CN111372947A

CN111372947A - 在体内从单特异性抗体产生多特异性抗体的方法

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Publication number: CN111372947A
Application number: CN201880071568.9A
Authority: CN
Inventors: U·布林克曼; K·迈尔; S·迪科普夫
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2018-10-29
Publication date: 2020-07-03
Also published as: CA3078676A1; US20200255522A1; TW201932494A; TWI832824B; JP2021501181A; MX2020004100A; BR112020007736A2; IL274071A; EP3704145A1; KR20200074195A; JP7438942B2; JP2024001197A; AU2018358883A1; WO2019086362A1

Abstract

本文报告了通过两个2/3‑IgG之间或两个2/3‑BiFab之间的半抗体交换反应、直接在细胞表面于作用位点上产生多特异性抗体的方法，所述2/3‑IgG或2/3‑BiFab在一半中通过非对称干扰突变而去稳定化，从而促进产生正确组装的全长双或多特异性抗体。本发明方法可以在起始2/3‑IgG或2/3‑BiFab中缺乏铰链区二硫键的情况下进行。

Description

在体内从单特异性抗体产生多特异性抗体的方法

本发明公开了利用新颖半抗体交换法、在细胞上体内组装多特异性(例如双特异性)抗体的方法。该方法甚至适用于完全抗体，即包含CH2-CH3结构域并因此具有效应功能的抗体。

发明背景

目前现有技术将单特异性抗体衍生物经生物化学转换得到组装的双特异性抗体的方法采用(i)半抗体互补反应和(i)IgG-IgG交换反应。

这些技术公开于例如WO 2015/046467；Rispens等,J.Biol.Chem.289(2014)6098–6109；US 9,409,989；WO 2013/060867；WO 2011/131746；WO 2011/133886；WO 2011/143545；WO 2010/151792；Gunasekaran等,J.Biol.Chem.285(2010)19637–19646；WO 2009/041613；WO 2009/089004；WO 2008/119353；WO 2007/114325；US 8,765,412；US 8,642,745；WO 2006/047340；WO 2006/106905；WO 2005/042582；WO 2005/062916；WO 2005/000898；US 7,183,076；US 7,951,917；Segal,D.M.等，Curr.Opin.Immunol.11(1999)558–562；WO 98/50431；WO 98/04592；Merchant,A.M.等,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；WO96/27011；Carter,P.等,Immunotechnol.2(1996)73；WO 93/11162和Kostelny,S.A.等,J.Immunol.148(1992)1547-1553中。

现有技术将单特异性抗体或抗体衍生物转换为bsAbs(双特异性抗体)的方法具有缺陷，例如组装后bsAb制品在工艺和组成方面的限制等。

例如，半抗体技术将单特异性和单价抗体组装成双价IgG。输入分子的表达以及交换反应本身不仅产生半抗体，而且产生类IgG双价(单特异性)抗体衍生物。输入物中以及组装反应的输出物中也会存在聚合物。两者(双价单特异性抗体和聚合物)都需要通过复杂的纯化方法从组装的bsAb中定量去除，或者(由于定量去除很难以高通量方式实现)它们会在一定程度上“污染”bsAb制品。

例如，Fab-arm交换技术从单特异性双价IgG衍生物组装双特异性双价IgGs。因此，交换反应的输入物是双价的(即，默认情况下具有亲合力(avidity))。为了确保交换反应中完全没有剩余的双价单特异性输入物，应进行亲合力或激动性抗体筛选，以便确保完全去除任何剩余的双价输入物以及任何在交换反应期间可能形成的聚合物。由于输入物和bsAb高度相似，需要复杂的程序进行定量去除(很难实现高通量)，否则剩余的双价输入物和聚合物将会在一定程度上污染最终的bsAb制品。

Labrijn,A.F.等公开了通过受控制的Fab-arm交换高效产生稳定的双特异性IgG1的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(2013)5145-5150)。

WO 2014/081955公开了异二聚抗体及其使用方法。

WO 2009/089004公开了利用静电转向效应制备抗体Fc-异二聚分子的方法。其中公开了在涉及结构域-结构域相互作用的四个独特的电荷残基对(Asp356---Lys439′、Glu357--Lys370′、Lys392---Asp399′、Asp399---Lys409′)中，只有Lys409---Asp399′适用于工程化改造，因为这两个残基在结构上保守并且是隐蔽残基。对于其他三对残基，至少一个伙伴残基是溶剂暴露的(％ASA>10)。

WO 2018/155611公开了不通过共价键合来结合的第一抗原结合分子和第二抗原结合分子的组合，当混合到液体中时，其更容易形成异质二聚体而不是同质二聚体。其中公开了一个实施方案，以其他氨基酸替换EU编号系统第226位和第229位之一或两者上的半胱氨酸残基，组合在EU编号系统的第357位或第397位的至少一个上以其他氨基酸残基替换第一CH3和第二CH3之一或两者。

Mayer,K.等人(Int.J.Mol.Sci.16(2015)27497-27506)公开了TriFabs——三价IgG型双特异性抗体衍生物，其设计、产生、表征和靶向载荷递送的应用。

发明概述

本发明公开，通过半抗体交换反应直接在靶细胞表面产生多特异性抗体的方法。这允许，例如，直接在目的作用位点上从非活性的前结合位点(pro-binding site)形成功能性结合位点。这样的就地(on-site)形成消除了系统性副反应的风险。

已发现，作为起始物，有利的是非完全抗体，例如包含抗体轻链、抗体重链和抗体重链片段的2/3-IgGs或2/3-BiFabs，其中重链-重链相互作用因非对称干扰突变而不稳定，突变优选在重链片段中，并且其中不存在重链-重链间共价/二硫键，例如铰链区二硫键或CH3结构域间二硫键。已发现，这种不对称干扰突变一方面促进起始不完全抗体的解离，另一方面促进产生正确组装的全长双特异性抗体。没有重链-重链间共价键，允许在没有还原剂的情况下，即在体内或生理条件下进行反应。

根据本发明的方法在无还原剂的情况下进行。因此，起始抗体没有重链-重链二硫键，例如铰链区二硫键。因此，根据本发明的链交换反应和方法允许在没有起始还原作用的情况下组装双特异性抗体，使得该方法适用于体内应用。因此，可以例如通过诱变PCR去除起始分子的重链之间天然存在的分子内二硫键。尽管重链之间缺乏所有分子间二硫键，但可正确形成稳定的，即可分离的抗体。因此，使用这些起始分子，可以利用无还原作用的自发链交换反应，实现双特异性抗体的体内产生。总之，根据本发明的无还原作用的链交换方法能够在体内直接在细胞表面高效产生功能性双特异性抗体。

本发明公开生产(多特异性)结合物/多聚体多肽的方法，包括以下步骤：

-孵育以下第一结合物和第二结合物，

第一结合物(单或双特异性的和异聚体的)/多聚体多肽，包含第一(单体)多肽和第二(单体)多肽，其中两个多肽均包含(从N端至C端方向)抗体可变域以及(直接)后随的人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域，

其中i)第一多肽的可变域是重链可变域，且第二多肽的可变域是轻链可变域，或ii)第一多肽的可变域是轻链可变域，且第二多肽的可变域是重链可变域，

其中i)第一多肽的CH3结构域包含杵突变(knob mutation)，且第二多肽的CH3结构域包含臼突变(hole mutation)，或ii)第一多肽的CH3结构域包含臼突变，且第二多肽的CH3结构域包含杵突变，

其中第一多肽包含至少一个功能结合位点或至少部分的结合位点，

其中第二多肽在CH3结构域中包含至少一个/第一干扰突变(选自如下突变：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T)，其中第一多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，

其中第一多肽和第二多肽非共价地彼此结合/形成非共价二聚体/是非共价地彼此结合的/是非共价二聚体，(由此，当第二多肽和第一多肽形成异二聚体时，第二多肽中的干扰突变导致去稳定化的相互作用)

以及

第二结合物(单或双特异性的和异聚体的)/多聚体多肽，包含第三(单体)多肽和第四(单体)多肽，其中两个多肽均包含(从N端至C端方向)抗体可变域以及直接后随的人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域，

其中i)第三多肽的可变域是重链可变域，且第四多肽的可变域是轻链可变域，或ii)第三多肽的可变域是轻链可变域，且第四多肽的可变域是重链可变域，其中，i)如果第一多肽的可变域是重链可变域，则第四多肽的可变域是轻链可变域，或ii)如果第一多肽的可变域是轻链可变域，则第四多肽的可变域是重链可变域，

其中i)第三多肽的CH3结构域包含杵突变，且第四多肽的CH3结构域包含臼突变，或ii)第三多肽的CH3结构域包含臼突变，且第四多肽的CH3结构域包含杵突变，其中，i)在第一多肽包含臼突变的情况下，第四多肽包含杵突变，或ii)在第一多肽包含杵突变的情况下，第四多肽包含臼突变，

其中第四多肽包含至少一个功能结合位点或至少部分的结合位点，

其中第三多肽在CH3结构域中包含至少一个/第二干扰突变(选自如下突变：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T)，其中第四多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，其中第三多肽中的突变与第二多肽中的突变是在不同位置上，

其中第三多肽和第四多肽共价地或非共价地彼此结合/形成共价或非共价二聚体/是非共价地或共价地彼此结合的/是非共价或共价二聚体，(由此，当第三多肽和第四多肽形成异二聚体时，第三多肽中的干扰突变导致去稳定化的相互作用)，

其中当第二多肽和第三多肽形成异二聚体时，第二多肽中的(第一)干扰突变和第三多肽中的(第二)干扰突变导致吸引性的相互作用，

其中第一多肽的可变域和第四多肽的可变域形成功能(能结合抗原的)结合位点(抗体可变域对(VH/VL对))，第二多肽的可变域和第三多肽的可变域形成非功能(不能结合抗原的)可变域对，

和

-回收包含第一多肽和第四多肽的结合物，从而产生(多特异性)结合物/多聚体多肽。

在一个实施方案中，第一至第四多肽从N端至C端方向各包含i)氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)，ii)源自人IgG1可变域的抗体可变域，以及iii)源自人IgG1CH3结构域的CH3结构域。

在一个实施方案中i)第一和第四多肽还各包含源自人IgG1 CH1结构域((变体)人IgG1 CH1结构)的CH1域、以及(彼此独立地)另一(重链或轻链)可变域，或ii)第一或第四多肽包含源自人IgG1 CH1结构域((变体)人IgG1 CH1结构域)的CH1结构域，且相应的另一多肽包含源自轻链恒定域((变体)人κ或λCL结构域)的结构域，且每个多肽还包含另一可变域。在一个实施方案中，第一多肽的另一可变域和第四多肽的另一可变域是(不同的)重链可变域。在一个实施方案中，第一多肽的另一可变域是重链可变域，而第四多肽的另一可变域是轻链可变域，或反之亦然。

在一个实施方案中，第一和第四多肽可以具有相同的或不同的N端至C端序列，如果第一和第四多肽相同，则它们选自由如下多肽组成的组；如果第一和第四多肽不同，则它们彼此独立地选自由如下多肽组成的组，其中所述多肽从N至C端方向包含：

i)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，和源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，

ii)SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二重链可变域，和人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，

iii)SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，和第二重链可变域，

iv)scFv，可选地肽接头，SEQ ID NO:66的铰链区，重或轻链可变域，源自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，

v)scFab，可选地肽接头，SEQ ID NO:66的铰链区，重或轻链可变域，源自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，

vi)SEQ ID NO:66的铰链区，重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，和scFv，

vii)SEQ ID NO:66的铰链区，重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，和scFab，

viii)第二重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ IDNO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第三重链可变域，和第二人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，

ix)第二重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，和第三重链可变域，

x)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，和scFv，

xi)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，和scFab，

xii)第二重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，和第二轻链可变域，

xiii)第二重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ IDNO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二轻链可变域，和第二人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，

xiv)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第三重链可变域，和人IgG1κ或λ轻链恒定域(源自其的轻链恒定域)，

xv)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人IgG1κ或λ轻链恒定域(源自其的轻链恒定域)，和第三重链可变域，

在一个实施方案中，第一和第四多肽之一从N端至C端方向包含第二重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，第三重链可变域，第一轻链恒定域，SEQ IDNO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，和源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域；而第一和第四多肽之另一从N端至C端方向包含第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，和源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域。在一个实施方案中，包含含有两个重链可变域的多肽的结合物还包含第一轻链以及(经结构域交换的)第二轻链，其中第一轻链包含第一轻链可变域和第二轻链恒定域(与第一重链可变域配对)，第二轻链包含第二轻链可变域和人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)(与第二重链可变域配对)，且另一结合物还包含第一轻链。

在一个实施方案中，第一和第四多肽之一从N端至C端方向包含第二重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，第二轻链可变域，第二人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，和源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域；而第一和第四多肽之另一从N端至C端方向包含第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，和源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域。在一个实施方案中，包含含有两个可变域的多肽的结合物还包含第一轻链以及(经结构域交换的)第二轻链，其中第一轻链包含第三轻链可变域和第一轻链恒定域(与第一重链可变域配对)，第二轻链包含第三重链可变域和第二轻链恒定域(与第一轻链可变域配对)，且另一结合物还包含第一轻链。

在一个实施方案中，第一和第二结合物还包含抗体轻链。

在一个实施方案中，

第一结合物包含

-第一多肽，其选自这样的多肽，所述多肽从N至C端方向包含：

xiv)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第三重链可变域，和人IgG1κ或λ轻链恒定域(源自其的轻链恒定域)，或

并包含杵突变或臼突变，

和

-第二多肽，其选自这样的多肽，所述多肽从N至C端方向包含：

SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，

其中i)如果第一多肽的可变域是轻链可变域，则第二多肽的可变域是重链可变域，或ii)如果第一多肽的可变域是重链可变域，则第二多肽的可变域是轻链可变域，

其中如果第一多肽包含臼突变，则该CH3结构域包含杵突变，或如果第一多肽包含杵突变，则该CH3结构域包含臼突变，

且包含第一干扰突变，该突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T，其中第一多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，

其中第一多肽和第二多肽非共价地彼此结合/形成非共价二聚体，(由此，当第二多肽和第一多肽形成异二聚体时，第二多肽中的干扰突变导致去稳定化的相互作用)，

和

-第三多肽，其包含另一轻链可变域和轻链恒定域，

其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，

且

第二结合物包含：

-第四多肽，其选自这样的多肽，所述多肽从N至C端方向包含：

SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，和源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，其中如果第二多肽包含臼突变，则该CH3结构域包含杵突变，或如果第二多肽包含杵突变，则该CH3结构域包含臼突变，

且包含第二干扰突变，该突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T，其中第五多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，其中第四多肽中的干扰突变与第二多肽中的干扰突变在不同的位置上，

和

-第五多肽，其选自这样的多肽，所述多肽从N至C端方向包含：

其中如果第四多肽包含臼突变，则该CH3结构域包含杵突变，或如果第四多肽包含杵突变，则该CH3结构域包含臼突变，

其中i)如果第二多肽的可变域是轻链可变域，则第四多肽的可变域是重链可变域，或ii)如果第二多肽的可变域是重链可变域，则第四多肽的可变域是轻链可变域，

其中第四多肽和第五多肽非共价地彼此结合/形成非共价二聚体，(由此，当第四多肽和第五多肽形成异二聚体时，第四多肽中的干扰突变导致去稳定化的相互作用)

和

-第六多肽，其包含轻链可变域和轻链恒定域，

其中第六多肽通过二硫键与第四多肽共价结合。

在一个实施方案中，孵育步骤在无还原剂的情况下进行。

在一个实施方案中i)第二多肽和第三多肽，或ii)第二多肽和第五多肽还包含(C端)标签。在一个实施方案中，标签具有氨基酸序列HHHHHH(SEQ ID NO:67)或HHHHHHHH(SEQID NO:68)，回收通过在金属(镍)螯合亲和层析柱上层析来进行。

在一个实施方案中，

第一结合物包含

第一多肽，其选自这样的多肽，所述多肽从N至C端方向包含：

并包含杵突变或臼突变，

和

第二多肽，其选自这样的多肽，所述多肽从N至C端方向包含：

且包含第一干扰突变，该突变选自D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E和K439E，其中第一多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，

和

第三多肽，其包含轻链可变域和轻链恒定域，

其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，

且

第二结合物包含

第四多肽，其选自这样的多肽，所述多肽从N至C端方向包含：

SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，

其中如果第二多肽包含臼突变，则该CH3结构域包含杵突变，或如果第二多肽包含杵突变，则该CH3结构域包含臼突变，

且包含第二干扰突变，该突变选自D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E和K439E，其中第五多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，其中第四多肽中的干扰突变与第二多肽中的干扰突变在不同的位置上，

和

第五多肽，其选自这样的多肽，所述多肽从N至C端方向包含：

如果第四多肽包含臼突变，则该多肽包含杵突变，或如果第四多肽包含杵突变，则该多肽包含臼突变，

其中第四多肽和第五多肽非共价地彼此结合/形成非共价二聚体，(其中当第四多肽和第五多肽形成异二聚体时，第四多肽中的干扰突变导致去稳定化的相互作用)，

和

第六多肽，其包含轻链可变域和轻链恒定域，

其中第六多肽通过二硫键与第四多肽共价结合。

本发明的一个方面报告了用于鉴别结合物组合的方法，包括以下步骤：

-对从第一批结合物中选出的第一结合物和从第二批结合物中选出的第二结合物的每种组合实施根据本发明的方法，产生批量结合物，

-以ELISA分析分别测定所生产的批量结合物中每个结合物对至少两个抗原的同时结合(量)，以及

-根据ELISA的结果，从批量结合物中选择结合物，从而鉴别出结合物组合。

本发明的一个方面报告了多聚体多肽，其包含第一多肽和第二多肽

其中两个多肽均包含(从N端至C端方向，彼此直接跟随，可选地在可变域和CH3结构域之间具有肽接头)氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)，抗体可变域和人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域，

其中i)第一多肽的CH3结构域包含杵突变，且第二多肽的CH3结构域包含臼突变，或ii)第一多肽的CH3结构域包含臼突变，且第二多肽的CH3结构域包含杵突变，

其中第二多肽在CH3结构域中包含至少一个干扰突变(选自如下突变：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T)，其中第一多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，

其中第一多肽和第二多肽非共价地彼此结合/形成非共价二聚体，(其中当第二多肽和第一多肽形成异二聚体时，第二多肽中的干扰突变导致去稳定化的相互作用)，

第一多肽的可变域和第二多肽的可变域形成功能或非功能(不能结合抗原的)可变域对。

在一个实施方案中，第一多肽选自这样的多肽，其以N至C端方向包含：

(并包含杵突变或臼突变)

且

第二多肽选自这样的多肽，其以N至C端方向包含：

SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，包含杵突变或臼突变的源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，

且包含干扰突变，所述突变选自：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T，其中第一多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)。

在一个实施方案中，多聚体多肽还包含第三多肽，该多肽包含(另外的)轻链可变域和轻链恒定域，其中第三多肽通过二硫键与第一多肽(的CH1结构域)共价结合。

本发明的一个方面报告了组合物，所述组合物包含

第一异三聚体多肽，其包含

-第一多肽，其选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

(包含杵突变或臼突变)

和

SEQ ID NO:66的铰链区，重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，

且包含干扰突变，该突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T，其中第一多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，

和

-第三多肽，其是包含另一轻链可变域和轻链恒定域的多肽，其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合

以及

第二异三聚体多肽，其包含

-第一(第四)多肽，其选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，和源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，

其中如果第一异三聚体多肽的第二多肽包含臼突变，则该CH3结构域包含杵突变，或如果第一异三聚体多肽的第二多肽包含杵突变，则该CH3结构域包含臼突变，

且包含第二干扰突变，该突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T，其中第二(第五)多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，其中第一(第四)多肽中的干扰突变与第一异三聚体的第二多肽中的干扰突变在不同的位置上，

和

-第二(第五)多肽，其选自这样的多肽，所述多肽从N至C端方向包含：

如果第一(第四)多肽包含臼突变，则该多肽包含杵突变，或如果第一(第四)多肽包含杵突变，则该多肽包含臼突变，

其中i)如果第二多肽的可变域是轻链可变域，则第五多肽的可变域是重链可变域，或ii)如果第二多肽的可变域是重链可变域，则第五多肽的可变域是轻链可变域，

和

-第三(第六)多肽，其是包含轻链可变域和轻链恒定域的多肽，其中第六多肽通过二硫键与第一(第四)多肽共价结合，

其中i)第一异三聚体的第一多肽的CH3结构域包含杵突变，第一异三聚体的第二多肽的CH3结构域包含臼突变，或ii)第一异三聚体的第一多肽的CH3结构域包含臼突变，第一异三聚体的第二多肽的CH3结构域包含杵突变，其中i)如果第一异三聚体的第一多肽包含臼突变，则第二异三聚体的第二(第五)多肽包含杵突变，或ii)如果第一异三聚体的第一多肽包含杵突变，则第二异三聚体的第二(第五)多肽包含臼突变，

其中第一异三聚体的第二多肽和第二异三聚体的第一多肽(第四多肽)不在相同的位置上包含干扰突变/在不同的位置包含干扰突变，

其中第一多肽的可变域和第五多肽的可变域形成功能(能结合抗原的)结合位点(抗体可变域对(VH/VL对))，第二多肽的可变域和第四多肽的可变域形成非功能(不能结合抗原的)可变域对。

其中两个多肽都包含人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域，

其中第一多肽和第二多肽非共价地或共价地彼此结合/形成非共价或共价二聚体，(由此，当第二多肽和第一多肽形成异二聚体时，第二多肽中的干扰突变导致去稳定化的相互作用)。

i)重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，

ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，重链可变域，和人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，

iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，和重链可变域，

iv)第一重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二重链可变域，和第二人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，

v)第一重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，和第二重链可变域，

vi)重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，和scFv，

vii)重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，和scFab，

viii)重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，和轻链可变域，

ix)重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，轻链可变域，和第二人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，

x)第一重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二重链可变域，和人IgG1κ或λ轻链恒定域(源自其的轻链恒定域)，

xi)第一重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人IgG1κ或λ轻链恒定域(源自其的轻链恒定域)，和第二重链可变域，或

xii)结合结构域的第一部分，可选地第一肽接头，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地第二肽接头，和结合结构域的第二部分，其中(相同多肽的)结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分(结合并)形成与靶标特异结合的功能结合位点；在一个实施方案中，结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)，而结合结构域的第二部分是轻链Fab片段(VL-CL或CL-VL)，或反之亦然，

并包含杵突变或臼突变，

且

第二多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，包含杵突变或臼突变的源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，

在一个实施方案中，多聚体多肽还包含第三多肽，该多肽包含轻链可变域和轻链恒定域，通过二硫键与第一多肽共价结合。

本发明的一个方面报告了组合物，所述组合物包含

第一异三聚体多肽，其包含

iv)第一重链可变域，第一源自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二重链可变域，和第二源自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域，

v)第一重链可变域，第一源自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二源自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域，和第二重链可变域，

xi)第一重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人IgG1κ或λ轻链恒定域(源自其的轻链恒定域)，和第二重链可变域，以及

并包含杵突变或臼突变，

和

-第二多肽，其选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，

如果第一多肽包含臼突变，则该多肽包含杵突变，或如果第一多肽包含杵突变，则该多肽包含臼突变，

且包含干扰突变，所述突变选自：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T，其中第一多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，

和

-第三多肽，其是包含轻链可变域和轻链恒定域的多肽，通过二硫键与第一多肽共价结合，

以及

第二异三聚体多肽，其包含

SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和源自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，

如果第一异三聚体的第二多肽包含臼突变，则该多肽包含杵突变，或如果第一异三聚体的第二多肽包含杵突变，则该多肽包含臼突变，

包含第二干扰突变，该突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T，其中第二(第五)多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，其中第一(第四)多肽中的干扰突变与第一异三聚体的第二多肽中的干扰突变在不同的位置上，

和

-第三(第六)多肽，其是包含轻链可变域和轻链恒定域的多肽，通过二硫键与第一(第四)多肽共价结合，

其中i)第一异三聚体的第一多肽的CH3结构域包含杵突变，第一异三聚体的第二多肽的CH3结构域包含臼突变，或ii)第一异三聚体的第一多肽的CH3结构域包含臼突变，第一异三聚体的第二多肽的CH3结构域包含杵突变，其中i)如果第一异三聚体的第一多肽包含臼突变，则第二异三聚体的第二多肽(第五多肽)包含杵突变，或ii)如果第一异三聚体的第一多肽包含杵突变，则第二异三聚体的第二多肽(第五多肽)包含臼突变，

其中第一异三聚体的第二多肽和第二异三聚体的第一多肽(第四多肽)不在相同的位置上包含干扰突变/在不同的位置包含干扰突变。

本发明的一个方面报告了药物制剂，其包含无重链-重链间二硫键的2/3-IgG，或包含无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab，或包含组合物，该组合物包含两个不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两个不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab，如本文所述，通过混合这样的2/3-IgG(s)或2/3-BiFab(s)来制备。

本发明的一个方面报告了无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab或包含两个不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两个不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物用作药物。

本发明的一个方面报告了无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab或包含两个不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两个不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物在生产或制备药物中的用途。

本发明的一个方面报告了用于治疗疾病的方法，所述方法包括给患病个体施用有效量的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab或包含两个不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两个不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物。

在一个实施方案中，该组合物包含第一异三聚体多肽，其包含第一、第二和第三单体多肽，以及第二异三聚体多肽，其包含第四、第五和第六单体多肽(即每个异三聚体多肽由三个(不相同的)单体多肽组成(共包含六个(不相同的)单体多肽(即，不相同的第一，第二，第三，第四，第五和第六单体多肽)))，

其中第一、第二、第四和第五(单体)多肽每个包含(从N端至C端方向)(i)氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)，(ii)第一抗体可变域，和(iii)人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域，其中(i)、(ii)和(iii)各自独立地直接或通过肽接头彼此连接，

其中i)第一和第二(单体)多肽、ii)第一和第五(单体)多肽、iii)第二和第四(单体)多肽以及iv)第五和第四(单体)多肽的第一抗体可变域是VH/VL对(即，第一(单体)多肽的第一可变域是重链可变域或轻链可变域，由此，如果它是重链可变域，则第二和第五(单体)多肽的第一可变域是轻链可变域，或如果它是轻链可变域，则第二和第五(单体)多肽的第一可变域是重链可变域，以及如果第五(单体)多肽的第一可变域是重链可变域，则第四(单体)多肽的第一可变域是轻链可变域，或如果第五(单体)多肽的第一可变域是轻链可变域，则第四(单体)多肽的第一可变域是重链可变域)，

其中i)第一和第五(单体)多肽、ii)第一和第二(单体)多肽、iii)第二和第四(单体)多肽以及iv)第五和第四(单体)多肽的CH3结构域包含杵-臼突变对(即，第一(单体)多肽的CH3结构域包含杵突变或臼突变，其中如果它包含杵突变，则第二和第五(单体)多肽的CH3结构域包含臼突变，或如果它包含臼突变，则第二和第五(单体)多肽的CH3结构域包含杵突变，以及如果第五(单体)多肽的CH3结构域包含臼突变，则第四(单体)多肽的CH3结构域包含杵突变，或如果第五(单体)多肽的CH3结构域包含杵突变，则第四(单体)多肽的CH3结构域包含臼突变)，

其中第一(单体)多肽和第五(单体)多肽各自彼此独立地在N端和C端之一或两者上彼此独立地包含scFv或scFab或Fab，

其中第二和第四(单体)多肽在CH3结构域中包含至少一个干扰突变(所述突变选自如下突变：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T)，其中第一(单体)多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与第二(单体)多肽的干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，其中第五(单体)多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与第四(单体)多肽的干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，其中第二(单体)多肽的干扰突变和第四(单体)多肽的干扰突变在不同位置上，其中当第二多肽与第四多肽形成异二聚体时，第二(单体)多肽的干扰突变和第四(单体)多肽的干扰突变导致吸引性(电荷)相互作用，其中当第二(单体)多肽与第一(单体)多肽形成异二聚体、第四(单体)多肽与第五(单体)多肽形成异二聚体时，第二多肽和第四(单体)多肽中的干扰突变分别导致排斥性(电荷)相互作用，

其中第一和第二(单体)多肽形成非共价二聚体，第四和第五(单体)多肽形成非共价二聚体，第三和第一(单体)多肽形成二硫键连接的二聚体，以及第六和第五(单体)多肽形成二硫键连接的二聚体，

其中第三和第六(单体)多肽是抗体轻链。

在一个实施方案中，第一(单体)多肽选自这样的多肽，其从N至C端方向包含：

xv)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域(源自其的CH1结构域)，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人IgG1κ或λ轻链恒定域(源自其的轻链恒定域)，和第三重链可变域。

在一个实施方案中，第二(单体)多肽选自这样的多肽，其从N至C端方向包含：

包含干扰突变，该突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T，其中第一多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，

和

第三多肽，其是包含另一轻链可变域和轻链恒定域的多肽，其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合。

在一个实施方案中，第四(单体)多肽选自这样的多肽，其从N至C端方向包含：

其中如果第一异三聚体的第二多肽包含臼突变，则该CH3结构域包含杵突变，或如果第一异三聚体的第二多肽包含杵突变，则该CH3结构域包含臼突变，

包含第二干扰突变，该突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T，其中第二(第五)多肽的氨基酸序列，在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，其中第一(第四)多肽中的干扰突变与第一异三聚体的第二多肽中的干扰突变在不同的位置上。

在一个实施方案中，第五(单体)多肽选自这样的多肽，其从N至C端方向包含：

其中i)如果第二多肽的可变域是轻链可变域，则第五的多肽可变域是重链可变域，或ii)如果第二多肽的可变域是重链可变域，则第五多肽的可变域是轻链可变域。

在一个实施方案中，第一多肽的可变域和第五多肽的可变域形成功能(能结合抗原的)结合位点(抗体可变域对(VH/VL对))，第二多肽的可变域和第四多肽的可变域形成非功能(不能结合抗原的)可变域对。

本发明的一个方面是(分离的)非共价复合物/多聚体多肽，其包含

-第一多肽，其包含

i)从N端至C端方向，a)选自特异地与第一靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域的第一抗体可变域，和b)第一人免疫球蛋白G CH3结构域，

和

ii)特异地与第二靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，位于第一抗体可变域的N端或第一CH3结构的C端，

-第二多肽，其包含

i)从N端至C端方向，a)选自特异地与第三靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域的第二抗体可变域，和b)第二人免疫球蛋白G CH3结构域，

其中如果第一抗体可变域是抗体重链可变域，则第二抗体可变域是抗体轻链可变域，或如果第一抗体可变域是抗体轻链可变域，则第二抗体可变域是抗体重链可变域，

以及

其中第二CH3结构域包含干扰突变，所述突变选自D356K、E357K、K370E和K439E，其中第一CH3结构域包含

a)第439位的氨基酸残基K，如果干扰突变是D356K，或

b)第370位的氨基酸残基K，如果干扰突变是E357K，或

c)第357位的氨基酸残基E，如果干扰突变是K370E，或

d)第356位的氨基酸残基D，如果干扰突变是K439E，

和

ii)可选地，特异地与第二靶标或第四靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，位于第二抗体可变域的N端或第二CH3结构域C端，该位置独立于第一多肽的所述可变域对的位置，

其中所有编号均根据Kabat EU索引进行。

在所有方面的一个实施方案中，第一CH3结构域和第二CH3结构域包含本发明公开的氨基酸序列突变以促进异二聚体形成，即如本发明下文章节D)异二聚体化中概述。

在所有方面的一个实施方案中，第一CH3结构域和第二CH3结构域包含另外的突变，以促进所述第一CH3结构域和所述第二CH3结构域之间异二聚体的形成，所述突变不同于干扰突变。

在所有方面的一个实施方案中，

第一CH3结构域包含

a)T366W突变，或

b)T366S/L368A/Y407V突变，

以及

第二CH3结构域包含

a)T366S/L368A/Y407V突变，如果第一CH3结构域包含T366W突变，或

b)T366W突变，如果第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变。

-第一多肽，其包含

其中第一CH3结构域包含

a)T366W突变，或T366S/L368A/Y407V突变，和

b)可选地Y349C或S354C突变，

和

-第二多肽，其包含

且

其中第二CH3结构域包含

a)T366S/L368A/Y407V突变，如果第一CH3结构域包含T366W突变，或

b)T366W突变，如果第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变，

且

a)第439位的氨基酸残基K，如果干扰突变是D356K，或

b)第470位的氨基酸残基K，如果干扰突变是E357K，或

c)第357位的氨基酸残基E，如果干扰突变是K370E，或

d)第356位的氨基酸残基D，如果干扰突变是K439E，

和

其中，所有编号均根据Kabat EU索引进行。

-第一多肽，其包含

i)从N端至C端方向，a)第一人免疫球蛋白G CH3结构域，和b)选自特异地与第一靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域的第一抗体可变域，

和

ii)特异地与第二靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，位于第一抗体CH3结构域的N端或第一抗体可变域的C端，

-第二多肽，其包含

i)从N端至C端方向，a)第二人免疫球蛋白G CH3结构域，和b)选自特异地与第三靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域的第二抗体可变域，

且

其中第二CH3结构域包含干扰突变，所述突变选自D356K、E357K、K370E和K439E，由此第一CH3结构域包含

a)第439位的氨基酸残基K，如果干扰突变是D356K，或

b)第470位的氨基酸残基K，如果干扰突变是E357K，或

c)第357位的氨基酸残基E，如果干扰突变是K370E，或

d)第356位的氨基酸残基D，如果干扰突变是K439E，

和

ii)可选地，特异地与第二靶标或第四靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，位于第二CH3结构域的N端或第二可变域的C端，该位置独立于第一多肽的所述可变域对的位置，

其中，所有编号均根据Kabat EU索引进行。

在所有方面的一个实施方案中，

第一CH3结构域包含

a)T366W突变，或

b)T366S/L368A/Y407V突变，

以及

第二CH3结构域包含

a)T366S/L368A/Y407V突变，如果第一CH3结构域包含T366W突变，或

b)T366W突变，如果第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变。

-第一多肽，其包含

其中第一CH3结构域包含

a)T366W突变，或T366S/L368A/Y407V突变，和

b)可选地Y349C或S354C突变，

和

-第二多肽，其包含

以及

其中第二CH3结构域包含

a)T366S/L368A/Y407V突变，如果第一CH3结构域包含T366W突变，或

b)T366W突变，如果第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变，

以及

a)第439位的氨基酸残基K，如果干扰突变是D356K，或

b)第470位的氨基酸残基K，如果干扰突变是E357K，或

c)第357位的氨基酸残基E，如果干扰突变是K370E，或

d)第356位的氨基酸残基D，如果干扰突变是K439E，

和

其中，所有编号均根据Kabat EU索引进行。

在根据本发明所有方面的一个实施方案中，第一多肽和第二多肽是非共价二聚体。

在根据本发明所有方面的一个实施方案中，第一可变域和第二可变域结合/结合并形成非功能结合位点。

在根据本发明所有方面的一个实施方案中，第一和第二多肽分别在第一和第二可变域的N端(如果第一CH3结构域位于第一可变域的C端)，或分别在第一和第二CH3结构域的N端(如果第一可变域位于第一和第二CH3结构域的C端)，包含氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQID NO:66)或DKTHT(SEQ ID NO:94)或GGGS(SEQ ID NO:69)或DKTHGGGGS(SEQ ID NO:97)。

在根据本发明所有方面的一个实施方案中，人免疫球蛋白G是人IgG1或人IgG2或人IgG3或人IgG4。在根据本发明所有方面的一个实施方案中，人免疫球蛋白G是人IgG1。

在根据本发明所有方面的一个实施方案中，人免疫球蛋白G CH3结构域是人IgG1CH3结构域或人IgG2 CH3结构域或人IgG3 CH3结构域或人IgG4 CH3结构域。

在根据本发明所有方面的一个实施方案中

i)第一CH3结构域包含T366W突变和第439位的氨基酸残基K，

以及第二CH3结构域包含D356K干扰突变和T366S/L368A/Y407V突变，或

ii)第一CH3结构域包含T366W突变和第370位的氨基酸残基K，

以及第二CH3结构域包含E357K干扰突变和T366S/L368A/Y407V突变，或

iii)第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变和第357位的氨基酸残基E，

以及第二CH3结构域包含K370E干扰突变和T366W突变，或

iv)第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变和第356位的氨基酸残基D，

以及第二CH3结构域包含K439E干扰突变和T366W突变。

在根据本发明所有方面的一个实施方案中，第一、第二和第三靶标是不同的。

在根据本发明所有方面的一个实施方案中，第一靶标或第三靶标是人CD3。

在根据本发明所有方面的一个实施方案中，与第二靶标特异性结合的抗体轻链可变域和抗体重链可变域对选自：Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、CrossFab、双特异性Fab、sdAb和VHH。

在根据本发明所有方面的一个实施方案中，与第四靶标特异性结合的抗体轻链可变域和抗体重链可变域对，独立于与第二靶标特异性结合的抗体轻链可变域和抗体重链可变域对，选自Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、CrossFab、双特异性Fab、sdAb和VHH。

在本发明所有方面的一个实施方案中，第一多肽从N端至C端方向包含：

抗体重链可变域或抗体轻链可变域，

人免疫球蛋白G CH1结构域或人抗体轻链恒定域，

可选地，另一抗体重链可变域或抗体轻链可变域，和另一人免疫球蛋白G CH1结构域或人抗体轻链恒定域，

SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:97的氨基酸序列，

第一抗体可变域，

可选地，人免疫球蛋白G CH2结构域，

第一人免疫球蛋白G CH3结构域，

可选地，SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76或SEQ IDNO:79的氨基酸序列，

可选地，Fab或经结构域交换的Fab或scFv或scFab。

抗体重链可变域或抗体轻链可变域，

人免疫球蛋白G CH1结构域或人抗体轻链恒定域，

可选地，人免疫球蛋白G CH2结构域，

第一人免疫球蛋白G CH3结构域，

第一抗体可变域，

可选地，Fab或经结构域交换的Fab或scFv或scFab。

本发明的一个方面为组合物，所述组合物包含根据本发明的第一多聚体多肽和根据本发明的第二多聚体多肽，其中

第一多聚体多肽的第二CH3结构域包含D356K突变，第二多聚体多肽的第二CH3结构域包含K439E突变，

或

第一多聚体多肽的第二CH3结构域包含E357K突变，第二多聚体多肽的第二CH3结构域包含K370E突变，

以及

第一多聚体多肽的第一抗体可变域和第二多聚体多肽的第一可变域是与第一靶标特异性结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，

和

第一多聚体多肽的第二抗体可变域和第二多聚体多肽的第二可变域是与第三靶标特异性结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，

以及

第二和第四靶标彼此独立地是细胞表面抗原。

在所有组合物方面的一个实施方案中，第一多聚体多肽的第一CH3结构域和第二多聚体多肽的第二CH3结构域包含相同的突变以促进异二聚体形成，且第一多聚体多肽的第二CH3结构域和第二多聚体多肽的第一CH3结构域包含相同的突变以促进异二聚体形成。

在所有组合物方面的一个实施方案中，

第一多肽的第一CH3结构域包含

a)T366W突变，或

b)T366S/L368A/Y407V突变，

以及

第一多肽的第二CH3结构域包含

a)T366S/L368A/Y407V突变，如果第一CH3结构域包含T366W突变，或

b)T366W突变，如果第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变。

根据本发明的一个方面为(药物)组合物，所述组合物包含根据本发明的第一多聚体多肽和根据本发明的第二多聚体多肽，

其中

第一多聚体多肽的第一CH3结构域和第二多聚体多肽的第二CH3结构域都包含T366W突变或T366S/L368A/Y407V突变，

以及

其中第一多聚体多肽的第二CH3结构域包含D356K突变，第二多聚体多肽的第二CH3结构域包含K439E突变，或反之亦然，

或

第一多聚体多肽的第二CH3结构域包含E357K突变，第二多聚体多肽的第二CH3结构域包含K370E突变，或反之亦然，

以及

可选地，其中

如果第一多聚体多肽的第一抗体可变域为抗体重链可变域，则第二多聚体多肽的第一抗体可变域为抗体轻链可变域

或

如果第一多聚体多肽的第一抗体可变域为抗体轻链可变域，则第二多聚体多肽的第一抗体可变域为抗体重链可变域，

以及

其中

和

以及

其中第二和第四靶标彼此独立地是细胞表面抗原。

本发明的一个方面是根据本发明的多聚体多肽或(药物)组合物用作药物。

本发明报告的一个方面是治疗方法，所述方法包括对需要该治疗的个体施用根据本发明的多聚体多肽或(药物)组合物。

发明详述

本发明至少部分基于以下发现：多特异性抗体可以通过半抗体交换反应获得，其中作为起始物使用非完全抗体，例如2/3-IgGs或2/3-BiFabs，其包含抗体轻链、抗体重链和抗体重链片段，其中重链-重链间相互作用被非对称干扰突变去稳定化，所述干扰突变优选在重链片段中，其中干扰突变一方面促进起始非完全抗体的解离，另一方面促进正确组装的全长双/多特异性抗体的产生。进一步发现，如果将起始非完全抗体中重链-重链间二硫键去除，则使用这种起始化合物，甚至可以在没有还原剂的情况下执行本发明的方法(起始物的生成以及交换反应和多特异性抗体的产生仍然有效)。

更具体地说，本发明至少部分基于以下发现：可以利用非完全(即非双特异性结合的)抗体作为起始物，通过半抗体交换反应，组合地获得多特异性抗体以及结合位点的细胞上活化。起始分子各自包含相互结合并形成二聚体/多聚体的一对抗体CH3结构域、不形成功能结合位点的一对抗体重链可变域和抗体轻链可变域、以及至少一个用于体内细胞表面靶向的功能结合位点。因此，所述CH3结构域对可以是较大分子(例如一对抗体重链、一对融合多肽等)的一部分。具有本文所述修饰的该CH3结构域对定义了本发明交换反应所需的最小结构元素。在不完全的起始抗体中，这些CH3结构域仍然相互结合(导致形成二聚体或多聚体)，但通过仅在所述CH3结构域之一中存在的不对称干扰(电荷)突变，所述CH3结构域对之间的吸引力可以被减小，即去稳定化。相应的另一CH3结构域在如下位置上仍具有野生型残基，其中所述位置是在结合的野生型CH3结构域对中与所述的突变位置相互作用的位置。所述干扰突变，只有在第二/另一个能更好匹配互补的非完全抗体存在时，才促进起始不完全抗体的解离和促进产生正确组装的完全双特异性抗体。研究发现，去稳定化的起始物可从细胞培养上清中被分离出来，尽管i)CH3结构域之间存在去稳定化的突变；和ii)组成起始非完全双特异性抗体的多肽的两个CH3结构域之间不存在二硫键。

本发明至少部分基于进一步的发现：通过使用上述起始化合物，在没有还原剂的情况下，即能够在体内，发生交换反应和形成完全和功能性的双特异性抗体。也就是说，起始分子多肽中含有的CH3结构域之间不需要二硫键。因此，可以从起始非完全抗体中去除铰链区二硫键以及其它重链-重链间二硫键。

I.定义

如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所述的Kabat编号系统编号，并在此称为“根据Kabat编号”。具体来说，Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版，Public Health Service，National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号系统(参见647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定域CL，而Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链域(CH1，铰链，CH2和CH3，在此情况下，在本文中这通过提及“根据Kabat EU索引编号”来进一步澄清)。

抗体重链中的CH3结构域可以通过“knob-into-holes”(杵入臼)技术改变，该技术在例如WO 96/027011；Ridgway,J.B.等,Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant，A.M.等，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中通过几个实例详细描述。在此方法中，两个CH3结构域的相互作用表面被改动，以增加这两个CH3结构域以及包含它们的多肽的异二聚体化。(两条重链的)两个CH3结构域中的一个可以是“杵”，而另一个是“臼”。引入二硫桥可以进一步稳定该异二聚体(Merchant,A.M.等,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell，S.等,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产量。但这不存在于本发明的分子中。

(抗体重链的)CH3结构域中的T366W突变表示为“杵突变”或“突变杵”，(抗体重链的)CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变表示为“臼突变”或“突变臼”(根据Kabat EU索引进行编号)。还可以利用CH3结构域之间另外的链间二硫桥(Merchant,A.M.等，NatureBiotech.16(1998)677-681)，例如通过将S354C突变引入带有“杵突变”的重链CH3结构域中(表示为杵-cys突变”或“突变杵-cys”)，并将Y349C突变引入带有“臼突变”的重链CH3结构域(表示为“臼-cys突变”或“突变臼-cys”)(根据Kabat EU索引进行编号)。但这不存在于本发明的分子中。

Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中给出了关于人免疫球蛋白轻链和重链核苷酸序列的一般信息。

可以用于实施本发明的有用方法和技术描述于例如Ausubel,F.M.(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,第I至III卷(1997)；Glover,N.D.,和Hames,B.D.,编辑,DNA Cloning:A Practical Approach,第I和II卷(1985),牛津大学出版社；Freshney,R.I.(编辑),Animal Cell Culture–a practical approach,IRL出版社(1986)；Watson,J.D.等,Recombinant DNA,第二版,CHSL出版社(1992)；Winnacker,E.L.,FromGenes to Clones；N.Y.,VCH出版社(1987)；Celis,J.,编辑,Cell Biology,SecondEdition,Academic出版社(1998)；Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manualof Basic Technique,第2版,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)中。

使用重组DNA技术可以产生核酸的衍生物。可以例如通过替换、改变、交换、缺失或插入，在单个或几个核苷酸位置上对这种衍生物进行修饰。该修饰或衍生化可以例如，利用定点诱变手段进行。本领域技术人员可以很容易地实施这些修饰(参见例如，Sambrook，J.等，Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor Laboratory出版社,纽约,美国；Hames,B.D.,和Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization–apractical approach(1985)IRL出版社,牛津,英国)。

必须指出，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“a”、“a”和“the”(一或一个或该)包括对复数形式的提及，除非上下文明确另有所指。因此，例如，提及“细胞”时，包括对多个这样的细胞及本领域技术人员所熟知的其等同物的提及，等等。此外，术语“a”(或“an”)，“一个或多个”和“至少一个”可以在本文中互换使用。还应指出的是，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。

术语“MHCFcRP”表示突变的重链Fc区多肽，其至少包含免疫球蛋白恒定域3(CH3)，所述CH3包含杵突变或臼突变和至少一个干扰(即去稳定化的)突变，该干扰突变引入一个(即单个和/或额外的)相对于野生型序列而言排斥性的电荷。也就是说，当MHCFcRP与包含第二CH3结构域的多肽配对时，第二CH3结构域在其氨基酸序列中在(野生型免疫球蛋白中)与该干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基。在一个实施方案中，干扰突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T突变(根据Kabat EU索引进行编号)。在一个优选实施方案中，干扰突变选自D356K、E357K、K370E和K439E突变。

术语“BiFab”表示由两对V₁-C₁/V₂-C₂组成的分子，其中V表示抗体可变域，C表示抗体恒定域，它们彼此结合。例如，所述对可以是VH₁-CH1/VL₁-CL和VH₂-CH3₁/VL₂-CH3₂。同样，“TriFab”表示包含三对V₁-C₁/V₂-C₂的分子，其中V表示抗体可变域，C表示抗体恒定域，它们彼此结合。例如，所述对可以是VH₁-CH1/VL₁-CL、VH₂-CH1/VL₂-CL和VH₃-CH3₁/VL₃-CH3₂。

术语“大约”表示后随的数值的+/-20％的范围。在一个实施方案中，术语“大约”表示后随数值的+/-10％的范围。在一个实施方案中，术语“大约”表示后随数值的+/-5％的范围。

术语“氨基酸替换”或“氨基酸突变”表示，预定亲本氨基酸序列中至少一个氨基酸残基用不同的“置换”氨基酸残基替换。置换残基(一个或多个)可以是“天然存在的氨基酸残基”(即，由遗传密码编码)，可选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile):亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸Val)。在一个实施方案中，置换残基不是半胱氨酸。以一个或多个非天然存在的氨基酸残基进行的替换也涵盖在本文中氨基酸替换的定义中。“非天然存在的氨基酸残基”表示上述天然存在的氨基酸残基之外的残基，其能够在多肽链中与相邻的氨基酸残基共价结合。非天然存在的氨基酸残基的例子包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸、aib和其它氨基酸残基类似物，如Ellman等，Meth.Enzym.202(1991)301-336中描述的。可以使用Noren等(Science 244(1989)182)和/或Ellman等(同上)中的程序产生这些非天然存在的氨基酸残基。简言之，这些程序涉及用非天然存在的氨基酸残基化学激活阻抑型tRNA，然后进行RNA的体外转录和翻译。非天然存在的氨基酸也可以通过化学肽合成来掺入肽中，随后将这些肽与重组产生的多肽(如抗体或抗体片段)融合。

术语“抗体依赖性细胞毒性(ADCC)”是由Fc受体结合介导的功能，是指在效应细胞存在的情况下由抗体Fc区介导的靶细胞裂解。在一个实施方案中，通过如下方式测定ADCC：在效应细胞例如新鲜分离的PBMC(外周血液单个核细胞)或从血沉棕黄层纯化的效应细胞如单核细胞或NK(自然杀伤)细胞存在的情况下，以本文中报告的包含Fc区的多肽处理表达靶标的红细胞(例如表达重组靶标的K562细胞)制备物。以Cr-51标记靶细胞，随后与本文报告的多肽孵育。将标记的细胞与效应细胞孵育，并分析上清液中释放的Cr-51。对照包括用效应细胞但无本文所报告的多肽孵育的靶内皮细胞。通过测定与表达Fcγ受体的细胞，例如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA的细胞或NK细胞(基本上表达FcγRIIIA)的结合，调查多肽诱导介导ADCC的初始步骤的能力。在一个优选实施方案中，测定与NK细胞上FcγR的结合。

术语“CH1结构域”表示抗体重链多肽的部分，该部分大约自EU 118位延伸至EU215位(EU编号系统)。在一个实施方案中，CH1结构域包含氨基酸序列ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSC(SEQ ID NO:27)。

术语“CH2结构域”表示抗体重链多肽的部分，该部分大约自EU 231位延伸至EU340位(根据Kabat的EU编号系统)。在一个实施方案中，CH2结构域包含氨基酸序列APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRWSVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK(SEQ ID NO:28)。CH2结构域是独特的，因为它不与另一结构域紧密配对。相反，两个N连接的分支糖链被间插在完整天然Fc区的两个CH2结构域之间。据推测，所述糖可提供对结构域-结构域配对的替代，有助于稳定CH2结构域。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。

术语“CH3结构域”表示抗体重链多肽的部分，该部分大约自EU 341位延伸至EU446位。在一个实施方案中，CH3结构域包含氨基酸序列GQPREPQVYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSP(SEQ ID NO:29)。

术语“包含”也包括“由……组成”。

术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”是指在补体存在的情况下，由本文报告的抗体的Fc区引起的细胞裂解。在一个实施方案中，通过在补体存在的情况下，用本文报告的多肽处理表达靶标的人内皮细胞来测定CDC。在一个实施方案中，用钙荧光素标记细胞。如果多肽在30微克/毫升的浓度下诱导20％或更多的靶细胞裂解，则存在CDC。可以在ELISA中测定与补体因子C1q的结合。在此类测定中，原则上，将一定浓度范围的多肽涂在ELISA板上，并加入纯化的人C1q或人血清。用抗C1q的抗体随后过氧化物酶标记的缀合物，检测C1q结合。结合的检测(最大结合Bmax)测量为采用过氧化物酶底物

(2,2′-联氮基-双-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸])时在405nm的光密度(OD405)。

如本文所用，“治疗”(及其语法变异，“treat”或“treating”或“treatment”)是指，试图改变被治疗个体的自然过程的临床干预，可以用于预防或用于临床病理学过程中。治疗的期望效果包括但不限于：预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病发展的速度、改善或缓解疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本文报告的抗体用于延迟疾病的发生或减缓疾病的进展。

“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的生物学活性，这些生物学活性随Fc区源自的抗体类别而变化。抗体效应子功能的示例包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(如B细胞受体)；和B细胞激活。

Fc受体结合依赖的效应子功能可由抗体的Fc区与Fc受体(FcRs)的相互作用来介导，Fc受体是造血细胞上专化的细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并已被证明介导：通过免疫复合物的吞噬作用去除抗体包被的病原体，以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)裂解红细胞和各种其它细胞靶标(例如肿瘤细胞)(呈递Fc区的)(参见例如Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。通过其对免疫球蛋白同种型的特异性定义FcRs：针对IgG型Fc区的Fc受体称为FcγR。Fc受体结合描述于，例如，Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等,Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas，M.等，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；Gessner,J.E.等,Ann.Hematol.76(1998)231-248中。

IgG型抗体Fc区的受体(FcγR)的交联可以触发广泛多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性，和炎症介质的释放，以及免疫复合物的清除和抗体产生的调节。在人类中，有三类FcγR已经被表征，它们是：

-FcγRI(CD64)，以高亲和力结合单体IgG，在巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。在Fc区IgG中对氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329(根据Kabat的EU索引进行编号)的至少一个的修饰可以降低与FcγRI的结合。将233-236位的IgG2残基替换为IgG1和IgG4，减少对FcγRI的结合10³倍，并消除人单核细胞对抗体敏化的红细胞的反应(Armour,K.L.等,Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。

-FcγRII(CD32)，以中至低亲和力结合复合的IgG，并广泛表达。该受体可以分为两个亚型，FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA存在于许多参与杀伤的细胞(如巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞)上，似乎能够激活杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中发挥作用，在B细胞、巨噬细胞、肥大细胞和嗜酸性细胞上存在。在B细胞上，它似乎起抑制进一步免疫球蛋白产生和同种型转换(例如至IgE类)的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB抑制FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性细胞和肥大细胞上，B型可以帮助抑制由IgE结合到其受体上引起的这些细胞的活化。发现FcγRIIA对例如包含如下IgG Fc区的抗体的结合降低，所述IgG Fc区在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414(根据Kabat的EU索引进行编号)中的至少一个上具有突变。

-FcγRIII(CD16)，以中至低亲和力结合IgG，并存在两种类型。FcγRIIIA在NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞和一些单核细胞以及T细胞上存在，并介导ADCC。FcγRIIIB在嗜中性粒细胞上高度表达。发现，FcγRIIIA对例如包含如下IgG Fc区的抗体的结合降低，所述IgG Fc区在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376(根据Kabat的EU索引进行编号)中的至少一个上具有突变。

人IgG1上的Fc受体结合位点的定位、上述突变位点和用于测定与FcγRI和FcγRIIA结合的方法，描述于Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604中。

术语“铰链区”表示抗体重链多肽的部分，该部分在野生型抗体重链中连接CH1结构域和CH2结构域，例如从约221至约230位(根据Kabat的EU编号系统)，或从约226至约230位(根据Kabat的EU编号系统)。其它IgG亚类的铰链区可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基进行比对来确定。

铰链区通常是由氨基酸序列相同的两个多肽组成的二聚体分子。铰链区通常具有氨基酸序列DKTHTCPXCP(SEQ ID NO:30)，其中X为S或P；或HTCPXCP(SEQ ID NO:31)，其中X为S或P；或CPXCP(SEQ ID NO:32)，其中X为S或P。

在一个实施方案中，铰链区没有内部二硫键。这可以通过在SEQ ID NO:32(以及同样地在SEQ ID NO:30和31)的序列中以丝氨酸残基替换半胱氨酸残基，或通过从SEQ IDNO:30，31或32的铰链区中缺失CPXC片段(SEQ ID NO:95)来实现。

术语“肽接头”表示天然和/或合成来源的接头。肽接头由氨基酸的线性链组成，其中20种天然氨基酸是单体构造块，它们通过肽键相连。链的长度为1至50个氨基酸残基，优选1至28个氨基酸残基，特别优选3至25个氨基酸残基。肽接头可以含有重复氨基酸序列或天然多肽的序列。肽接头通过允许结构域正确折叠和正确呈现，具有确保融合多肽的结构域能够执行其生物学活性的功能。优选地，肽接头是“合成的肽接头”，被指定为富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。这些残基按例如多达5个氨基酸的小重复单元的方式排列，例如GGGS(SEQ ID NO:69)、GGGGS(SEQ ID NO:70)、QQQG(SEQ ID NO:71)、QQQQG(SEQ IDNO:72)、SSSG(SEQ ID NO:73)或SSSSG(SEQ ID NO:74)。这种小重复单元可以重复两到五次，以形成一个多聚体单元，例如(GGGS)2(SEQ ID NO:75)、(GGGS)3(SEQ ID NO:76)、(GGGS)4(SEQ ID NO:77)、(GGGS)5(SEQ ID NO:78)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:79)、(GGGGS)3(SEQ ID NO:80)或(GGGGS)4(SEQ ID NO:81)。在一个实施方案中，肽接头选自SEQ ID NO:69至82的接头。在一个实施方案中，每个肽接头彼此独立选自SEQ ID NO:69至82的接头。在一个优选实施方案中，肽接头/每个肽接头(彼此独立)选自SEQ ID NO:75至81的接头。在多聚体单元的氨基和/或羧基端，可添加多达六个的额外的、任意的、天然氨基酸。其它合成的肽接头可以由单个氨基酸组成，重复10至20次，并且氨基和/或羧基端可以包含多达六个额外的任意的天然氨基酸，例如接头GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO:82)中的丝氨酸。所有肽接头都可由核酸分子编码，因此可以重组表达。由于接头本身是肽，通过在两个氨基酸之间形成的肽键，可以将抗融合肽(antifusogenic peptide)连接到接头上。

“抗体片段”是非完整抗体的分子，该分子包含完整抗体的一部分，与完整抗体结合的抗原结合。抗体片段的例子包括，但不限于Fv、scFv、Fab、scFab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)2；双链抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。有关某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等,Nat.Med.9(2003)129-134。有关scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,A.,In；The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编辑),Springer-Verlag,纽约(1994),第269-315页；也参见WO 93/16185；US 5,571,894和US 5,587,458。

双链抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，可以是双价或双特异性的。参见，例如EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等,Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。三链抗体(triabody)和四链抗体(tetrabody)也描述于Hudson，P.J.等，Nat.Med.9(20039 129-134)中。

单结构域抗体是抗体片段，其包含抗体重链可变域的全部或部分、或轻链可变域的全部或部分。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如US 6,248,516)。

抗体片段可以通过各种技术制备，所述技术包括但不限于以蛋白酶消化完整抗体以及通过重组的宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。

术语“抗体片段”还包括“双作用Fab”或“DAF”，其包含一个与两种不同抗原结合的抗原结合位点(参见，例如US 2008/0069820)。

“单特异性抗体”表示具有针对一个抗原的单一结合特异性的抗体。单特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2)或其组合(例如全长抗体加额外的scFv或Fab片段)。

“多特异性抗体”表示具有至少针对同一抗原上的两个不同表位或两个不同抗原的结合特异性的抗体。多特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)或其组合(例如全长抗体加额外的scFv或Fab片段)。具有两个、三个或更多(例如四个)功能性抗原结合位点的工程化抗体也已有报告(参见，例如，US 2002/0004587 A1)。一种多特异性抗体是双特异性抗体。多特异性抗体也可以通过构建静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子而制备(WO 2009/089004)。

术语“结合”表示结合位点与其靶标的结合，例如包含抗体重链可变域和抗体轻链可变域的抗体结合位点结合到相应的抗原。这种结合可以使用例如

测定(GEHealthcare,Uppsala,瑞典)来确定。也就是说，术语“结合(抗原)”可以表示抗体在体外测定中的结合。在一个实施方案中，在结合测定中确定结合，其中将抗体结合到表面上，并通过表面等离子共振(SPR)测定抗原与抗体的结合。结合是指，例如结合亲和力(K_D)为10^-8M或更小值，在某些实施方案中10^-13至10^-8M，在某些实施方案中，10^-13至10^-9M。术语“结合”还包括术语“特异性结合”。

结合可以通过BIAcore测定(GE Healthcare Biosensor AB,Uppsala,瑞典)进行调查。结合的亲和力(affinity)通过术语k_a(对于抗体/抗原复合物，抗体的结合速率常数)、k_d(解离常数)和K_D(k_d/k_a)来定义。

例如，在

测定的一个可能的实施方案中，抗原被结合到表面上，抗体结合位点的结合通过表面等离子共振(SPR)测定。结合的亲和力通过术语ka(结合常数：结合形成复合物的速率常数)、kd(解离常数：复合物解离的速度常数)，和KD(kd/ka)来定义。可选择地，可以在共振信号高度和解离行为方面，将SPR传感图的结合信号直接与参考的响应信号进行比较。

术语“结合位点”表示任何显示与靶标结合特异性的蛋白质实体。这可以是，例如受体，受体配体，anticalin，affibody，抗体等。因此，本文使用的术语“结合位点”表示可特异性结合到第二多肽或可被第二多肽特异性结合的多肽。在一个实施方案中，结合位点是选自以下的多肽：抗体重链可变域、抗体轻链可变域、抗体重链和抗体轻链可变域对、受体或其功能片段、受体配体或其功能片段、酶或其底物。

在抗体的情况下，结合位点包含至少三个HVR(例如，在VHH的情况下)或六个HVR(例如，在天然存在的抗体，即天然抗体中)。一般来说，负责抗原结合的抗体氨基酸残基将形成结合位点。这些残基通常包含在抗体重链可变域和关联(cognate)抗体轻链可变域对中。抗体的抗原结合位点包含来自“超变区”或“HVR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是此处定义的超变区域残基以外的可变域区域。因此，抗体的轻链和重链可变域从N端到C端包含FR1、HVR1/CDR1、FR2、HVR2/CDR2、FR3、HVR3/CDR3和FR4区(免疫球蛋白框架)。特别地，重链可变域的HVR3/CDR3区是对抗原结合贡献最大的区域，其定义了抗体的结合特异性。“功能性结合位点”能够特异性结合其靶标。术语“特异性结合”表示，在体外测定中，在一个实施方案中在结合测定中，结合位点与其靶标的结合。这样的结合测定可以是任何测定，只要能检测结合事件即可。例如，将抗体结合到表面并采用表面等离子共振(SPR)测量抗原与抗体的结合的测定。或者，可以使用桥式ELISA。结合是指抗体(结合物)对其靶标具有10^-8M或数值更小的结合亲和力(K_D)，在某些实施方案中10^-13至10^-8M，在某些实施方案中，10^-13至10^- ⁹M。

抗体的“类”是指其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。抗体有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几个类可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

术语“Fc区”表示免疫球蛋白重链的C端区域，该区域包含至少一部分铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，人类IgG重链Fc区从Asp221，或从Cys226，或从Pro230延伸到重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可存在或不存在。Fc区由两个重链Fc区多肽组成，其可以通过铰链区半胱氨酸残基形成的链间二硫键相互共价连接。

本文报告的多聚体多肽/结合物可包含完整的Fc区，在一个实施方案中，来自人源但没有铰链区半胱氨酸残基的Fc区。在一个实施方案中，Fc区包含人恒定区的所有部分，但没有铰链区半胱氨酸残基。抗体的Fc区直接参与补体活化、C1q结合、C3活化和Fc受体结合。虽然抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但结合到C1q是由Fc区中规定的结合位点引起的。该结合位点为本领域所知，并描述在Lukas，T.J.等,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.,和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等，Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等,J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等,Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434。此结合站点包括例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引进行编号)。IgG1、IgG2和IgG3亚类的抗体通常表现出补体活化、C1q结合和C3激活，而IgG4不激活补体系统，不结合C1q，不激活C3。“抗体的Fc区”是技术人员熟知的术语，其根据抗体的木瓜蛋白酶裂解来定义。在一个实施方案中，Fc区是人Fc区。在一个实施方案中，Fc区是人IgG4亚类的Fc区，包含S228P和/或L235E突变(根据Kabat的EU索引进行编号)。在一个实施方案中，Fc区是人IgG1亚类的Fc区，包含L234A和L235A和可选地P329G突变(根据Kabat的EU索引进行编号)。

术语“全长抗体”表示具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体。全长抗体包含两条全长抗体轻链(每条链包含一个轻链可变域和一个轻链恒定域)、以及两条全长抗体重链(每条链包含一个重链可变域、第一恒定域、一个铰链域、第二恒定域和第三恒定域)。全长抗体可以包含其它结构域，例如与全长抗体的一个或多个链缀合的额外scFv或scFab。这些缀合物也被术语全长抗体涵盖。

术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已经引入了外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其中包括初级转化细胞和从中衍生的后代(不考虑继代的次数)。后代的核酸可能与母细胞不完全相同，而是可能包含突变。本文也包括具有与在原初转化细胞中进行筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变体后代。

术语“源自”表示通过在至少一个位置引入改变/突变，从亲本氨基酸序列得到变体氨基酸序列。因此，来源的氨基酸序列在至少一个相应的位置上不同于相应的亲本氨基酸序列。在一个实施方案中，源自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置上有1至15个氨基酸残基的不同。在一个实施方案中，源自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置上有1至10个氨基酸残基的不同。在一个实施方案中，源自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置上有1至6个氨基酸残基的不同。同样，来源的氨基酸序列与其亲本氨基酸序列具有高度氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，从亲本氨基酸序列来源的氨基酸序列具有80％或以上的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，从亲本氨基酸序列来源的氨基酸序列具有90％或以上的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，从亲本氨基酸序列来源的氨基酸序列具有95％或以上的氨基酸序列同一性。

在一个实施方案中，一个或两个重链Fc区多肽源自SEQ ID NO:01的Fc区多肽，与SEQ ID NO:01的Fc区多肽相比，具有至少一个氨基酸突变或缺失。在一个实施方案中，Fc区多肽包含/具有约1至10个氨基酸突变或缺失，在一个实施方案中，约1至约5个氨基酸突变或缺失。在一个实施方案中，Fc区多肽具有与SEQ ID NO:01的人Fc区多肽至少80％的同源性。在一个实施方案中，Fc区多肽具有与SEQ ID NO:01的人Fc区多肽至少90％的同源性。在一个实施方案中，Fc区多肽具有与SEQ ID NO:01的人Fc区多肽至少95％的同源性。

源自SEQ ID NO:01或02或03或04的人Fc区多肽的Fc区多肽由其所含的氨基酸变化来进一步定义。因此，例如，术语P329G表示源自人Fc区多肽的Fc区多肽，其相对于SEQ IDNO:01或02或03或04的人Fc区多肽来说，在氨基酸329位具有脯氨酸至甘氨酸的突变。

人IgG1 Fc区多肽包含如下氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:01).

以下Fc区为源自野生型人IgG1 Fc区的变体。

具有L234A、L235A突变的人IgG1 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQID NO:05).

具有Y349C、T366S、L368A和Y407V突变的人IgG1 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:06).

具有S354C、T366W突变的人IgG1 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:07).

具有L234A、L235A突变和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的、人IgG1 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:08).

具有L234A、L235A和S354C、T366W突变的、人IgG1 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:09).

具有P329G突变的人IgG1 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

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具有L234A、L235A突变和P329G突变的人IgG1 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

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具有P329G突变和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的、人IgG1 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:12).

具有P329G突变和S354C、T366W突变的人IgG1 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:13).

具有L234A、L235A、P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的、人IgG1 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:14).

具有L234A、L235A、P329G突变和S354C、T366W突变的、人IgG1 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:15).

人IgG4 Fc区多肽包含如下氨基酸序列：

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:04).

以下Fc区为源自野生型人IgG4 Fc区的变体。

具有S228P和L235E突变的人IgG4 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:16).

具有S228P、L235E突变和P329G突变的人IgG4 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:17).

具有S354C、T366W突变的人IgG4 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

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具有Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的、人IgG4 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

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具有S228P、L235E和S354C、T366W突变的人IgG4 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

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具有S228P、L235E和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的人IgG4 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:21).

具有P329G突变的人IgG4 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:22).

具有P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的、人IgG4 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

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具有P329G和S354C、T366W突变的人IgG4 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:24).

具有S228P、L235E、P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的、人IgG4 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:25).

具有S228P、L235E、P329G和S354C、T366W突变的人IgG4 Fc区来源的Fc区多肽，包含如下氨基酸序列：

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:26).

“人源化”抗体是指一种抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体包含至少一个，通常是两个可变域的基本上全部，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，所有或基本上所有的FR都对应于人抗体的FR。可选地，人源化抗体可以包含至少一部分源自人抗体的抗体恒定区。抗体例如非人抗体的“人源化形式”，是指经过人源化的抗体。

此处使用术语“超变区”或“HVR”是指抗体可变域中包含如下氨基酸残基区段的每个区域，所述氨基酸残基区段在序列上高度可变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“超变环”)，和/或包含抗原接触残基(“抗原接触点”)。一般来说，抗体包含六个HVR；三个在重链可变域VH中(H1、H2、H3)，三个在轻链可变域VL中(L1、L2、L3)。

HVR包括

(a)位于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)的超变环(Chothia，C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；

(b)位于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)的CDR(Kabat,E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH出版社91-3242.)；

(c)位于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)的抗原接触点(MacCallum等J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和

(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。

除非另有说明，可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等,同上引文进行编号。

术语“轻链”表示天然IgG抗体的较短多肽链。基于其恒定域的氨基酸序列，抗体的轻链可分为两种类型，称为κ和λ。人κ轻链恒定域见SEQ ID NO:33，人λ轻链恒定域见SEQ IDNO:34。

术语“互补位”是指给定抗体分子中为靶标与结合位点之间特异性结合所必需的部分。互补位可以是连续的，即由结合位点中存在的相邻氨基酸残基形成，或是不连续的，即由一级序列中例如HVRs/CDRs的氨基酸序列中位于相继不同位置上、但在结合位点采取的三维结构中靠近的氨基酸残基形成。

“分离的”抗体是与其天然环境的组分分离了的抗体。在一些实施方案中，通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳、CE-SDS)或色谱(例如，体积排阻色谱或离子交换或反相HPLC)测定，抗体被纯化至大于95％或99％纯度。关于抗体纯度评估方法的综述，参见，例如Flatman,S.等,J.Chrom.B 848(2007)79-87。

“分离的”核酸是指与其天然环境组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外、或与其天然染色体位置不同的染色体位置上。

本文使用的术语“单克隆抗体”是指从一群基本同质的抗体中获得的抗体，即，除了通常以微小量存在的如下可能变体抗体除外，组成该群体的各单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，其中所述变体抗体例如含有天然发生的突变或在生产单克隆抗体制品期间出现。与多克隆抗体制品(其通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)不同，单克隆抗体制品的每个单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征——获自基本同质的抗体群，而不应被解释为需要通过任何特定方法生产该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白座位的转基因动物的方法，本文描述了制备单克隆抗体的这些方法和其它示例性方法。

“天然抗体”是指具有不同结构的天然产生的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由通过二硫键连接的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N端到C端，每条重链具有一个可变域(VH)，也称为可变重链域或重链可变域，其后跟随三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端到C端，每条轻链具有一个可变域(VL)，也称为可变轻链域或轻链可变域，其后跟随一个恒定轻链(CL)域。基于其恒定域的氨基酸序列，抗体的轻链可为两种类型之一，称为κ和λ。

术语“药物制剂”是指一种制剂，其采取的形式允许其中含有的活性成分的生物活性有效，并且不包含对施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的其它成分。

“药学可接受的载体”是指药物制剂中活性成分以外的成分，它对受试者无毒。药学可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

此处使用的术语“重组抗体”表示通过重组手段制备、表达、创造或分离的所有(嵌合的、人源化的和人的)抗体。这包括从宿主细胞例如NS0、HEK、BHK或CHO细胞中分离的抗体、或使用转染到宿主细胞中的重组表达质粒表达的抗体。

本申请中使用的术语“价”表示(抗体)分子中存在特定数量的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”表示在(抗体)分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。本文报告的双特异性抗体在一个优选实施方案中是“三价的”。本文报告的三特异性抗体在一个优选实施方案中是“三价的”。

术语“可变区”或“可变域”是指抗体重链或轻链的结构域，其涉及抗体与其抗原的结合。抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个框架区(FRs)和三个超变区(HVRs)(参见例如,Kindt,T.J.等Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman和Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可采用结合该抗原的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补VL或VH结构域的文库来分离。参见，例如Portolano,S.等,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等,Nature 352(1991)624-628)。

术语“变体”表示具有氨基酸序列的分子，所述氨基酸序列不同于亲本分子的氨基酸序列。通常，这样的分子具有一个或多个改变、插入或缺失。在一个实施方案中，经修饰的抗体或经修饰的融合多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含非天然存在的Fc区的至少一部分。此类分子具有与亲本结构域或Fc区小于100％的序列同一性。在一个实施例中，变体具有与亲本结构域或Fc区的氨基酸序列有约75％至小于100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，尤其是约80％至小于100％，尤其是约85％至小于100％，尤其是约90％至100％，和尤其是约95％至小于100％的序列同一性。在一个实施方案中，亲本结构域或Fc区和变体结构域或Fc区相差一个(单个)、两个或三个氨基酸残基。

此处使用的术语“结构域交换”表示，在一对抗体重链VH-CH1片段及其相应的关联抗体轻链中，即在抗体结合臂中(即在Fab片段中)，结构域顺序偏离天然顺序，其中至少一个重链结构域被其相应的轻链结构域替换，且反之亦然。结构域交换有三种一般类型，(i)CH1和CL结构域的交换，其导致具有VL-CH1结构域顺序的结构域交换轻链、和具有VH-CL结构域顺序的结构域交换重链片段(或具有VH-CL-铰链-CH2-CH3结构域顺序的全长抗体重链)，(ii)VH和VL结构域的交换，其导致具有VH-CL结构域顺序的结构域交换轻链和具有VL-CH1结构域顺序的结构域交换重链片段，和(iii)完整轻链(VL-CL)和完整VH-CH1重链片段的结构域交换(“Fab交换”)，其导致具有VH-CH1结构域顺序的结构域交换轻链和具有VL-CL结构域顺序的结构域交换重链片段(上述所有结构域顺序均以N端至C端方向指示)。

对于相应的重链和轻链结构域，如本文所用的术语“相互替换”是指上述结构域交换(crossover)。因此，当CH1和CL结构域“相互替换”时，它指的是在第(i)项中提到的结构域交换以及由此产生的重链和轻链结构域顺序。因此，当VH和VL“相互替换”时，它指的是在第(ii)项中提到的结构域交换；以及当CH1和CL结构域“相互替换”且VH1和VL结构域“相互替换”时，它指的是在第(iii)项中提到的结构域交换。包括结构域交换的双特异性抗体描述于例如WO 2009/080251；WO 2009/080252；WO 2009/080253；WO 2009/080254和Schaefer,W.等,Proc.Natl.Acad.Sci USA 108(2011)11187-11192中。

以本文报告的方法产生的多特异性抗体还可以包含Fab片段，其包括上文项(i)中提到的CH1和CL结构域的结构域交换、或上述项(ii)中提到的VH和VL结构域的结构域交换。特异性结合相同抗原的Fab片段可以被构造为具有相同的结构域顺序。因此，如果多特异性抗体包含多个具有结构域交换的Fab片段，所述Fab片段可以特异性结合相同的抗原。II.根据本发明的交换反应产生双/多特异性抗体

A)将单特异性单价IgG衍生物转换为双特异性IgG的方法

如下文所述的交换方法可以实现将单特异性(单价)抗体或抗体片段转换为双价双特异性抗体(bsAbs)或将已有的多特异性抗体转换为更高阶的多特异性抗体，例如双特异性抗体转换为三或四特异性抗体。

两个非功能性半抗体(即，对细胞靶标，仅为单特异性)用作起始物。例如，可以使用2/3IgG。2/3-IgG由具有第一组杵入臼(KiH)突变的重链、与其互补的轻链、以及Fc区组成，所述Fc区通过相应互补的第二组杵入臼突变与所述重链的Fc区互补。互补Fc区可以是例如Fc区重链片段或第二重链(可选地，没有结合特异性)。为了进一步促进所需的双(多)特异性抗体的正确组装，互补Fc区除了包含所述互补的第二组KiH突变外还包含额外的干扰(去稳定)排斥性电荷突变。此外，互补Fc区可以包含亲和标签(例如His6或C标签)，用于在生产后有效去除非所需的排放物(educts)和副产物。第二非功能性单特异性抗体包含互补干扰突变。一旦半抗体相互交换，例如，当结合在细胞表面上相互作用时，这两种干扰突变将转变为吸引性突变。

可以用根据本发明的多聚体分子实施的细胞上交换反应/方法包括以下步骤

-使第一(起始)多聚体多肽(其包含第一多肽和第二多肽)和第二(起始)多肽(其包含第三多肽和第四多肽)在细胞表面靠近，使得第二和第三多肽交叉交换，以形成第三多聚体多肽(其包含第一和第四多肽)和第四多聚体多肽(其包含第二和第三多肽)。

其中

i)第二多肽包含(第一干扰)突变，导致第一多聚体多肽，相较于除了第二多肽中所述突变以外与所述第一多聚体多肽相同的(多聚体)多肽，是去稳定化的，

ii)第三多肽包含(第二干扰)突变，导致第二多聚体多肽，相较于除了第三多肽中所述突变以外与所述第二多聚体多肽相同的(多聚体)多肽，是去稳定化的，

iii)第二多肽中的(第一干扰)突变和第三多肽中的(第二干扰)突变导致，相较于第一(起始)多聚体多肽和/或第二(起始)多聚体多肽，包含所述第二多肽和所述第三多肽的第三(交换的)多聚体多肽的稳定化，

iv)相较于第一(起始)多聚体多肽和/或第二(起始)多聚体多肽，第四(交换的)多聚体多肽更稳定，

v)第一多聚体多肽和第二多聚体多肽各自只包含无功能(即不能与其靶标结合的)的一个或两个新结合位点的一部分，和

vi)第三和/或第四多聚体多肽包含功能形式的该一个或两个新结合位点，即以允许与其相应靶标特异性结合的形式，其中通过在第一多聚体多肽和第二多聚体多肽之间交换第二和第三多肽，即通过将所述一个或两个新结合位点的非功能部分靠在一起以形成一个或两个新的功能性结合位点，从而生成/激活了该一个或两个新的功能结合位点。

因此，本发明至少部分基于以下发现：在(异)多聚体多肽中添加单个(单侧、非配对)去稳定(干扰)突变，足以促进与也包含单个(单侧、非配对)去稳定(干扰)突变的第二(异)多聚体多肽进行多肽链交换，这是因为：随着去稳定突变在交换和重组后转变为吸引性突变，与起始(异)多聚体多肽相比，两种新形成的经交换的(异)多聚体多肽具有改善的稳定性(即，更低的CH3-CH3结合自由能)。唯一必须遵循的条件是，将去稳定(干扰)突变引入一旦相应多肽相互结合后即可以发生相互作用的位置。

该方法可应用于符合上述标准的任何(异)多聚体多肽。

然而，根据本发明的方法在制药领域特别有用。

产生(异)多聚体多肽的不同方法为本领域所知。这些方法中的任何一种都可以使用，只要用于形成起始(异)多聚体多肽所需的突变不干扰或重叠于根据本发明的交换反应所需的(干扰)去稳定化突变。

回到制药领域，抗体是最广泛使用的结合物。抗体通过恒定区的相互作用，特别是重链的CH3结构域之间的相互作用进行二聚化。

因此，本发明至少部分基于以下发现：在一对CH3结构域的一个CH3结构域中引入去稳定化单突变，即足以实施根据本发明的方法。更详细地讲，已经发现，在第一起始(异)多聚体多肽的仅一个CH3结构域中在357位引入第一去稳定化突变，在第二起始多肽的仅一个CH3结构域中在370位引入第二去稳定化突变，可以在两个起始(异)多聚体多肽空间接近时，促进这些起始多肽之间多肽链的自发交换。由此产生的经交换的多肽之一包含在357和370位上分别具有突变的CH3结构域对，从而导致该交换的(异)多聚体的稳定化。类似情况可以通过356和439位上的突变来实现。所有位置的编号均根据Kabat的EU索引进行。一对优选的突变是E357K和K370E。另一对优选的突变是D356K和K439E。根据本发明的方法可应用于任何IgG亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，因为所述及的这些残基是高度保守的。在一个优选实施方案中，CH3结构域属于IgG1亚类。

本发明至少部分基于以下发现：起始(异)多聚体多肽的多肽链不需要例如通过二硫键相互共价连接以允许起始(异)多聚体多肽的形成和分离。更详细地说，由于起始多肽已经是异二聚体，它们将包含用于异二聚体化的另外突变。已发现，这些突变足以稳定起始异二聚体，即使在存在特定的去稳定化(干扰)单个单侧突变的情况下。因此，在起始(异)多聚体多肽中链的共价连接不再需要。因此，在一个实施方案中，在包含铰链区的起始(异)多聚体多肽的情况下，这些铰链区包含C226S和C229S突变或缺失整个CPXC(SEQ ID NO:95)序列(根据Kabat EU索引进行编号)。

通过省掉(异)多聚体起始多肽的含Fc区链之间的二硫键，无需还原剂即可启动交换反应。这允许交换反应在温和的体内条件下发生。此外，其它二硫键可以存在于起始(异)多聚体多肽中，例如Fab片段中，只要它们不干扰交换反应(包含CH3结构域的多肽共价地结合在一起)。

本发明至少部分基于以下发现：经交换的(异)多聚体多肽，例如那些只包含功能性和靶向结合位点的(异)多聚体多肽，只有在交换反应后，才可以通过形成二硫键来进一步稳定。例如，为形成(异)多聚体抗体而很好确立的突变是杵入臼突变。这些突变存在两种变型：无额外的二硫键和有额外的二硫键。因此，一种可选的起始(异)多聚体多肽包含杵入臼突变用于形成起始(异)多聚体多肽，并且仅在含有靶向结合位点的多肽链中提供杵入臼半胱氨酸残基。由此，只有在包含两个靶向结合位点的经交换的(异)多聚体多肽中，才存在用于形成二硫键所需的位于相应匹配位置上的两个半胱氨酸残基。因此，只有在所述的经交换的产物中才形成二硫键。这导致目的经交换的(异)多聚体多肽的进一步稳定，从而防止解离和/或逆反应。

此处使用的术语“(异)多聚体”表示一种多肽，其包含至少两条多肽链，这两条多肽链在氨基酸序列上部分或完全不相同，并且满足本发明的要求。该术语还涵盖包含三个或更多个多肽链的多肽，只要其中至少两个为根据本发明的(异)多聚体。因此，术语“多聚体”表示一种多肽，其包含至少三个多肽链，其中至少两个为(异)多聚体并满足本发明的要求。

术语“干扰突变”表示导致(异)二聚体多肽去稳定的突变。这种去稳定化通常是通过改变氨基酸残基的电荷来实现的，例如，通过将带正电荷的氨基酸残基与带负电荷的氨基酸残基进行交换，或反之亦然。这种交换会导致CH3-CH3结构域的相互作用位置上相似的电荷，和由此导致电荷排斥。一对优选的突变是E357K和K370E。另一对优选的突变是D356K和K439E。此外，根据本发明的方法可应用于任何IgG亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，因为这些残基是高度保守的。在一个优选实施方案中，CH3结构域属于IgG1亚类。

WO 2009/089004(以引用的方式并入本文)中公开了评估CH3结构域突变对二聚体稳定性的影响的方法。其中概述了如何使用EGAD软件来估计CH3-CH3结构域结合自由能(另参见Pokala,N.和Handel,T.M.,J.Mol.Biol.347(2005)203-227，就其全文通过引用的方式并入本文)：

EGAD可用于大致比较CH3结构域界面上制造的各种突变的结合自由能。突变体的结合自由能定义为ΔΔGmut＝μ(ΔGmut-ΔGwt)(mut＝突变体，wt＝野生型)。其中，μ(一般＝0.1)是在与实验能量进行比较时，用来将结合亲和力的预期改变标准化到具有斜率1的比例因子(scaling factor)。解离自由能(ΔG)定义为复合物(ΔGbound)和自由状态(ΔGfree)之间的能量差。

在下面以特定的、示范性起始物，即2/3-IgG，对本发明进行示例。这作为一般性基本概念的实例来呈现，不应被理解为对本发明的限制。本发明的真实范围在权利要求中阐明。

图1显示了在根据本发明的方法中用作示范性起始化合物的2/3-IgG的设计和模块化组成。2/3-IgG由三条单独的链组成：一条轻链(通常为包含轻链可变域和轻链恒定域的全长轻链)、一条重链(通常为包含重链可变域和所有重链恒定域的全长重链，包括具有或不具有半胱氨酸残基的铰链区)，以及一个互补重链Fc区多肽(通常为重链Fc区片段，其包含铰链的至少一部分和CH2-CH3，铰链区没有半胱氨酸残基)。轻链和重链的可变域构成功能性结合位点，即VH/VL对。

在根据本发明的方法中用作示范性起始化合物的2/3-BiFabs的设计和模块化组成也类似。2/3-BiFabs由三条单独的链组成：一条轻链(通常为包含轻链可变域和轻链恒定域的全长轻链)，一条重链(通常为包含第一重链可变域、CH1结构域、第二可变域和CH3结构域的全长重链，包括具有或不具有半胱氨酸残基的铰链区)和一个互补重链多肽(通常为一个重链片段，其包含铰链-可变域-CH3，铰链区具有或不具胱氨酸残基)。轻链的可变域和重链的第一可变域形成功能结合位点，即VH/VL对，重链的第二可变域和互补重链Fc区多肽的可变域也形成VH/VL对，其通常无功能，即不具有结合能力。

重链(通常是人IgG1亚类的)包含i)杵突变或臼突变(抗体重链的CH3结构域中的T366W突变表示为“杵突变”，抗体重链的CH3结构域中的T366S,L368A和Y407V突变表示为“臼突变”(根据Kabat EU索引进行编号)，或ii)杵-cys-突变或臼-cys-突变(抗体重链的CH3结构域中的T366W和S354C突变表示为“杵-cys-突变”，抗体重链的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V、Y349C突变表示为“臼-cys-突变”；颠倒也同样可以：CH3结构域中的T366W/Y349C和T366S/L368A/Y407V/S354C(根据Kabat EU索引进行编号)可实现杵入臼Fc区异二聚体的形成。

互补重链Fc区多肽或互补重链多肽也可以表示为“dummy-Fc”或“dummy-HC”，即缺乏VH和CH1的IgG1衍生物，在N端从铰链区序列(或其片段)开始，然后是CH2结构域或可变域，后随CH3结构域，并可选地在其C端包含纯化标签，例如His6或His8或C标签。此外，这种互补多肽在其CH3结构域中包含杵突变或臼突变，具体取决于重链中的突变。除了杵突变或臼突变外，互补多肽包含至少一个干扰(即去稳定化)突变，该突变引入一个(即单个额外的)或多个相对于野生型序列而言排斥性的电荷。例如，D356K或E357K突变，分别与K370E或K439E突变组合(参见图2)。这种“突变的重链Fc区多肽”在以下部分表示为MHCFcRP。

重链和MHCFcRP可以形成两种类型的异二聚体，取决于其中杵入臼突变的分布：

i)重链-杵::MHCFcRP-臼，和

ii)重链-臼::MHCFcRP-杵。

因此，2/3-IgG和2/3-BiFabs是具有结合的轻链的异聚体，即异三聚体。然而，这是有“缺陷”的，因为MHCFcRP中的电荷突变在重链中没有匹配的对应物，并且如果存在于重链中，MHCFcRP的电荷干扰突变没有匹配的重链对应物。

2/3-IgG是单价的、非二聚的/聚集的、单臂抗体衍生物，能够以与正常IgG类似的产量进行表达和纯化(参见图3)。这保证了起始物的单价性。如果使用双价2/3-IgG，则可以是单特异性的和双特异性的。

然而，构成这些有缺陷的2/3-IgG的多肽能够重新排列为双特异性抗体，如图4所示。

两个起始分子之间的交换反应是由KiH(杵入臼)重链(H链)彼此更好的互补性(无电荷排斥，且可选择地如果存在自由半胱氨酸残基，则形成二硫键)以及两个MHCFcRP彼此更好的互补性驱动。在反应中，两个起始分子的Fc区复合物解离并交换多肽形成两个更有利的复合物。这驱动如下反应：

2/3-IgG(A)-标签+2/3-IgG(B)-标签

(起始异二聚体多肽)

→

bsAb(AB)+MHCFcRP(A)-MHCFcRP(B)-标签

(经交换的异二聚体多肽)。

在如图4所示的实例中，起始2/3IgG A的重链(杵-cys)和起始2/3-IgG B的重链(臼-cys)形成匹配的双特异性抗体异二聚体(2xHC+2xLC)。

当在细胞上/体内情况下使用无铰链区-二硫键的2/3-IgG时，无需还原步骤。链重排自发发生。

这同样适用于2/3-BiFabs。

参见实施例1至5。

B)将单价和/或双价单或双特异性IgG衍生物转换为双、三或四价双、三或四特异性抗体的方法

采用根据本发明的方法，不仅可以组合不同的结合特异性，而且可以同时以不同的形式和以不同价性生产这些组合。这可以通过扩展上一节所述的方法中使用的起始物来实现。

例如，从上一节所述的2/3IgG开始，MHCFcRP保持不变，但重链以不同的形式使用。这样的形式可以是，例如，在C端或N端具有一个结合位点或具有两个结合位点(一个在N端和一个在C端)的链(见例如图9和10)。

在此实例中，在根据本发明的方法中，不同的起始形式(例如具有N端结合位点、C端结合位点，或N和C端结合位点)相互组合，允许产生具有不同价性、不同几何形状和不同的各结合位点三维排列/位置的不同抗体形式(当前实例中为9种，参见图11)。

对于多特异性抗体的产生，交换驱动原理(将有缺陷的输入分子转换为匹配的输出分子)不改变。MHCFcRP也被保留。因此，只有重链被改变。

例如，图1和9-10显示了三种不同的起始分子(具有N端、C端、以及N和C端结合位点的2/3-IgG)，这些分子已经在交换反应中相互组合，即在根据本发明的方法中组合，产生9种不同的双特异性形式。它们在价性、几何形状和各结合位点的位置上是不同的。

在不受理论约束的情况下，认为基于两个不同2/3IgG或2/3-BiFabs的缺陷异多聚体的短暂分离的交换反应，应导致含有优先匹配的Fc区异二聚体的产物。因此，该交换将2/3-IgG转换为四链IgG(不同的形式)以及相应的Fc区域异二聚体。

如果体外存在铰链区二硫键，则可以通过还原步骤启动交换反应，以打破链间铰链区二硫键，而在无铰链区二硫键的细胞上/体内情况下这可以被省略。链重排是自发发生的。

参见实施例6和7。

C)无Fc-Fc链间二硫键和无还原步骤的反应

重链链间二硫键稳定抗体，并定义连接到铰链的Fab臂的灵活性。包含铰链区的起始抗体的交换方法要求在交换反应之前或期间还原这些二硫键，并在交换反应完成后去除还原剂(参见实施例3和7)。

因此，本文报告了起始分子的交换反应，这些起始分子具有铰链区，但没有链间二硫键。

作为此示例，已经产生了其中Fc区中所有二硫键已被消除的2/3IgG以及2/3-BiFabs。已发现，即使没有这些链间二硫键，这种二硫键缺乏的2/3分子也能以有效的方式产生和纯化(见例如图15和图20)。当使用这种二硫键缺乏的2/3分子作为起始分子时，根据本发明的方法可以在体内执行，因为还原步骤不再需要，使得这些分子特别适用于细胞上的交换反应和体内应用。从这些二硫键缺乏的2/3-IgG和2/3-BiFabs产生的多特异性抗体是具有功能的和稳定的，由无链间二硫键的非共价Fc-Fc相互作用结合在一起(参见图15和图16)。

因此，消除Fc-Fc链间二硫键，可以允许相应的Fc区错配驱动的交换反应，而无需还原和再氧化，即在生理条件下进行。这有利于制备和(高通量)筛选程序。这也使得结构域交换反应可以在生理条件下(包括在活细胞表面上)发生。

参见实施例8。

在一个实施方案中，铰链区是无二硫键的。在SEQ ID NO:32的序列中，无二硫键的铰链区包含丝氨酸残基对半胱氨酸残基的替换。

除了去除二硫键外，还可以将铰链区缩短。通过使用这种经过修改的铰链区，可以获得双特异性抗体，提供各结合位点之间的不同距离(参见图51)。因此，在一个实施方案中，铰链区域具有氨基酸序列SEQ ID NO:31(HTCPXCP,X＝S或P)或SEQ ID NO:95(HTSPXSP,X＝S或P)或SEQ ID NO:94(HTPAPE；SEQ ID NO:31的CPXC被缺失)或DKTHGGGGS(SEQ ID NO:97)。

III.根据本发明的方法

本文报告了一种方法，其用于在细胞上组装/半抗体交换两种差异靶向的抗体-前体药物衍生物，从而在期望的作用部位直接于细胞表面产生新的功能，优选具有治疗效果的功能。

在下面以特定的、示例性起始物，即2/3-IgG和2/3-BiFab，对根据本发明的方法进行示例。这仅仅被作为一般性基本概念的实例来呈现，不应被理解为对本发明构成限制。本发明的真实范围在权利要求中提出。

A)单价单特异性抗体在细胞上转换为双价IgG

与双价抗体相比，单价抗体可以展现出对细胞表面的结合能力降低。不受理论的约束，认为其原因是双价性引起的对细胞表面的表观亲和力增强，即亲合力效应(avidityeffect)。通过用抗体的两个结合位点/两个臂结合相同的抗原/表位，可以实现在细胞表面上亲合力增强的结合和/或保留。在此单特异性设置中，与抗原密度低(降低双臂结合可能性)的细胞相比，双价结合可以增加携带大量关联抗原(增加双臂结合的可能性)的细胞的结合特异性。

细胞表面上亲合力增强的结合和/或保留还可以通过用双特异性抗体的不同结合位点/不同臂结合不同抗原来实现。不受理论的约束，认为在这种双特异性设置中，与存在和/或只表达一种抗原(只有一个结合位点/一个臂可结合)的细胞相比，双价结合导致对存在和/或表达两种抗原(两个结合位点/双臂结合)的细胞具有增加的结合特异性。

用于解决亲合力介导的结合改进的本领域技术，采用识别两个靶标的预先形成的bsAbs。为了实现特异性，每个单价臂必须具有相当低的亲和力，以避免以单价方式导致的足够结合强度压倒亲合力效应。如果满足此先决条件，bsAbs能以增加的特异性结合存在和/或表达两种抗原的细胞。

目前可用的亲合力驱动的结合改进概念的一个缺点是，细胞表面两种抗原的密度可能不是预形成的bsAbs本身结合的基本先决条件(只要两者都存在且可接近)。抗原密度可能仅决定与表达抗原的细胞结合的bsAb的量。

因此，具有非常高效力(和/或潜在毒性问题)的实体将带来这样的风险：结合——并影响——呈现/表达高和低水平的两种靶抗原的细胞。例如，具有固有或附加细胞毒性功能的bsAbs不仅可能影响表现出高抗原水平的肿瘤细胞，还会影响抗原水平低的非靶标正常细胞。

通过其中双特异性抗体在细胞上转换单价单特异性抗体而形成的本文方法，可解决上述问题，因为交换反应需要两个单特异性交换伴侣的物理相互作用。这种相互作用的概率取决于浓度，即低浓度时相互作用和交换的概率低，而增加浓度时相互作用和交换的概率更高。因此，例如，分开(连续)应用具有不同特异性的单特异性抗体，将导致两个单特异性成分在显示更大量的两种抗原的细胞上的增加累积(以低亲和力)。由此，这种细胞不仅会累积增加浓度的各单抗体，而且将更有效得多地将它们转换为bsAbs。接着，这些bsAbs将由于其两个结合位点与细胞表面抗原的亲合结合而被保留在靶细胞上，而未交换的前体抗体将解离。

B)具有前体药物功能的BiFabs的产生以及在细胞上转换为功能性TriFabs

本文报告的交换反应的驱动力是，将两个具有“缺陷”CH3界面的输入分子转换为具有匹配CH3界面的两种产物。规定这些CH3界面的设计在于MHCFcRPs的组成。MHCFcRPs包含CH2结构域和CH3结构域。然而，所有有助于MHCFcRPs特定组成的突变都位于CH3结构域中。因此，可以用其它不同的结构域替换MHCFcRPs的CH2结构域以及相关重链的CH2结构域。这些必须仍然允许(或甚至支持)重链-MHCFcRP异二聚体化以产生“缺陷的”分子。

用其它能够异二聚化的结构域替换IgG类分子的CH2结构域的可能性，已经以TriFab形式证实(参见WO 2016/087416；图18)。由于CH2结构域分别交换为VH和VL，TriFabs会显示双特异性功能。这种分子的Fc样“茎区”通过完好的KiH CH3结构域结合在一起。因为KiH CH3结构域与MHCFcRP的修饰CH3结构域兼容，由此也使得可以产生具有允许交换的特征的、含MHCFcRP的2/3-BiFab类似物。

TriFabs可以具有功能性Fv替代Fc区的CH2结构域，其中一个CH2结构域被VH结构域替换而另一个被互补VL结构域替换。2/3-BiFab衍生物可以包含MHCFcRP，所述MHCFcRP具有不相关的，即非关联的VH或VL结构域(在之前的CH2位置上)，即这些结构域不结合靶标。2/3-BiFabs可以保留一个功能性单价结合臂，并在茎区中包含第三结合位点的一半(参见图18)。两个互补的2/3-BiFab分子的交换反应不仅重构了TriFab形式，还导致在“茎位置”上重构了额外的第三结合功能(CH2替换)。因此，交换反应将两种2/3-BiFab前体药物转换为全功能的TriFabs。

消除上述2/3-IgG的Fc-Fc链间二硫键(铰链区和CH3结构域)，可允许MHCFcRP驱动的交换反应，而无需受控的还原和重新氧化。由此，这种分子的交换反应可以在生理条件下发生，尤其包括单个(单特异性)实体与靶细胞表面结合的条件。应用相同的原则，2/3-BiFabs可以在其功能Fab臂/功能结合位点结合后，在靶细胞上累积。如果两个互补的2/3-BiFabs(都携带结合失活的但彼此互补的茎Fvs)与同一细胞的表面结合，链交换反应直接在所述细胞的表面发生。这种交换在细胞上/原位/体内，即直接在细胞表面上于预期作用部位，产生全功能TriFab，所述TriFab直接在细胞表面，即在作用部位，具有至少双重甚至三重特异性。2/3-BiFab来源的前体药物的活化原则，将导致仅在以足够密度表达一种或多种靶抗原的细胞表面上产生结合功能。这使得只能在期望细胞上产生功能(包括，非常高的效力和/或潜在的PK或毒性问题)。

利用本发明的方法，可以使用低亲和力单特异性结合物直接在细胞上产生高亲和力亲合结合物，并同时激活治疗结合位点。

IV.用于本发明方法的多特异性分子

A)多聚体多肽

用于根据本发明的细胞上交换反应/方法的多聚体多肽定义如下

-包含第一多肽和第二多肽，其中每个多肽包含免疫球蛋白CH3结构域和非功能的部分结合位点，其中非功能的部分结合位点位于两多肽的CH3结构域的N端或C端；且其中至少一个多肽包含特异性结合细胞表面靶标的功能结合位点，优选结合非内化的细胞表面靶标，

-仅在一个CH3结构域中包含(干扰)突变，导致多聚体多肽相较于如下多肽是去稳定化的，其中所述多肽为除了在第二多肽中的所述突变外与所述去稳定的多聚体多肽相同的(多聚体)多肽，

-包含形成异二聚体所需的突变，以及

-所述第一和第二多肽之间不存在二硫键。

因此，本发明至少部分基于以下发现：在(异)多聚体多肽中添加单个(单侧、非配对)去稳定化(干扰)突变，足以促进与也包含单个(单侧、非配对)去稳定化(干扰)突变的第二(异)多聚体多肽进行多肽链交换，这是因为与起始(异)多聚体多肽相比，两种新形成的经交换的(异)多聚体多肽由于去稳定化突变在交换和重组后转变为吸引性突变而具有改善的稳定性(即更低的CH3-CH3结合自由能)。唯一必须遵循的条件是，将去稳定化(干扰)突变引入在相应多肽相互结合时可以彼此发生相互作用的位置。

该方法可应用于符合上述标准的任何(异)多聚体多肽。

因此，根据本发明方法中使用的多聚体多肽可以包含其它结构域或多肽。

在一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽在第一和第二多肽中，在CH3结构域的(直接)N端或(直接)C端，还包含免疫球蛋白CH2结构域。在一个优选实施方案中，该额外的免疫球蛋白CH2结构域在CH3结构域的N端。

在一个实施方案中，多聚体多肽包含铰链区和C226S和C229S突变、或没有CPXC(SEQ ID NO:95)序列的铰链区(根据Kabat EU索引进行编号)、或无铰链区。

产生(异)多聚体多肽的不同方法为本领域所知。这些方法中的任何一种都可以使用，只要形成起始(异)多聚体多肽所需的突变不干扰或重叠于根据本发明的交换反应所需的(干扰)去稳定化突变。

因此，本发明至少部分基于以下发现：为了执行根据本发明的方法，在一对CH3结构域的一个CH3结构域中引入单个去稳定化突变就足够了。更详细地讲，已经发现，在第一起始(异)多聚体多肽的仅一个CH3结构域中在357位引入第一去稳定化突变，并在第二起始多肽的仅一个CH3结构域中在370位引入第二去稳定化突变，可以在两个起始(异)多聚体多肽空间接近时促进这些起始多肽之间多肽链的自发交换。由此产生的经交换的多肽之一包含CH3结构域对，其在357和370位上分别具有突变，从而导致该经交换的(异)多聚体的稳定化。类似情况可以通过356和439位上的突变来实现。所有位置的编号均根据Kabat的EU索引进行。一对优选的突变是E357K和K370E。另一对优选的突变是D356K和K439E。根据本发明的方法可应用于任何IgG亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，因为这些所述残基是高度保守的。在一个优选实施方案中，CH3结构域属于IgG1亚类。

在一个实施方案中，多聚体多肽包含

-第一多肽，其包含

i)从N端至C端方向，a)选自特异地与第一靶标结合的一对抗体轻链可变域和重链可变域的第一抗体可变域，和b)第一人免疫球蛋白G CH3结构域，

其中第一CH3结构域包含

a)T366W突变，或

b)T366S/L368A/Y407V突变，

和

ii)特异地与第二靶标结合的一对抗体轻链可变域和重链可变域，位于第一抗体可变域的N端或第一CH3结构域的C端

-第二多肽，其包含

i)从N端至C端方向，a)选自特异地与第三靶标结合的一对抗体轻链可变域和重链可变域的第二抗体可变域，其，和b)第二人免疫球蛋白G CH3结构域，

以及

其中第二CH3结构域包含

a)T366S/L368A/Y407V突变，如果第一CH3结构域包含T366W突变，或

b)T366W突变，如果第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变，

以及

其中第二CH3结构域包含干扰突变，所述突变选自D356K、E357K、K370E和K439E，由此，第一CH3结构域包含

a)第439位的氨基酸残基K，如果干扰突变是D356K，或

b)第370位的氨基酸残基K，如果干扰突变是E357K，或

c)第357位的氨基酸残基E，如果干扰突变是K370E，或

d)第356位的氨基酸残基D，如果干扰突变是K439E，

和

ii)可选地，特异地与第二或第四靶标结合的一对抗体轻链可变域和重链可变域，位于第二抗体可变域的N端或第二CH3结构域的C端，

在此所有编号均根据Kabat EU索引进行。

在一个实施方案中，多聚体多肽包含

-第一多肽，其包含

i)从N端至C端方向，a)第一人免疫球蛋白G CH3结构域，和b)选自特异地与第一靶标结合的一对抗体轻链可变域和重链可变域的第一抗体可变域，

其中第一CH3结构域包含

a)T366W突变，或

b)T366S/L368A/Y407V突变，

和

ii)特异地与第二靶标结合的一对抗体轻链可变域和重链可变域，位于第一CH3结构域的N端或第一可变域的C端，

-第二多肽，其包含

以及

其中第二CH3结构域包含

a)T366S/L368A/Y407V突变，如果第一CH3结构域包含T366W突变，或

b)T366W突变，如果第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变，

以及

a)第439位的氨基酸残基K，如果干扰突变是D356K，或

b)第370位的氨基酸残基K，如果干扰突变是E357K，或

c)第357位的氨基酸残基E，如果干扰突变是K370E，或

d)第356位的氨基酸残基D，如果干扰突变是K439E，

和

ii)可选地，特异地与第二或第四靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，位于第二CH3结构域的N端或第二可变域的C端，

在此所有编号均根据Kabat EU索引进行。

在本发明所有方面的一个实施方案中，第一多肽和第二多肽是非共价二聚体。

在本发明所有方面的一个实施方案中，第一可变域和第二可变域形成非功能结合位点。

在本发明所有方面的一个实施方案中，第一和第二多肽各包含氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)或DKTHT(SEQ ID NO:94)或GGGS(SEQ ID NO:69)或DKTHGGGGS(SEQ ID NO:97)，位于第一和第二可变域的N端。

在本发明所有方面的一个实施方案中

i)第一CH3结构域包含T366W突变和439位的氨基酸残基K，

以及第二CH3结构域包含D356K干扰突变和T366S/L368A/Y407V突变，或

ii)第一CH3结构域包含T366W突变和370位的氨基酸残基K，

以及第二CH3结构域包含E357K干扰突变和T366S/L368A/Y407V突变，或

iii)第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变和357位的氨基酸残基E，

以及第二CH3结构域包含K370E干扰突变和T366W突变，或

iv)第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变和356位的氨基酸残基D，

以及第二CH3结构域包含K439E干扰突变和T366W突变。

在本发明所有方面的一个实施方案中，第一、第二和第三靶标是不同的。

在本发明所有方面的一个实施方案中，第一靶标或第三靶标是人CD3。

在所有方面的一个实施方案中，第二和第四靶标(如果存在的话)是相同的或不同的，且均位于相同(靶)细胞的表面。

在本发明所有方面的一个实施方案中，与第二靶标特异性结合的述抗体轻链和重链可变域对选自Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、CrossFab、双特异性Fab、sdAb和VHH。

在本发明所有方面的一个实施方案中，与第四靶标特异性结合的抗体轻链和重链可变域对，独立于与第二靶标特异性结合的抗体轻链可变域和抗体重链可变域对，选自Fv、scFc、Fab、scFab、dsscFab、CrossFab、双特异性Fab、sdAb和VHH。

在本发明所有方面的一个实施方案中，第一和第二多肽还包含免疫球蛋白G CH2结构域，位于CH3结构域的N端。

在本发明所有方面的一个实施方案中，人免疫球蛋白G是人IgG1或人IgG2或IgG3或人IgG4。

B)用于本发明方法的组合物

可以用包含根据本发明的两种多聚体分子的组合物执行的细胞上交换反应/方法包括以下步骤

-使第一(起始)多聚体多肽(其包含第一多肽和第二多肽)和第二(起始)多聚体多肽(其包含第三多肽和第四多肽)在细胞表面靠近，由此第二和第三多肽交叉交换以形成第三多聚体多肽和第四多聚体多肽，

其中

i)第二多肽包含(第一干扰)突变，导致第一多聚体多肽，相较于除了第二多肽中所述突变以外与所述第一多聚体多肽相同的(多聚体)多肽，是去稳定的，

ii)第三多肽包含(第二干扰)突变，导致第二多聚体多肽，相较于除了第三多肽中所述突变以外与所述第二多聚体多肽相同的(多聚体)多肽，是去稳定的，

iii)第二多肽中的(第一干扰)突变和第三多肽中的(第二干扰)突变导致，相较于第一(起始)多聚体多肽和/或第二(起始)多聚体多肽，包含所述第二多肽和所述第三多肽的第三(经交换的)多聚体多肽的稳定化，

iv)相较于第一(起始)多聚体多肽和/或第二(起始)多聚体多肽，第四(经交换的)多聚体多肽是稳定的，

v)第一多聚体多肽和第二多聚体多肽每个只包含无功能(即不能与其靶标结合)的一个或两个新结合位点的一部分，和

vi)第三和/或第四多聚体多肽包含功能形式的该一个或两个新的结合位点，即，允许与相应靶标特异性结合的形式，其中这些功能形式的结合位点已经通过如下方式生成/激活：在第一多聚体多肽和第二多聚体多肽之间进行多肽交换，即将所述一个或两个新结合位点的非功能部分聚在一起以形成一个或两个新的功能性结合位点。

本发明的一个方面是组合物，所述组合物包含根据本发明的第一多聚体多肽和根据本发明的第二条多聚体多肽，其中

第一多聚体多肽的第一CH3结构域和第二条多聚体多肽的第二CH3结构域包含T366W突变或T366S/L368A/Y407V突变，

和

第一多聚体多肽的第二CH3结构域包含D356K突变，第二条多聚体多肽的第二CH3结构域包含K439E突变，

或

第一多聚体多肽的第二CH3结构域包含E357K突变，第二条多聚体多肽的第二CH3结构域包含K370E突变，

和

第一多聚体多肽的第一抗体可变域和第二多聚体多肽的第一抗体可变域是与第一靶标特异性结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，

以及

第一多聚体多肽的第二抗体可变域和第二多聚体多肽的第二抗体可变域是与第三靶标特异性结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域

和

第二和第四靶标彼此独立地为细胞表面抗原。

在本发明所有方面的一个实施方案中，第一和/或第三靶标是人CD3。

在本发明所有方面的一个实施方案中，组合物是药用组合物，并还包含药学可接受的辅料。

在本发明所有方面的一个实施方案中，组合物用作药物。

C)Fc区变体

在某些实施方案中，根据本发明，可将一种或多种另外的氨基酸修改引入多聚体多肽的Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修改(例如替换)。

在某些实施方案中，本发明考虑根据本发明的变体多聚体多肽，其具有某些但并非全部效应子功能，这使得它对于体内半衰期重要但某些效应子功能(如补体和ADCC)不必要或有害的应用来说，是期望候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的减少/缺乏。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保根据本发明的多聚体多肽缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞则表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概述于Ravetch，J.V.和Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页的表3中。评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限定性实例描述于US 5,500,362(参见，例如Hellstrom，I.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。或者，可以使用非放射性检测方法(参见，例如用于流式细胞测定的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)和CytoTox

非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者，或另外，可在体内评估目标分子的ADCC活性，例如在Clynes,R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(1998)652-656中公开的动物模型中。也可以进行C1q结合测定，以确认抗体因无法结合C1q而缺乏CDC活性(参见，例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA)。为了评估补体活化，可以进行CDC测定(参见，例如Gazzano-Santoro,H.等,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等,Blood 101(2003)1045-1052；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如S.B.等,Int.Immunol.18(2006:1759-1769)。

根据本发明的包含具有降低的效应子功能的Fc区的多聚体多肽包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329之一个或多个的替换的多聚体多肽(US 6,737,056)。此类Fc区突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或两个以上处具有替换的Fc区突变体，包含所谓的“DANA”Fc区突变体，其具残基265和297到丙氨酸的替换(US 7,332,581)。

根据本发明的某些多聚体多肽包含对FcRs的结合改进了或降低了的Fc区变体(参见，例如US 6,737,056；WO 2004/056312和Shields,R.L.等,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。

在某些实施方案中，根据本发明的多聚体多肽包含Fc区变体，该变体具有可改进ADCC的一个或多个氨基酸替换，例如Fc区298、333和/或334位(残基的EU编号)上的替换。

在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)发生变化(即改进或降低)，例如，如US 6,194,551、WO 99/51642和Idusogie,E.E.等,J.Immunol.164(2000)4178-4184中描述的。

具有增加的半衰期和对新生儿Fc受体(FcRn)(该受体负责将母体IgG转移到胎儿(Guyer,R.L.等,J.Immunol.117(1976)587-593,和Kim,J.K.等,J.Immunol.24(1994)2429-2434))改进的结合的抗体描述于US 2005/0014934中。这些抗体包含其中具有一个或多个替换的Fc区，从而改进了Fc区与FcRn的结合。此类Fc区变体包括那些在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434之一个或多个上具有替换，例如Fc区残基434替换，的变体(US 7,371,826)。

关于Fc区变体的其它示例另见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；和WO 94/29351。

在所有方面的一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽包含(所有位置均根据Kabat的EU索引)

i)在两个Fc区多肽中具有P329G、L234A和L235A突变的人IgG1亚类的Fc区，或

ii)在两个Fc区多肽中具有P329G、S228P和L235E突变的人IgG4亚类的Fc区，或

iii)在两个Fc区多肽中具有P329G、L234A、L235A、I253A、H310A和H435A突变、或在两个Fc区多肽中具有P329G、L234A、L235A、H310A、H433A和Y436A突变的人IgG1亚类的Fc区，或

iv)人IgG1亚类的异二聚体Fc区，其中两个Fc区多肽包含P329G、L234A和L235A突变，且

a)一个Fc区多肽包含T366W突变，另一个Fc区多肽包含T366S、L368A和Y407V突变，或

b)一个Fc区多肽包含T366W和Y349C突变，另一个Fc区多肽包含T366S、L368A、Y407V和S354C突变，或

c)一个Fc区多肽包含T366W和S354C突变，另一个Fc区多肽包含T366S、L368A、Y407V和Y349C突变，

或

v)人IgG4亚类的异二聚体Fc区，其中两个Fc区多肽包含P329G、S228P和L235E突变，且

或

vi)i)、ii)和iii)之一与iv)和v)之一的组合。

在本文报告的所有方面的一个实施方案中，包含CH3结构域的根据本发明多聚体多肽包含额外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引进行编号)。在本文报告的所有方面的一个实施方案中，包含CH3结构域的根据本发明多聚体多肽包含额外的C端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引进行编号)。

根据本发明的多聚体多肽在一个实施方案中包含这样的Fc区，其是人IgG1亚类，具有PVA236、L234A/L235A突变和/或GLPSS331(根据Kabat EU索引进行编号)，或是IgG4亚类。在另一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽具有如下特征：包含任何IgG类别的Fc区，在一个实施方案中IgG1或IgG4亚类，在E233、L234、L235、G236、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331和/或P329中包含至少一个突变(根据Kabat的EU索引进行编号)。在一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽包含人IgG4亚类的Fc区，含有S228P突变、或S228P和L235E突变(Angal,S.等,Mol.Immunol.30(1993)105-108)(根据Kabat的EU索引进行编号)。

包含在根据本发明的多聚体多肽中的Fc区多肽的C端可以是以氨基酸残基PGK结尾的完整的C端。C端可以是缩短的C端，其中一个或两个C端氨基酸残基已被缺失。在一个优选实施方案中，C端是以氨基酸残基PG结尾的缩短C端。

D)异二聚体化

几种用于支持异二聚体化的CH3修饰方法已描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中，在此通过引用的方式并入。

通常，在本领域已知的方法中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域以互补方式工程化改造，因此，包含一个工程改造的CH3结构域的重链不再与相同结构的另一重链同源二聚体化(例如CH3工程改造的第一重链不再能与另一CH3工程改造的第一重链同源二聚体化；CH3工程改造的第二重链不再能与另一CH3工程改造的第二重链同源二聚体化)。由此，包含一个工程改造的CH3结构域的重链将与包含以互补方式工程改造的CH3结构域的另一重链异源二聚体化。对于本实施方案，第一重链Fc区多肽的CH3结构域和第二条重链Fc区多肽的CH3结构域通过氨基酸替换以互补的方式改造，使得第一重链Fc区多肽和第二重链Fc区多肽可以异二聚体化，而第一重链Fc区多肽和第二重链Fc区多肽不再同源二聚体化(例如，由于空间位阻的原因)。

上文所列举并列入的用于支持重链异二聚体化的本领域已知的不同方法，可以考虑用作不同的备选方案，用于提供本文报告的异二聚体/多聚体多肽(例如2/3-IgG)。

根据本发明的多聚体多肽的CH3结构域可以通过“杵入臼”技术进行改变，所述技术以几个实例详细描述于例如WO 96/027011,Ridgway,J.B.等,Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant,A.M.等,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中。在此方法中，两个CH3结构域的相互作用表面被改变，以增加包含这两个CH3结构域的两个重链Fc区多肽的异二聚体化。(两个重链Fc区多肽的)两个CH3结构域的每一个都可以是“杵”，而另一个是“臼”。可另外引入二硫键，以进一步稳定异二聚体(Merchant，A.M.等，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)和在根据本发明的交换反应中增加产量。

在一个优选实施方案中，根据本发明的多聚体多肽在“杵链”的CH3结构域中包含T366W突变，在“臼链”的CH3结构域中包含T366S、L368A、Y407V突变(根据Kabat EU索引进行编号)。还可以使用CH3结构域之间额外的链间二硫桥(Merchant,A.M.等,NatureBiotech.16(1998)677-681)，例如通过在杵链的一个CH3结构域中引入Y349C突变，在臼链的一个CH3结构域中引入E356C突变或S354C突变(在根据本发明的交换反应中，两个多聚体用作起始材料，所述多聚体的仅其中一个CH3结构域包含该额外的半胱氨酸残基，由此只有在经交换的产物中可以形成该额外的二硫键)。因此，在另一优选实施方案中，根据本发明的多聚体多肽在第一多聚体的一个CH3结构域中包含Y349C和T366W突变，在第二多聚体的相应互补CH3结构域中包含E356C、T366S、L368A和Y407V突变；或根据本发明的多聚体多肽在第一多聚体的一个CH3结构域中包含Y349C和T366W突变，在第二多聚体的相应互补CH3结构域中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变(一个CH3结构域中的额外Y349C突变和相应的CH3结构域中的额外E356C或S354C突变形成链间二硫桥)(根据Kabat EU索引进行编号)。

但是，也可以备选地或额外地使用如EP 1 870 459A1中描述的其它杵入臼技术。在一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽在“杵链”的CH3结构域中包含R409D和K370E突变，和在“臼链”的CH3结构域中包含D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引进行编号)。

在一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽在“杵链”的CH3结构域中包含T366W突变，和在“臼链”的CH3结构域中包含T366S、L368A和Y407V突变，以及另外地在“杵链”的CH3结构域中包含R409D和K370E突变，和在“臼链”的CH3结构域中包含D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引进行编号)。

在一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽在其中一个CH3结构域中包含Y349C和T366W突变，在互补CH3结构域中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变；或根据本发明的多聚体多肽在其中一个CH3结构域中包含Y349C和T366W突变，在互补CH3结构域中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变，并且此外，在“杵链”的CH3结构域中包含R409D和K370E突变，在“臼链”的CH3结构域中包含D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引进行编号)。

除了“杵入臼技术”外，其它可以修饰根据本发明的多聚体多肽的重链CH3结构域以实现异二聚体化的技术在本领域已知。这些技术，尤其是在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的技术，可以考虑与根据本发明的多聚体多肽相结合，作为“杵入臼技术”的替代。

在根据本发明的多聚体多肽的一个实施方案中，EP 1 870 459A1中描述的方法用于支持根据本发明的多聚体多肽的第一重链和第二重链的异二聚体化。这种方法基于在第一和第二重链之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置上引入具有相反电荷的带电荷氨基酸。

因此，该实施方案涉及根据本发明的多聚体多肽，其中在多聚体三级结构中，第一重链Fc区多肽的CH3结构域和第二重链Fc区多肽的CH3结构域形成一个界面，该界面位于相应CH3结构域之间，其中第一重链Fc区多肽的CH3结构域和第二重链Fc区多肽的CH3结构域的氨基酸序列分别包含一组氨基酸，这些氨基酸在根据本发明方法的多聚体多肽的三级结构中位于所述界面内，其中从一个重链Fc区多肽的CH3结构域中位于界面的该组氨基酸中，将第一氨基酸替换为带正电荷的氨基酸，并从另一重链Fc区多肽的CH3结构域中位于界面的该组氨基酸中，将第二氨基酸替换为带负电荷的氨基酸。根据此实施方案的多聚体多肽在本文也称为“CH3(+/-)工程化多聚体多肽”(其中缩写“+/-”代表在相应的CH3结构域中引入的带相反电荷的氨基酸)。

在根据本发明的所述CH3(+/-)工程化多聚体多肽的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K、R和H，带负电荷的氨基酸选自E或D。

在根据本发明的所述CH3(+/-)工程化多聚体多肽的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K和R，带负电荷的氨基酸选自E或D。

在根据本发明的所述CH3(+/-)工程化多聚体多肽的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸为K，带负电荷的氨基酸为E。

在本文报告的所述CH3(+/-)工程化2/3IgG的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，第409位的氨基酸R被D替换，第370位的氨基酸K被E替换，以及在另一重链的CH3结构域中，第399位的氨基酸D被K替换，第357位的氨基酸E被K替换(根据Kabat EU索引进行编号)。

在根据本发明的多聚体多肽的一个实施方案中，WO 2013/157953中描述的方法用于支持多聚体多肽的第一重链Fc区多肽和第二重链Fc区多肽的异二聚体化。在根据本发明的多聚体多肽的一个实施方案中，在一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第366位的氨基酸T被K替换，以及在另一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第351位的氨基酸L被D替换(根据Kabat EU索引进行编号)。在根据本发明的多聚体多肽的另一个实施方案中，在一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第366位的氨基酸T被K替换，第351位的氨基酸L被K替换，以及在另一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第351位的氨基酸L被D替换(根据Kabat EU索引进行编号)。

在根据本发明的多聚体多肽的另一个实施方案中，在一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第366位的氨基酸T被K替换，第351位的氨基酸L被K替换，在另一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第351位的氨基酸L被D替换(根据Kabat EU索引进行编号)。此外，以下替换中的至少一个被包含于另一个重链Fc区多肽的CH3结构域中：第349位的氨基酸Y被E替换，第349位的氨基酸Y被D替换，第368位的氨基酸L被E替换(根据Kabat EU索引进行编号)。在一个实施方案中，第368位的氨基酸L被E替换(根据Kabat EU索引进行编号)。

在根据本发明的多聚体多肽的一个实施方案中，WO 2012/058768中描述的方法用于支持根据本发明的多聚体多肽的第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的异二聚体化。在所述根据本发明的多聚体多肽的一个实施方案中，在一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第351位的氨基酸L被Y替换，第407位的氨基酸Y被A替换，在另一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第366位的氨基酸T被A替换，第409位的氨基酸K由F替换(根据Kabat EU索引进行编号)。在另一个实施方案中，除了上述替换外，在另一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，还在位置411(原为T)、399(原为D)、400(原为S)、405(原为F)、390(原为N)和392(原为K)具有至少一个氨基酸替换(根据Kabat EU索引进行编号)。优选的替换是：

-用选自N、R、Q、K、D、E和W的氨基酸替换第411位的氨基酸T(根据Kabat EU索引进行编号)，

-用选自R、W、Y和K的氨基酸替换第399位的氨基酸D(根据Kabat EU索引进行编号)，

-用选自E、D、R和K的氨基酸替换第400位的氨基酸S(根据Kabat EU索引进行编号)，

-用选自I、M、T、S、V和W的氨基酸替换第405位的氨基酸F(根据Kabat EU索引进行编号)，

-用选自R、K和D的氨基酸替换第390位的氨基酸N(根据Kabat EU索引进行编号)，以及

-用选自V、M、R、L、F和E的氨基酸替换第392位的氨基酸K(根据Kabat EU索引进行编号)。

在根据本发明的多聚体多肽的另一个实施方案中(根据WO 2012/058768进行工程改造)，在一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第351位的氨基酸L被Y替换，第407位的氨基酸Y被A替换，在另一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第366位的氨基酸T被V替换，第409位的氨基酸K被F替换(根据Kabat EU索引进行编号)。在根据本发明多聚体多肽的另一个实施方案中，在一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第407位的氨基酸Y被A替换，在另一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第366位的氨基酸T被A替换，第409位的氨基酸K被F替换(根据KabatEU索引进行编号)。在所述上一个实施方案中，在所述述另一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第392位的氨基酸K被E替换，第411位的氨基酸T被E替换，第399位的氨基酸D被R替换，第400位的氨基酸S被R替换(根据Kabat EU索引进行编号)。

在根据本发明的多聚体多肽的一个实施方案中，WO 2011/143545中描述的方法用于支持根据本发明的多聚体多肽的第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的异二聚体化。在本根据发明的所述多聚体多肽的一个实施方案中，在两个重链Fc区多肽的CH3结构域中于第368和/或409位引入氨基酸改变(根据Kabat EU索引进行编号)。

在根据本发明的多聚体多肽的一个实施方案中，WO 2011/090762中描述的方法用于支持根据本发明的多聚体多肽的第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的异二聚体化。WO 2011/090762与基于“杵入臼”技术的氨基酸修饰相关。在根据本发明的所述CH3(KiH)工程化多聚体多肽的一个实施方案中，在一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第366位的氨基酸T被W替换，在另一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第407位的氨基酸Y被A替换(根据Kabat EU索引进行编号)。在根据本发明的所述CH3(KiH)工程化多聚体多肽的一个实施方案中，在一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第366位的氨基酸T被Y替换，在另一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第407位的氨基酸Y被T替换(根据Kabat EU索引进行编号)。

在根据本发明的IgG2同种型的多聚体多肽的一个实施方案中，WO 2011/090762中描述的方法用于支持根据本发明的多聚体多肽的第一重链Fc区多肽和第二重链Fc区多肽的异二聚体化。

在根据本发明的多聚体多肽的一个实施方案中，WO 2007/147901中描述的方法用于支持根据本发明的多聚体多肽的第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的异二聚体化。在根据本发明的所述多聚体多肽的一个实施方案中，在一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第253位的氨基酸K被E替换，第282位的氨基酸D被K替换，第322位的氨基酸K被D替换，在另一个重链Fc区多肽的CH3结构域中，第239位的氨基酸D被K替换，第240位的氨基酸E被K替换，第292位的氨基酸K被D替换(根据Kabat EU索引进行编号)。

在根据本发明的多聚体多肽的一个实施方案中，WO 2007/110205中描述的方法用于支持根据本发明的多聚体多肽的第一多肽和第二多肽的异二聚体化。

在本文报告的所有方面的一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽具有IgG型抗体的恒定域结构。在本文报告的所有方面的另一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽的特点是所述多聚体多肽包含人IgG1亚类的Fc区，或具有L234A和L235A和可选地P329G突变的人IgG1亚类的Fc区。在本文报告的所有方面的另一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽的特点是所述多聚体多肽包含人IgG2亚类的Fc区。在本文报告的所有方面的另一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽的特点是所述多聚体多肽包含人IgG3亚类的Fc区。在本文报告的所有方面的另一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽的特点是所述多聚体多肽包含人IgG4亚类的Fc区，或者具有额外的S228P和L235E和可选地P329G突变的人IgG4亚类的Fc区。

在所有方面的一个实施方案中，根据本发明的多聚体多肽包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽，其中

a)第一和第二Fc区多肽包含Y436A突变，或

ii)第一和第二Fc区多肽包含I253A、H310A和H435A突变，或

iii)第一和第二Fc区多肽包含H310A、H433A和Y436A突变，或

iv)第一和第二Fc区多肽包含L251D、L314D和L432D突变，或

v)第一Fc区多肽包含Y436A突变，第二Fc区多肽包含

a)I253A、H310A和H435A突变，或

b)H310A、H433A和Y436A突变，或

c)L251D、L314D和L432D突变，

或

vi)第一Fc区多肽包含I253A、H310A和H435A突变，第二Fc区多肽包含

a)H310A、H433A和Y436A突变，或

b)L251D、L314D和L432D突变，

或

vii)第一Fc区多肽包含H310A、H433A和Y436A突变，第二Fc区多肽包含

a)L251D、L314D和L432D突变。

V.重组方法和组合物

抗体可以使用重组方法和组合物生产，例如，如美国US 4,816,567中所描述。在一个实施方案中，提供了编码无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的分离的核酸。在进一个实施方案中，提供了一个或多个包含此类核酸的载体(例如表达载体)。在进一个实施方案中，提供了一个包含这种核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如人胚肾(HEK)细胞，或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp2/0细胞)。在一个实施方案中，提供了制备无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的方法，其中该方法包括：在适合抗体表达的条件下，培养上面提供的包含编码无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的核酸的宿主细胞，以及可选地从宿主细胞(或宿主细胞培养物)中回收无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab。

为了重组生产无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab，分离例如上文所述的编码无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的核酸，并将其插入到一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。

适合克隆或表达无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab编码载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。

例如，可以在细菌中生产抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。有关在细菌中表达抗体片段和多肽，参见US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(另见Charlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(编辑),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),第245-254页，其中描述了在大肠杆菌中表达抗体片段)。表达后，可从细菌细胞糊状物分离可溶性级分中的抗体，并可进一步纯化。

除原核生物外，真核微生物(例如丝状真菌或酵母)是无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab编码载体的适合克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的真菌和酵母菌株，所述人源化导致产生具有部分或全部人糖基化模式的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等,Nat.Biotech.24(2006)210-215。

用于表达糖基化的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的适合宿主细胞也来自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出许多可与昆虫细胞结合使用的杆状病毒株，特别地是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。

脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，可以使用适应悬浮生长的哺乳动物细胞系。其它有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括：经SV40(COS-7)转化的猴肾CV1细胞系；人胚胎肾细胞系(293或293细胞系，描述于例如Graham,F.L.等,J.Gen Virol.36(1977)59-74中)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather,J.P.等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中描述)；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR^-CHO细胞(Urlaub,G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，例如Y0，NS0和Sp2/0。关于某些适合抗体生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编辑),Humana出版社,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。

VI.诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，任何本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab均可用于检测生物样品中其靶标的存在。本文使用的术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样本包括细胞或组织。

在一个实施方案中，提供了无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab用于诊断或检测方法。

在某些实施方案中，提供了标记的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab。标记包括但不限于，可以直接检测的标记物或结构部分(例如荧光的、发色团的、电子致密的、化学发光的和放射性的标记物)，以及被间接检测的结构部分，例如酶或配体，例如通过酶反应或分子相互作用检测。示例性标记包含但不限于：放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³1I；荧光团，如稀土螯合物或荧光素及其衍生物；若丹明及其衍生物；丹酰；伞形酮；萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(US 4,737,456)；荧光素；2,3-二氢酞嗪二酮(2,3-dihydrophthalazinediones)；辣根氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡萄糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶；与利用过氧化氢氧化染料前体的酶偶联，例如HRP，乳过氧化物酶或微过氧化物酶；生物素/亲和素；自旋标记物；噬菌体标记；稳定自由基等等。

VII.免疫缀合物

本发明还提供免疫缀合物，其包含如本文报告的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab与缀合的一种或多种细胞毒性剂，所述细胞毒性剂例如化疗剂或药物，生长抑制剂，毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素。

在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab与一种或多种药物缀合，所述药物包括但不限于：美登素类化合物(maytansinoid)(参见US 5,208,020；US 5,416,064和EP 0425 235 B1)；澳瑞他汀(auristatin)，例如单甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US 5,635,483；US 5,780,588和US 7,498,298)；多拉斯他丁(dolastatin)；卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见US 5,712,374；US 5,714,586；US 5,739,116；US 5,767,285；US 5,770,701；US 5,770,710；US 5,773,001和US 5,877,296；Hinman，L.M.等，Cancer Res.53(1993)3336-3342；和Lode，H.N.等,Cancer Res.58(1998)2925-2928)；蒽环霉素(anthracycline)，例如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz,F.等,Curr.Med.Chem.13(2006)477-523；Jeffrey,S.C.等,Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358-362；Torgov,M.Y.等,Bioconjug.Chem.16(2005)717-721；Nagy,A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829-834；Dubowchik，G.M.等，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12(2002)1529-1532；King,H.D.等,J.Med.Chem.45(200294336-4343；和US 6,630,579)；甲氨蝶呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷化合物(taxane)，例如多西他赛(docetaxel)，安素泰(paclitaxel)，larotaxel，tesetaxel和ortataxel；单端孢霉烯(trichothecene)以及CC1065。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包括如本文描述的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab与酶活性毒素或其片段缀合，所述毒素或其片段包括但不限：白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链(来自绿脓假单胞菌)，蓖麻毒素A链，相思豆毒素A链，蒴莲素A链，α帚曲霉素，油桐蛋白，香石竹毒蛋白，美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻疯树毒蛋白(curcin)，巴豆毒蛋白(crotin)，肥皂草抑制剂，多花白树毒蛋白(gelonin)，米托菌素(mitogellin)，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)，新霉素，和单端孢霉烯。参见，例如1993年10月28日发布的WO 93/21232。

在另一个实施方案中，免疫缀合物包括如本文所述的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab与放射性原子缀合形成放射性缀合物。各种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。示例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，其可以包含用于闪烁成像研究的放射性原子，例如TC^99m或I¹²³，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记物，例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可使用各种双官能偶联剂来制备无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab与细胞毒性剂的缀合物，所述偶联剂例如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯的双官能衍生物(如二甲基己二酸酯HCl)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛)，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta,E.S.等,Science 238(1987)1098-1104中所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三氨五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。见WO 94/11026。这种接头可是有利于细胞毒药物在细胞内释放的“可切开接头”。例如，可使用酸不稳定型接头，肽酶敏感型接头，光不稳定性接头，二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等,Cancer Res.52(1992)127-131；US 5,208,020)。

此处的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于使用交联剂制备的此类缀合物，所述交联剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB，以及SVSB(琥珀酰亚胺-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，这些产品可商业获取(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford,IL.,美国)。

如本文所报告的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab与一种或多种小分子毒素的缀合物也涵盖在本文中，所述小分子毒素例如卡奇霉素，美登素(US 5,208,020)，单端孢霉烯和CC1065。在本发明的一个实施方案中，无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab与一个或多个美登素分子缀合(例如，每个拮抗剂分子约1至10个美登素分子)。美登素(maytansine)可以例如转换为May-SS-Me，后还原为May-SH3，并与经过修饰的拮抗剂发生反应(Chari等Cancer Research 52:127-131(1992))，从而产生美登素样-抗体缀合物。

或者，如本文所报告的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab与一个或多个卡奇霉素分子缀合。卡奇霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度下引起双链DNA断裂。可利用的卡奇霉素的结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰-γ1I、PSAG和θI 1(Hinman等Cancer Research 53:3336-3342(1993)和Lode等CancerResearch 58:2925-2928(1998))。

本发明进一步涵盖了如本文所报道的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab与具有核溶解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶例如脱氧核糖核酸酶；DNase)缀合。

或者，可以例如通过重组技术或肽合成，制备包含如本文所报告的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab和细胞毒性剂的融合蛋白。

VIII.药物制剂

如本文所述的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab或包含两种不同无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物的药物制剂，可以通过将具有所需纯度的所述2/3-IgG(s)或2/3-BiFab(s)与一种或多种可选的药学可接受的载体(Remington′s Pharmaceutical Sciences,16thedition,Osol,A.(编辑)(1980))进行混合来制备，采取冻干制剂或水溶液的形式。药学可接受的载体在所使用的剂量和浓度下一般对受体无毒，所述载体包括但不限于：缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸等；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚；丁基醇或苯甲醇；烷基苯甲酸酯类，例如甲基或丙基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚(乙烯吡咯烷酮)；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖；二糖；和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖，例如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物(例如锌-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文示例性药学可接受的载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酶糖蛋白，例如rhuPH20(

Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGPs(包括rhuPH20)和使用方法描述于US 2005/0260186和US 2006/0104968中。在一个方面，sHASEGP与一个或多个额外的糖胺聚糖酶(如软骨素酶)结合使用。

示例性冻干抗体制剂描述于US 6,267,958中。水性抗体制剂包括在US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的，后者制剂包括组氨酸-醋酸盐缓冲液。

适于皮下施用的冻干制剂描述于WO 97/04801中。这种冻干制剂可以用适当的稀释剂重构为高蛋白质浓度，重构制剂可以皮下施用给有待治疗的哺乳动物。

根据所治疗的特定适应症的需要，本发明的制剂也可包含一种以上活性成分，优选那些具有互补活性且不会相互带来不利影响的活性成分。这样的活性成分适宜地以对预定目标有效的量存在于组合物中。

也可以将活性成分截留在通过例如凝聚技术或界面聚合制备的微囊，例如羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲脂)微囊中，胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米囊)中，或粗乳剂中。这种技术公开于Remington′sPharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.(编辑)(1980)中。

可以制备持续释放制备物。持续释放制备物的适合的实例包括，包含抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质处于有形物的形式，例如薄膜，或微囊。持续释放基质的实例包括聚酯；水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)；或聚(乙烯基醇))；聚交酯(US 3,773,919)；L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物；不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯；可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物，例如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

用于体内施用的制剂一般是无菌的。灭菌可以很容易实现，例如通过无菌过滤膜进行过滤。在一个实施方案中，制剂是等渗的。

IX.治疗方法和组合物

任何本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab，或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物均可用于治疗方法。

在一个方面，提供了无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物用作药物。在某些实施方案中，提供了无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物用于治疗方法中。根据上述任何实施方案“个体”优选是人。

在另一方面，本文提供了无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物用于生产或制备药物的用途。根据上述任何实施方案“个体”优选是人。

在另一个方面，本文提供了治疗疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括给患有疾病的个体施用有效量的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab，或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物。在一个此类实施方案中，该方法还包括向个体施用有效量的至少一种其他治疗剂，如下文所示。根据上述任何实施方案“个体”可以是人。

在另一方面，本文提供了包含如本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物的药物制剂例如用于上述任何治疗方法。在一个实施方案中，药物制剂包含任何本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物、和药学可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含任何本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物、和至少一种其他治疗剂，例如如下所述。

如本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物，可以在治疗中单独使用，或与其它药剂组合使用。例如，如本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物，可与至少一种其他治疗剂共施用。

上述这种组合治疗包括组合施用(其中两种或两种以上治疗剂包含在相同或分开的制剂中)、和分开施用，在这种情况下，如本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物的施用，可在其他治疗剂(一或多种)施用之前、同时和/或之后进行。如本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物也可与其它干预疗法组合使用。所述干预疗法例如但不限于放射疗法，行为疗法或其它在本领域中已知且适合于治疗或预防神经紊乱的疗法。

可以采用任何合适的手段施用如本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物(以及任何其他治疗剂)，这些手段包括胃肠外，肺内和鼻内施用，以及如果需要局部治疗，则进行病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹腔内或皮下施用。可以通过任何合适的途径给药，例如通过注射，如静脉注射或皮下注射，部分取决于施用是短时间的还是长时间的。本文考虑各种给药时间方案，包括但不限于，经多个时间点单次或多次施用、大浓度(bolus)施用、和脉冲输注。

将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用如本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物。在这方面考虑的因素包括正在治疗的特定疾病、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、药剂给送的部位、施用的方法、施用的时间表，以及医生已知的其它因素。如本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物，不必但可以选择性地与一种或多种目前用于预防或治疗相关疾病的药剂配制在一起。这些其它药剂的有效量取决于制剂中存在的治疗剂的量、病症或治疗的类型、以及上述讨论的其它因素。它们通常以相同的剂量使用和采用本文描述的施用途径，或以本文描述的剂量的约1至99％施用，或以任何剂量和通过经验/临床确定为适当的任何途径施用。

输送化合物穿过BBB的基于脂质的方法包括但不限于，将融合构建体或化合物包封在脂质体中，所述脂质体与结合BBB的血管内皮上受体的单价结合实体偶联(参见，例如US 2002/0025313)；以及在低密度脂蛋白颗粒上包被单价结合实体(参见，例如US 2004/0204354)、或载脂蛋白E(参见，例如US 2004/0131692)。

为预防或治疗疾病，如本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物(单独或与一种或多种其它额外治疗剂组合使用时)的合适剂量，将取决于要治疗的疾病类型，如本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物的类型，疾病的严重程度和进程，抗体是否为预防或治疗目的施用，以前的治疗，个体的临床病史和对抗体的反应，以及主治医生的判断。如本文提供的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物，适合一次性或在一系列治疗中给患者施用。取决于疾病的类型和严重程度，大约1微克/千克至15毫克/千克(例如0.5毫克/千克至10毫克/千克)抗体可以是给患者施用的初始候选剂量，例如通过一次或多次分开施用或通过持续输注。一个典型的日剂量可以是从约1微克/千克到100毫克/千克或更多，这取决于上述因素。对于几天或更长时间的重复施用，根据情况，治疗通常会持续，直到疾病症状发生期望的抑制。抗体的一个示范性剂量为约0.05毫克/千克至约10毫克/千克的范围。因此，可以给患者施用约0.5毫克/千克，2.0毫克/千克，4.0毫克/千克或10毫克/千克的一个或多个剂量(或其任何组合)。这种剂量可以间歇性施用，例如每周或每三周一次(例如，患者接受约2至20，或例如约6个剂量的抗体)。可以施用初始较高的负荷剂量，随后施用一个或多个较低剂量。然而，可以采用其它剂量方案。该治疗的进程可以容易地通过常规技术和测定来监测。

应理解的是，上述任何制剂或治疗方法都可以使用本文报告的免疫缀合物作为无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab、或包含两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或两种不同的无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物的替代或补充来执行。

将以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用如本文报告的包含无重链-重链间二硫键的2/3-IgG或无重链-重链间二硫键的2/3-BiFab的组合物。在这方面考虑的因素包括正在治疗的特定疾病、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、药剂给送的部位、施用的方法、施用的时间表，以及医生已知的其它因素。待施用的治疗有效量将由这些因素决定。

然而，如上所述，可以对这些建议的施用量进行各种治疗上的判断。在适当剂量和时间表的选择上，关键的因素是所获得的结果，如上所述。例如，对于持续的和急性疾病的治疗，可能最初需要相对较高的剂量。为了获得最有效的结果，根据不同的疾病或病症，拮抗剂可以尽可能靠近疾病或病症的第一次迹象、诊断、表现或发生时施用，或在疾病或病症的缓解期间施用。

用于将其他治疗剂与抗体缀合的一般技术已是熟知的(参见，例如Arnon等，"Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy"，于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Reisfeld等编辑,第243至256页(AlanR.Liss,Inc.1985)中；Hellstrom等,"Antibodies For Drug Delivery",于ControlledDrug Delivery(第2版),Robinson等编辑,第623至653页(Marcel Dekker,Inc.1987)中；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",于Monoclonal Antibodies′84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等编辑，第475至506页(1985)；和Thorpe等,"The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.,62(1982)119-58)。

X.制造品

在本文报告的另一个方面，提供了包含用于治疗、预防和/或诊断疾病的上述材料的制造品。制造品包含容器和插在容器上或与容器关联的标签或包装。合适的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器、IV型输液袋等。容器可由各种材料(例如玻璃或塑料)制造。容器容纳有单独或与可有效治疗、预防和/或诊断病情的另一种组合物组合的组合物，并可具有无菌入口(例如，容器可是静脉输液袋或具有可用皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本文所报告的抗体。标签或包装插入物指示组合物用于治疗所选的病症。此外，制造品可包含：(a)第一内含组合物的容器，其中组合物包含本文报告的抗体；(b)内含组合物的第二容器，其中组合物包含其他细胞毒性剂或其它治疗剂。该实施方案中的制造品可进一步包含包装插入件，其指示组合物可用于治疗特定的病情。或者，或另外，制造品可进一步包含第二(或第三)容器，该容器装有药学可接受的缓冲液，如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏液和葡萄糖液。它还可进一步包含从商业和用户角度需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

应理解的是，任何上述制造品可包括本文报告的免疫缀合物作为本文报告的双特异性抗体的替代或补充。

XI.本发明的具体实施方案

第1组：

1.包含第一多肽和第二多肽的多聚体2/3-BiFab多肽

其中两个多肽均包含氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)、抗体可变域和人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域，

其中i)如果第二多肽的可变域是轻链可变域，则第一多肽的可变域是重链可变域，或ii)如果第二多肽的可变域是重链可变域，则第一多肽的可变域是轻链可变域，

其中i)第一多肽的CH3结构域包含杵突变，第二多肽的CH3结构域包含臼突变，或ii)第一多肽的CH3结构域包含臼突变，第二多肽的CH3结构域包含杵突变，

其中第一多肽包含至少一个功能结合位点或至少部分的结合位点

其中第二多肽在CH3结构域中包含至少一个干扰突变，由此，第一多肽在其氨基酸序列(CH3结构域)中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)，

其中第一多肽和第二多肽是非共价二聚体，

其中第一多肽的可变域与第二多肽的可变域形成非功能结合位点。

2.根据实施方案1的多聚体2/3-BiFab多肽，其中第一多肽选自这样的多肽，其以N至C端方向包含：

i)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，和源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，

ii)SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二重链可变域，和人IgG1 CH1结构域，

iii)SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人IgG1 CH1结构域，和第二重链可变域，

viii)第二重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第三重链可变域，和第二人IgG1 CH1结构域，

ix)第二重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二人IgG1 CH1结构域，和第三重链可变域，

x)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，和scFv，

xi)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，和scFab，

xii)第二重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二人IgG1 CH1结构域，和第二轻链可变域，

xiii)第二重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二轻链可变域，和第二人IgG1 CH1结构域，

xiv)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第三重链可变域，和人κ或λ轻链恒定域，或

xv)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人κ或λ轻链恒定域，和第三重链可变域，

和

第二多肽选自这样的多肽，其以N至C端方向包含：

其中CH3结构域包含干扰突变，所述突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T突变，由此第一多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白(CH3结构域)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)。

3.根据实施方案1至2之任一的多聚体2/3-BiFab多肽，其中多聚体多肽还包含第三多肽，所述第三多肽包含另外的轻链可变域和轻链恒定域，其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合。

4.组合物，其包含

第一异三聚体2/3-BiFab多肽，其包含

-第一多肽，选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

和

-第二多肽，选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

其中如果第一多肽包含臼突变，则CH3结构域包含杵突变，或如果第一多肽包含杵突变，则CH3结构域包含臼突变，

其中CH3结构域包含干扰突变，所述突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T突变，由此，第一多肽在其氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)，

和

-第三多肽，其包含另外的轻链可变域和轻链恒定域，其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，

以及

第二异三聚体2/3-BiFab多肽，其包含

-第一多肽，选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

其中该CH3结构域包含第二干扰突变，所述突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T突变，由此，第二多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)，

和

-第二多肽，选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

xiv)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第三重链可变域，和人IgG1κ或λ轻链恒定域，或

xv)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人IgG1κ或λ轻链恒定域，和第三重链可变域，

且如果第一多肽包含臼突变，则包含杵突变；或如果第一多肽包含杵突变，则包含臼突变，

其中i)如果第一异三聚体的第二多肽的可变域是轻链可变域，则该第二多肽的可变域是重链可变域，或ii)如果第一异三聚体的第二多肽的可变域是重链可变域，则该第二多肽的可变域是轻链可变域，

和

-第三多肽，其包含轻链可变域和轻链恒定域，其中此第六多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，

其中i)第一异三聚体的第一多肽的CH3结构域包含杵突变，第一异三聚体的第二多肽的CH3结构域包含臼突变，或ii)第一异三聚体的第一多肽的CH3结构域包含臼突变，第一异多聚体的第二多肽的CH3结构域包含杵突变，由此i)如果第一异三聚体的第一多肽包含臼突变，则第二异三聚体多肽的第二多肽包含杵突变，或ii)如果第一异三聚体的第一多肽包含杵突变，则第二异三聚体的第二多肽包含臼突变，

其中第一异三聚体的第二多肽和第二异三聚体多肽的第一多肽在不同位置上包含干扰突变，

其中第一异三聚体的第一多肽的可变域和第二异三聚体的第二多肽的可变域形成功能结合位点，第一异三聚体的第二多肽的可变域和第二异三聚体的第一多肽的可变域形成非功能可变域对。

5.包含第一多肽和第二多肽的多聚体2/3-IgG多肽

其中两个多肽均包含人免疫球蛋白CH3结构域

其中第二多肽在CH3结构域中包含至少一个干扰突变，由此，第一多肽在其氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(CH3结构域)野生型氨基酸残基(一个或多个)，

其中第一多肽和第二多肽是非共价或共价二聚体。

6.根据实施方案5的多聚体2/3-IgG多肽，其中第一多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

i)重链可变域，IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，

ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，重链可变域，和人IgG1 CH1结构域，

iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人IgG1 CH1结构域，和重链可变域，

iv)第一重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二重链可变域，和第二人IgG1 CH1结构域，

v)第一重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二人IgG1 CH1结构域，和第二重链可变域，

vi)重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，和scFv，

vii)重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，和scFab，

viii)重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二人IgG1 CH1结构域，和轻链可变域，

ix)重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，轻链可变域，和第二人IgG1 CH1结构域，

x)第一重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二重链可变域，和人IgG1κ或λ轻链恒定域，

xi)第一重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人κ或λ轻链恒定域，和第二重链可变域，

xii)结合结构域的第一部分，可选地第一肽接头，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地第二肽接头，和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶标特异结合的功能结合位点，

和

第二多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

且包含干扰突变，所述突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T突变，由此，第一多肽在其氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)。

7.根据实施方案5或6之任一的多聚体2/3-IgG多肽，其中多聚体多肽还包含第三多肽，所述第三多肽包含轻链可变域和轻链恒定域，

其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合。

8.组合物，其包含

第一异三聚体2/3-IgG多肽，其包含

i)重链可变域，IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，

ii)SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，重链可变域，和人IgG1 CH1结构域，

iii)SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人IgG1 CH1结构域，和重链可变域，

iv)第一重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二重链可变域，和第二人IgG1 CH1结构域，

v)第一重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二人IgG1CH1结构域，和第二重链可变域，

vi)重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，和scFv，

vii)重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，和scFab，

viii)重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二人IgG1CH1结构域，和轻链可变域，

ix)重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，轻链可变域，和第二人IgG1 CH1结构域，

x)第一重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二重链可变域，和人κ或λ轻链恒定域，

xi)第一重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人IgG1κ或λ轻链恒定域，和第二重链可变域，或

xii)结合结构域的第一部分，可选地第一肽接头，SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地第二肽接头，和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶标特异结合的功能结合位点，

并包含杵突变或臼突变，

和

且包含干扰突变，所述突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T突变，由此，第一多肽在其氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，

和

-第三多肽，其包含轻链可变域和轻链恒定域，通过二硫键与第一多肽共价结合，

以及

第二异三聚体2/3-IgG多肽，其包含

其中该CH3结构域包含第二干扰突变，所述突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T突变，由此，第二多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与第二干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)，

和

x)第一重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第二重链可变域，和人IgG1κ或λ轻链恒定域，

和

-第三多肽，其是包含轻链可变域和轻链恒定域的多肽，

其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，

其中i)第一异三聚体的第一多肽的CH3结构域包含杵突变，第一异多聚体的第二多肽的CH3结构域包含臼突变，或ii)第一异三聚体的第一多肽的CH3结构域包含臼突变，第一异三聚体的第二多肽的CH3结构域包含杵突变，由此i)如果第一异三聚体的第一多肽包含臼突变，则第二异三聚体多肽的第二多肽包含杵突变，或ii)如果第一异三聚体的第一多肽包含杵突变，则第二异三聚体多肽的第二多肽包含臼突变，

其中第一异三聚体的第二多肽和第二异三聚体多肽的第一多肽在不同位置上包含干扰突变。

9.药物制剂，其包含根据实施方案5、6和7之任一的2/3-IgG、或包含根据实施方案1、2和3之任一的2/3-BiFab、或包含根据实施方案4和8之任一的组合物，和可选地药学可接受的辅料。

10.药物制剂，其包含

第一异三聚体多肽，其包含第一、第二和第三单体多肽，

以及

第二异三聚体多肽，其包含第四、第五和第六单体多肽，

其中第一、第二、第四和第五单体多肽每个以N至C端方向包含：

(i)氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)，

(ii)第一抗体可变域，和

(iii)人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域，

其中(i)、(ii)和(iii)彼此独立地直接或通过肽接头相互连接，

其中i)第一和第二单体多肽、和ii)第一和第四单体多肽、iii)第二和第五单体多肽、和iv)第四和第五单体多肽的第一抗体可变域为VH/VL对，

其中i)第一和第四单体多肽、和ii)第一和第二单体多肽、iii)第二和第五单体多肽、和iv)第四和第五单体多肽的CH3结构域为杵-入-臼对，

其中第一单体多肽和第四单体多肽彼此独立地在其N和C端之一或两者上彼此独立地包含scFv或scFab或Fab，

其中第二条和第五单体多肽分别在其CH3结构域中包含至少一个干扰突变，由此，第一单体多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与第二单体多肽的干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)，由此，第四单体多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与第五单体多肽的干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)，其中第二单体多肽中的干扰突变与第五单体多肽中的干扰突变位于氨基酸序列的不同位置，其中当第二单体多肽与第五单体多肽形成异二聚体时，第二单体多肽中的干扰突变和第五单体多肽中的干扰突变导致吸引性的(电荷)相互作用，其中当第二单体多肽与第一单体多肽形成异二聚体以及第五单体多肽与第四单体多肽形成异二聚体时，第二和第五单体多肽中的干扰突变分别导致排斥性的(电荷)相互作用，

其中第一和第二单体多肽为非共价二聚体，第四和第五单体多肽为非共价二聚体，第三和第一单体多肽为二硫键连接的二聚体，第六和第四单体多肽为二硫键连接的二聚体。

11.根据实施方案10的药物制剂，其中第一多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

和

第三多肽是包含另外的轻链可变域和轻链恒定域的多肽，其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合。

12.根据实施方案10和11之任一的药物制剂，其中第二多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

其中该CH3结构域包含干扰突变，所述突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T突变，由此，第一多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)。

13.根据实施方案10至12之任一的药物制剂，其中第五多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

其中该CH3结构域包含第二干扰突变，所述突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、Y349C、S366T、A368L、V407Y、S354C和W366T突变，由此，第五多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)，其中第五多肽中的干扰突变和第二多肽中的干扰突变在不同的位置上。

14.根据实施方案10至13之任一的药物制剂，其中第四多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

其中i)如果第一多肽的第一可变域是轻链可变域，则第四多肽的第一可变域是重链可变域，或ii)如果第一多肽的第一可变域是重链可变域，则第四多肽的第一可变域是轻链可变域，

和

第六多肽是包含另外的轻链可变域和轻链恒定域的多肽，其中第六多肽通过二硫键与第四多肽共价结合。

15.根据实施方案10至14之任一的药物制剂，其中第一多肽的第一可变域和第四多肽的第一可变域形成功能结合位点，第二多肽的第一可变域和第五多肽的第一可变域形成非功能可变域对。

第2组：

1.多聚体多肽，其包含：

第一多肽，其以N至C端方向包含：抗体可变域和人免疫球蛋白G CH3结构域，

第二多肽，其以N至C端方向包含：抗体可变域和人免疫球蛋白G CH3结构域，

其中，i)如果第二多肽的可变域是轻链可变域，则第一多肽的可变域是重链可变域，或ii)如果第二多肽的可变域是重链可变域，则第一多肽的可变域是轻链可变域，

其中第二多肽在CH3结构域中包含至少一个干扰突变，其中第一多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)，

其中第一多肽和第二多肽是非共价二聚体，

其中第一多肽的可变域与第二多肽的可变域形成非功能结合位点，

其中第一多肽还包含功能结合位点。

2.根据实施方案1的多聚体多肽，其中第一和第二多肽各自在其可变域的N端包含氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)或DKTHT(SEQ ID NO:94)或GGGS(SEQ ID NO:69)或DKTHGGGGS(SEQ ID NO:97)。

3.多聚体多肽，其包含

第一多肽，其以N至C端方向包含：人免疫球蛋白G CH3结构域和抗体可变域，

第二多肽，其以N至C端方向包含：人免疫球蛋白G CH3结构域和抗体可变域，

其中第二多肽在CH3结构域中包含至少一个干扰突变，由此，第一多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)，

其中第一多肽和第二多肽是非共价二聚体，

其中第一多肽还包含功能结合位点。

4.根据实施方案4的多聚体多肽，其中第一和第二多肽各自在其CH3结构域的N端包含氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)或GGGS(SEQ ID NO:69)或DKTHT(SEQ ID NO:94)或DKTHGGGGS(SEQ ID NO:97)。

5.根据实施方案1至4之任一的多聚体多肽，其中i)第一多肽的CH3结构域包含杵突变，第二多肽的CH3结构域包含臼突变，或ii)第一多肽的CH3结构域包含臼突变，第二多肽的CH3结构域包含杵突变。

6.根据实施方案1至5之任一的多聚体多肽，其中i)第一多肽的CH3结构域包含杵-cys突变，第二多肽的CH3结构域包含臼突变，或ii)第一多肽的CH3结构域包含臼-cys突变，第二多肽的CH3结构域包含杵突变。

7.根据实施方案1至6之任一的多聚体多肽，其中干扰突变选自D356K、E357K、K370E和K439E突变。

8.根据实施方案1至7之任一的多聚体多肽，其中人免疫球蛋白G CH3结构域是人IgG1 CH3结构域或人IgG2 CH3结构域或人IgG3 CH3结构域或人IgG4 CH3结构域。

9.根据实施方案1至8之任一的多聚体多肽，其中

i)第一多肽包含杵或杵-cys突变，第二多肽包含干扰突变D356K和臼突变，或

ii)第一多肽包含杵或杵-cys突变，第二多肽包含干扰突变E375K和臼突变，或

iii)第一多肽包含杵或杵-cys突变，第二多肽包含干扰突变K370E和臼突变，或

iv)第一多肽包含杵或杵-cys突变，第二多肽包含干扰突变K439E和臼突变。

10.根据实施方案1至9之任一的多聚体多肽，其中第一多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

i)重链可变域，人IgG1 CH1结构域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，和人免疫球蛋白G CH3结构域，

ii)可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，重链可变域，人IgG1 CH1结构域，

iii)可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，人IgG1 CH1结构域，重链可变域，

iv)scFv，可选地肽接头，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，和人免疫球蛋白G CH3结构域，

v)scFab，可选地肽接头，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，和人免疫球蛋白G CH3结构域，

vi)可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，和scFv，

vii)可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，和scFab，

viii)重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，重链可变域，和第二人IgG1CH1结构域，

ix)重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，第二人IgG1 CH1结构域，和重链可变域，

x)重链可变域，人IgG1 CH1结构域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，和scFv，

xi)重链可变域，人IgG1 CH1结构域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，和scFab，

xii)重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，第二人IgG1 CH1结构域，和轻链可变域，

xiii)重链可变域，第一人IgG1 CH1结构域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，轻链可变域，和第二人IgG1CH1结构域，

xiv)重链可变域，人IgG1 CH1结构域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，重链可变域，和人κ或λ轻链恒定域，

xv)重链可变域，人IgG1 CH1结构域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重链或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，人κ或λ轻链恒定域，和重链可变域，

xvi)重链可变域，人IgG1 CH1结构域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，和重链或轻链可变域，

xvii)轻链可变域，人IgG1 CH1结构域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，和重链或轻链可变域，

xviii)轻链可变域，人κ或λ轻链恒定域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，和重链或轻链可变域，或

xiv)重链可变域，人κ或λ轻链恒定域，可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，人免疫球蛋白G CH3结构域，可选地肽接头，和重链或轻链可变域，

和

第二条是多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

i)可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，重或轻链可变域，人免疫球蛋白G CH3结构域，或

ii)可选地SEQ ID NO:66或69或94或97，人免疫球蛋白G CH3结构域，重或轻链可变域，

其中CH3结构域包含干扰突变，所述突变选自D356K、E357K、K370E和K439E突变，由此，第一多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白(CH3结构域)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)。

11.根据实施方案1至10之任一的多聚体多肽，其中多聚体多肽还包含第三多肽，所述第三多肽包含轻链可变域和轻链恒定域，其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价连接。

12.组合物，其包含

根据实施方案1至11之任一的第一多聚体多肽，和

根据实施方案1至11之任一的第二多聚体多肽

其中

i)第一多聚体多肽中的干扰突变是D356K，第二多聚体多肽中的干扰突变是K439E，或

ii)第一多聚体多肽中的干扰突变是E357K，第二多聚体多肽中的干扰突变是K370E。

13.包含第一多肽和第二多肽的多聚体多肽，

其中两个多肽均包含人免疫球蛋白CH3结构域，

其中第二多肽在CH3结构域中包含至少一个干扰突变，由此，第一多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(CH3结构域)野生型氨基酸残基(一个或多个)，

其中第一多肽和第二多肽是非共价或共价二聚体。

14.根据实施方案13的多聚体多肽，其中第一多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

xi)第一重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:65或66的铰链区，源自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，人κ或λ轻链恒定域，和第二重链可变域，或

和

第二多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

且包含干扰突变，所述突变选自D356K、E357K、K370E和K439E突变，由此，第一多肽在其氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)。

15.根据实施方案13或14之任一的多聚体多肽，其中多聚体多肽还包含第三多肽，所述第三多肽包含轻链可变域和轻链恒定域，

其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合。

16.组合物，其包含

第一多聚体多肽，其包含

并包含杵突变或臼突变，

和

且包含干扰突变，所述突变选自D356K、E357K、K370E和K439E突变，由此，第一多肽在其氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白(IgG1)中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基(一个或多个)，

和

以及

第二异多聚体多肽，其包含

其中该CH3结构域包含第二干扰突变，所述突变选自D356K、E357K、K370E和K439E突变，由此，第二多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与第二干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基，

和

-第三多肽，其包含轻链可变域和轻链恒定域，

其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，

17.包含根据实施方案1至15之任一的多聚体多肽、或包含根据实施方案16的组合物，和可选地药学可接受的辅料的药物制剂。

18.药物制剂，其包含

第一异三聚体多肽，其包含第一、第二和第三单体多肽，

和

第二异三聚体多肽，其包含第四、第五和第六单体多肽，

其中第一、第二、第四和第五单体多肽各自以N至C端方向包含：

(i)氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)，

(ii)第一抗体可变域，和

(iii)人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域，

其中(i)、(ii)和(iii)彼此独立地直接或通过肽接头相互连接，

其中第二和第五单体多肽各自在其CH3结构域中包含至少一个干扰突变，由此，第一单体多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与第二单体多肽的干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)，由此，第四单体多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与第五单体多肽的干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)，其中第二单体多肽中的干扰突变与第五单体多肽中的干扰突变于氨基酸序列中不同的位置上，其中当第二单体多肽与第五单体多肽形成异二聚体时，第二单体多肽中的干扰突变和第五单体多肽中的干扰突变导致吸引性的(电荷)相互作用，其中当第二单体多肽与第一单体多肽形成异二聚体以及第五单体多肽与第四单体多肽形成异二聚体时，第二和第五单体多肽中的干扰突变分别导致排斥性的(电荷)相互作用，

其中第一和第二单体多肽为非共价二聚体，第四和第五单体多肽为非共价二聚体，第三和第一单体多肽为二硫键连接的二聚体，第六和第四单体多肽为二硫键连接的二聚体，

其中第三和第六单体多肽是抗体轻链。

19.根据实施方案18的药物制剂，其中第一多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

xiv)第二重链可变域，人IgG1 CH1结构域，SEQ ID NO:66的铰链区，第一重或轻链可变域，源自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，可选地肽接头，第三重链可变域，和人κ或λ轻链恒定域，和

和

20.根据实施方案18和19之任一的药物制剂，其中第二多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

其中该CH3结构域包含干扰突变，所述突变选自D356K、E357K、K370E和K439E突变，由此，第一多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)。

21.根据实施方案18至21之任一的药物制剂，其中第五多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

其中该CH3结构域包含第二干扰突变，所述突变选自D356K、E357K、K370E和K439E突变，由此，第五多肽在其(CH3结构域)氨基酸序列中，于野生型免疫球蛋白中与干扰突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置(一个或多个)上，包含人免疫球蛋白野生型氨基酸残基(一个或多个)，其中第五多肽中的干扰突变与第二多肽中的干扰突变在不同的位置上。

22.根据实施方案18至21之任一的药物制剂，其中第四多肽选自这样的多肽，所述多肽以N至C端方向包含：

和

23.根据实施方案18至22之任一的药物制剂，其中第一多肽的第一可变域和第四多肽的第一可变域形成功能结合位点，第二多肽的第一可变域和第五多肽的第一可变域形成非功能可变域对。

提供以下实施例、序列和图表以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附的权利要求中阐明。应理解的是，可在不偏离本发明精神的条件下，对所提出的方案进行修改。

附图说明

图1：可用于根据本发明方法中的示例性2/3-IgG的设计和模块化组成。

图2：杵-cys和臼-cys重链之间(上部)以及杵-cys重链和MHCFcRP之间(中部和下部)的相互作用。共价二硫化物键用虚线表示，吸引性相互作用对用整球形之间的线表示，排斥性相互作用或由此产生的空间位阻用双箭头线表示。

图3A、3B、3C和3D：具有不同的MHCFcRPs的纯化2/3-IgG的SEC色谱图：显示了从细胞培养物上清液蛋白A提取后的2/3-IgG制备物的SEC图谱；每个图谱的主峰值代表2/3-IgG；具有荧光素(fluos；抗-fluos)或生物素(bio；抗-bio)结合位点/特异性(见实施例2)。图3A：具有D356K(臼)；图3B：具有K370E(杵)；图3C：具有E357K(臼)；图3D：具有K439E(杵)。

图4：以2/3-IgG为例通过本发明的交换反应产生的bsAbs(双特异性抗体)。

图5：应用TCEP(与2/3输入IgG相关的x摩尔当量)(部分)还原铰链二硫键。SEC区分2/3-IgG起始分子、产生的bsAb和二聚体MHCFcRP。在相同孵育时间后，终止在不同TCEP浓度下的所有反应(三角形：bsAb；叉号：2/3-IgG，菱形：二聚MHCFcRP)。

图6：如果反应在体外进行，从所需的bsAb产物中去除不需要的未反应输入分子和副产物的示意图。

图7A和7B：图7A：交换反应的示意图；图7B：NiNTA纯化的SDS-page；NiNTA结合(上部分)代表从NiNTA洗脱的蛋白质，NiNTA穿流(下部分)是不包含His-6或His-8标签的蛋白质；n.r.＝非还原的，r.＝还原的；M＝标记。

图8：根据本发明交换反应产生的bsAbs的双特异性功能。通过桥式ELISA对功能进行评估，该桥式ELISA能够检测双特异性抗体的结合位点的同时结合。涂在ELISA板上的抗原A是荧光素(fluos-BSA，FITC-BSA)，抗原B是生物素(bio-Cy5)，可通过其荧光进行检测。

图9：在重链C端具有结合位点的示例性2/3-IgG的2/3-IgG交换反应。

图10：在重链N端以及C端具有结合位点的示例性2/3-IgG的2/3-IgG交换反应。

图11：以2/3-IgG为例，使用不同结合特异性和形式的起始材料，通过IgG交换反应，显示根据本发明方法的普遍适用性。

图12：使用示例性2/3-IgG，通过根据本发明的交换反应产生的不同bsAb形式矩阵。该矩阵使用荧光素结合实体和生物胞素酰胺(biocytinamid)结合实体产生。输入分子和源自交换的输出分子如图11所示。通过桥式ELISA，使用fluos-BSA作为捕获抗原和bio-Cy5检测双特异性结合功能，评估了所产生的bsAbs的功能。源自桥式ELISA的信号表明，所有形式均具有双特异性结合效果。

图13：通过根据本发明的交换反应，使用小型化高通量和自动化兼容的方法，产生和表征bsAb多样性的矩阵。

图14：通过根据本发明方法的交换反应，采用HTS技术，形成双特异性抗体。显示的是示例性桥式ELISA的信号，其显示了浓度依赖的荧光信号，指示双特异性抗体的形成。Fluos-bio桥式ELISA，叉号：fluos[臼/K370E]+bio[杵/E357K]，菱形：bio[臼/K370E]+fluos[杵/E357K]。所有其它曲线：没有关联交换伴侣的2/3-IgG输入分子(它们不显示桥接信号，因为只存在一个结合位点)。

图15：根据本发明的交换反应的示意图，以无铰链区和CH3结构域链间二硫键的2/3-IgG为例。这使得无需添加还原剂可以在根据本发明方法中实现链交换反应。

图16：无链间二硫桥的2/3IgG与标准IgG一样被分泌到培养物上清液中，通过标准蛋白A亲和及尺寸排阻色谱进行纯化，并通过SDS-PAGE分析，确认所需的100kDa 2/3-IgG为表达产物。这证明纯化的2/3-IgG衍生物组装正确，没有链间二硫桥，也没有不需要的二聚体和聚集物。i)抗生物素抗体轻链(SEQ ID NO:39)+无铰链区半胱氨酸残基的抗生物素抗体重链-杵(SEQ ID NO:57)+无铰链区半胱氨酸残基的MHCFcRP-臼-E357K(SEQ ID NO:62)(显示在左边)和ii)抗荧光素抗体轻链(SEQ ID NO:42)+无铰链区二硫键的抗荧光素抗体全长重链-臼(SEQ ID NO:60)+无铰链区半胱氨酸残基的MHCFcRP-杵-K370E(SEQ ID NO:63)(显示在右边)的纯化。

图17：根据本发明的交换反应的结果，其中起始材料无铰链区二硫键：2.5μM浓度的输入分子，以纯化的bsAb作为正对照，表明通过以无Fc区链间二硫键的单特异性2/3-IgG输入分子进行的链交换成功产生了bsAb。

图18：BiFabs到TriFabs的设计和组成以及链交换原理。

图19A和19B：2/3-BiFabs的表达和纯化：

图19A：Kappa选择；图19B：SEC

图谱为LeY-proDig(杵)-MHCFcRP(臼)的示例性显示。

图20A和20B：2/3-BiFabs的表达和纯化：SDS-Page；n.r＝非还原的；r＝还原的；L＝分子量标记。图20A：LeY-proDig(杵)-MHCFcRP(臼)，LeY-proDig(臼)-MHCFcRP(杵)，MSLN-proDig(臼)-MHCFcRP(杵)；图20B：LeY-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)，LeY-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)，LeY-proCD-AG-2(杵)-MHCFcRP(臼)，LeY-proCD-AG-2(臼)-MHCFcRP(杵)。

图21：FACS分析接触起始分子的细胞和通过根据本发明交换反应所获得的分子。

图22：2/3-BiFab在细胞表面的交换反应重排并从而激活茎区中第三结合位点(Fv)。

图23：不同抗原靶向和含有不同茎-Fv的TriFab样前体药物在细胞上转换为细胞结合的三特异性TriFabs。

图24：通过CD3信号报告分子测定，检测CD3结合功能在细胞上激活的原理。

图25：通过在靶细胞上的2/3-BiFab交换激活CD3结合功能。

图26：不同抗原靶向的2/3-BiFab前体药物在细胞上转换为全功能细胞结合的活化的三特异性TriFabs的原理。

图27：不同抗原靶向的2/3-BiFab前体药物的细胞上转换。A431-H9细胞上的LeY和MSLN靶向抗体。在37℃下孵育6小时。

图28：包含前体药物交换模块的TriFab衍生物，其可以重排为全功能三特异性实体。

图29：包含单链前体药物交换模块的2/3-BiFab衍生物，其可以重排为全功能四特异性实体。

图30A和30B：来自两个不同供体的PBMCs与MCF7和抗LeY-proCD3 2/3-BiFabs的共培养。LDH释放作为细胞介导的靶标肿瘤细胞杀伤的指标。图30A：供体1的PBMCs；图30B：供体2的PBMCs。

图31A和31B：图31A：PBMCs与A431细胞和抗EGFR-proCD3 2/3-BiFabs的共培养。图31B：PBMCs与HELA细胞和抗AG-4-proCD3 2/3-BiFabs的共培养。LDH释放作为细胞介导的靶向肿瘤细胞杀伤的指标。

图32A、32B、32C、32D和32E：PBMCs与HELA和抗AG-4-proCD3 2/3-BiFabs在4nM的摩尔浓度下共培养后，上清液中细胞因子的含量。图32A：IL-2含量；图32B：IFNγ含量；图32C：颗粒酶B含量；图32D：TNFα含量；图32E：图例。

图33：HELA细胞上表面抗原AG-4和EGFR的表达水平。

图34：各proCD3 2/3-BiFabs对AG-4和EGFR的双重靶向，导致在Jurkat报告分子测定中T细胞活化。

图35：包含单链前体药物交换模块的2/3-BiFab衍生物，可以重排为全功能地高辛和生物素结合实体，并可通过Dig-Cy5和Bio-488结合以FACS进行分析。

图36A和36B：在TriFab衍生物转换后对细胞表面上染料结合的FACS分析。图36A：Dig-Cy5；图36B：Bio-488。

图37：包含单链前体药物交换模块的2/3-BiFab衍生物，可以重排为全功能CD3和CD-AG-2结合物。

图38：包含单链前体药物交换模块的2/3-BiFab衍生物，可以重排为全功能CD3和CD-AG-2结合物，在CD3信号报告分子测定中活化T细胞。

图39：MHCFcRP可配备可变片段(VH或VL)，并在2/3-BiFab转换后生成CD-AG-2结合性Fab分子作为副产物。

图40：通过产物结合到Jurkat细胞表面，对CD-AG-2-MHCFcRP进行的FACS分析。

图41：在MHCFcRP的N端添加靶向Fab实体，在MHCFcRP中组合两个proCD3/proCD-AG-2可变域，导致在细胞上组装两类能够进行CD3和CD-AG-2结合的三特异性TriFabs。

图42：三特异性TriFabs在CD3信号测定中的T细胞活化能力。

图43：包含CH2结构域和因此具有效应子功能的Fc区的可选2/3-BiFab形式；可变域均位于Fc区的C端。

图44：包含额外的CH2结构域和因此具有效应子功能的Fc区的可选2/3-BiFab形式；可变域分别位于Fc区和靶向Fab之间或位于N端。

图45：进行了分析型FcRn亲和色谱，以证明具有功能性CH2的2/3-BiFab分子的CH2依赖性结合。

图46A和46B：在应用含有CH2的2/3-BiFabs后，对细胞表面的Dig-Cy5结合进行的FACS分析。地高辛结合位点仅在应用两个相应的BiFabs后被转换。从上到下：MCF-7+Dig-Cy5；杵-析出物(educt)；臼-析出物；细胞上改组/交换反应物；产物对照。图46A：可变域在Fc区C端；图46B：可变域在Fc区和靶向Fab之间。

图47：含有CH2的BiFab的分子设置，用于在细胞上生成功能性CD3结合位点。

图48：T细胞报告分子测定揭示含有CH2的2/3-BiFabs诱导T细胞活化的能力。KN＝杵；HL＝臼。

图49A、49B和49C：负染色透射电子显微镜(NS-TEM)分析揭示2/3-BiFabs的分子形状和柔性。图49A：抗AG-4-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)；图49B：AG-3-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)；图49C：抗AG-4/CD3/AG-3抗体。

图50：仅在高浓度(300nM)情况下以低水平发生与靶标无关的改组。

图51：通过修饰IgG1铰链区，即通过去除二硫键或缩短铰链区，可以工程化构建在各个结合位点之间的不同距离。

实施例

实施例1

2/3-IgGs的设计和模块化组成

概述

图1显示了用于根据本发明方法的2/3-IgG的设计和模块化组成。这些2/3-IgG由三条单链组成：一条轻链(通常是包含轻链可变域和轻链恒定域的全长轻链)，一条重链(通常是包含重链可变域和包括铰链区在内的所有重链恒定域的全长重链)和一条重链Fc区多肽(通常是包含铰链CH2-CH3的重链Fc区片段)。轻链和重链的可变域形成功能结合位点。重链(通常源自人IgG1亚类)在CH3中包含杵-cys-突变或臼-cys-突变(抗体重链的CH3结构域中的T366W和S354C突变表示为“杵-cys-突变”，抗体重链的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V、Y349C突变表示为“臼-cys-突变”(根据Kabat EU索引编号))，从而能够形成杵入臼Fc区二聚体。该重链Fc区多肽是所谓的“dummy-Fc”/MHCFcRP(见下文)，即缺乏VH和CH1的IgG1衍生物，从N端开始具有至少一部分铰链区序列，并在其C端带有His6标签。此外，2/3-IgG的重链Fc区多肽在其CH3结构域中包含杵突变或臼突变(抗体重链的CH3结构域中的T366W突变表示为“杵突变”，抗体重链的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变表示为“臼突变”(根据Kabat EU索引进行编号))。除了杵或臼突变，重链Fc区多肽还包含去稳定化突变，相对于野生型序列，该突变引入一个(即单个额外的)排斥性电荷：D356K或E357K或K370E或K439E；SEQ ID NO:35至38；这种经突变的重链Fc区多肽在以下表示为MHCFcRP。

重链和MHCFcRP可以形成两种类型的异二聚体，具体取决于其中杵入臼突变的分布：

i)重链-杵::MHCFcRP-臼，和

ii)重链-臼::MHCFcRP-杵。

然而，这些异二聚体有些“缺陷”，因为互补的Fc区缺乏形成重链链间二硫键所需的额外CH3半胱氨酸，而且它们还包含没有相匹配的重链对应物的电荷突变。

实施例2

2/3-IgG的表达和纯化

2/3-IgG的表达是利用本领域技术，将编码轻链、重链(带杵或臼突变)和相匹配的MHCFcRP(臼或杵)的质粒共转染到哺乳动物细胞(例如HEK293)中来实现的。

更详细地讲，例如，对于通过瞬时转染(例如，在HEK293细胞中)产生2/3-IgG，应用了如下的表达质粒，所述表达质粒基于具有或不具有CMV-内含子A启动子的cDNA组织、或者基于具有CMV启动子的基因组组织。

除了抗体表达盒，质粒包含：

-复制起点，其允许在大肠杆菌中复制该质粒，

-β-内酰胺酶基因，其赋予在大肠杆菌中的青霉素抗性，和

-来自小家鼠(Mus musculus)的二氢叶酸还原酶基因作为真核细胞中选择标记。

每个抗体基因的转录单元由以下元素组成：

-5＇端处的独特限制位点

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，

-跟随内含子A序列，在cDNA组织情况下，

-人抗体基因的5＇非翻译区，

-免疫球蛋白重链信号序列，

-抗体链，以cDNA形式或在基因组组织中(保持免疫球蛋白外显子-内含子组织)，

-具有多聚腺苷酸化信号序列的3＇非翻译区，和

-3＇端处的独特限制位点。

包含抗体链的融合基因通过PCR和/或基因合成产生，并采用已知的重组方法和技术，通过例如利用相应质粒中的独特限制位点将相应的核酸片段连接，来进行组装。通过DNA测序验证亚克隆的核酸序列。通过从转化的大肠杆菌培养物进行质粒制备(NucleobondAX,Macherey-Nagel)，制备了大量质粒用于瞬时转染。

使用如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada，K.M.编辑，John Wiley&Sons，Inc中描述的标准细胞培养技术。

通过使用HEK293-F系统(Invitrogen)按照制造商的说明以相应质粒进行瞬时转染来产生2/3-IgGs。简单地说，以相应表达质粒和293fectin^TM或fectin(Invitrogen)，转染悬浮生长在摇瓶或搅拌发酵罐内无血清FreeStyle^TM293表达培养基(Invitrogen)中的HEK293-F细胞(Invitrogen)。对于2L摇瓶(Corning)，以600毫升中1×10⁶个细胞/毫升的密度接种HEK293-F细胞，并在120rpm，8％CO2条件下孵育。第二天，在约1.5×10⁶个细胞/毫升的细胞密度下，以约42毫升如下混合物转染细胞：A)20毫升Opti-MEM(Invitrogen)，600微克总质粒DNA(1微克/毫升)，B)20毫升Opti-MEM+1.2毫升293fectin或fectin(2微升/毫升)。根据葡萄糖消耗，在发酵过程中添加葡萄糖溶液。正确组装的2/3-IgG和标准IgGs一样被分泌到培养物上清液中。5-10天后采集含有分泌的2/3-IgG的上清液，直接从上清液中纯化2/3-IgGs，或者将上清液进行冷冻和储存。

由于2/3-IgG包含Fc区，通过应用标准的蛋白A亲和色谱对其进行纯化：通过使用MabSelectSure-Sepharose^TM(GE Healthcare,瑞典)的亲和色谱和Superdex 200尺寸排阻(GE Healthcare,瑞典)色谱，从细胞培养物上清液中纯化2/3-IgG。

简单地说，无菌过滤的细胞培养物上清液被捕获在以PBS缓冲液(10mM Na2HPO4,1mM KH2PO4,137mM NaCl和2.7mM KCl,pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe树脂上，以平衡缓冲液洗涤并在pH 3.0下用25mM柠檬酸钠洗脱。将洗脱的抗体级分合并，以2M Tris，pH 9.0进行中和。通过使用以20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex 200 26/60GL(GEHealthcare,瑞典)柱，进行尺寸排阻色谱来进一步纯化抗体合并物。合并包含2/3-IgG的级分，使用Vivaspin超滤装置(Sartorius Stedim Biotech S.A.,法国)浓缩到所需的浓度，并储存在-80℃。

在每次纯化步骤后，通过使用微流体Labchip技术(Caliper Life Science,美国)的CE-SDS对纯度和完整性进行分析。制备蛋白质溶液(5微升)，使用HT蛋白快速试剂盒(HTProtein Express Reagent Kit)按照制造商的说明进行CE-SDS分析，并在LabChip GXII系统上使用HT蛋白质快速芯片(HT Protein Express Chip)进行分析。使用LabChip GX软件分析数据。

例如，通过共表达相应的L链、H链和MHCFcRP编码质粒产生了以下2/3-IgGs：

相应的SEC色谱图如图3所示。

实施例3

通过2/3-IgG交换反应产生双特异性抗体(bsAbs)

包含轻链、重链和MHCFcRP的2/3-IgGs以两种类型的KiH异二聚体形式产生：全长重链-杵::MHCFcRP-臼和全长重链-臼::MHCFcRP-杵。这两种类型的2/3-IgGs都有些“缺陷”，因为MHCFcRP缺乏与重链形成链间二硫键所需的额外CH3半胱氨酸，而且MHCFcRP还包含全长重链中没有相匹配对应物的电荷突变。然而，构成这些有缺陷的异二聚体的模块能够重排为如图4所示具有匹配电荷的双特性异二聚体。2/3-IgG A的全长重链(杵-cys)和2/3-IgG B的全长重链(臼-cys)形成相匹配的异二聚体。当MHCFcRP(臼-电荷)与MHCFcRP(杵-电荷)相互作用时，也形成相匹配的异二聚体。因此，基于两个不同2/3-IgGs的起始异二聚体的短暂分离的交换反应，导致了优先包含(电荷)匹配异二聚体的产物。因此，交换反应将两个单特异性2/3-IgGs转换为一个双特异性IgG和一个MHCFcRP异二聚体：

2/3-IgG(A)-His6(8)+2/3-IgG(B)-His6(8)→bsAb(AB)+Fc-His6(8)

交换反应由还原步骤起始(例如，通过应用各种浓度的2-MEA或TCEP)，以打破尤其是铰链区链间二硫键。此后，链重排自发发生。

因此，将抗荧光素-2/3-IgG和抗生物胞素酰胺-2/3-IgG输入分子，在384孔

板(Brooks,#1800030)上，于总体积40微升的1xPBS+0.05％Tween 20(具有所示浓度的TCEP)中，以100微克/毫升的蛋白质浓度，以等摩尔量混合。离心后，密封平板并在27℃孵育一小时。

随后使用生物素-荧光素桥式ELISA定量双特异性抗体。因此，以1微克/毫升白蛋白-荧光素异硫氰酸酯缀合物(FITC，Sigma,#A9771)包被白色

MaxiSorp^TM384孔板，并在4℃孵育过夜。用90微升PBST缓冲液(PBST，双蒸水，10xPBS+0.05％Tween 20)洗涤3次后，每个孔加入90微升封闭缓冲液(1xPBS,2％明胶,0.1％Tween-20)，在室温下孵育1小时。用90微升PBST缓冲液洗涤3次后，每个孔加入25微升每个交换反应的1:10稀释液。在室温下孵育一小时后，再次用90微升PBST缓冲液洗涤平板3次。每个孔加入25微升于0.5％BSA,0.025％Tween-20,1xPBS中的生物素-Cy5缀合物至终浓度为0.1微克/毫升，将平板在室温下孵育一小时。用90微升PBST缓冲液洗涤6次后，每个孔加入25微升1xPBS。在Tecan Safire2Reader上于670nm发射波长(在649nm激发)测量Cy5荧光。

图5显示了用于从2/3-IgG交换产生bsAbs的氧化还原条件的分析结果。应用TCEP(部分)还原重链Fc区多肽之间，即全长半IgG和MHCFcRP之间的铰链-二硫键。可通过SEC鉴别链交换，SEC区分2/3-IgG输入物、bsAb输出物和MHCFcRP副产物。交换反应的产量取决于2/3-IgG和TCEP之间的比率，显示在图5中(为了比较，所有反应都在相同反应时间后进行分析)。

所有2/3-IgG起始分子、所有非所需副产物、以及交换反应期间可能生成的所有聚集物都带有亲和标签(His6或His8)。交换反应中产生的所需bsAb是唯一不带有His标签的分子。因此，应用简单的NiNTA吸附步骤去除所有不需要的分子(参见图6和图7)。余下的bsAbs(未被NiNTA吸附去除)直接应用于筛选程序，并进行分析以鉴别具有所需功能的bsAbs。

实施例4

通过2/3-IgG交换反应产生的双特异性抗体(bsAbs)的功能评估

通过桥式ELISA测定，评估了作为2/3-IgG交换反应的产物产生的bsAbs的双特异性功能。图8显示了由本文报告的交换反应产生的抗荧光素/生物胞素酰胺双特异性抗体的结合结果的示例。在反应中，使用生物胞素酰胺(bio)结合性2/3-IgG和荧光素(fluos)结合性2/3-IgG作为起始分子。抗fluos/bio双特异性抗体的fluos结合臂与包被在ELISA板上的fluos-BSA结合。随后接触bio-Cy5，仅在bsAb介导通过bsAb的生物素结合臂捕获bio-Cy5时，才产生信号。由于桥接介导的信号仅伴随bsAbs发生，而不伴随单特异性Fluos或Bio结合物发生，因此在测定中在仅使用2/3-IgG时观察不到信号。因为该原因以及由于交换反应不迫使分子聚集，这种桥式ELISA可以直接在交换反应混合物上进行，无需事先由NiNTA介导去除非bsAb分子。应用反应混合物时观察到的信号表明成功产生了和存在功能性bsAbs。通过桥式ELISA产生的信号取决于交换反应中使用的输入实体的量。

实施例5

交换反应在功能上独立于起始2/3-IgG的结合特异性或V区组成

制备了各种2/3-IgG，以评估2/3-IgG的产生以及交换反应是否适用于不同的抗体而不受其结合特性和V区组成影响，以及适用于不同的抗体组合。

因此，使用了对生物胞素酰胺(bio)、地高辛(dig)、荧光素(fluos)、LeY-碳水化合物(LeY)、VEGF和PDGF具有结合特异性的2/3-IgG。它们通过共转染如上所述的编码全长轻链、杵或臼-全长重链和突变的重链Fc区多肽的表达质粒来产生。

SEQ ID NO:49-52描述了对地高辛、VEGF、PDGF和LeY具有特异性的2/3-IgGs的VH-CH1区。它们与SEQ ID NO:40和41的铰链-CH2-CH3区融合(即替换bio VH-CH1区)，以产生具有所需特异性的完全H链。用于产生这些分子的MHCFcRPs列于SEQ ID NO:35-38中。

和标准IgG相比，所有这些2/3-IgG都可以在相当的条件下以类似的产量产生和纯化(参见实施例2)。具有不同结合特异性的这些2/3-IgG的表达实例显示于下表中。

在用于产生不同特异性的bsAbs的交换矩阵中，采用了具有荧光素、生物胞素酰胺、VEGF、PDGF和地高辛结合特异性的2/3-IgGs的如下表所示的所有组合。

通过桥式ELISA监测起始2/3-IgG的链交换和具有所需特异性组合的bsAbs的产生(参见实施例4)，其中采用了匹配不同bsAb特异性组合的包被板的抗原和产生信号的抗原-缀合物/复合物。

用于评估不同bsAb组合的功能的桥式ELISA的结果如下表所示。只有识别作为捕获或检测抗原存在的其关联抗原对的bsAbs，才在桥式ELISA中产生信号。矩阵中生成的其它bsAbs都由于缺少至少一个特异性而呈阴性。

表：桥式ELISA确认产生的bsAbs的功能。显示了在输入分子浓度1.3μM下、在一次测定中相对信号强度。将最高值设置为100％作为参考。N.a.＝不可得。

对于含有VEGF的双特异性抗体，进行了相同的测定。这些也显示了只有相应组合的信号高于背景水平。

可以看出，根据本发明的交换反应是一种普遍适用的方法：交换反应导致功能性bsAb，独立于起始分子的结合特异性或V区组成。

实施例6

变体形式的设计、组成和产生

实施例4的2/3-IgG交换反应被拓展至如下起始分子，所述起始分子在重链的C端具有一个结合位点或在重链的N和C端均具有结合位点。对于经交换的bsAbs的产生，交换驱动原理(将有缺陷的输入异二聚体转换为匹配的输出异二聚体)保持不变。如上所述，也保留了MHCFcRPs的组成。

图1、9和10显示了用于产生不同bsAb形式的三种2/3-IgG形式的模块化组成。一种2/3-IgG在N端位置具有一个Fab臂。另一种2/3-IgG具有通过柔性接头连接到重链C端的Fab臂(即，其N端以铰链区开始)。第三2/3-IgG具有C端Fab臂以及N端Fab臂。

通过将编码轻链、重链(杵或臼)和相应的MHCFcRP(臼或杵)的质粒共转染到哺乳动物细胞(例如HEK293)中，表达了这些2/3-IgG变体(参见实施例2)。

用于产生不同bsAb形式的修饰的全长重链的序列如下：

2/3-IgG和标准IgG一样被分泌到培养物上清液中，通过标准蛋白A亲和色谱对其进行纯化(参见实施例2)。尺寸排除和质谱分析显示，纯化的2/3-IgG变体得到了正确组装并且不存在不需要的二聚体和聚集物。2/3-IgG的表达产量与在相同表达系统中使用标准IgG观察到的表达产量相似。相应的数据呈现在下表中。

实施例7

在不同价性、化学计量和几何形状方面表征具有组合的结合功能的bsAbs

三种不同的起始分子(具有N端、C端、N和C端结合位点的2/3-IgG)可以在根据本发明方法中相互组合，产生九种不同的bsAb形式。它们在价性、几何形状和各结合位点的位置上有所不同。产生这些不同bsAbs的交换反应是在与实施例3中概述的相同条件下进行的。

所有类型的输入形式都是“有缺陷的”，因为MHCFcRP缺乏与重链形成链间二硫键所需的额外CH3半胱氨酸，并且它包含排斥性电荷突变(即没有相匹配的全长重链对应物的电荷)。在根据本发明方法中构成这些有缺陷的异二聚体的重链重排形成(电荷和二硫键)匹配的异二聚体。不同类型的全长重链(杵-cys和臼-cys)形成匹配的异二聚体。也由MHCFcRP(臼-电荷和杵-电荷)形成匹配的异二聚体。

在不受理论约束的情况下，认为基于两个不同2/3-IgG的缺陷异二聚体的短暂分离的交换反应，可以导致含有优先完美匹配的异二聚体的产物，其中匹配的异二聚体具有匹配的电荷和(如果存在的话)用于形成二硫键的半胱氨酸残基。因此，交换将单特异性2/3-IgG转换为(不同形式)双特性IgG以及相应的(无可变区，即无靶标结合能力的)Fc区异二聚体。

对于交换反应的描述，将输入分子称为：

-“nA或nB”，用于在全长重链(H链)的正常N端处具有Fab臂的分子

-“cA或cB”，用于在H链的C端处具有Fab臂的分子

-“ncA或ncB”，用于在H链的N和C端具有Fab的分子

不同形式-交换反应如下：

2/3-IgG(nA)-His-标签+2/3-IgG(nB)-His-标签→bsAb(nAnB)+Fc-His-标签

2/3-IgG(nA)-His-标签+2/3-IgG(cB)-His-标签→bsAb(nAcB)+Fc-His-标签

2/3-IgG(nA)-His-标签+2/3-IgG(ncB)-His-标签→bsAb(nAncB)+Fc-His-标签

2/3-IgG(cA)-His-标签+2/3-IgG(cB)-His-标签→bsAb(cAcB)+Fc-His-标签

2/3-IgG(cA)-His-标签+2/3-IgG(nB)-His-标签→bsAb(cAnB)+Fc-His-标签

2/3-IgG(cA)-His-标签+2/3-IgG(ncB)-His-标签→bsAb(cAncB)+Fc-His-标签

2/3-IgG(ncA)-His-标签+2/3-IgG(nB)-His-标签→bsAb(ncAnB)+Fc-His-标签

2/3-IgG(ncA)-His-标签+2/3-IgG(cB)-His-标签→bsAb(ncAcB)+Fc-His-标签

2/3-IgG(ncA)-His-标签+2/3-IgG(ncB)-His-标签→bsAb(ncAncB)+Fc-His-标签

通过还原步骤打破链间(铰链区)二硫键来启动交换反应，此后自发地发生链重排。所有输入分子、所有副产物、以及所有可能在交换反应过程中形成的聚集物都带有亲和标签(例如His6或His8标签)。然而，交换反应的bsAb产物不携带亲和标签，因此可以通过亲和(例如NiNTA)吸附色谱来分离。(不同形式的)bsAbs可直接应用于筛选过程和分析，以鉴别和排序具有最佳功能的不同bsAbs形式。

双特异性形式通过在384孔MTP格式中交换上述输入2/3-IgG来产生，然后以桥式ELISA评估功能性组装物。因此，交换伴侣(由包含臼-cys突变的全长重链和MHCFcRP-杵-K370E组成的2/3-IgG分子1；由包含杵-cys突变的全长重链和MHCFcRP-臼-E357K组成的2/3-IgG分子2)以等摩尔量(4μM)在总体积100微升的1xPBS+0.05％Tween 20中混合。将蛋白质溶液在384深孔平板(Greiner 384

)中按1:2稀释11次。在384孔

板(Brooks,#1800030)上，将来自稀释系列的每个样品的20微升与20微升0.5mM TCEP溶液混合至最终蛋白质浓度为200至0.2微克/毫升和TCEP为0.25mM。离心后，密封平板并在37℃下孵育一小时。

作为对照实例，使用一侧包含生物素结合功能、另一侧包含荧光素结合功能的bsAbs。由此产生的bsAbs的功能通过生物素-荧光素桥式ELISA进行评估。因此，以1微克/毫升的白蛋白-荧光素异硫氰酸酯缀合物(Sigma,#A9771)包被白色

MaxiSorp^TM384孔平板，并在4℃下孵育过夜。用90微升PBST缓冲液(PBST，双蒸水，10xPBS Roche#11666789001+0.05％Tween 20)洗涤3次后，每个孔加入90微升封闭缓冲液(1xPBS,2％BSA,0.1％Tween-20)，在室温下孵育1小时。用90微升PBST缓冲液洗涤3次后，每个孔加入25微升的每个反应的1:4稀释液。在室温下孵育一小时后，再次用90微升PBST缓冲液洗涤平板3次。每个孔加入25微升于0.5％BSA,0.025％Tween-20，1xPBS中的生物素-Cy5缀合物至终浓度为0.1微克/毫升，将平板在室温下孵育一小时。用90微升PBST缓冲液洗涤6次后，每个孔加入25微升1xPBS。在Tecan Safire 2Reader上于670nm发射波长(在649nm激发)下测量Cy5荧光。

通过交换不同形式的2/3-IgG，产生具有一个荧光素结合实体和一个生物胞素酰胺结合实体的不同bsAb形式。输入分子和源自交换的输出分子如图11所示。

通过如图12所示的桥式ELISA来评估所产生的bsAbs的功能，其中使用fluos-BSA作为捕获抗原和bio-Cy5来检测双特异性桥接结合功能。所有不同的形式都导致桥式ELISA信号。

这些结果表明了，使用根据本发明的方法，通过链交换反应，可以以稳健的且高通量兼容的方式来产生不同的形式。

实施例8

通过2/3-IgG交换和筛选/鉴别具有所需功能的bsAbs来产生功能性bsAbs与小型化和高通量以及自动化技术兼容

需要且在许多情况下必须应用高通量和自动化技术来处理大量不同的bsAbs(在结合位点序列和/或形式上不同)。因此，分析了通过本发明的2/3-IgG交换方法产生bsAb、以及分析和筛选由此产生的双特异性抗体的功能(即双特异性结合)是否可以小型化，以便与高通量和自动化技术兼容。

因此，在348孔板中以小型化规模进行了2/3-IgG交换反应并分析了反应产物。

在384孔MTP格式中设置矩阵筛选如下：交换伴侣(由包含臼-cys突变的全长重链和MHCFcRP-杵-K370E组成的2/3-IgG分子1；由包含杵-cys突变的全长重链和MHCFcRP-臼-E357K组成的2/3-IgG分子2)以等摩尔量(4μM)在总体积30微升的1xPBS+0.05％Tween 20中混合。将蛋白质溶液在384深孔平板(Greiner 384

)中按1:3稀释4次。在384孔

板(Brooks，#1800030)上，将来自稀释系列的每个样品的20微升与20微升的0.5mMTCEP溶液混合，至最终蛋白质浓度为2μM至0.025μM和TCEP为0.25mM。离心后，密封平板并在37℃下孵育一小时。

随后，在小型化的高通量格式中，通过桥式ELISA(见上文)评估了由此产生的bsAbs的功能：以1微克/毫升白蛋白-荧光素异硫氰酸酯缀合物(Sigma,#A9771)、1微克/毫升PDGF(CST,#8912)或1微克/毫升VEGF121包被白色

MaxiSorp^TM384孔平板，并在4℃下孵育过夜。用90微升PBST缓冲液(PBST，双蒸水，10xPBS+0.05％Tween 20)洗涤3次后，每个孔加入90微升封闭缓冲液(1xPBS,2％BSA,0.1％Tween-20)，在室温下孵育1小时。用90微升PBST缓冲液洗涤3次后，每个孔加入25微升每个交换反应的1:4稀释液。在室温下孵育一小时后，再次用90微升PBST缓冲液洗涤平板3次。每个孔加入25微升于0.5％BSA,0.025％Tween-20,1xPBS中的生物素-Cy5缀合物或dig-Cy5缀合物至终浓度为0.1微克/毫升，将平板在室温下孵育一小时。用90微升PBST缓冲液洗涤6次后，每个孔加入25微升1xPBS。在Tecan Safire 2Reader上于670nm发射波长(在649nm激发)下测量Cy5荧光。使用与VEGF或PDGF或地高辛或生物素或荧光素结合的2/3-IgG模块进行的交换反应和桥式ELISA的细节以及分析，显示于图13中。图14显示了这些分析中一个示例的结果，表明2/3-IgG交换反应和后续功能分析可被执行，并与高通量和自动化技术兼容。

实施例9

具有三个结合位点的bsAbs的产生，这些位点中一个结合位点靶向第一抗原，其它两个结合位点靶向另一个抗原

根据本发明的方法可用于产生T细胞双特异性抗体(TCB)。它们具有此前描述过的格式(参见例如WO 2013/026831)。对于TCB交换方法，一条H链(如上文所述具有杵-cys或臼-cys)在其铰链的N端包含结合CD3的CrossFab来源的实体，并在N端进一步由另一个抗体来源的靶向实体延伸。在与上述相同条件下进行交换反应，导致含有CD3结合实体和两个额外结合实体的TCB。这些TCB可以结合靶细胞抗原。这些分子可以同时结合T细胞上的CD3和靶(例如肿瘤)细胞上的抗原，从而诱导杀死靶细胞。

实施例10

设计和产生根据本发明的(在铰链区和CH3结构域中)无Fc区链间二硫键的2/3-IgG

以包含Fc区(铰链区)二硫键的2/3-IgG进行的链交换需要还原作为起始步骤，以能够进行链分离和随后组装所需的bsAbs。为了避免还原步骤及其相关的去除还原剂的需求，制备了无铰链区二硫键的2/3-IgG。该原理如图15所示。通过将其突变至丝氨酸，去除铰链区中负责铰链-二硫键形成的半胱氨酸残基。此外，第354或349位形成KiH相关二硫键的CH3-半胱氨酸也被省略。相应的氨基酸序列是：

上述2/3-IgG的表达通过将编码轻链、全长重链(杵或臼)和相应的MHCFcRP(臼或杵)的质粒共转染到哺乳动物细胞(例如HEK293)中来实现(参见实施例2)。2/3-IgG和标准IgGs一样被分泌到培养物上清液中，然后通过标准的蛋白A亲和及尺寸排阻色谱进行纯化(参见实施例2)。通过尺寸排阻色谱和SDS-PAGE后续分析所需的100kDa 2/3-IgG表达产物(图16)。这证明了2/3-IgG的正确组装以及不存在不需要的二聚体和聚集物。这是令人惊讶的，因为这样的分子不通过Fc区(铰链区和CH3结构域)间的二硫键维持稳定。无Fc区链间二硫键的抗荧光素和抗生物素2/3-IgG的纯化产率呈现于下表中。

实施例11

在本发明方法中通过无还原作用的2/3-IgG交换反应产生功能性bsAbs

以不含Fc区链间二硫键的2/3-IgG进行如上文所述的链交换反应(参见实施例3)，但是省略了起始还原步骤。2/3-IgG包含荧光素或生物素结合位点以及在全长重链和MHCFcRP之间没有链间二硫键的Fc区。这些2/3-IgG的组成和产生描述于实施例10中。在没有起始还原的交换反应后，进行桥式ELISA，以证明bsAbs的双特异性功能。桥式ELISA包括将交换反应产物添加到固定的fluos-BSA中，然后进行洗涤步骤，随后添加生物素-Cy5以探测bsAb的第二结合臂的存在(有关桥式ELISA的详细信息，参见前面的实施例)。只有正确组装的功能性bsAbs才能通过其荧光素结合位点结合到测定板上，被保留，并通过捕获和保留生物素-Cy5来产生信号。没有双特异性的分子不会产生信号，因为它们不与板结合(仅生物素结合物)，或无法捕获产生信号的生物素-Cy5(仅荧光素结合物)。这些分析结果(在本实施例中在2.5μM的输入分子浓度下进行交换反应，以纯化的bsAb为正对照)显示于图17中。结果表明，通过以无Fc区链间二硫键的单特异性2/3-IgG输入分子进行链交换，成功产生了bsAb。有效的链交换的发生没有起始还原的要求。因此，去除Fc区多肽间二硫键消除了对起始还原步骤的需求。生成的bsAbs通过非共价Fc-Fc相互作用结合在一起。因此，消除Fc-Fc链间二硫键可以允许由相应的Fc区不匹配驱动的交换反应而无需还原，从而允许在体内应用。

实施例12

通过部分去稳定的全长重链-MHCFcRP界面驱动链交换反应

将2/3-IgG转换为bsAbs的驱动力是设计的全长重链和MHCFcRP之间“有缺陷的”界面。这种人为的排斥界面是由于引入到MHCFcRP的杵或臼-CH3结构域中的突变的结果。在2/3-IgG的表达过程中，MHCFcRP仍与相应的(“正常”)杵或臼-伴侣结合(参见上面的实施例)。这些分子有足够的稳定性来呈现2/3-IgG并表现为无不需要的聚集倾向的分子。

不受理论约束，当两个互补2/3-IgG接近，这些全长抗体重链::MHCFcRP对彼此靠近地发生部分释放时，根据本发明的交换反应产生，导致bsAbs。在这种条件下，应该有利于匹配的(即非电荷排斥的)杵-臼全长重链的重新组装，因为全长抗体重链(CH3)界面是完善的。因此，所形成的bsAb的全长重链仍然结合，优于部分不完善的(电荷不匹配的)2/3-IgG分子的重新形成。因此，经设计的部分去稳定(电荷排斥的)CH3界面是进行成功的定向链交换反应的关键参数。

Fc界面，尤其是CH3-CH3界面的部分去稳化，可以通过突变MHCFcRP的CH3残基同时保留全长抗体重链上的相互作用残基来实现。

下表提供了可引入到MHCFcRP的CH3结构域中来影响全长抗体重链::MHCFcRP界面的示例性突变。

一些突变包括将改变的电荷置入界面的交换。电荷突变削弱或破坏先前存在的稳定电荷对或导致排斥效应，或两者兼而有之。

类似，可以引入具有不同大小侧链的氨基酸，以产生空间排斥效应。此类突变削弱或干扰现有的疏水性界面相互作用，或产生分空间位阻，或两者兼而有之。

通过电荷和/或空间效应来部分去稳定的突变也可以相互组合。

此外，可以将包含电荷和/或空间改变引入到其MHCFcRP中的第一2/3-IgG，与包含不同的电荷和/或空间改变引入到其MHCFcRP中的第二2/3-IgG组合，其中第二2/3-IgG的MHCFcRP中的电荷和/或空间改变与第一2/3-IgG的MHCFcRP中的电荷和/或空间改变相匹配。

这些2/3-IgG以及所产生的bsAbs以这样的方式组装，其中配对的CH3结构域在一侧含有杵突变，在另一侧含有臼突变。因此，MHCFcRP的相应杵或臼残基回复突变到野生型组成，也会产生界面干扰。下表列出了杵或臼-CH3结构域与野生型结构域的组合。

这些回复突变可被应用于使CH3-CH3界面部分地去稳定。

这些回复突变也可以与其它干扰突变结合使用，所述干扰突变包括上表中描述的突变。

上述所有部分干扰性的单突变或突变组合也可以以这样的方式选择：它们造成2/3-IgG的部分去稳定，但是稳定作为交换反应的第二产物的杵-MHCFcRP::臼-MHCFcRP异二聚体，由此进一步使反应平衡向产物侧迁移(交换反应)。

实施例13

单价2/3-IgG衍生物在细胞上转换为根据本发明的双价bsAbs

重链和MHCFcRP之间无链间二硫键的2/3-IgG衍生物不需要还原来启动交换反应。因此，也可以在生理条件下实现交换，即使在各2/3-IgG与细胞表面结合时。如果2/3-IgG的功能Fab臂与细胞表面结合，则它们会在靶细胞上累积。如果两个互补的2/3-IgG与同一细胞的表面结合，则可在直接结合在所述细胞的表面上时发生链交换。此交换直接在细胞表面上产生具有双特异性的全功能bsAb。

为了证明这种原位细胞上链交换，将结合抗原LeY或Her1的两个互补2/3-IgG应用于展示出高水平LeY、高水平Her1或高水平的LeY和Her1两者的细胞。FACS分析可以显示，单独应用的2/3-BiFabs与表达其关联抗原的细胞结合。两种2/3-BiFabs的共应用(同时或连续)导致仅增加与表达两种抗原的细胞的结合。这表明通过单价2/3-BiFabs(前体药物)的细胞上交换反应，成功产生了功能性双价bsAb产物(具有亲合力介导的改进结合)。

实施例14

根据本发明的无重链:MHCFcRP二硫键的2/3-BiFabs的设计、组成和功能

TriFabs是抗体衍生物，其由于IgG CH2结构域分别交换为VH和VL而具有双特异性功能。这种分子的Fc样“茎区”通过完整的KiH CH3结构域结合在一起。这使得能够产生包含MHCFcRP的BiFab类似物，其具有潜在能引起交换的特征。图18显示了包含MHCFcRP的2/3-IgG-BiFab衍生物的设计和组成。应用与2/3-IgG相同的一般原则，工程化2/3-BiFab类似物由KiH重链和MHCFcRP实体组成，该MHCFcRP实体包含无关抗体的互补VL或VH结构域而不是CH2结构域、以及匹配的CH3 KiH结构域。因此，2/3-IgG中重链和MHCFcRP的CH2结构域被VH或VL结构域所取代。此外，作为与实施例1中描述的2/3-IgG进一步的差别，这些2/3-BiFab衍生物的重链以及MHCFcRP-茎不含有促进重链:MHCFcRP共价连接的半胱氨酸(类似于实施例10的2/3-IgG衍生物)。因为2/3-BiFabs含有交换模块，即CH3结构域，基于与2/3-IgG(无链间二硫键)相同的原理，交换反应能以与针对2/3-IgG所描述和显示的相同方式发生。2/3-BiFab相关的交换反应的一般原则显示于图18中。用于产生2/3-BiFabs的轻链、杵或臼-重链和MHCFcRP臼或杵-链的序列如下：

实施例15

表达和纯化根据本发明的2/3-BiFabs

通过此前描述的本领域技术(WO 2016/087416)，将编码轻链、修饰的茎-重链(杵或臼)和匹配的MHCFcRP-茎(臼或杵)的质粒共转染到哺乳动物细胞(例如HEK293)中，来实现2/3-BiFabs的表达。2/3-BiFabs和标准IgG一样被分泌到培养物上清液中。由于不存在功能性Fc区(因为它们缺乏CH2结构域)，2/3-BiFabs通过标准蛋白L(KappaSelect)亲和色谱进行纯化，如图19和图20所示。令人惊讶的是，2/3-BiFabs能够以有效的方式产生和纯化，即使它们在茎区中没有功能性V区(因为它由不匹配的VH和VL组成)，以及尽管它们不包含用于链共价连接的链间二硫键。尺寸排阻和非变性质谱分析表明，纯化的2/3-BiFab衍生物组装正确以及没有不需要的二聚体和聚集物。在未优化的瞬时表达条件下2/3-BiFabs的表达产率列于下表中。

实施例16

根据本发明通过无还原链交换产生功能性TriFabs

对于2/3-IgG，如上所述的消除Fc-Fc链间二硫键，允许MHCFcRP驱动的交换反应而无需受控制的还原和重新氧化，即在生理条件下进行。因此，在生理条件下“改组”这些分子是可以的，即使在这些分子已经结合到靶细胞表面上后也是可以的。

因此，2/3-BiFab交换反应在没有还原作为交换反应的起始触发器的情况下进行。这些交换反应的输入分子是如上所述具有功能性LeY结合臂和“分割的”地高辛结合茎区(proDig)的结合LeY的2/3-BiFabs。随后，通过NiNTA树脂上吸附不需要的含His8的蛋白，去掉未反应的2/3-BiFabs和MHCFcRP副产物。随后应用FACS分析评估所产生的TriFab的结合功能，并与2/3-BiFab前体分子比较。因此，将表达LeY抗原的MCF7细胞与单个LeY结合性2/3-BiFabs或与交换反应的TriFab接触。随后加入Dig-Cy5，并评估细胞的荧光。图21显示与2/3-BiFabs接触的细胞具有低的地高辛-Cy5相关信号，即使两个实体都具有完整的可识别细胞表面碳水化合物LeY的Fab臂。

2/3-BiFabs不能与地高辛化负载结合的原因是，它们在其茎区中不含有功能性地高辛结合Fv。然而，链交换反应的TriFab产物明确地显示了地高辛-Cy5相关信号，即地高辛结合功能。这表明，其“茎-Fv”具有失活的结合功能的2/3-BiFab前体分子可以通过链交换被转换为全功能性TriFabs。

实施例17

根据本发明2/3-BiFabs前体药物在细胞上转换为全功能细胞结合的活化的双或三特异性TriFabs

2/3-BiFabs只是部分没有结合能力，因为它们包含一个全功能的Fab臂。只有茎区顶端的Fv是非功能性的，因为它由非互补的VH和VL结构域(不同抗体，或包含干扰与关联抗原结合的突变，结合位点的失活前体原形式)组成。如果功能性Fab臂与细胞表面结合，则2/3-BiFabs会在靶细胞上累积。如果两个互补的2/3-BiFabs(均携带失活的但彼此互补的茎-Fvs)与同一细胞的表面结合，则在直接结合在所述细胞的表面时，就可发生链交换。此交换直接在细胞表面上产生全功能TriFab，具有至少两个特异性(图22)。

为了实验证明原位细胞上链交换，将各单个2/3BiFab模块以及经过生化链改组的模块(如上面实施例所描述的)应用于MCF7细胞，然后进行FACS分析。MCF7细胞在其细胞表面携带LeY抗原，因此结合具有功能性Fab臂的各单个2/3-BiFabs。图23显示单独应用的2/3-BiFabs结合到MCF7细胞，但不能捕获第2个靶标地高辛-Cy5(图23，第2行和第3行)。这反映了2/3-BiFab中缺乏功能性茎Fv，因此在只结合一个2/3BiFab的细胞上。然而，同时应用两个(互补的)2/3-BiFabs，能够捕获和保留地高辛-Cy5在MCF7细胞的表面(图23，第4行)。这表明成功进行了链重排/交换，产生了具有茎-Fv的地高辛结合功能的功能性TriFabs。在连续应用互补的2/3-BiFabs后，还观察到了茎区成功的链交换和功能性茎-Fv的恢复(地高辛-Cy5相关的靶向FACS信号)。应用第一实体使细胞结合，然后充分洗涤，以去除未结合分子，随后应用第二实体，也在抗原阳性细胞上产生FACS信号。这证实了成功的交换反应(通过同时或依次应用)可以在靶细胞表面上于生理条件下发生。

实施例18

靶向的抗CD3-前体药物2/3-BiFabs在细胞上链转换为根据本发明的全功能双特异性抗体

为了证明2/3-BiFab前体药物的细胞上转换是可适用于不同结合特异性的一般原则，制备了包含CD3结合抗体的VH或VL结构域的2/3-BiFabs。T细胞双特异性抗体(也称为T细胞招募者)是组合了识别肿瘤细胞表面抗原的结合实体与CD3结合功能的蛋白质。这些分子通过其肿瘤抗原结合实体与肿瘤细胞结合以及(通过CD3结合功能)与T细胞结合。这反过来产生(激活)信号和过程，其最终导致通过抗体结合诱导的T细胞攻击介导的肿瘤细胞裂解/死亡。

具有抗CD3前体药物功能的2/3-BiFabs(即CD3结合位点位于茎区，因此在2/3-BiFab析出物中没有结合能力)按照上文所述设计(参见实施例14和15)。将轻链、杵或臼-重链和匹配的MHCFcRPs共表达，以产生2/3-BiFab LeY-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)和2/3-BiFab LeY-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)。如上所述纯化2/3-BiFabs(参见实施例15中的表)，对其进行细胞上链交换反应。

为了实验证明具有抗CD3-前体药物功能的2/3-BiFabs的细胞上链交换，将它们应用于MCF7细胞。随后通过基于细胞的报告分子检测来确定CD3结合功能的存在或缺乏，所述检测在CD3受体结合后产生信号(Promega T-细胞激活测定(NFAT),cat.#J1621,图24)。

MCF7细胞在其细胞表面携带LeY抗原，因此，单个2/3-BiFabs可以以其功能性Fab臂进行结合。在图25中，可以看到，单独应用的2/3-BiFabs结合MCF7细胞，但不产生或产生低的CD3报告分子信号。这反映了这些分子缺乏CD3结合功能。然而，同时应用两个(互补的)2/3-BiFabs会产生反映高效CD3结合的显著信号。这表明在细胞上/体内成功发生了链重排/交换，并在细胞上产生了具有CD3结合功能的功能性TriFabs。

在连续应用互补的2/3-BiFabs后，还观察到了茎区成功的链交换和功能性茎-Fv(CD3信号)的恢复。应用第一实体使细胞结合，然后充分洗涤以去除未结合的分子，随后应用第二实体，也在抗原阳性细胞上产生了信号。这证实了靶向抗CD3前体药物分子的成功交换反应和激活可以在靶细胞表面于生理条件下发生。

实施例19

不同抗原靶向的2/3-BiFabs前体药物在细胞上转换为根据本发明的全功能细胞结合的活化的三特异性TriFabs

2/3-BiFab介导的链交换和随后前体药物样抗体衍生物的活化可与双抗原结合原理组合。图26所示，这增强了前体药物-活化特异性：在链交换后产生功能性TriFabs的一对2/3BiFabs可以这样产生，其包含相同特异性的茎-Fv互补功能(例如CD3(＝CD-抗原1)或CD-AG-2(＝CD-抗原2)或受益于靶向前体药物方法的其它结合物)，还包含具有不同特异性的细胞表面结合Fab臂。因此，有效的链交换和茎-Fv功能的恢复只在表达两种抗原的细胞上发生。在这样的设置中，交换反应在细胞表面产生三特异性TriFabs，该TriFabs具有源自每个2/3-BiFab的一个Fab臂和从来自两者的互补VH和VL恢复的茎-Fv。提供了前体药物活化的高特异性，因为在单个2/3-BiFab中或在仅结合一个2/3-BiFab的细胞上缺乏茎-Fv功能。只有携带针对两个互补2/3-BiFabs的靶标抗原的细胞(密度足够)，才能进行链交换并进而重构功能性茎-Fv区。在细胞上产生双特异性结合功能也增加了亲合力，因为它将单价细胞表面结合物转换为双价细胞表面结合物。因此，它增加和稳定了TriFab衍生物在靶细胞表面的结合(亲合力介导的改进，也如缺乏二硫键的2/3-IgG所示的那样)。

因此，细胞表面浓度较高，并由此获得额外的特异性。

图27显示了不同抗原靶向的2/3-BiFab前体药物在细胞上转换为全功能、细胞结合的、活化的、三特异性TriFabs的实验结果。产生了结合细胞表面抗原LeY或细胞表面抗原间皮素(MSLN)的互补2/3-BiFabs，将其在同时表达两种抗原的细胞系上组合6小时。两个构建体的(失活的)茎-Fv分别含有地高辛结合抗体的VH或VL。FACS分析表明，在应用仅LeY结合的或仅皮质素结合的2/3-BiFab时缺乏相关的地高辛结合活性(图27，第2和第3列)。然而，两者共同应用导致产生地高辛结合的细胞表面相关功能，显示为这些细胞的荧光增加(图27，第4列)。

实施例20

不同抗原靶向的TriFab前体药物在细胞上转换为根据本发明的三特异性TriFabs

作为起始分子的2/3-BiFab衍生物包含MHCFcRP，其具有修饰的茎-Fv区，在N端没有Fab臂。将Fab臂连接到这些实体上并和重链一起表达，产生如图28所示可交换的2/3-TriFab衍生物。这些分子的MHCFcRPs被改变为潜在具有抗原结合能力的链，这些链在找到其相应的伴侣后交换为功能性三特异性TriFabs。

因此，可以产生具有细胞表面靶标结合特异性“A”的2/3-TriFab衍生物，该衍生物含有非功能性茎-Fv，所述茎-Fv由具有特异性“X”的VH和具有特异性“Y”的VL组成。相应地，可以产生具有细胞表面靶标结合特异性“B”的互补2/3-TriFab衍生物，该衍生物含有非功能性茎-Fv，所述茎-Fv由具有特异性“Y”的VH和具有特异性“X”的VL组成。这些分子的细胞上链交换产生两种类型的三特异性TriFabs，两者都携带(亲合力增强的)双特异性细胞结合Fab臂(A+B两者)。其中一种TriFab具有第一特异性的完全活化的茎-Fv功能，另一种TriFab具有第二茎Fv功能(完全活性的“X”TriFab或完全活性的“Y”TriFab)。应用这种TriFab-前体药物对，例如，应允许选择性地仅在那些同时表达两种指定(癌症)表面抗原的细胞上(密度足够)，同时将CD3和CD-AG-2结合物(或其它受益于亲合力增强的特异性前体药物活化的结合物对)从非活性形式转换为活性形式。

实施例21

根据本发明的三或四特异性2/3-BiFab前体药物衍生物

设计和可产生2/3-BiFab衍生物作为如本文报告的交换反应的起始分子，其中MHCFcRPs通过肽接头(例如(G4S)6接头)与重链的C端共价连接。这产生类似于TriFabs的单链茎模块的“非功能性”实体，如图29所示。将Fab臂附加到这些单链茎模块上，可产生能够进行交换的TriFab衍生物。两种这样的衍生物可以交换为如图29所示的功能性三或四特异性抗体衍生物。

链	SEQ ID NO:
		单链抗LeY-地高辛TriFab重链(杵)–生物素VL(臼)	92
单链抗LeY-地高辛TriFab重链(臼)–生物素VL(杵)	93

LeY结合区可与能够结合其它抗原的序列交换，以产生可以结合细胞上不同抗原并以图28中描述的方式重排的抗体-前体药物。

实施例22

根据本发明的靶向性抗CD3-前体药物2/3-BiFabs的细胞上链转换，实现有效的T细胞介导的肿瘤细胞灭杀

此实施例证实了2/3-BiFab前体药物在细胞上转换为CD3结合的TriFabs可以实现T细胞介导的靶肿瘤细胞灭杀：产生结合LeY肿瘤抗原的2/3-BiFabs，所述2/3-BiFabs包含CD3结合抗体的VH或VL结构域。这些2/3-BiFab前体药物的设计与产生描述于前面的实施例中。这些2/3-BiFab前体药物的CD3结合物的VH和VL序列描述于US 2015/0166661A1中。

为了证明这些分子在同时结合时诱导细胞介导的灭杀，将它们以不同浓度应用于LeY阳性MCF7细胞。因此，将MCF7细胞种在96孔板中，孵育过夜，然后使这些细胞与2/3-BiFab抗-LeY-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)和2/3-BiFab抗-LeY-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)接触。单独/依次、或组合添加这些组分。为了评估T细胞介导的灭杀，以5:1的比率加入来自健康供体的全血的PBMC(通过本领域技术Ficoll纯化进行分离)。然后，将培养物于37℃、5％二氧化碳条件下保持48小时，然后(应用本领域技术LDH释放测定)评估肿瘤细胞裂解的程度。

这些测定的结果示于图30中。

MCF7细胞在其细胞表面携带LeY抗原，因此，各单个2/3-BiFabs可以与其功能Fab臂结合。单独应用2/3BiFab，即施用抗LeY-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)或2/3-BiFab抗LeY-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)，即使在高摩尔浓度下，也不导致相关的T细胞介导的灭杀(不释放LDH)。这反映了这些分子缺乏CD3结合功能(其为T细胞介导的细胞裂解所需要)。

相反，同时应用两种(互补的)2/3-BiFabs导致了显著的LDH释放。这反映了已经在相当低的浓度下发生了显著的肿瘤细胞裂解。其原因是在肿瘤细胞表面成功进行了链重排/交换，并产生了具有CD3结合功能的功能性TriFabs。这些功能性结合CD3的TriFabs随后招募和结合T细胞，这又导致靶肿瘤细胞裂解。

实施例23

根据本发明的AG-4和EGFR靶向的抗CD3前体药物2/3-BiFabs的细胞上链转换，实现有效的T细胞介导的肿瘤细胞灭杀和强烈的细胞因子释放

与实施例22中描述的实验设置类似，以2/3-BiFabs分别靶向表达AG-4的HELA细胞和表达EGFR的A431细胞。

向HELA细胞施用抗-AG-4-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)或2/3-BiFab抗-AG-4-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)不会导致相关的细胞介导的灭杀(不释放LDH)。这反映了这些分子缺乏CD3结合功能(其为T细胞介导的细胞裂解所需要)。

此外，向A431细胞施用抗EGFR-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)或2/3-BiFab抗EGFR-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)不导致相关的细胞介导的灭杀(不释放LDH)。

相反，同时应用两个(互补的)2/3-BiFabs在两个靶细胞设置中都产生了显著的LDH释放。这反映了已经在相当低浓度下实现肿瘤细胞的显著裂解(图31)。其原因是肿瘤细胞表面上2/3-BiFabs之间的成功链交换与具有CD3结合功能的功能性TriFabs的产生。

此外，图32显示靶向HELA细胞的AG-4在4nM浓度的细胞因子分泌量。在应用抗AG-4-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)和2/3-BiFab抗-AG-4-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)两者的设置中，存在显著更多量的IL-2、IFN-γ、颗粒酶B和TNFα，从而也在细胞因子水平上反映了强免疫反应(图32)。

实施例24

EGFR和AG-4在HELA细胞上的双靶向，实现根据本发明的抗CD3前体药物2/3-BiFabs的细胞上链转换和有效的T细胞活化

使用在CD3受体结合后产生信号的报告分子细胞系(Promega T细胞活化生物测定(NFAT)，cat.#J1621)，在功能检测中评估了双靶向。

以靶向AG-4或EGFR的2/3-BiFab处理表达细胞表面抗原4(AG-4)和表皮生长因子(EGFR)的HELA细胞(图33)。两个构建体的(失活的)茎-Fv分别含有CD3结合抗体的VH或VL。结果表明，在仅应用EGFR-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)或仅AG-4-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)时，缺乏相关的CD3结合活性。但是，两者共同应用会导致与CD3的显著结合和报告细胞系的激活(图34)。作为对照，分析了EGFR-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)和AG-3-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)分子。关于抗原表达，HELA细胞是AG-3阴性的，因此只有EGFR靶向的2/3-BiFabs能够结合。此对照另外证明了在细胞表面上发生了改组反应，且只有当两个2/3-BiFabs都结合到细胞表面时发生。如果在培养基中转换即使于低浓度下也已经有效，则转换产物EGFR/AG-3/CD3 TriFab将能够通过EGFR结合实体结合细胞表面，从而诱导CD3介导的活化，这未检测。

实施例25

具有单链茎模块的三特异性2/3Fab前体药物衍生物进行根据本发明的细胞上转换，从而产生两个额外的结合位点并强烈激活T细胞

设计和产生2/3-BiFab衍生物作为如本文报告的交换反应的起始分子，其中MHCFcRPs通过肽接头(例如(G4S)6接头(SEQ ID NO:81x 6))与重链的C端共价连接。这产生类似于TriFabs的单链茎模块的“非功能性”实体，如图29所示。将Fab臂加到这些单链茎模块上，可产生能够进行交换的TriFab衍生物。两种这样的衍生物可以交换为如图29所示的功能性三特异性抗体衍生物。

链	SEQ ID NO:
		单链抗LeY-地高辛TriFab重链(杵)–Bio VL(臼)	92
单链抗LeY-地高辛TriFab重链(臼)–Bio VH(杵)	93

图35描述了通过流式细胞仪进行结合研究的设置。获得的结果如图36所示。构建体的任何一个单独都未导致地高辛-Cy5或bio-488的结合(图36A：第2行和第3行；图36B：第2行和第3行)，然而，两者的共同应用，导致产生地高辛和生物素结合的细胞表面相关功能，表现为这些细胞的荧光增加(图36A：第4行；图36B：第4行)。

因此，通过将单链抗LeY-CD3-TriFab重链(杵)-CD-AG-2-VL(臼)与单链抗LeY-CD3-TriFab重链(臼)-CD-AG-2-VH(杵)相结合，产生了具有CD3和CD-AG-2结合实体的三特异性抗体(图37)。通过使用(Promega T-cell Activation Bioassay(NFAT),cat.#J1621)证明了这些分子激活T细胞的能力，如图38所示。

实施例26

具有额外结合位点的Fab型MHCFcRP二聚体作为根据本发明的靶向性抗CD3前体药物2/3-BiFabs细胞上链转换的副产物

如图18所示，具有特异性4的MHCFcRP副产物可以是非结合的。然而，通过在MHCFcRP中加入功能性结合实体的VH或相应VL，在交换反应过程中产生了功能性、即具有结合能力的Fab分子。为了显示MHCFcRP副产物的结合功能，单独或组合地，将携带CD-AG-2MHCFcRP的LeY靶向2/3-BiFabs对，加入到培养基中。此外，还加入了表达CD-AG-2的LeY阴性Jurkat细胞。整个设置如图39所示。以PE-抗His6抗体检测MHCFcRP副产物。单独2/3-BiFabs(图40，第2行和第3行)没有导致检测抗体的His6结合，因为Jurkat细胞是LeY阴性的，2/3-BiFab不能结合细胞表面。结合两个2/3-BiFabs导致产生能够结合CD-AG-2的MHCFcRP副产物，所述副产物可以通过流式细胞仪以抗His6抗体进行检测(参见图40，第4行)。由于LeY表达缺乏，未反应的2/3-BiFabs不能结合细胞。

实施例27

具有额外N端融合的Fab作为靶向实体的MHCFcRP允许双价细胞靶向，介导细胞上转换和产生根据本发明的三价MHCFcRP副产物

作为起始分子的2/3-BiFab衍生物包含MHCFcRP，具有修饰的茎-Fv区，在其N端没有Fab臂。将Fab臂连接到这些实体上并和重链一起表达，产生如图41所示可交换的2/3-TriFab衍生物。这些分子的MHCFcRPs被改变为具有LeY结合能力的链，这些链在找到其相应的伴侣后交换为功能性三特异性TriFabs。

因此，可以产生具有LeY靶标结合特异性的2/3-TriFab衍生物，该衍生物含有非功能性茎-Fv，所述非功能茎-Fv由具有CD3特异性的VH和CD-AG-2特异性的VL组成，或反之亦然。这些分子的细胞上链交换产生两种类型的三特异性TriFabs，两种TriFabs都携带(亲合力增强的)双特异性LeY Fab臂。其中一种TriFab具有CD3特异性的完全活性茎-Fv功能，另一种TriFab具有CD-AG-2茎Fv功能。对表达LeY的MCF7细胞应用这种TriFab-前体药物对，例如，能够同时将CD3和CD-AG-2结合物从非活性形式转换为活性形式。

结果如图42所示。结果表明，在仅应用LeY-proCD3(杵)-LeY-proCD-AG-2-MHCFcRP(臼)或LeY-proCD3(臼)-LeY-proCD-AG-2-MHCFcRP(杵)时，缺乏相关的T细胞激活实体。然而，两者的共同应用会导致显著的T细胞激活。

实施例28

可选2/3-BiFab衍生物保持CH2依赖的FcRn结合完整性并表现出根据本发明的细胞上链转换

作为起始分子的2/3-BiFab衍生物包含具有修饰的茎-Fv区的MHCFcRP。为了保持来自IgG的CH2结构域和由此结合FcRn的能力(用于延长半衰期)，可将可变域片段加到CH2-CH3二聚体的C端，如图43所示。CH3结构域中的部分去稳定化突变与2/3-BiFabs中的相同。或者，可将可变域片段引入在Fc-部分(CH2+CH3)和Fab部分之间，如图44所示。所有抗体均如上文所述表达，产量良好(72毫克/升至161毫克/升)。图45证实，含CH2的形式表现出与FcRn更强结合的能力，揭示了相较于起始2/3-BiFabs延长的血清半衰期(分析性FcRn亲和色谱按Schlothauer，T.等，MAbs 5(2013)576-586中的描述进行)。

如上所述，通过流式细胞仪分析含CH2的2/3-BiFabs赋予细胞上链转换的能力。将两个析出物分子依次应用(中间两次洗涤)于MCF7细胞。链交换后组装了功能性抗地高辛结合位点，因此能够在细胞表面结合地高辛化的Cy5而被FACS检测到。根据图43和图44的两类分子都成功进行了根据本发明的链交换反应，如图46中所示。

实施例29

包含CH2结构域的2/3-BiFabs能够在根据本发明的方法中转换为功能性CD3结合位点，从而介导T细胞活化

使用上述Jurkat活化测定，分析了含CH2、C端附加有可变片段的2/3-BiFabs(图47)产生功能性CD3结合物的能力。以MCF7细胞作为靶细胞，LeY作为靶标抗原。虽然2/3-BiFabs没有诱导显著的Jurkat活化，但两者的组合导致报告系统(RLU)中剂量依赖性的活化和光发射(图48)。

实施例30

透射电子显微镜确认2/3-Bfabs及其相应产物的结构，并揭示其具有高度柔性

为了分析根据本发明方法中获得的2/3-BiFabs及相应链交换产物的形状和结构，进行了负染色透射电子显微镜(NS-TEM)分析。结果(图49)揭示了刚性结构域内特征，但结构域间柔性高。

网格制备：将刚刚解冻的样品在D-PBS中稀释至浓度约为5毫克/毫升。将4微升稀释后的样品吸附到辉光放电的400目碳膜Parlodion铜网上，用3滴水洗涤，以3微升含TMV的溶液孵育，进一步用2滴水洗涤，最后以2滴2％的醋酸铀染色。

透射电子显微镜：使用Tecnai12透射电子显微镜(FEI,Eindhoven,荷兰)在120千伏下运行对样品成像。电子显微图以标称放大倍率195，000x记录在2048x2048像素的电荷偶联装置照相机(Veleta Gloor Instruments)上，在试样水平上达到0.296纳米的最终像素大小。或者，使用FEI Tecnai G2 Spirit TEM(FEI,Eindhoven,荷兰)在80千伏下运行对样品成像。然后，电子显微图以标称放大倍率135,000x记录在2048x2048像素的电荷偶联装置照相机(Veleta Soft Imaging Systems)上，在试样水平上达到0.33纳米的最终像素大小。

图像处理：使用EMAN2图像处理包，对从所记录的图像中手动选择的粒子进行无参考比对(参见，例如G.Tang,L.等,J.Struct.Biol.157(2007)38-46)。通过多变量统计分析对提取的粒子进行比对和分类，获得二维数组平均值。此外，当无法求数组平均值时，也使用Photoshop对粒子的原始图像手动染色以使其变清晰。

实施例31

与靶标无关的链转换仅在高浓度情况下低效发生

为了探究链转换是否也在培养基中于高浓度情况下发生，将2/3-BiFabs应用于与PBMC共同培养的HELA细胞。在第一设置中，应用了抗AG-4-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)和EGFR-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)(由于两个靶标都在HELA细胞上表达，细胞上转换得以发生)。在第二设置中，应用了抗AG-4-proCD3(臼)-MHCFcRP(杵)和AG-3-proCD3(杵)-MHCFcRP(臼)(AG-3不在HELA细胞上表达，因此应不可能发生细胞上转换)。然而，在300nM浓度情况下的灭杀百分率显示，培养基中的转换和通过AG-4结合位点与HELA细胞表面的单价结合很少发生，并且介导的靶细胞灭杀仅以低百分率发生(图50)。

Claims

1.多聚体多肽，其包含

第一多肽，其包含

i)以N端至C端方向，a)选自特异地与第一靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域的第一抗体可变域，和b)第一人免疫球蛋白G CH3结构域，

ii)特异地与第二靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，位于第一抗体可变域的N端或第一CH3结构域的C端，

第二多肽，其包含

i)以N端至C端方向，a)选自特异地与第三靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域的第二抗体可变域，和b)第二人免疫球蛋白G CH3结构域，

以及

其中第二CH3结构域包含干扰突变，所述突变选自D356K,E357K,K370E和K439E，由此，第一CH3结构域包含

a)第439位的氨基酸残基K，如果干扰突变是D356K，或

b)第370位的氨基酸残基K，如果干扰突变是E357K，或

c)第357位的氨基酸残基E，如果干扰突变是K370E，或

d)第356位的氨基酸残基D，如果干扰突变是K439E，

和

ii)可选地，特异地与第二或第四靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，位于第二抗体可变域的N端或第二CH3结构域的C端，

其中所有编号均根据Kabat EU索引进行。

2.多聚体多肽，其包含

第一多肽，其包含

i)以N端至C端方向，a)第一人免疫球蛋白G CH3结构域，和b)选自特异地与第一靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域的第一抗体可变域，

ii)特异地与第二靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，位于第一CH3结构域的N端或第一可变域的C端，

第二多肽，其包含

i)以N端至C端方向，a)第二人免疫球蛋白G CH3结构域，和b)选自特异地与第三靶标结合的一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域的第二抗体可变域，

其中如果第一抗体可变域是抗体重链可变域，则第二抗体可变域是抗体轻链可变域；或如果第一抗体可变域是抗体轻链可变域，则第二抗体可变域是抗体重链可变域，

以及

a)第439位的氨基酸残基K，如果干扰突变是D356K，或

b)第370位的氨基酸残基K，如果干扰突变是E357K，或

c)第357位的氨基酸残基E，如果干扰突变是K370E，或

d)第356位的氨基酸残基D，如果干扰突变是K439E，

和

ii)可选地，特异地与第二或第四靶标结合的一对抗体轻链和重链可变域，位于第二CH3结构域或第二可变域的N端，

其中所有编号均根据Kabat EU索引进行。

3.根据权利要求1至2之任一的多聚体多肽，其中第一CH3结构域和第二CH3结构域还包含促进所述第一CH3结构域和所述第二CH3结构域之间异二聚体形成的突变，所述突变不同于干扰突变。

4.根据权利要求1至3之任一的多聚体多肽，其中

第一CH3结构域包含

a)T366W突变，或

b)T366S/L368A/Y407V突变，

以及

第二CH3结构域包含

a)T366S/L368A/Y407V突变，如果第一CH3结构域包含T366W突变，或

b)T366W突变，如果第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变。

5.根据权利要求1至4之任一的多聚体多肽，其中第一多肽和第二多肽是非共价二聚体。

6.根据权利要求1至5之任一的多聚体多肽，其中第一可变域和第二可变域形成非功能性结合位点。

7.根据权利要求1至6之任一的多聚体多肽，其中如果第一CH3结构域位于第一可变域的C端，则第一和第二多肽分别在第一和第二可变域的N端包含氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQID NO:66)或DKTHT(SEQ ID NO:94)或GGGS(SEQ ID NO:69)或DKTHGGGGS(SEQ ID NO:97)；或如果第一可变域位于第一和第二CH3结构域的C端，则第一和第二多肽分别在第一和第二CH3结构域的N端包含氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)或DKTHT(SEQ ID NO:94)或GGGS(SEQ ID NO:69)或DKTHGGGGS(SEQ ID NO:97)。

8.根据权利要求1至7之任一的多聚体多肽，其中

i)第一CH3结构域包含T366W突变和第439位上的氨基酸残基K，

以及

第二CH3结构域包含D356K干扰突变和T366S/L368A/Y407V突变，或

ii)第一CH3结构域包含T366W突变和第370位上的氨基酸残基K，

以及

第二CH3结构域包含E357K干扰突变和T366S/L368A/Y407V突变，或

iii)第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变和第357位上的氨基酸残基E，

以及

第二CH3结构域包含K370E干扰突变和T366W突变，或

iv)第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变和第356位上的氨基酸残基D，

以及

第二CH3结构域包含K439E干扰突变和T366W突变。

9.根据权利要求1至8之任一的多聚体多肽，其中第一、第二和第三靶标是不同的。

10.根据权利要求1至9之任一的多聚体多肽，其中第一靶标和/或第三靶标是人CD3。

11.根据权利要求1至10之任一的多聚体多肽，其中与第二靶标特异性结合的抗体轻链可变域和抗体重链可变域对选自：Fv,scFc,Fab,scFab,dsscFab,CrossFab,双特异性Fab,sdAb和VHH。

12.根据权利要求1至11之任一的多聚体多肽，其中所述与第四靶标特异性结合的抗体轻链可变域和抗体重链可变域对，独立于与第二靶标特异性结合的抗体轻链和重链可变域对，选自Fv,scFc,Fab,scFab,dsscFab,CrossFab,双特异性Fab,sdAb和VHH。

13.根据权利要求1至12之任一的多聚体多肽，其中第一和第二多肽分别还直接在CH3结构域的N端包含免疫球蛋白G CH2结构域。

14.根据权利要求1至13之任一的多聚体多肽，其中人免疫球蛋白G是人IgG1或人IgG2或人IgG3或人IgG4。

15.包含根据权利要求1至14之任一的第一多聚体多肽和根据权利要求1至14之任一的第二多聚体多肽的组合物，其中

或

以及

和

以及

第二和第四靶标彼此独立地是细胞表面抗原。

16.根据权利要求15的组合物，其中第一多聚体多肽的第一CH3结构域和第二多聚体多肽的第二CH3结构域包含相同的突变以促进异二聚体形成，以及第一多聚体多肽的第二CH3结构域和第二多聚体多肽的第一CH3结构域包含相同的突变以促进异二聚体形成。

17.根据权利要求15至16之任一的组合物，其中

第一多肽的第一CH3结构域包含

a)T366W突变，或

b)T366S/L368A/Y407V突变，

以及

第一多肽的第二CH3结构域包含

a)T366S/L368A/Y407V突变，如果第一CH3结构域包含T366W突变，或

b)T366W突变，如果第一CH3结构域包含T366S/L368A/Y407V突变。

18.根据权利要求15至17之任一的组合物，其中

第一多聚体多肽的第一CH3结构域和第二多聚体多肽的第二CH3结构域包含T366W突变或T366S/L368A/Y407V突变，

并且

或

并且

第二和第四靶标彼此独立地是细胞表面抗原。

19.根据权利要求15至18之任一的组合物，其中第一和/或第三靶标是人CD3。

20.根据权利要求15至19之任一的组合物，其中组合物是药物组合物，并可选地还包含药学可接受的辅料。

21.根据权利要求1至14之任一的多聚体多肽或根据权利要求15至20之任一的组合物用作药物。

22.一种治疗方法，该方法包括对需要这种治疗的患者施用根据权利要求1至14之任一的多聚体多肽或根据权利要求15至20之任一的组合物。