TW201932494A - 自單特異性抗體於活體內產生多特異性抗體之方法 - Google Patents

Abstract

本文中報導一種直接在細胞表面上、在作用位點處產生多特異性抗體的方法，此藉由兩個2/3-IgG或兩個2/3-BiFab之間的半抗體交換反應來達成，該兩個2/3-IgG或兩個2/3-BiFab的一半藉由不對稱擾動突變而失去穩定，從而促進正確組裝的全長雙特異性或多特異性抗體產生。該方法係在初始2/3-IgG或2/3-BiFab缺乏鉸鏈區二硫鍵的情況下進行。

Description

自單特異性抗體於活體內產生多特異性抗體之方法

本文中報導一種使用新穎半抗體交換方法在活體內在細胞上組裝多特異性(諸如雙特異性)抗體的方法。本發明方法甚至適用於完整抗體，亦即，包含CH2-CH3域且藉此具有效應功能的完整抗體。

用於單特異性抗體衍生物生物化學轉化為經組裝之雙特異性抗體的當前技術方法係應用(i)半抗體互補反應及(ii) IgG-IgG交換反應。

此等技術揭示於例如WO 2015/046467；Rispens等人, J. Biol. Chem. 289 (2014) 6098-6109；US 9,409,989；WO 2013/060867；WO 2011/131746；WO 2011/133886；WO 2011/143545；WO 2010/151792；Gunasekaran等人, J. Biol. Chem. 285 (2010) 19637-19646；WO 2009/041613、WO 2009/089004、WO 2008/119353、WO 2007/114325、US 8,765,412、US 8,642,745、WO 2006/047340、WO 2006/106905、WO 2005/042582、WO 2005/062916、WO 2005/000898、US 7,183,076、US 7,951,917；Segal, D.M.等人, Curr. Opin. Immunol. 11 (1999) 558-562；WO 98/50431、WO 98/04592；Merchant, A.M.等人, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681；WO 96/27011；Carter, P.等人, Immunotechnol. 2 (1996) 73；WO 93/11162，及Kostelny, S.A.等人, J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553。

用於單特異性抗體或抗體衍生物轉化為bsAbs的當前技術方法有缺點，諸如關於組裝後bsAb製備之方法及組合物的限制。

舉例而言，半抗體技術係在二價IgG的側面組裝單特異性及單價抗體。輸入分子的表現以及交換反應本身不僅產生半抗體，而且產生IgG樣二價(單特異性)抗體衍生物。聚集體亦存在於組裝反應的輸入材料以及輸出物中。兩者(二價單特異性抗體與聚集體)需要經由精巧的純化途徑自所組裝的bsAb中定量地移除或(因為定量移除難以高通量方式達成)，其在某種程度上『污染』bsAb製劑。

舉例而言，Fab-臂交換技術係自單特異性二價IgG衍生物組裝雙特異性二價IgG。因此，交換反應的輸入物為二價的，亦即藉由預設值實現親合力。為了確保應經歷親合力或促效抗體篩選的剩餘二價單特異性輸入材料完全不存在於交換反應中，必須保證任何剩餘二價輸入物以及在交換反應期間可能形成的任何聚集體被完全移除。由於輸入物與bsAb的相似性高，因此需要用於定量移除的精密程序(極難以高通量達成)，或剩餘的二價輸入物及聚集體在某種程度上污染最終bsAb製劑。

Labrijn, A. F.等人揭示藉由可控的Fab-臂交換來有效產生穩定的雙特異性IgG1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150)。

WO 2014/081955揭示雜二聚抗體及使用方法。

WO 2009/089004揭示利用靜電轉向效應製備抗體Fc-雜二聚分子的方法。其中揭示在涉及結構域-結構域相互作用的四個獨特電荷殘基對(Asp356---Lys439'、Glu357--Lys370'、Lys392---Asp399'、Asp399---Lys409')中，僅Lys409---Asp399'因兩個此等殘基在結構上保守並且內埋而適於工程改造。對於其他三對而言，至少一個搭配物暴露於溶劑(%ASA＞10)。

WO 2018/155611揭示不藉由共價鍵結結合的第一抗原結合分子與第二抗原結合分子之組合，雜二聚體比同二聚體更容易形成液體形式。其中在一個實施例中揭示位置226及位置229 (EU編號系統)中之一或兩者處之半胱胺酸殘基被其他胺基酸取代與位置357或位置397 (EU編號系統)中之至少一者處之第一CH3及第二CH3中之一或兩者被其他胺基酸殘基取代組合。

Mayer, K.等人(Int. J. Mol. Sci. 16 (2015) 27497-27506)揭示作為三價IgG形雙特異性抗體衍生物的TriFab、其設計、產生、表徵及用於靶向遞送有效負載的應用。

本文中報導一種藉由半抗體交換反應而直接在靶細胞表面上產生多特異性抗體的方法。此尤其允許在預定作用位點直接自非活性結合前位點形成功能結合位點。此類胞上位點形成消除了全身副反應風險。

已發現不完全抗體作為初始材料係有利的，諸如包含抗體輕鏈、抗體重鏈及抗體重鏈片段的2/3-IgG或2/3-BiFab，其中重鏈-重鏈相互作用藉由不對稱擾動突變(較佳位於重鏈片段中)失去穩定，且其中不存在重鏈-重鏈間共價/二硫鍵，諸如鉸鏈區二硫鍵或CH3域間二硫鍵。已發現此不對稱擾動突變在一方面促進初始不完全抗體解離且另一方面促進正確組裝之全長雙特異性抗體產生。重鏈-重鏈間缺乏共價鍵允許反應可以在還原劑不存在下進行，亦即在活體內或生理條件下進行。

本發明之方法係在還原劑不存在下進行。因此，初始抗體不具有重鏈-重鏈二硫鍵，諸如鉸鏈區二硫鍵。因此，根據本發明的鏈交換反應及方法允許在不進行初始還原的情況下實現雙特異性抗體組裝，使得此方法適於活體內應用。因此，藉由例如突變誘發PCR移除初始分子之重鏈之間天然存在之分子內二硫鍵。儘管重鏈之間缺乏所有分子間二硫鍵，但正確形成穩定(亦即可分離)的抗體。因此，使用此等初始分子，利用非還原自發鏈交換反應有可能實現雙特異性抗體的活體內產生。總體而言，根據本發明的非還原鏈交換方法能夠直接在活體內細胞表面上達成功能性雙特異性抗體的有效產生。

本文中報導一種用於產生(多特異性)結合子/多聚體多肽的方法，包含以下步驟：
- 培育
第一結合子(其為單特異性或雙特異性的及雜聚的)/多聚體多肽，其包含均含有(在N端至C端方向上)抗體可變域、隨後(直接)為人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域的第一(單體)多肽及第二(單體)多肽，
其中i)第一多肽之可變域為重鏈可變域且第二多肽之可變域為輕鏈可變域，或ii)第一多肽之可變域為輕鏈可變域且第二多肽之可變域為重鏈可變域，
其中i)第一多肽的CH3域包含杵突變且第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一多肽的CH3域包含臼突變且第二多肽的CH3域包含杵突變，
其中第一多肽包含至少一個功能結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第二多肽的CH3域中包含至少一種/第一擾動突變(選自由以下組成的突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T)，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽彼此間非共價結合/形成非共價二聚體/彼此間非共價結合/為非共價二聚體，(其中當第二多肽與第一多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)
及
第二結合子(其為單特異性或雙特異性及雜聚的)/多聚體多肽，其包含均含有(在N端至C端方向上)抗體可變域、隨後(直接)為人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域的第三(單體)多肽及第四(單體)多肽，
其中i)第三多肽的可變域為重鏈可變域且第四多肽的可變域為輕鏈可變域，或ii)第三多肽的可變域為輕鏈可變域且第四多肽的可變域為重鏈可變域，其中i)若第一多肽的可變域為重鏈可變域，則第四多肽的可變域為輕鏈可變域，或ii)若第一多肽的可變域為輕鏈可變域，則第四多肽的可變域為重鏈可變域，
其中i)第三多肽的CH3域包含杵突變且第四多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第三多肽的CH3域包含臼突變且第四多肽的CH3域包含杵突變，其中i)在第一多肽包含臼突變的情況下，第四多肽包含杵突變，或ii)在第一多肽包含突變杵的情況下，第四多肽包含突變臼，
其中第四多肽包含至少一個功能結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第三多肽的CH3域中包含至少一種/第二擾動突變(選自由以下組成的突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T)，其中第四多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第三多肽中的突變與第二多肽中的突變處於不同位置，
其中第三多肽與第四多肽彼此間共價或非共價結合/形成共價或非共價二聚體/彼此間非共價或共價結合/為非共價或共價二聚體，(其中當第三多肽與第四多肽形成雜二聚體時，第三多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)
其中當第二多肽與第三多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的(第一)擾動突變及第三多肽中的(第二)擾動突變引起吸引性相互作用，
其中第一多肽的可變域與第四多肽的可變域形成功能性(能結合抗原)結合位點(抗體可變域對(VH/VL對))，且第二多肽的可變域與第三多肽的可變域形成非功能性(不能結合抗原)可變域對，
及
- 回收包含第一多肽及第四多肽的結合子且藉此產生(多特異性)結合子/多聚體多肽。

在一個實施例中，第一至第四多肽在N端至C端方向上各自包含i)胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)，ii)源於人類IgG1可變域的抗體可變域，及iii)源於人類IgG1 CH3域的CH3域。

在一個實施例中，i)第一及第四多肽各自進一步包含源於人類IgG1 CH1域((變異型)人類IgG1 CH1域)的CH1域及(彼此獨立地)另一(重鏈或輕鏈)可變域，或ii)第一或第四多肽包含源於人類IgG1 CH1域((變異型)人類IgG1 CH1域)的CH1域且相應其他多肽包含源於輕鏈恆定域((變異型)人類κ或λ CL域)的域且各多肽進一步包含另一可變域。在一個實施例中，第一多肽的另一可變域及第四多肽的另一可變域為(不同)重鏈可變域。在一個實施例中，第一多肽之另一可變域為重鏈可變域且第四多肽之另一可變域為輕鏈可變域，或反之亦然。

在一個實施例中，第一及第四多肽可以具有相同或不同的N端至C端序列且在第一與第四多肽相同的情況下，其選自以下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含且在第一與第四多肽不同的情況下，其彼此獨立地選自以下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第三重鏈可變域。

在一個實施例中，第一及第四多肽之一在N端至C端方向上包含第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、第三重鏈可變域、第一輕鏈恆定域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，且第一及第四多肽中之另一者在N端至C端方向上包含第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域。在一個實施例中，包含含有兩個重鏈可變域之多肽的結合子進一步包含含有第一輕鏈可變域及第二輕鏈恆定域(與第一重鏈可變域配對)的第一輕鏈及含有第二輕鏈可變域及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)(與第二重鏈可變域配對)的(域交換)第二輕鏈，且另一結合子進一步包含第一輕鏈。

在一個實施例中，第一及第四多肽之一在N端至C端方向上包含第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、第二輕鏈可變域、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，且第一及第四多肽中之另一者在N端至C端方向上包含第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域。在一個實施例中，包含含有兩個可變域之多肽的結合子進一步包含含有第三輕鏈可變域及第一輕鏈恆定域(與第一重鏈可變域配對)的第一輕鏈及含有第三重鏈可變域及第二輕鏈恆定域(與第一輕鏈可變域配對)的(域交換)第二輕鏈，且另一結合子進一步包含第一輕鏈。

在一個實施例中，第一及第二結合子進一步包含抗體輕鏈。

在一個實施例中，第一結合子包含選自如下多肽群組的多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第三重鏈可變域，
包含杵突變或臼突變，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中i)若第一多肽的可變域為輕鏈可變域，則第二多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第一多肽的可變域為重鏈可變域，則第二多肽的可變域為輕鏈可變域，
其中若第一多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
包含選自由以下組成之突變群組的第一擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽彼此間非共價結合/形成非共價二聚體，(其中當第二多肽與第一多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)
及
包含另一輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，
其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽，
及
該第二結合子包含
選自如下多肽群組之多肽作為第四多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，其中若第二多肽包含臼突變，則CH3域包含突變杵，或若第二多肽包含突變杵，則CH3域包含臼突變，
包含選自由以下組成之突變群組的第二擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第五多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第四多肽中的擾動突變與第二多肽中的擾動突變處於不同位置，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第五多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第三重鏈可變域，
其中若第四多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第四多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
其中i)若第二多肽的可變域為輕鏈可變域，則第四多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第二多肽的可變域為重鏈可變域，則第四多肽的可變域為輕鏈可變域，
其中第四多肽與第五多肽彼此間非共價結合/形成非共價二聚體，(其中當第四多肽與第五多肽形成雜二聚體時，第四多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第六多肽，
其中該第六多肽藉由二硫鍵共價結合至該第四多肽。

在一個實施例中，培育步驟係在還原劑不存在下進行。

在一個實施例中，i)第二多肽及第三多肽，或ii)第二多肽及第五多肽進一步包含(C端)標籤。在一個實施例中，標籤具有胺基酸序列HHHHHH (SEQ ID NO: 67)或HHHHHHHH (SEQ ID NO: 68)且回收係藉由金屬(鎳)螯合劑親和層析管柱層析來進行。

在一個實施例中，
第一結合子包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第三重鏈可變域，
包含杵突變或臼突變，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中i)若第一多肽的可變域為輕鏈可變域，則第二多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第一多肽的可變域為重鏈可變域，則第二多肽的可變域為輕鏈可變域，
其中若第一多肽包含臼突變，則CH3域包含突變杵，或若第一多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
包含選自由D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的第一擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽彼此間非共價結合/形成非共價的，(其中當第二多肽與第一多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，
其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽，
及
第二結合子包含
選自如下多肽群組之多肽作為第四多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中若第二多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第二多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
包含選自由以下組成之突變群組的第二擾動突變：D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E及K439E，其中第五多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第四多肽中之擾動突變與第二多肽中之擾動突變處於不同位置，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第五多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第三重鏈可變域，
若第四多肽包含臼突變，則包含突變杵，或若第四多肽包含杵突變，則包含臼突變，
其中第四多肽與第五多肽彼此間非共價結合/形成非共價二聚體，(其中當第四多肽與第五多肽形成雜二聚體時，第四多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)，
其中第一多肽的可變域與第四多肽的可變域形成功能(能結合抗原)結合位點(抗體可變域對(VH/VL對))，且第二多肽的可變域與第三多肽的可變域形成非功能性(不能結合抗原)可變域對，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第六多肽，
其中該第六多肽藉由二硫鍵共價結合至該第四多肽。

如本文所報導之一個態樣為一種鑑別結合子組合的方法，包含以下步驟：
- 藉由對選自第一多個結合子之第一結合子與選自第二多個結合子之第二結合子的各種組合執行本發明之方法來產生多種結合子，
- 在ELISA分析中個別地量測所產生之多個結合子中之各種結合子對至少兩種抗原的同時結合(量)，及
- 基於ELISA結果自多個結合子中選擇結合子且藉此鑑別結合子組合。

如本文所報導之一個態樣為包含第一多肽及第二多肽的多聚體多肽
其中兩種多肽包含(在N端至C端方向上，緊接彼此之後，可變域與CH3域之間視情況具有肽連接子)胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)、抗體可變域，及人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域，
其中i)若第一多肽的可變域為輕鏈可變域，則第二多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第一多肽的可變域為重鏈可變域，則第二多肽的可變域為輕鏈可變域，
其中i)第一多肽的CH3域包含杵突變且第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一多肽的CH3域包含臼突變且第二多肽的CH3域包含杵突變，
其中第一多肽包含至少一個功能結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第二多肽的CH3域中包含至少一種擾動突變(選自由以下組成的突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T)，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽彼此間非共價結合/形成非共價二聚體，(其中當第二多肽與第一多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)，
第一多肽的可變域與第二多肽的可變域形成功能性或非功能性可變域對(不能結合抗原)。

在一個實施例中，第一多肽為選自如下多肽群組的多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第三重鏈可變域，
(且包含杵突變或臼突變)
及
第二多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域之包含杵突變或臼突變的CH3域，
包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基。

在一個實施例中，多聚體多肽進一步包含含有(另一)輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，其中第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽(CH1域)。

如本文所報導之一個態樣為一種組合物，其包含
第一雜三聚多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第三重鏈可變域，
(包含杵突變或臼突變)
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中i)若第一多肽的可變域為輕鏈可變域，則第二多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第一多肽的可變域為重鏈可變域，則第二多肽的可變域為輕鏈可變域，
其中若第一多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
及
包含另一輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三多肽，其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽，
及
第二雜三聚多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一(第四)多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中若第一雜三聚體的第二多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一雜三聚體的第二多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
包含選自由以下組成之突變群組的第二擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349Y、S366T、A368L、V407Y、S354S及W366T，其中第二(第五)多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第一(第四)多肽中的擾動突變與第一雜三聚體之第二多肽中的擾動突變處於不同位置，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二(第五)多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第三重鏈可變域，
若第一(第四)多肽包含臼突變，則包含杵突變，或若第一(第四)多肽包含杵突變，則包含臼突變，
其中i)若第二多肽的可變域為輕鏈可變域，則第五多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第二多肽的可變域為重鏈可變域，則第五多肽的可變域為輕鏈可變域，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三(第六)多肽，其中該第六多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一(第四)多肽，
其中i)第一雜三聚體中之第一多肽的CH3域包含杵突變且第一雜三聚體中之第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一雜三聚體中之第一多肽的CH3域包含臼突變且第一雜三聚體中之第二多肽的CH3域包含杵突變，其中i)在第一雜三聚體中之第一多肽包含臼突變的情況下，第二雜三聚體中之第二多肽(第五)多肽包含杵突變，或ii)在第一雜三聚體中之第一多肽包含杵突變的情況下，第二雜三聚體中之第二多肽(第五)多肽包含臼突變，
其中第一雜三聚體中的第二多肽及第二雜三聚體中之第一多肽(第四)多肽在相同位置不包含擾動突變/在不同位置包含擾動突變，
其中第一多肽的可變域與第四多肽的可變域形成功能性(能結合抗原)結合位點(抗體可變域對(VH/VL對))，且第二多肽的可變域與第四多肽的可變域形成非功能性(不能結合抗原)可變域對。

如本文所報導之一個態樣為包含第一多肽及第二多肽的多聚體多肽
其中兩種多肽均包含人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域，
其中i)第一多肽的CH3域包含杵突變且第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一多肽的CH3域包含臼突變且第二多肽的CH3域包含杵突變，
其中第一多肽包含至少一個功能結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第二多肽的CH3域中包含至少一種擾動突變(選自由以下組成的突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T)，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽彼此間非共價或共價結合/形成非共價或共價二聚體，(其中當第二多肽與第一多肽形成雜二聚體時，第二多肽中的擾動突變引起去穩定化相互作用)。

在一個實施例中，第一多肽為選自如下多肽群組的多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中(相同多肽之)結合域的第一部分與結合域的第二部分(結合且)形成特異性結合至標靶的功能結合位點；在一個實施例中，結合域的第一部分為抗體重鏈Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)且結合域的第二部分為輕鏈Fab片段(VL-CL或CL-VL)，或反之亦然，
且包含杵突變或臼突變，
及
第二多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域之包含突變杵或臼突變的CH3域，
包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基。

在一個實施例中，多聚體多肽進一步包含含有輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽。

如本文所報導之一個態樣為一種組合物，其包含
第一雜三聚多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，
v) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中(相同多肽之)結合域的第一部分與結合域的第二部分(結合且)形成特異性結合至標靶的功能結合位點；在一個實施例中，結合域的第一部分為抗體重鏈Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)且結合域的第二部分為輕鏈Fab片段(VL-CL或CL-VL)，或反之亦然，
包含杵突變或臼突變，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第一多肽包含臼突變，則包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則包含臼突變，
包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三多肽，該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽，
及
第二雜三聚多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一(第四)多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第一雜三聚體之第二多肽包含臼突變，則包含杵突變，或若第一雜三聚體之第二多肽包含杵突變，則包含臼突變，
包含選自由以下組成之突變群組的第二擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349Y、S366T、A368L、V407Y、S354S及W366T，其中第二(第五)多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第一(第四)多肽中的擾動突變與第一雜三聚體之第二多肽中的擾動突變處於不同位置，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二(第五)多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，
v) 第一重鏈可變域、源於人類IgG1 CH1域的第一CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、源於人類IgG1 CH1域的第二CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中(相同多肽之)結合域的第一部分與結合域的第二部分(結合且)形成特異性結合至標靶的功能結合位點；在一個實施例中，結合域的第一部分為抗體重鏈Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)且結合域的第二部分為輕鏈Fab片段(VL-CL或CL-VL)，或反之亦然，
若第一(第四)多肽包含臼突變，則包含杵突變，或若第一(第四)多肽包含杵突變，則包含臼突變，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三(第六)多肽，該多肽共價藉由二硫鍵結合至第一(第四)多肽，
其中i)第一雜三聚體中之第一多肽的CH3域包含杵突變且第一雜三聚體中之第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一雜三聚體中之第一多肽的CH3域包含臼突變且第一雜三聚體中之第二多肽的CH3域包含杵突變，其中i)在第一雜三聚體中之第一多肽包含臼突變的情況下，第二雜三聚體中之第二多肽(第五)多肽包含杵突變，或ii)在第一雜三聚體中之第一多肽包含杵突變的情況下，第二雜三聚體中之第二多肽(第五)多肽包含臼突變，
其中第一雜三聚體中的第二多肽及第二雜三聚體中之第一多肽(第四)多肽在相同位置不包含擾動突變/在不同位置包含擾動突變。

如本文所報導之一個態樣為一種醫藥調配物，包含不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或包含不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab；或組合物，其如本文所述包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的不同2/3-BiFab，其藉由將此類2/3-IgG或2/3-BiFab混合來製備。

如本文所報導之一個態樣為不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab，或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物，其用作藥劑。

如本文所報導之一個態樣為不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab之組合物用於製造或製備藥劑的用途。

如本文所報導之一個態樣為一種治療疾病的方法，包含向患有疾病之個體投與有效量的不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物。

在一個實施例中，組合物包含第一雜三聚多肽，其包含第一、第二及第三單體多肽；及第二雜三聚多肽，其包含第四、第五及第六單體多肽(亦即，各雜三聚多肽包含三種(不相同)單體多肽(合起來包含總共六種(不相同)單體多肽(亦即，第一、第二、第三、第四、第五及第六不相同單體多肽))，
其中第一、第二、第四及第五(單體)多肽各自包含(在N端至C端方向上)(i)胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)，(ii)第一抗體可變域，及(iii)人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域，其中(i)、(ii)及(iii)彼此獨立地直接或經由肽連接子彼此結合，
其中i)第一及第二(單體)多肽及(ii)第一及第五(單體)多肽、iii)第二及第四(單體)多肽及iv)第五及第四(單體)多肽的第一抗體可變域為VH/VL對(亦即，第一(單體)多肽的第一可變域為重鏈可變域或輕鏈可變域，其中在其為重鏈可變域的情況下，第二及第五(單體)多肽的第一可變域為輕鏈可變域或在其為輕鏈可變域的情況下，第二及第五(單體)多肽的第一可變域為重鏈可變域，且在第五(單體)多肽的第一可變域為重鏈可變域的情況下，第四(單體)多肽的第一可變域為輕鏈可變域，或在第五(單體多肽)之第一可變域為輕鏈可變域的情況下，其為重鏈可變域)，
其中i)第一及第五(單體)多肽及ii)第一及第二(單體)多肽、iii)第二及第四(單體)多肽及iv)第五及第四(單體)多肽的CH3域為臼包杵對(亦即，第一(單體)多肽的CH3域包含杵突變或臼突變，其中在其包含杵突變的情況下，第二及第五(單體)多肽的CH3域包含臼突變，或在其包含臼突變的情況下，第二及第五(單體)多肽的CH3域包含臼突變，且在第五(單體)多肽之CH3域包含臼突變的情況下，第四(單體)多肽之CH3域包含杵突變，或在第五(單體多肽)之CH3域包含杵突變的情況下，其包含臼突變)，
其中第一(單體)多肽及第五(單體)多肽彼此獨立地在N端及C端中之一或兩者處彼此獨立地各自包含scFv或scFab或Fab，
其中第二及第四(單體)多肽的CH3域包含至少一種擾動突變(選自由以下組成之突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第一(單體)多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與第二(單體)多肽之擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第五(單體)多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與第四(單體)多肽之擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置出包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第二(單體)多肽中的擾動突變在胺基酸序列中與第四(單體)多肽中的擾動突變不處於相同位置，其中當第二多肽與第四多肽形成雜二聚體，時，第二(單體)多肽中的擾動突變與第四(單體)多肽中的擾動突變引起吸引性(電荷)相互作用，其中當第二(單體)多肽與第一(單體)多肽形成雜二聚體且第四(單體)多肽與第五(單體)多肽形成雜二聚體時，第二及第四(單體)多肽中的擾動突變分別引起排斥(電荷)相互作用，
其中第一與第二(單體)多肽形成非共價二聚體，第四與第五(單體)多肽形成非共價二聚體，第三與第一(單體)多肽形成二硫鍵連接的二聚體，且第六與第五(單體)多肽形成二硫鍵連接的二聚體，
其中第三及第六(單體)多肽為抗體輕鏈。

在一個實施例中，第一(單體)多肽為選自如下多肽群組的多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第三重鏈可變域。

在一個實施例中，第二(單體)多肽為選自如下多肽群組的多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中i)若第一多肽的可變域為輕鏈可變域，則第二多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第一多肽的可變域為重鏈可變域，則第二多肽的可變域為輕鏈可變域，
其中若第一多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
及
包含另一輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三多肽，其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽。

在一個實施例中，第四(單體)多肽為選自如下多肽群組的多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中若第一雜三聚體的第二多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一雜三聚體的第二多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
包含選自由以下組成之突變群組的第二擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349Y、S366T、A368L、V407Y、S354S及W366T，其中第二(第五)多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，其中第一(第四)多肽中的擾動突變與第一雜三聚體之第二多肽中的擾動突變處於不同位置。

在一個實施例中，第五(單體)多肽選自在N端至C端方向上包含以下之多肽的群組
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域(源於其的CH1域)、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域(源於其的輕鏈恆定域)，及第三重鏈可變域，
若第一(第四)多肽包含臼突變，則包含杵突變，或若第一(第四)多肽包含杵突變，則包含臼突變，
其中i)若第二多肽的可變域為輕鏈可變域，則第五多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第二多肽的可變域為重鏈可變域，則第五多肽的可變域為輕鏈可變域。

在一個實施例中，第一多肽的可變域與第五多肽的可變域形成功能性(能結合抗原)結合位點(抗體可變域對(VH/VL對))，且第二多肽的可變域與第四多肽的可變域形成功能性或非功能性(不能結合抗原)可變域對。

本發明之一個態樣為一種(經分離)非共價複合物/多聚體多肽，包含
第一多肽，其包含
i)在N端至C端方向上，a)第一抗體可變域，其選自特異性結合至第一標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，及b)第一人類免疫球蛋白G CH3域，
及
ii)抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，其特異性結合至第二標靶，位於第一抗體可變域N端或第一CH3域C端，
第二多肽，其包含
i)在N端至C端方向上，a)第二抗體可變域，其選自特異性結合至第三標靶的抗體輕鏈可變域及抗體重鏈可變域對，及b)第二人類免疫球蛋白G CH3域，
其中若第一抗體可變域為抗體重鏈可變域，則第二抗體可變域為抗體輕鏈可變域；或若第一抗體可變域為抗體輕鏈可變域，則第二抗體可變域為抗體重鏈可變域，
及
其中第二CH3域包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的擾動突變，其中第一CH3域包含
a)位置439處之胺基酸殘基K，若擾動突變為D356K，或
b)位置370處之胺基酸殘基K，若擾動突變為E357K，或
c)位置357處之胺基酸殘基E，若擾動突變為K370E，或
d)位置356處之胺基酸殘基D，若擾動突變為K439E，
及
ii)視情況存在之抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，其特異性結合至第二標靶或第四標靶，位於第二抗體可變域N端或第二CH3域C端，該位置獨立於第一多肽之該可變域對的位置，
其中所有編號均根據Kabat EU索引。

在所有態樣之一個實施例中，第一CH3域及第二CH3域包含如本文所揭示之促進雜二聚體形成的胺基酸突變，亦即如下文章節D)雜二聚化中所概述。

在所有態樣之一個實施例中，第一CH3域及第二CH3域包含促進該第一CH3域與該第二CH3域之間形成雜二聚體且不同於擾動突變的其他突變。

在所有態樣的一個實施例中，
第一CH3域包含
a)突變T366W，或
b)突變T366S/L368A/Y407V，
及
第二CH3域包含
a)突變T366S/L368A/Y407V，若第一CH3域包含突變T366W，或
b)突變T366W，若第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V。

本發明之一個態樣為一種(經分離)非共價複合物/多聚體多肽，其包含
第一多肽，其包含
i)在N端至C端方向上，a)第一抗體可變域，其選自特異性結合至第一標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，及b)第一人類免疫球蛋白G CH3域，
其中第一CH3域包含
a)突變T366W，或突變T366S/L368A/Y407V，
及
b)視情況存在之突變Y349C或S354C，
及
ii)抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，其特異性結合至第二標靶，位於第一抗體可變域N端或第一CH3域C端，
第二多肽，其包含
i)在N端至C端方向上，a)第二抗體可變域，其選自特異性結合至第三標靶的抗體輕鏈可變域及抗體重鏈可變域對，及b)第二人類免疫球蛋白G CH3域，
其中若第一抗體可變域為抗體重鏈可變域，則第二抗體可變域為抗體輕鏈可變域；或若第一抗體可變域為抗體輕鏈可變域，則第二抗體可變域為抗體重鏈可變域，
及
其中第二CH3域包含
a)突變T366S/L368A/Y407V，若第一CH3域包含突變T366W，或
b)突變T366W，若第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V，
及
其中第二CH3域包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的擾動突變，其中第一CH3域包含
a)位置439處之胺基酸殘基K，若擾動突變為D356K，或
b)位置370處之胺基酸殘基K，若擾動突變為E357K，或
c)位置357處之胺基酸殘基E，若擾動突變為K370E，或
d)位置356處之胺基酸殘基D，若擾動突變為K439E，
及
ii)視情況存在之抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，其特異性結合至第二標靶或第四標靶，位於第二抗體可變域N端或第二CH3域C端，該位置獨立於第一多肽之該可變域對的位置，
其中所有編號均根據Kabat EU索引。

本發明之一個態樣為一種(經分離)非共價複合物/多聚體多肽，其包含
第一多肽，其包含
i)在N端至C端方向上，a)第一人類免疫球蛋白G CH3域，及b)第一抗體可變域，該第一抗體可變域選自特異性結合至第一標靶的抗體輕鏈可變域及抗體重鏈可變域對，
及
ii)抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，其特異性結合至第二標靶，位於第一抗體CH3域N端或第一抗體可變域C端，
第二多肽，其包含
i)在N端至C端方向上，a)第二人類免疫球蛋白G CH3域及b)第二抗體可變域，該第二抗體可變域選自特異性結合至第三標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，
其中若第一抗體可變域為抗體重鏈可變域，則第二抗體可變域為抗體輕鏈可變域；或若第一抗體可變域為抗體輕鏈可變域，則第二抗體可變域為抗體重鏈可變域，
及
其中第二CH3域包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的擾動突變，其中第一CH3域包含
a)位置439處之胺基酸殘基K，若擾動突變為D356K，或
b)位置370處之胺基酸殘基K，若擾動突變為E357K，或
c)位置357處之胺基酸殘基E，若擾動突變為K370E，或
d)位置356處之胺基酸殘基D，若擾動突變為K439E，
及
ii)視情況存在之抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，其特異性結合至第二標靶或第四標靶，位於第二CH3域N端或第二可變域C端，該位置獨立於第一多肽之該可變域對的位置，
其中所有編號均根據Kabat EU索引。

在所有態樣之一個實施例中，第一CH3域及第二CH3域包含如本文所揭示之促進雜二聚體形成的胺基酸突變，亦即如下文章節D)雜二聚化中所概述。

在所有態樣之一個實施例中，第一CH3域及第二CH3域包含促進該第一CH3域與該第二CH3域之間形成雜二聚體且不同於擾動突變的其他突變。

在所有態樣的一個實施例中，
第一CH3域包含
a)突變T366W，或
b)突變T366S/L368A/Y407V，
及
第二CH3域包含
a)突變T366S/L368A/Y407V，若第一CH3域包含突變T366W，或
b)突變T366W，若第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V。

本發明之一個態樣為一種(經分離)非共價複合物/多聚體多肽，其包含
第一多肽，其包含
i)在N端至C端方向上，a)第一人類免疫球蛋白G CH3域，及b)第一抗體可變域，該第一抗體可變域選自特異性結合至第一標靶的抗體輕鏈可變域及抗體重鏈可變域對，
其中第一CH3域包含
a)突變T366W，或突變T366S/L368A/Y407V，
及
b)視情況存在之突變Y349C或S354C，
及
ii)抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，其特異性結合至第二標靶，位於第一抗體CH3域N端或第一抗體可變域C端，
第二多肽，其包含
i)在N端至C端方向上，a)第二人類免疫球蛋白G CH3域及b)第二抗體可變域，該第二抗體可變域選自特異性結合至第三標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，
其中若第一抗體可變域為抗體重鏈可變域，則第二抗體可變域為抗體輕鏈可變域；或若第一抗體可變域為抗體輕鏈可變域，則第二抗體可變域為抗體重鏈可變域，
及
其中第二CH3域包含
a)突變T366S/L368A/Y407V，若第一CH3域包含突變T366W，或
b)突變T366W，若第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V，
及
其中第二CH3域包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的擾動突變，其中第一CH3域包含
a)位置439處之胺基酸殘基K，若擾動突變為D356K，或
b)位置370處之胺基酸殘基K，若擾動突變為E357K，或
c)位置357處之胺基酸殘基E，若擾動突變為K370E，或
d)位置356處之胺基酸殘基D，若擾動突變為K439E，
及
ii)視情況存在之抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，其特異性結合至第二標靶或第四標靶，位於第二CH3域N端或第二可變域C端，該位置獨立於第一多肽之該可變域對的位置，
其中所有編號均根據Kabat EU索引。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一多肽及第二多肽為非共價二聚體。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一可變域與第二可變域結合/締合且形成非功能結合位點。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一及第二多肽各自包含位於第一及第二可變域中之每一者之N端(在第一CH3域位於第一可變域C端的情況下)或第一及第二CH3域中之每一者之N端(在第一可變域位於第一及第二CH3域的情況下)的胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)或DKTHT (SEQ ID NO: 94)或GGGS (SEQ ID NO: 69)或DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97)。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，人類免疫球蛋白G為人類IgG1或人類IgG2或人類IgG3或人類IgG4。在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，人類免疫球蛋白G為人類IgG1。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，人類免疫球蛋白G CH3域為人類IgG1 CH3域或人類IgG2 CH3域或人類IgG3 CH3域或人類IgG4 CH3域。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中
i) 第一CH3域包含突變T366W及位置439處之胺基酸殘基K，
及
第二CH3域包含擾動突變D356K及突變T366S/L368A/Y407V，或
ii) 第一CH3域包含突變T366W及位置370處之胺基酸殘基K，
及
第二CH3域包含擾動突變E357K及突變T366S/L368A/Y407V，或
iii) 第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V及位置357處之胺基酸殘基E，
及
第二CH3域包含擾動突變K370E及突變T366W，或
iv) 第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V及位置356處之胺基酸殘基D，
及
第二CH3域包含擾動突變K439E及突變T366W。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一、第二及第三標靶不同。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一標靶或第三標靶為人類CD3。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，特異性結合至第二標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對選自由以下組成之群：Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、互換Fab、雙特異性Fab、sdAb及VHH。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，特異性結合至第四標靶之抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對獨立於特異性結合至第二標靶之抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對選自由以下組成之群：Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、互換Fab、雙特異性Fab、sdAb及VHH。

在本發明之所有態樣的一個實施例中，第一多肽在N端至C端方向上包含
抗體重鏈可變域或抗體輕鏈可變域，
人類免疫球蛋白G CH1域或人類抗體輕鏈恆定域，
視情況存在之另一抗體重鏈可變域或抗體輕鏈可變域，及另一人類免疫球蛋白G CH1域或人類抗體輕鏈恆定域，
SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 94或SEQ ID NO: 69或SEQ ID NO: 77或SEQ ID NO: 75或SEQ ID NO: 76或SEQ ID NO: 79或SEQ ID NO: 97之胺基酸序列，
第一抗體可變域，
視情況存在之人類免疫球蛋白G CH2域，
第一人類免疫球蛋白G CH3域，
視情況存在之胺基酸序列SEQ ID NO: 69或SEQ ID NO: 77或SEQ ID NO: 75或SEQ ID NO: 76或SEQ ID NO: 79，
視情況存在之Fab或域交換Fab或scFv或scFab。

在本發明之所有態樣的一個實施例中，第一多肽在N端至C端方向上包含
抗體重鏈可變域或抗體輕鏈可變域，
人類免疫球蛋白G CH1域或人類抗體輕鏈恆定域，
視情況存在之另一抗體重鏈可變域或抗體輕鏈可變域，及另一人類免疫球蛋白G CH1域或人類抗體輕鏈恆定域，
SEQ ID NO: 66或SEQ ID NO: 94或SEQ ID NO: 69或SEQ ID NO: 77或SEQ ID NO: 75或SEQ ID NO: 76或SEQ ID NO: 79或SEQ ID NO: 97之胺基酸序列，
視情況存在之人類免疫球蛋白G CH2域，
第一人類免疫球蛋白G CH3域，
第一抗體可變域，
視情況存在之胺基酸序列SEQ ID NO: 69或SEQ ID NO: 77或SEQ ID NO: 75或SEQ ID NO: 76或SEQ ID NO: 79，
視情況存在之Fab或域交換Fab或scFv或scFab。

本發明之一個態樣為包含根據本發明之第一多聚體多肽及根據本發明之第二多聚體多肽的組合物，其中
第一多聚體多肽之第二CH3域包含突變D356K且第二多聚體多肽之第二CH3域包含突變K439E，
或
第一多聚體多肽之第二CH3域包含突變E357K且第二多聚體多肽之第二CH3域包含突變K370E，
及
第一多聚體多肽之第一抗體可變域及第二多聚體多肽之第一可變域為特異性結合至第一標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，
及
第一多聚體多肽之第二抗體可變域及第二多聚體多肽之第二可變域為特異性結合至第三標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，
及
第二及第四標靶彼此獨立地為細胞表面抗原。

在所有組合物態樣之一個實施例中，第一多聚體多肽的第一CH3域及第二多聚體多肽的第二CH3域包含促進雜二聚體形成的相同突變且第一多聚體多肽的第二CH3域及第二多聚體多肽的第一CH3域包含促進雜二聚體形成的相同突變。

在所有組合物態樣的一個實施例中，
第一多肽的第一CH3域包含
a)突變T366W，或
b)突變T366S/L368A/Y407V，
及
第一多肽的第二CH3域包含
a)突變T366S/L368A/Y407V，若第一CH3域包含突變T366W，或
b)突變T366W，若第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V。

根據本發明的一個態樣為一種(醫藥)組合物，其包含根據本發明的第一多聚體多肽及根據本發明的第二多聚體多肽，
其中
第一多聚體多肽的第一CH3域與第二多聚體多肽的第二CH3域均包含突變T366W或突變T366S/L368A/Y407V，
及
其中
第一多聚體多肽之第二CH3域包含突變D356K且第二多聚體多肽之第二CH3域包含突變K439E，或反之亦然，
或
第一多聚體多肽的第二CH3域包含突變E357K且第二多聚體多肽的第二CH3域包含突變K370E，或反之亦然，
及
視情況其中
若第一多聚體多肽的第一抗體可變域為抗體重鏈可變域，則第二多聚體多肽的第一抗體可變域為抗體輕鏈可變域，或
若第一多聚體多肽的第一抗體可變域為抗體輕鏈可變域，則第二多聚體多肽的第一抗體可變域為抗體重鏈可變域，
及
其中
第一多聚體多肽之第一抗體可變域及第二多聚體多肽之第一抗體可變域為特異性結合至第一標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，
及
第一多聚體多肽之第二抗體可變域及第二多聚體多肽之第二抗體可變域為特異性結合至第三標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，
及
其中第二及第四標靶彼此獨立地為細胞表面抗原。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一標靶或第三標靶為人類CD3。

本發明之一個態樣為根據本發明之多聚體多肽或(醫藥)組合物，其用作藥劑。

如本文所報導之一個態樣為一種治療方法，包含向需要此類治療之患者投與根據本發明之多聚體多肽或(醫藥)組合物。

本發明至少部分地基於以下發現：多特異性抗體可以使用不完全抗體(諸如包含抗體輕鏈、抗體重鏈及抗體重鏈片段的2/3-IgG或2/3-BiFab)作為初始材料、藉由半抗體交換反應來獲得，其中重鏈-重鏈相互作用係藉由不對稱擾動突變(較佳位於重鏈片段中)失去穩定，其中該擾動突變在一方面促進初始不完全抗體解離且在另一方面促進正確組裝的全長雙特異性/多特異性抗體產生。已進一步發現，若自初始不完全抗體移除重鏈-重鏈間二硫鍵，則藉由使用此類初始化合物，本發明之方法甚至可以在還原劑不存在下進行(初始材料的產生以及多特異性抗體的交換反應及產生仍然有效地運作)。

更詳言之，本發明至少部分地基於以下發現：多特異性抗體與結合位點之細胞上活化組合可以藉由半抗體交換反應、使用不完全(亦即不發生雙特異性結合)抗體作為初始材料來獲得。初始分子各自包含彼此間結合且形成二聚體/多聚體的抗體CH3域對、不形成功能結合位點以及至少一個用於活體內細胞表面靶向之功能結合位點的抗體重鏈可變域與抗體輕鏈可變域對。因此，該CH3域對可為較大分子(諸如抗體重鏈對、融合多肽對等)之一部分。如本文中概述具有修飾的CH3域對限定根據本發明之交換反應所必需的最小結構元件。在不完全初始抗體中，CH3域仍然彼此間結合(引起二聚體或多聚體形成)，但該對CH3域之間的吸引力藉由僅存在於CH3域之一中的不對稱擾動(電荷)突變而減小，亦即失去穩定。相應其他CH3域在與突變位置相互作用的位置處仍然具有野生型殘基，如在相關野生型CH3域對中。該擾動突變僅在第二/另一較佳匹配互補不完全抗體存在的情況下促進初始不完全抗體解離且促進正確組裝的完整雙特異性抗體產生。已發現儘管i) CH3域之間存在去穩定化突變；及ii)初始不完全雙特異性抗體之兩個含CH3域多肽之間缺乏二硫鍵，但是去穩定的初始材料可以自細胞培養物上清液中分離。

本發明至少部分地基於以下進一步發現：藉由使用如上文所概述的初始化合物，使得交換反應及完整及功能性雙特異性抗體形成在還原劑不存在下發生，亦即可以在活體內進行。亦即，初始分子之含CH3域多肽之間不需要二硫鍵。因此，可以自初始不完全抗體中移除鉸鏈區二硫鍵以及其他重鏈-重鏈二硫鍵。

I. 定義
如本文所用，重鏈及輕鏈之所有恆定區及恆定域中的胺基酸位置均根據Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公眾衛生服務署(Public Health Service), 國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)中所述之Kabat編號系統編號且在本文中稱為「根據Kabat編號」。具體而言，κ及λ同型之輕鏈恆定域CL使用Kabat編號系統(參見Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版之第647-660頁, 美國公眾衛生服務署, 國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991))且重鏈恆定域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3，在此情況下，藉由參考「根據Kabat EU索引編號」來進一步闡明)使用Kabat EU索引編號系統(參見第661-723頁)。

二價雙特異性抗體之重鏈Fc區中的CH3域可以藉由「臼包杵」技術改變，該技術詳細描述於以下文獻的若干實例中：WO 96/027011；Ridgway, J .B.等人, Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及Merchant, A. M.等人, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681。在此方法中，改變兩個CH3域之相互作用表面以增加含有此兩個CH3域的雜二聚且藉此增加包含其之多肽的雜二聚。(兩個重鏈之)兩個CH3域中之每一者可為「杵」，而另一者為「臼」。引入二硫橋鍵進一步使雜二聚體穩定(Merchant, A.M.等人, Nature Biotech 16 (1998) 677-681；Atwell, S.等人, J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)且提高產量。但此在本發明的分子中不存在。

(抗體重鏈之) CH3域中的突變T366W係以「杵突變」或「突變杵」表示且(抗體重鏈之) CH3域中的突變T366S、L368A、Y407V係以「臼突變」或「突變臼」表示(根據Kabat EU索引編號)。CH3域之間亦可使用另一鏈間二硫橋鍵(Merchant, A. M.等人, Nature Biotech. 16 (1998) 677-681)，例如藉由將S354C突變引入具有「杵突變」(以「杵-cys突變」或「突變杵-cys」表示)之重鏈CH3域中及將Y349C突變引入具有「臼突變」(以「臼-cys突變」或「突變臼-cys」表示)之重鏈CH3域中(根據Kabat EU索引編號)。但此在本發明的分子中不存在。

關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊提供於Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公眾衛生服務署, 國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991)中。

用於實施本發明的適用方法及技術描述於例如Ausubel, F.M. (編), Current Protocols in Molecular Biology, 第I至III卷(1997)；Glover, N.D., 及Hames, B.D.編, DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985), Oxford University Press；Freshney, R.I. (編), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986)；Watson, J.D.等人, Recombinant DNA, 第二版, CHSL Press (1992)；Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987)；Celis, J.編, Cell Biology, 第二版, Academic Press (1998)；Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 第二版, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)。

使用重組DNA技術能夠產生核酸衍生物。此類衍生物可以例如在個別或若干核苷酸位置藉由取代、改變、交換、缺失或插入而修飾。修飾或衍生化可以例如藉助於定點突變誘發來實施。此類修飾可以容易地由熟習此項技術者實施(參見例如Sambrook, J.等人, Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA；Hames, B.D., 及Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, England)。

亦必須注意，除非上下文另有明確規定，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「一個細胞」包括多個此類細胞及熟習此項技術者已知之其等效物，諸如此類。同樣，術語「一(a)」(或「一(an)」)、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。亦應注意，術語「包含」、「包括」及「具有」可互換使用。

術語「MHCFcRP」表示包含至少一個免疫球蛋白恆定域3 (CH3)的突變重鏈 Fc 區 多肽 ，該免疫球蛋白恆定域包含杵突變或臼突變及至少一個相對於野生型序列而引入一個(亦即，單一及/或另一個)排斥電荷的擾動(亦即，去穩定化)突變。亦即，當MHCFcRP與含有第二個CH3域之多肽配對時，該第二個CH3域的胺基酸序列在(野生型免疫球蛋白中之)與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基。在一個實施例中，擾動突變係選自由以下組成之突變群組：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T (根據Kabat EU索引編號)。在一個較佳實施例中，擾動突變係選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成的突變群組。

術語「BiFab」表示包含兩對V₁ -C₁ /V₂ -C₂ 的分子，其中V表示抗體可變域且C表示抗體恆定域，其彼此間結合。舉例而言，該等對可為VH₁ -CH1/VL₁ -CL及VH₂ -CH3₁ /VL₂ -CH3₂ 。同樣，術語「TriFab」表示包含三對V₁ -C₁ /V₂ -C₂ 的分子，其中V表示抗體可變域且C表示抗體恆定域，其彼此間結合。舉例而言，該等對可為VH₁ -CH1/VL₁ -CL、VH₂ -CH1/VL₂ -CL，及VH₃ -CH3₁ /VL₃ -CH3₂ 。

術語「約」表示其後數值之+/-20%範圍。在一個實施例中，術語約表示其後數值之+/-10%範圍。在一個實施例中，術語約表示其後數值之+/-5%範圍。

術語「胺基酸取代」或「胺基酸突變」表示預定親本胺基酸序列中的至少一個胺基酸殘基經不同「置換」胺基酸殘基置換。該或該等置換殘基可為「天然存在之胺基酸殘基」(亦即，由遺傳密碼編碼)且選自由以下組成之群：丙胺酸(Ala)；精胺酸(Arg)；天冬醯胺(Asn)；天冬胺酸(Asp)；半胱胺酸(Cys)；麩醯胺酸(Gln)；麩胺酸(Glu)；甘胺酸(Gly)；組胺酸(His)；異白胺酸(Ile)：白胺酸(Leu)；離胺酸(Lys)；甲硫胺酸(Met)；苯丙胺酸(Phe)；脯胺酸(Pro)；絲胺酸(Ser)；蘇胺酸(Thr)；色胺酸(Trp)；酪胺酸(Tyr)；及纈胺酸(Val)。在一個實施例中，置換殘基不為半胱胺酸。本文中之胺基酸取代定義亦涵蓋一或多個非天然存在之胺基酸殘基取代。「非天然存在之胺基酸殘基」表示除上文所列之天然存在之彼等胺基酸殘基之外的殘基，其能夠共價結合多肽鏈中之相鄰胺基酸殘基。非天然存在之胺基酸殘基之實例包括正白胺酸、鳥胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸、aib及其他胺基酸殘基類似物，諸如Ellman等人, Meth. Enzym. 202 (1991) 301-336中所述的彼等物。為了產生非天然存在之此類胺基酸殘基，可以使用Noren等人(Science 244 (1989) 182)及/或Ellman等人(同上)之程序。簡言之，此等程序包括在化學上用非天然存在之胺基酸殘基活化抑制因子tRNA，隨後活體外轉錄及轉譯RNA。非天然存在之胺基酸亦可經由化學肽合成及隨後使此等肽與重組產生的多肽(諸如抗體或抗體片段)融合而併入肽中。

術語「抗體依賴性細胞毒性(ADCC)」為藉由Fc受體結合介導之功能且指抗體Fc區在效應細胞存在下介導靶細胞溶解。在一個實施例中，藉由在效應細胞(諸如剛分離的PBMC (周邊血液單核細胞)或自白血球層純化之效應細胞(如單核球或NK (自然殺手)細胞))存在下，用如本文所報導之包含Fc區之多肽處理表現標靶之紅血球系細胞(例如表現重組標靶之K562細胞)的製劑來量測ADCC。靶細胞經Cr-51標記且隨後與如本文所報導之多肽一起培育。將經標記細胞與效應細胞一起培育且分析上清液中的所釋放Cr-51。對照組包括將標靶內皮細胞與效應細胞一起、但不與如本文所報導之多肽一起培育。藉由量測對Fcγ受體表現細胞(諸如重組表現FcγRI及/或FcγRIIA的細胞或NK細胞(基本上表現FcγRIIIA))的結合來探究多肽誘導初始介導ADCC步驟的能力。在一個較佳實施例中，量測對NK細胞上之FcγR的結合。

術語「CH1域」表示抗體重鏈多肽之一部分，其自EU位置118大約延伸至EU位置215 (EU編號系統)。在一個實施例中，CH1域包含胺基酸序列ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSC (SEQ ID NO: 27)。

術語「CH2域」表示抗體重鏈多肽之一部分，其自EU位置231大約延伸至EU位置340 (根據Kabat的EU編號系統)。在一個實施例中，CH2域包含胺基酸序列APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK (SEQ ID NO: 28)。CH2域的獨特之處在於其不與另一域緊密配對。實情為，兩個N連接分支鏈碳水化合物鏈插入完整原生Fc區之兩個CH2域之間。已推測碳水化合物可為域-域配對提供替代物且有助於CH2域穩定化。Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206。

術語「CH3域」表示抗體重鏈多肽之一部分，其自EU位置341大約延伸至EU位置446。在一個實施例中，CH3域包含胺基酸序列GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSP (SEQ ID NO: 29)。

術語「包含」亦包括術語「由……組成」。

術語「補體依賴性細胞毒性(CDC)」係指如本文所報導之抗體Fc區在補體存在下誘導細胞溶解。在一個實施例中，藉由在補體存在下，用如本文所報導之多肽處理表現標靶之人類內皮細胞來量測CDC。在一個實施例中，細胞經鈣黃綠素標記。若多肽在30 µg/ml濃度下誘導20%或超過20%之靶細胞溶解，則發現CDC。可在ELISA中量測對補體因子C1q之結合。在此類分析中，原則上，用一定濃度範圍之添加有經純化人類C1q或人類血清的多肽塗佈ELISA盤。藉由針對C1q之抗體，隨後藉由過氧化酶標記之結合物偵測C1q結合。偵測結合(最大結合Bmax)係以405 nm光學密度(OD405)、針對過氧化酶受質ABTS® (2,2'-次偶氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鹽])量測。

如本文所用，「治療(treatment)」(及其文法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床介入且可出於防治目的或在臨床病理學之病程期間進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防轉移、減緩疾病進展速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改善預後。在一些實施例中，如本文所報導之抗體用於延遲疾病發生或減緩疾病進展。

「效應功能」係指可歸因於抗體Fc區的彼等生物活性，其因其來源之抗體類別而異。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。

抗體Fc區與Fc受體(FcR)(其為造血細胞上的專門化細胞表面受體)的相互作用可以介導Fc受體結合依賴性效應功能。Fc受體屬於免疫球蛋白超家族，且已顯示介導以下作用：藉由免疫複合物吞噬來移除經抗體塗佈之病原體，及經由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)而使紅血球及呈現Fc區的各種其他細胞標靶(例如腫瘤細胞)溶解(參見例如Van de Winkel, J.G.及Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524)。FcR係根據其對免疫球蛋白同型之特異性定義：針對IgG型Fc區之Fc受體稱為FcγR。Fc受體結合描述於例如Ravetch, J.V.及Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492；Capel, P.J.等人, Immunomethods 4 (1994) 25-34；de Haas, M.等人, J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341；Gessner, J.E.等人, Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248。

受體與IgG型抗體Fc區的交聯(FcγR)觸發多種效應功能，包括吞噬、抗體依賴性細胞毒性，及炎性介體釋放，以及免疫複合物清除及抗體產生調控。人類中的三類FcγR已表徵，其為：
− FcγRI (CD64)以高親和力結合單體IgG且在巨噬細胞、單核球、嗜中性球及嗜酸性細胞上表現。在Fc區IgG中之胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327及P329 (根據Kabat之EU索引編號)中之至少一者修飾使得對FcγRI的結合減少。位置233-236處之IgG2殘基取代至IgG1及IgG4中使對FcγRI的結合減少10³倍，且消除人類單核球對抗體敏化紅血球的反應(Armour, K.L.等人, Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。
− FcγRII (CD32)以中至低親和力結合複合的IgG且受到廣泛表現。此受體可分為兩種子類型：FcγRIIA及FcγRIIB。FcγRIIA發現於涉及殺死作用之許多細胞(例如巨噬細胞、單核球、嗜中性球)上且似乎能夠活化殺死過程。FcγRIIB似乎在抑制過程中起作用且發現於B細胞、巨噬細胞上及肥大細胞及嗜酸性球上。在B細胞上，其作用似乎為抑制免疫球蛋白進一步產生及同型轉換為例如IgE類別。在巨噬細胞上，FcγRIIB用以抑制如經由FcγRIIA介導的吞噬。在嗜酸性球及肥大細胞上，B形式可以經由IgE結合至其各別受體而有助於活化此等細胞。發現包含IgG Fc區的抗體例如對FcγRIIA的結合減少，該IgG Fc區至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292及K414 (根據Kabat EU索引編號)之一處具有突變。
− FcγRIII (CD16)係以中至低親和力結合IgG且作為兩種類型存在。FcγRIIIA發現於NK細胞、巨噬細胞、嗜酸性球及一些單核球及T細胞上且介導ADCC。FcγRIIIB高度表現於嗜中性球上。發現包含IgG Fc區三抗體例如對FcγRIIIA的結合減少，該IgG Fc區至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338及D376 (根據Kabat EU索引編號)之一處具有突變。

人類IgG1上之針對Fc受體之結合位點的定位、上述突變位點及用於量測對FcγRI及FcγRIIA之結合的方法描述於Shields, R.L.等人, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604中。

術語「鉸鏈區」表示抗體重鏈多肽的一部分，其使CH1域與CH2域在野生型抗體重鏈中連接，例如約位置221至約位置230 (根據Kabat EU編號系統)，或約位置226至約位置230 (根據Kabat EU編號系統)。其他IgG亞類的鉸鏈區可以藉由與IgG1子類序列之鉸鏈區半胱胺酸殘基比對來確定。

鉸鏈區通常為由具有一致胺基酸序列之兩個多肽組成的二聚合分子。鉸鏈區通常具有胺基酸序列DKTHTCPXCP (SEQ ID NO: 30)，其中X為S或P；或HTCPXCP (SEQ ID NO: 31)，其中X為S或P；或CPXCP (SEQ ID NO: 32)，其中X為S或P。

在一個實施例中，鉸鏈區不具有內部二硫鍵。此如下達成：用絲胺酸殘基取代SEQ ID NO: 32 (及同樣SEQ ID NO: 30及31)之序列中的半胱胺酸殘基，或使SEQ ID NO: 30、31或32之鉸鏈區中的CPXC片段(SEQ ID NO: 95)缺失。

術語「肽連接子」表示天然及/或合成來源的連接子。肽連接子由胺基酸直鏈組成，其中20種天然存在之胺基酸為藉由肽鍵連接的單體結構單元。該鏈的長度為1至50個胺基酸殘基，較佳在1與28個胺基酸殘基之間，尤其較佳在3與25個胺基酸殘基之間。肽連接子可以含有重複胺基酸序列或天然存在之多肽序列。肽連接子的作用在於確保融合多肽的結構域可以執行其生物活性，此藉由使該等結構域正確摺疊且適當呈現來達成。肽連接子較佳為「合成肽連接子」，其指定富含甘胺酸、麩醯胺酸及/或絲胺酸殘基。此等殘基排列成例如至多五個胺基酸的小重複單元，諸如GGGS (SEQ ID NO: 69)、GGGGS (SEQ ID NO: 70)、QQQG (SEQ ID NO: 71)、QQQQG (SEQ ID NO: 72)、SSSG (SEQ ID NO: 73)或SSSSG (SEQ ID NO: 74)。此小重複單元可以重複兩次至五次以形成多聚體單元，諸如(GGGS)2 (SEQ ID NO: 75)、(GGGS)3 (SEQ ID NO: 76)、(GGGS)4 (SEQ ID NO: 77)、(GGGS)5 (SEQ ID NO: 78)、(GGGGS)2 (SEQ ID NO: 79)、(GGGGS)3 (SEQ ID NO: 80)，或(GGGGS)4 (SEQ ID NO: 81)。在一個實施例中，肽連接子選自SEQ ID NO: 69至82之連接子群組。在一個實施例中，肽連接子中之每一者彼此獨立地選自由SEQ ID NO: 69至82組成的連接子群組。在一個較佳實施例中，肽連接子/各種肽連接子(彼此獨立地)選自由SEQ ID NO: 75至81組成之連接子群組。在多聚體單元之胺基端及/或羧基端，可以添加至多六個天然存在之其他任意胺基酸。其他合成肽連接子由單一胺基酸重複10至20次而構成且可以在胺基端及/或羧基端包含至多六個天然存在之其他任意胺基酸，諸如連接子GSSSSSSSSSSSSSSSG (SEQ ID NO: 82)中的絲胺酸。所有肽連接子可以由核酸分子編碼且因此可以重組表現。由於連接子本身為肽，因此抗基因融合肽經由肽鍵連接至連接子，該肽鍵在兩個胺基酸之間形成。

「抗體片段」係指除完整抗體之外的分子，其包含完整抗體之一部分，該部分結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、scFv、Fab、scFab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。關於某些抗體片段的評述，參見Hudson, P.J.等人, Nat. Med. 9 (2003) 129-134。關於scFv片段之評述，參見例如Plueckthun, A., 於; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore (編), Springer-Verlag, New York (1994), 第269-315頁；亦參見WO 93/16185；US 5,571,894及US 5,587,458。

雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點的抗體片段，該兩個抗原結合位點可為二價或雙特異性的。參見例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson, P.J.等人, Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及Holliger, P.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson, P.J.等人, Nat. Med. 9 (20039 129-134)中。

單域抗體為包含抗體重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如US 6,248,516)。

抗體片段可以藉由各種技術製得，包括(但不限於)完整抗體的蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生。

術語「抗體片段」亦包括「雙重作用型Fab」或「DAF」，其包含結合至兩種不同抗原的抗原結合位點(參見例如US 2008/0069820)。

「單特異性抗體」表示對一種抗原具有單一結合特異性的抗體。單特異性抗體可以作為全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2)或其組合(例如全長抗體加上其他scFv或Fab片段)製備。

「多特異性抗體」表示對相同抗原或兩種不同抗原上之至少兩種不同抗原決定基具有結合特異性的抗體。多特異性抗體可以作為全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)或其組合(例如全長抗體加上其他scFv或Fab片段)製備。具有兩個、三個或超過三個(例如四個)功能性抗原結合位點的工程化抗體亦已有報導(參見例如US 2002/0004587 A1)。一種多特異性抗體為雙特異性抗體。多特異性抗體亦可藉由用於製備抗體Fc-雜二聚分子的工程化靜電轉向效應(WO 2009/089004)來製成。

術語「結合至」表示結合位點對其標靶的結合，諸如包含抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域之抗體結合位點對相應抗原的結合。此結合可以使用例如BIAcore®分析(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)測定。亦即，術語「結合(至抗原)」表示抗體在活體外分析中的結合。在一個實施例中，在結合分析中測定結合，其中該抗體結合至表面且藉由表面電漿子共振(SPR)量測抗原對抗體的結合。結合意謂例如結合親和力(K_D )為10^{- 8} M或小於10^{- 8} M，在一些實施例中為10^{- 13} 至10^{- 8} M，在一些實施例中為10^{- 13} 至10^{- 9} M。術語「結合」亦包括術語「特異性結合」。

可以藉由BIAcore分析(GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Sweden)探究結合。結合親和力係藉由術語k_a (來自抗體/抗原複合物之抗體結合的速率常數)、k_d (解離常數)及K_D (k_d /k_a )定義。

舉例而言，在BIAcore®分析之一個可能實施例中，抗原結合至表面且藉由表面電漿子共振(SPR)量測抗體結合位點的結合。結合親和力係藉由術語ka (結合常數：用於結合形成複合物的速率常數)、kd (解離常數；用於複合物解離的速率常數)及KD (kd/ka)定義。或者，SPR感測圖中的結合信號可以在共振信號高度及解離特性方面，直接與參考物的反應信號加以比較。

術語「結合位點」表示對標靶顯示結合特異性的任何蛋白質實體。此可為例如受體、受體配位體、抗運載蛋白、親和抗體、抗體等。因此，如本文所用，術語「結合位點」表示可以特異性結合至或可以被第二多肽特異性結合的多肽。在一個實施例中，結合位點係選自由以下組成的多肽群組：抗體重鏈可變域、抗體輕鏈可變域、抗體重鏈與抗體輕鏈可變域對、受體或其功能片段、受體配位體或其功能片段、酶或其受質。

在抗體情況下，結合位點包含至少三個HVR (例如在VHH情況下)或六個HVR (例如在天然存在之(亦即原生)抗體情況下)。一般而言，負責抗原結合之抗體的胺基酸殘基形成結合位點。此等殘基通常包含於一對抗體重鏈可變域與同源抗體輕鏈可變域中。抗體之抗原結合位點包含來自「高變區」或「HVR」的胺基酸殘基。「構架」或「FR」區為除如本文所定義之高變區殘基之外的彼等可變域區域。因此，抗體之輕鏈及重鏈可變域自N端至C端包含區域FR1、HVR1/CDR1、FR2、HVR2/CDR2、FR3、HVR3/CDR3，及FR4 (免疫球蛋白構架)。具體言之，重鏈可變域之HVR3/CDR3區為對抗原結合貢獻最大且限定抗體結合特異性的區域。「功能結合位點」能夠特異性結合至其標靶。術語「特異性結合至」表示結合位點在活體外分析(在一個實施例，在一個結合分析中)中結合至其標靶。此類結合分析可為任何分析，只要可以偵測到結合事件。舉例而言，其中抗體結合至表面且藉由表面電漿子共振(SPR)量測抗原與抗體之結合的分析。或者，可以使用橋式ELISA。結合意謂抗體(結合子)對其標靶的結合親和力(K_D )為10^-8 M或小於10^-8 M，在一些實施例中為10^-13 M至10^-8 M，在一些實施例中為10^-13 至10^-9 M。

抗體的「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。抗體存在五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干者可以進一步分成子類(同型)，例如IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 、IgG₄ 、IgA₁ 及IgA₂ 。對應於免疫球蛋白不同類別的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及µ。

術語「Fc區」表示免疫球蛋白重鏈的C端區域，其含有鉸鏈區、CH2域及CH3域的至少一部分。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Asp221或自Cys226或自Pro230延伸至重鏈羧基端。然而，Fc區的C端離胺酸(Lys447)可或可不存在。Fc區係由兩條重鏈Fc區多肽構成，其彼此間可以經由形成鏈間二硫鍵的鉸鏈區半胱胺酸殘基共價連接。

如本文所報導之多聚體多肽/結合子在一個實施例中可以包含源於人類來源、但不具有鉸鏈區半胱胺酸殘基的Fc區作為完全Fc區。在一個實施例中，Fc區包含人類恆定區、但不具有鉸鏈區半胱胺酸殘基的所有部分。抗體的Fc區直接涉及補體活化、C1q結合、C3活化及Fc受體結合。雖然抗體對補體系統的影響依賴於某些條件，但對C1q的結合係由Fc區中的限定結合位點引起。此類結合位點在當前技術中為已知的且描述於例如Lukas, T.J.等人, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560；Brunhouse, R.,及Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917；Burton, D.R.等人, Nature 288 (1980) 338-344；Thommesen, J.E.等人, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004；Idusogie, E.E.等人, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184；Hezareh, M.等人, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168；Morgan, A.等人, Immunology 86 (1995) 319-324；及EP 0 307 434。此類結合位點為例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329 (根據Kabat EU索引編號)。子類IgG1、IgG2及IgG3的抗體通常顯示補體活化、C1q結合及C3活化，而IgG4不活化補體系統，不結合C1q且不活化C3。「抗體Fc區」為熟習此項技術者熟知且基於木瓜蛋白酶使抗體裂解而定義的術語。在一個實施例中，Fc區為人類Fc區。在一個實施例中，Fc區屬於包含突變S228P及/或L235E (根據Kabat EU索引編號)的人類IgG4子類。在一個實施例中，Fc區屬於包含突變L234A及L235A及視情況存在之P329G (根據Kabat EU索引編號)的人類IgG1子類。

術語「全長抗體」表示結構與原生抗體結構基本上類似的抗體。全長抗體包含兩個各包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的全長抗體輕鏈，及兩個各包含重鏈可變域、第一恆定域、鉸鏈區、第二恆定域及第三恆定域的全長抗體重鏈。全長抗體可以包含與全長抗體之一或多條鏈結合的其他結構域，諸如其他scFv或scFab。術語全長抗體亦涵蓋此等結合物。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指其中已引入外源核酸的細胞，包括此類細胞之後代。宿主包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括轉型的初代細胞及其衍生的後代(就繼代次數而言)。後代可以在核酸含量上與親本細胞不完全相同，但可以含有突變。本文中包括所篩選或選擇之與最初轉型之細胞具有相同功能或生物活性的突變體後代。

術語「衍生」表示藉由在至少一個位置引入變化/突變而自親本胺基酸序列獲得變異型胺基酸序列。因此，衍生的胺基酸序列與相應的親本胺基酸序列在至少一個相應位置不同。在一個實施例中，源於親本胺基酸序列的胺基酸序列在相應位置處有一至十五個胺基酸殘基的差異。在一個實施例中，源於親本胺基酸序列的胺基酸序列在相應位置處有一至十個胺基酸殘基的差異。在一個實施例中，源於親本胺基酸序列的胺基酸序列在相應位置處有一至六個胺基酸殘基的差異。同樣，衍生的胺基酸序列與其親本胺基酸序列具有較高的胺基酸序列一致性。在一個實施例中，源於親本胺基酸序列的胺基酸序列具有80%或大於80%的胺基酸序列一致性。在一個實施例中，源於親本胺基酸序列的胺基酸序列具有90%或大於90%的胺基酸序列一致性。在一個實施例中，源於親本胺基酸序列的胺基酸序列具有95%或大於95%的胺基酸序列一致性。

在一個實施例中，一或兩種重鏈Fc區多肽源於SEQ ID NO: 01的Fc區多肽且相較於SEQ ID NO: 01的Fc區多肽具有至少一個胺基酸突變或缺失。在一個實施例中，Fc區多肽包含/具有約一至約十個胺基酸突變或缺失，且在一個實施例中，Fc區多肽包含/具有約一至約五個胺基酸突變或缺失。在一個實施例中，Fc區多肽與SEQ ID NO: 01之人類Fc區多肽具有至少約80%同源性。在一個實施例中，Fc區多肽與SEQ ID NO: 01之人類Fc區多肽具有至少約90%同源性。在一個實施例中，Fc區多肽與SEQ ID NO: 01之人類Fc區多肽具有至少約95%同源性。

源於SEQ ID NO: 01或02或03或04之人類Fc區多肽的Fc區多肽進一步藉由所含的胺基酸變化來限定。因此，舉例而言，術語P329G表示源於人類Fc區多肽的Fc區多肽，該Fc區多肽相對於SEQ ID NO: 01或02或03或04之人類Fc區多肽，在胺基酸位置329的脯胺酸突變為甘胺酸。

人類IgG1 Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

以下Fc區為源於野生型人類IgG1 Fc區的變異體。

源於人類IgG1 Fc區之具有突變L234A、L235A的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：


。

源於人類IgG1 Fc區之具有Y349C、T366S、L368A及Y407V突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有S354C、T366W突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有L234A、L235A突變及Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有L234A、L235A及S354C、T366W突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有P329G突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有L234A、L235A突變及P329G突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有P329G突變及Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有P329G突變及S354C、T366W突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有L234A、L235A、P329G及Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG1 Fc區之具有L234A、L235A、P329G突變及S354C、T366W突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

人類IgG4 Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

以下Fc區為源於野生型人類IgG4 Fc區的變異體。

源於人類IgG4 Fc區之具有S228P及L235E突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有S228P、L235E突變及P329G突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有S354C、T366W突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有S228P、L235E及S354C、T366W突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有S228P、L235E及Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：


。

源於人類IgG4 Fc區之具有P329G突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有P329G及Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有P329G及S354C、T366W突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有S228P、L235E、P329G及Y349C、T366S、L368A、Y407V突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

源於人類IgG4 Fc區之具有S228P、L235E、P329G及S354C、T366W突變的Fc區多肽包含以下胺基酸序列：

。

「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含基本上所有的至少一個且典型兩個可變域，其中所有或基本上所有HVR (例如CDR)對應於非人類抗體的彼等HVR，且所有或基本上所有FR對應於人類抗體的彼等對應於人類抗體的彼等FR。人類化抗體視情況可以包含源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體的「人類化形式」，例如非人類抗體，係指已經歷人類化的抗體。

如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域的每個區域，其包含序列高度可變的胺基酸殘基片段(「互補決定區」或「CDR」)且/或形成結構上確定的環(「高變環」)，且/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸點」)。一般而言，抗體包含六個HVR；三個存在於重鏈可變域VH (H1、H2、H3)中，且三個存在於輕鏈可變域VL (L1、L2、L3)中。

HVR包括
(a) 存在於胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)的高變環(Chothia, C.及Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917)；
(b) 存在於胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)的CDR (Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公眾衛生服務署, 國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991), NIH公告91-3242.)；
(c) 存在於胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)的抗原接觸點(MacCallum等人, J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及
(d) (a)、(b)及/或(c)之組合，包括胺基酸殘基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)及94-102 (H3)。

除非另有說明，否則可變域中的HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人(同上)編號。

術語「輕鏈」表示原生IgG抗體之較短多肽鏈。抗體輕鏈基於其恆定域之胺基酸序列可歸為兩種類型之一，稱為kappa (κ)及lambda (λ)。關於人類κ輕鏈恆定域，參見SEQ ID NO: 33且關於人類λ輕鏈恆定域，參見SEQ ID NO: 34。

術語「互補位」係指所指定抗體分子的一部分，其為標靶與結合位點之間特異性結合所必需的。互補位可為連續的，亦即，由存在於結合位點中的相鄰胺基酸殘基形成，或可為不連續的，亦即，由位於初始序列(諸如HVR/CDR之胺基酸序列)中之不同順序位置、但在結合位點所採用之三維結構中緊鄰著的胺基酸殘基形成。

「分離」的抗體為一種抗體，其已與其天然環境中的組分分離。在一些實施例中，抗體經純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電點聚焦(IEF)、毛細管電泳、CE-SDS)或層析(例如尺寸排阻層析或離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評估抗體純度之方法的評述，參見例如Flatman, S.等人, J. Chrom. B 848 (2007) 79-87。

「分離」的核酸係指一種核酸分子，其已與其天然環境分離。分離的核酸包括通常含有該核酸分子之細胞中所含的核酸，但該核酸分子存在於染色體外或位於與其天然染色體位置不同的染色體位置。

如本文所用，術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體群獲得的抗體，亦即，構成該群體的個別抗體相同且/或結合相同抗原決定基，但可能的變異型抗體(例如含有天然存在之突變或在單株抗體製劑製備期間產生)除外，此類變異體通常少量存在。與典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體製劑中的各種單株抗體係針對抗原上的單一決定子。因此，修飾語「單株」表示自實質上均質抗體群獲得之抗體特徵，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，根據本發明使用的單株抗體可藉由多種技藝製備，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法，及使用含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分之轉殖基因動物的方法，本文中描述了此類方法及用於製備單株抗體的其他例示性方法。

「原生抗體」係指天然存在的具有不同結構之免疫球蛋白分子。舉例而言，原生IgG抗體為約150,000道爾頓的雜四聚醣蛋白，其由二硫鍵鍵結的兩條相同輕鏈與兩條相同重鏈構成。各重鏈自N端至C端，具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，繼之為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，各輕鏈自N端至C端，具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，繼之為恆定輕鏈(CL)域。抗體輕鏈基於其恆定域的胺基酸序列，可歸為兩種類型之一，稱為kappa (κ)及lambda (λ)。

術語「醫藥調配物」係指一種製劑，其所呈形式可允許其中所含活性成分的生物活性有效，且其不含毒性對調配物將投與之受試者不可接受的其他組分。

「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中之除活性成分之外的成分，其對於受試者而言無毒。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

如本文所用，術語「重組抗體」表示藉由重組方式製備、表現、形成或分離的所有抗體(嵌合體、人類化及人類)。此包括自宿主細胞(諸如NS0、HEK、BHK或CHO細胞)中分離的抗體，或使用轉染至宿主細胞內之重組表現質體所表現的抗體。

如本申請案中所用，術語「價」表示(抗體)分子內存在特定數目個結合位點。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」表示(抗體)分子內分別存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。如本文所報導的雙特異性抗體在一個較佳實施例中為「三價」的。如本文所報導的三特異性抗體(如本文所報導)在一個較佳實施例中為「三價」的。

術語「可變區」或「可變域」係指涉及抗體結合至其抗原的抗體重鏈或輕鏈結構域。抗體重鏈與輕鏈可變域(分別為VH及VL)通常具有類似的結構，其中每個結構域包含四個構架區(FR)及三個超變區(HVR) (參見例如Kindt, T.J.等人, Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman及Co., N.Y. (2007), 第91頁)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。另外，結合特定抗原的抗體可以利用來自結合抗原之抗體的VH或VL域加以分離，以分別篩選出互補VL或VH域的文庫。參見例如Portolano, S.等人, J. Immunol. 150 (1993) 880-887；Clackson, T.等人, Nature 352 (1991) 624-628)。

術語「變異體」表示胺基酸序列與親本分子之胺基酸序列不同的分子。典型地，此類分子具有一或多種變化、插入或缺失。在一個實施例中，經修飾的抗體或經修飾的融合多肽包含含有非天然存在之Fc區之至少一部分的胺基酸序列。此類分子與親本結構域或Fc區具有小於100%的序列一致性。在一個實施例中，變異體的胺基酸序列與親本結構域或Fc區的胺基酸序列具有約75%至小於100% (特定言之，約80%至小於100%，特定言之，約85%至小於100%，特定言之，約90%至小於100%，且特定言之，約95%至小於100%)的胺基酸序列一致性。在一個實施例中，親本結構域或Fc區與變異型結構域或Fc區相差一個(或單一)、兩個或三個胺基酸殘基。

如本文所用，術語「域互換」表示在一對抗體重鏈VH-CH1片段及其相應同源抗體輕鏈中，亦即，在抗體結合臂(亦即，在Fab片段中)，抗體序列偏離天然序列之處在於至少一個重鏈域被其相應輕鏈域取代，且反之亦然。域互換一般存在三種類型：(i) CH1與CL域的互換，其產生具有VL-CH1域序列的域互換輕鏈及具有VH-CL域序列的域互換重鏈片段(或具有VH-CL-鉸鏈-CH2-CH3域序列的全長抗體重鏈)；(ii) VH與VL域的域互換，其產生具有VH-CL域序列的域互換輕鏈及具有VL-CH1域序列的域互換重鏈片段；及(iii)完整輕鏈(VL-CL)與完整VH-CH1重鏈片段的域互換(「Fab crossover」)，其產生具有VH-CH1域序列的域互換輕鏈及具有VL-CL域序列的域互換重鏈片段(所有上述域序列均依N端至C端方向指示)。

如本文所用，術語「彼此間置換」結合相應的重鏈與輕鏈域而言，係指上述域互換。因此，當CH1與CL域「彼此間置換」時，其係指(i)項下所提及的域互換，及所得重鏈及輕鏈域序列。因此，當VH與VL「彼此間置換」時，其係指(ii)項下所提及的域互換；且當CH1與CL域「彼此間置換」且VH1與VL域「彼此間置換」時，其係指(iii)項下所提及的域互換。包括域互換的雙特異性抗體報導於例如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254及Schaefer, W.等人, Proc. Natl. Acad. Sci USA 108 (2011) 11187-11192。

利用本文所報導方法產生的多特異性抗體亦可包含Fab片段，該等片段包括如在上述(i)項下所提及之CH1與CL域的域互換，或在上述(ii)項下所提及之VH與VL域的域互換。特異性結合至相同抗原的Fab片段經構築具有相同的域序列。因此，在超過一個具有域互換之Fab片段包含於多特異性抗體中的情況下，該(等) Fab片段特異性結合至相同抗原。

II. 藉由根據本發明之交換反應產生雙特異性/多特異性抗體
A) 使單特異性單價IgG衍生物轉化為雙特異性二價IgG的方法
如下文中所概述的交換方法可以達成單特異性(單價)抗體或抗體片段向二價雙特異性抗體(bsAb)的轉化或已具多特異性抗體向高階多特異性抗體的轉化，諸如雙特異性抗體於三特異性或四特異性抗體中。

兩個非功能性半抗體(亦即，對細胞標靶僅具單特異性)用作初始材料。可以使用例示性2/3-IgG。2/3-IgG係由具有第一組臼包杵(KiH)突變的重鏈、與其互補的輕鏈以及Fc區構成，該Fc區藉由相應互補的第二組臼包杵突變而與重鏈的Fc區互補。互補Fc區可為例如Fc區重鏈片段或第二重鏈(視情況不具有結合特異性)。為了進一步促進所要雙(多)特異性抗體正確組裝，互補Fc區除包含第二組互補KiH突變之外，亦包含額外的擾動(去穩定化)排斥電荷突變。另外，互補Fc區可以包含親和標籤(例如His6或C標籤)用於在其產生之後有效移除非所要離析物及副產物。第二非功能性單特異性抗體包含互補擾動突變。一旦抗體一半在彼此間交換(例如在細胞表面上結合的同時進行相互作用後)，則此兩種擾動突變轉變成吸引性突變。

可以使用本發明之多聚體分子進行的細胞上交換反應/方法包含以下步驟
- 使包含第一多肽及第二多肽的第一(初始)多聚體多肽與包含第三多肽及第四多肽的第二(初始)多聚體多肽在細胞表面上接近，以使第二與第三多肽交叉互換，從而形成第三多聚體多肽(包含第一及第四多肽)及第四多聚體多肽(包含第二及第三多肽)，
其中
i) 該第二多肽包含(第一擾動)突變，相較於與第一多聚體多肽相同、除該第二多肽中之該突變之外的(多聚體)多肽，該突變引起該第一多聚體多肽失去穩定，
ii) 該第三多肽包含(第二擾動)突變，相較於與第二(多聚體)多肽相同、除該第三多肽中之該突變之外的多聚體多肽，該突變引起該第二多聚體多肽失去穩定，
iii) 相較於第一(初始)多聚體多肽及/或第二(初始)多聚體多肽，該第二多肽中之(第一擾動)突變及該第三多肽中之(第二擾動)突變引起包含該第二多肽及該第三多肽之第三(交換)多聚體多肽穩定，
iv) 相較於第一(初始)多聚體多肽及/或第二(初始)多聚體多肽，第四(交換)多聚體多肽更穩定，
v) 第一多聚體多肽及第二多聚體多肽各自僅包含一或兩個新結合位點的一部分，該等新結合位點不具功能性，亦即不能結合至其標靶，及
vi) 第三及/或第四多聚體多肽包含一或兩個新結合位點的功能形式，亦即，允許特異性結合至其相應標靶的形式，其中已藉由第二與第三多肽在第一多聚體多肽與第二多聚體多肽之間交換而產生/活化一或兩個新功能結合位點，亦即，使該一或兩個新結合位點的非功能部分結合在一起而形成一或兩個新功能結合位點。

因此，本發明至少部分地基於以下發現：在(雜)多聚體多肽中添加單一(單側、不成對)去穩定化(擾動)突變足以促進多肽鏈與亦包含一個單一(單側、不成對)去穩定化(擾動)突變的第二(雜)多聚體多肽發生交換，原因為所得兩種新形成的交換(雜)多聚體多肽相較於初始(雜)多聚體多肽具有改良的穩定性(亦即，CH3-CH3結合自由能較低)，因為在交換及重組後，去穩定化突變轉變成吸引性突變。必須遵循的唯一限制條件為，在相應多肽彼此間結合後，在彼此間相互作用的位置處引入去穩定化(擾動)突變。

此方法可應用於滿足如上文所概述之準則的任何(雜)多聚體多肽。

然而，根據本發明的方法尤其適用於醫藥領域。

此項技術中已知用於產生(雜)多聚體多肽的不同方法。可以使用此等方法中之任一者，只要形成初始(雜)多聚體多肽所必需的突變不干擾根據本發明之交換反應所必需的(擾動)去穩定化突變或與該等突變重疊。

轉回至醫藥領域，抗體為使用類別最廣泛的結合子。抗體經由其恆定區中、尤其重鏈之CH3域之間的相互作用而二聚。

因此，本發明至少部分地基於如下發現：在一對CH3域中之一個CH3域中引入單一去穩定化突變足以用於執行本發明的方法。更詳細而言，已發現在兩種初始(雜)多聚體多肽進行空間方法後，在第一初始(雜)多聚體多肽之唯一一個CH3域中的位置357處引入第一去穩定化突變及在第二初始多肽之唯一一個CH3域中的位置370處引入第二去穩定化突變促進多肽鏈在此等初始多肽之間自發交換。所得交換多肽之一包含分別在位置357及370具有突變的CH3域對，該等突變引起交換的(雜)多聚體穩定。類似情形可以經由位置356及439處的突變達成。所有位置根據Kabat EU索引編號。一對較佳突變為E357K及K370E。另一對較佳突變為D356K及K439E。根據本發明的方法可應用於任何IgG子類，亦即IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，原因為所討論的殘基為高度保守的。在一個較佳實施例中，CH3域屬於IgG1子類。

本發明至少部分地基於如下發現：初始(雜)多聚體多肽的多肽鏈不需要彼此間共價連接，例如經由二硫鍵共價連接，以便於形成及分離初始(雜)多聚體多肽。更詳細而言，由於初始多肽已為雜二聚體，因此此等多肽包含用於雜二聚化的其他突變。已發現，此等突變足以使初始雜二聚體穩定，即使在單一、單側的特定去穩定化(擾動)突變存在下。從而不再需要初始(雜)多聚體多肽中之鏈共價鍵聯。因此，在一個實施例中，在含有鉸鏈區之初始(雜)多聚體多肽情況下，此等鉸鏈區包含突變C226S及C229S，或整個CPXC (SEQ ID NO: 95)序列的缺失(根據Kabat EU索引編號)。

藉由將(雜)多聚體初始多肽之包含Fc區之鏈之間的二硫鍵省去，無需還原劑來起始交換反應。此允許交換反應在溫和的活體內條件下發生。另外，其他二硫鍵可以存在於初始(雜)多聚體多肽中，諸如存在於Fab片段中，只要此等二硫鍵不干擾交換反應(與包含CH3域的多肽共價結合在一起)。

本發明至少部分地基於以下發現：交換的(雜)多聚體多肽，例如僅包含功能及標靶結合位點的彼等多肽，可以藉由僅在交換反應之後形成二硫鍵來進一步穩定化。舉例而言，為了(雜)多聚體抗體形成而良好確立的突變為臼包杵突變。此等突變存在於兩種變異體中：不具有及具有額外的二硫鍵。因此，一種替代的初始(雜)多聚體多肽包含用於形成初始(雜)多聚體多肽的臼包杵突變，且僅在具有標靶結合位點的多肽鏈中提供臼包杵半胱胺酸殘基。從而僅在包含兩個標靶結合位點的交換(雜)多聚體多肽中存在為了在相應匹配位置形成二硫鍵所必需的兩個半胱胺酸殘基。因此，僅在該交換產物中形成二硫鍵。此引起標靶交換(雜)多聚體多肽進一步穩定，從而防止解離及/或回復反應。

如本文所用，術語「(雜)多聚體」表示一種包含至少兩條多肽鏈的多肽，該等多肽鏈在胺基酸序列上部分地或完全地不一致且滿足本發明的需要。術語亦涵蓋包含三個或超過三個多肽鏈的多肽，只要其中的至少兩者為根據本發明的(雜)多聚體。因此，術語「多聚體」表示包含至少三個多肽鏈的多肽，其中至少兩者為(雜)多聚體且滿足本發明的需要。

術語「擾動突變」表示引起(雜)二聚多肽失去穩定的突變。此去穩定化通常藉由改變胺基酸殘基電荷來達成，諸如使帶正電胺基酸殘基與帶負電胺基酸殘基交換，或反之亦然。此類交換引起CH3-CH3域界面之相互作用位置出現相似電荷且從而引起電荷排斥。一對較佳突變為E357K及K370E。另一對較佳突變為D356K及K439E。另外，根據本發明的方法可應用於任何IgG子類，亦即IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，原因為所討論的殘基為高度保守的。在一個較佳實施例中，CH3域屬於IgG1子類。

WO 2009/089004 (以引用之方式併入本文中)中揭示一種評估CH3域突變對二聚體穩定性之影響的方法。其中概述如何可以使用EGAD軟體估算CH3-CH3域結合自由能(亦參見Pokala, N.及Handel, T.M., J. Mol. Biol. 347 (2005) 203-227，該文獻以全文引用之方式併入本文中)：

EGAD可以用於大致比較在CH3域界面所產生之各種突變的結合自由能。突變體的結合自由能定義為ΔΔGmut = μ (ΔGmut - ΔGwt)(mut = 突變體，wt = 野生型)。其中，μ (=0.1，一般而言)為使結合親和力之預測變化歸一化而使用的比例因子，與實驗能量相比，其斜率為1。解離自由能(ΔG)定義為複合狀態(ΔG結合)與自由狀態(ΔG自由)之間的能量差。

本發明在下文中以特定的例示性初始材料(亦即2/3-IgG)為例說明。此以潛在大體構思之範例呈現且不應理解為對本發明的限制。本發明的真實範疇闡述於申請專利範圍中。

圖1顯示作為例示性初始化合物用於本發明方法中之2/3-IgG的設計及模組化組成。2/3-IgG係由三條個別鏈構成：一條輕鏈(通常為包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的全長輕鏈)、一條重鏈(通常為包含重鏈可變域及所有重鏈恆定域的全長重鏈，該等重鏈恆定域包括具有或不具有半胱胺酸殘基的鉸鏈區)，及一條互補重鏈Fc區多肽(通常為包含至少一部分鉸鏈及CH2-CH3的重鏈Fc區片段，該鉸鏈區不具有半胱胺酸殘基)。輕鏈與重鏈的可變域形成功能結合位點，亦即VH/VL對。

亦可在本發明方法中用作例示性初始化合物之2/3-BiFab的設計及模組化組成為類似的。2/3-BiFab係由三條個別鏈構成：一條輕鏈(通常為包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的全長輕鏈)、一條重鏈(通常為包含第一重鏈可變域、CH1域、第二可變域及CH3域的變異型全長重鏈，該CH3域包括具有或不具有半胱胺酸殘基的鉸鏈區)，及一條互補重鏈多肽(通常為包含鉸鏈-可變域-CH3的重鏈片段，該鉸鏈區具有或不具有半胱胺酸殘基)。輕鏈可變域與重鏈之第一可變域形成功能結合位點，亦即VH/VL對，且重鏈之第二可變域與互補重鏈Fc區多肽之可變域亦形成VH/VL對，該VH/VL對通常無功能，亦即不能結合。

重鏈(通常為人類IgG1子類的重鏈)含有i)杵突變或臼突變(抗體重鏈CH3域中的突變T366W表示為「杵突變」且抗體重鏈CH3域中的突變T366S、L368A及Y407V表示為「臼突變」(根據Kabat EU索引編號))，或ii)杵-cys突變或臼-cys突變(抗體重鏈CH3域中的突變T366W及S354C表示為「杵-cys突變」且抗體重鏈CH3域中的突變T366S、L368A、Y407V、Y349C表示為「臼-cys突變」；逆向配置同樣可以：CH3域中之T366W/Y349C及T366S/L368A/Y407V/S354C (根據Kabat EU索引編號)，以允許臼包杵Fc區雜二聚體形成。

互補重鏈Fc區多肽或互補重鏈多肽亦可表示為『假Fc』或『假HC』，亦即缺乏VH及CH1的IgG1衍生物，其以N端始於鉸鏈區序列(或其片段)，隨後為CH2域或可變域，隨後為CH3域且視情況包含純化標籤(例如His6或His8或C標籤)於其C端。另外，此互補多肽的CH3域含有杵突變或臼突變，此視重鏈中的突變而定。除杵突變或臼突變之外，互補多肽相對於野生型序列亦包含至少一個引入一個(亦即，另一個單一)或多個排斥電荷的擾動(亦即，去穩定化)突變。舉例而言，突變D356K或E357K分別與突變K370E或K439E分別組合(參見圖2)。此類突變的重鏈 Fc 區 多肽 在下文中表示為MHCFcRP。

重鏈與MHCFcRP可以形成兩種類型的雜二聚體，此視其中臼包杵突變的分佈而定：
i) 重鏈-杵::MHCFcRP-臼，及
ii) 重鏈-臼::MHCFcRP-杵。

因此，2/3-IgG及2/3-BiFab為與輕鏈結合的雜二聚體，亦即雜三聚體。然而，此等物稍微『有瑕疵』，原因為MHCFcRP中的電荷突變與重鏈中的配對物不匹配且若存在於重鏈中，則MHCFcRP的電荷擾動突變與重鏈配對物不匹配。

2/3-IgG為單價、非二聚/聚集、單臂抗體衍生物，其可以表現且純化至與正常IgG相似的產量(參見圖3)。此確保初始材料為一價。若使用二價2/3-IgG，則其可為單特異性以及雙特異性的。

然而，構成彼等有瑕疵之2/3-IgG的多肽能夠重排成雙特異性抗體，如圖4中所示。

兩種初始分子之間的交換反應係由KiH (臼包杵)重鏈(H鏈)彼此間的較佳互補性(無電荷排斥及視情況形成二硫鍵(若存在自由半胱胺酸殘基))驅動以及由兩個MHCFcRP彼此間的較佳互補性驅動。在反應中，兩種初始分子的Fc區複合物解離且發生多肽交換而形成兩種更有利的複合物。此如下驅動反應：
2/3-IgG(A)-標籤 + 2/3-IgG(B)-標籤
(初始雜二聚多肽)
→
bsAb(AB) + MHCFcRP(A)-MHCFcRP(B)-標籤
(交換的雜二聚多肽)。

在如圖4所描繪之實例中，初始2/3-IgG之重鏈(杵-cys) A與初始2/3-IgG之重鏈(臼-cys) B形成匹配的雙特異性抗體雜四聚體(2xHC + 2xLC)。

由於在此細胞上/活體內情形中使用不含鉸鏈區二硫鍵的2/3-IgG，因此無需還原步驟。自發地發生鏈重排。

此同樣適用於2/3-BiFab。

參見實例1至5。

B) 使一價及/或二價單特異性或雙特異性IgG衍生物轉化成二價、三價或四價雙特異性、三特異性或四特異性抗體的方法
使用本發明的方法，不僅可以將不同結合特異性組合，而且可以使此等組合在不同形式內以不同價數同時產生。此係藉由擴增方法中所使用之起始材料來達成，如前述章節中所概述。

舉例而言，如前述章節中所概述，以2/3-IgG為起始物，維持MHCFcRP不變，但使用不同形式的重鏈。此類形式可為例如在C端或在N端具有一個結合位點或兩個結合位點的鏈(一個在N端且一個在C端)(參見例如圖9及10)。

在此實例中，不同初始形式(例如具有N端結合位點、C端結合位點，或N端與C端結合位點)在本發明之方法中彼此間組合，從而允許產生個別結合位點具有才、不同幾何形狀及不同三維排列/位置的不同抗體形式(在本發明實例中，為9種，參見圖11)。

為了產生多特異性抗體，不改變交換驅動原理(有瑕疵的輸入分子轉化為匹配的輸出分子)。MHCFcRP亦得以持留。因此，僅改變重鏈。

舉例而言，圖1及9至10顯示三種不同初始分子(具有N端、C端及N端與C端結合位點的2/3-IgG)，該等初始分子在交換反應中(亦即在本發明方法中)已彼此組合，從而產生九種不同雙特異性形式。此等形式的不同之處在於個別結合位點的價數、幾何形狀及位置。

不受此理論束縛，假設基於兩種不同2/3-IgG或2/3-BiFab之有瑕疵雜多聚體之臨時分離的交換反應應產生較佳含有匹配型Fc區雜二聚體的產物。因此，交換使2/3-IgG轉化為四鏈IgG (不同形式)，以及相應的Fc區雜二聚體。

若鉸鏈區二硫鍵存在於活體外，則藉由使鏈間鉸鏈區二硫鍵斷裂的還原步驟來起始交換反應，在不具有鉸鏈區二硫鍵的細胞上/活體內情形中，此還原步驟可以省去。鏈重排自發地發生。

參見實例6及7。

C) 不存在Fc-Fc鏈間二硫鍵且不涉及還原步驟的反應
重鏈鏈間二硫鍵使抗體穩定且限定連接至鉸鏈之Fab臂的柔性。包含初始抗體之鉸鏈區的交換途徑需要此等二硫鍵在交換反應之前或期間還原以及在交換反應完成後移除還原劑(參見實例3及7)。

因此，本文中報導具有鉸鏈區、但不具有鏈間二硫鍵之初始分子的交換反應。

為了對此舉例說明，已產生其中Fc區中之所有二硫鍵已排除的2/3-IgG以及2/3-BiFab。已發現，此類二硫鍵耗乏之2/3-分子可以有效方式產生及純化，甚至不存在此等鏈間二硫鍵(參見例如圖15及20)。當使用此類二硫鍵耗乏之2/3-分子作為初始分子時，根據本發明的方法有可能在活體內進行，原因為不再需要還原步驟，使得此等分子特別適於細胞上交換反應及活體內應用。由此等二硫鍵耗乏之2/3-IgG及2/3-BiFab製成的多特異性抗體具有功能且穩定，藉由非共價Fc-Fc相互作用而非鏈間二硫鍵結合在一起(參見圖15及16)。

因此，Fc-Fc鏈間二硫鍵的消去從而允許相應的Fc區錯配驅動交換反應，而無需還原及再氧化(亦即在生理條件下)。此有助於製備及(高處理量)篩選程序。此亦允許域交換反應在生理條件下發生，包括在活細胞表面上發生。

參見實例8。

在一個實施例中，鉸鏈區不含二硫鍵。不含二硫鍵的鉸鏈區在SEQ ID NO: 32序列中包含絲胺酸殘基替代半胱胺酸殘基。

除移除二硫鍵之外，另外可以縮短鉸鏈區。藉由使用此類經修飾之鉸鏈區，可以獲得在個別結合位點之間提供不同距離的雙特異性抗體(參見圖51)。因此，在一個實施例中，鉸鏈區具有胺基酸序列SEQ ID NO: 31 (HTCPXCP，X=S或P)，或SEQ ID NO: 95 (HTSPXSP，X=S或P)，或SEQ ID NO: 94 (HTPAPE；SEQ ID NO: 31之CPXC已缺失)或DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97)。

III. 根據本發明之方法
本文中報導一種用於兩種不同標靶抗體-前藥衍生物在細胞上進行組裝/半抗體交換以直接在細胞表面上之預定作用位點產生新功能(較佳為具有治療效果的新功能)的方法。
根據本發明之方法在下文中以特定例示性初始材料(亦即2/3-IgG及2/3-BiFab)為例說明。此僅以潛在大體構思之範例呈現且不應理解為對本發明的限制。本發明的真實範疇闡述於申請專利範圍中。

A) 單價單特異性抗體在細胞上轉化為二價IgG
相較於二價抗體，單價抗體可以顯示減小的針對細胞表面之結合能力。不受此理論束縛，假設原因為二價誘導的針對細胞表面之表觀親和力(亦即，親合力效應)增強。在細胞表面上親合力增強的結合及/或滯留可以藉由使相同抗原/抗原決定基與抗體之兩個結合位點/兩個臂結合來達成。在此單特異性配置中，相較於抗原密度低的細胞(兩個臂均結合的機率降低)，二價結合可以增強針對攜帶大量同源抗原之細胞的結合特異性(兩個臂均結合的機率增加)。

在細胞表面上親合力增強的結合及/或滯留亦可藉由使兩種不同抗原與雙特異性抗體的不同結合位點/不同臂結合來達成。不受此理論束縛，假設在此雙特異性配置中，相較於呈現及/或表現僅一種抗原的細胞(僅一個結合位點/一個臂可以結合)，二價結合引起對呈現及/或表現兩種抗原之細胞的結合特異性增強(兩個結合位點/兩個臂均結合)。

解決親合力介導之結合改良的當前技術係應用預形成的bsAb識別兩個標靶。為了達成特異性，必需使各單價臂的親和力相當低，以避免採取單價方式的充分結合強度超過親合力效應。若滿足該前提條件，則bsAb可以增強的特異性結合至呈現及/或表現兩種抗原的細胞。

當前可獲得之親合力驅動結合改良構思的一個缺點為，細胞表面上之兩種抗原的密度可能不為預形成之bsAb本身結合的必需前提條件(只要兩者均存在且可及)。抗原密度可能僅決定結合至表現抗原之細胞之bsAb的量。

因此，具有極高效力(及/或潛在毒性問題)的實體具有結合至細胞且影響細胞的風險，該等細胞呈現/表現高以及低水準的兩種靶抗原。舉例而言，具有內在或添加之細胞毒性功能的bsAb不僅可以影響呈現高抗原水準的腫瘤細胞，而且可以影響具有低抗原水準的非標靶正常細胞。

由於交換反應需要兩個單特異性交換搭配物的物理相互作用，因此如本文所報導之方法(其中雙特異性抗體係藉由單價單特異性抗體在細胞上轉化來形成)可應用於解決上述問題。此類相互作用的機率與濃度相關，亦即，在低濃度下，相互作用及交換的機率低，而在增加的濃度下，相互作用及交換的機率較高。因此，舉例而言，具有不同特異性之單特異性抗體的各別(連續)應用引起兩種單特異性組分在呈現較大量之兩種抗原之細胞上的積聚增加(親和力低)。因此，此類細胞不僅積聚了濃度增加的個別抗體，而且使其轉化為bsAb的有效性大得多。彼等bsAb又由於其兩個結合位點親合結合至細胞表面抗原而持留於靶細胞上，同時未交換的前驅物抗體將解離。

B) 產生具有前藥功能的BiFab及在細胞上轉化為功能TriFab
本文中所報導之交換反應的驅動力為具有「有瑕疵」CH3界面的兩種輸入分子轉化成具有匹配CH3界面的兩種產物。指明此等CH3界面的設計位於MHCFcRP的組成中。MHCFcRP包含CH2域及CH3域。然而，促成MHCFcRP之特殊組成的所有突變位於CH3域中。因此，可以用其他不同結構域置換MHCFcRP之CH2域以及相關重鏈之彼等域。彼等域必須仍允許(或甚至支持)重鏈-MHCFcRP雜二聚化產生「有瑕疵」分子。

用其他能夠實現雜二聚化的結構域置換IgG樣分子之CH2域的可能性已顯示於TriFab形式中(參見WO 2016/087416；圖18)。TriFab由於CH2域分別與VH及VL交換而呈現雙特異性功能。此類分子的Fc樣『莖區域』藉由完整KiH CH3域結合在一起。由於KiH CH3域與MHCFcRP之經修飾之CH3域相容，因此彼等域亦可實現含有2/3-BiFab類似物之MHCFcRP的產生，該等類似物具有能夠實現交換的特徵。

由於一個CH2域經VH域置換且另一個域經互補VL域置換，因此TriFab具有功能Fv替代Fc區之CH2域。2/3-BiFab衍生物含有具有無關(亦即，非同源) VH或VL域(在先前CH2位置)的MHCFcRP，亦即此等物不結合至標靶。2/3-BiFab保留一個功能單價結合臂，但在莖區域中含有第3結合位點之一半(參見圖18)。兩個互補2/3-BiFab分子的交換反應不僅重構TriFab形式，而且在『莖區域』重構額外第3結合功能(CH2置換)。交換反應因此使兩種2/3-BiFab前藥轉化成全功能TriFab。

如上文針對2/3-IgG所述之Fc-Fc鏈間二硫鍵(鉸鏈區及CH3域)的消除允許MHCFcRP驅動的交換反應而無需可控的還原及再氧化。因此，此類分子的交換反應可以在生理條件(尤其包括個別(單特異性)實體結合至靶細胞表面時的條件)下發生。應用相同原理，2/3-BiFab在其功能Fab臂/功能結合位點結合後積聚於靶細胞上。若兩個互補2/3-BiFab (均載有無結合活性、但彼此互補的莖-Fv)結合至相同細胞的表面，則鏈交換反應直接發生於該等細胞之表面上。此交換係在細胞上/原位/在活體內產生(亦即直接在細胞表面上之預定作用位點產生)全功能TriFab，該TriFab直接在細胞表面上(亦即在作用位點)至少具有雙重或甚至參重特異性。2/3-BiFab衍生前藥活化原理僅在以足夠密度表現一或多種靶抗原的細胞表面上產生結合功能。此允許僅在所需細胞上產生功能(包括極高效力及/或潛在PK或毒性問題的彼等功能)。

使用本發明之方法，可以使用低親和力單特異性結合子直接在細胞上產生高親和力結合子且同時活化治療結合位點。

IV. 用於本發明方法中的多特異性分子
A) 多聚體多肽
用於在細胞上進行根據本發明之交換反應/方法的多聚體多肽定義如下
- 包含第一多肽及第二多肽，其中每一者包含免疫球蛋白CH3域及結合位點的非功能部分，其中結合位點的此非功能部分位於兩種多肽中之CH3域的N端或C端；且該等多肽中之至少一者包含特異性結合至細胞表面標靶、較佳結合至非內化細胞表面標靶的功能結合位點，
- 該等CH3域僅一者中包含引起多聚體多肽去穩定的(擾動)突變，此係與該去穩定多聚體多肽相同、除第二多肽中之該突變之外的(多聚體)多肽相比較，
- 包含用於形成雜二聚體的突變，及
- 該第一及第二多肽之間缺乏二硫鍵。

因此，本發明至少部分地基於以下發現：在(雜)多聚體多肽中添加單一(單側、不成對)去穩定化(擾動)突變足以促進多肽鏈與亦包含一個單一(單側、不成對)去穩定化(擾動)突變的第二(雜)多聚體多肽發生交換，原因為所得兩種新形成的交換(雜)多聚體多肽相較於初始(雜)多聚體多肽具有改良的穩定性(亦即，CH3-CH3結合自由能較低)，因為在交換及重組後，去穩定化突變轉變成吸引性突變。必須遵循的唯一限制條件為，在相應多肽彼此間結合後，在彼此間相互作用的位置處引入去穩定化(擾動)突變。

此方法可應用於滿足如上文所概述之準則的任何(雜)多聚體多肽。

因此，用於本發明之方法中的多聚體多肽可以包含其他域或多肽。

在一個實施例中，根據本發明的多聚體多肽在第一及第二多肽中另外包含位於CH3域N端(直接)或C端(直接)的免疫球蛋白CH2域。在一個較佳實施例中，其他免疫球蛋白CH2域位於CH3域N端。

在一個實施例中，多聚體多肽包含鉸鏈區及突變C226S及C229S，或不具有CPXC (SEQ ID NO: 95)序列(根據Kabat EU索引編號)的鉸鏈區，或不包含鉸鏈區。

此項技術中已知用於產生(雜)多聚體多肽的不同方法。可以使用此等方法中之任一者，只要形成初始(雜)多聚體多肽所必需的突變不干擾根據本發明之交換反應所必需的(擾動)去穩定化突變或與該等突變重疊。

因此，本發明至少部分地基於如下發現：在一對CH3域中之一個CH3域中引入單一去穩定化突變足以用於執行本發明的方法。更詳細而言，已發現在兩種初始(雜)多聚體多肽進行空間方法後，在第一初始(雜)多聚體多肽之唯一一個CH3域中的位置357處引入第一去穩定化突變及在第二初始多肽之唯一一個CH3域中的位置370處引入第二去穩定化突變促進多肽鏈在此等初始多肽之間自發交換。所得交換多肽之一包含分別在位置357及370具有突變的CH3域對，該等突變引起交換的(雜)多聚體穩定。類似情形可以經由位置356及439處的突變達成。所有位置根據Kabat EU索引編號。一對較佳突變為E357K及K370E。另一對較佳突變為D356K及K439E。根據本發明的方法可應用於任何IgG子類，亦即IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，原因為所討論的殘基為高度保守的。在一個較佳實施例中，CH3域屬於IgG1子類。

在一個實施例中，多聚體多肽包含
第一多肽，其包含
i)在N端至C端方向上，a)第一抗體可變域，其選自特異性結合至第一標靶之抗體輕鏈與重鏈可變域對，及b)第一人類免疫球蛋白G CH3域，
其中第一CH3域包含
a)突變T366W，或
b)突變T366S/L368A/Y407V，
及
ii)特異性結合至第二標靶的抗體輕鏈與重鏈可變域對，位於第一抗體可變域N端或第一CH3域C端，
第二多肽，其包含
i)在N端至C端方向上，a)第二抗體可變域，其選自特異性結合至第三標靶的抗體輕鏈與重鏈可變域對，及b)第二人類免疫球蛋白G CH3域，
其中若第一抗體可變域為抗體重鏈可變域，則第二抗體可變域為抗體輕鏈可變域；或若第一抗體可變域為抗體輕鏈可變域，則第二抗體可變域為抗體重鏈可變域，
及
其中第二CH3域包含
a)突變T366S/L368A/Y407V，若第一CH3域包含突變T366W，或
b)突變T366W，若第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V，
及
其中第二CH3域包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的擾動突變，其中第一CH3域包含
a)位置439處之胺基酸殘基K，若擾動突變為D356K，或
b)位置370處之胺基酸殘基K，若擾動突變為E357K，或
c)位置357處之胺基酸殘基E，若擾動突變為K370E，或
d)位置356處之胺基酸殘基D，若擾動突變為K439E，
及
ii)視情況存在之特異性結合至第二或第四標靶的抗體輕鏈與重鏈可變域對，位於第二抗體可變域N端或第二CH3域C端，
其中所有編號均根據Kabat EU索引。

在一個實施例中，多聚體多肽包含
第一多肽，其包含
i)在N端至C端方向上，a)第一人類免疫球蛋白G CH3域，及b)第一抗體可變域，其選自特異性結合至第一標靶之抗體輕鏈與重鏈可變域對，
其中第一CH3域包含
a)突變T366W，或
b)突變T366S/L368A/Y407V，
及
ii)特異性結合至第二標靶的抗體輕鏈與重鏈可變域對，位於第一CH3域N端或第一可變域C端，
第二多肽，其包含
i)在N端至C端方向上，a)第二人類免疫球蛋白G CH3域，及b)第二抗體可變域，其選自特異性結合至第三標靶的抗體輕鏈與重鏈可變域對，
其中若第一抗體可變域為抗體重鏈可變域，則第二抗體可變域為抗體輕鏈可變域；或若第一抗體可變域為抗體輕鏈可變域，則第二抗體可變域為抗體重鏈可變域，
及
其中第二CH3域包含
a)突變T366S/L368A/Y407V，若第一CH3域包含突變T366W，或
b)突變T366W，若第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V，
及
其中第二CH3域包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的擾動突變，其中第一CH3域包含
a)位置439處之胺基酸殘基K，若擾動突變為D356K，或
b)位置370處之胺基酸殘基K，若擾動突變為E357K，或
c)位置357處之胺基酸殘基E，若擾動突變為K370E，或
d)位置356處之胺基酸殘基D，若擾動突變為K439E，
及
ii)視情況存在之特異性結合至第二或第四標靶的抗體輕鏈與重鏈可變域對，位於第二CH3域N端或第二可變域C端，
其中所有編號均根據Kabat EU索引。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一多肽及第二多肽為非共價二聚體。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一可變域與第二可變域形成非功能結合位點。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一及第二多肽各自包含第一及第二可變域N端的胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)或DKTHT (SEQ ID NO: 94)或GGGS (SEQ ID NO: 69)或DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97)。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中
i) 第一CH3域包含突變T366W及位置439處之胺基酸殘基K，
及
第二CH3域包含擾動突變D356K及突變T366S/L368A/Y407V，或
ii) 第一CH3域包含突變及位置370處之胺基酸殘基K，
及
第二CH3域包含擾動突變E357K及突變T366S/L368A/Y407V，或
iii) 第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V及位置357處之胺基酸殘基E，
及
第二CH3域包含擾動突變K370E及突變T366W，或
iv) 第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V及位置356處之胺基酸殘基D，
及
第二CH3域包含擾動突變K439E及突變T366W。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一、第二及第三標靶不同。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一標靶或第三標靶為人類CD3。

在所有態樣的一個實施例中，第二及(若存在)第四標靶為相同或不同的且均位於相同(標靶)細胞表面上。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，特異性結合至第二標靶之抗體輕鏈與重鏈可變域對選自由以下組成之群：Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、互換Fab、雙特異性Fab、sdAb及VHH。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，特異性結合至第四標靶之抗體輕鏈與重鏈可變域對獨立於特異性結合至第二標靶之抗體輕鏈與重鏈可變域對選自由以下組成之群：Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、互換Fab、雙特異性Fab、sdAb及VHH。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一及第二多肽進一步包含CH3域N端的免疫球蛋白G CH2域。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，人類免疫球蛋白G為人類IgG1或人類IgG2或IgG3或人類IgG4。

B) 用於根據本發明之方法中的組合物
可以使用包含兩種根據本發明之多聚體分子之組合物進行的細胞上交換反應/方法包含以下步驟
- 使包含第一多肽及第二多肽的第一(初始)多聚體多肽及包含第三多肽及第四多肽的第二(初始)多聚體多肽接近細胞表面，以使第二與第三多肽交叉互換，從而形成第三多聚體多肽及第四多聚體多肽，
其中
i) 該第二多肽包含(第一擾動)突變，相較於與第一多聚體多肽相同、除該第二多肽中之該突變之外的(多聚體)多肽，該突變引起該第一多聚體多肽失去穩定，
ii) 該第三多肽包含(第二擾動)突變，相較於與第二(多聚體)多肽相同、除該第三多肽中之該突變之外的多聚體多肽，該突變引起該第二多聚體多肽失去穩定，
iii) 相較於第一(初始)多聚體多肽及/或第二(初始)多聚體多肽，該第二多肽中之(第一擾動)突變及該第三多肽中之(第二擾動)突變引起包含該第二多肽及該第三多肽之第三(交換)多聚體多肽穩定，
iv) 相較於第一(初始)多聚體多肽及/或第二(初始)多聚體多肽，第四(交換)多聚體多肽穩定化，
v) 第一多聚體多肽及第二多聚體多肽各自僅包含一或兩個新結合位點的一部分，該等新結合位點不具功能性，亦即不能結合至其標靶，及
vi) 第三及/或第四多聚體多肽包含一或兩個新結合位點的功能形式，亦即允許特異性結合至其相應標靶的形式，該功能形式已藉由在第一多聚體多肽與第二多聚體多肽之間進行多肽交換而產生/活化，亦即，使該一或兩個新結合位點的非功能部分結合在一起而形成一或兩個新功能結合位點。

本發明之一個態樣為包含根據本發明之第一多聚體多肽及根據本發明之第二多聚體多肽的組合物，其中
第一多聚體多肽的第一CH3域與第二多聚體多肽的第二CH3域均包含突變T366W或突變T366S/L368A/Y407V，
及
第一多聚體多肽之第二CH3域包含突變D356K且第二多聚體多肽之第二CH3域包含突變K439E，
或
第一多聚體多肽之第二CH3域包含突變E357K且第二多聚體多肽之第二CH3域包含突變K370E，
及
第一多聚體多肽之第一抗體可變域及第二多聚體多肽之第一抗體可變域為特異性結合至第一標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，
及
第一多聚體多肽之第二抗體可變域及第二多聚體多肽之第二抗體可變域為特異性結合至第三標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對，
及
第二及第四標靶彼此獨立地為細胞表面抗原。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，第一及/或第三標靶為人類CD3。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，組合物為醫藥組合物且進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。

在根據本發明之所有態樣的一個實施例中，組合物用作藥劑。

C) Fc區變異體
在某些實施例中，一或多個其他胺基酸修飾可以引入本文提供之根據本發明之多聚體多肽之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可以包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)的人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。

在某些實施例中，本發明涵蓋根據本發明的多聚體多肽，其具有一些但非所有的效應功能，從而使得其成為合乎應用需要之候選物，在該等應用中，活體內抗體半衰期具有重要作用，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以證實CDC及/或ADCC活性之減小/耗乏。舉例而言，可以進行Fc受體(FcR)結合分析，以確保根據本發明的多聚體多肽缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch, J.V.及Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492第464頁之表3中。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於US 5,500,362 (參見例如Hellstrom, I.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及Hellstrom, I.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502)；US 5,821,337 (參見Bruggemann, M.等人, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361)中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流式細胞術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96^® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI)。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。替代地或另外，可以評估所關注之分子在活體內(例如在動物模型中)的ADCC活性，諸如Clynes, R.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656中所揭示。亦可進行C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性(參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA)。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro, H.等人, J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171；Cragg, M.S.等人, Blood 101 (2003) 1045-1052；及Cragg, M.S.及M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743)。亦可使用此項技術中已知之方法(參見例如Petkova, S.B.等人, Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769)測定FcRn結合及活體內清除/半衰期。

包含效應功能減少之Fc區的本發明多聚體多肽包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者被取代的彼等多肽(US 6,737,056)。此類Fc區突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或超過兩者處具有取代的Fc區突變體，包括殘基265及297經丙胺酸取代的所謂「DANA」Fc區突變體(US 7,332,581)。

根據本發明的某些多聚體多肽包含對FcR之結合改良或減弱的Fc區變異體(參見例如US 6,737,056；WO 2004/056312，及Shields, R.L.等人, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。

在某些實施例中，根據本發明的多聚體多肽包含Fc區變異體，該Fc區變異體具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代，例如Fc區之位置298、333及/或334處的取代(殘基之EU編號)。

在一些實施例中，在Fc區中產生變化，從而引起C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即，改良或減弱)，例如如以下文獻中所述：US 6,194,551、WO 99/51642及Idusogie, E.E.等人, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184。

半衰期延長且對新生兒Fc受體(FcRn)之結合改良的抗體描述於US 2005/0014934中，該新生兒Fc受體負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer, R.L.等人, J. Immunol. 117 (1976) 587-593；及Kim, J.K.等人, J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434)。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該等取代改良Fc區與FcRn的結合。此類Fc區變異體包括Fc區殘基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中之一或多者被取代的彼等變異體，例如Fc區殘基434被取代(US 7,371,826)。

關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan, A.R.及Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 94/29351。

在所有態樣之一個實施例中，根據本發明的多聚體多肽包含(根據Kabat EU索引的所有位置)
i) 兩種Fc區多肽中具有突變P329G、L234A及L235A之人類IgG1子類的Fc區，或
ii) 兩種Fc區多肽中具有突變P329G、S228P及L235E之人類IgG4子類的Fc區，或
iii) 兩種Fc區多肽中具有突變P329G、L234A、L235A、I253A、H310A及H435A或兩種Fc區多肽中具有突變P329G、L234A、L235A、H310A、H433A及Y436A之人類IgG1子類的Fc區，或
iv) 人類IgG1子類之雜二聚Fc區，其中兩種Fc區多肽均包含突變P329G、L234A及L235A，及
a) 一種Fc區多肽包含突變T366W，且另一種Fc區多肽包含突變T366S、L368A及Y407V，或
b) 一種Fc區多肽包含突變T366W及Y349C，且另一種Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及S354C，
c) 一種Fc區多肽包含突變T366W及S354C，且另一種Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及Y349C，
或
v) 人類IgG4子類之雜二聚Fc區，其中兩種Fc區多肽均包含突變P329G、S228P及L235A，及
a) 一種Fc區多肽包含突變T366W，且另一種Fc區多肽包含突變T366S、L368A及Y407V，或
b) 一種Fc區多肽包含突變T366W及Y349C，且另一種Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及S354C，
c) 一種Fc區多肽包含突變T366W及S354C，且另一種Fc區多肽包含突變T366S、L368A、Y407V及Y349C，
或
vi) i)、ii)及iii)之一與iv)及v)之一的組合。

在如本文所報導之所有態樣的一個實施例中，包含CH3域之本發明多聚體多肽包含另一個C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在如本文所報導之所有態樣的一個實施例中，包含CH3域的本發明多聚體多肽包含另一個C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。

在一個實施例中，根據本發明的多聚體多肽包含Fc區，該Fc區的特徵為屬於具有突變PVA236、L234A/L235A及/或GLPSS331的人類子類IgG1 (根據Kabat EU索引編號)，或屬於子類IgG4。在另一實施例中，根據本發明之多聚體多肽的特徵為包含Fc區，該Fc區屬於任何IgG類別，在一個實施例中屬於IgG1或IgG4子類，從而在E233、L234、L235、G236、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331及/或P329 (根據Kabat EU索引編號)含有至少一個突變。另外在一個實施例中，根據本發明的多聚體多肽包含人類IgG4子類之Fc區，該Fc區含有突變S228P或突變S228P及L235E (Angal, S.等人, Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108)(根據Kabat EU索引編號)。

根據本發明之多聚體多肽中所包含之Fc區多肽的C端可為終止於胺基酸殘基PGK的完整C端。C端可為縮短的C端，其中C端胺基酸殘基中之一或兩個已移除。在一個較佳實施例中，C端為終止於胺基酸殘基PG的縮短C端。

D) 雜二聚化
用於CH3修飾以便支持雜二聚之若干種方法已描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中，該等文獻均以引用的方式包括於本文中。

典型地，在此項技術中已知之方法中，第一重鏈之CH3域與第二重鏈之CH3域均以互補方式經工程改造，使得包含一個工程化CH3域的重鏈可以不再與相同結構之另一重鏈發生均二聚(例如CH3工程化第一重鏈可以不再與另一CH3工程化第一重鏈發生均二聚；且CH3工程化第二重鏈可以不再與另一CH3工程化第二重鏈發生均二聚)。藉此，包含一個工程化CH3域的重鏈與另一個包含CH3域的重鏈發生雜二聚，此以互補方式進行工程改造。在此實施例中，第一重鏈Fc區多肽的CH3域與第二重鏈Fc區多肽的CH3域係以互補方式藉由胺基酸取代進行工程改造，以便第一重鏈Fc區多肽與第二重鏈Fc區多肽發生雜二聚，而第一重鏈Fc區多肽與第二重鏈Fc區多肽不再發生均二聚(例如因空間原因)。

上文所引述且所包括、此項技術中已知之用於支持重鏈雜二聚化的不同方法作為用於提供如本文所報導之雜二聚/多聚體多肽(例如2/3-IgG)的不同替代方式涵蓋在內。

根據本發明之多聚體多肽中的CH3域可以藉由「臼包杵」技術改變，該技術以若干實例詳細描述於例如WO 96/027011；Ridgway, J.B.等人, Protein Eng. 9 (1996) 617-621；及Merchant, A.M.等人, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681。在此方法中，改變兩個CH3域的相互作用表面以增加含有此兩種CH3域之兩種重鏈Fc區多肽的雜二聚化。(兩種重鏈Fc區多肽之)兩種CH3域中之每一者可為「杵」，而另一者為「臼」。另外可以引入二硫橋鍵以使雜二聚體進一步穩定(Merchant, A.M.等人, Nature Biotech. 16 (1998) 677-681；Atwell, S.等人, J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)且在根據本發明的交換反應中增加產量。

在一個較佳實施例中，根據本發明的多聚體多肽在「杵鏈」之CH3域中包含T366W突變且在「臼鏈」之CH3域中包含T366S、L368A、Y407V突變(根據Kabat EU索引編號)。CH3域之間亦可使用額外的鏈間二硫橋鍵(Merchant, A.M.等人, Nature Biotech. 16 (1998) 677-681)，例如藉由將Y349C突變引入杵鏈之一CH3域中及將E356C突變或S354C突變引入臼鏈之一CH3域中(在根據本發明的交換反應中，使用兩種多聚體作為初始材料，該等多聚體中僅一個CH3域包含額外半胱胺酸殘基，從而僅在交換產物中形成額外二硫鍵)。因此在另一個較佳實施例中，根據本發明的多聚體多肽在第一多聚體之一個CH3域中包含Y349C及T366W突變且在第二多聚體之相應互補CH3域中包含E356C、T366S、L368A及Y407V突變；或根據本發明的多聚體多肽在第一多聚體之一個CH3域中包含Y349C及T366W突變且在第二多聚體之相應互補CH3域中包含S354C、T366S、L368A及Y407V突變(一個CH3域中的額外Y349C突變與相應CH3域中的額外E356C或S354C突變形成鏈間二硫橋鍵)(根據Kabat EU索引編號)。

而且可以替代地或另外使用如EP 1 870 459 A1所述之其他臼包杵技術。在一個實施例中，根據本發明的多聚體多肽在「杵鏈」的CH3域中包含R409D及K370E突變且在「臼鏈」的CH3域中包含D399K及E357K突變(根據Kabat EU索引編號)。

在一個實施例中，根據本發明的多聚體多肽在「杵鏈」之CH3域中包含T366W突變且在「臼鏈」之CH3域中包含T366S、L368A及Y407V突變，且另外，在「杵鏈」之CH3域中包含R409D及K370E突變且在「臼鏈」之CH3域中包含D399K及E357K突變(根據Kabat EU索引編號)。

在一個實施例中，根據本發明的多聚體抗體在一個CH3域中包含Y349C及T366W突變且在互補CH3域中包含S354C、T366S、L368A及Y407V突變，或根據本發明的多聚體多肽在一個CH3域中包含Y349C及T366W突變且在互補CH3域中包含S354C、T366S、L368A及Y407V突變，且另外，在「杵鏈」之CH3域中包含R409D及K370E突變且在「臼鏈」之CH3域中包含D399K及E357K突變(根據Kabat EU索引編號)。

除「臼包杵技術」之外，用於修飾本發明多聚體多肽之重鏈CH3域以加強雜二聚化的其他技術在此項技術中已知。本文涵蓋此等技術，具體言之，WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954及WO 2013/096291中所述之技術，作為「臼包杵技術」之替代方案與本發明多聚體多肽的組合。

在本發明多聚體多肽的一個實施例中，EP 1 870 459 A1中所述的方法用於支持本發明多聚體多肽之第一重鏈與第二重鏈的雜二聚化。此方法係基於在第一與第二重鏈之間的CH3/CH3域界面中之特定胺基酸位置處引入帶相反電荷之帶電胺基酸。

因此，此實施例係關於根據本發明的多聚體多肽，其中在多聚體的三級結構中，第一重鏈Fc區多肽的CH3域與第二重鏈Fc區多肽的CH3域形成位於相應CH3域之間的界面，其中第一重鏈Fc區多肽CH3域及第二重鏈Fc區多肽CH3域的相應胺基酸序列各自包含位於本發明之多聚體多肽之三級結構中的該界面內的胺基酸集合，其中在位於一條重鏈Fc區多肽之CH3域中之界面內的胺基酸集合中，第一胺基酸經帶正電的胺基酸取代且在位於另一重鏈Fc區多肽之CH3域中之界面內的胺基酸集合中，第二胺基酸經帶負電的胺基酸取代。根據此實施例之多聚體多肽在本文中亦稱為「CH3(+/-)工程化多特異性抗體」(其中縮寫「+/-」表示引入相應CH3域中之帶相反電荷胺基酸)。

在本發明之該CH3(+/-)工程化多聚體多肽的一個實施例中，帶正電胺基酸係選自K、R及H，且帶負電胺基酸係選自E或D。

在本發明之該CH3(+/-)工程化多聚體多肽的一個實施例中，帶正電胺基酸係選自K及R，且帶負電胺基酸係選自E或D。

在本發明之該CH3(+/-)工程化多聚體多肽的一個實施例中，帶正電胺基酸為K，且帶負電胺基酸為E。

在如本文所報導之該CH3(+/-)工程化2/3-IgG的一個實施例中，在一個重鏈之CH3域中，位置409處之胺基酸R經D取代且位置370處之胺基酸K經E取代，且在另一個重鏈之CH3域中，位置399處之胺基酸D經K取代且位置357處之胺基酸E經K取代(根據Kabat EU索引編號)。

在本發明多聚體多肽的一個實施例中，WO 2013/157953中所述的方法用於支持多聚體多肽之第一重鏈Fc區多肽與第二重鏈Fc區多肽的雜二聚化。在本發明之該多聚體多肽的一個實施例中，在一個重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處之胺基酸T經K取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置351處之胺基酸L經D取代(根據Kabat EU索引編號)。在本發明之該多聚體多肽的另一個實施例中，在一個重鏈Fc區多肽之CH3域中，位置366處之胺基酸T經K取代且位置351處之胺基酸L經K取代，且在另一重鏈Fc區多肽之CH3域中，位置351處之胺基酸L經D取代(根據Kabat EU索引編號)。

在本發明之該多聚體多肽的另一個實施例中，在一個重鏈Fc區多肽之CH3域中，位置366處之胺基酸T經K取代且位置351處之胺基酸L經K取代，且在另一重鏈Fc區多肽之CH3域中，位置351處之胺基酸L經D取代(根據Kabat EU索引編號)。另外，另一重鏈Fc區多肽之CH3域中包含以下取代中之至少一者：位置349處的胺基酸Y經E取代，位置349處的胺基酸Y經D取代且位置368處的胺基酸L經E取代(根據Kabat EU索引編號)。在一個實施例中，位置368處之胺基酸L經E取代(根據Kabat EU索引編號)。

在本發明多聚體多肽的一個實施例中，WO 2012/058768中所述的方法用於支持本發明之多聚體多肽之第一Fc區多肽與第二Fc區多肽的雜二聚化。在本發明之該多聚體多肽的一個實施例中，在一個重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置351處之胺基酸L經Y取代且位置407處之胺基酸Y經A取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處之胺基酸T經A取代且位置409處之胺基酸K經F取代(根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，除前述取代之外，在另一重鏈Fc區多肽之CH3域中，位置411 (最初為T)、399 (最初為D)、400 (最初為S)、405 (最初為F)、390 (最初為N)及392 (最初為K)之胺基酸中之至少一者經取代(根據Kabat EU索引編號)。較佳取代為：
- 位置411之胺基酸T經選自N、R、Q、K、D、E及W之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)，
- 位置399處之胺基酸D經選自R、W、Y及K之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)，
- 位置400處之胺基酸S經選自E、D、R及K之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)，
- 位置405處之胺基酸F經選自I、M、T、S、V及W之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；
- 位置390處之胺基酸N經選自R、K及D之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；及
- 位置392處之胺基酸K經選自V、M、R、L、F及E之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。

在本發明之多聚體多肽(根據WO 2012/058768經工程改造)的另一個實施例中，在一個重鏈Fc區多肽之CH3域中，位置351處之胺基酸L經Y取代且位置407處之胺基酸Y經A取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處之胺基酸T經V取代且位置409處之胺基酸K經F取代(根據Kabat EU索引編號)。在本發明之該多聚體多肽的另一個實施例中，在一個重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置407處之胺基酸Y經A取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處之胺基酸T經A取代且位置409處之胺基酸K經F取代(根據Kabat EU索引編號)。在該前述最後一個實施例中，在該另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置392處的胺基酸K經E取代，位置411處的胺基酸T經E取代，位置399處的胺基酸D經R取代且位置400處的胺基酸S經R取代(根據Kabat EU索引編號)。

在本發明多聚體多肽的一個實施例中，WO 2011/143545中所述的方法用於支持本發明之多聚體多肽之第一Fc區多肽與第二Fc區多肽的雜二聚化。在本發明之該多聚體多肽的一個實施例中，兩種重鏈Fc區多肽之CH3域中的胺基酸修飾在位置368及/或409引入(根據Kabat EU索引編號)。

在本發明多聚體多肽的一個實施例中，WO 2011/090762中所述的方法用於支持本發明之多聚體多肽之第一Fc區多肽與第二Fc區多肽的雜二聚化。WO 2011/090762係關於根據「臼包杵」技術進行胺基酸修飾。在本發明之該CH3(KiH)工程化多聚體多肽的一個實施例中，在一個重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處之胺基酸T經W取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置407處之胺基酸Y經A取代(根據Kabat EU索引編號)。在本發明之該CH3(KiH)工程化多聚體多肽的另一個實施例中，在一個重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置366處之胺基酸T經Y取代，且在另一重鏈Fc區多肽之CH3域中，位置407處之胺基酸Y經T取代(根據Kabat EU索引編號)。

在本發明之多聚體多肽(IgG2同型)的一個實施例中，WO 2011/090762中所述的方法用於支持本發明之多聚體多肽中之第一重鏈Fc區多肽與第二重鏈Fc區多肽的雜二聚化。

在本發明多聚體多肽的一個實施例中，WO 2007/147901中所述的方法用於支持本發明之多聚體多肽之第一Fc區多肽與第二Fc區多肽的雜二聚化。在本發明之該多聚體多肽的一個實施例中，在一個重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置253處之胺基酸K經E取代，位置282處之胺基酸D經K取代且位置322處之胺基酸K經D取代，且在另一重鏈Fc區多肽的CH3域中，位置239處之胺基酸D經K取代，位置240處之胺基酸E經K取代且位置292處之胺基酸K經D取代(根據Kabat EU索引編號)。

在本發明多聚體多肽的一個實施例中，WO 2007/110205中所述的方法用於支持本發明之多聚體多肽之第一多肽與第二多肽的雜二聚化。

在如本文所報導之所有態樣的一個實施例中，本發明的多聚體多肽具有IgG型抗體的恆定域結構。在如本文所報導之所有態樣的另一實施例中，本發明多聚體多肽的特徵在於，該多聚體多肽包含人類子類IgG1之Fc區，或具有突變L234A及L235A及視情況存在之P329G之人類子類IgG1的Fc區。在如本文所報導之所有態樣的另一實施例中，本發明多聚體多肽的特徵在於，該多聚體多肽包含人類子類IgG2的Fc區。在如本文所報導之所有態樣的一個實施例中，本發明多聚體多肽的特徵在於，該多聚體多肽包含人類子類IgG3的Fc區。在如本文所報導之所有態樣的另一實施例中，本發明多聚體多肽的特徵在於，該多聚體多肽包含人類子類IgG4之Fc區，或具有額外突變S228P及L235E及視情況存在之P329G之人類子類IgG4的Fc區。

在所有態樣的一個實施例中，本發明的多聚體多肽包含第一Fc區多肽及第二Fc區多肽，其中
i) 該第一及第二Fc區多肽包含突變Y436A，或
ii) 該第一及第二Fc區多肽包含突變I253A、H310A及H435A，或
iii) 該第一及第二Fc區多肽包含突變H310A、H433A及Y436A，或
iv) 該第一及第二Fc區多肽包含突變L251D、L314D及L432D，或
v) 該第一Fc區多肽包含突變Y436A且該第二Fc區多肽包含
a)突變I253A、H310A及H435A，或
b)突變H310A、H433A及Y436A，或
c)突變L251D、L314D及L432D，
或
vi) 該第一Fc區多肽包含突變I253A、H310A及H435A且該第二Fc區多肽包含
a)突變H310A、H433A及Y436A，或
b)突變L251D、L314D及L432D，
或
vii) 該第一Fc區多肽包含突變H310A、H433A及Y436A且該第二Fc區多肽包含
a)突變L251D、L314D及L432D。

V. 重組方法及組合物
可以使用重組方法及組合物(例如如美國專利第4,816,567號中所述)產生抗體。在一個實施例中，提供經分離之核酸，其編碼如本文所述之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab。在另一實施例中，提供一或多種包含此類核酸的載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供包含此類核酸之宿主細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如人類胚胎腎臟(HEK)細胞或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp2/0細胞)。在一個實施例中，提供一種製備不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab的方法，其中該方法包含在適於表現抗體的條件下培養如上文所提供之包含編碼不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab之核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab。

為了重組產生不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab，分離出編碼不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab的核酸(例如如上文所述)且插入一或多種載體中用於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。

適用於選殖或表現不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab編碼載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。

舉例而言，抗體可於細菌中產生，尤其當不需要糖基化及Fc效應功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如US 5,648,237、US 5,789,199及US 5,840,523。(亦參見Charlton, K.A., 於: Methods in Molecular Biology, 第248卷, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2003), 第245-254頁，該文獻描述抗體片段在大腸桿菌中的表現)。表現之後，可以自可溶性溶離份中之細菌細胞糊狀物分離出抗體且可以進一步純化。

除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab編碼載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已「人類化」的真菌及酵母株系，從而以部分或完全人類糖基化模式產生不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab。參見Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及Li, H.等人, Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215。

適用於表現不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之糖基化2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之糖基化2/3-BiFab的宿主細胞亦源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞的實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出多種桿狀病毒株，其可聯合昆蟲細胞使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )細胞。

植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978及US 6,417,429 (描述用於在轉殖基因植物中產生抗體的PLANTIBODIES^TM 技術)。

脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為藉由SV40轉型之猴腎CV1株系(COS-7)；人類胚胎腎臟株系(293或293細胞，如例如Graham, F.L.等人, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)(TM4細胞，如例如Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌瘤細胞(HELA)；犬科動物腎細胞(MDCK；水牛鼠(buffalo rat)肝臟細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝臟細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如例如Mather, J.P.等人, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68中所述；MRC 5細胞；以及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub, G.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；以及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適用於產生抗體之某些哺乳動物宿主細胞株的評述，參見例如Yazaki, P.及Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, 第248卷, Lo, B.K.C. (編), Humana Press, Totowa, NJ (2004), 第255-268頁。

VI. 用於診斷及偵測之方法及組合物
在某些實施例中，本文所提供之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab中的任一者適用於偵測其標靶在生物樣品中的存在。如本文所用，術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織。

在一個實施例中，提供不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab用於診斷或偵測方法中。

在某些實施例中，提供不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之經標記之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之經標記之2/3-BiFab。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標記)，以及間接(例如經由酶反應或分子相互作用)偵測之部分，諸如酶或配位體。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素³² P、¹⁴ C、¹²⁵ I、³ H及¹³¹ I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹醯基(dansyl)；傘酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(US 4,737,456)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與使用過氧化氫將染料前驅物氧化之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似標記。

VII. 免疫結合物
本發明亦提供免疫結合物，其包含如本文所報導之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab與一或多種細胞毒性劑的結合，諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素。

在一個實施例中，免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC)，其中不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab與一或多種藥物結合，包括(但不限於)類美登素(參見US 5,208,020、US 5,416,064及EP 0 425 235 B1)；奧瑞他汀(auristatin)，諸如單甲基奧瑞他汀藥物部分DE及DF (MMAE及MMAF)(參見US 5,635,483、US 5,780,588及US 7,498,298)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇黴素或其衍生物(參見US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001及US 5,877,296；Hinman, L.M.等人, Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342；及Lode, H.N.等人, Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928)；蒽環黴素(anthracycline)，諸如柔紅黴素(daunomycin)或小紅莓(doxorubicin)(參見Kratz, F.等人, Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523；Jeffrey, S.C.等人, Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362；Torgov, M.Y.等人, Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721；Nagy, A.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834；Dubowchik, G.M.等人, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532；King, H.D.等人, J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343；及US 6,630,579)；甲胺喋呤(methotrexate)；長春地辛(vindesine)；紫杉烷，諸如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel)；新月毒素(trichothecene)；及CC1065。

在另一個實施例中，免疫結合物包含如本文所述之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab與酶活性毒素或其片段的結合，包括(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素(ricin) A鏈、相思子毒素(abrin) A鏈、莫迪素(modeccin) A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、康乃馨(dianthin)蛋白質、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及新月毒素。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。

在另一個實施例中，免疫結合物包含如本文所述之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab與放射性原子的結合，以形成放射性結合物。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括At²¹¹ 、I¹³¹ 、I¹²⁵ 、Y⁹⁰ 、Re¹⁸⁶ 、Re¹⁸⁸ 、Sm¹⁵³ 、Bi²¹² 、P³² 、Pb²¹² 及Lu之放射性同位素。當放射性結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍照相研究之放射性原子，例如TC^99m 或I¹²³ ；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)之自旋標記，又諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。

不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab與細胞毒性劑的結合物可以使用多種雙官能偶合劑製得，諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如二丁二醯亞胺辛二酸酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)，及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta, E.S.等人, Science 238 (1987) 1098-1104中所述製備。碳-14標記之1-異硫氰酸基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO 94/11026。連接子可為促進細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫鍵連接子(Chari, R.V.等人, Cancer Res. 52 (1992) 127-131；US 5,208,020)。

本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋(但不限於)用交聯試劑製備之此類結合物，交聯試劑包括(但不限於) BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，及SVSB (丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，該等交聯試劑可市購(例如購自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)。

本文中亦涵蓋如本文所報導之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab與一或多種小分子毒素(諸如卡奇黴素、美登素(US 5,208,020)、新月毒素及CC1065)的結合物。在本發明之一個實施例中，不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab與一或多種美登素分子結合(例如每個拮抗劑分子約1至約10個美登素分子)。美登素可以例如轉化成May-SS-Me，該May-SS-Me可以還原成May-SH3且與經修飾之拮抗劑反應(Chari等人, Cancer Research 52: 127-131 (1992))以產生類美登素-抗體結合物。

或者，如本文所報導之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab與一或多種卡奇黴素分子結合。抗生素之卡奇黴素家族能夠在亞皮莫耳濃度下產生雙股DNA斷裂。可以使用的卡奇黴素結構類似物包括(但不限於) γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙醯基-γ1 I、PSAG及θI 1 (Hinman等人, Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)及Lode等人, Cancer Research 58: 2925-2928 (1998))。

本發明進一步涵蓋如本文所報導之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab與具有核分解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶，諸如去氧核糖核酸酶；DNase)的結合。

或者，如本文所報導之包含不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab及細胞毒性劑的融合蛋白可以藉由例如重組技術或肽合成來製得。

VIII. 醫藥調配物
藉由將具有所需純度之此類2/3-IgG或2/3-BiFab與一或多種視情況存在之醫藥學上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A. (編)(1980))混合來製備如本文所述之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab的醫藥調配物，或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物，其呈凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下通常對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚(乙烯吡咯啶酮)；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)。某些例示性sHASEGP及使用方法，包括rhuPH20，描述於US 2005/0260186及US 2006/0104968中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種額外葡萄糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。

例示性凍乾抗體調配物描述於US 6,267,958中。水性抗體調配物包括US 6,171,586及WO 2006/044908中所述之彼等調配物，後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。

適於皮下投藥的凍乾調配物描述於WO 97/04801中。此類凍乾調配物可以用適合稀釋劑復原至高蛋白質濃度且復原的調配物可以皮下投與本文中待治療的哺乳動物。

本文之調配物亦可含有超過一種為治療特定適應症所必需之活性成分，較佳為彼此間不會產生不利影響之具有互補活性的活性成分。此類活性成分宜以對預期目的有效之量存在於組合中。

活性成分可以截留於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合法所製備之微膠囊，例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；截留於膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A. (編) (1980)中。

可以製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形製品形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(US 3,773,919)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOT^TM (由乳酸-乙醇酸共聚物及亮丙立德乙酸酯(leuprolide acetate)構成之可注射微球體)，及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可容易藉由例如無菌過濾膜過濾來實現。在一個實施例中，調配物具有等張性。

IX. 治療方法及組合物
本文所提供之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab之組合物中的任一者可以用於治療方法中。

在一個態樣中，提供不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab，或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物，其用作藥劑。在某些實施例中，提供不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab，或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物，其用於治療方法中。根據任一上述實施例之「個體」較佳為人類。

在另一個態樣中，本文提供不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab之組合物用於製造或製備藥劑的用途。根據任一上述實施例之「個體」可為人類。

在另一態樣中，本文提供疾病治療方法。在一個實施例中，方法包含向患有疾病的個體投與有效量的不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物。在一個此類實施例中，方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種其他治療劑，諸如下文所指定。根據任一上述實施例之「個體」可為人類。

在另一個態樣中，本文提供包含以下中之任一者的醫藥調配物：如本文所提供之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG，或如本文所提供之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab，或如本文所提供之包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物，其例如用於任一上述治療方法中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之以下中之任一者及醫藥學上可接受之載劑：不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG，或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab，或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物。在另一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之以下中之任一者及至少一種其他治療劑(例如如下文所指定)：不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG，或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab，或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物。

如本文所報導之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物可以單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，如本文所報導之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物可以與至少一種其他治療劑共投與。

上文提及之此類組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或超過兩種治療劑包括於相同或各別調配物中)，及各別投藥，在此情況下，如本文所報導之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物可以在另一種治療劑或藥劑投與之前、同時及/或之後投與。如本文所報導之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物亦可與其他干預療法(諸如(但不限於)輻射療法、行為療法或此項技術中已知且適於治療或預防神經病症的其他療法)組合使用。

如本文所報導之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物(及任何額外治療劑)可以藉由任何適合方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內，及必要時進行局部治療、病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。可以藉由任何適合途徑(例如注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥，此部分地視是否短期或長期投藥而定。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或在不同時間點的多次投藥、推注投藥及脈衝式輸注。

如本文所報導之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物將以符合良好醫學實務的方式調配、給藥及投與。在此情形下，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之病因、藥劑遞送部位、投藥方法、投藥時程及從醫者已知之其他因素。不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物不必定，而是視情況用一或多種當前用於預防或治療所討論之病症的藥劑調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之治療劑之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。此等藥劑一般以與本文所述相同之劑量且用如本文所述之投與途徑使用，或以本文所述劑量之約1%至99%使用，或以任何劑量且藉由憑經驗/臨床上確定為適當之任何途徑使用。

輸送化合物跨越BBB的基於脂質之方法包括(但不限於)將融合構築體或化合物囊封於脂質體中，使該等脂質體與結合至BBB血管內皮細胞上之單價結合實體偶聯(參見例如US 2002/0025313)，以及用低密度脂蛋白顆粒(參見例如US 2004/0204354)或載脂蛋白E (參見例如US 2004/0131692)塗佈該單價結合實體。

為了預防或治療疾病，如本文所報導之不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab之組合物(單獨或與一或多種其他其他治療劑組合使用時)的適當劑型將視以下而定：待治療之疾病類型、不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab之組合物的類型、疾病嚴重程度及過程、抗體是否為了預防或治療目的、先前療法、患者臨床歷史及對抗體的反應，及主治醫師的判斷。不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵的2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物宜一次性或在一系列治療期間投與患者。視疾病的類型及嚴重程度而定，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.5 mg/kg-10 mg/kg)抗體可為投與患者的初始候選劑型，不論例如藉由一或多次分開投藥或藉由連續輸注。視上述因素而定，一種典型的日劑量可能在約1 μg/kg至100 mg/kg或超過100 mg/kg之範圍內。在數日或更長時間內重複投藥時，視病狀而定，治療一般維持至疾病症狀出現所需抑制為止。抗體之一種例示性劑量將在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg範圍內。因此，可以向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg(或其任何組合)之一或多次劑量。此類劑量可以間歇性地投與，例如每週或每三週(例如使得患者接受約兩次至約二十次或例如約六次劑量的抗體)。初始可投與較高起始劑量，隨後可投與一或多次較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程容易藉由習知技術及分析來監測。

應瞭解，替代或除不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab或包含兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-IgG或兩種不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之不同2/3-BiFab的組合物之外，亦可以使用如本文所報導之免疫結合物執行任何上述調配或治療方法。

如本文所報導之包含不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-IgG或不具有重鏈-重鏈間二硫鍵之2/3-BiFab的組合物將以符合良好醫學實務的方式調配、給藥及投藥。在此情形下，考慮因素包括所治療之特定疾病或病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、疾病或病症之起因、藥劑遞送位點、投藥方法、投藥時程及從醫者已知之其他因素。待投與的治療有效量將依據此類考量來決定。

然而，如上所指出，此等建議投藥量服從於很多治療判斷。選擇適當劑量及排程的關鍵因素為所得結果，如上文所指明。舉例而言，可能初始需要相對較高的劑量治療進行中的急性疾病。為了獲得最有效的結果，視疾病或病症而定，拮抗劑儘可能在疾病或病症接近首次病徵、診斷、出現或發生時或在疾病或病症緩解期間投與。

用於其他治療劑與抗體結合的一般技術已熟知(參見例如Arnon等人, 「Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy」, 於Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld等人(編), 第243-56頁(Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom等人, 「Antibodies For Drug Delivery」, 於Controlled Drug Delivery (第2版), Robinson等人(編), 第623-53頁(Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」, 於Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera等人(編), 第475-506頁(1985)；及Thorpe」, 「The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates」, Immunol. Rev., 62 (1982) 119-58)。

X. 製品
在如本文所報導之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質的製品。製品包含容器及附於或系連於容器之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器裝有單獨或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中的至少一種活性劑為如本文所報導之抗體。標籤或藥品說明書表明組合物用於治療所選病狀。另外，製品可以包含(a)內含組合物之第一容器，其中該組合物包含如本文所報導之抗體；及(b)內含組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或治療劑。此實施例中之製品可以進一步包含表明組合物可以用於治療特定病狀之藥品說明書。替代地或另外，製品可以進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可以進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應瞭解，替代或除如本文所報導之雙特異性抗體之外，任何上述製品可以包括如本文所報導之免疫結合物。

XI. 本發明之具體實施例集合
第 1 集合 ：
1. 一種多聚體2/3-BiFab多肽，其包含第一多肽及第二多肽
其中兩種多肽均包含胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)、抗體可變域，及人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域，
其中i)若第二多肽的可變域為輕鏈可變域，則第一多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第二多肽的可變域為重鏈可變域，則第一多肽的可變域為輕鏈可變域，
其中i)第一多肽的CH3域包含杵突變且第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一多肽的CH3域包含臼突變且第二多肽的CH3域包含杵突變，
其中第一多肽包含至少一個功能結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第二多肽的CH3域中包含至少一個擾動突變，其中該第一多肽的胺基酸序列(CH3域)在野生型免疫球蛋白中之與該擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽為非共價二聚體，
其中第一多肽的可變域與第二多肽的可變域形成非功能結合位點。
2. 根據實施例1之多聚體2/3-BiFab多肽，其中第一多肽為選自如下多肽群組的多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第三重鏈可變域，
及
第二多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域之包含杵突變或臼突變的CH3域，
其中該CH3域包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第一多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(CH3域)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基。
3. 根據實施例1至2中任一例之多聚體2/3-BiFab多肽，其中該多聚體多肽進一步包含含有另一輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，其中第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽。
4. 一種組合物，包含
第一雜三聚2/3-BiFab多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第三重鏈可變域，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中i)若第一多肽的可變域為輕鏈可變域，則第二多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第一多肽的可變域為重鏈可變域，則第二多肽的可變域為輕鏈可變域，
其中若第一多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
其中該CH3域包含包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
及
包含另一輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三多肽，其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽，
及
第二雜三聚2/3-BiFab多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中若第一雜三聚體的第二多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一雜三聚體的第二多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
其中該CH3域包含選自由以下組成之突變群組的第二擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第二多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域，及第三重鏈可變域，
若第一多肽包含臼突變，則包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則包含臼突變，
其中i)若第一雜三聚體中之第二多肽的可變域為輕鏈可變域，則第二多肽之可變域為重鏈可變域，或ii)若第一雜三聚體中之第二多肽的可變域為重鏈可變域，則第二多肽之可變域為輕鏈可變域，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三多肽，其中該第六多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽，
其中i)第一雜三聚體中之第一多肽的CH3域包含杵突變且第一雜三聚體中之第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一雜三聚體中之第一多肽的CH3域包含臼突變且第一雜三聚體中之第二多肽的CH3域包含杵突變，其中i)在第一雜三聚體中之第一多肽包含臼突變的情況下，第二雜三聚體多肽中之第二多肽包含杵突變，或ii)在第一雜三聚體中之第一多肽包含杵突變的情況下，第二雜三聚體多肽中之第二多肽包含臼突變，
其中第一雜三聚體中的第二多肽及第二雜三聚體多肽中的第一多肽包含處於不同位置的擾動突變，
其中第一雜三聚體中之第一多肽的可變域與第二雜三聚體中之第二多肽的可變域形成功能結合位點，且第一雜三聚體中之第二多肽的可變域與第二雜三聚體中之第一多肽的可變域形成非功能可變域對。
5. 一種多聚體2/3-IgG多肽，其包含第一多肽及第二多肽
其中兩種多肽均包含人類免疫球蛋白CH3域，
其中i)第一多肽的CH3域包含杵突變且第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一多肽的CH3域包含臼突變且第二多肽的CH3域包含杵突變，
其中第一多肽包含至少一個功能結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第二多肽的CH3域中包含至少一個擾動突變，其中該第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與該擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(CH3域)野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽及第二多肽為非共價或共價二聚體。
6. 根據實施例5之多聚體2/3-IgG多肽，其中第一多肽為選自如下多肽群組的多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能結合位點，
及
第二多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域之包含突變杵或臼突變的CH3域，
包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基。
7. 根據實施例5或6中任一例之多聚體2/3-IgG多肽，其中該多聚體多肽進一步包含含有輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，
其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽。
8. 一種組合物，包含
第一雜三聚2/3-IgG多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能結合位點，
包含杵突變或臼突變，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第一多肽包含臼突變，則包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則包含臼突變，
包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三多肽，該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽，
及
第二雜三聚2/3-IgG多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中若第一雜三聚體的第二多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一雜三聚體的第二多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
其中該CH3域包含選自由以下組成之突變群組的第二擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第二多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與第二擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能結合位點，
若第一多肽包含臼突變，則包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則包含臼突變，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三多肽，
其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽，
其中i)第一雜三聚體中之第一多肽的CH3域包含杵突變且第一雜三聚體中之第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一雜三聚體中之第一多肽的CH3域包含臼突變且第一雜三聚體中之第二多肽的CH3域包含杵突變，其中i)在第一雜三聚體中之第一多肽包含臼突變的情況下，第二雜三聚體多肽中之第二多肽包含杵突變，或ii)在第一雜三聚體中之第一多肽包含杵突變的情況下，第二雜三聚體多肽中之第二多肽包含臼突變，
其中第一雜三聚體中的第二多肽及第二雜三聚體多肽中的第一多肽包含處於不同位置的擾動突變。
9. 一種醫藥調配物，包含根據實施例5、6及7中任一例之2/3-IgG，或包含根據實施例1、2及3中任一例之2/3-BiFab，或包含根據實施例4及8中任一例之組合物，及視情況存在之醫藥學上可接受之賦形劑。
10. 一種醫藥調配物，包含
第一雜三聚多肽，其包含第一、第二及第三單體多肽，
及
第二雜三聚多肽，其包含第四、第五及第六單體多肽，
其中第一、第二、第四及第五單體多肽各自在N端至C端方向上包含
(i)胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)，
(ii)第一抗體可變域，及
(iii)人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域，
其中(i)、(ii)及(iii)彼此獨立地直接結合或經由肽連接子彼此結合，
其中i)第一及第二單體多肽及ii)第一及第四單體多肽、iii)第二及第五單體多肽及iv)第四及第五單體多肽中的第一抗體可變域各自為VH/VL對，
其中i)第一及第四單體多肽及ii)第一及第二單體多肽、iii)第二及第五單體多肽及iv)第四及第五單體多肽的CH3域各自為臼包杵對，
其中第一單體多肽及第四單體多肽彼此獨立地在其N端及C端中之一或兩者處彼此獨立地各自包含scFv或scFab或Fab，
其中第二及第五單體多肽各自在CH3域中包含至少一個擾動突變，其中第一單體多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與第二單體多肽之擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基，其中第四單體多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與第五單體多肽之擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基，其中第二單體多肽中的擾動突變與第五單體多肽中的擾動突變在胺基酸序列中不處於相同位置，其中當第二單體多肽與第五單體多肽形成雜二聚體時，第二單體多肽中的擾動突變與第五單體多肽中的擾動突變引起吸引性(電荷)相互作用，其中當第二單體多肽與第一單體多肽形成雜二聚體且第五單體多肽與第四單體多肽形成雜二聚體時，第二及第五單體多肽中的擾動突變分別引起排斥(電荷)相互作用，
其中第一及第二單體多肽為非共價二聚體，第四及第五單體多肽為非共價二聚體，第三及第一單體多肽為二硫鍵連接的二聚體，且第六及第四單體多肽為二硫鍵連接的二聚體，
其中第三及第六單體多肽為抗體輕鏈。
11. 根據實施例10之醫藥調配物，其中該第一多肽係選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第三重鏈可變域，
及
第三多肽為包含另一輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽，其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽。
12. 根據實施例10及11中任一例之醫藥調配物，其中第二多肽係選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中i)若第一多肽的可變域為輕鏈可變域，則第二多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第一多肽的可變域為重鏈可變域，則第二多肽的可變域為輕鏈可變域，
其中若第一多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
其中該CH3域包含選自由以下組成之突變群組的擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第一多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基。
13. 根據實施例10至12中任一例之醫藥調配物，其中第五多肽係選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中若第一雜三聚體的第二多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一雜三聚體的第二多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
其中CH3域包含選自由以下組成之突變群組的第二擾動突變：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C及W366T，其中第五多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基，其中第五多肽中的擾動突變與第二多肽中的擾動突變處於不同位置。
14. 根據實施例10至13中任一例之醫藥調配物，其中第四多肽係選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第三重鏈可變域，
若第一多肽包含臼突變，則包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則包含臼突變，
其中i)若第一多肽的第一可變域為輕鏈可變域，則第四多肽的第一可變域為重鏈可變域，或ii)若第一多肽的第一可變域為重鏈可變域，則第四多肽的第一可變域為輕鏈可變域，
及
第六多肽為包含另一輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽，其中該第六多肽藉由二硫鍵共價結合至該第四多肽。
15. 根據實施例10至14中任一例之醫藥調配物，其中第一多肽的第一可變域與第四多肽的第一可變域形成功能結合位點，且第二多肽的第一可變域與第五多肽的第一可變域形成非功能可變域對。

第 2 集合 ：
1. 一種多聚體多肽，包含
第一多肽，其在N端至C端方向上包含抗體可變域及人類免疫球蛋白G CH3域，
第二多肽，其在N端至C端方向上包含抗體可變域及人類免疫球蛋白G CH3域，
其中i)若第二多肽的可變域為輕鏈可變域，則第一多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第二多肽的可變域為重鏈可變域，則第一多肽的可變域為輕鏈可變域，
其中第二多肽的CH3域中包含至少一個擾動突變，其中該第一多肽的胺基酸序列(CH3域)在野生型免疫球蛋白中之與該擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽為非共價二聚體，
其中第一多肽的可變域與第二多肽的可變域形成非功能結合位點，
其中第一多肽進一步包含功能結合位點。
2. 根據實施例1的多聚體多肽，其中第一及第二多肽各自包含可變域N端的胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)或DKTHT (SEQ ID NO: 94)或GGGS (SEQ ID NO: 69)或DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97)。
3. 一種多聚體多肽，包含
第一多肽，其在N端至C端方向上包含人類免疫球蛋白G CH3域及抗體可變域，
第二多肽，其在N端至C端方向上包含人類免疫球蛋白G CH3域及抗體可變域，
其中i)若第二多肽的可變域為輕鏈可變域，則第一多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第二多肽的可變域為重鏈可變域，則第一多肽的可變域為輕鏈可變域，
其中第二多肽的CH3域中包含至少一個擾動突變，其中該第一多肽的胺基酸序列(CH3域)在野生型免疫球蛋白中之與該擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽與第二多肽為非共價二聚體，
其中第一多肽的可變域與第二多肽的可變域形成非功能結合位點，
其中第一多肽進一步包含功能結合位點。
4. 根據實施例4的多聚體多肽，其中第一及第二多肽各自包含CH3域N端的胺基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO: 66)或GGGS (SEQ ID NO: 69)或DKTHT (SEQ ID NO: 94)或DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97)。
5. 根據實施例1至4中任一例之多聚體多肽，其中i)第一多肽的CH3域包含杵突變且第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一多肽的CH3域包含臼突變且第二多肽的CH3域包含杵突變。
6. 根據實施例1至5中任一例之多聚體多肽，其中i)第一多肽的CH3域包含杵-cys突變且第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一多肽的CH3域包含臼-cys突變且第二多肽的CH3域包含杵突變。
7. 根據實施例1至6中任一例之多聚體多肽，其中擾動突變係選自包含D356K、E357K、K370E及K439E之突變群組。
8. 根據實施例1至7中任一例之多聚體多肽，其中該人類免疫球蛋白G CH3域為人類IgG1 CH3域或人類IgG2 CH3域或人類IgG3 CH3域或人類IgG4 CH3域。
9. 根據實施例1至8中任一例之多聚體多肽，其中
i) 第一多肽包含杵突變或杵-cys突變且第二多肽包含擾動突變D356K及臼突變，或
ii) 第一多肽包含杵突變或杵-cys突變且第二多肽包含擾動突變E357K及臼突變，或
iii) 第一多肽包含臼突變或臼-cys突變且第二多肽包含擾動突變K370E及杵突變，或
iv) 第一多肽包含臼突變或臼-cys突變且第二多肽包含擾動突變K439E及杵突變。
10. 根據實施例1至9中任一例之多聚體多肽，其中第一多肽為選自如下多肽群組的多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域，及人類免疫球蛋白G CH3域，
ii) 視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) 視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域，及人類免疫球蛋白G CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域，及人類免疫球蛋白G CH3域，
vi) 視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
x) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
xiii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子、重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xv) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及重鏈可變域，
xvi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子，及重鏈或輕鏈可變域，
xvii) 輕鏈可變域、人類IgG1 CH1域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子，及重鏈或輕鏈可變域，
xviii) 輕鏈可變域、人類κ或λ輕鏈恆定域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子，及重鏈或輕鏈可變域，及
xiv) 重鏈可變域、人類κ或λ輕鏈恆定域、視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、人類免疫球蛋白G CH3域、視情況存在之肽連接子，及重鏈或輕鏈可變域，
及
第二多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i)視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、重鏈或輕鏈可變域、人類免疫球蛋白G CH3域，
或
ii)視情況存在之SEQ ID NO: 66或69或94或97、人類免疫球蛋白G CH3域及重鏈或輕鏈可變域，
其中CH3域包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的擾動突變，其中第一多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(CH3域)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基。
11. 根據實施例1至10中任一例之多聚體多肽，其中該多聚體多肽進一步包含含有輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，其中第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽。
12. 一種組合物，包含
根據實施例1至11中任一例之第一多聚體多肽，
及
根據實施例1至11中任一例之第二多聚體多肽，
其中
i)第一多聚體多肽中的擾動突變為D356K且第二多聚體多肽中的擾動突變為K439E，
或
ii)第一多聚體多肽中的擾動突變為E357K且第二多聚體多肽中的擾動突變為K370E。
13. 一種多聚體，其包含第一多肽及第二多肽
其中兩種多肽均包含人類免疫球蛋白CH3域，
其中i)第一多肽的CH3域包含杵突變且第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一多肽的CH3域包含臼突變且第二多肽的CH3域包含杵突變，
其中第一多肽包含至少一個功能結合位點或結合位點的至少一部分，
其中第二多肽的CH3域中包含至少一個擾動突變，其中該第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與該擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(CH3域)野生型胺基酸殘基，
其中第一多肽及第二多肽為非共價或共價二聚體。
14. 根據實施例13之多聚體多肽，其中第一多肽為選自如下多肽群組的多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能結合位點，
及
第二多肽為選自如下多肽群組之多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 65或66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域之包含突變杵或臼突變的CH3域，
包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基。
15. 根據實施例13或14中任一例之多聚體多肽，其中該多聚體多肽進一步包含含有輕鏈可變域及輕鏈恆定域的第三多肽，
其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽。
16. 一種組合物，包含
第一多聚體多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能結合位點，
包含杵突變或臼突變，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
若第一多肽包含臼突變，則包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則包含臼突變，
包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的擾動突變，其中第一多肽的胺基酸序列在野生型免疫球蛋白(IgG1)中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白(IgG1)野生型胺基酸殘基，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三多肽，該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至第一多肽，
及
第二多聚體多肽，其包含
選自如下多肽群組之多肽作為第一多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中若第一雜三聚體的第二多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一雜三聚體的第二多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
其中CH3域包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的第二擾動突變，其中第二多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與第二擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基，
及
選自如下多肽群組之多肽作為第二多肽，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在的肽連接子、人類IgG1 CH1域，及重鏈可變域，
iv) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
v) 第一重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
vi) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) 重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及輕鏈可變域，
ix) 重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
x) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 κ或λ輕鏈恆定域，
xi) 第一重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第二重鏈可變域，及
xii) 結合域的第一部分、視情況存在之第一肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、源於人類IgG1 CH2域的CH2域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之第二肽連接子，及結合域的第二部分，其中結合域的第一部分與結合域的第二部分形成特異性結合至標靶的功能結合位點，
若第一多肽包含臼突變，則包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則包含臼突變，
及
包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽作為第三多肽，
其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽，
其中i)第一雜三聚體中之第一多肽的CH3域包含杵突變且第一雜三聚體中之第二多肽的CH3域包含臼突變，或ii)第一雜三聚體中之第一多肽的CH3域包含臼突變且第一雜三聚體中之第二多肽的CH3域包含杵突變，其中i)在第一雜三聚體中之第一多肽包含臼突變的情況下，第二雜三聚體多肽中之第二多肽包含杵突變，或ii)在第一雜三聚體中之第一多肽包含杵突變的情況下，第二雜三聚體多肽中之第二多肽包含臼突變，
其中第一雜三聚體中的第二多肽及第二雜三聚體多肽中的第一多肽包含處於不同位置的擾動突變。
17. 一種醫藥調配物，包含根據實施例1至15中任一例之多聚體多肽，或包含根據實施例16之組合物，及視情況存在之醫藥學上可接受之賦形劑。
18. 一種醫藥調配物，包含
第一雜三聚多肽，其包含第一、第二及第三單體多肽，
及
第二雜三聚多肽，其包含第四、第五及第六單體多肽，
其中第一、第二、第四及第五單體多肽各自在N端至C端方向上包含
(i)胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)，
(ii)第一抗體可變域，及
(iii)人類免疫球蛋白(IgG1) CH3域，
其中(i)、(ii)及(iii)彼此獨立地直接結合或經由肽連接子彼此結合，
其中i)第一及第二單體多肽及ii)第一及第四單體多肽、iii)第二及第五單體多肽及iv)第四及第五單體多肽中的第一抗體可變域各自為VH/VL對，
其中i)第一及第四單體多肽及ii)第一及第二單體多肽、iii)第二及第五單體多肽及iv)第四及第五單體多肽的CH3域各自為臼包杵對，
其中第一單體多肽及第四單體多肽彼此獨立地在其N端及C端中之一或兩者處彼此獨立地各自包含scFv或scFab或Fab，
其中第二及第五單體多肽各自在CH3域中包含至少一個擾動突變，其中第一單體多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與第二單體多肽之擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基，其中第四單體多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與第五單體多肽之擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基，其中第二單體多肽中的擾動突變與第五單體多肽中的擾動突變在胺基酸序列中不處於相同位置，其中當第二單體多肽與第五單體多肽形成雜二聚體時，第二單體多肽中的擾動突變與第五單體多肽中的擾動突變引起吸引性(電荷)相互作用，其中當第二單體多肽與第一單體多肽形成雜二聚體且第五單體多肽與第四單體多肽形成雜二聚體時，第二及第五單體多肽中的擾動突變分別引起排斥(電荷)相互作用，
其中第一及第二單體多肽為非共價二聚體，第四及第五單體多肽為非共價二聚體，第三及第一單體多肽為二硫鍵連接的二聚體，且第六及第四單體多肽為二硫鍵連接的二聚體，
其中第三及第六單體多肽為抗體輕鏈。
19. 根據實施例18之醫藥調配物，其中該第一多肽係選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第三重鏈可變域，
及
第三多肽為包含另一輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽，其中該第三多肽藉由二硫鍵共價結合至該第一多肽。
20. 根據實施例18及19中任一例之醫藥調配物，其中第二多肽係選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中i)若第一多肽的可變域為輕鏈可變域，則第二多肽的可變域為重鏈可變域，或ii)若第一多肽的可變域為重鏈可變域，則第二多肽的可變域為輕鏈可變域，
其中若第一多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
其中CH3域包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的擾動突變，其中第一多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基。
21. 根據實施例18至21中任一例之醫藥調配物，其中第五多肽係選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
其中若第一雜三聚體的第二多肽包含臼突變，則CH3域包含杵突變，或若第一雜三聚體的第二多肽包含杵突變，則CH3域包含臼突變，
其中該CH3域包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的第二擾動突變，其中該第五多肽的(CH3域)胺基酸序列在野生型免疫球蛋白中之與擾動突變處之胺基酸殘基相互作用的胺基酸位置處包含人類免疫球蛋白野生型胺基酸殘基，其中第五多肽中之擾動突變與第二多肽中之擾動突變處於不同位置。
22. 根據實施例18至21中任一例之醫藥調配物，其中第四多肽係選自如下多肽群組，該群組多肽在N端至C端方向上包含
i) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
ii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二重鏈可變域，及人類IgG1 CH1域，
iii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類IgG1 CH1域，及第二重鏈可變域，
iv) scFv、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
v) scFab、視情況存在之肽連接子、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域，及源於人類IgG1 CH3域的CH3域，
vi) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
vii) SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
viii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
ix) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第三重鏈可變域，
x) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFv，
xi) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子，及scFab，
xii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二人類IgG1 CH1域，及第二輕鏈可變域，
xiii) 第二重鏈可變域、第一人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第二輕鏈可變域，及第二人類IgG1 CH1域，
xiv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、第三重鏈可變域，及人類κ或λ輕鏈恆定域，及
xv) 第二重鏈可變域、人類IgG1 CH1域、SEQ ID NO: 66之鉸鏈區、第一重鏈或輕鏈可變域、源於人類IgG1 CH3域的CH3域、視情況存在之肽連接子、人類κ或λ輕鏈恆定域，及第三重鏈可變域，
若第一多肽包含臼突變，則包含杵突變，或若第一多肽包含杵突變，則包含臼突變，
其中i)若第一多肽的第一可變域為輕鏈可變域，則第四多肽的第一可變域為重鏈可變域，或ii)若第一多肽的第一可變域為重鏈可變域，則第四多肽的第一可變域為輕鏈可變域，
及
第六多肽為包含另一輕鏈可變域及輕鏈恆定域的多肽，其中該第六多肽藉由二硫鍵共價結合至該第四多肽。
23. 根據實施例18至22中任一例之醫藥調配物，其中第一多肽的第一可變域與第四多肽的第一可變域形成功能結合位點，且第二多肽的第一可變域與第五多肽的第一可變域形成非功能可變域對。

提供以下實例、序列及圖式以有助於理解本發明，其真實範疇闡述於隨附申請專利範圍中。應理解，可以對所述程序進行潤飾而不悖離本發明的精神。

實例
實例 1
2 / 3 - IgG 的設計及模組化組成
一般批註
圖1顯示根據本發明之方法中所用之2/3-IgG的設計及模組化組成。此等2/3-IgG係由三條個別鏈構成：一條輕鏈(通常為包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域的全長輕鏈)、一條重鏈(通常為包含重鏈可變域及所有重鏈恆定域(包括鉸鏈區)的全長重鏈)及一條重鏈Fc區多肽(通常為包含鉸鏈-CH2-CH3的重鏈Fc區片段)。輕鏈及重鏈的可變域形成功能結合位點。重鏈(通常源於人類IgG1子類)在CH3中含有杵-cys突變或臼-cys突變(抗體重鏈CH3域中的突變T366W及S354C表示為「杵-cys突變」且抗體重鏈CH3域中的突變T366S、L368A、Y407V、Y349C表示為「臼-cys突變」(根據Kabat EU索引編號))以允許形成臼包杵Fc區二聚體。重鏈Fc區多肽為所謂的「假Fc」/MHCFcRP (參見下文)，亦即缺乏VH及CH1的IgG1衍生物，其在N端以鉸鏈區序列的至少一部分開始且在其C端具有His6標籤。另外，2/3-IgG之重鏈Fc區多肽在其CH3域中含有杵突變或臼突變(抗體重鏈CH3域中的突變T366W表示為「杵突變」且抗體重鏈CH3域中的突變T366S、L368A、Y407V表示為「臼突變」(根據Kabat EU索引編號))。除杵突變或臼突變之外，重鏈Fc區多肽相對於野生型序列包含引入一個(亦即，額外單個)排斥電荷的去穩定化突變：D356K或E357K或K370E或K439E；SEQ ID NO: 35至38；此突變的重鏈Fc區多肽在下文中表示為MHCFcRP。

重鏈與MHCFcRP可以形成兩種類型的雜二聚體，此視其中臼包杵突變的分佈而定：
i) 重鏈-杵::MHCFcRP-臼，及
ii) 重鏈-臼::MHCFcRP-杵。

然而，彼等雜二聚體稍微「有瑕疵」，原因為互補Fc區缺乏為與重鏈形成鏈間二硫化鍵所需要的額外CH3半胱胺酸，且此等物亦含有與重鏈配對物不匹配的電荷突變。

實例 2
2 / 3 - IgG 表現及純化
藉由當前技術將編碼輕鏈、重鏈(具有杵或臼突變)且與MHCFcRP (臼或杵)匹配的質體共轉染至哺乳動物細胞(例如HEK293)中來達成2/3-IgG表現。

更詳言之，舉例而言，藉由短暫轉染(例如在HEK293細胞中)產生2/3-IgG時，應用基於具有或不具有CMV內含子A啟動子之cDNA組織或基於具有CMV啟動子之基因組組織的表現質體。

除抗體表現卡匣之外，質體含有：
- 允許此質體在大腸桿菌中複製的複製起點，
- β-內醯胺酶基因，其賦予大腸桿菌安比西林(ampicillin)抗性，及
- 來自小家鼠之二氫葉酸還原酶基因作為真核細胞中的可選標記物。

各抗體基因之轉錄單元由以下元件構成：
- 位於5'端的獨特限制位點
- 來自人類細胞巨大病毒之即刻早期增強子及啟動子，
- 在cDNA組織之情況下，繼之為內含子A序列，
- 人類抗體基因之5'非轉譯區，
- 免疫球蛋白重鏈信號序列，
- 作為cDNA或存在於基因組組織中的抗體鏈(維持免疫球蛋白外顯子-內含子組織)，
- 具有聚腺苷酸化信號序列之3'非轉譯區，及
- 位於3'端的獨特限制位點。

包含抗體鏈的融合基因係藉由PCR及/或基因合成來產生且藉由已知重組方法及技術、藉由連接相應核酸區段(例如利用相應質體中的獨特限制位點)來組裝。藉由DNA定序來驗證次選殖的核酸序列。為了短暫轉染，藉由質體製備、自轉型之大腸桿菌培養物(Nucleobond AX, Macherey-Nagel)製備大量質體。

標準細胞培養技術如以下文獻中所述來使用：Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及Yamada, K.M. (編), John Wiley & Sons, Inc.

根據製造商說明書、藉由使用HEK293-F系統(Invitrogen)短暫轉染相應質體來產生2/3-IgG。簡言之，用相應表現質體及293fectin™或費克汀(fectin)(Invitrogen)轉染HEK293-F細胞(Invitrogen)，該等細胞懸浮生長於搖瓶中或攪拌醱酵器中之無血清FreeStyle™ 293表現培養基(Invitrogen)中。對於2 L搖瓶(Corning)而言，在600 mL中以1*10⁶ 個細胞/毫升之密度接種HEK293-F細胞且在120 rpm、8% CO₂ 下培育。次日，使用以下之約42 mL混合物，以約1.5*10⁶ 個細胞/毫升之細胞密度轉染細胞：A) 20 mL Opti-MEM (Invitrogen)，其含有600 µg總質體DNA (1 µg/mL)；及B) 20 ml Opti-MEM + 1.2 mL 293費克汀或費克汀(2 µL/mL)。在醱酵過程中，根據葡萄糖消耗來添加葡萄糖溶液。正確組裝的2/3-IgG類似於標準IgG分泌於培養物上清液中。5-10天之後收集含有所分泌2/3-IgG之上清液，且直接自上清液中純化2/3-IgG，或上清液冷凍且儲存。

由於2/3-IgG含有Fc區，因此藉由應用標準蛋白質A親和層析將其純化：藉由使用MabSelectSure-Sepharose^TM (GE Healthcare, Sweden)的親和層析及Superdex 200尺寸排阻(GE Healthcare, Sweden)層析，自細胞培養物上清液中純化抗體。

簡言之，在經PBS緩衝液(10 mM Na₂ HPO₄ 、1 mM KH₂ PO₄ 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe樹脂上捕捉無菌過濾的細胞培養物上清液，用平衡緩衝液洗滌且用25 mM檸檬酸鈉(pH 3.0)溶離。將所溶離的抗體溶離份彙集且用2 M Tris (pH 9.0)中和。抗體池藉由尺寸排阻層析進一步純化，該尺寸排阻層析係使用經20 mM組胺酸、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡的Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Sweden)管柱。彙集含有2/3-IgG的溶離份，利用Vivaspin超濾裝置(Sartorius Stedim Biotech S.A., France)濃縮至所需濃度且在-80℃儲存。

各純化步驟之後，使用微流體Labchip技術(Caliper Life Science, USA)、藉由CE-SDS分析純度及完整性。使用HT蛋白質表現試劑套組，根據製造商說明書製備蛋白質溶液(5 µl)供CE-SDS分析用，且在使用HT蛋白質表現晶片的LabChip GXII系統上加以分析。使用LabChip GX軟體分析資料。

舉例而言，以下2/3-IgG已藉由相應L鏈、H鏈及MHCFcRP編碼質體之共表現而產生：

相應的SEC層析圖顯示於圖3中。

實例 3
藉由 2 / 3 - IgG 交換反應來產生雙特異性抗體 ( bsAb )
含有輕鏈、重鏈及MHCFcRP的2/3-IgG已藉由兩種類型的KiH雜二聚體產生：全長重鏈-杵::MHCFcRP-臼及全長重鏈-臼::MHCFcRP-杵。兩種類型的2/3-IgG均稍微『有瑕疵』，原因為MHCFcRP缺乏為了與重鏈形成鏈間二硫鍵而必需的額外CH3半胱胺酸，且MHCFcRP含有與全長重鏈配對物不匹配的電荷突變。然而，構成彼等有瑕疵之雜二聚體的模組能夠重排成具有匹配電荷的雙特異性雜二聚體，如圖4中所示。2/3-IgG A的全長重鏈(杵-cys)與2/3-IgG B的全長重鏈(臼-cys)形成匹配雜二聚體。當MHCFcRP (臼-電荷)與MHCFcRP (杵-電荷)相互作用時，亦形成匹配雜二聚體。因此，交換反應係基於兩種不同2/3-IgG之初始雜二聚體的暫時分離，從而產生較佳含有(電荷)匹配雜二聚體的產物。交換反應因此將兩個單特異性2/3-IgG轉化成一個雙特異性IgG及一個MHCFcRP雜二聚體：
2/3-IgG(A)-His6(8) + 2/3-IgG(B)-His6(8) → bsAb(AB) + Fc-His6(8)

交換反應藉由尤其使鉸鏈區鏈間二硫鍵斷裂的還原步驟(例如應用各種濃度的2-MEA或TCEP)起始。隨後自發地發生鏈重排。

因此，抗螢光素-2/3-IgG與抗生物素胺-2/3-IgG輸入分子在100 µg/ml的蛋白質濃度下、在總體積40 µl的1xPBS + 0.05% Tween 20 (具有指定的TCEP濃度)中、以等莫耳量混合於384孔REMP®盤(Brooks, #1800030)上。離心之後，將培養盤密封且在27℃培育一小時。

隨後使用生物素-螢光素橋式ELISA量化雙特異性抗體。

因此，白色Nunc® MaxiSorp™ 384孔盤用1 µg/ml白蛋白-螢光素異硫氰酸鹽結合物(FITC, Sigma, #A9771)塗佈且在4℃培育隔夜。用90 µl PBST緩衝液(PBST、再蒸餾水、10xPBS + 0.05% Tween 20)洗滌3次之後，每孔添加90 µl阻斷緩衝液(1xPBS、2%明膠、0.1% Tween-20)且在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌3次之後，向各孔中添加25 µl各交換反應1:10稀釋液。在室溫下培育一小時之後，用90 µl PBST緩衝液再洗滌盤3次。添加每孔25 µl含生物素-Cy5結合物的0.5% BSA、0.025% Tween-20、1×PBS直至0.1 µg/ml的最終濃度且培養盤在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌6次之後，向各孔中添加25 µl 1xPBS。在Tecan Safire 2讀取器上量測發射波長為670 nm (在649 nm下激發)的Cy5螢光。

圖5顯示藉由2/3-IgG交換來產生bsAb之氧化還原條件下的分析結果。TCEP用於(部分地)還原重鏈Fc區多肽之間(亦即全長半IgG與MHCFcRP之間)的鉸鏈二硫鍵。可藉由SEC鑑別鏈交換，從而區分2/3-IgG輸入物、bsAb輸出物及MHCFcRP副產物。視2/3-IgG與TCEP之間比率而定的交換反應產量顯示於圖5中(為了比較，所有反應均在相同的反應時間之後加以分析)。

所有2/3-IgG初始分子、所有非所要副產物以及在交換反應期間潛在產生的所有聚集體均具有親和標籤(His6或His8)。交換反應中所產生的所需bsAb僅為不攜帶His標籤的分子。因此，應用簡單的NiNTA吸收步驟來移除所有非所需分子(參見圖6及7)。剩餘bsAb (未藉由NiNTA吸收耗乏)直接應用於篩選程序且加以分析以鑑別具有所需功能的bsAb。

實例 4
對藉由 2 / 3 - IgG 交換反應所產生之雙特異性抗體 ( bsAb ) 進行的 功能性評估
作為2/3-IgG交換反應產物產生之bsAb的雙特異性功能係藉由橋式ELISA分析加以評估。圖8顯示藉由如本文所報導之交換反應所產生之抗螢光素/生物素胺雙特異性抗體的結合結果作為實例。反應中使用結合生物素胺(bio)的2/3-IgG及結合螢光素(fluos)的2/3-IgG作為初始分子。抗fluos/bio雙特異性抗體的fluos結合臂結合至經fluos-BSA塗佈的ELISA盤。隨後暴露於bio-Cy5產生信號，此僅在bsAb介導bsAb之生物結合臂捕捉bio-Cy5後發生。由於橋聯介導信號僅發生於bsAb，而非單特異性Fluos或Bio結合子，因此在分析中使用單獨2/3-IgG時觀測不到信號。由於此原因且由於交換反應不迫使分子聚集，因此可以直接對交換反應混合物執行此類橋式ELISA，而無需預先進行NiNTA介導非bsAb分子耗乏。施加反應混合物時觀測到信號表明功能性bsAb成功產生及存在。經由橋式ELISA進行的信號產生視交換反應中所使用之輸入實體的量而定。

實例 5
交換反應在功能上獨立於初始 2 / 3 - IgG 的 結合特異性或 V 區 組成
若2/3-IgG產生以及交換反應獨立於其結合特異性及V區組成對不同抗體以及對不同抗體組合發揮作用，則產生多種2/3-IgG供評估。

因此，使用對生物素胺(bio)、地高辛(digoxigenin)(dig)、螢光素(fluos)、LeY-碳水化合物(LeY)、VEGF及PDGF具有結合特異性的2/3-IgG。此等物係藉由如上文所述共轉染表現質體來產生，該等質體編碼全長輕鏈、杵-全長重鏈或臼-全長重鏈及突變的重鏈Fc區多肽。

SEQ ID NO: 49-52描述對dig、VEGF、PDGF及LeY具有特異性之2/3-IgG的VH-CH1區域。將彼等區域與SEQ ID NO: 40及41之鉸鏈-CH2-CH3區域融合(亦即，置換bio VH-CH1區域)以產生具有所需特異性的完整H鏈。用於產生此等分子的MHCFcRP係作為SEQ ID NO: 35-38列舉。

所有此等2/3-IgG可以與標準IgG在類似條件下相似的產率產生及純化(參見實例2)。具有不同結合特異性之此等2/3-IgG之表現的實例示於下表中。

在應用於產生不同特異性之bsAb的交換矩陣中，將對螢光素、生物素胺、VEGF、PDGF及地高辛具有結合特異性之2/3-IgG組合使用，所有組合如下表中所示。

藉由橋式ELISA監測初始2/3-IgG的鏈交換及具有所需特異性組合之bsAb的產生(參見實例4)，其中施加與不同bsAb特異性組合匹配的塗佈於盤上之抗原及產生信號的抗原結合物/複合物。

應用於評估不同bsAb組合之功能之橋式ELISA的結果示於下表中。僅識別其同源抗原對(作為捕捉或偵測抗原存在)的bsAb在橋式ELISA中產生信號。在矩陣中，所產生的其他bsAb由於缺乏至少一種特異性而為負值。
表：橋式ELISA證實所產生之bsAb的功能。所示為在一個分析內、在1.3 µM輸入分子濃度下的相對信號強度。最高值設定為100%作為參考。N.a. = 不適用。

對於含有VEGF的雙特異性抗體而言，已進行相同分析。此等物在相應組合中亦僅顯示高於背景水準的信號。

可見根據本發明的交換反應為普遍適用的方法：交換反應獨立於初始分子的結合特異性或V區組成而產生功能性bsAb。

實例 6
形式變異體之設計、組成及產生
向重鏈C端具有一個結合位點的初始分子或N端以及C端具有結合位點的重鏈擴增實例4之2/3-IgG交換反應。為了產生交換的bsAb，保持交換驅動原理(將有瑕疵的輸入物雜二聚體轉化為匹配的輸出物雜二聚體)不變。如上文所述，亦保持MHCFcRP的組成。

圖1、9至10展示三種2/3-IgG形式的模組化組成，其應用於產生不同bsAb形式。2/3-IgG之一在N端位置具有一個Fab臂。另一2/3-IgG具有Fab臂，該Fab臂經由柔性連接子連接至重鏈C端(亦即，其與鉸鏈區始於N端)。第三2/3-IgG具有C端Fab臂以及N端Fab臂。

此等2/3-IgG變異體的表現係藉由將編碼輕鏈、重鏈(杵或臼)及相應MHCFcRP (臼或杵)的質體共轉染至哺乳動物細胞(例如HEK293)中來達成(參見實例2)。

用於產生不同bsAb形式之經修飾之全長重鏈的序列如下：

2/3-IgG類似於標準IgG分泌於培養物上清液中且藉由標準蛋白質A親和層析加以純化(參見實例2)。尺寸排阻及質譜分析展現經純化之2/3-IgG變異體正確組裝且不存在非所要二聚體及聚集體。2/3-IgG的表現產量類似於標準IgG在相同表現系統中所觀測到的表現產量。相應資料呈現於下表。

實例 7
表徵結合功能以不同價數、化學計量及幾何構型組合的 bsAb
三種不同初始分子(具有N端、C端、N端與C端結合位點的2/3-IgG)可以在根據本發明的方法中彼此組合，從而產生九種不同bsAb形式。此等形式的不同之處在於個別結合位點的價數、幾何構型及位置。產生此等不同bsAb的交換反應係在如實例3中所概述的相同條件下進行。

所有類型的輸入形式由於MHCFcRP缺乏為了與重鏈形成鏈間二硫鍵而必需的額外CH3半胱胺酸且由於其含有排斥電荷突變(亦即，與全長重鏈配對物不匹配的電荷)而「有瑕疵」。在根據本發明的方法中，構成彼等「有瑕疵」雜二聚體的重鏈重排而形成(電荷及二硫鍵)匹配的雜二聚體。不同類型的全長重鏈(杵-cys與臼-cys)形成匹配的雜二聚體。匹配的雜二聚體亦由MHCFcRP (臼電荷與杵電荷)形成。

不受此理論束縛，假設交換反應係基於兩種不同2/3-IgG之有瑕疵雜二聚體的暫時分離，從而產生較佳含有完全匹配之雜二聚體的產物，該等雜二聚體具有匹配的電荷及(若存在)半胱胺酸殘基用於形成二硫鍵。交換因此將單特異性2/3-IgG轉化成雙特異性IgG (不同形式)，以及相應(不含可變區，亦即能結合非標靶) Fc區雜二聚體。

為了說明交換反應，如下稱呼輸入分子：
- 『nA或nB』用於在全長重鏈(H鏈)之正常N端具有Fab臂的分子，
- 『cA或cB』用於在H鏈之C端具有Fab臂的分子，
- 『ncA或ncB』用於在H鏈之N端以及C端具有Fab的分子。

不同的形式交換反應如下：
2/3-IgG(nA)-His-標籤 + 2/3-IgG(nB)-His-標籤 → bsAb(nAnB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(nA)-His-標籤 + 2/3-IgG(cB)-His-標籤 → bsAb(nAcB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(nA)-His-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-His-標籤 → bsAb(nAncB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(cA)-His-標籤 + 2/3-IgG(cB)-His-標籤 → bsAb(cAcB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(cA)-His-標籤 + 2/3-IgG(nB)-His-標籤 → bsAb(cAnB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(cA)-His-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-His-標籤 → bsAb(cAncB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(ncA)-His-標籤 + 2/3-IgG(nB)-His-標籤 → bsAb(ncAnB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(ncA)-His-標籤 + 2/3-IgG(cB)-His-標籤 → bsAb(ncAcB) + Fc-His-標籤
2/3-IgG(ncA)-His-標籤 + 2/3-IgG(ncB)-His-標籤 → bsAb(ncAncB) + Fc-His-標籤

藉由使鏈間(鉸鏈區)二硫鍵斷裂的還原步驟起始交換反應，隨後自發地發生鏈重排。所有輸入分子、所有副產物以及在交換反應期間可能潛在形成的所有聚集體具有親和標籤(例如His6或His8標籤)。然而，交換反應的bsAb產物不攜帶親和標籤且因此可以經由親和(例如NiNTA)吸收層析加以分離。bsAb (呈不同形式)可以直接應用於篩選程序及分析中以鑑別及評定具有最佳功能的不同bsAb形式。

雙特異性形式係藉由在384孔MTP形式中交換上述輸入物2/3-IgG而產生，隨後藉由橋式ELISA評估功能性組裝。因此，交換搭配物(由含有臼-cys突變的全長重鏈及MHCFcRP-杵-K370E組成的2/3-IgG分子1；由含有杵-cys突變的全長重鏈及MHCFcRP-臼-E357K組成的2/3-IgG分子2)在總體積100 µl 1xPBS + 0.05% Tween 20中以等莫耳量(4 µM)混合。蛋白質溶液在384深孔盤(Greiner 384 masterblock®)中1:2稀釋11次。在384孔REMP®盤(Brooks, #1800030)上，將20 µl得自一系列稀釋液的各樣品與20 µl 0.5 mM TCEP溶液混合直至200-0.2 µg/ml的最終蛋白質濃度及0.25 mM TCEP。離心之後，將培養盤密封且在37℃培育一小時。

作為對照實例，使用在一側含有bio結合功能且在另一側含有螢光素結合功能的bsAb。所得bsAb的功能藉由生物素-螢光素橋式ELISA評估。因此，白色Nunc® MaxiSorp™ 384孔盤用1 µg/ml白蛋白-螢光素異硫氰酸鹽結合物(Sigma, #A9771)塗佈且在4℃培育隔夜。用90 µl PBST緩衝液(PBST，再蒸餾水，10xPBS Roche #11666789001 + 0.05% Tween 20)洗滌3次之後，添加每孔90 µl阻斷緩衝液(1xPBS、2% BSA、0.1% Tween 20)且在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌3次之後，向各孔中添加25 µl各交換反應1:4稀釋液。在室溫下培育一小時之後，用90 µl PBST緩衝液再洗滌盤3次。添加每孔25 µl含生物素-Cy5結合物的0.5% BSA、0.025% Tween-20、1xPBS直至0.1 µg/ml的最終濃度且培養盤在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌6次之後，向各孔中添加25 µl 1xPBS。在Tecan Safire 2讀取器上量測發射波長為670 nm (在649 nm下激發)的Cy5螢光。

使用一個螢光素結合實體及一個生物素胺結合實體產生不同形式之2/3-IgG經由交換而產生的不同bsAb形式。輸入分子及交換衍生的輸出分子顯示於圖11中。

使用fluos-BSA (作為捕捉抗原)及bio-Cy5偵測雙特異性橋式結合功能，藉由如圖12中所示的橋式ELISA來評估所產生之bsAb的功能。所有不同形式均產生橋式ELISA信號。

此等結果顯示使用根據本發明之方法、經由鏈交換反應、以穩定的高處理量相容方式產生不同形式的可行性。

實例 8
藉由 2 / 3 - IgG 交換產生功能性 bsAb 及篩選 / 鑑別具有所要功能性的 bsAb 與小型化及高處理量以及自動化技術相容
需要應用高處理量及自動化技術且在許多情況下需要操控結合位點序列及/或形式不同的大量不同bsAb。因此已分析經由根據本發明之2/3-IgG交換方法進行的bsAb產生以及對藉此產生之雙特異性抗體之功能(亦即雙特異性結合)進行的分析/篩選是否能夠小型化，以便與高通量及自動化技術相容。

因此，進行2/3-IgG交換反應且在348孔盤中以小型化規模分析反應產物。

在384孔MTP形式中如下配置矩陣篩選：交換搭配物(由含有臼-cys突變的全長重鏈及MHCFcRP-杵-K370E組成的2/3-IgG分子1；由含有杵-cys突變的全長重鏈及MHCFcRP-臼-E357K組成的2/3-IgG分子2)在總體積30 µl 1xPBS + 0.05% Tween 20中以等莫耳量(4 µM)混合。蛋白質溶液在384深孔盤(Greiner 384 masterblock®)中1:3稀釋四次。在384孔REMP®盤(Brooks, #1800030)上，將20 µl得自一系列稀釋液的各樣品與20 µl 0.5 mM TCEP溶液混合直至2 µM-0.025 µM的最終蛋白質濃度及0.25 mM TCEP。離心之後，將培養盤密封且在37℃培育一小時。

隨後經由橋式ELISA (參見上文)、以小型化高處理量形式評估藉此產生之bsAb的功能：白色Nunc® MaxiSorp™ 384孔盤用1 µg/ml白蛋白-螢光素異硫氰酸鹽結合物(Sigma, #A9771)、1 µg/ml PDGF (CST, #8912)或1 µg/ml VEGF121塗佈且在4℃下培育隔夜。用90 µl PBST緩衝液(PBST、再蒸餾水、10xPBS + 0.05% Tween 20)洗滌3次之後，每孔添加90 µl阻斷緩衝液(1xPBS、2% BSA、0.1% Tween-20)且在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌3次之後，向各孔中添加25 µl各交換反應1:4稀釋液。在室溫下培育1小時之後，用90 µl PBST緩衝液再洗滌盤3次。添加每孔25 µl含有生物素-Cy5結合物或dig-Cy5結合物的0.5% BSA、0.025% Tween 20、1xPBS直至0.1 µg/ml的最終濃度且培養盤在室溫下培育一小時。用90 µl PBST緩衝液洗滌6次之後，向各孔中添加25 µl 1xPBS。在Tecan Safire 2讀取器上量測發射波長為670 nm (在649 nm下激發)的Cy5螢光。交換反應及橋式ELISA在此等分析中利用結合VEGF或PDGF或dig或bio或fluos之2/3-IgG模組的詳情顯示於圖13中。一種例示性此等分析之結果顯示於圖14中且證明可以執行2/3-IgG交換反應及隨後的功能性分析且其與高處理量的自動化技術相容。

實例 9
產生具有三個結合位點的 bsAb ，其中 一個結合位點靶向第一抗原且兩個其他結合位點靶向另一抗原
根據本發明的方法可以用於產生T細胞雙特異性抗體(TCB)。此等抗體可以具有如前所述的形式(參見例如WO 2013/026831)。在TCB交換方法中，一個H鏈(如上文所述具有杵-cys或具有臼-cys)在其鉸鏈的N端含有結合CD3的互換Fab衍生實體，其在N端藉由另一抗體衍生的靶向實體進一步延長。交換反應在上文所述的相同條件下進行且產生具有CD3結合實體及兩個額外結合實體的TCB。此等物可以結合至靶細胞抗原。彼等分子可以同時結合至T細胞上的CD3及靶(例如腫瘤)細胞上的抗原且藉此誘導靶細胞被殺死。

實例 10
根據本發明設計及產生無 Fc 區 鏈間二硫鍵 ( 鉸鏈區以及 CH3 域中 ) 的 2 / 3 - IgG
與Fc區(鉸鏈區)含二硫鍵之2/3-IgG發生的鏈交換需要還原作為初始步驟以實現鏈分離及所需bsAb的隨後組裝。為了避免還原步驟及移除還原劑的相關需要，產生不具有鉸鏈區二硫鍵的2/3-IgG。原理顯示於圖15中。鉸鏈區中之負責鉸鏈二硫鍵形成的半胱胺酸殘基係藉由突變為絲胺酸來移除。此外，位置354或349處之形成KiH相關二硫鍵的CH3-半胱胺酸已省去。相應胺基酸序列為：

上述2/3-IgG的表現係藉由將編碼輕鏈、全長重鏈(杵或臼)及相應MHCFcRP (臼或杵)的質體共轉染至哺乳動物細胞(例如HEK293)中來達成(參見實例2)。2/3-IgG類似於標準IgG分泌於培養物上清液中且隨後藉由標準蛋白質A親和層析及尺寸排阻層析加以純化(參見實例2)。隨後經由尺寸排阻層析及SDS-PAGE分析所需100 kDa 2/3-IgG表現產物(圖16)。由此證明2/3-IgG正確組裝且不存在非所要的二聚體及聚集體。由於此類分子藉由Fc區(既非鉸鏈區，亦非CH3域)之間的二硫鍵而不穩定，因此此結果令人驚訝。無Fc區鏈間二硫鍵之抗fluos-及抗bio-2/3-IgG的純化產量呈現於下表

實例 11
在本發明方法中藉由 2 / 3 - IgG 交換反應而非還原來產生功能性 bsAb
使不含有Fc區鏈間二硫鍵的2/3-IgG進行如上文所述的鏈交換反應(參見實例3)，但其中省去初始還原步驟。2/3-IgG含有fluos結合位點或bio結合位點及全長重鏈與MHCFcRP之間無鏈間二硫鍵的Fc區。此等2/3-IgG的組成及產生描述於實例10中。在交換反應而非起始還原之後，進行橋式ELISA以證明bsAb的雙特異性功能。橋式ELISA包含將交換反應產物添加至經固著的fluos-BSA中，隨後進行洗滌步驟且隨後添加bio-Cy5以探測bsAb之第2結合臂的存在(關於橋式ELISA之詳情，參見前述實例)。僅正確組裝的功能性bsAb可以藉由其fluos結合位點結合至分析盤，被持留且藉由捕捉及持留bio-Cy5來產生信號。不具有雙特異性的分子不產生信號，原因為其不結合至盤(僅bio結合子)或不能捕捉到產生信號的bio-Cy5 (僅fluos結合子)。此等分析的結果(在此實例中，在輸入分子的2.5 µM濃度下，以經純化的bsAb作為陽性對照來進行交換反應)顯示於圖17中。結果證明不具有Fc區鏈間二硫鍵之單特異性2/3-IgG輸入分子經由鏈交換成功地產生bsAb。在無需初始還原的情況下富有成效地發生鏈交換。因此，鏈間Fc區多肽二硫鍵的移除消除了初始還原步驟的必要性。所得bsAb藉由非共價Fc-Fc相互作用結合在一起。Fc-Fc鏈間二硫鍵的消除從而允許相應的Fc區錯配驅動交換反應而無需進行還原，從而達成活體內應用。

實例 12
部分去穩定化全長重鏈 - MHCFcRP 界面驅動鏈交換反應
用於2/3-IgG轉化為bsAb的驅動因素為全長重鏈與MHCFcRP之間所設計的「有瑕疵」界面。此人造排斥界面為引入MHCFcRP之杵-或臼-CH3域中之突變的結果。在2/3 IgG表現期間，MHCFcRP仍與相應(「正常」)杵或臼搭配物結合(參見上述實例)。彼等分子具有足以呈現2/3-IgG以及所運作分子的穩定性，而無非所要的聚集傾向。

不受此理論束縛，當兩個互補2/3-IgG距離接近且全長抗體重鏈::MHCFcRP對部分地、彼此一個接一個地釋放時，發生本發明的交換反應，從而產生bsAb。由於全長抗體重鏈(CH3)界面完美，因此匹配(亦即不帶排斥電荷)的杵-臼全長重鏈在此類條件下之再組裝應為有利的。因此，所形成之bsAb的全長重鏈與部分不完美(電荷錯配)的2/3-IgG分子保持結合優於該等分子的再形成。因此，設計成部分去穩定化(帶排斥電荷)的CH3界面為成功導引鏈交換反應的關鍵參數。

Fc界面(具體言之，CH3-CH3界面)的部分去穩定可以藉由使MHCFcRP的CH3殘基發生突變、同時維持全長抗體重鏈上的相互作用殘基來達成。

可以引入MHCFcRP之CH3域中、從而影響全長抗體重鏈::MHCFcRP界面的例示性突變提供於下表中。

一些突變包括改變界面電荷的交換。電荷突變使先前存在的穩定電荷對減弱或斷裂或引起排斥效應，或兩者。

類似地，可以引入具有不同尺寸側鏈的胺基酸以產生空間排斥效應。此類突變減弱或干擾現存的疏水性界面相互作用或產生空間位阻，或兩者的組合。

經由電荷及/或空間效應而實現部分去穩定的突變亦可彼此組合。

另外，含有引入其MHCFcRP中之電荷及/或空間變化的第一2/3-IgG可以與含有引入其MHCFcRP中之不同電荷及/或空間變化、與來自第一2/3-IgG之MHCFcRP之電荷及/或空間變化匹配的第二2/3-IgG組合。

2/3-IgG以及所得bsAb係以其中成對CH3域在一側具有杵突變且在另一側具有臼突變的方式組裝。因此，『回復突變』為MHCFcRP之相應杵或臼殘基之野生型組成亦產生界面擾動。杵-或臼-CH3-域與野生型域的此類組合列舉於下表中。

此等回復突變可應用於使CH3-CH3界面部分地失去穩定。

此等回復突變亦可與其他擾動突變(包括前述表中所述的彼等擾動突變)組合應用。

所有部分擾動型個別突變或如上文所述之突變組合亦可以如下方式選擇：其使2/3-IgG部分地失去穩定，又使作為交換反應之第2種產物的杵-MHCFcRP::臼-MHCFcRP雜二聚體穩定且藉此使反應平衡進一步轉向產物一側(交換反應)。

實例 13
根據本發明 ， 單價 2 / 3 - IgG 衍生物在細胞上轉化為二價 bsAb
重鏈與MHCFcRP之間不具有鏈間二硫鍵的2/3-IgG衍生物不需要還原來起始交換反應。因此，交換亦有可能在生理條件下達成，即使在個別2/3-IgG結合至細胞表面時亦有可能。若2/3-IgG之Fab功能臂結合至細胞表面，則其在靶細胞上積聚。若兩種互補2/3-IgG結合至同一細胞的表面，則可以發生鏈交換，同時直接在該等細胞之表面上結合。此交換直接在細胞表面上產生具有雙重特異性的全功能bsAb。

為了證明在細胞上原位發生的此鏈交換，將結合抗原LeY或Her1的兩種互補2/3-IgG施加至呈現高含量LeY、高含量Her1或高含量之兩者的細胞。FACS分析可以表明，個別施加的2/3-BiFab結合至表現其同源抗原的細胞。兩種2/3-BiFab之共同施加(同時或連續)使得僅對表現兩種抗原之細胞的結合增加。此表明，單價2/3-BiFab(前藥)在細胞上的交換反應成功地產生功能二價bsAb產物(親合力介導的結合改良)。
實例 14
根據本發明之不具有重鏈 : MHCFcRP 二硫鍵之 2 / 3 - BiFab 的 設計和組成及功能
TriFab為由於IgG CH2域與VH及VL分別交換而具有雙特異性功能的抗體衍生物。此類分子的Fc樣『莖區域』藉由完整KiH CH3域結合在一起。此能夠產生含有MHCFcRP的BiFab類似物，其具有潛在的能夠實現交換之特徵。圖18顯示含有MHCFcRP之2/3-IgG-BiFab衍生物的設計及組成。應用與2/3-IgG相同的一般原理，工程化2/3-BiFab類似物係由KiH重鏈及MHCFcRP實體構成，該MHCFcRP實體具有無關抗體之互補VL或VH域(替代CH2域)以及匹配CH3 KiH域。因此，2/3-IgG中之重鏈與MHCFcRP的CH2域被VH或VL域置換。另外，且與實例1中所述之2/3-IgG有進一步差異之處在於，此等2/3-BiFab衍生物的重鏈以及MHCFcRP-莖不具有促進重鏈:MHCFcRP共價連接的半胱胺酸(類似於實例10之2/3-IgG衍生物)。由於2/3-BiFab具有交換模組(亦即CH3域)，因此基於與2/3-IgG (不具有鏈間二硫鍵)相同的原理，可以與針對2/3-IgG所述及所示相同之方式發生交換反應。2/3-BiFab相關交換反應的一般原理顯示於圖18中。用於產生2/3-BiFab之輕鏈、杵-重鏈或臼-重鏈及MHCFcRP臼-鏈或杵-鏈的序列如下：
實例 15
根據本發明之 2 / 3 - BiFab 的 表現和純化
2/3-BiFab的表現係藉由先前所述的當前技術(WO 2016/087416)將編碼輕鏈、經修飾之莖-重鏈(杵或臼)及匹配MHCFcRP-莖(臼或杵)的質體共轉染至哺乳動物細胞(例如HEK293)中來達成。如同標準IgG，2/3-BiFab分泌於培養物上清液中。由於缺乏功能Fc區(因其缺乏CH2域)，因此藉由標準蛋白質L (KappaSelect)親和層析純化2/3-BiFab，如圖19及20所示。驚人的是，2/3-BiFab可以有效方式產生及純化，即使其莖區域中不具有功能V區(因其由非匹配VH及VL構成)，且即使其不含有用於鏈共價連接的鏈間二硫鍵。尺寸排阻及原生質譜分析表明，經純化之2/3-BiFab衍生物組裝正確且不存在非所要二聚體及聚集體。2/3-BiFab在非最佳化短暫表現條件下的表現產量列舉於下表中。

實例 16
藉由根據本發明的非還原鏈交換來產生功能 TriFab
如上文針對2/3-IgG所示之Fc-Fc鏈間二硫鍵消去能夠實現MHCFcRP驅動的交換反應，而無需可控的還原及再氧化，亦即在生理條件下。從而有可能在生理條件下潛在地「改組」此類分子，即使已結合至靶細胞表面時。

因此，在初始不利用還原來觸發交換反應的情況下進行2/3-BiFab交換反應。此等交換反應中的輸入分子為結合LeY的2/3-BiFab，其具有功能LeY結合臂；及『分離』的Dig結合莖區域(proDig)，如上文所述。未反應2/3-BiFab及MHCFcRP副產物的耗乏隨後經由NiNTA樹脂吸收非所要含His8蛋白質達成。隨後應用FACS分析，相較於2/3-BiFab前驅體分子來評估所產生之TriFab的結合功能。因此，使表現LeY抗原的MCF7細胞暴露於結合LeY之個別2/3-BiFab或暴露於交換反應之TriFab。隨後添加Dig-Cy5且評估細胞螢光。圖21顯示暴露於2/3-BiFab的細胞出現低Dig-Cy5相關信號，即使兩種實體均具有識別細胞表面碳水化合物LeY的完整Fab臂。

2/3-BiFab不能結合地高辛化有效負載(digoxigenylated payload)的原因為，其莖區域不具有結合Dig的功能Fv。然而，鏈交換反應的TriFab產物明確地呈現Dig-Cy5相關信號，亦即結合Dig的功能。此證明其『莖-Fv』之結合功能不活化的2/3-BiFab前驅體分子經由鏈交換轉化成全功能TriFab。

實例 17
2 / 3 - BiFab 前藥在細胞上轉化為根據本發明之結合全功能細胞的活化雙特異性或三特異性 TriFab

2/3-BiFab因其包含一個全功能Fab臂而僅部分地不能結合。僅位於莖區域之尖端的Fv不具功能，原因為其由(不同抗體或含有干擾結合至同源抗原的突變，結合位點之前驅體非活性前形式)非互補的VH及VL域構成。若功能Fab臂結合至細胞表面，則2/3-BiFab在靶細胞上積聚。若兩個互補2/3-BiFab (均載有無結合活性、但彼此互補的莖-Fv)結合至同一細胞的表面，則鏈交換反應可以發生，同時直接在該細胞表面上結合。此交換接著直接在細胞表面上產生至少具有雙重特異性的全功能TriFab (圖22)。

為了在實驗上證明細胞上原位發生鏈交換，吾等將個別2/3-BiFab模組以及經歷生物化學鏈改組的彼等物(上述實例中所述)施加至MCF7細胞，隨後進行FACS分析。MCF7細胞在其細胞表面上攜帶LeY抗原且因此使個別2/3-BiFab與其功能Fab臂結合。圖23表明，個別施加的2/3-BiFab結合至MCF7細胞、但不能夠捕捉第2標靶Dig-Cy5 (圖23，第2及3行)。此反映2/3-BiFab中缺乏功能莖-Fv且因此反映細胞僅結合一個2/3-BiFab。然而，同時施加(互補) 2/3-BiFab能夠捕捉且使Dig-Cy5持留於MCF7細胞表面上(圖23，第4列)。此表示成功的鏈重排/交換及產生其中莖-Fv具有Dig結合功能的功能TriFab。連續施加互補2/3-BiFab後，亦觀測到莖區域的成功鏈交換及功能莖-Fv的回收(Dig-Cy5相關標靶FACS信號)。施加第一實體以實現細胞結合，隨後廣泛洗滌以移除未結合的分子且隨後施加第2實體，亦產生關於抗原陽性細胞的FACS信號。此證實成功的交換反應(藉由同時或依序施加)可以在生理條件下、在靶細胞表面上發生。

實例 18
標靶抗 CD3 前藥 2 / 3 - BiFab 在細胞上發生鏈轉化而成為根據本發明之全功能雙特異性抗體
為了證明2/3-BiFab前藥在細胞上的轉化為可以適用於不同結合特異性的一般原理，產生含有CD3結合抗體之VH或VL域的2/3-BiFab。T細胞雙特異性抗體(亦稱為T細胞募集者)為蛋白質，其為識別腫瘤細胞表面上之抗原之具有CD3結合功能之結合實體的組合。此類分子經由其腫瘤抗原結合實體結合至腫瘤細胞且結合至T細胞(經由CD3結合功能)。此又產生(活化)信號且過程，最終引起腫瘤細胞溶解/死亡，此腫瘤細胞溶解/死亡係由抗體結合誘導T細胞攻擊來介導。

具有抗CD3前藥功能(亦即，CD3結合位點位於莖區域中且因此在2/3-BiFab離析物中不能結合)的2/3-BiFab如上文所述設計(參見實例14及15)。輕鏈、杵-重鏈或臼-重鏈及匹配MHCFcRP共表現以產生2/3-BiFab LeY-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)及2/3-BiFab LeY-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)。2/3-BiFab如上文所述純化(參見實例15中的表)且經歷細胞上的鏈交換反應。

為了在實驗上證明具有抗CD3前藥功能之2/3-BiFab在細胞上發生鏈交換，接著將此等物施加至MCF7細胞。隨後經由基於細胞的報導子分析來確定CD3結合功能的存在或不存在，該等報導子分析在CD3受體結合後產生信號(Promega T細胞活化生物分析(NFAT)，目錄# J1621，圖24)。

MCF7細胞在其細胞表面上攜帶LeY抗原且個別2/3-BiFab因此可以與其功能Fab臂結合。在圖25中，可以發現個別施加的2/3-BiFab結合至MCF7細胞，但不產生/產生低CD3報導子信號。此反映此等分子缺乏CD3結合功能。然而，兩種(互補) 2/3-BiFab的同時施加產生顯著信號，此反映有效的CD3結合。此表明成功的細胞上/活體內鏈重排/交換及產生在細胞上具有CD3結合功能的功能TriFab。

連續施加互補2/3-BiFab後，亦觀測到莖區域成功的鏈交換及功能莖-Fv (CD3-信號)的回收。施加第一實體以實現細胞結合，隨後廣泛洗滌以移除未結合的分子且隨後施加第2實體，亦產生關於抗原陽性細胞的信號。此證實標靶抗CD3前藥分子反應的成功交換及活化可以在生理條件下、在靶細胞表面上發生。

實例 19
靶向不同抗原之 2/3-BiFab前藥在細胞上轉化為結合細胞之根據本發明之全功能活化三特異性 TriFab
2/3-BiFab介導前藥樣抗體衍生物發生的鏈交換及隨後活化可以與雙重抗原結合原理組合。如圖26中所描繪，此增強前藥活化特異性：可以產生2/3-BiFab對，其在鏈交換後產生功能TriFab，該2/3-BiFab對包含具有相同特異性的莖-Fv互補功能(例如CD3 (=CD-抗原1)或CD-AG-2 (=CD-抗原2)或受益於靶向前藥途徑的其他結合子)，但包含不同特異性的細胞表面結合Fab臂。從而僅在表現兩種抗原的細胞上發生富有成效的鏈交換及莖-Fv功能的復原。在此類配置中，交換反應係在細胞表面三特異性TriFab上產生，其中一個Fab臂源於各2/3-BiFab且莖-Fv自來自兩者的互補VH及VL回收。由於個別2/3-BiFab中或僅結合一個2/3-BiFab之細胞上不存在莖-Fv功能，因此提供的前藥活化具有高特異性。僅兩個互補2/3-BiFab攜帶靶抗原(足夠密度)的細胞實現鏈交換且藉此使功能莖-Fv區域再生。在細胞上產生雙特異性結合功能亦促成親合力，因為其使單價細胞表面結合子轉化為二價細胞表面結合子。從而，其使TriFab衍生物在靶細胞表面上的結合增加且穩定(親合力介導的改良，亦如缺乏二硫鍵的2/3-IgG所示)。

因此，細胞表面濃度較高且藉此獲得額外的特異性。

圖27顯示靶向不同抗原之2/3-BiFab前藥在細胞上轉化為結合細胞之全功能活化三特異性TriFab的實驗結果。產生結合細胞表面抗原LeY或細胞表面抗原間皮素(MSLN)的互補2/3-BiFab且在同時表現兩種抗原的細胞株上組合6小時。兩種構築體的(不活化)莖-Fv含有Dig結合抗體的VH或VL。FACS分析表明，施加僅結合LeY或僅結合間皮素之2/3-BiFab後，缺乏相關Dig結合活性(圖27，第2及3欄)。然而，兩者的共同施加引起結合Dig之細胞表面產生相關功能，如此等細胞的螢光增強所指示(圖27，第4欄)。

實例 20
靶向不同抗原之 TriFab 前藥在細胞上轉化為根據本發明之三特異性 TriFab
作為初始分子的2/3-BiFab衍生物包含N端處不具有Fab臂的經修飾之莖-Fv區域作為MHCFcRP。Fab臂連接至此等實體及其與重鏈組合的表現產生能夠實現交換的2/3-TriFab衍生物，如圖28中所示。彼等分子的MHCFcRP已潛在地改變為能結合抗原的鏈，該等鏈在找到其相應搭配物後交換為功能三特異性TriFab。

因此，可以產生具有細胞表面標靶結合特異性『A』的2/3-TriFab衍生物，該等衍生物具有由具有特異性『X』之VH及具有『Y』之VL構成的非功能莖-Fv。相應地，可以產生具有細胞表面標靶結合特異性『B』的互補2/3-TriFab衍生物，該等衍生物具有由具有特異性『Y』之VH及具有特異性『X』之VL構成的非功能莖-Fv。此類分子在細胞上發生的鏈交換產生兩種類型的三特異性TriFab，該兩種類型的TriFab均攜有(親合力增強)雙特異性細胞結合Fab臂(均為A+B)。彼等TriFab之一具有第一特異性的完全活性莖-Fv功能，另一TriFab含有第二莖Fv功能(完全活性『X』TriFab或完全活性『Y』TriFab)。舉例而言，施加此類TriFab-前藥對應能夠實現非活性向活性CD3以及CD-AG-2結合子(或因親合力增強之特異性前藥活化而受益的其他結合子對)的同時轉化，此轉化僅選擇性地在以足夠密度同時表現兩種限定(癌症)表面抗原的彼等細胞上進行。

實例 21
根據本發明之三特異性或四特異性 2 / 3 - BiFab 前藥衍生物
根據如本文所報導之交換反應來設計2/3-BiFab衍生物且可以作為初始分子產生，其中MHCFcRP與重鏈之C端經由肽連接子(諸如(G4S)6連接子)共價結合。類似於TriFab之單鏈莖模組，此產生『非功能』實體，如圖29中所示。Fab臂連接至此等單鏈莖模組產生了能夠實現交換的TriFab衍生物。此等物中之兩者可以與三特異性或四特異性功能抗體衍生物交換，如圖29中所示。

LeY結合區可以與允許結合至其他抗原的序列交換以產生抗體前藥，其在細胞上結合不同抗原且以與圖28所述相同之方式重排。

實例 22
根據本發明之標靶抗 CD3 前藥 2 / 3 - BiFab 在細胞上發生的鏈轉化實現有效的 T 細胞 介導殺死腫瘤細胞
此實例證明，2/3-BiFab前藥在細胞上轉化為結合CD3的TriFab實現T細胞介導殺死標靶腫瘤細胞：產生結合LeY腫瘤抗原的2/3-BiFab，其含有CD3結合抗體之VH或VL域。彼等2/3-BiFab前藥的設計及產生描述於前述實例中。此等2/3-BiFab前藥之CD3結合子的VH及VL序列描述於US 2015/0166661 A1中。

為了證明彼等分子在同時結合後誘導細胞介導殺死，將彼等分子以不同濃度施加至LeY陽性MCF7細胞。因此，將MCF7細胞接種於96孔盤中且培育隔夜，隨後使彼等細胞暴露於2/3-BiFab抗LeY-proCD3 (杵)-MHCFcRP (臼)及2/3-BiFab抗LeY-proCD3 (臼)-MHCFcRP (杵)。此等組分個別地/依序添加或組合添加。為了評估T細胞介導殺死，依5:1比率添加來自健康供者全血的PBMC (經由當前技術Ficoll純化法分離)。培養物接著在37℃、5% CO₂ 下維持48小時，隨後評估腫瘤細胞溶解程度(應用當前技術LDH釋放分析)。

此等分析之結果顯示於圖30中。

MCF7細胞在其細胞表面上攜帶LeY抗原且個別2/3-BiFab因此可以與其功能Fab臂結合。個別施加的2/3-BiFab (亦即，投與抗LeY-proCD3 (杵)-MHCFcRP (臼)或2/3-BiFab抗LeY-proCD3 (臼)-MHCFcRP (杵))即使在高莫耳濃度下亦不引起相關的T細胞介導殺死(LDH未釋放)。此反映此等分子缺乏CD3結合功能(T細胞介導細胞溶解所必需)。

相比之下，同時施加兩種(互補) 2/3-BiFab引起顯著的LDH釋放。此反映腫瘤細胞溶解顯著(濃度已非常低)。此原因在於腫瘤細胞表面上發生成功的鏈重排/交換及產生具有CD3結合功能的功能TriFab。彼等功能CD3結合TriFab接著募集T細胞且與T細胞接合，此又引起標靶腫瘤細胞溶解。

實例 23
根據本發明之靶向 AG - 4 及 EGFR 的 抗 CD3 前藥 2 / 3 - BiFab 在細胞上發生的鏈轉化實現有效的 T 細胞 介導殺死腫瘤細胞及強細胞介素釋放
類似於實例22中所述的實驗配置，利用相應2/3-BiFab靶向表現AG-4的HELA細胞及表現EGFR的A431細胞。

抗AG-4-proCD3 (杵)-MHCFcRP (臼)或2/3-BiFab抗AG-4-proCD3 (臼)-MHCFcRP (杵)投與HELA細胞未引起相關的細胞介導殺死(LDH未釋放)。此反映此等分子缺乏CD3結合功能(T細胞介導細胞溶解所必需)。

另外，抗EGFR-proCD3 (杵)-MHCFcRP (臼)或2/3-BiFab抗EGFR-proCD3 (臼)-MHCFcRP (杵)投與A431細胞未引起相關的細胞介導殺死(LDH未釋放)。

相比之下，在兩種靶細胞配置下，兩種(互補) 2/3-BiFab的同時施加均引起顯著的LDH釋放。此反映腫瘤細胞溶解顯著(濃度已非常低)(圖31)。此原因在於2/3-BiFab在腫瘤細胞表面上發生成功的鏈交換及產生具有CD3結合功能的功能TriFab。

另外，圖32顯示在4 nM濃度下所分泌之細胞介素的量，用於靶向HELA細胞上的AG-4。在施加抗AG-4-proCD3 (杵)-MHCFcRP (臼)與2/3-BiFab抗AG-4-proCD3 (臼)-MHCFcRP (杵)的配置中，存在顯著更多量的IL-2、IFN-γ、顆粒酶B及TNFα，此反映在細胞介素層面上亦出現強免疫反應(圖32)。

實例 24
對 HELA 細胞上之 EGFR 與 AG - 4 的 雙重靶向實現了根據本發明之抗 CD3 前藥 2 / 3 - BiFab 在細胞上發生的鏈轉化及有效 T 細胞活化
在使用報導體細胞株的功能分析中，評估雙重靶向，該報導體細胞株在CD3受體結合後產生信號(Promega T細胞活化生物分析(NFAT)，目錄# J1621)。

表現細胞表面抗原4 (AG-4)與表皮生長因子(EGFR)的HELA細胞(圖33)用靶向AG-4或EGFR的2/3-BiFab處理。兩種構築體的(不活化)莖-Fv含有CD3結合抗體的VH或VL。結果表明，施加單獨的EGFR-proCD3 (杵)-MHCFcRP (臼)或單獨的AG-4-proCD3 (臼)-MHCFcRP (杵)後，相關的CD3結合活性不存在。然而，兩者的共同施加引起顯著的CD3結合及報導體細胞株活化(圖34)。作為對照，分析EGFR-proCD3 (臼)-MHCFcRP (杵)及AG-3-proCD3 (杵)-MHCFcRP (臼)分子。關於抗原表現，HELA細胞呈AG-3陰性，因此僅靶向EGFR的2/3-BiFab能夠結合。此對照充當另一證據，其證實改組反應在細胞表面上發生且僅當兩種2/3-BiFab結合至細胞表面時才在細胞表面上發生。在轉化在培養基中即使在低濃度下有效的情況下，轉化產物EGFR/AG-3/CD3 TriFab已能夠經由EGFR結合實體結合細胞表面且從而誘導CD3介導活化，此未偵測到。
實例 25
具有單鏈莖動力的三特異性 2 / 3 Fab 前藥衍生物在細胞上經歷本發明之轉化 ， 從而產生兩個額外結合位點及強活化的 T 細胞

設計2/3-BiFab衍生物且作為初始分子產生用於如本文所報導之交換反應，其中MHCFcRPs與重鏈C端經由肽連接子(諸如(G4S)6連接子(SEQ ID NO: 81 x 6))共價結合。類似於TriFab的單鏈莖模組，此產生『非功能』實體，如圖29中所示。Fab臂與此等單鏈莖模組連接產生能夠實現交換的TriFab衍生物。此等衍生物中有兩者顯示與三特異性功能抗體衍生物交換，如圖29中所示。

圖35描繪經由流式細胞術進行結合研究的配置。所得結果顯示於圖36中。儘管單獨的構築體不引起Dig-Cy5或Bio-488結合(圖36A：第2及3列；圖36B：第2及3列)，然而兩者的共同施加引起結合Dig及Bio之細胞表面相關功能產生，如此等細胞之螢光增強所指示(圖36A：第4列；圖36B：第4列)。

因此，利用CD3及CD-AG-2結合實體、藉由組合單鏈抗LeY-CD3-TriFab重鏈(杵)-CD-AG-2-VL(臼)與單鏈抗LeY-CD3-TriFab重鏈(臼)-CD-AG-2-VH (杵)來產生三特異性抗體(圖37)。此等分子活化T細胞的能力係藉由使用(Promega T細胞活化生物分析(NFAT)，目錄# J1621)證實且顯示於圖38中。

實例 26
具有另一結合位點的 Fab 成形 MHCFcRP 二聚體 ， 其為根據本發明之標靶抗 CD3 前藥 2 / 3 - BiFab 在細胞上發生鏈轉化的副產物
如圖18中所描繪，具有特異性4的MHCFcRP副產物可為非結合的副產物。然而，藉由向MHCFcRP中添加功能結合實體之VH或相應VL，在交換反應期間產生功能(亦即，能結合)的Fab分子。為了顯示MHCFcRP副產物的結合功能，將攜有CD-AG-2 MHCFcRP之靶向LeY的2/3-BiFab對單獨或組合添加至培養基中。另外，添加表現CD-AG-2的LeY陰性Jurkat細胞。整個配置顯示於圖39中。用PE-抗His6抗體偵測MHCFcRP副產物。由於Jurkat細胞呈LeY陰性且2/3-BiFab可以不結合細胞表面，因此單獨的2/3-BiFab (圖40，第2及3列)不引起偵測抗體發生His6結合。兩種2/3-BiFab的組合引起MHCFcRP副產物產生，該等副產物能夠結合至CD-AG-2且可以經由抗His6抗體、藉由流式細胞術偵測(參見圖40，第4列)。由於缺乏LeY表現，因此未反應的2/3-BiFab不能夠結合細胞。

實例 27
具有另一個 N 端 融合 Fab 作為標靶實體的 MHCFcRP 允許二價細胞標靶介導在細胞上發生的轉化及產生根據本發明之三價 MHCFcRP 副產物
作為初始分子的2/3-BiFab衍生物包含N端處不具有Fab臂的經修飾之莖-Fv區域作為MHCFcRP。Fab臂連接至此等實體及其與重鏈組合的表現產生能夠實現交換的2/3-TriFab衍生物，如圖41中所示。彼等分子的MHCFcRP已改變為能結合LeY的鏈，該等鏈在找到其相應搭配物後，與三特異性功能TriFab發生交換。

從而可以產生具有LeY標靶結合特異性的2/3-TriFab衍生物，該等衍生物含有非功能莖-Fv，該莖-Fv係由具有CD3特異性的VH及具有CD-AG-2特異性之VL (或反之亦然)構成。此類分子在細胞上發生的鏈交換產生兩種類型的三特異性TriFab，該兩種類型的三特異性TriFab均攜有(親合力增強)雙特異性LeY Fab臂。彼等TriFab之一含有CD3特異性的完全活性莖-Fv功能，另一TriFab含有CD-AG-2莖Fv功能。將此類TriFab前藥對施加至表現LeY的MCF7細胞例如能夠實現非活性向活性CD3以及CD-AG-2結合子的同時轉化。

結果描繪於圖42中。結果表明，在施加單獨的LeY-proCD3 (杵)-LeY-proCD-AG-2-MHCFcRP (臼)或LeY-proCD3 (臼)-LeY-proCD-AG-2-MHCFcRP (杵)後，缺乏相關T細胞活化實體。然而，兩者的共同施加引起顯著的T細胞活化。

實例 28
替代的 2 / 3 - BiFab 衍生物保持 CH2 依賴性 FcRn 結合完整且在細胞上顯示根據本發明發生的鏈轉化
作為初始分子的2/3-BiFab衍生物包含經修飾之莖-Fv區域作為MHCFcRP。為了保留來自習知IgG的CH2域且因此保留在延長的半衰期期間結合FcRn的能力，可以使可變片段在CH2-CH3二聚體之C端連接，如圖43中所描繪。CH3域中的部分去穩定化突變與2/3-BiFab中的相同。或者，可以將可變片段引入Fc部分(CH2+CH3)與Fab部分之間，如圖44中所示。所有抗體如先前所述以良好產量(72 mg/L至161 mg/L)受到表現。圖45證實含有CH2之形式能夠對FcRn呈現較高的結合，此揭露血清半衰期相較於初始2/3-BiFab延長(分析型FcRn親和層析如Schlothauer, T.等人, MAbs 5 (2013) 576-586中所述進行)。

如上文所述，藉由流式細胞術分析含有CH2之2/3-BiFab賦予細胞上鏈轉化的能力。兩種離析劑分子依序施加(其間洗滌兩次)至MCF7細胞中。鏈交換發生後，組裝功能抗地高辛結合位點且因此能夠結合細胞表面上的地高辛化Cy5，其藉由FACS偵測。根據圖43及44的兩種分子類別成功地經歷根據本發明之鏈交換反應，如圖46中所描繪。

實例 29
含有 CH2 域的 2 / 3 - BiFab 能夠在根據本發明之方法中轉化成功能 CD3 結合位點且藉此介導 T 細胞活化
使用如上文所概述的Jurkat活化分析，分析在C端與可變片段連接的含有CH2之2/3-BiFab (圖47)產生功能CD3結合子的能力。MCF7細胞充當靶細胞，LeY充當靶抗原。儘管2/3-BiFab不誘導顯著的Jurkat活化，然而兩者的組合均引起劑量依賴性活化及報導體系統(RLU)發光(圖48)。

實例 30
透射電子顯微鏡證實 2 / 3 - BiFab 及相應產物之所提出結構且揭露其具有高柔性
為了分析本發明方法所得之2/3-BiFab及相應鏈交換產物的形狀及結構，進行負染色透射電子顯微鏡術(NS-TEM)。結果(圖49)揭露域內特徵呈剛性，但域間柔性較高。
柵極製備：使剛解凍的樣品在D-PBS中稀釋至約5 mg/ml的濃度。使4 µl經稀釋的樣品吸附至輝光放電的400目經碳塗佈之parlodion銅柵極上，用3滴水洗滌，與3 µl含TMV溶液一起培育，進一步用2滴水洗滌且最後用2滴2%醋酸鈾醯染色。

透射電子顯微鏡 ：使用在120 kV下操作的Tecnai12透射電子顯微鏡(FEI, Eindhoven, The Netherlands)對樣品成像。在2048x2048像素電荷耦合裝置相機(Veleta Gloor Instruments)上，以195,000倍的標稱放大率記錄電子顯微照片，從而在試樣層面上產生0.296 nm的最終像素尺寸。或者，使用在80 kV下操作的FEI Tecnai G2 Spirit TEM (FEI, Eindhoven, The Netherlands)對樣品成像。接著在2048x2048像素電荷耦合裝置相機(Veleta Soft Imaging Systems)上、以135,000倍的標稱放大率記錄電子顯微照片，從而在試樣層面上產生0.33 nm的最終像素尺寸。

圖像處理 ：使用EMAN2圖像處理套裝，利用所記錄的影像對人工選擇的顆粒執行無參考對齊(參見例如G. Tang, L.等人, J. Struct. Biol. 157 (2007) 38-46)。將所萃取的顆粒對齊且藉由多變數統計分析進行分類，從而產生2D類別的平均值。另外，當取類別平均值不可能時，為了清晰起見，亦使用Photoshop對原始顆粒影像進行人工染色。

實例 31
標靶無關的鏈轉化僅在高濃度下低效發生
為了解決鏈轉化在培養基中是否亦在高濃度下發生，將2/3-BiFab施加至與PBMC共培養的HELA細胞中。在第一配置中，施加抗AG-4-proCD3 (臼)-MHCFcRP (杵)及EGFR-proCD3 (杵)-MHCFcRP (臼)(由於兩種標靶均在HELA細胞上表現，因此在細胞上發生轉化)。在第二配置中，施加抗AG-4-proCD3 (臼)-MHCFcRP (杵)及AG-3-proCD3 (杵)-MHCFcRP (臼)(AG-3不表現於HELA細胞上，因此細胞上的轉化應不可能)。然而，300 nM濃度下的殺死百分比揭露，培養基中的轉化及經由AG-4結合位點單價結合至HELA細胞表面鮮有發生且僅以較低百分比介導殺死靶細胞(圖50)。

圖 1 ： 例示性2/3-IgG的設計及模組化組成，其可以用於本發明之方法中。

圖 2 杵-cys與臼-cys重鏈之間(上部)及杵-cys重鏈與MHCFcRP之間(中部及下部)的相互作用。共價二硫鍵係用短劃線表示，吸引性相互作用對係用實心球之間的線描繪，排斥相互作用或所產生的空間位阻係用雙箭頭線表示。

圖 3A 、 3B 、 3C 及 3D ： 具有不同MHCFcRPs之經純化2/3-IgG的SEC層析圖：所示為自細胞培養物上清液中進行蛋白質A萃取之後，2/3-IgG製劑的SEC特徵曲線；各種特徵曲線的主峰代表具有螢光素(fluos；抗fluos)或生物素(bio；抗bio)結合位點/特異性的2/3-IgG(參見實例2)。圖3A：具有D356K (臼)；圖3B：具有K370E (杵)；圖3C：具有E357K (臼)；圖3D：具有K439E (杵)。

圖 4 ： 根據本發明、藉由交換反應產生bsAbs (雙特異性抗體)，以2/3-IgG為例說明。

圖 5 ： 施加TCEP (相對於2/3輸入IgG的x莫耳當量)以(部分地)還原鉸鏈二硫鍵。SEC區分2/3-IgG初始分子，產生bsAb及二聚合MHCFcRP。相同培育時間之後，中止不同TCEP濃度下的所有反應(三角形：bsAb；十字形：2/3-IgG，菱形：二聚合MHCFcRP)。

圖 6 ： 自所要bsAb產物中移除非所要的未反應輸入分子及副產物的方案(若反應在活體外進行)。

圖 7A 及 7B ： 圖7A：交換反應方案；圖7B：NiNTA之SDS-page - 純化；所結合的NiNTA (上圖)表示自NiNTA溶離的蛋白質，NiNTA流過(下圖)為不含有His-6或His-8標籤的蛋白質；n.r. = 非還原，r. = 還原；M = 標記物。

圖 8 ： 根據本發明、藉由交換反應產生bsAbs的雙特異性功能。藉由能夠偵測雙特異性抗體之結合位點同時結合的橋式ELISA評估功能。塗佈至ELISA盤的抗原A為螢光素(fluos-BSA，FITC-BSA)且抗原B為生物素(bio-Cy5)，其可藉由其螢光偵測到。

圖 9 ： 用於2/3-IgG交換反應的例示性2/3-IgG在重鏈的C端具有結合位點。

圖 10 ： 用於2/3-IgG交換反應的例示性2/3-IgG在重鏈的N端及C端具有結合位點。

圖 11 ： 本發明方法的普遍適用性，如使用具有不同結合特異性及形式之初始材料藉由IgG交換反應所表明，以2/3-IgG為例說明。

圖 12 ： 根據本發明、使用例示性2/3-IgG、經由交換反應產生的不同bsAb形式基質。該基質係使用螢光素結合實體及生物素胺結合實體產生。輸入分子及交換衍生的輸出分子顯示於圖11中。使用fluos-BSA作為捕捉抗原及bio-Cy5偵測雙特異性結合功能，藉由橋式ELISA評估所產生之bsAb的功能。源於橋式ELISA的信號表明所有形式均具有雙特異性結合功效。

圖 13 ： 使用小型化高處理量及自動化相容性方法、根據本發明、經由交換反應產生及表徵bsAb多樣性的基質。

圖 14 ： 根據本發明之方法、利用HTS技術、經由交換反應來形成雙特異性抗體。所示為例示性橋式ELISA的信號，其顯示指示雙特異性抗體形成的濃度依賴性螢光信號。Fluos-bio橋式ELISA，十字形：fluos [臼/K370E] + bio [杵/E357K]，菱形：bio [臼/K370E] + fluos [杵/E357K]。所有其他曲線：無同源交換搭配物的2/3-IgG輸入分子(此等物因存在僅一個結合位點而未顯示橋聯信號)。

圖 15 ： 根據本發明的交換反應方案，以無鉸鏈區及CH3域鏈間二硫鍵的2/3-IgG為例說明。此能實現本發明之方法中的鏈交換反應而不需要添加還原劑。

圖 16 ： 使無鏈間二硫橋鍵的2/3-IgG分泌至培養物上清液(如標準IgG)中，藉由標準蛋白質A親和及尺寸排阻層析加以純化，且藉由SDS-PAGE分析，證實所要100 kDa 2/3-IgG為表現產物。此證明經純化之2/3-IgG衍生物得到正確的組裝，該等衍生物無鏈間二硫橋鍵且不存在非所要二聚體及聚集體。以下各者的純化：i)抗bio抗體輕鏈(SEQ ID NO: 39) + 無鉸鏈區半胱胺酸殘基的抗bio抗體重鏈-杵(SEQ ID NO: 57) + 無鉸鏈區半胱胺酸殘基的MHCFcRP-臼-E357K (SEQ ID NO: 62)(左側所示)及ii)抗fluos抗體輕鏈(SEQ ID NO: 42) + 無鉸鏈區二硫鍵的抗fluos抗體全長重鏈-臼(SEQ ID NO: 60) + 無鉸鏈區半胱胺酸殘基的MHCFcRP-杵-K370E(SEQ ID NO: 63)(右側所示)。

圖 17 ： 使用無鉸鏈區二硫鍵之初始材料、根據本發明之交換反應的結果：以經純化之bsAb作為陽性對照物的2.5 µM濃度之輸入分子表明無Fc區鏈間二硫鍵之單特異性2/3-IgG輸入分子經由鏈交換而成功地產生bsAb。

圖 18 ： BiFab相對於TriFab的設計及組成及鏈交換原理。

圖 19A 及 19B ： 2/3-BiFab之表現及純化：圖19A：KappaSelect；圖19B：SEC

例示性顯示LeY-proDig (杵)-MHCFcRP(臼)的特徵曲線。

圖 20A 及 20B ： 2/3-BiFab之表現及純化：SDS-Page；n.r = 非還原；r = 還原；L = 分子量標記物。圖20A：LeY-proDig (杵)-MHCFcRP (臼)、LeY-proDig (臼)-MHCFcRP (杵)、MSLN-proDig (臼)-MHCFcRP (杵)；圖20B：LeY-proCD3 (杵)-MHCFcRP (臼)、LeY-proCD3 (臼)-MHCFcRP (杵)、LeY-proCD-AG-2 (杵)-MHCFcRP (臼)、LeY-proCD-AG-2 (臼)-MHCFcRP (杵)。

圖 21 ： 對暴露於初始分子及藉由本發明之交換反應所得之分子的細胞進行的FACS分析。

圖 22 ： 細胞表面上的2/3-BiFab交換反應再排列且藉此活化莖區域中的第3結合位點(Fv)。

圖 23 ： 靶向不同抗原且含有不同莖Fv之TriFab樣前藥在細胞上轉化為結合細胞的三特異性TriFab。

圖 24 ： 藉由CD3信號傳導報導分析偵測細胞上之CD3結合功能活化的原理。

圖 25 ： 在靶細胞上藉由2/3-BiFab交換活化CD3結合功能。

圖 26 ： 靶向不同抗原之2/3-BiFab前藥在細胞上轉化為結合細胞之全功能活化三特異性TriFab。

圖 27 ： 靶向不同抗原之2/3-BiFab前藥在細胞上的轉化。A431-H9細胞上之靶向LeY及MSLN的抗體。在37℃下培育六小時。

圖 28 ： 含有前藥交換模組的TriFab衍生物，該等前藥交換模組可以重排成全功能三特異性實體。

圖 29 ： 含有單鏈前藥交換模組的2/3-BiFab衍生物，該等單鏈前藥交換模組可以重排成全功能四特異性實體。

圖 30A 及 30B ： 來自兩位不同供者之PBMC及MCF7與抗LeY-proCD3 2/3-BiFab的共培養。LDH釋放充當細胞介導殺死標靶腫瘤細胞的指標。圖30A：供者1的PBMC；圖30B：供者2的PBMC。

圖 31A 及 31B ： 圖31A：PBMC及A431細胞與抗EGFR-proCD3 2/3-BiFab的共培養。圖31B：PBMC及HELA細胞與抗AG-4-proCD3 2/3-BiFab的共培養。LDH釋放充當細胞介導殺死標靶腫瘤細胞的指標。

圖 32A 、 32B 、 32C 、 32D 及 32E ： PBMC及HELA與4 nM莫耳濃度之抗AG-4-proCD3 2/3-BiFab共培養之後，上清液中的細胞介素量。圖32A：IL-2量；圖32B：IFNγ量；圖32C：顆粒酶B量；圖32D：TNFα量；圖32E：圖例。

圖 33 ： 表面抗原AG-4及EGFR在HELA細胞上的表現量。

圖 34 ： 在Jurkat報導分析中，相應proCD3 2/3-BiFab對AG-4及EGFR的雙重靶向及所引起的T細胞活化。

圖 35 ： 含有單鏈前藥交換模組的2/3-BiFab衍生物，該等單鏈前藥交換模組可以重排成全功能地高辛及生物素結合實體且可以藉由FACS、根據Dig-Cy5及Bio-488結合加以分析。

圖 36A 及 36B ： TriFab衍生物轉化後，對細胞表面上之染料結合進行的FACS分析。圖36A：Dig-Cy5；圖36B：Bio-488。

圖 37 ： 含有單鏈前藥交換模組的2/3-BiFab衍生物，該等單鏈前藥交換模組可以重排成全功能CD3及CD-AG-2結合子。

圖 38 ： 含有單鏈前藥交換模組的2/3-BiFab衍生物，該等單鏈前藥交換模組可以重排成全功能CD3且CD-AG-2結合子在CD3信號傳導報導分析中活化T細胞。

圖 39 ： MHCFcRP可以具備可變片段(VH或VL)且在2/3-BiFab轉化後，產生結合CD-AG-2的Fab分子作為副產物。

圖 40 ： 根據產物對Jurkat細胞表面的結合，對CD-AG-2-MHCFcRP進行的FACS分析。

圖 41 ： 標靶Fab實體在N端添加至MHCFcRP中與MHCFcRP內之兩個proCD3/proCD-AG-2可變區的組合引起兩種類型的三特異性TriFab在細胞上組裝，從而實現CD3以及CD-AG-2結合。

圖 42 ： 三特異性TriFab在CD3信號傳導分析中的T細胞活化能力。

圖 43 ： 一種替代的2/3-BiFab形式，其含有CH2域且藉此含有能發揮效應功能的Fc區；可變域各自位於Fc區的C端。

圖 44 ： 一種替代的2/3-BiFab形式，其含有另一個CH2域且藉此含有能發揮效應功能的Fc區；可變域分別位於Fc區與標靶Fab之間，或N端。

圖 45 ： 進行分析型FcRn親和層析以證實CH2勝任2/3-BiFab分子的CH2依賴性結合。

圖 46A 及 46B ： 施加含有CH2之2/3-BiFab後，對細胞表面上之Dig-Cy5結合進行的FACS分析。Dig結合位點僅在施加兩種相應BiFab後轉化。自上而下：MCF-7+Dig-Cy5；杵-離析劑；臼-離析劑；細胞上改組/交換反應；對照產物。

圖46A：Fc區之C端處的可變域；圖46B：Fc區與標靶Fab之間的可變域。

圖 47 ： 含有CH2之BiFab的分子配置，其用於在細胞上產生功能性CD3結合位點。

圖 48 ： T細胞報導分析揭露含有CH2之2/3-BiFab能夠誘導T細胞活化。KN = 杵；HL = 臼。

圖 49A 、 49B 及 49C ： 負染色透射電子顯微鏡(NS-TEM)分析揭露2/3-BiFab的分子形狀及柔性。圖49A：抗AG-4-proCD3 (臼)-MHCFcRP (杵)；圖49B：AG-3-proCD3 (杵)-MHCFcRP (臼)；圖49C：抗AG-4/CD3/AG-3-抗體。

圖 50 ： 標靶非依賴性改組僅在高濃度(300 nM)下以低水準發生。

圖 51 ： 藉由修飾IgG1鉸鏈區，亦即藉由移除二硫鍵或藉由縮短鉸鏈區，可以對個別結合位點之間的不同距離進行工程改造。

Claims (21)

1. 一種多聚體多肽，包含 第一多肽，其包含 i)在N端至C端方向上，a)第一抗體可變域，其選自特異性結合至第一標靶之抗體輕鏈與重鏈可變域對，及b)第一人類免疫球蛋白G CH3域， ii)特異性結合至第二標靶的抗體輕鏈與重鏈可變域對，位於該第一抗體可變域之N端或該第一CH3域之C端， 第二多肽，其包含 i)在N端至C端方向上，a)第二抗體可變域，其選自特異性結合至第三標靶的抗體輕鏈與重鏈可變域對，及b)第二人類免疫球蛋白G CH3域， 其中若該第一抗體可變域為抗體重鏈可變域，則該第二抗體可變域為抗體輕鏈可變域；或若該第一抗體可變域為抗體輕鏈可變域，則該第二抗體可變域為抗體重鏈可變域， 及 其中該第二CH3域包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的擾動突變，其中該第一CH3域包含 a)位置439處之胺基酸殘基K，若該擾動突變為D356K，或 b)位置370處之胺基酸殘基K，若該擾動突變為E357K，或 c)位置357處之胺基酸殘基E，若該擾動突變為K370E，或 d)位置356處之胺基酸殘基D，若該擾動突變為K439E， 及 ii)視情況存在之特異性結合至該第二標靶或第四標靶的抗體輕鏈與重鏈可變域對，位於該第二抗體可變域的N端或該第二CH3域的C端， 其中所有編號均根據Kabat EU索引。
2. 一種多聚體多肽，包含 第一多肽，其包含 i)在N端至C端方向上，a)第一人類免疫球蛋白G CH3域，及b)第一抗體可變域，其選自特異性結合至第一標靶之抗體輕鏈與重鏈可變域對， ii)特異性結合至第二標靶的抗體輕鏈與重鏈可變域對，位於該第一CH3域之N端或該第一可變域之C端， 第二多肽，其包含 i)在N端至C端方向上，a)第二人類免疫球蛋白G CH3域，及b)第二抗體可變域，其選自特異性結合至第三標靶的抗體輕鏈與重鏈可變域對， 其中若該第一抗體可變域為抗體重鏈可變域，則該第二抗體可變域為抗體輕鏈可變域；或若該第一抗體可變域為抗體輕鏈可變域，則該第二抗體可變域為抗體重鏈可變域， 及 其中該第二CH3域包含選自由D356K、E357K、K370E及K439E組成之突變群組的擾動突變，其中該第一CH3域包含 a)位置439處之胺基酸殘基K，若該擾動突變為D356K，或 b)位置370處之胺基酸殘基K，若該擾動突變為E357K，或 c)位置357處之胺基酸殘基E，若該擾動突變為K370E，或 d)位置356處之胺基酸殘基D，若該擾動突變為K439E， 及 ii)視情況存在之特異性結合至該第二標靶或第四標靶的抗體輕鏈與重鏈可變域對，位於該第二CH3域或該第二可變域的N端， 其中所有編號均根據Kabat EU索引。
3. 如請求項1至2中任一項之多聚體多肽，其中該第一CH3域及該第二CH3域包含促進該第一CH3域與該第二CH3域之間形成雜二聚體且不同於該擾動突變的其他突變。
4. 如請求項1或2之多聚體多肽，其中 該第一CH3域包含 a)突變T366W，或 b)突變T366S/L368A/Y407V， 及 該第二CH3域包含 a)突變T366S/L368A/Y407V，若該第一CH3域包含突變T366W，或 b)突變T366W，若該第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V。
5. 如請求項1或2之多聚體多肽，其中該第一多肽及該第二多肽為非共價二聚體。
6. 如請求項1或2之多聚體多肽，其中該第一可變域與該第二可變域形成非功能結合位點。
7. 如請求項1或2之多聚體多肽，其中該第一及第二多肽各自包含胺基酸序列DKTHTSPPS (SEQ ID NO: 66)或DKTHT (SEQ ID NO: 94)或GGGS (SEQ ID NO: 69)或DKTHGGGGS (SEQ ID NO: 97)，在該第一CH3域位於該第一可變域之C端的情況下，該等胺基酸序列位於該第一及第二可變域中之每一者的N端，或在該第一可變域位於該第一及第二CH3域之C端的情況下，該等胺基酸序列位於該第一及第二CH3域中之每一者的N端。
8. 如請求項1或2之多聚體多肽，其中 i) 該第一CH3域包含突變T366W及位置439處之胺基酸殘基K， 及 第二CH3域包含擾動突變D356K及突變T366S/L368A/Y407V，或 ii) 該第一CH3域包含突變及位置370處之胺基酸殘基K， 及 該第二CH3域包含擾動突變E357K及突變T366S/L368A/Y407V，或 iii) 該第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V及位置357處之胺基酸殘基E， 及 該第二CH3域包含擾動突變K370E及突變T366W，或 iv) 該第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V及位置356處之胺基酸殘基D， 及 該第二CH3域包含擾動突變K439E及突變T366W。
9. 如請求項1或2之多聚體多肽，其中該第一、第二及第三標靶為不同的。
10. 如請求項1或2之多聚體多肽，其中該第一標靶及/或該第三標靶為人類CD3。
11. 如請求項1或2之多聚體多肽，其中特異性結合至該第二標靶的該抗體輕鏈與重鏈可變域對選自由以下組成之群：Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、互換Fab、雙特異性Fab、sdAb及VHH。
12. 如請求項1或2之多聚體多肽，其中特異性結合至該第四標靶之該抗體輕鏈與重鏈可變域對獨立於特異性結合至該第二標靶之該抗體輕鏈與重鏈可變域對選自由以下組成之群：Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、互換Fab、雙特異性Fab、sdAb及VHH。
13. 如請求項1或2之多聚體多肽，其中該第一及第二多肽中之每一者進一步包含直接位於該CH3域之N端的免疫球蛋白G CH2域。
14. 如請求項1或2之多聚體多肽，其中該人類免疫球蛋白G為人類IgG1或人類IgG2或IgG3或人類IgG4。
15. 一種組合物，其包含如請求項1至14中任一項之第一多聚體多肽及如請求項1至14中任一項之第二多聚體多肽，其中 該第一多聚體多肽之該第二CH3域包含突變D356K且該第二多聚體多肽之該第二CH3域包含突變K439E， 或 該第一多聚體多肽之該第二CH3域包含突變E357K且該第二多聚體多肽之該第二CH3域包含突變K370E， 及 該第一多聚體多肽之該第一抗體可變域及該第二多聚體多肽之該第一可變域為特異性結合至該第一標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對， 及 該第一多聚體多肽之該第二抗體可變域及該第二多聚體多肽之該第二可變域為特異性結合至該第三標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對， 及 該第二及第四標靶彼此獨立地為細胞表面抗原。
16. 如請求項15之組合物，其中該第一多聚體多肽的該第一CH3域及該第二多聚體多肽的該第二CH3域包含促進雜二聚體形成的相同突變且該第一多聚體多肽的該第二CH3域及該第二多聚體多肽的該第一CH3域包含促進雜二聚體形成的相同突變。
17. 如請求項15至16中任一項之組合物，其中 該第一多肽的該第一CH3域包含 a)突變T366W，或 b)突變T366S/L368A/Y407V， 及 該第一多肽的該第二CH3域包含 a)突變T366S/L368A/Y407V，若該第一CH3域包含突變T366W，或 b)突變T366W，若該第一CH3域包含突變T366S/L368A/Y407V。
18. 如請求項15至16中任一項之組合物，其中 該第一多聚體多肽的該第一CH3域與該第二多聚體多肽的該第二CH3域均包含突變T366W或突變T366S/L368A/Y407V， 及 該第一多聚體多肽之該第二CH3域包含突變D356K且該第二多聚體多肽之該第二CH3域包含突變K439E， 或 該第一多聚體多肽之該第二CH3域包含突變E357K且該第二多聚體多肽之該第二CH3域包含突變K370E， 及 該第一多聚體多肽之該第一抗體可變域及該第二多聚體多肽之該第一可變域為特異性結合至該第一標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對， 及 該第一多聚體多肽之該第二抗體可變域及該第二多聚體多肽之該第二可變域為特異性結合至該第三標靶的抗體輕鏈可變域與抗體重鏈可變域對， 及 該第二及第四標靶彼此獨立地為細胞表面抗原。
19. 如請求項15或16之組合物，其中該第一及/或該第三標靶為人類CD3。
20. 如請求項15或16之組合物，其中該組合物為醫藥組合物且視情況進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。
21. 一種如請求項1至14中任一項之多聚體多肽或如請求項15至20中任一項之組合物的用途，其用於製造供治療需要此類治療之患者的藥劑。