JP6800154B2 - 結合形成酵素の活性アッセイ - Google Patents
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Description
本発明は、一般に、結合形成酵素の存在および/または活性の検出に関する。本発明は、具体的には、ソルターゼの存在および/または活性の検出に関する。
発明の背景
ソルターゼおよびトランスグルタミナーゼのような結合形成酵素は、産業的過程および生体内変化過程においてより重要になりつつある。生産ツールとして酵素を使用するためには、それらの特性を決定することが必要である。
ソルターゼおよびトランスグルタミナーゼのような結合形成酵素は、産業的過程および生体内変化過程においてより重要になりつつある。生産ツールとして酵素を使用するためには、それらの特性を決定することが必要である。
酵素アッセイは、ある種の酵素の活性を決定する方法である。これは、酵素の特異性または動力学を研究するのに必要である。NADのような発色性もしくは蛍光発生性の基質またはコファクターを加工する酵素は、モニタリングするのが容易である。これらのアッセイは、かなり以前から公知であり、複数の酵素について標準的な活性アッセイが開発されている。これらのアッセイの大部分は、実施するのが迅速であり容易である。しかしながら、多くの酵素が、発色性または蛍光発生性の基質またはコファクターを使用しない。これは、例えば、一般の結合形成酵素の代表として本明細書において使用される結合形成酵素ソルターゼに当てはまる。
結合形成酵素反応をモニタリングするための様々な方法が発表されている。一般に使用されているのは、反応物（educts）と生成物との間の重量または疎水性の変化を決定するための質量分析またはHPLCである。しかしながら、これらの方法は、複雑であり、時間がかかり、平行して実施するのが困難である。さらに、結合形成酵素反応の反応物および生成物のサイズの差を研究するためには、SDS-PAGEを使用することができる。
ソルターゼ反応の初期の研究（Ton-That et al.,PNAS 96(1999)12424-12429（非特許文献1））において、SDSゲル分析およびHPLC分析の組み合わせが、動力学的データを含まない全く定性的な研究において実施されている。Ton-Thatら（J Biol Chem 275(2000)9876-9881（非特許文献2））において、ソルターゼ反応の動力学的データが示されている。そこでは、質量分析、HPLC、および吸光度測定の組み合わせが使用されている。しかしながら、シグナルがLPETG基質の切断にのみ由来するため、ペプチド転移反応をモニタリングすることは不可能である。
Liら（Chinese Journal of Biotechnology 30(2)(2014)284-293（非特許文献3））においては、ソルターゼAによって触媒されるタンパク質ライゲーションの効率を、SDS-PAGEを介してモニタリングするレポーター系が報告されている。
Oteng-Pabiら（Analytical Biochemistry 441(2013)169-173（非特許文献4））は、放出されたNH3を介した、微生物トランスグルタミナーゼ活性についての連続酵素共役アッセイを報告している。
Matsumotoら（Journal of Biotechnology 152(2011)37-42（非特許文献5））においては、ソルターゼAを使用した部位特異的四量体ストレプトアビジン-タンパク質コンジュゲーションが報告されている。
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ソルターゼ、トランスペプチダーゼSrtAにおける逆プロトン化触媒機序についての動力学的な機序および証拠への洞察は、Frankelら（Biochemistry 44(2005)11188-11200（非特許文献6））に記載されている。
従って、結合形成酵素の検出のための、迅速で、信頼性があり、効率的で、高感度で、再現性があり、かつ実施するのが容易なアッセイを提供する必要がある。
Ton-That et al.,PNAS 96(1999)12424-12429
J Biol Chem 275(2000)9876-9881
Chinese Journal of Biotechnology 30(2)(2014)284-293
Analytical Biochemistry 441(2013)169-173
Journal of Biotechnology 152(2011)37-42
Biochemistry 44(2005)11188-11200
結合形成酵素、具体的には、ソルターゼの存在および/または活性の検出のための方法およびアッセイが、本明細書において報告される。
より詳細には、本発明の方法によって、一般的に使用されている方法と比較して、より迅速で、より高感度で、再現性があり、信頼性があり、かつ/または迅速なスクリーニングのために適当な、結合形成酵素の活性を検出するアッセイを確立することができることが見出された。本明細書において報告された方法においては、とりわけ、第1の切断反応のみが検出可能ないくつかの市販のソルターゼアッセイに当てはまるように、部分的な反応のみが測定され得るのではない。むしろ、本発明においては、完全な反応が起こった場合にのみ、結合形成酵素の活性を検出することができる。例えば、それ自体が固相（例えば、マルチウェルプレートまたはビーズ）に結合していてもよい要素との、レポーター酵素のライゲーション反応の成功を検出することによって、結合形成酵素、例えば、ソルターゼの活性を検出することができることが見出された。本明細書において報告される方法は、高速液体クロマトグラフィ（HPLC）に基づく方法またはMatsumotoら（Langmuir 28(2012)3553-3557）において報告されたもののような現在公知の方法と比べて、改善された特性を有し、スピード、複雑さ、頑強さ、再現性、および感度のうちの少なくとも一つが改善されている。
本明細書において報告される一つの局面は、
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中に結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）固定化タグによって/使用して、（工程（a）の）コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、（試料中の）結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法である。
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中に結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）固定化タグによって/使用して、（工程（a）の）コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、（試料中の）結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、さらに、試料が遠心分離される。
本明細書において報告される一つの局面は、
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中に結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、即ち、第1の基質が第2の基質にコンジュゲートされる、工程、
（b）試料を遠心分離する工程、
（c）固定化タグによって/使用して、（工程（a）の）コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（d）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中の結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法である。
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中に結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、即ち、第1の基質が第2の基質にコンジュゲートされる、工程、
（b）試料を遠心分離する工程、
（c）固定化タグによって/使用して、（工程（a）の）コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（d）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中の結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、さらに、試料が、2500×g〜7500×gで5分間〜15分間遠心分離される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（機能性の）結合形成酵素の存在が検出される（定性的検出）。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、結合形成酵素の活性の程度が決定される（定量的検出）。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、固定化タグを含む第1の基質は第1の結合形成酵素認識モチーフを含み、かつ検出可能標識を含む第2の基質は第2の結合形成酵素認識モチーフを含む。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、第1の結合形成酵素認識モチーフは第1のソルターゼ認識モチーフであり、かつ第2の結合形成酵素認識モチーフは第2のソルターゼ認識モチーフである。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、
（1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含む。
（1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含む。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、検出可能標識は、タンパク質、フルオロフォア、放射性元素、ナノ粒子、または比色定量色素である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、検出可能標識は酵素である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、検出可能標識は比色定量反応を触媒する酵素である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、検出可能標識はグルコースデヒドロゲナーゼである。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、固定化タグは特異的結合対の第1のメンバーであり、かつ固相は特異的結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされている。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、固定化タグはビオチンであり、かつ固相はストレプトアビジンまたはアビジンにコンジュゲートされている。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、固相はマルチウェルプレートである。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、固相はビーズである。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、さらに、試料は10倍〜30倍に希釈される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、さらに、試料は15倍〜25倍に希釈される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、さらに、試料は約1:20（20倍）に希釈される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、さらに、試料はヨードアセトアミド（IAA）を含む溶液で希釈される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、ヨードアセトアミド（IAA）が添加される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（それぞれ、工程（b）または（c）の）固定化の後、さらに、試料は少なくとも3回洗浄される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（それぞれ、工程（b）または（c）の）固定化の後、さらに、試料は少なくとも4〜12回洗浄される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（それぞれ、工程（b）または（c）の）固定化の後、さらに、試料は少なくとも6〜10回洗浄される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、結合形成酵素はソルターゼである。
本明細書において報告される一つの局面は、
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中にソルターゼが存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）固定化タグによって/使用して、（工程（a）の）コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中のソルターゼを検出する、試料中のソルターゼの検出のための方法である。
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中にソルターゼが存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）固定化タグによって/使用して、（工程（a）の）コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中のソルターゼを検出する、試料中のソルターゼの検出のための方法である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、さらに、試料は遠心分離される。
本明細書において報告される一つの局面は、
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中にソルターゼが存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、即ち、第1の基質が第2の基質にコンジュゲートされる、工程、
（b）試料を遠心分離する工程、
（c）固定化タグによって/使用して（工程（a）の）コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（d）検出可能標識によって/使用して固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中のソルターゼを検出する、試料中のソルターゼの検出のための方法である。
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中にソルターゼが存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、即ち、第1の基質が第2の基質にコンジュゲートされる、工程、
（b）試料を遠心分離する工程、
（c）固定化タグによって/使用して（工程（a）の）コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（d）検出可能標識によって/使用して固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中のソルターゼを検出する、試料中のソルターゼの検出のための方法である。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、さらに、試料は2500×g〜7500×gで5分間〜15分間遠心分離される。
この局面の一つの態様において、（機能性の）ソルターゼの存在が検出される（定性的検出）。
この局面の一つの態様において、ソルターゼの活性の程度が決定される（定量的検出）。
この局面の一つの態様において、固定化タグを含む第1の基質は第1のソルターゼ認識モチーフを含み、かつ検出可能標識を含む第2の基質は第2のソルターゼ認識モチーフを含む。
この局面の一つの態様において、
（1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含む。
（1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含む。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、さらに、試料は10倍〜30倍に希釈される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、さらに、試料は15倍〜25倍に希釈される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、さらに、試料は約1:20（20倍）に希釈される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、さらに、試料はヨードアセトアミド（IAA）を含む溶液で希釈される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（工程（a）の）インキュベーションの後、ヨードアセトアミド（IAA）が添加される。
本明細書において報告される一つの局面は、
（a）少なくとも2種の結合形成酵素を準備する工程、
（b）少なくとも2種の結合形成酵素を用いて本明細書において報告される方法を実施する工程、
（c）工程（b）において検出された結合形成酵素を選択する工程
によって、複数の結合形成酵素から1種類の結合形成酵素を選択するための方法である。
（a）少なくとも2種の結合形成酵素を準備する工程、
（b）少なくとも2種の結合形成酵素を用いて本明細書において報告される方法を実施する工程、
（c）工程（b）において検出された結合形成酵素を選択する工程
によって、複数の結合形成酵素から1種類の結合形成酵素を選択するための方法である。
この局面の一つの態様において、最も高い活性を有する結合形成酵素が選択される。
本明細書において報告される一つの局面は、
（a）少なくとも2種のソルターゼを準備する工程、
（b）少なくとも2種のソルターゼを用いて本明細書において報告される方法を実施する工程、
（c）工程（b）において検出されたソルターゼを選択する工程
によって、複数のソルターゼから1種類のソルターゼを選択する方法である。
（a）少なくとも2種のソルターゼを準備する工程、
（b）少なくとも2種のソルターゼを用いて本明細書において報告される方法を実施する工程、
（c）工程（b）において検出されたソルターゼを選択する工程
によって、複数のソルターゼから1種類のソルターゼを選択する方法である。
この局面の一つの態様において、最も高い活性を有するソルターゼが選択される。
本明細書において報告される一つの局面は、
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中に結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）固定化タグによって/使用して、（工程（a）の）コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、（試料中の）結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための結合形成アッセイである。
[本発明1001]
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中に結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）試料を遠心分離する工程、
（c）固定化タグによって（/使用して）、工程（a）のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（d）検出可能標識によって（/使用して）、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中の結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法。
[本発明1002]
工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料が10倍〜30倍に希釈される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
固定化タグを含む第1の基質が第1の結合形成酵素認識モチーフを含み、かつ検出可能標識を含む第2の基質が第2の結合形成酵素認識モチーフを含む、本発明1001〜1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
第1の結合形成酵素認識モチーフが第1のソルターゼ認識モチーフであり、かつ第2の結合形成酵素認識モチーフが第2のソルターゼ認識モチーフである、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
（1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフもしくはオリゴアラニンモチーフを含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフもしくはオリゴアラニンモチーフを含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
検出可能標識が酵素である、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
固定化タグが特異的結合対の第1のメンバーであり、かつ固相が特異的結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされている、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
固定化タグがビオチンであり、かつ固相にストレプトアビジンまたはアビジンがコンジュゲートされている、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
固相がマルチウェルプレートである、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
固相がビーズである、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1011]
工程（a）のインキュベーションの後、試料が、ヨードアセトアミド（IAA）を含む溶液で希釈される、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
試料が、2500×g〜7500×gで5分間〜15分間遠心分離される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
工程（c）の固定化の後、さらに、試料が少なくとも3回洗浄される、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
（a）少なくとも2種の結合形成酵素を準備する工程、
（b）該少なくとも2種の結合形成酵素を用いて本発明1001の方法を実施する工程、
（c）工程（b）において検出された結合形成酵素を選択する工程
によって、複数の結合形成酵素から1種類の結合形成酵素を選択するための方法。
[本発明1015]
最も高い活性を有する結合形成酵素が選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
結合形成酵素がソルターゼである、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中に結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）固定化タグによって/使用して、（工程（a）の）コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、（試料中の）結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための結合形成アッセイである。
[本発明1001]
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中に結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）試料を遠心分離する工程、
（c）固定化タグによって（/使用して）、工程（a）のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（d）検出可能標識によって（/使用して）、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中の結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法。
[本発明1002]
工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料が10倍〜30倍に希釈される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
固定化タグを含む第1の基質が第1の結合形成酵素認識モチーフを含み、かつ検出可能標識を含む第2の基質が第2の結合形成酵素認識モチーフを含む、本発明1001〜1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
第1の結合形成酵素認識モチーフが第1のソルターゼ認識モチーフであり、かつ第2の結合形成酵素認識モチーフが第2のソルターゼ認識モチーフである、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
（1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフもしくはオリゴアラニンモチーフを含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフもしくはオリゴアラニンモチーフを含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
検出可能標識が酵素である、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
固定化タグが特異的結合対の第1のメンバーであり、かつ固相が特異的結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされている、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
固定化タグがビオチンであり、かつ固相にストレプトアビジンまたはアビジンがコンジュゲートされている、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
固相がマルチウェルプレートである、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
固相がビーズである、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1011]
工程（a）のインキュベーションの後、試料が、ヨードアセトアミド（IAA）を含む溶液で希釈される、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
試料が、2500×g〜7500×gで5分間〜15分間遠心分離される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
工程（c）の固定化の後、さらに、試料が少なくとも3回洗浄される、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
（a）少なくとも2種の結合形成酵素を準備する工程、
（b）該少なくとも2種の結合形成酵素を用いて本発明1001の方法を実施する工程、
（c）工程（b）において検出された結合形成酵素を選択する工程
によって、複数の結合形成酵素から1種類の結合形成酵素を選択するための方法。
[本発明1015]
最も高い活性を有する結合形成酵素が選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
結合形成酵素がソルターゼである、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
発明の詳細な説明
本発明の方法によって、結合形成酵素の活性の検出のための改善されたアッセイを確立することができることが見出された。
本発明の方法によって、結合形成酵素の活性の検出のための改善されたアッセイを確立することができることが見出された。
結合形成酵素の完全/完璧な反応を検出する系を使用し、第1の結合形成酵素認識モチーフを含む固定化タグ（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）を含む第1の基質および第2の結合形成酵素認識モチーフを含む検出可能標識（例えば、レポーター酵素）を含む第2の基質を使用することによって、改善された活性アッセイを提供することができる。
非限定的に、スピード、迅速なスクリーニングのための利用可能性、感度、材料および装置のコストの改善。
本明細書において報告される方法によって、例えば、レポーター酵素を異なるソルターゼ認識モチーフに融合させ、これを第1の基質として使用することによって、直接（例えば、測光法によって）ソルターゼの動力学を測定することができる。第2の基質として、例えば、ビオチン化されたグリシンまたはアラニンが、求核剤として使用される。ソルターゼが第1および第2の基質に添加される場合、生成物はビオチン化されたレポーター酵素である。この生成物は、ビオチンによって、固相、例えば、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチウェルプレート（SA-MTP）に付着させられてもよい。レポーター酵素のための基質が添加される時、生成物が検出され得る。
レポーター酵素の活性の量に関して、洗浄後には、ビオチン化されたレポーター酵素のみがSA-MTPに結合しているため、結合形成酵素の活性に関する結論を引き出すことができる。結合形成酵素がビオチンによってレポーター酵素を多く標識するほど、多くのレポーター酵素-ビオチンがSA-MTP上に固定化され、基質のより高いターンオーバーが検出され得ると結論付けることができる。
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中に結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）固定化タグによって/使用して、工程（a）のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、（試料中の）結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法が、本明細書において報告される。
（b）固定化タグによって/使用して、工程（a）のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、（試料中の）結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法が、本明細書において報告される。
「結合形成酵素」という用語は、本明細書において使用されるように、共有結合の形成をもたらす反応を触媒する任意の酵素をさす。一つの態様において、結合形成酵素はアミド結合形成酵素である。一つの好ましい態様において、結合形成酵素はペプチド結合形成酵素である。一つの好ましい態様において、結合形成酵素はソルターゼである。いくつかの態様において、結合形成酵素は、リガーゼ、ポリメラーゼ、キナーゼ、アルドラーゼ、ディールス・アルデラーゼ（diels alderase）、またはトランスフェラーゼ（例えば、トランスグルタミナーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ADPリボシルトランスフェラーゼ、無水溶媒中の加水分解酵素）である。
「コンジュゲートされた」または「コンジュゲーション」という用語は、2つの要素、例えば、2つのタンパク質、またはタンパク質および反応性ハンドル、またはタンパク質および薬剤、例えば、検出可能標識のような2つの分子の会合をさす。会合は、例えば、直接もしくは間接の（例えば、リンカーを介した）共有結合を介していてもよいし、または非共有結合性の相互作用を介していてもよい。いくつかの態様において、会合は共有結合性である。いくつかの態様において、2つの分子は、両方の分子を接続するリンカーを介してコンジュゲートされる。例えば、2つのタンパク質が相互にコンジュゲートされてタンパク質融合物を形成する、いくつかの態様において、2つのタンパク質は、ポリペプチドリンカー、例えば、一方のタンパク質のC末端を他方のタンパク質のN末端に接続するアミノ酸配列を介して、コンジュゲートされてもよい。いくつかの態様において、タンパク質のタンパク質またはペプチドとのコンジュゲーションは、ソルターゼを使用したペプチド転移によって達成される。例示的なソルターゼ、タンパク質、認識モチーフ、試薬、およびソルターゼによって媒介されるペプチド転移の方法については、例えば、各々の全内容が参照によって本明細書に組み入れられるWO2010/087994およびWO/2011/133704を参照すること。
「薬剤」という用語は、本明細書において使用されるように、任意の分子、要素、または部分をさす。例えば、薬剤は、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、検出可能標識、結合剤、タグ、金属原子、造影剤、触媒、非ポリペプチドポリマー、合成ポリマー、認識要素、固定化タグ、リンカー、または低分子のような化学的化合物であり得る。
「検出可能標識」という用語は、標識が付着した分子、例えば、タンパク質もしくはペプチドまたはその他の要素の検出を可能にする、少なくとも1種の要素、同位体、または官能基が組み込まれた部分をさす。標識は、直接付着してもよいし、またはリンカーを介して付着してもよい。標識は、任意の位置で、分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、またはその他の要素に付着してもよいしまたは組み込まれてもよいことが認識されるであろう。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、検出可能標識は、タンパク質、フルオロフォア、放射性元素、ナノ粒子、または比色定量色素である。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、検出可能標識は酵素である。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、検出可能標識は比色定量反応を触媒する酵素である。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、検出可能標識はグルコースデヒドロゲナーゼである。
色素原（蛍光性または発光性の基および色素）、酵素、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、NMR活性基または金属粒子、ハプテン、例えば、ジゴキシゲニン、または結合剤、例えば、抗体が、検出可能標識の例である。検出可能標識は、光によって活性化可能な架橋基、例えば、アジド基またはアジリン基であってもよい。電気化学発光（ECL）によって検出され得る金属キレートも、好ましいシグナル放射基であり、特に好ましいのは、ルテニウムキレート、例えば、ルテニウム(ビスピリジル)32+キレートである。適当なルテニウム標識基は、例えば、EP 0 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511、およびWO 92/14138に記載されている。
「固定化タグ」という用語は、本明細書において使用されるように、固相上に固定化されるのに適当な部分をさす。一つの態様において、固定化タグは、ストレプトアビジンタグ（Strepタグ）、ビオチンタグ、ヒスチジンタグ（Hisタグ）、アビジンタグ（Aviタグ）、Haloタグ、プロテインA、FLAGタグ、セルロース結合モジュール、マルトース結合タンパク質、タマビジン（Tamavidin）、抗体が結合することができるアンチジーンを含む群より選択される。
「試料」という用語には、生物または以前は生存していた生物に由来する任意の量の物質が含まれるが、これらに限定されるわけではない。そのような生物には、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、およびその他の動物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。そのような物質には、臨床的なルーチンにおいて最も広く使用されている試料の起源である、個体に由来する全血、血清、または血漿が含まれるが、これらに限定されるわけではない。一つの態様において、試料は、細菌細胞の集団、例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞に由来する溶解物である。
「低分子」という用語は、天然に存在するものであってもよいしまたは（例えば、化学合成を介して）人為的に作出されたものであってもよい、比較的低い分子量を有する分子をさすために、本明細書において使用される。典型的には、低分子は、有機化合物である（即ち、炭素を含有している）。低分子は、複数の炭素間結合、立体中心、およびその他の官能基（例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボニル、または複素環）を含有していてよい。
「固相」という用語は、非液状物質を意味し、ポリマー、金属（常磁性、強磁性粒子）、ガラス、およびセラミックのような材料から作成された（微粒子およびビーズを含む）粒子；シリカゲル、アルミナゲル、およびポリマーゲルのようなゲル物質；ポリマー、金属、ガラス、および/またはセラミックで作成されていてよい毛細管；ゼオライトおよびその他の多孔性物質；電極；マルチウェルプレート；固体ストリップ；ならびにキュベット、チューブ、またはその他の分光計試料容器を含む。「固相」は、キャプチャー薬物抗体と相互作用することを目的とした少なくとも1種の部分を表面上に含有しているという点で、アッセイの固相成分は、アッセイが接触し得る不活性の固体表面と区別される。固相は、チューブ、ストリップ、キュベット、もしくはマルチウェルプレートのような静止成分であってもよいし、またはビーズおよび微粒子のような非静止成分であってもよい。微粒子は、均質アッセイフォーマットのための固相としても使用され得る。タンパク質およびその他の物質の非共有結合性または共有結合性の付着を可能にする多様な微粒子が使用され得る。そのような粒子には、ポリスチレンおよびポリ(メチルメタクリレート)のようなポリマー粒子；金ナノ粒子および金コロイドのような金粒子；ならびにシリカ粒子、ガラス粒子、および金属酸化物粒子のようなセラミック粒子が含まれる。例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、Martin,C.R.,et al.,Analytical Chemistry-News & Features,May 1,1998,322A-327Aを参照すること。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、固相はマルチウェルプレートである。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、固相はビーズである。
「基質」という用語は、本明細書において使用されるように、結合形成酵素によって媒介されるコンジュゲーション反応において利用され得る分子または要素をさす。典型的には、結合形成酵素は2つの基質を利用する。例えば、第1の基質は（一つの好ましい態様において、C末端に）結合形成酵素認識モチーフを含み、かつ第2の基質は（一つの好ましい態様において、N末端に）結合形成酵素認識モチーフを含み、反応は、共有結合を介した両基質のコンジュゲーションをもたらす。
基質は、認識モチーフとは別の付加的な部分または要素を含んでいてもよい。例えば、基質は、第1の結合形成酵素認識モチーフを含み、例えば、そのN末端が、任意の薬剤、例えば、ペプチドまたはタンパク質、低分子、結合剤、脂質、炭水化物、検出可能標識、または固定化タグにコンジュゲートされていてもよい。同様に、基質は、第2の結合形成酵素認識モチーフを含み、例えば、そのC末端が、任意の薬剤、例えば、ペプチドまたはタンパク質、低分子、結合剤、脂質、炭水化物、検出可能標識、または固定化タグにコンジュゲートされていてもよい。従って、基質は、タンパク質またはペプチドに限定されず、ソルターゼ認識モチーフにコンジュゲートされた任意の部分または要素を含む。
一つの例示的な認識モチーフは、ソルターゼ認識モチーフである。いくつかのソルターゼ認識モチーフが、本明細書に記載され、付加的な適当なソルターゼ認識モチーフは、当業者に周知である。例えば、黄色ブドウ球菌のソルターゼAは、ペプチド転移反応において、C末端のLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）およびN末端のGG（G）モチーフを認識し利用する。付加的なソルターゼ認識モチーフは、当業者に明白であり、本発明はこれに関して限定されない。
（主としてサイズの差を検出することによって）結合形成酵素の完全な反応を検出することができる、質量分析（MS）、高速液体クロマトグラフィ（HPLC）、またはSDS pageのような他の方法が報告されているが、これらは複雑で遅い。以下の表は、異なる方法の本発明の方法との比較を提供し、本発明の方法がスピードに関して優れていることを示す。
本発明の方法は一般に使用される他の方法より高感度であることも見出された。例えば、HPLC、MS、またはSDS-PAGEによって、1％未満の収率/ターンオーバー/ライゲーション生成物という感度しか達成され得ないことが当業者に公知である。しかしながら、これは本発明の方法によって可能である（図1を参照すること）。例えば、Matsumotoら(2012)によって記載されたような他の方法と比較した時にも、本明細書において報告される方法によって感度の改善が達成され得る（図3および4を参照すること）。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、（機能性の）結合形成酵素の存在が検出される（定性的検出）。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、結合形成酵素の活性の程度が決定される（定量的検出）。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、固定化タグを含む第1の基質は第1の結合形成酵素認識モチーフを含み、かつ検出可能標識を含む第2の基質は第2の結合形成酵素認識モチーフを含む。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、第1の結合形成酵素認識モチーフは第1のソルターゼ認識モチーフであり、かつ第2の結合形成酵素認識モチーフは第2のソルターゼ認識モチーフである。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、
（1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含む。
（1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含む。
本発明の一つの態様において、固定化タグは特異的結合対の第1のメンバーであり、かつ固相は特異的結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされている。そのような特異的結合対（第1のメンバー/第2のメンバー）は、例えば、ストレプトアビジンまたはアビジン/ビオチン、抗体/抗原（例えば、Hermanson,G.T.,et al.,Bioconjugate Techniques,Academic Press,1996を参照すること）、レクチン/多糖、ステロイド/ステロイド結合タンパク質、ホルモン/ホルモン受容体、酵素/基質、IgG/プロテインAおよび/またはGおよび/またはL等である。本明細書において報告される全ての局面の一つの好ましい態様において、固定化タグはビオチンであり、かつ固相はストレプトアビジンまたはアビジンにコンジュゲートされている。
とりわけ、固相上への固定化の前に試料を希釈すること、および試料を遠心分離することによって、方法の信頼性、再現性、および頑強さが改善され得ることが見出された。さらに、結合形成酵素によって媒介される反応を、適当な薬剤によって中止させることによって、信頼性、再現性、および頑強さが改善され得る。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料はヨードアセトアミド（IAA）を含む溶液で希釈される。本明細書に報告される全ての局面の一つの態様において、工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料は10倍〜30倍に希釈される。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料は15倍〜25倍に希釈される。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料は約1:20（20倍）に希釈される。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料は遠心分離される。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料は2500×g〜7500×gで5分間〜15分間遠心分離される。
固定化されたコンジュゲートを検出する前に試料を洗浄することによって、方法の信頼性および頑強さがさらに改善され得ることが見出された。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、工程（b）の固定化の後、さらに、試料は少なくとも3回洗浄される。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、工程（b）の固定化の後、さらに、試料は4〜12回洗浄される。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、工程（b）の固定化の後、さらに、試料は6〜10回洗浄される。
「ソルターゼ」という用語は、本明細書において使用されるように、ソルターゼ活性を有するタンパク質、即ち、アミド基転移を介して、タンパク質のC末端をタンパク質のN末端またはリジンのεアミノ基とコンジュゲートするペプチド転移反応を実施することができる酵素をさす。その用語には、全長ソルターゼタンパク質、例えば、全長の天然に存在するソルターゼタンパク質、ソルターゼ活性を有するそのようなソルターゼタンパク質の断片、そのようなソルターゼタンパク質またはその断片の修飾された（例えば、変異型）バリアントまたは誘導体、および天然に存在するソルターゼタンパク質に由来しないが、ソルターゼ活性を示すタンパク質が含まれる。当業者は、例えば、ペプチド転移を可能にする条件の下で、当該のタンパク質またはタンパク質断片を適当なソルターゼ基質と接触させ、それぞれのペプチド転移反応生成物が形成されるか否かを決定することによって、所定のタンパク質またはタンパク質断片がソルターゼ活性を示すか否かを容易に決定することができるであろう。
適当なソルターゼは、当業者に明白であり、A型、B型、C型、およびD型のソルターゼを含むが、これらに限定されるわけではない。例えば、本発明は、任意の細菌種または細菌株に由来するソルターゼAに関係する態様を包含する。本発明は、任意の細菌種または細菌株に由来するソルターゼBに関係する態様を包含する。本発明は、任意の細菌種または細菌株に由来するクラスCソルターゼに関係する態様を包含する。本発明は、任意の細菌種または細菌株に由来するクラスDソルターゼに関係する態様も包含する。ソルターゼのアミノ酸配列、およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、当業者に公知である。当業者は、任意のソルターゼおよび任意のソルターゼ認識モチーフが、本発明のいくつかの態様において使用され得ることを認識するであろう。いくつかの態様において、ソルターゼは、黄色ブドウ球菌のソルターゼAである。いくつかの態様において、ソルターゼは、もう一つの生物の、例えば、化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）、リステリア菌（L.monozytogenes）、またはG.ヘモリサンス（haemolysans）のようなもう一つの細菌株に由来するソルターゼAである。いくつかの態様において、ソルターゼは、ソルターゼB、ソルターゼC、またはソルターゼDである。他の細菌株に由来する適当なソルターゼは、当業者に明白であろう。
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中にソルターゼが存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）固定化タグによって/使用して、工程（a）のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中のソルターゼを検出する、試料中のソルターゼの検出のための方法が、本明細書において報告される。
（b）固定化タグによって/使用して、工程（a）のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中のソルターゼを検出する、試料中のソルターゼの検出のための方法が、本明細書において報告される。
この局面の一つの態様において、（機能性の）ソルターゼの存在が検出される（定性的検出）。
この局面の一つの態様において、ソルターゼの活性の程度が決定される（定量的検出）。
この局面の一つの態様において、固定化タグを含む第1の基質は第1のソルターゼ認識モチーフを含み、かつ検出可能標識を含む第2の基質は第2のソルターゼ認識モチーフを含む。
この局面の一つの態様において、
（1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含む。
（1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含む。
本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、検出可能標識は、タンパク質、フルオロフォア、放射性元素、ナノ粒子、または比色定量色素である。この局面の一つの態様において、検出可能標識は酵素である。この局面の一つの態様において、検出可能標識は比色定量反応を触媒する酵素である。この局面の一つの態様において、検出可能標識はグルコースデヒドロゲナーゼである。
この局面の一つの態様において、固定化タグは特異的結合対の第1のメンバーであり、かつ固相は特異的結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされている。この局面の一つの態様において、固定化タグはビオチンであり、かつ固相はストレプトアビジンまたはアビジンにコンジュゲートされている。
この局面の一つの態様において、固相はマルチウェルプレートである。この局面の一つの態様において、固相はビーズである。
この局面の一つの態様において、工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料はヨードアセトアミド（IAA）を含む溶液で希釈される。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料は10倍〜30倍に希釈される。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料は15倍〜25倍に希釈される。本明細書において報告される全ての局面の一つの態様において、工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料は約1:20（20倍）に希釈される。
この局面の一つの態様において、工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料は遠心分離される。この局面の一つの態様において、工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料は2500×g〜7500×gで5分間〜15分間遠心分離される。
この局面の一つの態様において、工程（b）の固定化の後、さらに、試料は少なくとも3回洗浄される。この局面の一つの態様において、工程（b）の固定化の後、さらに、試料は4〜12回洗浄される。この局面の一つの態様において、工程（b）の固定化の後、さらに、試料は6〜10回洗浄される。
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中に結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）固定化タグによって/使用して、工程（a）のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、（試料中の）結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法であって、
結合形成酵素がソルターゼであり、
（1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含み、
検出可能標識がグルコースデヒドロゲナーゼであり、
固定化タグがビオチンであり、かつ固相にストレプトアビジンまたはアビジンがコンジュゲートされており、固相がマルチウェルプレートまたはビーズであり、
工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料が、ヨードアセトアミド（IAA）を含む溶液で15倍〜25倍に希釈され、
工程（a）のインキュベーションおよび希釈の後、さらに、試料が2500×g〜7500×gで5分間〜15分間遠心分離され、
工程（b）の固定化の後、さらに、試料が少なくとも6〜10回洗浄される、方法が、本明細書において報告される。
（b）固定化タグによって/使用して、工程（a）のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、（試料中の）結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法であって、
結合形成酵素がソルターゼであり、
（1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:03；GGG）もしくはオリゴアラニンモチーフ（例えば、SEQ ID NO:04；AAA）を含み、
検出可能標識がグルコースデヒドロゲナーゼであり、
固定化タグがビオチンであり、かつ固相にストレプトアビジンまたはアビジンがコンジュゲートされており、固相がマルチウェルプレートまたはビーズであり、
工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料が、ヨードアセトアミド（IAA）を含む溶液で15倍〜25倍に希釈され、
工程（a）のインキュベーションおよび希釈の後、さらに、試料が2500×g〜7500×gで5分間〜15分間遠心分離され、
工程（b）の固定化の後、さらに、試料が少なくとも6〜10回洗浄される、方法が、本明細書において報告される。
（a）少なくとも2種の結合形成酵素を準備する工程、
（b）少なくとも2種の結合形成酵素を用いて本明細書において報告される方法を実施する工程、
（c）工程（b）において検出された結合形成酵素を選択する工程
によって、複数の結合形成酵素から1種類の結合形成酵素を選択するための方法が、本明細書において報告される。
（b）少なくとも2種の結合形成酵素を用いて本明細書において報告される方法を実施する工程、
（c）工程（b）において検出された結合形成酵素を選択する工程
によって、複数の結合形成酵素から1種類の結合形成酵素を選択するための方法が、本明細書において報告される。
この局面の一つの態様において、最も高い活性、定義された特異性、定義されたpH最適、定義された温度最適、または（例えば、熱もしくはpHによって誘導された）ストレスの後の最も高い活性を有する結合形成酵素が選択される。この局面の一つの態様において、最も高い活性を有する結合形成酵素が選択される。
（a）少なくとも2種のソルターゼを準備する工程、
（b）少なくとも2種のソルターゼを用いて本明細書において報告される方法を実施する工程、
（c）工程（b）において検出されたソルターゼを選択する工程
によって、複数のソルターゼから1種類のソルターゼを選択するための方法が、本明細書において報告される。
（b）少なくとも2種のソルターゼを用いて本明細書において報告される方法を実施する工程、
（c）工程（b）において検出されたソルターゼを選択する工程
によって、複数のソルターゼから1種類のソルターゼを選択するための方法が、本明細書において報告される。
この局面の一つの態様において、最も高い活性、定義された特異性、定義されたpH最適、定義された温度最適、または（例えば、熱もしくはpHによって誘導された）ストレスの後の最も高い活性を有するソルターゼが選択される。この局面の一つの態様において、最も高い活性を有するソルターゼが選択される。
（a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、試料中に結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）固定化タグによって/使用して、工程（a）のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、（試料中の）結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための結合形成アッセイが、本明細書において報告される。
（b）固定化タグによって/使用して、工程（a）のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（c）検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、（試料中の）結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための結合形成アッセイが、本明細書において報告される。
以下の実施例、添付の図面、および配列は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲において示される。本発明の本旨から逸脱することなく、示された手法に修飾を施し得ることが理解される。
配列表の説明
SEQ ID NO:01 ソルターゼモチーフLPXTG
SEQ ID NO:02 ソルターゼモチーフLPXTA
SEQ ID NO:03 オリゴグリシンGGG
SEQ ID NO:04 オリゴアラニンAAA
SEQ ID NO:05 ビオチンに付着したオリゴグリシン（GG-ビオチン）
SEQ ID NO:06 ストレプトアビジンに付着したオリゴグリシン（GG-ストレプトアビジン）
SEQ ID NO:07 ビオチンに付着したオリゴアラニン（AA-ビオチン）
SEQ ID NO:08 ストレプトアビジンに付着したオリゴアラニン（AA-ストレプトアビジン）
SEQ ID NO:01 ソルターゼモチーフLPXTG
SEQ ID NO:02 ソルターゼモチーフLPXTA
SEQ ID NO:03 オリゴグリシンGGG
SEQ ID NO:04 オリゴアラニンAAA
SEQ ID NO:05 ビオチンに付着したオリゴグリシン（GG-ビオチン）
SEQ ID NO:06 ストレプトアビジンに付着したオリゴグリシン（GG-ストレプトアビジン）
SEQ ID NO:07 ビオチンに付着したオリゴアラニン（AA-ビオチン）
SEQ ID NO:08 ストレプトアビジンに付着したオリゴアラニン（AA-ストレプトアビジン）
実施例1
粗溶解物からのソルターゼ活性のハイスループットスクリーニング
ソルターゼを発現する細胞（大腸菌BL21）を、200μLのLB培地を含む96穴プレートにおいて培養する。
粗溶解物からのソルターゼ活性のハイスループットスクリーニング
ソルターゼを発現する細胞（大腸菌BL21）を、200μLのLB培地を含む96穴プレートにおいて培養する。
1:10で混合し、50℃で30分間インキュベートすることによって、各細胞懸濁物を、溶解緩衝液（50mMトリス（pH7.5）、0.1％トリトンX100、200mM NaCl、および5％B-PER）によって溶解する。
50μLの溶解物を、150μLの基質溶液（50mMトリス pH7.5、200mM NaCl、（ソルターゼ反応の基質のうちの一方（LPXTG；ここではX=K）を含有している）20μMグルコースデヒドロゲナーゼ、および（ソルターゼ反応の他方の基質（ここでは：GGG）を含有している）20μMビオチン）と混合し、37℃で2時間インキュベートする。
10〜20倍過剰の阻害緩衝液（50mMトリス、pH7.5、200mM NaCl、10mM CaCl2、5mMヨードアセトアミド）の添加によって、反応を中止させる。中止した反応混合物を、5000×gで10分間遠心分離する。
上清（50μL）を、ストレプトアビジンによってコーティングされたマルチウェルプレートに移し、200mM NaCl、10mM CaCl2を含む50mMトリス緩衝液（pH7.5）100μLを添加し、混合物を30℃で200rpmで30分間インキュベートする。
その後、マルチウェルプレートを、各々300μLの洗浄緩衝液（50mMトリス、pH7.5、200mM NaCl、10mM CaCl2、5mg/mL BSA、0.1％トリトンX100）で8回洗浄する。
マルチウェルプレートを洗浄した後、150μLの試験緩衝液（0.2Mクエン酸ナトリウム、pH5.8、0.3g/L 4-ニトロソアニリン、1mM CaCl2、30mMグルコース）を添加する。
レポーター酵素（グルコースデヒドロゲナーゼ）の動力学を620nmで5分間測定する。
レポーター酵素の活性は、ビオチン化された酵素の量に比例する固定化された酵素の量に比例し、これはソルターゼの活性に比例する。
実施例2
ソルターゼ活性の測定
精製されたソルターゼを、200mM NaClを含有している50mMトリス緩衝液 pH7.5において、2種の基質、レポーター酵素、即ち、LPXTG（ここでは：X=K）モチーフを含有しているグルコースデヒドロゲナーゼ（60μm）、およびN末端にグリシンまたはアラニンを含有しているビオチン誘導体（60μm）と混合する（1:1:1）。
ソルターゼ活性の測定
精製されたソルターゼを、200mM NaClを含有している50mMトリス緩衝液 pH7.5において、2種の基質、レポーター酵素、即ち、LPXTG（ここでは：X=K）モチーフを含有しているグルコースデヒドロゲナーゼ（60μm）、およびN末端にグリシンまたはアラニンを含有しているビオチン誘導体（60μm）と混合する（1:1:1）。
この反応混合物を37℃で2時間インキュベートする。
10〜20倍過剰の阻害緩衝液（50mMトリス、pH7.5、200mM NaCl、10mM CaCl2、5mMヨードアセトアミド）の添加によって、反応を中止させた。
中止した反応混合物を、5000×gで10分間遠心分離する。
上清（50μL）を、200mM NaCl、10mM CaCl2を含む50mMトリス緩衝液（pH7.5）100μLに添加し、ストレプトアビジンによってコーティングされたビーズを添加し、30℃で200rpmで30分間インキュベートする。
その後、磁石および真空ポンプを使用して、V底マルチウェルプレートにおいて、磁性ビーズを、各300μLの洗浄緩衝液（50mMトリス、pH7.5、200mM NaCl、10mM CaCl2、5mg/mL BSA、0.1％トリトンX100）で5回洗浄する。
その後、ビーズを、100μLクエン酸試験緩衝液に再懸濁させ、その10〜80μLを新しいウェルに移す。そこに、150μLの試験緩衝液（0.2Mクエン酸ナトリウム、pH5.8、0.3g/L 4-ニトロソアニリン、1mM CaCl2、30mMグルコース）を添加する。
レポーター酵素の動力学を620nmで5分間測定する。
レポーター酵素の活性は、ビオチン化された酵素の量に比例する固定化された酵素の量に比例し、これはソルターゼの活性に比例する。
実施例3
異なる方法セットアップによるソルターゼ活性の測定
いくつかの改変を加え、基本的には前記のように、実験を実施した：
セットアップ1：前記の方法（実施例2）
セットアップ2：セットアップ1と同様であるが、遠心分離工程を欠く
セットアップ3：セットアップ2と同様であるが、さらに、IAA（ヨードアセトアミド）の添加によって反応を中止させる工程も欠く
セットアップ4：セットアップ3と同様であるが、さらに、希釈工程を欠く。
異なる方法セットアップによるソルターゼ活性の測定
いくつかの改変を加え、基本的には前記のように、実験を実施した：
セットアップ1：前記の方法（実施例2）
セットアップ2：セットアップ1と同様であるが、遠心分離工程を欠く
セットアップ3：セットアップ2と同様であるが、さらに、IAA（ヨードアセトアミド）の添加によって反応を中止させる工程も欠く
セットアップ4：セットアップ3と同様であるが、さらに、希釈工程を欠く。
基質濃度は、Matsumotoら（2011および2012）の発表と同様に選択された（5μM SortタグLPKTG、20μM求核剤GGG-ビオチン）。温度、インキュベーションの時間、および酵素濃度は、Matsumotoら（2012）と同様に選択された（2.1μM SrtA、25℃、および30分）。
結果:（図3を参照すること）
実施例4
Matsumotoら（2012）の方法と比較されたソルターゼ活性、標準偏差、およびバックグラウンドシグナルの測定
実施例2に記載されたように実験を実施した。基質濃度は、Matsumotoら（2011および2012）の発表と同様に選択された（5μM SortタグLPKTG、20μM求核剤GGG-ビオチン）。温度、インキュベーションの時間、および酵素濃度は、Matsumotoら（2012）と同様に選択された（2.1μM SrtA、25℃、および30分）。
Matsumotoら（2012）の方法と比較されたソルターゼ活性、標準偏差、およびバックグラウンドシグナルの測定
実施例2に記載されたように実験を実施した。基質濃度は、Matsumotoら（2011および2012）の発表と同様に選択された（5μM SortタグLPKTG、20μM求核剤GGG-ビオチン）。温度、インキュベーションの時間、および酵素濃度は、Matsumotoら（2012）と同様に選択された（2.1μM SrtA、25℃、および30分）。
GOx（MatsumotoらにおいてはGODと呼ばれる）活性およびHRP活性についてのデータは、Matsumotoら（2012）から得た。
本明細書に記載される方法についての結果（実施例2）：
Matsumotoらの方法と比較した結果（図4を参照すること）
Claims (13)
- （a）固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、第1の基質が、第1のソルターゼ認識モチーフを含む固定化タグを含み、第2の基質が、第2のソルターゼ認識モチーフを含む検出可能標識を含み、かつそれによって、試料中にソルターゼが存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが形成される、工程、
（b）工程（a）でインキュベートされた試料を遠心分離する工程、
（c）固定化タグを使用して、工程（a）のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
（d）検出可能標識を使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中のソルターゼを検出する、試料中のソルターゼの検出のための方法。 - 工程（a）のインキュベーションの後、さらに、試料が10倍〜30倍に希釈される、請求項1記載の方法。
- （1）第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフもしくはオリゴアラニンモチーフを含むか、または
（2）第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ（SEQ ID NO:01）を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフもしくはオリゴアラニンモチーフを含む、請求項2記載の方法。 - 検出可能標識が酵素である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 固定化タグが特異的結合対の第1のメンバーであり、かつ固相が特異的結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされている、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 固定化タグがビオチンであり、かつ固相にストレプトアビジンまたはアビジンがコンジュゲートされている、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 固相がマルチウェルプレートである、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 固相がビーズである、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 工程（a）のインキュベーションの後、試料が、ヨードアセトアミド（IAA）を含む溶液で希釈される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 試料が、2500×g〜7500×gで5分間〜15分間遠心分離される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 工程（c）の固定化の後、さらに、試料が少なくとも3回洗浄される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- （a）少なくとも複数のソルターゼを準備する工程、
（b）該少なくとも複数のソルターゼを用いて請求項1記載の方法を実施する工程、
（c）工程（b）において検出された1つのソルターゼを選択する工程
によって、複数のソルターゼから1つのソルターゼを選択するための方法。 - 最も高い活性を有するソルターゼが選択される、請求項12記載の方法。
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