JP2018500900A - 結合形成酵素の活性アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
ソルターゼおよびトランスグルタミナーゼのような結合形成酵素は、産業的過程および生体内変化過程においてより重要になりつつある。生産ツールとして酵素を使用するためには、それらの特性を決定することが必要である。
(a)固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが試料中に形成される、工程、
(b)固定化タグによって/使用して、(工程(a)の)コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
(c)検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、(試料中の)結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法である。
(a)固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが試料中に形成される、即ち、第1の基質が第2の基質にコンジュゲートされる、工程、
(b)試料を遠心分離する工程、
(c)固定化タグによって/使用して、(工程(a)の)コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
(d)検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中の結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法である。
(1)第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ(SEQ ID NO:01)を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:03;GGG)もしくはオリゴアラニンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:04;AAA)を含むか、または
(2)第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ(SEQ ID NO:01)を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:03;GGG)もしくはオリゴアラニンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:04;AAA)を含む。
(a)固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、ソルターゼが存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが試料中に形成される、工程、
(b)固定化タグによって/使用して、(工程(a)の)コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
(c)検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中のソルターゼを検出する、試料中のソルターゼの検出のための方法である。
(a)固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、ソルターゼが存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが試料中に形成される、即ち、第1の基質が第2の基質にコンジュゲートされる、工程、
(b)試料を遠心分離する工程、
(c)固定化タグによって/使用して(工程(a)の)コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
(d)検出可能標識によって/使用して固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中のソルターゼを検出する、試料中のソルターゼの検出のための方法である。
(1)第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ(SEQ ID NO:01)を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:03;GGG)もしくはオリゴアラニンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:04;AAA)を含むか、または
(2)第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ(SEQ ID NO:01)を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:03;GGG)もしくはオリゴアラニンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:04;AAA)を含む。
(a)少なくとも2種の結合形成酵素を準備する工程、
(b)少なくとも2種の結合形成酵素を用いて本明細書において報告される方法を実施する工程、
(c)工程(b)において検出された結合形成酵素を選択する工程
によって、複数の結合形成酵素から1種類の結合形成酵素を選択するための方法である。
(a)少なくとも2種のソルターゼを準備する工程、
(b)少なくとも2種のソルターゼを用いて本明細書において報告される方法を実施する工程、
(c)工程(b)において検出されたソルターゼを選択する工程
によって、複数のソルターゼから1種類のソルターゼを選択する方法である。
(a)固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが試料中に形成される、工程、
(b)固定化タグによって/使用して、(工程(a)の)コンジュゲートを固相へ固定化する工程、
(c)検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、(試料中の)結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための結合形成アッセイである。
本発明の方法によって、結合形成酵素の活性の検出のための改善されたアッセイを確立することができることが見出された。
(b)固定化タグによって/使用して、工程(a)のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
(c)検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、(試料中の)結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法が、本明細書において報告される。
(1)第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ(SEQ ID NO:01)を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:03;GGG)もしくはオリゴアラニンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:04;AAA)を含むか、または
(2)第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ(SEQ ID NO:01)を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:03;GGG)もしくはオリゴアラニンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:04;AAA)を含む。
(b)固定化タグによって/使用して、工程(a)のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
(c)検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中のソルターゼを検出する、試料中のソルターゼの検出のための方法が、本明細書において報告される。
(1)第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ(SEQ ID NO:01)を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:03;GGG)もしくはオリゴアラニンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:04;AAA)を含むか、または
(2)第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ(SEQ ID NO:01)を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:03;GGG)もしくはオリゴアラニンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:04;AAA)を含む。
(b)固定化タグによって/使用して、工程(a)のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
(c)検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、(試料中の)結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法であって、
結合形成酵素がソルターゼであり、
(1)第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ(SEQ ID NO:01)を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:03;GGG)もしくはオリゴアラニンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:04;AAA)を含むか、または
(2)第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ(SEQ ID NO:01)を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:03;GGG)もしくはオリゴアラニンモチーフ(例えば、SEQ ID NO:04;AAA)を含み、
検出可能標識がグルコースデヒドロゲナーゼであり、
固定化タグがビオチンであり、かつ固相にストレプトアビジンまたはアビジンがコンジュゲートされており、固相がマルチウェルプレートまたはビーズであり、
工程(a)のインキュベーションの後、さらに、試料が、ヨードアセトアミド(IAA)を含む溶液で15倍〜25倍に希釈され、
工程(a)のインキュベーションおよび希釈の後、さらに、試料が2500×g〜7500×gで5分間〜15分間遠心分離され、
工程(b)の固定化の後、さらに、試料が少なくとも6〜10回洗浄される、方法が、本明細書において報告される。
(b)少なくとも2種の結合形成酵素を用いて本明細書において報告される方法を実施する工程、
(c)工程(b)において検出された結合形成酵素を選択する工程
によって、複数の結合形成酵素から1種類の結合形成酵素を選択するための方法が、本明細書において報告される。
(b)少なくとも2種のソルターゼを用いて本明細書において報告される方法を実施する工程、
(c)工程(b)において検出されたソルターゼを選択する工程
によって、複数のソルターゼから1種類のソルターゼを選択するための方法が、本明細書において報告される。
(b)固定化タグによって/使用して、工程(a)のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
(c)検出可能標識によって/使用して、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、(試料中の)結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための結合形成アッセイが、本明細書において報告される。
SEQ ID NO:01 ソルターゼモチーフLPXTG
SEQ ID NO:02 ソルターゼモチーフLPXTA
SEQ ID NO:03 オリゴグリシンGGG
SEQ ID NO:04 オリゴアラニンAAA
SEQ ID NO:05 ビオチンに付着したオリゴグリシン(GG-ビオチン)
SEQ ID NO:06 ストレプトアビジンに付着したオリゴグリシン(GG-ストレプトアビジン)
SEQ ID NO:07 ビオチンに付着したオリゴアラニン(AA-ビオチン)
SEQ ID NO:08 ストレプトアビジンに付着したオリゴアラニン(AA-ストレプトアビジン)
粗溶解物からのソルターゼ活性のハイスループットスクリーニング
ソルターゼを発現する細胞(大腸菌BL21)を、200μLのLB培地を含む96穴プレートにおいて培養する。
ソルターゼ活性の測定
精製されたソルターゼを、200mM NaClを含有している50mMトリス緩衝液 pH7.5において、2種の基質、レポーター酵素、即ち、LPXTG(ここでは:X=K)モチーフを含有しているグルコースデヒドロゲナーゼ(60μm)、およびN末端にグリシンまたはアラニンを含有しているビオチン誘導体(60μm)と混合する(1:1:1)。
異なる方法セットアップによるソルターゼ活性の測定
いくつかの改変を加え、基本的には前記のように、実験を実施した:
セットアップ1:前記の方法(実施例2)
セットアップ2:セットアップ1と同様であるが、遠心分離工程を欠く
セットアップ3:セットアップ2と同様であるが、さらに、IAA(ヨードアセトアミド)の添加によって反応を中止させる工程も欠く
セットアップ4:セットアップ3と同様であるが、さらに、希釈工程を欠く。
Matsumotoら(2012)の方法と比較されたソルターゼ活性、標準偏差、およびバックグラウンドシグナルの測定
実施例2に記載されたように実験を実施した。基質濃度は、Matsumotoら(2011および2012)の発表と同様に選択された(5μM SortタグLPKTG、20μM求核剤GGG-ビオチン)。温度、インキュベーションの時間、および酵素濃度は、Matsumotoら(2012)と同様に選択された(2.1μM SrtA、25℃、および30分)。
Claims (16)
- (a)固定化タグを含む第1の基質および検出可能標識を含む第2の基質と共に試料をインキュベートする工程であって、それによって、結合形成酵素が存在する場合には、固定化タグおよび検出可能標識を含むコンジュゲートが試料中に形成される、工程、
(b)試料を遠心分離する工程、
(c)固定化タグによって(/使用して)、工程(a)のコンジュゲートを固相へ固定化する工程、
(d)検出可能標識によって(/使用して)、固定化されたコンジュゲートを検出する工程
を含み、それによって、試料中の結合形成酵素を検出する、試料中の結合形成酵素の検出のための方法。 - 工程(a)のインキュベーションの後、さらに、試料が10倍〜30倍に希釈される、請求項1記載の方法。
- 固定化タグを含む第1の基質が第1の結合形成酵素認識モチーフを含み、かつ検出可能標識を含む第2の基質が第2の結合形成酵素認識モチーフを含む、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
- 第1の結合形成酵素認識モチーフが第1のソルターゼ認識モチーフであり、かつ第2の結合形成酵素認識モチーフが第2のソルターゼ認識モチーフである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- (1)第1のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ(SEQ ID NO:01)を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第2のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフもしくはオリゴアラニンモチーフを含むか、または
(2)第2のソルターゼ認識モチーフがLPXTGモチーフ(SEQ ID NO:01)を含み、ここでXは任意のアミノ酸を表し、かつ第1のソルターゼ認識モチーフがオリゴグリシンモチーフもしくはオリゴアラニンモチーフを含む、請求項4記載の方法。 - 検出可能標識が酵素である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 固定化タグが特異的結合対の第1のメンバーであり、かつ固相が特異的結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされている、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 固定化タグがビオチンであり、かつ固相にストレプトアビジンまたはアビジンがコンジュゲートされている、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 固相がマルチウェルプレートである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 固相がビーズである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 工程(a)のインキュベーションの後、試料が、ヨードアセトアミド(IAA)を含む溶液で希釈される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 試料が、2500×g〜7500×gで5分間〜15分間遠心分離される、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- 工程(c)の固定化の後、さらに、試料が少なくとも3回洗浄される、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
- (a)少なくとも2種の結合形成酵素を準備する工程、
(b)該少なくとも2種の結合形成酵素を用いて請求項1の方法を実施する工程、
(c)工程(b)において検出された結合形成酵素を選択する工程
によって、複数の結合形成酵素から1種類の結合形成酵素を選択するための方法。 - 最も高い活性を有する結合形成酵素が選択される、請求項14記載の方法。
- 結合形成酵素がソルターゼである、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
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