による多量体ポリペプチドの第1Fc領域ポリペプチドと第2Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2011/090762に記載のアプローチが使用される。WO2011/090762は「ノブ・イントゥ・ホール」技術によるアミノ酸修飾に関する。本発明によるCH3（KiH）操作多量体ポリペプチドの一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはWで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、407番目のアミノ酸YはAで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。本発明による該CH3（KiH）操作多量体ポリペプチドの別の一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸TはYで置換されており、他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、407番目のアミノ酸YはTで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
IgG2アイソタイプである本発明による多量体ポリペプチドの一態様では、本発明による多量体ポリペプチドの第1重鎖Fc領域ポリペプチドと第2重鎖Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2011/090762に記載のアプローチが使用される。
本発明による多量体ポリペプチドの一態様では、本発明による多量体ポリペプチドの第1Fc領域ポリペプチドと第2Fc領域ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2007/147901に記載のアプローチが使用される。本発明による多量体ポリペプチドの一態様では、一方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、253番目のアミノ酸KはEで置換され、282番目のアミノ酸DはKで置換され、322番目のアミノ酸KはDで置換されており、かつ他方の重鎖Fc領域ポリペプチドのCH3ドメインにおいて、239番目のアミノ酸DはKで置換され、240番目のアミノ酸EはKで置換され、292番目のアミノ酸KはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
本発明による多量体ポリペプチドの一態様では、本発明による多量体ポリペプチドの第1ポリペプチドと第2ポリペプチドのヘテロ二量体化をサポートするために、WO 2007/110205に記載のアプローチが使用される。
本明細書に掲載するすべての局面の一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、IgGタイプ抗体の定常ドメイン構造を有する。本明細書に掲載するすべての局面のさらなる一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、多量体ポリペプチドが、ヒトサブクラスIgG1のFc領域を含むか、または変異L234AおよびL235Aならびに任意でP329Gを持つヒトサブクラスIgG1のFc領域を含むことを特徴とする。本明細書に掲載するすべての局面のさらなる一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、多量体ポリペプチドが、ヒトサブクラスIgG2のFc領域を含むことを特徴とする。本明細書に掲載するすべての局面のさらなる一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、多量体ポリペプチドがヒトサブクラスIgG3のFc領域を含むことを特徴とする。本明細書に掲載するすべての局面のさらなる一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは、多量体ポリペプチドが、ヒトサブクラスIgG4のFc領域を含むか、または追加の変異S228PおよびL235Eならびに任意でP329Gを持つヒトサブクラスIgG4のFc領域を含むことを特徴とする。
すべての局面の一態様において、本発明による多量体ポリペプチドは第1Fc領域ポリペプチドと第2Fc領域ポリペプチドとを含み、
（i）第1Fc領域ポリペプチドおよび第2Fc領域ポリペプチドは変異Y436Aを含むか、または
（ii）第1Fc領域ポリペプチドおよび第2Fc領域ポリペプチドは変異I253A、H310AおよびH435Aを含むか、または
（iii）第1Fc領域ポリペプチドおよび第2Fc領域ポリペプチドは変異H310A、H433AおよびY436Aを含むか、または
（iv）第1Fc領域ポリペプチドおよび第2Fc領域ポリペプチドは変異L251D、L314DおよびL432Dを含むか、または
（v）第1Fc領域ポリペプチドは変異Y436Aを含み、かつ第2Fc領域ポリペプチドは
（a）変異I253A、H310AおよびH435A、もしくは
（b）変異H310A、H433AおよびY436A、もしくは
（c）変異L251D、L314DおよびL432D
を含むか、または
（vi）第1Fc領域ポリペプチドは変異I253A、H310AおよびH435Aを含み、かつ第2Fc領域ポリペプチドは
（a）変異H310A、H433AおよびY436A、もしくは
（b）変異L251D、L314DおよびL432D
を含むか、または
（vii）第1Fc領域ポリペプチドは変異H310A、H433AおよびY436Aを含み、かつ第2Fc領域ポリペプチドは
（a）変異L251D、L314DおよびL432D
を含む。
V.組換え方法および組成物
抗体は、例えば、US 4,816,567に記載されている、組換え方法および組成物を使用して生成され得る。一つの態様において、本明細書中に記載される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabをコードする単離された核酸が提供される。さらなる態様において、そのような核酸を含む1種または複数種のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一つの態様において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、ヒト胎児腎臓（HEK）細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Y0細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞）である。一つの態様において、先に提供された重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabをコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現のために適当な条件の下で培養する工程を含み、任意で、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabを、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収する工程を含む、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabを作成する方法が提供される。
重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabの組換え作製のためには、例えば、前記の、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabをコードする核酸が、単離され、さらなるクローニングおよび/または宿主細胞における発現のため、1種または複数種のベクターへ挿入される。
重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabをコードするベクターのクローニングまたは発現のために適当な宿主細胞には、本明細書中に記載された原核細胞または真核細胞が含まれる。
例えば、具体的には、グリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない時、抗体は細菌において作製され得る。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、US 5,648,237、US 5,789,199、およびUS 5,840,523を参照すること。（大腸菌（E.coli）における抗体断片の発現を記載している、Charlton, K.A., In:Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo,B.K.C.(ed.), Humana Press, Totowa, NJ(2003), pp.245-254も参照すること。）発現の後、抗体は、細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離され得、さらに精製され得る。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物、例えば、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的にまたは完全にヒトのグリコシル化パターンを有する重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabの産生をもたらす真菌株および酵母株も、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabをコードするベクターのための適当なクローニングまたは発現の宿主である。Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；およびLi,H. et al., Nat.Biotech. 24(2006)210-215を参照すること。
重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしのグリコシル化された2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしのグリコシル化された2/3-BiFabの発現のために適当な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫の細胞が含まれる。具体的には、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのため、昆虫細胞と共に使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も宿主として利用され得る。例えば、（トランスジェニック植物において抗体を作製するためのPLANTIBODIES（商標）テクノロジーを記載している）US 5,959,177、US 6,040,498、US6,420,548、US 7,125,978、および US 6,417,429を参照すること。
脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁増殖に適応した哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株のその他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）；ヒト胎児腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J.Gen Virol. 36(1977)59-74に記載されている293または293細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252に記載されているTM4細胞）；サル腎臓細胞（CV1）；アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76）；ヒト子宮頚癌細胞（HELA）；イヌ腎臓細胞（MDCK）；バッファローラット肝臓細胞（BRL 3A）；ヒト肺細胞（W138）；ヒト肝臓細胞（Hep G2）；マウス乳腺腫瘍（MMT 060562）；例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68に記載されているTRI細胞；MRC 5細胞；およびFS4細胞である。その他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR-CHO細胞（Urlaub, G.et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞；ならびにY0、NS0、およびSp2/0のような骨髄腫細胞株が含まれる。抗体作製のために適当なある種の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki,P.and Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2004),pp.255-268を参照すること。
VI.診断および検出のための方法および組成物
ある種の態様において、本明細書中に提供される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabのうちの任意のものが、生物学的試料中の標的の存在を検出するために有用である。「検出」という用語には、本明細書中で使用されるように、定量的または定性的な検出が包含される。ある種の態様において、生物学的試料は、細胞または組織を含む。
一つの態様において、診断または検出の方法において使用するための重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabが提供される。
ある種の態様において、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの標識された2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの標識された2/3-BiFabが提供される。標識には、（蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、および放射標識のような）直接検出される標識またはモエティが含まれ、例えば、酵素反応または分子相互作用を通して間接的に検出される酵素またはリガンドのようなモエティも含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的な標識には、放射性同位体32P、14C、125I、3H、および131I、希土類キレート化合物またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンのようなフルオロフォア、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（US 4,737,456）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類酸化酵素、例えば、グルコース酸化酵素、ガラクトース酸化酵素、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、HRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ（microperoxidase）のような色素前駆体を酸化するために過酸化水素を利用する酵素と共役した、ウリカーゼおよびキサンチン酸化酵素のような複素環酸化酵素、ビオチン/アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル等が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
VII.イムノコンジュゲート
本発明は、化学療法剤または化学療法薬のような1種または複数種の細胞傷害性薬剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物に由来するタンパク質毒素、酵素活性毒素、もしくはそれらの断片）、または放射性同位体にコンジュゲートされた、本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabを含むイムノコンジュゲートも提供する。
一つの態様において、イムノコンジュゲートは、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabが、マイタンシノイド（US 5,208,020、US 5,416,064、および EP 0 425 235 B1を参照すること）；モノメチルアウリスタチン薬物モエティDEおよびDF（MMAEおよびMMAF）（US 5,635,483、US 5,780,588、および US 7,498,298を参照すること）のようなアウリスタチン；ドラスタチン；カリチアマイシンまたはその誘導体（US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001、およびUS 5,877,296；Hinman,L.M.et al.,Cancer Res.53(1993)3336-3342；およびLode,H.N.et al.,Cancer Res.58(1998)2925-2928を参照すること）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンのようなアントラサイクリン（Kratz,F.et al.,Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey,S.C.et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov,M.Y.et al.,Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy,A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik,G.M.et al.,Bioorg.& Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King,H.D.et al.,J.Med.Chem.45（20029 4336-4343；およびUS 6,630,579を参照すること）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルのようなタキサン；トリコテシン；ならびにCC1065を含むが、これらに限定されるわけではない、1種または複数種の薬物にコンジュゲートされた抗体薬物コンジュゲート（ADC）である。
もう一つの態様において、イムノコンジュゲートは、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来の）外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、αサルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン（curcin）、クロチン（crotin）、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテシンを含むが、これらに限定されるわけではない酵素活性毒素またはそれらの断片にコンジュゲートされた、本明細書中に記載される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabを含む。例えば、1993年10月28日に公開されたWO 93/21232を参照すること。
もう一つの態様において、イムノコンジュゲートは、ラジオコンジュゲートを形成させるため、放射性原子にコンジュゲートされた、本明細書中に記載される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabを含む。多様な放射性同位体が、ラジオコンジュゲートの作製のために利用可能である。例には、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、およびLuの放射性同位体が含まれる。ラジオコンジュゲートが検出のために使用される時、それには、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えば、TC99mもしくはI123、またはヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄のような（磁気共鳴画像法、MRIとしても公知の）核磁気共鳴（NMR）画像法用のスピン標識が含まれ得る。
重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabと細胞傷害性薬剤とのコンジュゲートは、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）、イミノチオラン（IT）、（ジメチルアジポイミデートHClのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミンのような）ビスアジド化合物、（ビス(p-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミンのような）ビスジアゾニウム誘導体、（トルエン2,6-ジイソシアネートのような）ジイソシアネート、および（1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンのような）ビス活性フッ素化合物のような多様な二官能性カップリング剤を使用して作成され得る。例えば、リシンイムノトキシンは、Vitetta,E.S.et al.,Science 238(1987)1098-1104に記載されたように調製され得る。炭素14によって標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、放射性核種の抗体とのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。WO 94/11026を参照すること。リンカーは、細胞における細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari,R.V.et al.,Cancer Res.52(1992)127-131；US 5,208,020）が使用され得る。
本明細書中のイムノコンジュゲートまたはADCは、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、ならびに（例えば、Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.Aから）市販されているSVSB（スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート）を含むが、これらに限定されるわけではない架橋試薬によって調製されたそのようなコンジュゲートを明らかに企図するが、これらに限定されるわけではない。
本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabと、カリチアマイシン、マイタンシン（US 5,208,020）、トリコテン（trichothene）、およびCC1065のような1種または複数種の低分子毒素とのコンジュゲートも、本明細書中に企図される。本発明の一つの態様において、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabは、1個または複数個のマイタンシン分子（例えば、アンタゴニスト分子1個当たり約1〜約10個のマイタンシン分子）にコンジュゲートされる。マイタンシンを、例えば、May-SS-Meに変換することができ、それをMay-SH3に還元し、修飾型アンタゴニストと反応させて（Chari et al.Cancer Research 52:127-131(1992)）、マイタンシノイド-抗体コンジュゲートを生成することができる。
あるいは、本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabは、1個または複数個のカリチアマイシン分子にコンジュゲートされる。カリチアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル未満の濃度で二本鎖DNAブレークを作製することができる。使用され得るカリチアマイシンの構造類似体には、γ1I、α2I、α3I、N-アセチル-γ1I、PSAG、およびθI1（Hinman et al.Cancer Research 53:3336-3342(1993)およびLode et al.Cancer Research 58:2925-2928(1998)）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
本発明は、さらに、核酸分解活性を有する化合物（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ；DNaseのようなリボヌクレアーゼまたはDNAエンドヌクレアーゼ）とコンジュゲートされた、本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabを企図する。
あるいは、本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabと細胞傷害性薬剤とを含む融合タンパク質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作成され得る。
VIII.薬学的製剤
本明細書中に記載される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物の薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような2/3-IgGまたは2/3-BiFabを、1種または複数種の任意での薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.(ed.)(1980)）と混合することによって、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態に調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、利用される投薬量および濃度において、レシピエントに対して無毒であり、リン酸、クエン酸、およびその他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノールアルコール、ブチルアルコール、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールのような）保存剤；低分子量（約10残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリ(ビニルピロリドン)のような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、およびその他の炭水化物；EDTAのようなキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールのような糖；ナトリウムのような、塩を形成する対イオン；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；ならびに/またはポリエチレングリコール（PEG）のような非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されるわけではない。本明細書中の例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）、例えば、rhuPH20（HYLENEX（登録商標）、Baxter International,Inc.）のようなヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質のような間質薬物分散剤が含まれる。rhuPH20を含む、ある種の例示的なsHASEGP、および使用の方法は、US 2005/0260186およびUS 2006/0104968に記載されている。一つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼのような1種または複数種の付加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、US 6,267,958に記載されている。水性抗体製剤には、US 6,171,586およびWO 2006/044908に記載されたものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン酢酸緩衝剤を含む。
皮下投与に適応した凍結乾燥製剤は、WO 97/04801に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は、適当な希釈剤によって高いタンパク濃度に再構成され得、再構成された製剤は、本明細書中の処置される哺乳類へ皮下投与され得る。
本明細書中の製剤は、処置される特定の適応症のために必要な複数種の活性成分、好ましくは、相互に悪影響を及ぼさない補完的な活性を有する活性成分を含有していてもよい。そのような活性成分は、意図された目的のために有効な量で組み合わせられて適当に存在する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに捕捉されてもよい。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.(ed.)(1980)に開示されている。
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適当な例には、成形された物体、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態の、抗体を含有している固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)）、およびポリラクチド（US 3,773,919）、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）（乳酸グリコール酸コポリマーおよびリュープロリド酢酸塩から構成された注射可能なマイクロスフェア）のような分解性乳酸グリコール酸コポリマー、ならびにポリD-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
インビボ投与のために使用される製剤は、一般に、無菌である。無菌性は、例えば、無菌ろ過膜を通したろ過によって、容易に達成され得る。一つの態様において、製剤は、等張である。
IX.治療方法および組成物
本明細書中に提供される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物のうちの任意のものが、治療方法において使用され得る。
一つの局面において、医薬として使用するための重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物が提供される。ある種の態様において、処置の方法において使用するための重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物が提供される。前記の態様のいずれかによる「個体」は、好ましくは、ヒトである。
さらなる局面において、医薬の製造または調製における、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物の使用が、本明細書中に提供される。前記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
さらなる局面において、疾患を処置する方法が、本明細書中に提供される。一つの態様において、方法は、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物を、有効量、疾患を有する個体へ投与する工程を含む。一つのそのような態様において、方法は、以下に与えられるような少なくとも1種の付加的な治療剤を、有効量、個体へ投与する工程をさらに含む。前記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであり得る。
さらなる局面において、例えば、前記の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書中に提供される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または本明細書中に提供される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または本明細書中に提供される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物のうちの任意のものを含む薬学的製剤が、本明細書中に提供される。一つの態様において、薬学的製剤は、本明細書中に提供される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物のうちの任意のものと、薬学的に許容される担体とを含む。もう一つの態様において、薬学的製剤は、本明細書中に提供される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物のうちの任意のものと、例えば、以下に与えられるような少なくとも1種の付加的な治療剤とを含む。
本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物は、治療において、単独で使用されてもよいし、または他の薬剤と組み合わせて使用されてもよい。例えば、本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物は、少なくとも1種の付加的な治療剤と共投与されてもよい。
前述のそのような組み合わせ治療には、（2種以上の治療剤が同一のまたは別々の製剤に含まれる）組み合わせ投与、および別々の投与が包含され、それらのケースにおいて、本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物の投与は、付加的な治療剤の投与の前に、それと同時に、かつ/またはその後に行われ得る。本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物は、以下に限定されるわけではないが、当技術分野において公知の、神経学的障害を処置するかまたは防止するために適切な、放射線治療、行動治療、またはその他の治療のような他の介入治療と組み合わせて使用されてもよい。
本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物（および付加的な治療剤）は、非経口投与、肺内投与、および鼻腔内投与を含み、局所処置のために望まれる場合、病巣内投与を含む、任意の適当な手段によって投与されてよい。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。投薬は、一部分、投与が短期であるか慢性であるかに依って、任意の適当なルートによって、例えば、静脈内注射または皮下注射のような注射によってなされ得る。単回投与または様々な時点における複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これらに限定されるわけではない、様々な投薬スケジュールが、本明細書中で企図される。
本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物は、グッドメディカルプラクティス（good medical practice）に一致する様式で製剤化され、投薬され、投与されるであろう。これに関して考慮される因子には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳類、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、および医療従事者に公知のその他の因子が含まれる。重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物は、必ずではないが、任意で、当該の障害を防止するかまたは処置するために現在使用されている1種または複数種の薬剤と共に製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する治療剤の量、障害または処置の型、および前述のその他の因子に依る。これらは、一般に、本明細書中に記載されるのと同一の投薬量および投与ルートで、または本明細書中に記載された投薬量の約1〜99％で、または経験的に/臨床的に適切であると決定された任意の投薬量およびルートで使用される。
BBBを横切って化合物を輸送する、脂質に基づく方法には、BBBの血管内皮上の受容体に結合する1価結合エンティティとカップリングされたリポソームへの融合構築物または化合物の封入（例えば、US 2002/0025313を参照すること）、および低密度リポタンパク質粒子（例えば、US 2004/0204354を参照すること）またはアポリポタンパク質E（例えば、US 2004/0131692を参照すること）による1価結合エンティティのコーティングが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
疾患の防止または処置のため、（単独でまたは1種もしくは複数種の他の付加的な治療剤と組み合わせて使用される時の）本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物の適切な投薬量は、処置される疾患の型、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物の型、疾患の重症度および経過、抗体が防止目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに主治医の判断に依るであろう。重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物は、単回で、または一連の処置によって、患者へ適当に投与される。疾患の型および重症度に依って、約1μg/kg〜15mg/kg（例えば、0.5mg/kg〜10mg/kg）の抗体が、例えば、1回もしくは複数回の別々の投与によっても、または連続的な注入によっても、患者への投与のための初期候補投薬量であり得る。典型的な1日投薬量は、前述の因子に依って、約1μg/kg〜100mg/kgまたはそれ以上の範囲であり得る。数日以上にわたる反復投与については、条件に依って、一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、処置が継続されるであろう。抗体の一つの例示的な投薬量は、約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲内にあるであろう。従って、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、または10mg/kg（またはそれらの任意の組み合わせ）が、1回または複数回、患者へ投与され得る。そのような用量は、（例えば、患者が、約2〜約20回、または、例えば、約6回、抗体を受容するよう）断続的に、例えば、毎週または3週間毎に投与され得る。初期に比較的高い負荷用量が投与され、その後、より低い用量が、1回または複数回投与されてもよい。しかしながら、その他の投薬計画も有用であり得る。この治療の進行は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。
前記の製剤または治療方法のうちの任意のものが、重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgG、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFab、または重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-IgGもしくは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2種の異なる2/3-BiFabを含む組成物の代わりに、またはそれらに加えて、本明細書中に報告されるイムノコンジュゲートを使用して実施されてもよいことが理解される。
本明細書中に報告される重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-IgGまたは重鎖-重鎖間ジスルフィド結合なしの2/3-BiFabを含む組成物は、グッドメディカルプラクティスに一致する様式で製剤化され、投薬され、投与されるであろう。これに関して考慮される因子には、処置される特定の疾患または障害、処置される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、疾患または障害の原因、薬剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、および医療従事者に公知のその他の因子が含まれる。投与される治療的に有効な量は、そのような考慮によって管理されるであろう。
しかしながら、前述のように、これらの提唱された投与量は、多くの治療的判断を受ける。適切な用量およびスケジュールの選択における重大因子は、先に示されたような、得られる結果である。例えば、進行中の急性の疾患の処置のためには、初期に、比較的高い用量が必要とされ得る。最も有効な結果を得るためには、疾患または障害に依って、疾患もしくは障害の最初の兆候、診断、出現、もしくは発生に可能な限り近く、または疾患もしくは障害の寛解中に、アンタゴニストが投与される。
付加的な治療剤を抗体とコンジュゲートするための一般的な技術は、周知である（例えば、Arnon et al.,"Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy",in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Reisfeld et al.(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery",in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson et al.(eds.),pp.623-53(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",in Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera et al.(eds.),pp.475-506(1985)；およびThorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.,62(1982)119-58を参照すること）。
X.製品
本明細書中に報告されるもう一つの局面において、前記の障害の処置、防止、および/または診断のために有用な材料を含有している製品が提供される。製品は、容器と、容器上のまたは容器に付属したラベルまたはパッケージインサートとを含む。適当な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、IV溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックのような多様な材料から形成されていてよい。容器は、単独で、または状態の処置、防止、および/もしくは診断のために有効なもう一つの組成物と組み合わせて、組成物を保持し、無菌のアクセスポートを有していてよい（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも1種の活性薬剤は、本明細書中に報告される抗体である。ラベルまたはパッケージインサートは、組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを示す。さらに、製品は、（a）本明細書中に報告される抗体を含む組成物を含有している第1の容器；および（b）さらなる細胞傷害性薬剤またはその他の治療剤を含む組成物を含有している第2の容器を含んでいてもよい。この態様において、製品は、特定の状態を処置するために組成物が使用され得ることを示すパッケージインサートをさらに含んでいてよい。あるいは、またはさらに、製品は、注射用静菌水（BWFI）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液のような薬学的に許容される緩衝液を含む第2（または第3）の容器をさらに含んでいてもよい。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、および注射器を含む、商業的見地および使用者見地から望ましいその他の材料をさらに含んでいてもよい。
前記の製品のうちの任意のものが、本明細書中に報告される二重特異性抗体の代わりにまたはそれに加えて、本明細書中に報告されるイムノコンジュゲートを含んでいてもよいことが理解される。
XI.本発明の具体的な態様のセット
第1のセット：
1. 第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む多量体2/3-BiFabポリペプチドであって、
両方のポリペプチドがアミノ酸配列DKTHTSPPS（SEQ ID NO:66）、抗体可変ドメイン、およびヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメインを含み、
（i）第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
（i）第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、
第1のポリペプチドが少なくとも1個の機能性の結合部位または結合部位の少なくとも一部を含み、
第2のポリペプチドが少なくとも1個の撹乱変異をCH3ドメインに含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するそのアミノ酸配列（CH3ドメイン）内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含み、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが非共有結合性二量体であり、
第1のポリペプチドの可変ドメインおよび第2のポリペプチドの可変ドメインが非機能性の結合部位を形成する、
前記多量体2/3-BiFabポリペプチド。
2. 態様1による多量体2/3-BiFabポリペプチドであって、
第1のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン
を含むポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドであり、
第2のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ノブ変異またはホール変異を含むヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインが、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（CH3ドメイン）において相互作用するその（CH3ドメイン）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドである、
前記多量体2/3-BiFabポリペプチド。
3. さらなる軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチドをさらに含む、態様1〜2のいずれかによる多量体2/3-BiFabポリペプチドであって、第3のポリペプチドがジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、前記多量体2/3-BiFabポリペプチド。
4. 第1のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン
を含むポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第2のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
（i）第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
CH3ドメインが、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
CH3ドメインが、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第3のポリペプチドとして、さらなる軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドであって、該第3のポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、前記ポリペプチドと
を含む、第1のヘテロ三量体2/3-BiFabポリペプチド、ならびに
第1のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインが、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
CH3ドメインが、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2の撹乱変異を含み、それに従って、第2のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するその（CH3ドメイン）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第2のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン
を含み、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含むポリペプチドであって、
（i）第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである、
前記ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第3のポリペプチドとして、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドであって、第6のポリペプチドがジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、前記ポリペプチドと
を含む第2のヘテロ三量体2/3-BiFabポリペプチド
を含む組成物であって、
（i）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、それによって、（i）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドがホール変異を含むケースにおいて、第2のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがノブ変異を含み、または（ii）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドがノブ変異を含むケースにおいて、第2のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがホール変異を含み、
第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドおよび第2のヘテロ三量体の第1のポリペプチドが異なる位置に撹乱変異を含み、
第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドの可変ドメインおよび第2のヘテロ三量体の第2のポリペプチドの可変ドメインが機能性の結合部位を形成し、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドの可変ドメインおよび第2のヘテロ三量体の第1のポリペプチドの可変ドメインが非機能性の可変ドメインのペアを形成する、
前記組成物。
5. 第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む多量体2/3-IgGポリペプチドであって、
両方のポリペプチドがヒト免疫グロブリンCH3ドメインを含み、
（i）第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、
第1のポリペプチドが少なくとも1個の機能性の結合部位または結合部位の少なくとも一部を含み、
第2のポリペプチドが少なくとも1個の撹乱変異をCH3ドメインに含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（CH3ドメイン）野生型アミノ酸残基を含み、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが非共有結合性または共有結合性の二量体である、
前記多量体2/3-IgGポリペプチド。
6. 態様5による多量体2/3-IgGポリペプチドであって、
第1のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1の一部、任意で、第1のペプチドリンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、第2のペプチドリンカー、および結合ドメインの第2の一部であって、結合ドメインの第1の一部および結合ドメインの第2の一部が標的に特異的に結合する機能性の結合部位を形成するもの
を含むポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドであり、
第2のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ノブ変異またはホール変異を含むヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドである、
前記多量体2/3-IgGポリペプチド。
7. 軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチドをさらに含む、態様5または6のいずれかによる多量体2/3-IgGポリペプチドであって、第3のポリペプチドがジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、前記多量体2/3-IgGポリペプチド。
8. 第1のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン
（x）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1の一部、任意で、第1のペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、第2のペプチドリンカー、および結合ドメインの第2の一部であって、結合ドメインの第1の一部および結合ドメインの第2の一部が標的に特異的に結合する機能性の結合部位を形成するもの
を含み、ノブ変異またはホール変異を含む、ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第2のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインが、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第3のポリペプチドとして、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドと
を含む、第1のヘテロ三量体2/3-IgGポリペプチド、ならびに
第1のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインが、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
CH3ドメインが、E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2の撹乱変異を含み、それに従って、第2のポリペプチドが第2の撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するその（CH3ドメインの）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第2のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン
（v）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1の一部、任意で、第1のペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、第2のペプチドリンカー、および結合ドメインの第2の一部であって、結合ドメインの第1の一部および結合ドメインの第2の一部が標的に特異的に結合する機能性の結合部位を形成するもの
を含み、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含む、ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第3のポリペプチドとして、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドであって、該第3のポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、前記ポリペプチドと
を含む、第2のヘテロ三量体2/3-IgGポリペプチド
を含む組成物であって、
（i）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、それによって、（i）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドがホール変異を含むケースにおいて、第2のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがノブ変異を含み、または（ii）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドがノブ変異を含むケースにおいて、第2のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがホール変異を含み、
第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドおよび第2のヘテロ三量体の第1のポリペプチドが異なる位置に撹乱変異を含む、
前記組成物。
9. 態様5、6、および7のいずれかによる2/3-IgGを含むか、または態様1、2、および3のいずれかによる2/3-BiFabを含むか、または態様4および8のいずれかによる組成物を含み、任意で、薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的製剤。
10. 第1、第2、および第3の単量体ポリペプチドを含む第1のヘテロ三量体ポリペプチドと、第4、第5、および第6の単量体ポリペプチドを含む第2のヘテロ三量体ポリペプチドとを含む薬学的製剤であって、
第1、第2、第4、および第5の単量体ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、
（i）アミノ酸配列DKTHTSPPS（SEQ ID NO:66）、
（ii）第1の抗体可変ドメイン、および
（iii）ヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメイン
を含み、
（i）、（ii）、および（iii）が相互に独立に直接またはペプチドリンカーを介して相互にコンジュゲートされており、
（i）第1および第2の単量体ポリペプチド、ならびに（ii）第1および第4の単量体ポリペプチド、（iii）第2および第5の単量体ポリペプチド、ならびに（iv）第4および第5の単量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインが各々VH/VLペアであり、
（i）第1および第4の単量体ポリペプチド、ならびに（ii）第1および第2の単量体ポリペプチド、（iii）第2および第5の単量体ポリペプチド、ならびに（iv）第4および第5の単量体ポリペプチドのCH3ドメインが各々ノブイントゥホールペアであり、
第1の単量体ポリペプチドおよび第4の単量体ポリペプチドが相互に独立にscFvまたはscFabまたはFabを相互に独立にN末端およびC末端の一方または両方に各々含み
第2および第5の単量体ポリペプチドがそれぞれ、少なくとも1個の撹乱変異をCH3ドメインに含み、それに従って、第1の単量体ポリペプチドが第2の単量体ポリペプチドの撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するその（CH3ドメイン）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第4の単量体ポリペプチドが第5の単量体ポリペプチドの撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するその（CH3ドメイン）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第2の単量体ポリペプチドにおける撹乱変異が第5の単量体ポリペプチドにおける撹乱変異と同一のアミノ酸配列内の位置になく、それによって、第2の単量体ポリペプチドにおける撹乱変異および第5の単量体ポリペプチドにおける撹乱変異が、第2のポリペプチドおよび第5のポリペプチドがヘテロ二量体を形成する時、誘引性の（電荷）相互作用をもたらし、それによって、第2および第5の単量体ポリペプチドにおける撹乱変異が、それぞれ、第2の単量体ポリペプチドが第1の単量体ポリペプチドとヘテロ二量体を形成し、第5の単量体ポリペプチドが第4の単量体ポリペプチドとヘテロ二量体を形成する時、反発的な（電荷）相互作用をもたらし、
第1および第2の単量体ポリペプチドが非共有結合性二量体であり、第4および第5の単量体ポリペプチドが非共有結合性二量体であり、第3および第1の単量体ポリペプチドがジスルフィドによって連結された二量体であり、第6および第4の単量体ポリペプチドがジスルフィドによって連結された二量体であり、
第3および第6の単量体ポリペプチドが抗体軽鎖である、
前記薬学的製剤。
11. 態様10による薬学的製剤であって、
第1のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン
を含むポリペプチド
の群より選択され、
第3のポリペプチドが、さらなる軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドであり、該第3のポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、
前記薬学的製剤。
12. 態様10および11のいずれかによる薬学的製剤であって、第2のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
（i）第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
CH3ドメインが、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
CH3ドメインがE345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tの群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するその（CH3ドメイン）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択される、薬学的製剤。
13. 態様10〜12のいずれかによる薬学的製剤であって、第5のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインが、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
CH3ドメインがE345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C、およびW366Tからなる変異の群より選択される第2の撹乱変異を含み、それに従って、第5のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するその（CH3ドメイン）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第5のポリペプチドおける撹乱変異が第2のポリペプチドにおける撹乱変異と異なる位置にある、
前記ポリペプチド
の群より選択される、薬学的製剤。
14. 態様10〜13のいずれかによる薬学的製剤であって、第4のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン
を含み、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含む、ポリペプチド
の群より選択され、
（i）第1のポリペプチドの第1の可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第4のポリペプチドの第1の可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第1のポリペプチドの第1の可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第4のポリペプチドの第1の可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
第6のポリペプチドが、さらなる軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドであって、該第6のポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第4のポリペプチドと共有結合している、
前記薬学的製剤。
15. 態様10〜14のいずれによる薬学的製剤であって、第1のポリペプチドの第1の可変ドメインおよび第4のポリペプチドの第1の可変ドメインが機能性の結合部位を形成し、第2のポリペプチドの第1の可変ドメインおよび第5のポリペプチドの第1の可変ドメインが非機能性の可変ドメインのペアを形成する、前記薬学的製剤。
第2のセット:
1. N末端からC末端に向かって、抗体可変ドメインおよびヒト免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第1のポリペプチドと、
N末端からC末端に向かって、抗体可変ドメインおよびヒト免疫グロブリンG CH3ドメインを含む第2のポリペプチドと
を含む多量体ポリペプチドであって、
（i）第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
第2のポリペプチドが少なくとも1個の撹乱変異をCH3ドメインに含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するそのアミノ酸配列（CH3ドメイン）内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含み、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが非共有結合性二量体であり、
第1のポリペプチドの可変ドメインおよび第2のポリペプチドの可変ドメインが非機能性の結合部位を形成し、
第1のポリペプチドが機能性の結合部位をさらに含む、
前記多量体ポリペプチド。
2. 態様1による多量体ポリペプチドであって、第1および第2のポリペプチドがそれぞれ、可変ドメインのN末端側にアミノ酸配列DKTHTSPPS（SEQ ID NO:66）またはDKTHT（SEQ ID NO:94）またはGGGS（SEQ ID NO:69）またはDKTHGGGGS（SEQ ID NO:97）を含む、前記多量体ポリペプチド。
3. N末端からC末端に向かって、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメインおよび抗体可変ドメインを含む第1のポリペプチドと、
N末端からC末端に向かって、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメインおよび抗体可変ドメインを含む第2のポリペプチドと
を含む多量体ポリペプチドであって、
（i）第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
第2のポリペプチドが少なくとも1個の撹乱変異をCH3ドメインに含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するそのアミノ酸配列（CH3ドメイン）内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含み、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが非共有結合性二量体であり、
第1のポリペプチドの可変ドメインおよび第2のポリペプチドの可変ドメインが非機能性の結合部位を形成し、
第1のポリペプチドが機能性の結合部位をさらに含む、
前記多量体ポリペプチド。
4. 態様4による多量体ポリペプチドであって、第1および第2のポリペプチドがそれぞれ、CH3ドメインのN末端側にアミノ酸配列DKTHTSPPS（SEQ ID NO:66）またはGGGS（SEQ ID NO:69）またはDKTHT（SEQ ID NO:94）またはDKTHGGGGS（SEQ ID NO:97）を含む、前記多量体ポリペプチド。
5. 態様1〜4のいずれかによる多量体ポリペプチドであって、（i）第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含む、前記多量体ポリペプチド。
6. 態様1〜5のいずれかによる多量体ポリペプチドであって、（i）第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ-cys-変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール-cys-変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含む、前記多量体ポリペプチド。
7. 態様1〜6のいずれかによる多量体ポリペプチドであって、撹乱変異がD356K、E357K、K370E、およびK439Eを含む変異の群より選択される、前記多量体ポリペプチド。
8. 態様1〜7のいずれかによる多量体ポリペプチドであって、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメインがヒトIgG1 CH3ドメインまたはヒトIgG2 CH3ドメインまたはヒトIgG3 CH3ドメインまたはヒトIgG4 CH3ドメインである、前記多量体ポリペプチド。
9.態様1〜8のいずれかによる多量体ポリペプチドであって、
（i）第1のポリペプチドがノブ変異またはノブ-cys-変異を含み、第2のポリペプチドが撹乱変異D356Kおよびホール変異を含むか、または
（ii）第1のポリペプチドがノブ変異またはノブ-cys-変異を含み、第2のポリペプチドが撹乱変異E357Kおよびホール変異を含むか、または
（iii）第1のポリペプチドがホール変異またはホール-cys-変異を含み、第2のポリペプチドが撹乱変異K370Eおよびノブ変異を含むか、または
（iv）第1のポリペプチドがホール変異またはホール-cys-変異を含み、第2のポリペプチドが撹乱変異K439Eおよびノブ変異を含む、
前記多量体ポリペプチド。
10. 態様1〜9のいずれかによる多量体ポリペプチドであって、
第1のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、
（ii）任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、
（vi）任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（x）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（xiii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、
（xv）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（xvi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、および重鎖または軽鎖の可変ドメイン、
（xvii）軽鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、および重鎖または軽鎖の可変ドメイン、
（xviii）軽鎖可変ドメイン、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、および重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ならびに
（xiv）重鎖可変ドメイン、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、および重鎖または軽鎖の可変ドメイン
を含むポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドであり、
第2のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
（i）任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、または
（ii）任意で、SEQ ID NO:66または69または94または97、ヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、および重鎖または軽鎖の可変ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインがD356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（CH3ドメイン）において相互作用するその（CH3ドメイン）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドである、
前記多量体ポリペプチド。
11. 軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチドをさらに含む、態様1〜10のいずれかによる多量体ポリペプチドであって、第3のポリペプチドがジスルフィド結合によって第1のポリペプチドに共有結合している、前記多量体ポリペプチド。
12. 第1の態様1〜11のいずれかによる多量体ポリペプチドと第2の態様1〜11のいずれかによる多量体ポリペプチドとを含む組成物であって、
（i）第1の多量体ポリペプチドにおける撹乱変異がD356Kであり、第2の多量体ポリペプチドにおける撹乱変異がK439Eであるか、または
（ii）第1の多量体ポリペプチドにおける撹乱変異がE357Kであり、第2の多量体ポリペプチドにおける撹乱変異がK370Eである、
前記組成物。
13. 第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む多量体であって、
両方のポリペプチドがヒト免疫グロブリンCH3ドメインを含み、
（i）第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、
第1のポリペプチドが少なくとも1個の機能性の結合部位または結合部位の少なくとも一部を含み、
第2のポリペプチドが少なくとも1個の撹乱変異をCH3ドメインに含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（CH3ドメイン）野生型アミノ酸残基を含み、
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが非共有結合性または共有結合性の二量体である、
前記多量体。
14. 態様13による多量ポリペプチドであって、
第1のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、ならびに
（xii）結合ドメインの第1の一部、任意で、第1のペプチドリンカー、SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、第2のペプチドリンカー、および結合ドメインの第2の一部であって、結合ドメインの第1の一部および結合ドメインの第2の一部が標的に特異的に結合する機能性の結合部位を形成するもの
を含むポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドであり、
第2のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:65または66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ノブ変異またはホール変異を含むヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
D356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドである、
前記多量体ポリペプチド。
15. 軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第3のポリペプチドをさらに含む、態様13または14のいずれかによる多量体ポリペプチドであって、第3のポリペプチドがジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、前記多量体ポリペプチド。
16. 第1のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（v）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン
（x）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1の一部、任意で、第1のペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、第2のペプチドリンカー、および結合ドメインの第2の一部であって、結合ドメインの第1の一部および結合ドメインの第2の一部が標的に特異的に結合する機能性の結合部位を形成するもの
を含み、ノブ変異またはホール変異を含む、ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第2のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインが、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
D356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリン（IgG1）において相互作用するそのアミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン（IgG1）野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第3のポリペプチドとして、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドと
を含む、第1の多量体ポリペプチド、ならびに
第1のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインが、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
CH3ドメインが、D356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される第2の撹乱変異を含み、それに従って、第2のポリペプチドが第2の撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するその（CH3ドメインの）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第2のポリペプチドとして、
N末端からC末端に向かって、
（i）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および重鎖可変ドメイン、
（iv）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン
（v）第1の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（vi）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および軽鎖可変ドメイン、
（ix）重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（x）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1κまたはλ軽鎖定常ドメイン、
（xi）第1の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（xii）結合ドメインの第1の一部、任意で、第1のペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、ヒトIgG1 CH2ドメインに由来するCH2ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、第2のペプチドリンカー、および結合ドメインの第2の一部であって、結合ドメインの第1の一部および結合ドメインの第2の一部が標的に特異的に結合する機能性の結合部位を形成するもの
を含み、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含む、ポリペプチド
の群より選択されるポリペプチドと、
第3のポリペプチドとして、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドであって、該第3のポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、前記ポリペプチドと
を含む、第2の多量体ポリペプチド
を含む組成物であって、
（i）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含むか、または（ii）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドのCH3ドメインがホール変異を含み、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドのCH3ドメインがノブ変異を含み、それによって、（i）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドがホール変異を含むケースにおいて、第2のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがノブ変異を含み、または（ii）第1のヘテロ三量体の第1のポリペプチドがノブ変異を含むケースにおいて、第2のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがホール変異を含み、
第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドおよび第2のヘテロ三量体の第1のポリペプチドが異なる位置に撹乱変異を含む、
前記組成物。
17. 態様1〜15のいずれかによる多量体ポリペプチドを含むか、または態様16の組成物を含み、任意で、薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的製剤。
18. 第1、第2、および第3の単量体ポリペプチドを含む第1のヘテロ三量体ポリペプチドと、第4、第5、および第6の単量体ポリペプチドを含む第2のヘテロ三量体ポリペプチドとを含む薬学的製剤であって、
第1、第2、第4、および第5の単量体ポリペプチドがそれぞれ、N末端からC末端に向かって、
（i）アミノ酸配列DKTHTSPPS（SEQ ID NO:66）、
（ii）第1の抗体可変ドメイン、および
（iii）ヒト免疫グロブリン（IgG1）CH3ドメイン
を含み、
（i）、（ii）、および（iii）が相互に独立に直接またはペプチドリンカーを介して相互にコンジュゲートされており、
（i）第1および第2の単量体ポリペプチド、ならびに（ii）第1および第4の単量体ポリペプチド、（iii）第2および第5の単量体ポリペプチド、ならびに（iv）第4および第5の単量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインが各々VH/VLペアであり、
（i）第1および第4の単量体ポリペプチド、ならびに（ii）第1および第2の単量体ポリペプチド、（iii）第2および第5の単量体ポリペプチド、ならびに（iv）第4および第5の単量体ポリペプチドのCH3ドメインが各々ノブイントゥホールペアであり、
第1の単量体ポリペプチドおよび第4の単量体ポリペプチドが相互に独立にscFvまたはscFabまたはFabを相互に独立にN末端およびC末端の一方または両方に各々含み
第2および第5の単量体ポリペプチドがそれぞれ、少なくとも1個の撹乱変異をCH3ドメインに含み、それに従って、第1の単量体ポリペプチドが第2の単量体ポリペプチドの撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するその（CH3ドメイン）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第4の単量体ポリペプチドが第5の単量体ポリペプチドの撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するその（CH3ドメイン）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第2の単量体ポリペプチドにおける撹乱変異が第5の単量体ポリペプチドにおける撹乱変異と同一のアミノ酸配列内の位置になく、それによって、第2の単量体ポリペプチドにおける撹乱変異および第5の単量体ポリペプチドにおける撹乱変異が、第2のポリペプチドおよび第5のポリペプチドがヘテロ二量体を形成する時、誘引性の（電荷）相互作用をもたらし、それによって、第2および第5の単量体ポリペプチドにおける撹乱変異が、それぞれ、第2の単量体ポリペプチドが第1の単量体ポリペプチドとヘテロ二量体を形成し、第5の単量体ポリペプチドが第4の単量体ポリペプチドとヘテロ二量体を形成する時、反発的な（電荷）相互作用をもたらし、
第1および第2の単量体ポリペプチドが非共有結合性二量体であり、第4および第5の単量体ポリペプチドが非共有結合性二量体であり、第3および第1の単量体ポリペプチドがジスルフィドによって連結された二量体であり、第6および第4の単量体ポリペプチドがジスルフィドによって連結された二量体であり、
第3および第6の単量体ポリペプチドが抗体軽鎖である、
前記薬学的製剤。
19. 態様18による薬学的製剤であって、
第1のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン
を含むポリペプチド
の群より選択され、
第3のポリペプチドが、さらなる軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドであり、該第3のポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第1のポリペプチドと共有結合している、
前記薬学的製剤。
20. 態様18および19のいずれかによる薬学的製剤であって、第2のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
（i）第1のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第1のポリペプチドの可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第2のポリペプチドの可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
CH3ドメインが、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
CH3ドメインがD356K、E357K、K370E、およびK439Eの群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するその（CH3ドメイン）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含む、
前記ポリペプチド
の群より選択される、薬学的製剤。
21. 態様18〜21のいずれかによる薬学的製剤であって、第5のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン
を含むポリペプチドであって、
CH3ドメインが、第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のヘテロ三量体の第2のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含み、
CH3ドメインがD356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される第2の撹乱変異を含み、それに従って、第5のポリペプチドが撹乱変異におけるアミノ酸残基と野生型免疫グロブリンにおいて相互作用するその（CH3ドメイン）アミノ酸配列内のアミノ酸位置にヒト免疫グロブリン野生型アミノ酸残基を含み、それによって、第5のポリペプチドおける撹乱変異が第2のポリペプチドにおける撹乱変異と異なる位置にある、
前記ポリペプチド
の群より選択される、薬学的製剤。
22. 態様18〜21のいずれかによる薬学的製剤であって、第4のポリペプチドが、
N末端からC末端に向かって、
（i）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（ii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2の重鎖可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH1ドメイン、
（iii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の重鎖可変ドメイン、
（iv）scFv、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（v）scFab、任意で、ペプチドリンカー、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、およびヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、
（vi）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（vii）SEQ ID NO:66のヒンジ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（viii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（ix）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン、
（x）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFv、
（xi）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、およびscFab、
（xii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、および第2の軽鎖可変ドメイン、
（xiii）第2の重鎖可変ドメイン、第1のヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、ペプチドリンカー、第2の軽鎖可変ドメイン、および第2のヒトIgG1 CH1ドメイン、
（xiv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、第3の重鎖可変ドメイン、およびヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、ならびに
（xv）第2の重鎖可変ドメイン、ヒトIgG1 CH1ドメイン、SEQ ID NO:66のヒンジ領域、第1の重鎖または軽鎖の可変ドメイン、ヒトIgG1 CH3ドメインに由来するCH3ドメイン、任意で、ペプチドリンカー、ヒトκまたはλ軽鎖定常ドメイン、および第3の重鎖可変ドメイン
を含み、第1のポリペプチドがホール変異を含む場合、ノブ変異を含み、または第1のポリペプチドがノブ変異を含む場合、ホール変異を含む、ポリペプチド
の群より選択され、
（i）第1のポリペプチドの第1の可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合、第4のポリペプチドの第1の可変ドメインが重鎖可変ドメインであり、または（ii）第1のポリペプチドの第1の可変ドメインが重鎖可変ドメインである場合、第4のポリペプチドの第1の可変ドメインが軽鎖可変ドメインであり、
第6のポリペプチドが、さらなる軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含むポリペプチドであって、該第6のポリペプチドが、ジスルフィド結合によって第4のポリペプチドと共有結合している、
前記薬学的製剤。
23. 態様18〜22のいずれによる薬学的製剤であって、第1のポリペプチドの第1の可変ドメインおよび第4のポリペプチドの第1の可変ドメインが機能性の結合部位を形成し、第2のポリペプチドの第1の可変ドメインおよび第5のポリペプチドの第1の可変ドメインが非機能性の可変ドメインのペアを形成する、前記薬学的製剤。
以下の実施例、配列および図面は本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。記載した手順には、本発明の要旨から逸脱することなく、変更を加えることができると理解される。
本発明の方法において使用することができる例示的な2/3-IgGのデザインおよびモジュラー組成。 ノブ-cys重鎖とホール-cys重鎖の相互作用（上）およびノブ-cys重鎖とMHCFcRPの相互作用（中および下）。ジスルフィド共有結合は破線で示され、誘引的相互作用ペアは全円（full sphere）間の線で表され、反発的相互作用または結果的立体障害は、両方向に矢印がついている線で示されている。 図3A、3B、3C、および3D：MHCFcRPが異なる精製2/3-IgGのSECクロマトグラム。細胞培養上清からのプロテインA抽出後の2/3-IgG調製物のSECプロファイルが示されている。各プロファイルの主ピークは2/3-IgGを表す。フルオレセイン（fluos；抗fluos）またはビオチン（bio；抗bio）結合部位/特異性を持つもの（実施例2参照）。図3A：D356K（ホール）を有する；図3B：K370E（ノブ）を有する；図3C：E357K（ホール）を有する；図3D：K439E（ノブ）を有する。 2/3-IgGで例示される、本発明の交換反応によるbsAb（二重特異性抗体）の生成。 ヒンジ-ジスルフィド結合を（部分的に）還元するために、TCEP（2/3インプットIgGに対するモル当量倍数）が適用される。SECは、2/3-IgG出発分子、生成したbsAbおよび二量体型MHCFcRPを識別する。さまざまなTCEP濃度における反応をいずれも同じインキュベーション時間後に停止させた（三角形:bsAb、十字:2/3-IgG、菱形:二量体型MHCFcRP）。 反応がインビトロで行われる場合の所望のbsAb生成物からの望ましくない未反応インプット分子および副生成物の除去のスキーム。 図7A：交換反応のスキーム；図7B：NiNTA精製のSDS-page;NiNTA結合物（上側）はNiNTAから溶出させたタンパク質を表し、NiNTA素通り画分（下側）は、His-6タグもHis-8タグも含有しないタンパク質である;n.r.＝非還元、r.＝還元;M＝マーカー。 本発明の交換反応によって生成したbsAbの二重特異的機能性。二重特異性抗体の結合部位の同時結合の検出を可能にするブリッジングELISAによって機能性を評価した。ELISAプレートにコーティングされる抗原Aをフルオレセイン（fluos-BSA、FITC-BSA）とし、抗原Bを、その蛍光によって検出されるビオチン（bio-Cy5）とした。 重鎖のC末端に結合部位を持つ、2/3-IgG交換反応用の例示的2/3-IgG。 重鎖のN末端およびC末端に結合部位を持つ、2/3-IgG交換反応用の例示的2/3-IgG。 2/3-IgGで例示される、結合特異性とフォーマットとが異なる出発材料を使ったIgG交換反応により示される、本発明による方法の包括的な適用可能性。 例示的2/3-IgGを使った本発明の交換反応によって生成するさまざまなbsAbフォーマットマトリックス。フルオレセイン結合体およびビオシチンアミド（biocytinamid）結合体でマトリックスを生成させた。インプット分子および交換によるアウトプット分子を図11に示す。二重特異性結合機能性を検出するために捕捉抗原としてのfluos-BSAとbio-Cy5とを用いるブリッジングELISAによって、生成したbsAbの機能性を評価した。ブリッジングELISAに由来するシグナルは、すべてのフォーマットが二重特異性結合効力を有することを示している。 小型化された、ハイスループットおよび自動化に対応できるアプローチを用いる、交換反応によるbsAb多様性の生成および特性解析のためのマトリックス。 HTS技術を使った本発明方法の交換反応による二重特異性抗体形成。示されているのは、二重特異性抗体の形成を表す濃度依存的な蛍光シグナルを示す、例示的ブリッジングELISAのシグナルである。fluos-bioブリッジングELISA、十字:fluos［ホール/K370E］＋bio［ノブ/E357K］、菱形:bio［ホール/K370E］＋fluos［ノブ/E357K］。他のすべての曲線:コグネイト交換パートナーを持たない2/3IgGインプット分子（1つだけの結合部位が存在するため、ブリッジングシグナルを示さないもの）。 ヒンジ領域ジスルフィド結合およびCH3ドメイン鎖間ジスルフィド結合を持たない2/3-IgGで例示した本発明の交換反応のスキーム。これにより、還元剤を加えなくても、本発明の方法における鎖交換反応が可能になる。 鎖間ジスルフィド架橋を持たない2/3-IgGを、標準的IgGのように培養上清に分泌させ、標準的プロテインAアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、SDS-PAGEによって分析したところ、発現産物として所望の100kDa 2/3-IgGが確認された。これは、鎖間ジスルフィド架橋を持たない精製2/3-IgG誘導体の正しい組立てと、望ましくない二量体および凝集物の非存在とを証明している。（i）抗bio抗体軽鎖（SEQ ID NO:39）＋ヒンジ領域システイン残基を持たない抗bio抗体重鎖-ノブ（SEQ ID NO:57）＋ヒンジ領域システイン残基を持たないMHCFcRP-ホール-E357K（SEQ ID NO:62）（左に示す）と（ii）抗fluos抗体軽鎖（SEQ ID NO:42）＋ヒンジ領域ジスルフィド結合を持たない抗fluos抗体完全長重鎖-ホール（SEQ ID NO:60）＋ヒンジ領域システイン残基を持たないMHCFcRP-ノブ-K370E（SEQ ID NO:63）（右に示す）の精製。 ヒンジ領域ジスルフィド結合を持たない出発材料による本発明の交換反応の結果。2.5μM濃度のインプット分子が、陽性対照としての精製bsAbと共に、Fc領域鎖間ジスルフィド結合を持たない単一特異性2/3-IgGインプット分子での、鎖交換によるbsAb生成の成功を示している。 BiFabの設計および組成およびTriFabへの鎖交換原理。 図19Aおよび19B：2/3-BiFabの発現および精製：LeY-proDig(ノブ)-MHCFcRP(ホール)についての、図19A：KappaSelectプロファイル；図19B：SECプロファイルが、例示的に示される。 図20Aおよび20B：2/3-BiFabの発現および精製：SDS-Page；n.r＝非還元；r＝還元；L＝分子量マーカー。図20A：LeY-proDig(ノブ)-MHCFcRP(ホール)、LeY-proDig(ホール)-MHCFcRP(ノブ)、MSLN-proDig(ホール)-MHCFcRP(ノブ)；図20B：LeY-proCD3(ノブ)-MHCFcRP(ホール)、LeY-proCD3(ホール)-MHCFcRP(ノブ)、LeY-proCD-AG-2(ノブ)-MHCFcRP(ホール)、LeY-proCD-AG-2(ホール)-MHCFcRP(ノブ)。 出発分子および本発明による交換反応によって得られた分子に曝された細胞のFACS分析。 細胞表面における2/3-BiFab交換反応は、ステム領域における第3の結合部位（Fv）を再配置し、それによって、活性化する。 異なる抗原を標的とする異なるステム-Fvを含有しているTriFab様プロドラッグの、細胞結合型三重特異性TriFabへのオンセル変換。 CD3シグナリングレポーターアッセイによる、CD3結合機能性のオンセル活性化の検出の原理。 標的細胞における2/3-BiFab交換によるCD3結合機能性の活性化。 異なる抗原を標的とする2/3-BiFabプロドラッグの、完全に機能性の細胞結合型活性化三重特異性TriFabへのオンセル変換の原理。 異なる抗原を標的とする2/3-BiFabプロドラッグのオンセル変換。A431-H9細胞上のLeYおよびMSLNを標的とする抗体。37℃で6時間のインキュベーション。 完全に機能性の三重特異性エンティティへ再配置され得るプロドラッグ交換モジュールを含有しているTriFab誘導体。 完全に機能性の四重特異性エンティティへ再配置され得る単鎖プロドラッグ交換モジュールを含有している2/3-BiFab誘導体。 図30Aおよび30B：2人の異なるドナーに由来するPBMCおよびMCF7の抗LeY-proCD3 2/3-BiFabとの共培養。LDH放出は、細胞によって媒介される標的腫瘍細胞の死滅の指標として役立つ。図30A：ドナー1のPBMC；図30B：ドナー2のPBMC。 図31A：PBMCおよびA431細胞の抗EGFR-proCD3 2/3-BiFabとの共培養。図31B：PBMCおよびHELA細胞の抗AG-4-proCD3 2/3-BiFabとの共培養。LDH放出は、細胞によって媒介される標的腫瘍細胞の死滅の指標として役立つ。 図32A、32B、32C、32D、および32E：PBMCおよびHELAの4nMのモル濃度の抗AG-4-proCD3 2/3-BiFabとの共培養の後の上清中のサイトカイン量。図32A：IL-2量；図32B：IFNγ量；図32C：グランザイムB量；図32D：TNFα量；図32E：レジェンド。 HELA細胞上の表面抗原AG-4およびEGFRの発現レベル。 Jurkatレポーターアッセイにおける、それぞれのproCD3 2/3-BiFabによるAG-4およびEGFRの二重ターゲティング、ならびに得られたT細胞活性化。 完全に機能性のジゴキシゲニン結合エンティティおよびビオチン結合エンティティへ再配置され得、Dig-Cy5およびBio-488との結合によってFACSによって分析され得る、単鎖プロドラッグ交換モジュールを含有している2/3-BiFab誘導体。 図36Aおよび36B：TriFab誘導体変換時の細胞表面上の色素結合のFACS分析。図36A：Dig-Cy5；図36B：Bio-488。 完全に機能性のCD3結合物質およびCD-AG-2結合物質へ再配置され得る、単鎖プロドラッグ交換モジュールを含有している2/3-BiFab誘導体。 完全に機能性のCD3結合物質およびCD-AG-2結合物質へ再配置され得る、単鎖プロドラッグ交換モジュールを含有している2/3-BiFab誘導体は、CD3シグナリングレポーターアッセイにおいてT細胞を活性化する。 MHCFcRPに、可変断片（VHまたはVL）が備わっていてもよく、2/3-BiFab変換時に、副生成物としてCD-AG-2結合Fab分子を生成してもよい。 CD-AG-2-MHCFcRP副生成物のJurkat細胞表面との結合のFACS分析。 MHCFcRP内の2種のproCD3/proCD-AG-2可変領域と組み合わせられた、MHCFcRPへのターゲティングFabエンティティのN末端付加は、CD3およびCD-AG-2の結合を可能にする2つの型の三重特異性TriFabのオンセル組み立てをもたらす。 CD3シグナリングアッセイにおける三重特異性TriFabのT細胞活性化能力。 CH2ドメインを含有しており、従って、エフェクター機能コンピテントFc領域を含有している代替的な2/3-BiFabフォーマット；可変ドメインは、Fc領域のC末端に各々ある。 付加的なCH2ドメインを含有しており、従って、エフェクター機能コンピテントFc領域を含有している代替的な2/3-BiFabフォーマット；可変ドメインは、Fc領域とターゲティングFabとの間、またはN末端に、それぞれある。 CH2コンピテント2/3-BiFab分子のCH2依存性の結合を立証するため、分析用FcRnアフィニティクロマトグラフィが実施された。 図46Aおよび46B：CH2含有2/3-BiFabの適用時の細胞表面上のDig-Cy5結合のFACS分析。Dig結合部位は、それぞれのBiFabの両方の適用時にのみ変換される。上から下へ：MCF-7＋Dig-Cy5；ノブ遊離体；ホール遊離体；オンセルシャフリング/交換反応；生成物対照。図46A：Fc領域のC末端にある可変ドメイン；図46B：Fc領域とターゲティングFabとの間にある可変ドメイン。 機能性のCD3結合部位のオンセル生成のためのCH2含有BiFabの分子セットアップ。 T細胞レポーターアッセイは、CH2含有2/3-BiFabの、T細胞活性化を誘導する能力を明らかにする。KN＝ノブ；HL＝ホール。 図49A、49B、および49C：ネガティブ染色透過型電子顕微鏡（NS-TEM）分析は、2/3-BiFabの分子形状および可動性を明らかにする。図49A：抗AG-4-proCD3(ホール)-MHCFcRP(ノブ)；図49B：Ag-3-proCD3(ノブ)-MHCFcRP(ホール)；図49C：抗AG-4/CD3/AG-3抗体。 標的非依存性のシャフリングは高濃度（300nM）でのみ低レベルに起こる。 IgG1ヒンジ領域の修飾によって、即ち、ジスルフィド結合の除去によって、またはヒンジ領域の短縮によって、個々の結合部位の間の異なる距離を改変することができる。
実施例1
2/3-IgGのデザインおよびモジュラー組成
概論
図1に、本発明の方法において使用される2/3-IgGのデザインおよびモジュラー組成を示す。これらの2/3-IgGは、3つの個別の鎖、すなわち1つの軽鎖（通常は軽鎖可変ドメインと軽鎖定常ドメインとを含む完全長軽鎖）、1つの重鎖（通常は重鎖可変ドメインとヒンジ領域を含むすべての重鎖定常ドメインとを含む完全長重鎖）および1つの重鎖Fc領域ポリペプチド（通常はヒンジ-CH2-CH3を含む重鎖Fc領域断片）で構成される。軽鎖と重鎖の可変ドメインは機能的結合部位を形成する。重鎖（通常はヒトIgG1サブクラスに由来するもの）は、ノブ・イントゥ・ホールFc領域二量体の形成を可能にするために、CH3中にノブ-cys変異またはホール-cys変異のどちらかを含有する（抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366WおよびS354Cは「ノブ-cys変異」と表され、抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366S、L368A、Y407V、Y349Cは「ホール-cys変異」と表される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う））。重鎖Fc領域ポリペプチドは、いわゆる「ダミーFc」/MHCFcRP（下記参照）、すなわち、VHおよびCH1を欠き、N末端はヒンジ領域配列の少なくとも一部で始まり、His6タグをそのC末端に保持するIgG1誘導体である。加えて、2/3-IgGの重鎖Fc領域ポリペプチドはそのCH3ドメイン中にノブ変異またはホール変異のどちらか一方を含有する（抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366Wは「ノブ変異」と表され、抗体重鎖のCH3ドメインにおける変異T366S、L368A、Y407Vは「ホール変異」と表される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う））。ノブ変異またはホール変異に加えて、重鎖Fc領域ポリペプチドは、野生型配列に対して1つの（すなわち単一の追加）反発電荷を導入する不安定化変異、すなわちD356KまたはE357KまたはK370EまたはK439Eを含む：SEQ ID NO:35〜38。この変異型重鎖Fc領域ポリペプチドは以下の説明ではMHCFcRPと表される。
重鎖とMHCFcRPは、ノブ・イントゥ・ホール変異の分布に応じて、以下の2タイプのヘテロ二量体を形成することができる:
（i）重鎖-ノブ::MHCFcRP-ホール、および
（ii）重鎖-ホール::MHCFcRP-ノブ。
しかし、これらのヘテロ二量体には、多少の「欠陥」がある。というのも、相補的Fc領域が重鎖への鎖間ジスルフィド結合を形成するのに必要な追加のCH3システインを欠き、またこれらは適合する重鎖対応物がない電荷変異も含有するからである。
実施例2
2/3-IgGの発現および精製
2/3-IgGの発現は、軽鎖、重鎖（ノブ変異またはホール変異を持つもの）および適合するMHCFcRP（ホールまたはノブ）をコードするプラスミドを、最先端の技術で、哺乳動物細胞（例えばHEK293）に共トランスフェクトすることによって達成された。
より具体的には、例えば（HEK293細胞などにおける）一過性トランスフェクションによる2/3-IgGの生産には、CMVイントロンAプロモーターを持つもしくはCMVイントロンAプロモーターを持たないcDNA編成に基づくか、またはCMVプロモーターを持つゲノム構成に基づく、発現プラスミドを適用した。
抗体発現カセットの他に、プラスミドは、以下：
・大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、
・大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子、および
・真核細胞における選択可能マーカーとしてのハツカネズミ（Mus musculus）由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子
を含有した。
各抗体遺伝子の転写単位は以下の要素で構成された：
・5'端のユニークな制限部位、
・ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・cDNA編成の場合は、それに続くイントロンA配列
・ヒト抗体遺伝子の5'-非翻訳領域、
・免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・cDNA編成としての、またはゲノム編成としての（免疫グロブリンエクソン-イントロン編成が維持されている）、抗体鎖、
・ポリアデニル化シグナル配列を持つ3'非翻訳領域、および
・3'端のユニークな制限部位。
抗体鎖を含む融合遺伝子を、PCRおよび/または遺伝子合成によって生成させ、例えばそれぞれのプラスミド中のユニークな制限部位を使うなどして、一致する核酸セグメントを接続することにより、公知の組換え方法および組換え技法によって組み立てた。サブクローニングされた核酸配列はDNA配列決定によって検証した。一過性トランスフェクションのために、形質転換された大腸菌培養物からのプラスミド調製によって、より多量のプラスミドを調製した（Nucleobond AX、Macherey-Nagel）。
Current Protocols in Cell Biology（2000）, Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.and Yamada, K.M.（eds.）, John Wiley＆Sons, Incに記載されているように、標準的な細胞培養技法を使用した。
HEK293-Fシステム（Invitrogen）を製造者の説明書に従って使用する、それぞれのプラスミドの一過性トランスフェクションによって、2/3-IgGを生成させた。簡単に述べると、振とうフラスコまたは撹拌発酵槽中、無血清FreeStyle（商標）293発現培地（Invitrogen）において浮遊状態で成長するHEK293-F細胞（Invitrogen）に、それぞれの発現プラスミドと293fectin（商標）またはfectin（Invitrogen）との混合物をトランスフェクトした。2L振とうフラスコ（Corning）の場合、HEK293-F細胞を1.0×106細胞/mLの密度で600 mLに播種し、120 rpm、8％CO2でインキュベートした。翌日、細胞に、およそ1.5×106細胞/mLの細胞密度で、（A）600μgの総プラスミドDNA（1μg/mL）を含む20 mLのOpti-MEM（Invitrogen）と（B）20 ml Opti-MEM＋1.2 mL 293fectinまたはfectin（2μL/mL）との混合物約42 mLをトランスフェクトした。発酵中は、グルコース消費に応じて、グルコース溶液を加えた。正しく組み立てられた2/3-IgGは、標準的IgGのように、培養上清中に分泌された。分泌された2/3-IgGを含有する上清を5〜10日後に収穫し、2/3-IgGを上清から直接精製するか、または上清を凍結して保存した。
2/3-IgGはFc領域を含有するので、標準的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーを適用することによって、それらを精製した：2/3-IgGは、MabSelectSure-Sepharose（商標）（GE Healthcare、スウェーデン）およびSuperdex 200サイズ排除（GE Healthcare、スウェーデン）クロマトグラフィーを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製された。
簡単に述べると、滅菌濾過した細胞培養上清をPBS緩衝液（10 mM Na2HPO4、1 mM KH2PO4、137 mM NaClおよび2.7 mM KCl、pH 7.4）で平衡化したMabSelectSuRe樹脂上に捕捉し、平衡化緩衝液で洗浄し、pH 3.0の25 mMクエン酸ナトリウムで溶出させた。溶出した抗体画分をプールし、2 M Tris、pH 9.0で中和した。20 mMヒスチジン、140 mM NaCl、pH 6.0で平衡化したSuperdex 200 26/60 GL（GE Healthcare、スウェーデン）カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって、抗体プールをさらに精製した。2/3-IgG含有画分をプールし、Vivaspin限外濾過デバイス（Sartorius Stedim Biotech S.A.、フランス）を使って必要な濃度まで濃縮し、-80℃で保存した。
CE-SDSによる各精製工程後に、マイクロ流体Labchip技術（Caliper Life Science、米国）を使って、純度および完全性を分析した。HT Protein Express試薬キットを製造者の説明書に従って使用することで、タンパク質溶液（5μl）をCE-SDS分析用に調製し、HT Protein Expressチップを使って、LabChip GXIIシステムで分析した。データはLabChip GXソフトウェアを使って分析した。
例えば、対応するL鎖、H鎖およびMHCFcRPをコードするプラスミドの同時発現により、以下の2/3-IgGを生産した。
Figure 2021501181
対応するSECクロマトグラムを図3に示す。
実施例3
2/3-IgG交換反応による二重特異性抗体（bsAb）の生成
軽鎖、重鎖およびMHCFcRPを含有する2/3-IgGを、完全長重鎖-ノブ::MHCFcRP-ホールおよび完全長重鎖-ホール::MHCFcRP-ノブという2タイプのKiHヘテロ二量体で、生成させた。両タイプの2/3-IgGには多少の「欠陥」がある。というのも、MHCFcRPは重鎖への鎖間ジスルフィドを形成するのに必要な追加のCH3システインを欠き、MHCFcRPは適合する完全長重鎖における対応物がない電荷変異を含有するからである。しかし、これらの欠陥ヘテロ二量体を構成するモジュールは、図4に示すように、適合する電荷を持つ二重特異性ヘテロ二量体へと再編成する能力を有する。2/3-IgG Aの完全長重鎖（ノブ-cys）と2/3-IgG Bからの完全長重鎖（ホール-cys）は適合するヘテロ二量体を形成する。適合するヘテロ二量体はMHCFcRP（ホール-電荷）がMHCFcRP（ノブ-電荷）と相互作用した場合にも形成される。こうして、2つの異なる2/3-IgGの出発ヘテロ二量体の一時的な分離に基づく交換反応は、（電荷が）適合するヘテロ二量体を優先的に含有する生成物をもたらした。したがって交換反応は2種の単一特異性2/3-IgGを、1つの二重特異性IgGと1つのMHCFcRPヘテロ二量体とに変換した。
2/3-IgG（A）-His6（8）＋2/3-IgG（B）-His6（8）→bsAb（AB）＋Fc-His6（8）
交換反応は、とりわけヒンジ領域鎖間ジスルフィド結合を切るための（例えば2-MEAまたはTCEPをさまざまな濃度で適用することなどによる）還元工程によって開始された。その後は鎖再編成が自発的に起こった。
したがって、384ウェルREMP（登録商標）プレート（Brooks、＃1800030）上で、等モル量の抗フルオレセイン-2/3-IgGインプット分子と抗ビオシチンアミド-2/3-IgGインプット分子とを、表示のTCEP濃度を持つ総体積40μlの1×PBS＋0.05％Tween 20中、100μg/mlのタンパク質濃度で混合した。遠心分離後に、プレートをシールし、27℃で1時間インキュベートした。
次にビオチン-フルオレセイン・ブリッジングELISAを使って二重特異性抗体を定量した。したがって、ホワイトNunc（登録商標）MaxiSorp（商標）384ウェルプレートを1μg/mlアルブミン-フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲート（FITC、Sigma、＃A9771）でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。90μlのPBST緩衝液（PBST、二回蒸留水、10×PBS＋0.05％Tween 20）で3回洗浄した後、90μl/ウェルのブロッキング緩衝液（1×PBS、2％ゼラチン、0.1％Tween-20）を加え、室温で1時間インキュベートした。90μlのPBST緩衝液で3回洗浄した後、各交換反応の1:10希釈液25μlを、各ウェルに加えた。室温で1時間のインキュベーション後に、再びプレートを90μlのPBST緩衝液で3回洗浄した。0.5％BSA、0.025％Tween-20、1×PBS中のビオチン-Cy5コンジュゲート25μl/ウェルを、0.1μg/mlの最終濃度になるように加え、室温で1時間インキュベートした。90μlのPBST緩衝液で6回洗浄した後、25μlの1×PBSを各ウェルに加えた。Cy5蛍光はTecan Safire 2リーダーを使って670 nmの放出波長（励起は649 nm）で測定した。
図5は、2/3-IgG交換によるbsAbの生成に関する酸化還元条件の分析結果を示している。TCEPは、重鎖Fc領域ポリペプチド間の、すなわち完全長半IgGとMHCFcRPの間の、ヒンジ-ジスルフィド結合を（部分的に）還元するために適用される。鎖交換は、2/3-IgGインプット、bsAbアウトプットおよびMHCFcRP副生成物を識別するSECによって同定することができる。2/3-IgGとTCEPの比に依存する交換反応の収率を図5に示す（比較のためにすべての反応を同じ反応時間後に分析した）。
すべての2/3-IgG出発分子、すべての不要な副生成物および交換反応中に生成した可能性のあるすべての凝集物は、アフィニティータグ（His6またはHis8）を保持している。交換反応において生産された所望のbsAbは、Hisタグを担持していない唯一の分子である。それゆえに、望ましくない分子をすべて除去するために、単純なNiNTA吸収工程を適用した（図6および図7参照）。所望の機能性を持つbsAbを同定するために、残存bsAb（NiNTA吸収によって枯渇しなかったもの）をそのままスクリーニング手順に適用し、分析した。
実施例4
2/3-IgG交換反応によって生成した二重特異性抗体（bsAb）の機能的評価
2/3-IgG交換反応の生成物として生成したbsAbの二重特異的機能性をブリッジングELISAアッセイによって評価した。図8に、一例として、本明細書に掲載される交換反応によって生成した抗フルオレセイン/ビオシチンアミド二重特異性抗体に関する結合結果を示す。反応には、出発分子として、ビオシチンアミド（bio）結合2/3-IgGとフルオレセイン（fluos）結合2/3-IgGとを、使用した。抗fluos/bio二重特異性抗体のfluos結合アームは、fluos-BSAコートELISAプレートに結合する。続いてbio-Cy5に曝露すると、bsAbのbio結合アームを介したbio-Cy5のbsAbによる捕捉が起こった場合にのみ、シグナルが生成する。ブリッジングによるシグナルはbsAbでしか起こらず、単一特異性Fluos結合物質または単一特異性Bio結合物質のどちらかでは起こらないので、アッセイに2/3-IgGしか使用しない場合には、シグナルは観察されなかった。それゆえに、そしてまた交換反応が分子凝集を強いることはないので、このようなブリッジングELISAは、非bsAb分子のNiNTAによる枯渇を必要とすることなく、交換反応混合物で直接行うことができる。反応混合物を適用したときに観察されるシグナルにより、機能的bsAbの生成の成功とその存在が示された。ブリッジングELISAによるシグナル生成は、交換反応に使用したインプットエンティティの量に依存した。
実施例5
交換反応は、出発2/3-IgGの結合特異性またはV領域組成とは無関係に機能的である
2/3-IgGの生産および交換反応が、異なる抗体についてもそれらの特異性およびV領域組成とは無関係に機能するかどうか、そしてまた異なる抗体の組合せについても機能するかどうかを評価するために、さまざまな2/3-IgGを生産した。
したがって、ビオシチンアミド（bio）、ジゴキシゲニン（dig）、フルオレセイン（fluos）、LeY糖質（LeY）、VEGFおよびPDGFに対する結合特異性を持つ2/3-IgGを使用した。これらは、上述のように完全長軽鎖、ノブ-またはホール-完全長重鎖および変異型重鎖Fc領域ポリペプチドをコードする発現プラスミドの共トランスフェクションによって生産された。
Figure 2021501181
SEQ ID NO:49〜52に、dig、VEGF、PDGFおよびLeYに対する特異性を持つ2/3-IgGのVH-CH1領域を記載する。これらをSEQ ID NO:40およびSEQ ID NO:41のヒンジ-CH2-CH3領域に融合すること（すなわちbio VH-CH1領域を置き換えること）で、所望の特異性を持つ完全なH鎖を生成させた。これらの分子を生成させるために適用したMHCFcRPをSEQ ID NO:35〜38に列挙する。
これらの2/3-IgGはいずれも、匹敵する条件下で、標準的なIgGの場合と類似する収率で生産し、精製することができた（実施例2参照）。さまざまな結合特異性を持つこれらの2/3-IgGの発現に関する例を以下の表に示す。
Figure 2021501181
特異性が異なるbsAbを生成させるために適用したこの交換マトリックスでは、以下の表に示すすべての組合せで、フルオレセイン、ビオシチンアミド、VEGF、PDGFおよびジゴキシゲニンに対する結合特異性を持つ2/3-IgGの組合せを使用した。
Figure 2021501181
出発2/3-IgGの鎖交換と、所望する特異性の組合せを持つbsAbの生成を、さまざまなbsAbの特異性の組合せと合致する、プレートにコーティングされた抗原とシグナル生成抗原コンジュゲート/複合体とが適用されるブリッジングELISA（実施例4参照）によってモニターした。
さまざまなbsAb組合せの機能性を評価するために適用したブリッジングELISAの結果を以下の表に示す。捕捉抗原または検出抗原として存在する抗原のそれぞれのコグネイトペアを認識するbsAbだけが、ブリッジングELISAにおいてシグナルを生成する。マトリックスにおいて生成した他のbsAbは、少なくとも1つの特異性が存在しないために陰性である。
（表）ブリッジングELISAにより、生成したbsAbの機能性が確認される。1つのアッセイ内でのインプット分子濃度1.3μMにおける相対的シグナル強度が示されている。最も高い値が基準値として100％に設定されている。n.a.＝利用不可
Figure 2021501181
Figure 2021501181
Figure 2021501181
Figure 2021501181
Figure 2021501181
Figure 2021501181
VEGF含有二重特異性抗体について同じアッセイを行った。これらもそれぞれの組合せについてバックグラウンドレベルを上回るシグナルだけを示した。
本発明の交換反応は一般に利用可能な方法であり、交換反応は、出発分子の結合特異性にもV領域組成にも依存せずに機能的なbsAbをもたらすことがわかる。
実施例6
フォーマット変異体のデザイン、組成および生成
実施例4の2/3-IgG交換反応を、重鎖のC末端に1つの結合部位を有する出発分子またはN末端とC末端とに結合部位を持つ重鎖を有する出発分子へと拡張した。交換済みbsAbを生成させるために、交換を推進する原理（欠陥インプットヘテロ二量体から適合アウトプットヘテロ二量体への変換）には手を加えなかった。MHCFcRPの組成も上述のとおりに保った。
図1、9、および10は、異なるbsAbフォーマットを生成させるために適用した3つの2/3-IgGフォーマットのモジュラー組成を示す。2/3-IgGのうちの1つは、N末端位置に1つのFabアームを有する。2/3-IgGのうちの別の1つは、重鎖のC末端にフレキシブルなリンカーを介して取り付けられたFabアームを有する（すなわちN末端はヒンジ領域で始まる）。第3の2/3-IgGはC末端FabアームおよびN末端Fabアームを有する。
これらの2/3-IgG変異体の発現は、軽鎖、重鎖（ノブまたはホール）および対応するMHCFcRP（ホールまたはノブ）をコードするプラスミドを哺乳動物細胞（例えばHEK293）に共トランスフェクトすることによって達成された（実施例2参照）。
さまざまなbsAbフォーマットの生成に使用された、修飾された完全長重鎖の配列は以下のとおりである。
Figure 2021501181
2/3-IgGは標準的IgGのように培養上清に分泌され、標準的プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製された（実施例2参照）。サイズ排除および質量分析により、精製2/3-IgG変異体の正しい組立てと、望ましくない二量体および凝集物の非存在とが明らかになった。2/3-IgGの発現収率は同じ発現系では標準的IgGで観察されるものと類似していた。それぞれのデータを以下の表に提示する。
Figure 2021501181
実施例7
価数、化学量論およびジオメトリーが異なる複合的結合機能性を持つbsAbの特性解析
3つの異なる出発分子（N末端、C末端、N末端およびC末端結合部位を持つ2/3-IgG）を、本発明の交換反応において互いに組み合わせることで、9つの異なるbsAbフォーマットをもたらすことができる。これらは、価数、ジオメトリーおよび個々の結合部位の位置が異なる。これらの異なるbsAbを生成させるための交換反応を、実施例3に概説したものと同じ条件下で行った。
どのタイプのインプットフォーマットにも「欠陥」がある。というのも、MHCFcRPは重鎖への鎖間ジスルフィドを形成するのに必要な追加のCH3システインを欠き、またそれは、反発電荷変異（すなわち適合する完全長重鎖対応物がない電荷）を含有するからである。これらの「欠陥」ヘテロ二量体を構成する重鎖は、本発明の方法において、再編成することで（電荷およびジスルフィド）適合ヘテロ二量体を形成する。異なるタイプの完全長重鎖（ノブ-cysとホール-cys）は適合するヘテロ二量体を形成する。適合するヘテロ二量体はMHCFcRP（ホール-電荷とノブ-電荷）からも形成される。
この理論に拘泥するわけではないが、2つの異なる2/3-IgGの欠陥ヘテロ二量体の一時的な分離に基づく交換反応は、適合する電荷と、もし存在するのであれば、ジスルフィド結合を形成するためのシステイン残基とを持つ、完全に適合するヘテロ二量体を優先的に含有する生成物をもたらす。それゆえに交換は、単一特異性2/3-IgGを、（さまざまなフォーマットの）二重特異性IgGと、対応する（可変領域を含有しない、すなわち標的結合能を持たない）Fc領域ヘテロ二量体とに変換する。
交換反応を説明するために、インプット分子を以下のように名付ける：
・完全長重鎖（H鎖）の通常のN末端にFabアームを有する分子については「nAまたはnB」
・H鎖のC末端にFabアームを有する分子については「cAまたはcB」
・H鎖のN末端およびC末端にFabを持つ分子については「ncAまたはncB」。
さまざまなフォーマット交換反応は以下のとおりである:
Figure 2021501181
交換反応は、鎖間（ヒンジ領域）ジスルフィド結合を切るための還元工程によって開始され、その後は、鎖再編成が自発的に起こる。すべてのインプット分子、すべての副生成物および交換反応中に潜在的に形成されうるすべての凝集物はアフィニティータグ（例えばHis6タグまたはHis8タグ）を保持する。しかし、交換反応のbsAb生成物はアフィニティータグを担持せず、それゆえにアフィニティー（例えばNiNTA）吸収クロマトグラフィーによって分離することができる。（さまざまなフォーマットの）bsAbは、最適な機能性を持つさまざまなbsAbフォーマットを同定しランク付けするためのスクリーニング手順および分析にそのまま適用することができる。
384ウェルMTPフォーマットにおいて上述のインプット2/3-IgGを交換することによって、二重特異性フォーマットを生成させた後、ブリッジングELISAを行って機能的な組立てを評価した。したがって、総体積100μlの1×PBS＋0.05％Tween 20中で、等モル量（4μM）の交換パートナー（ホール-cys変異を含有する完全長重鎖とMHCFcRP-ノブ-K370Eとからなる2/3-IgG分子1、ノブ-cys変異を含有する完全長重鎖とMHCFcRP-ホール-E357Kとからなる2/3-IgG分子2）を混合した。384深底ウェルプレート（Greiner 384 masterblock（登録商標））において、タンパク質溶液を11回、1:2希釈した。この希釈系列からの各試料20μlを、384ウェルREMP（登録商標）プレート（Brooks、＃1800030）で、20μlの0.5 mM TCEP溶液と混合することで、200〜0.2μg/mlの最終タンパク質濃度および0.25 mM TCEPにした。遠心分離後に、プレートをシールし、37℃で1時間インキュベートした。
対照実施例として、片側にbio結合機能性を含有し、反対側にフルオレセイン結合機能性を含有するbsAbを使用した。結果として生じるbsAbの機能性を、ビオチン-フルオレセイン・ブリッジングELISAによって評価した。したがって、ホワイトNunc（登録商標）MaxiSorp（商標）384ウェルプレートを1μg/mlアルブミン-フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲート（Sigma、＃A9771）でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。90μlのPBST緩衝液（PBST、再蒸留水、10×PBS Roche ＃11666789001＋0.05％Tween 20）で3回洗浄した後、90μl/ウェルのブロッキング緩衝液（1×PBS、2％BSA、0.1％Tween 20）を加え、室温で1時間インキュベートした。90μlのPBST緩衝液で3回洗浄した後、各交換反応の1:4希釈液25μlを、各ウェルに加えた。室温で1時間のインキュベーション後に、再びプレートを90μlのPBST緩衝液で3回洗浄した。0.5％BSA、0.025％Tween 20、1×PBS中のビオチン-Cy5コンジュゲート25μl/ウェルを加えて最終濃度を0.1μg/mlとし、プレートを室温で1時間インキュベートした。90μlのPBST緩衝液で6回洗浄した後、25μlの1×PBSを各ウェルに加えた。Cy5蛍光はTecan Safire 2リーダーを使って670 nmの放出波長（励起は649 nm）で測定した。
さまざまなフォーマットの2/3-IgGの交換により、1つのフルオレセイン結合体と1つのビオシチンアミド結合体とを持つさまざまなbsAbフォーマットを生成させた。インプット分子および交換によるアウトプット分子を図11に示す。
捕捉抗原としてのfluos-BSAと、二重特異性ブリッジング結合機能性を検出するためのbio-Cy5とを用いるブリッジングELISAによって、図12に示すように、生成したbsAbの機能性を評価した。さまざまなフォーマットのすべてが、ブリッジングELISAシグナルをもたらす。
これらの結果は、本発明の方法を使って、鎖交換反応により、ロバストでハイスループットに対応できる方法で、さまざまなフォーマットを生成させることが可能であることを示している。
実施例8
2/3-IgG交換による機能的bsAbの生成と所望の機能性を持つbsAbのスクリーニング/同定は、小型化およびハイスループットならびに自動化技術に適合する
結合部位の配列および/またはフォーマットが異なる多数の異なるbsAbを扱うには、ハイスループットおよび自動化技術の応用が望ましく、多くの場合、それが必要である。そこで、本発明の2/3-IgG交換法によるbsAb生成およびそれによって生成した二重特異性抗体の機能性、すなわち二重特異的結合の分析/スクリーニングを、ハイスループットおよび自動化技術と適合するように小型化することができるかどうかを分析した。
そこで、348ウェルプレートにおいて、小型化された規模で、2/3-IgG交換反応を行い、反応生成物を分析した。
マトリックススクリーンは384ウェルMTPフォーマットで以下のように設定した：
総体積30μlの1×PBS＋0.05％Tween 20中で、等モル量（4μM）の交換パートナー（ホール-cys変異を含有する完全長重鎖とMHCFcRP-ノブ-K370Eとからなる2/3-IgG分子1、ノブ-cys変異を含有する完全長重鎖とMHCFcRP-ホール-E357Kとからなる2/3-IgG分子2）を混合した。384深底ウェルプレート（Greiner 384 masterblock（登録商標））において、タンパク質溶液を4回、1:3希釈した。この希釈系列からの各試料20μlを、384ウェルREMP（登録商標）プレート（Brooks、＃1800030）で、20μlの0.5 mM TCEP溶液と混合することで、2μM〜0.025μMの最終タンパク質濃度および0.25 mM TCEPにした。遠心分離後に、プレートをシールし、37℃で1時間インキュベートした。
次に、これによって生成したbsAbの機能性を、小型化されたハイスループットフォーマットでのブリッジングELISA（上記参照）によって評価した。すなわち、ホワイトNunc（登録商標）MaxiSorp（商標）384ウェルプレートを1μg/mlアルブミン-フルオレセインイソチオシアネート・コンジュゲート（Sigma、＃A9771）、1μg/ml PDGF（CST、＃8912）または1μg/ml VEGF121でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。90μlのPBST緩衝液（PBST、再蒸留水、10×PBS＋0.05％Tween 20）で3回洗浄した後、90μl/ウェルのブロッキング緩衝液（1×PBS、2％BSA、0.1％Tween 20）を加え、室温で1時間インキュベートした。90μlのPBST緩衝液で3回洗浄した後、各交換反応の1:4希釈液25μlを、各ウェルに加えた。室温で1時間のインキュベーション後に、再びプレートを90μlのPBST緩衝液で3回洗浄した。0.5％BSA、0.025％Tween 20、1×PBS中のビオチン-Cy5コンジュゲートまたはdig-Cy5コンジュゲート25μl/ウェルを加えて最終濃度を0.1μg/mlとし、プレートを室温で1時間インキュベートした。90μlのPBST緩衝液で6回洗浄した後、25μlの1×PBSを各ウェルに加えた。Cy5蛍光はTecan Safire 2リーダーを使って670 nmの放出波長（励起は649 nm）で測定した。VEGFまたはPDGFまたはdigまたはbioまたはfluosのいずれかに結合する2/3-IgGモジュールによる交換反応およびブリッジングELISA分析の詳細を図13に示す。例示的な分析の結果を図14に示す。これらの結果は、2/3-IgG交換反応とそれに続く機能分析をハイスループットおよび自動化技術で行うことができ、それらがハイスループットおよび自動化技術に適合することを実証している。
実施例9
1つの結合部位で第1抗原を標的とし、他の2つの結合部位でさらにもう一つの抗原を標的とする、3つの結合部位を持つbsAbの生成
本発明の方法はT細胞二重特異性抗体（TCB）の生成に使用することができる。これらは以前に述べられたようなフォーマットを有しうる（例えばWO 2013/026831参照）。TCB交換アプローチの場合、一方のH鎖（上述のようにノブ-cysを持つかまたはホール-cysを持つもの）は、そのヒンジのN末端にCD3結合性のCrossFab由来の実体を含有し、N末端は別の抗体に由来するターゲティング実体によってさらに延長されている。交換反応は、上述の条件と同じ条件下で実行され、CD3結合体と2つの追加結合体とを保持するTCBをもたらす。これらは標的細胞抗原に結合することができる。これらの分子は、T細胞上のCD3と標的（例えば腫瘍細）細胞上の抗原とに同時に結合することによって、標的細胞のキリングを誘導することができる。
実施例10
本発明による（ヒンジ領域およびCH3ドメイン中に）Fc領域鎖間ジスルフィド結合を持たない2/3-IgGのデザインおよび生成
Fc領域（ヒンジ領域）ジスルフィド含有2/3-IgGによる鎖交換は、鎖の分離とそれに続く所望のbsAbの組立てを可能にするために、初期工程として還元を必要とする。還元工程と、それに付随して還元剤を除去する必要とを回避するために、ヒンジ領域ジスルフィド結合を持たない2/3-IgGを生成させた。原理を図15に示す。ヒンジジスルフィド形成を担うヒンジ領域中のシステイン残基をセリンへの変異によって除去した。KiH関連ジスルフィド結合を形成する354番目または349番目のCH3-システインも省いた。それぞれのアミノ酸配列は次のとおりである。
Figure 2021501181
上記2/3-IgGの発現は、軽鎖、完全長重鎖（ノブまたはホール）および対応するMHCFcRP（ホールまたはノブ）をコードするプラスミドを、哺乳動物細胞（例えばHEK293）に共トランスフェクトすることによって達成された（実施例2参照）。2/3-IgGは標準的IgGのように培養上清に分泌され、その後、標準的プロテインAアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された（実施例2参照）。続いて、所望の100kDa 2/3-IgG発現生成物の、サイズ排除クロマトグラフィーおよびSDS-PAGEによる分析を行った（図16）。これにより、2/3-IgGの正しい組立てと、望ましくない二量体および凝集物の非存在とが証明される。これは驚くべきことである。このような分子は（ヒンジ領域でもCH3ドメインでも）Fc領域間のジスルフィドによって安定化されていないからである。Fc領域鎖間ジスルフィド結合を持たない抗fluos2/3-IgGおよび抗bio-2/3-IgGの精製収率を以下の表に提示する。
Figure 2021501181
実施例11
本発明の方法における、還元を伴わない2/3-IgG交換反応による機能的bsAbの生成
Fc領域鎖間ジスルフィド結合を含有しない2/3-IgGを、初期還元工程を省略した点以外は上述のように、鎖交換反応に供した（実施例3参照）。2/3-IgGは、fluos結合部位またはbio結合部位のどちらか一方と、完全長重鎖とMHCFcRPの間に鎖間ジスルフィド結合を持たないFc領域とを含有した。これらの2/3-IgGの組成および生産は実施例10で説明した。開始のための還元を伴わない交換反応に続いて、bsAbの二重特異的機能性を実証するために、ブリッジングELISAを行った。ブリッジングELISAは、固定化fluos-BSAへの交換反応生成物の添加と、それに続く洗浄工程、続いてbsAbの第2結合アームの存在を探るためのbio-Cys5の添加を含んだ（ブリッジングELISAの詳細については前述の実施例を参照されたい）。正しい、組み立てられた機能的bsAbだけが、それらのfluos結合部位によってアッセイプレートに結合することができ、保持され、bio-Cy5を捕捉し保持することによってシグナルを生成する。二重特異性を持たない分子はシグナルを生成しない。それらはプレートに結合しないか（bioのみを結合する物質）またはシグナルを生成するbio-Cy5を捕捉することができない（fluosのみを結合する物質）からである。これらの分析の結果（この実施例では精製bsAbを陽性対照として、2.5μMのインプット分子濃度で交換反応を行う）を図17に示す。これらの結果は、Fc領域鎖間ジスルフィド結合を持たない単一特異性2/3-IgGインプット分子を使った鎖交換によるbsAb生成の成功を実証している。初期還元を必要とすることなく、生産的な鎖交換が起こった。このようにFc領域ポリペプチド間ジスルフィド結合の除去により、初期還元工程の必要性は排除された。結果として生じるbsAbは非共有結合的Fc-Fc相互作用によって一つにまとまっている。このように、Fc-Fc鎖間ジスルフィドの排除は、還元の必要がない、対応するFc領域ミスマッチ推進型の交換反応を可能にし、それによりインビボ適用を可能にする。
実施例12
鎖交換反応は、部分的に不安定化された完全長重鎖-MHCFcRP界面によって推進される
2/3-IgGからbsAbへの変換の推進要因は、完全長重鎖とMHCFcRPの間の意図的な「欠陥」界面である。この人工的反発界面は、MHCFcRPのノブ-またはホール-CH3ドメインに導入された変異の結果である。2/3IgGの発現中、MHCFcRPは依然として、対応する（「通常の」）ノブパートナーまたはホールパートナーと会合する（上記実施例参照）。これらの分子は2/3-IgGを、望ましくない凝集傾向を伴わない正しく振る舞う分子として提示するのに十分な安定性を有する。
この理論に拘泥するわけではないが、bsAbをもたらす本発明の交換反応は、2つの相補的2/3-IgGが近接して、完全長抗体重鎖::MHCFcRPペアが隣り合わせに一部放出されたときに起こる。完全長抗体重鎖（CH3）界面は完全であるので、そのような条件下では、適合する、すなわち電荷反発のない、ノブ-ホール完全長重鎖の再組立てが、好まれるはずである。したがって、形成されるbsAbの完全長重鎖は、部分的に不完全な（電荷がミスマッチした）2/3-IgG分子の再形成よりも優先的に会合した状態を保つ。したがって、意図的な部分的不安定化（電荷反発）CH3界面は、指向的鎖交換反応の成功にとってキーパラメータである。
Fc界面の、とりわけCH3-CH3界面の、部分的不安定化は、完全長抗体重鎖上の相互作用残基を維持したまま、MHCFcRPのCH3残基を変異させることによって達成することができる。
MHCFcRPのCH3ドメインに導入することができて完全長抗体重鎖::MHCFcRP界面に影響を及ぼす例示的変異を、以下の表に掲載する。
Figure 2021501181
変異の一部には、改変された電荷を界面に入れる交換が含まれる。電荷変異は、以前に存在していた安定化電荷ペアを弱めもしくは破壊し、または反発効果をもたらし、またはその両方を生じる。
同様に、サイズが異なる側鎖を持つアミノ酸を導入することで、立体反発効果を生じさせることもできる。そのような変異は、既存の疎水性界面相互作用を弱めもしくは妨害し、または立体障害を生じさせ、またはその両方を併せ持つ。
電荷および/または立体効果によって部分的に不安定化する変異を互いに組み合わせることもできる。
さらにまた、そのMHCFcRPに導入された電荷および/または立体的改変を含有する第1の2/3-IgGを、そのMHCFcRPに導入された異なる電荷および/または立体改変であって、第1の2/3-IgGからのMHCFcRPの改変と合致するものを含有する第2の2/3-IgGと組み合わせることができる。
2/3-IgGおよび結果として生じるbsAbは、ペアになったCH3ドメインが片側にノブ変異を保持し、反対側にホール変異を保持するような形で集合する。それゆえに、MHCFcRPの対応するノブ残基またはホール残基の野生型組成への「復帰変異」は、やはり界面障害を生じる。ノブ-CH3ドメインまたはホール-CH3-ドメインと野生型ドメインとのそのような組合せを以下の表に列挙する。
Figure 2021501181
これらの復帰変異は、CH3-CH3界面を部分的に不安定化するために適用することができる。
これらの復帰変異は、前述の表に記載したものを含む他の撹乱変異と組み合わせて適用することもできる。
上述した部分的に撹乱性の個々の変異または変異の組合せはいずれも、それらが2/3-IgGを部分的に不安定化するが、交換反応の第2生成物であるノブ-MHCFcRP::ホール-MHCFcRPヘテロ二量体を安定化することにより、反応の平衡を生成物側（交換反応）へとさらにシフトさせるように、選ぶこともできる。
実施例13
本発明による1価2/3-IgG誘導体の2価bsAbへのオンセル変換
重鎖とMHCFcRPとの間の鎖間ジスルフィド結合を含まない2/3-IgG誘導体は、交換反応を開始するために還元を必要としない。従って、生理学的条件下でも、交換を達成することが可能であり、おそらく、個々の2/3-IgGが細胞表面に結合している時ですら可能である。2/3-IgGの機能性のFabアームが細胞表面に結合する場合、それらは標的細胞上に蓄積する。2種の補完的な2/3-IgGが同一の細胞の表面に結合する場合、細胞の表面上で直接、結合したまま、鎖交換が起こり得る。この交換は、細胞表面上で直接、二重の特異性を有する完全に機能性のbsAbを生成する。
このインサイチューオンセル鎖交換を証明するため、抗原LeYまたはHer1のいずれかに結合する2種の補完的な2/3-IgGを、高レベルのLeY、高レベルのHer1のいずれか、または高レベルの両方を呈示する細胞に適用する。個々に適用された2/3-BiFabが、同族抗原を発現する細胞に結合することは、FACS分析において示され得る。両方の2/3-BiFabの共適用（同時または連続）は、両方の抗原を発現する細胞との結合のみの増加をもたらす。これは、1価2/3-BiFab（プロドラッグ）のオンセル交換反応による、（アビディティによって媒介される結合改善を有する）機能性の2価bsAb生成物の生成の成功を示す。
実施例14
本発明による重鎖:MHCFcRPジスルフィド結合なしの2/3-BiFabの設計＆組成および機能性
TriFabは、IgG CH2ドメインの、それぞれVHおよびVLへの交換のため、二重特異性の機能性を保有している抗体誘導体である。そのような分子のFc様「ステム領域」は、完全なKiH CH3ドメインによって集合している。これは、潜在的に交換を可能にする特色を有するMHCFcRP含有BiFab類似体の生成を可能にする。図18は、MHCFcRP含有2/3-IgG-BiFab誘導体の設計および組成を示す。2/3-IgGと同一の一般原理を適用して、改変された2/3-BiFab類似体は、KiH重鎖と、CH2ドメインの代わりに無関係な抗体の補完的なVLドメインまたはVHドメインを保有し、適合するCH3 KiHドメインも保有しているMHCFcRPエンティティとから構成される。従って、2/3-IgGにおける重鎖およびMHCFcRPのCH2ドメインは、VHドメインまたはVLドメインのいずれかに交換されている。さらに、実施例1に記載された2/3-IgGとのさらなる違いとして、これらの2/3-BiFab誘導体の重鎖およびMHCFcRP-ステムは、（実施例10の2/3-IgG誘導体と類似の）重鎖:MHCFcRP共有結合性接続を促進するシステインを保有していない。2/3-BiFabは、（鎖間ジスルフィドなしの）2/3-IgGと同一の原理に基づき、交換モジュール、即ち、CH3ドメインを保有しているため、2/3-IgGについて記載され示されたのと同様に、交換反応が起こり得る。2/3-BiFabに関連した交換反応の一般原理は、図18に示される。2/3-BiFabを作製するために適用された軽鎖、ノブ重鎖またはホール重鎖、およびMHCFcRPのホール鎖またはノブ鎖の配列は、以下の通りである：
Figure 2021501181
実施例15
本発明による2/3-BiFabの発現＆精製
以前に記載された最新テクノロジー（WO 2016/087416）を介した、軽鎖、修飾型ステム重鎖（ノブまたはホール）、および適合するMHCFcRPステム（ホールまたはノブ）をコードするプラスミドの哺乳動物細胞（例えば、HEK293）へのコトランスフェクションによって、2/3-BiFabの発現を達成した。2/3-BiFabは、標準的なIgGと同様に、培養上清へ分泌される。CH2ドメインの欠損による、機能性のFc領域の欠如のため、図19および20に示されるように、標準的なタンパク質L（KappaSelect）アフィニティクロマトグラフィによって、2/3-BiFabを精製した。（不適合のVHおよびVLから構成されているため）機能性のV領域をステム領域に保有していないにも関わらず、また、鎖の共有結合性の接続のための鎖間ジスルフィドを含有していないにも関わらず、2/3-BiFabが効果的に作製され精製され得ることは、驚くべきことである。サイズ排除分析およびネイティブ質量分析は、精製された2/3-BiFab誘導体の正確な組み立てを示し、不要の二量体および凝集物の欠如も示した。最適化されていない一過性発現条件の下での2/3-BiFabの発現収率は、以下の表にリストされる。
Figure 2021501181
実施例16
本発明による還元なしの鎖交換による機能性TriFabの生成
2/3-IgGについて先に示されたようなFc-Fc鎖間ジスルフィドの排除は、調節された還元および再酸化を必要としない、即ち、生理学的条件下での、MHCFcRPによって駆動される交換反応を可能にする。従って、そのような分子を、生理学的条件下で「シャフリング」することが可能であり、標的細胞表面に既に結合してる時ですら可能であり得る。
従って、2/3-BiFab交換反応を、交換反応の初期トリガーとしての還元なしに実施した。これらの交換反応へのインプット分子は、前記のような、機能性のLeY結合アームおよび「分割された」Dig結合ステム領域（proDig）を含むLeY結合2/3-BiFabであった。その後、不要のHis8含有タンパク質のNiNTA樹脂への吸着を介して、未反応の2/3-BiFabおよびMHCFcRP副生成物の枯渇を達成した。その後、2/3-BiFab前駆体分子と比較して、生成されたTriFabの結合機能性を査定するため、FACS分析を適用した。従って、LeY抗原発現MCF7細胞を、個々のLeY結合2/3-BiFabのいずれか、または交換反応のTriFabに曝した。その後、Dig-Cy5を添加し、細胞の蛍光を査定した。図21は、いずれかの2/3-BiFabに曝された細胞では、いずれのエンティティも、細胞表面炭水化物LeYを認識する完全なFabアームを保有しているにも関わらず、Dig-Cy5関連シグナルが低いことを示している。
2/3-BiFabがジゴキシゲニル化ペイロードに結合し得ないのは、機能性のDig結合Fvをステム領域に保有していないためである。しかしながら、鎖交換反応のTriFab生成物は、Dig-Cy5関連シグナル、即ち、Dig結合機能性を明瞭に呈示した。これは、「ステム-Fv」の不活化された結合機能性を有する2/3-BiFab前駆体分子が、鎖交換を介して、完全に機能性のTriFabに変換されることを証明している。
実施例17
本発明による2/3-BiFabプロドラッグの完全に機能性の二重特異性または三重特異性の細胞結合型活性化TriFabへのオンセル変換
2/3-BiFabは、1本の完全に機能性のFabアームを含むため、部分的にのみ非結合コンピテントである。ステム領域の先端にあるFvのみが、（異なる抗体の、または同族抗原との結合に干渉する変異を含有している、結合部位の前駆体不活性プロ型である）非補完的なVHドメインおよびVLドメインから構成されるため非機能性である。機能性のFabアームが細胞表面に結合した場合、2/3-BiFabが標的細胞上に蓄積する。（いずれも不活化されているが相互に補完的なステム-Fvを保持している）2種の補完的な2/3-BiFabが、同一の細胞の表面に結合した場合、鎖交換反応が、細胞の表面上で直接、結合したまま起こり得る。次いで、この交換は、細胞表面上で直接、少なくとも二重の特異性を有する完全に機能性のTriFabを生成する（図22）。
インサイチューオンセル鎖交換を実験的に証明するため、本発明者らは、個々の2/3-BiFabモジュール、および（前記実施例に記載された）生化学的鎖シャフリングに供されたものを、MCF7細胞に適用し、その後、FACS分析を行った。MCF7細胞は、細胞表面上にLeY抗原を保持しており、従って、機能性のFabアームによって個々の2/3-BiFabに結合する。図23は、個々に適用された2/3-BiFabが、MCF7細胞に結合するが、第2の標的Dig-Cy5を捕獲することはできないことを示す（図23、2列目および3列目）。これは、2/3-BiFabにおける、従って、一方の2/3-BiFabのみと結合した細胞における、機能性のステム-Fvの欠如を反映している。しかしながら、両方の（補完的な）2/3-BiFabの同時適用は、MCF7細胞の表面上でDig-Cy5を捕獲し保持することを可能にする（図23、4列目）。これは、鎖再配置/交換、およびステム-FvのDig結合機能性を有する機能性のTriFabの生成の成功を示す。ステム領域の鎖交換および機能性のステム-Fv（Dig-Cy5に関連した標的FACSシグナル）の回収の成功は、補完的な2/3-BiFabの連続適用時にも観察された。細胞結合を可能にするための第1のエンティティの適用、それに続く、未結合の分子を除去するための充分な洗浄、その後の第2のエンティティの適用も、抗原陽性細胞上でFACSシグナルを生成する。これは、（同時適用または連続適用のいずれかによる）交換反応の成功が、標的細胞の表面上で生理学的条件下で起こり得ることを確認する。
実施例18
本発明によるターゲティングされた抗CD3プロドラッグ2/3-BiFabの完全に機能性の二重特異性抗体へのオンセル鎖変換
2/3-BiFabプロドラッグのオンセル変換が、異なる結合特異性のために適用され得る一般原理であることを証明するため、CD3結合抗体のVHドメインまたはVLドメインを含有している2/3-BiFabを生成した。（T細胞リクルーターとも呼ばれる）T細胞二重特異性抗体は、腫瘍細胞の表面上の抗原を認識する結合エンティティを、CD3結合機能性と組み合わせたタンパク質である。そのような分子は、腫瘍抗原結合エンティティを介して腫瘍細胞に結合し、（CD3結合機能性を介して）T細胞にも結合する。それが、次に、（活性化の）シグナルおよび過程を生成し、最終的には、抗体結合によって誘導されたT細胞攻撃によって媒介される腫瘍細胞溶解/死をもたらす。
抗CD3プロドラッグ機能性を有する2/3-BiFab（即ち、CD3結合部位が、ステム領域に位置しており、従って、2/3-BiFab遊離体においては結合コンピテントでない）を、前記のように設計した（実施例14および15を参照すること）。2/3-BiFab LeY-proCD3(ホール)-MHCFcRP(ノブ)および2/3-BiFab LeY-proCD3(ノブ)-MHCFcRP(ホール)を生成するため、軽鎖、ノブ重鎖またはホール重鎖、および適合するMHCFcRPを共発現させた。2/3-BiFabを、前記のように精製し（実施例15の表を参照すること）、オンセル鎖交換反応に供した。
次いで、抗CD3プロドラッグ機能性を有する2/3-BiFabのオンセル鎖交換を実験的に証明するため、これらをMCF7細胞に適用した。その後、CD3結合機能性の存在または欠如を、CD3受容体結合時にシグナルを生成する、細胞に基づくレポーターアッセイ（Promega T-cell Activation Bioassay（NFAT）、カタログ番号J1621、図24）を介して決定した。
MCF7細胞は、細胞表面上にLeY抗原を保持しており、従って、個々の2/3-BiFabは、機能性のFabアームによって結合することができる。図25において、個々に適用された2/3-BiFabは、MCF7細胞に結合するが、CD3レポーターシグナルを生成しない/低く生成することが分かる。これは、これらの分子におけるCD3結合機能性の欠如を反映している。しかしながら、両方の（補完的な）2/3-BiFabの同時適用は、効率的なCD3結合を反映する有意なシグナルを生成した。これは、細胞上でのオンセル/インビボ鎖再配置/交換およびCD3結合機能性を有する機能性のTriFabの生成の成功を示す。
ステム領域の鎖交換および機能性のステム-Fv（CD3シグナル）の回収の成功は、補完的な2/3-BiFabの連続適用時にも観察された。細胞結合を可能にするための第1のエンティティの適用、それに続く、未結合の分子を除去するための充分な洗浄、その後の第2のエンティティの適用も、抗原陽性細胞においてシグナルを生成した。これは、ターゲティングされた抗CD3プロドラッグ分子の交換および活性化の反応の成功が、標的細胞の表面上で生理学的条件下で起こり得ることを確認した。
実施例19
本発明による異なる抗原を標的とする2/3-BiFabプロドラッグの完全に機能性の細胞結合型活性化三重特異性TriFabへのオンセル変換
2/3-BiFabによって媒介される鎖交換およびその後のプロドラッグ様抗体誘導体の活性化を、二重抗原結合原理と組み合わせることができる。これは、図26に図示されるように、プロドラッグ活性化特異性を増強する：同一の特異性の機能性（例えば、CD3（＝CD抗原1）結合物質もしくはCD-AG-2（＝CD抗原2）結合物質またはターゲティングされたプロドラッグアプローチから利益を得るその他の結合物質）を補完するステム-Fvを含むが、異なる特異性の細胞表面結合Fabアームを含む、鎖交換によって機能性のTriFabを生成する2/3-BiFabのペアを生成することができる。従って、生産的な鎖交換およびステム-Fv機能性の回収は、両方の抗原を発現する細胞においてのみ起こる。そのような設定において、交換反応は、各2/3-BiFabに由来する1本ずつのFabアーム、ならびに両方に由来するVHおよびVLの補完から回収されたステム-Fvを含む三重特異性TriFabを、細胞表面上で生成する。個々の2/3-BiFabに、または一方の2/3-BiFabのみと結合した細胞に、ステム-Fv機能性は存在しないため、プロドラッグ活性化の高い特異性が提供される。両方の補完的な2/3-BiFabのための標的抗原を（十分な密度で）保持している細胞のみが、鎖交換を可能にし、従って、機能性のステム-Fv領域の再生を可能にする。二重特異性結合機能性のオンセル生成は、1価の細胞表面結合物質を2価に変換するため、アビディティにも寄与する。従って、それは、標的細胞の表面におけるTriFab誘導体の結合を増加させ安定化する（ジスルフィドが欠損している2/3-IgGについても示された、アビディティによって媒介される改善）。
従って、細胞表面濃度がより高くなり、従って、付加的な特異性が獲得される。
図27は、異なる抗原を標的とする2/3-BiFabプロドラッグの完全に機能性の細胞結合型活性化三重特異性TriFabへのオンセル変換についての実験結果を示す。細胞表面抗原LeYまたは細胞表面抗原メソテリン（MSLN）のいずれかに結合する補完的な2/3-BiFabを作製し、両方の抗原を同時に発現する細胞株において6時間組み合わせた。両方の構築物の（不活化された）ステム-Fvは、Dig結合抗体のVHまたはVLを保有していた。FACS分析は、LeY結合2/3-BiFabのみまたはメソテリン結合2/3-BiFabのみの適用時、関連するDig結合活性の欠損を示した（図27、第2カラムおよび第3カラム）。しかしながら、両方の共適用は、これらの細胞の増加した蛍光によって示される、Dig結合細胞表面関連機能性の生成をもたらす（図27、第4カラム）。
実施例20
本発明による異なる抗原を標的とするTriFabプロドラッグの三重特異性TriFabへのオンセル変換
出発分子としての2/3-BiFab誘導体は、N末端にFabアームを含まない修飾型ステム-Fv領域をMHCFcRPとして含む。これらのエンティティへのFabアームの付着、および重鎖と組み合わせての発現は、図28に示されるように、交換によって可能になる2/3-TriFab誘導体を生成する。これらの分子は、対応するパートナーの発見時に、機能性の三重特異性TriFabへと交換される、潜在的に抗原結合コンピテントな鎖へ変更されたMHCFcRPを有する。
従って、特異性「X」を有するVHおよび特異性「Y」のVLから構成された非機能性のステム-Fvを保有している、細胞表面標的結合特異性「A」を有する2/3-TriFab誘導体を生成することができる。それに対応して、特異性「Y」を有するVHおよび特異性「X」のVLから構成された非機能性のステム-Fvを保有している、細胞表面標的結合特異性「B」を有する補完的な2/3-TriFab誘導体を生成することができる。そのような分子のオンセル鎖交換は、（アビディティによって増強される）二重特異性細胞結合Fabアーム（A＋Bの両方）をいずれも保持している2つの型の三重特異性TriFabを生成する。それらのTriFabのうちの一方は、第1の特異性の完全に活性なステム-Fv機能性を保有しており、他方のTriFabは、第2のステムFv機能性を含有している（完全に活性な「X」TriFabまたは完全に活性な「Y」TriFabのいずれか）。そのようなTriFabプロドラッグペアの適用は、例えば、十分な密度で2種の明確な（癌）表面抗原を同時に発現している細胞においてのみ選択的に、CD3結合物質およびCD-AG-2結合物質の不活性から活性への同時変換（またはアビディティによって増強される特異的なプロドラッグの活性化から利益を得るその他の結合物質ペアの変換）を可能にするはずである。
実施例21
本発明による三重特異性または四重特異性の2/3-BiFabプロドラッグ誘導体
例えば、(G4S)6リンカーのようなペプチドリンカーを介して、重鎖のC末端に共有結合でMHCFcRPがコンジュゲートされている2/3-BiFab誘導体を、本明細書中に報告される交換反応のための出発分子として設計し、生成することができる。これは、図29に示されるような、TriFabの単鎖ステムモジュールに類似している「非機能性」のエンティティを生成する。これらの単鎖ステムモジュールへのFabアームの付着は、交換によって可能になるTriFab誘導体を生成する。これらのうちの2種は、図29に示されるように、機能性の三重特異性または四重特異性の抗体誘導体へ交換され得る。
Figure 2021501181
細胞上の異なる抗原に結合する抗体プロドラッグを生成するため、LeY結合領域を、他の抗原との結合を可能にする配列に交換し、図28に記載されたのと同様に再配置することもできる。
実施例22
本発明によるターゲティングされた抗CD3プロドラッグ2/3-BiFabのオンセル鎖変換は、効果的なT細胞によって媒介される腫瘍細胞の死滅を可能にする
この実施例は、2/3-BiFabプロドラッグのCD3結合TriFabへのオンセル変換が、T細胞によって媒介される標的腫瘍細胞の死滅を可能にすることを証明する：CD3結合抗体のVHドメインまたはVLドメインのいずれかを含有しているLeY腫瘍抗原結合2/3-BiFabを生成した。これらの2/3-BiFabプロドラッグの設計および生成は、以前の実施例に記載されている。これらの2/3-BiFabプロドラッグのCD3結合物質のVHおよびVLの配列は、US 2015/0166661 A1に記載されている。
それらの分子が、同時結合時に、細胞によって媒介される死滅を誘導することを証明するため、それらを異なる濃度でLeY陽性MCF7細胞に適用した。従って、MCF7細胞を、96穴プレートに播種し、一晩インキュベートし、その後、それらの細胞を2/3-BiFab抗LeY-proCD3(ノブ)-MHCFcRP(ホール)および2/3-BiFab抗LeY-proCD3(ホール)-MHCFcRP(ノブ)に曝した。これらの成分は、個々に/連続的に、または組み合わせて添加された。T細胞によって媒介される死滅を査定するため、（最新Ficoll精製を介して単離された）健常ドナーの全血由来のPBMCを5:1比で添加した。次いで、培養物を、37℃、5％CO2で48時間維持し、その後、（最新LDH放出アッセイを適用して）腫瘍細胞溶解の程度を査定した。
これらのアッセイの結果は図30に示される。
MCF7細胞は、細胞表面上にLeY抗原を保持しており、従って、個々の2/3-BiFabは、機能性のFabアームによって結合することができる。個々に適用された2/3-BiFab、即ち、抗LeY-proCD3(ノブ)-MHCFcRP(ホール)または2/3-BiFab抗LeY-proCD3(ホール)-MHCFcRP(ノブ)のいずれかの投与は、高いモル濃度ですら、関連するT細胞によって媒介される死滅をもたらさない（LDHの放出なし）。これは、これらの分子の（T細胞によって媒介される細胞溶解のために必要とされる）CD3結合機能性の欠如を反映している。
対照的に、両方の（補完的な）2/3-BiFabの同時適用は、有意なLDH放出をもたらした。これは、極めて低い濃度で既に腫瘍細胞溶解が有意であることを反映している。その理由は、腫瘍細胞表面上での鎖再配置/交換およびCD3結合機能性を有する機能性のTriFabの生成の成功である。次いで、それらの機能性のCD3結合TriFabは、T細胞をリクルートし、エンゲージし、次に、それが、標的腫瘍細胞の溶解をもたらす。
実施例23
本発明によるAG-4およびEGFRへターゲティングされた抗CD3プロドラッグ2/3-BiFabのオンセル鎖変換は、効果的なT細胞によって媒介される腫瘍細胞の死滅および強力なサイトカイン放出を可能にする
実施例22に記載された実験セットアップと類似して、AG-4発現HELA細胞およびEGFR発現A431細胞を、それぞれの2/3-BiFabによって標的とした。
抗AG-4-proCD3(ノブ)-MHCFcRP(ホール)または2/3-BiFab抗AG-4-proCD3(ホール)-MHCFcRP(ノブ)のいずれかのHELA細胞への投与は、関連する細胞によって媒介される死滅をもたらさない（LDHの放出なし）。これは、これらの分子の（T細胞によって媒介される細胞溶解のために必要とされる）CD3結合機能性の欠如を反映している。
さらに、抗EGFR-proCD3(ノブ)-MHCFcRP(ホール)または2/3-BiFab抗EGFR-proCD3(ホール)-MHCFcRP(ノブ)のいずれかのA431細胞への投与は、関連する細胞によって媒介される死滅をもたらさない（LDHの放出なし）。
対照的に、両方の（補完的な）2/3-BiFabの同時適用は、両方の標的細胞セットアップにおいて有意なLDH放出をもたらした。これは、極めて低い濃度で既に腫瘍細胞溶解が有意であることを反映している（図31）。この理由は、腫瘍細胞表面上での2/3-BiFabの間の鎖交換およびCD3結合機能性を有する機能性のTriFabの生成の成功である。
さらに、図32は、HELA細胞上のAG-4を標的とした場合の、4nMの濃度での、分泌されたサイトカインの量を示す。抗AG-4-proCD3(ノブ)-MHCFcRP(ホール)および2/3-BiFab抗AG-4-proCD3(ホール)-MHCFcRP(ノブ)の両方が適用される設定においては、有意に多い量のIL-2、IFNγ、グランザイムB、およびTNFαが存在し、このことは、サイトカインレベルに関しても免疫応答が強力であることを反映している（図32）。
実施例24
HELA細胞上のEGFRおよびAG-4の二重ターゲティングは、本発明による抗CD3プロドラッグ2/3-BiFabのオンセル鎖変換および効果的なT細胞活性化を可能にする
CD3受容体結合時にシグナルを生成するレポーター細胞株を使用した機能アッセイ（Promega T-cell Activation Bioassay（NFAT）、カタログ番号J1621）において、二重ターゲティングを評価した。
細胞表面抗原4（AG-4）および上皮増殖因子（EGFR）の両方を発現するHELA細胞（図33）を、AG-4またはEGFRのいずれかを標的とする2/3-BiFabによって処理した。両方の構築物の（不活化された）ステム-Fvは、CD3結合抗体のVHまたはVLを保有していた。結果は、EGFR-proCD3(ノブ)-MHCFcRP(ホール)のみまたはAG-4-proCD3(ホール)-MHCFcRP(ノブ)のみの適用時の関連するCD3結合活性の欠損を示した。しかしながら、両方の共適用は、CD3との有意な結合およびレポーター細胞株の活性化をもたらす（図34）。対照として、EGFR-proCD3(ホール)-MHCFcRP(ノブ)分子およびAG-3-proCD3(ノブ)-MHCFcRP(ホール)分子を分析した。抗原発現に関して、HELA細胞はAG-3陰性であり、従って、EGFRにターゲティングされた2/3-BiFabのみが結合することができる。この対照は、両方の2/3-BiFabが細胞表面に結合している時にのみ、細胞表面上でシャフリング反応が起こることのもう一つの証拠として役立つ。変換が培地中で低濃度ですら効率的であるケースにおいては、変換生成物EGFR/AG-3/CD3 TriFabが、EGFR結合エンティティを介して細胞表面に結合することができ、従って、CD3によって媒介される活性化を誘導することができるであろうが、それは検出されなかった。
実施例25
単鎖ステムモチーフを含む三重特異性2/3 Fabプロドラッグ誘導体は、本発明によるオンセル変換を受け、それによって、2種の付加的な結合部位を生成し、T細胞を強く活性化する
例えば、(G4S)6リンカー（SEQ ID NO:81×6）のようなペプチドリンカーを介して、重鎖のC末端に共有結合でMHCFcRPがコンジュゲートされている2/3-BiFab誘導体を、本明細書中に報告される交換反応のための出発分子として設計し、生成した。これは、図29に示されるような、TriFabの単鎖ステムモジュールに類似している「非機能性」のエンティティを生成した。これらの単鎖ステムモジュールへのFabアームの付着は、交換によって可能になるTriFab誘導体を生成した。これらのうちの2種は、図29に示されるように、機能性の三重特異性抗体誘導体に交換されることが示された。
Figure 2021501181
図35は、フローサイトメトリーを介した結合研究についてのセットアップを図示する。得られた結果は、図36に示される。いずれの構築物も、単独では、Dig-Cy5またはBio-488の結合をもたらさなかったが（図36A：2列目および3列目；図36B：2列目および3列目）、両方の共適用は、これらの細胞の増加した蛍光によって示される、DigおよびBioに結合する細胞表面関連機能性の生成をもたらす（図36A：4列目；図36B：4列目）。
従って、単鎖抗LeY-CD3-TriFab重鎖(ノブ)-CD-AG-2-VL(ホール)および単鎖抗LeY-CD3-TriFab重鎖(ホール)-CD-AG-2-VH(ノブ)を組み合わせることによって、CD3結合エンティティおよびCD-AG-2結合エンティティを含む三重特異性抗体が生成された（図37）。これらの分子の、T細胞を活性化する能力は、Promega T-cell Activation Bioassay（NFAT）（カタログ番号J1621）を使用することによって立証され、図38に示される。
実施例26
本発明によるターゲティングされた抗CD3プロドラッグ2/3-BiFabのオンセル鎖変換の副生成物としての、付加的な結合部位を含むFab型MHCFcRP二量体
図18に図示されるように、特異性4を有するMHCFcRP副生成物は、非結合性であり得る。しかしながら、機能性の結合エンティティのVHまたはそれぞれのVLをMHCFcRPへ付加することによって、機能性の、即ち、結合コンピテントなFab分子が、交換反応において生成された。MHCFcRP副生成物の結合機能性を示すため、CD-AG-2 MHCFcRPを保持しているLeYを標的とする2/3-BiFabペアを、単独で、または組み合わせて、培地に添加した。さらに、CD-AG-2を発現しているLeY陰性Jurkat細胞を添加した。全セットアップが図39に示される。MHCFcRP副生成物を、PE-抗His6抗体によって検出した。Jurkat細胞がLeY陰性であり、2/3-BiFabが細胞表面に結合し得ないという事実のため、2/3-BiFab（図40、2列目および3列目）は、単独では検出抗体のHis6結合をもたらさなかった。2種の2/3-BiFabの組み合わせは、CD-AG-2に結合することができ、フローサイトメトリーによって抗His6抗体を介して検出され得るMHCFcRP副生成物の生成をもたらした（図40、4列目を参照すること）。未反応の2/3-BiFabは、LeY発現が存在しないため、細胞に結合することができなかった。
実施例27
ターゲティングエンティティとしてN末端に融合した付加的なFabを含むMHCFcRPは、2価細胞ターゲティングを可能にし、本発明によるオンセル変換および3価MHCFcRP副生成物の作製を媒介する
出発分子としての2/3-BiFab誘導体は、N末端にFabアームを含まない修飾型ステム-Fv領域をMHCFcRPとして含む。これらのエンティティへのFabアームの付着、および重鎖と組み合わせての発現は、図41に示されるように、交換によって可能になる2/3-TriFab誘導体を生成する。それらの分子は、対応するパートナーの発見時に、機能性の三重特異性TriFabへと交換されるLeY結合コンピテント鎖に変更されたMHCFcRPを有する。
従って、CD3特異性を有するVHおよびCD-AG-2特異性のVLまたはその逆から構成される非機能性のステム-Fvを保有している、LeY標的結合特異性を有する2/3-TriFab誘導体を生成することができる。そのような分子のオンセル鎖交換は、（アビディティによって増強される）二重特異性LeY Fabアームをいずれも保持している2つの型の三重特異性TriFabを生成する。それらのTriFabの一方は、CD3特異性の完全に活性なステム-Fv機能性を保有しており、他方のTriFabは、CD-AG-2ステムFv機能性を含有している。例えば、そのようなTriFabプロドラッグペアのLeY発現MCF7細胞への適用は、CD3結合物質およびCD-AG-2結合物質の不活性から活性への同時変換を可能にする。
結果は図42に示される。結果は、LeY-proCD3(ノブ)-LeY-proCD-AG-2-MHCFcRP(ホール)またはLeY-proCD3(ホール)-LeY-proCD-AG-2-MHCFcRP(ノブ)のみの適用時の、関連するT細胞活性化エンティティの欠損を示した。しかしながら、両方の共適用は、有意なT細胞活性化をもたらす。
実施例28
代替的な2/3-BiFab誘導体は、CH2依存性FcRn結合性が完全なままであり、本発明によるオンセル鎖変換を示す
出発分子としての2/3-BiFab誘導体は、修飾型ステム-Fv領域をMHCFcRPとして含む。従来のIgGに由来するCH2ドメインを維持し、従って、延長された半減期のためのFcRn結合能力を維持するため、図43に図示されるように、CH2-CH3二量体のC末端に、可変断片を付加することができる。CH3ドメイン内の部分不安定化変異は、2/3-BiFabのものと同一である。あるいは、図44に示されるように、Fc部分（CH2＋CH3）とFab部分との間に、可変断片を導入してもよい。全ての抗体が、以前に記載されたように、良好な収率（72mg/L〜161mg/L）で発現された。図45は、CH2含有フォーマットの、FcRnとのより高い結合を呈示する能力を確認し、初期2/3-BiFabと比較して延長された血清半減期を明らかにしている（分析用FcRnアフィニティクロマトグラフィは、Schlothauer,T.,et al.,MAbs 5(2013)576-586に記載されるように実施された）。
CH2含有2/3-BiFabのオンセル鎖変換を授与する能力を、前記のフローサイトメトリーによって分析した。2種の遊離体分子を（間に2回洗浄して）MCF7細胞に連続適用した。鎖交換によって、機能性の、従って、細胞表面上のジゴキシゲニル化Cy5に結合することができる抗ジゴキシゲニン結合部位が組み立てられ、それがFACSによって検出された。図43および44による分子クラスの両方が、図46に図示されるように、本発明による鎖交換反応を成功裡に受けた。
実施例29
CH2ドメイン含有2/3-BiFabは、本発明による方法において機能性のCD3結合部位へ変換され、それによって、T細胞活性化を媒介することができる
C末端に付着した可変断片を含むCH2含有2/3-BiFab（図47）を、先に概説されたJurkat活性化アッセイを使用して、機能性のCD3結合物質を生成する能力について分析した。MCF7細胞を標的細胞として、LeYを標的抗原として用いた。2/3-BiFabは有意なJurkat活性化を誘導しなかったが、両方の組み合わせは、レポーター系において用量依存性の活性化および発光（RLU）をもたらした（図48）。
実施例30
透過型電子顕微鏡法は、2/3-BiFabおよび対応する生成物の提唱された構造を確認し、それらが高度に可動性であることを明らかにする
2/3-BiFabおよび本発明による方法において得られたそれぞれの鎖交換生成物の形状および構造を分析するため、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡法（NS-TEM）を実施した。結果（図49）は、ドメイン内の特徴は強固であるが、ドメイン間の可動性は高いことを明らかにしている。
グリッド調製：新鮮に解凍された試料を、D-PBSで約5mg/mlの濃度に希釈する。希釈された試料4μlをグロー放電処理された400メッシュ炭素コーティングparlodion銅グリッドに吸着させ、3滴の水で洗浄し、3μlのTMV含有溶液と共にインキュベートし、2滴の水でさらに洗浄し、最後に、2滴の酢酸ウラニル2％によって染色した。
透過型電子顕微鏡法：試料を、120kVで作動するTecnai12透過型電子顕微鏡（FEI,Eindhoven,The Netherlands）を使用して画像化した。標本レベルで0.296nmの最終ピクセルサイズを与える195,000倍の公称倍率で、2048×2048ピクセル電荷結合素子カメラ（Veleta Gloor Instruments）で、電子顕微鏡写真を記録した。あるいは、80kVで作動するFEI Tecnai G2 Spirit TEM（FEI,Eindhoven,The Netherlands）を使用して、試料を画像化した。その場合、標本レベルで0.33nmの最終ピクセルサイズを与える135,000倍の公称倍率で、2048×2048ピクセル電荷結合素子カメラ（Veleta Soft Imaging Systems）で、電子顕微鏡写真を記録した。
画像処理：EMAN2画像処理パッケージ（例えば、G.Tang,L.,et al.,J.Struct.Biol.157(2007)38-46を参照すること）を使用して、記録された画像から手動で選択された粒子に対して、リファレンスなしの軸合わせを実施した。抽出された粒子を、軸合わせし、多変量統計分析によって分類し、2Dクラス平均を得た。さらに、クラス平均化が可能でない時には、Photoshopを使用して、鮮明さのため、粒子の生画像の手動染色も行った。
実施例31
標的と無関係の鎖変換は高濃度でのみ非効率的に起こる
鎖変換が高い濃度で培地中でも起こるか否かに取り組むため、2/3-BiFabをPBMCと共培養されたHELA細胞に適用した。第1のセットアップにおいて、抗AG-4-proCD3(ホール)-MHCFcRP(ノブ)およびEGFR-proCD3(ノブ)-MHCFcRP(ホール)を適用した（両方の標的がHELA細胞上に発現されているため、オンセル変換が起こる）。第2のセットアップにおいては、抗AG-4-proCD3(ホール)-MHCFcRP(ノブ)およびAG-3-proCD3(ノブ)-MHCFcRP(ホール)を適用した（AG-3がHELA細胞上に発現されておらず、従って、オンセル変換は可能でないはずである）。しかしながら、300nMの濃度での死滅率は、培地中の変換およびAG-4結合部位を介したHELA細胞表面への1価結合が、ほとんど起こっておらず、低い率でしか標的細胞の死滅を媒介しないことを明らかにする（図50）。
本明細書中に報告される一つの局面は、本発明による多量体ポリペプチドまたは（薬学的）組成物を、そのような処置を必要とする患者へ投与する工程を含む、処置の方法である。
[本発明1001]
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第1の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアより選択される第1の抗体可変ドメイン、ならびに（b）第1のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、
（ii）第1の抗体可変ドメインのN末端側または第1のCH3ドメインのC末端側のいずれかに、第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペア
を含む、第1のポリペプチドと、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第3の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアより選択される第2の抗体可変ドメイン、ならびに（b）第2のヒト免疫グロブリンG CH3ドメインであって、
第1の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインであり；または第1の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインであり、かつ
第2のCH3ドメインがD356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のCH3ドメインが
（a）撹乱変異がD356Kである場合、439位にアミノ酸残基K、または
（b）撹乱変異がE357Kである場合、370位にアミノ酸残基K、または
（c）撹乱変異がK370Eである場合、357位にアミノ酸残基E、または
（d）撹乱変異がK439Eである場合、356位にアミノ酸残基D
を含むもの、
ならびに
（ii）任意で、第2の抗体可変ドメインのN末端側または第2のCH3ドメインのC末端側のいずれかに、第2または第4の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペア
を含む、第2のポリペプチドと
を含む多量体ポリペプチドであって、全てのナンバリングがKabat EUインデックスに従う、前記多量体ポリペプチド。
[本発明1002]
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第1のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、ならびに（b）第1の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアより選択される第1の抗体可変ドメイン、
（ii）第1のCH3ドメインのN末端側または第1の可変ドメインのC末端側のいずれかに、第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペア
を含む、第1のポリペプチドと、
（i）N末端からC末端に向かって、（a）第2のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、ならびに（b）第3の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアより選択される第2の抗体可変ドメインであって、
第1の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインであり；または第1の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインであり、かつ
第2のCH3ドメインがD356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のCH3ドメインが
（a）撹乱変異がD356Kである場合、439位にアミノ酸残基K、または
（b）撹乱変異がE357Kである場合、370位にアミノ酸残基K、または
（c）撹乱変異がK370Eである場合、357位にアミノ酸残基E、または
（d）撹乱変異がK439Eである場合、356位にアミノ酸残基D
を含むもの、
ならびに
（ii）任意で、第2のCH3ドメインまたは第2の可変ドメインのいずれかのN末端側に、第2または第4の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペア
を含む、第2のポリペプチドと
を含む多量体ポリペプチドであって、全てのナンバリングがKabat EUインデックスに従う、前記多量体ポリペプチド。
[本発明1003]
第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインが、第1のCH3ドメインと第2のCH3ドメインとの間のヘテロ二量体形成を助長するための、前記撹乱変異とは異なるさらなる変異を含む、本発明1001〜1002のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1004]
第1のCH3ドメインが
（a）変異T366W、または
（b）変異T366S/L368A/Y407V
を含み、
第2のCH3ドメインが
（a）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含む場合、変異T366S/L368A/Y407V、または
（b）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含む場合、変異T366W
を含む、
本発明1001〜1003のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1005]
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが非共有結合性二量体である、本発明1001〜1004のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1006]
第1の可変ドメインおよび第2の可変ドメインが非機能性の結合部位を形成する、本発明1001〜1005のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1007]
第1および第2のポリペプチドがそれぞれ、第1のCH3ドメインが第1の可変ドメインのC末端側に位置するケースにおいては、第1および第2の可変ドメインの各々のN末端側に、または第1の可変ドメインが第1および第2のCH3ドメインのC末端側に位置するケースにおいては、第1および第2のCH3ドメインの各々のN末端側に、アミノ酸配列DKTHTSPPS（SEQ ID NO:66）またはDKTHT（SEQ ID NO:94）またはGGGS（SEQ ID NO:69）またはDKTHGGGGS（SEQ ID NO:97）を含む、本発明1001〜1006のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1008]
（i）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含み、439位にアミノ酸残基Kを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異D356Kおよび変異T366S/L368A/Y407Vを含むか、または
（ii）第1のCH3ドメインが変異を含み、370位にアミノ酸残基Kを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異E357Kおよび変異T366S/L368A/Y407Vを含むか、または
（iii）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含み、357位にアミノ酸残基Eを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異K370Eおよび変異T366Wを含むか、または
（iv）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含み、356位にアミノ酸残基Dを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異K439Eおよび変異T366Wを含む、
本発明1001〜1007のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1009]
第1、第2、および第3の標的が異なる、本発明1001〜1008のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1010]
第1の標的および/または第3の標的がヒトCD3である、本発明1001〜1009のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1011]
第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアがFv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、CrossFab、二重特異性Fab、sdAb、およびVHHからなる群より選択される、本発明1001〜1010のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1012]
第4の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアが、第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアとは独立に、Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、CrossFab、二重特異性Fab、sdAb、およびVHHからなる群より選択される、本発明1001〜1011のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1013]
第1および第2のポリペプチドの各々がCH3ドメインのN末端側に直接的に免疫グロブリンG CH2ドメインをさらに含む、本発明1001〜1012のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1014]
ヒト免疫グロブリンGがヒトIgG1またはヒトIgG2またはIgG3またはヒトIgG4である、本発明1001〜1013のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1015]
第1の本発明1001〜1014のいずれかの多量体ポリペプチドと第2の本発明1001〜1014のいずれかの多量体ポリペプチドとを含む組成物であって、
第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異D356Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異K439Eを含むか、または
第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異E357Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異K370Eを含み、かつ
第1の多量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第1の可変ドメインが第1の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、かつ
第1の多量体ポリペプチドの第2の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2の可変ドメインが第3の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、かつ
第2および第4の標的が相互に独立に細胞表面抗原である、
前記組成物。
[本発明1016]
第1の多量体ポリペプチドの第1のCH3ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインがヘテロ二量体形成を助長するための同一の変異を含み、第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第1のCH3ドメインがヘテロ二量体形成を助長するための同一の変異を含む、本発明1015の組成物。
[本発明1017]
第1のポリペプチドの第1のCH3ドメインが
（a）変異T366W、または
（b）変異T366S/L368A/Y407V
を含み、
第1のポリペプチドの第2のCH3ドメインが
（a）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含む場合、変異T366S/L368A/Y407V、または
（b）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含む場合、変異T366W
を含む、
本発明1015〜1016のいずれかの組成物。
[本発明1018]
第1の多量体ポリペプチドの第1のCH3ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異T366Wまたは変異T366S/L368A/Y407Vを含み、かつ
第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異D356Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異K439Eを含むか、または
第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異E357Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異K370Eを含み、かつ
第1の多量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第1の可変ドメインが第1の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、かつ
第1の多量体ポリペプチドの第2の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2の可変ドメインが第3の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、かつ
第2および第4の標的が相互に独立に細胞表面抗原である、
本発明1015〜1017のいずれかの組成物。
[本発明1019]
第1および/または第3の標的がヒトCD3である、本発明1015〜1018のいずれかの組成物。
[本発明1020]
薬学的組成物であり、任意で、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、本発明1015〜1019のいずれかの組成物。
[本発明1021]
医薬として使用するための、本発明1001〜1014のいずれかの多量体ポリペプチドまたは本発明1015〜1020のいずれかの組成物。
[本発明1022]
本発明1001〜1014のいずれかの多量体ポリペプチドまたは本発明1015〜1020のいずれかの組成物を、そのような処置を必要とする患者へ投与する工程を含む、処置の方法。

Claims (22)

  1. （i）N末端からC末端に向かって、（a）第1の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアより選択される第1の抗体可変ドメイン、ならびに（b）第1のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、
    （ii）第1の抗体可変ドメインのN末端側または第1のCH3ドメインのC末端側のいずれかに、第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペア
    を含む、第1のポリペプチドと、
    （i）N末端からC末端に向かって、（a）第3の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアより選択される第2の抗体可変ドメイン、ならびに（b）第2のヒト免疫グロブリンG CH3ドメインであって、
    第1の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインであり；または第1の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインであり、かつ
    第2のCH3ドメインがD356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のCH3ドメインが
    （a）撹乱変異がD356Kである場合、439位にアミノ酸残基K、または
    （b）撹乱変異がE357Kである場合、370位にアミノ酸残基K、または
    （c）撹乱変異がK370Eである場合、357位にアミノ酸残基E、または
    （d）撹乱変異がK439Eである場合、356位にアミノ酸残基D
    を含むもの、
    ならびに
    （ii）任意で、第2の抗体可変ドメインのN末端側または第2のCH3ドメインのC末端側のいずれかに、第2または第4の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペア
    を含む、第2のポリペプチドと
    を含む多量体ポリペプチドであって、全てのナンバリングがKabat EUインデックスに従う、前記多量体ポリペプチド。
  2. （i）N末端からC末端に向かって、（a）第1のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、ならびに（b）第1の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアより選択される第1の抗体可変ドメイン、
    （ii）第1のCH3ドメインのN末端側または第1の可変ドメインのC末端側のいずれかに、第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペア
    を含む、第1のポリペプチドと、
    （i）N末端からC末端に向かって、（a）第2のヒト免疫グロブリンG CH3ドメイン、ならびに（b）第3の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアより選択される第2の抗体可変ドメインであって、
    第1の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインであり；または第1の抗体可変ドメインが抗体軽鎖可変ドメインである場合、第2の抗体可変ドメインが抗体重鎖可変ドメインであり、かつ
    第2のCH3ドメインがD356K、E357K、K370E、およびK439Eからなる変異の群より選択される撹乱変異を含み、それに従って、第1のCH3ドメインが
    （a）撹乱変異がD356Kである場合、439位にアミノ酸残基K、または
    （b）撹乱変異がE357Kである場合、370位にアミノ酸残基K、または
    （c）撹乱変異がK370Eである場合、357位にアミノ酸残基E、または
    （d）撹乱変異がK439Eである場合、356位にアミノ酸残基D
    を含むもの、
    ならびに
    （ii）任意で、第2のCH3ドメインまたは第2の可変ドメインのいずれかのN末端側に、第2または第4の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペア
    を含む、第2のポリペプチドと
    を含む多量体ポリペプチドであって、全てのナンバリングがKabat EUインデックスに従う、前記多量体ポリペプチド。
  3. 第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインが、第1のCH3ドメインと第2のCH3ドメインとの間のヘテロ二量体形成を助長するための、前記撹乱変異とは異なるさらなる変異を含む、請求項1〜2のいずれか一項記載の多量体ポリペプチド。
  4. 第1のCH3ドメインが
    （a）変異T366W、または
    （b）変異T366S/L368A/Y407V
    を含み、
    第2のCH3ドメインが
    （a）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含む場合、変異T366S/L368A/Y407V、または
    （b）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含む場合、変異T366W
    を含む、
    請求項1〜3のいずれか一項記載の多量体ポリペプチド。
  5. 第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが非共有結合性二量体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の多量体ポリペプチド。
  6. 第1の可変ドメインおよび第2の可変ドメインが非機能性の結合部位を形成する、請求項1〜5のいずれか一項記載の多量体ポリペプチド。
  7. 第1および第2のポリペプチドがそれぞれ、第1のCH3ドメインが第1の可変ドメインのC末端側に位置するケースにおいては、第1および第2の可変ドメインの各々のN末端側に、または第1の可変ドメインが第1および第2のCH3ドメインのC末端側に位置するケースにおいては、第1および第2のCH3ドメインの各々のN末端側に、アミノ酸配列DKTHTSPPS（SEQ ID NO:66）またはDKTHT（SEQ ID NO:94）またはGGGS（SEQ ID NO:69）またはDKTHGGGGS（SEQ ID NO:97）を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の多量体ポリペプチド。
  8. （i）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含み、439位にアミノ酸残基Kを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異D356Kおよび変異T366S/L368A/Y407Vを含むか、または
    （ii）第1のCH3ドメインが変異を含み、370位にアミノ酸残基Kを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異E357Kおよび変異T366S/L368A/Y407Vを含むか、または
    （iii）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含み、357位にアミノ酸残基Eを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異K370Eおよび変異T366Wを含むか、または
    （iv）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含み、356位にアミノ酸残基Dを含み、第2のCH3ドメインが撹乱変異K439Eおよび変異T366Wを含む、
    請求項1〜7のいずれか一項記載の多量体ポリペプチド。
  9. 第1、第2、および第3の標的が異なる、請求項1〜8のいずれか一項記載の多量体ポリペプチド。
  10. 第1の標的および/または第3の標的がヒトCD3である、請求項1〜9のいずれか一項記載の多量体ポリペプチド。
  11. 第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアがFv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、CrossFab、二重特異性Fab、sdAb、およびVHHからなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載の多量体ポリペプチド。
  12. 第4の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアが、第2の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインのペアとは独立に、Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、CrossFab、二重特異性Fab、sdAb、およびVHHからなる群より選択される、請求項1〜11のいずれか一項記載の多量体ポリペプチド。
  13. 第1および第2のポリペプチドの各々がCH3ドメインのN末端側に直接的に免疫グロブリンG CH2ドメインをさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の多量体ポリペプチド。
  14. ヒト免疫グロブリンGがヒトIgG1またはヒトIgG2またはIgG3またはヒトIgG4である、請求項1〜13のいずれか一項記載の多量体ポリペプチド。
  15. 第1の請求項1〜14のいずれか一項記載の多量体ポリペプチドと第2の請求項1〜14のいずれか一項記載の多量体ポリペプチドとを含む組成物であって、
    第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異D356Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異K439Eを含むか、または
    第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異E357Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異K370Eを含み、かつ
    第1の多量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第1の可変ドメインが第1の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、かつ
    第1の多量体ポリペプチドの第2の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2の可変ドメインが第3の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、かつ
    第2および第4の標的が相互に独立に細胞表面抗原である、
    前記組成物。
  16. 第1の多量体ポリペプチドの第1のCH3ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインがヘテロ二量体形成を助長するための同一の変異を含み、第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第1のCH3ドメインがヘテロ二量体形成を助長するための同一の変異を含む、請求項15記載の組成物。
  17. 第1のポリペプチドの第1のCH3ドメインが
    （a）変異T366W、または
    （b）変異T366S/L368A/Y407V
    を含み、
    第1のポリペプチドの第2のCH3ドメインが
    （a）第1のCH3ドメインが変異T366Wを含む場合、変異T366S/L368A/Y407V、または
    （b）第1のCH3ドメインが変異T366S/L368A/Y407Vを含む場合、変異T366W
    を含む、
    請求項15〜16のいずれか一項記載の組成物。
  18. 第1の多量体ポリペプチドの第1のCH3ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異T366Wまたは変異T366S/L368A/Y407Vを含み、かつ
    第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異D356Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異K439Eを含むか、または
    第1の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異E357Kを含み、第2の多量体ポリペプチドの第2のCH3ドメインが変異K370Eを含み、かつ
    第1の多量体ポリペプチドの第1の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第1の可変ドメインが第1の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、かつ
    第1の多量体ポリペプチドの第2の抗体可変ドメインおよび第2の多量体ポリペプチドの第2の可変ドメインが第3の標的に特異的に結合する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインのペアであり、かつ
    第2および第4の標的が相互に独立に細胞表面抗原である、
    請求項15〜17のいずれか一項記載の組成物。
  19. 第1および/または第3の標的がヒトCD3である、請求項15〜18のいずれか一項記載の組成物。
  20. 薬学的組成物であり、任意で、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項15〜19のいずれか一項記載の組成物。
  21. 医薬として使用するための、請求項1〜14のいずれか一項記載の多量体ポリペプチドまたは請求項15〜20のいずれか一項記載の組成物。
  22. 請求項1〜14のいずれか一項記載の多量体ポリペプチドまたは請求項15〜20のいずれか一項記載の組成物を、そのような処置を必要とする患者へ投与する工程を含む、処置の方法。
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