JP6327855B2 - 新規モジュレータ及びその使用法 - Google Patents
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Description
本出願は米国特許法§119(e)のもとに、2010年9月3日出願の米国特許仮出願第61/380,181号の利益を主張し、この出願は本明細書において引用によりその全体が組み込まれる。
本願は、概して、組成物、並びにこの組成物を、異常増殖性疾患、その増殖、再発、再燃又は転移の治療又は改善に使用する方法に関する。広範には、本発明は、腫瘍性疾患の処置又は予防用のCD46アンタゴニスト及び融合コンストラクトなどの、CD46モジュレータの使用法に関する。特に好ましい実施形態においては、本発明は、免疫療法による処置の際に抗CD46抗体を使用する方法を提供し、がん起始細胞の発生頻度を減少させることを包含する。
a.対象者から組織試料を得る工程、
b.組織試料を少なくとも1種のCD46モジュレータと接触させる工程、並びに
c.試料と会合したCD46モジュレータを検出又は定量する工程。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
単離したCD46モジュレータ。
(項目2)
前記CD46モジュレータがCD46アンタゴニストを含む、項目1に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目3)
前記CD46モジュレータが、抗体又はそれらの免疫反応性断片を含む、項目1に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目4)
前記抗体又はそれらの免疫反応性断片が、モノクローナル抗体を含む、項目3に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目5)
前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択される、項目4に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目6)
前記モノクローナル抗体が、3つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と、3つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、前記重鎖及び軽鎖相補性決定領域が、図11Bに示す相補性決定領域を含む、項目4に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目7)
前記モノクローナル抗体がヒト化抗体である、項目6に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目8)
前記モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号17、配列番号21、配列番号25、配列番号29、配列番号33、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号49、配列番号53、配列番号57、配列番号61、配列番号65、配列番号69、配列番号73、配列番号77、配列番号81及び配列番号85で示す通りのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%配列相同性であり、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号15、配列番号19、配列番号23、配列番号27、配列番号31、配列番号35、配列番号39、配列番号43、配列番号47、配列番号51、配列番号55、配列番号59、配列番号63、配列番号67、配列番号71、配列番号75、配列番号79及び配列番号83で示す通りのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%配列相同性である、項目4に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目9)
項目8に記載の重鎖可変領域のアミノ酸又は軽鎖可変領域のアミノ酸をコードしている核酸。
(項目10)
項目9に記載の核酸を含むベクター。
(項目11)
項目8に記載のモノクローナル抗体から誘導されたヒト化抗体。
(項目12)
CD46変異体A由来のアミノ酸配列又はそれらの断片を含む、項目1に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目13)
前記CD46モジュレータが更に、免疫グロブリン定常領域を少なくとも一部分含む、項目12に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目14)
項目1に記載の単離したCD46モジュレータであって、対象者に投与すると、がん起始細胞の発生頻度が減少する、単離したCD46モジュレータ。
(項目15)
前記発生頻度の減少が、がん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析か、あるいはがん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーの免疫組織化学的な検出を用い評価されるものである、項目14に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目16)
前記発生頻度の減少が、in vitro又はin vivo限界希釈法を用い評価されるものである、項目14に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目17)
前記発生頻度の減少が、in vivo限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ヒト腫瘍細胞の生細胞を、免疫不全マウスに移植する工程を含む、項目16に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目18)
前記発生頻度の減少が、in vivo限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ポワソン分布を用いがん起始細胞の発生頻度を定量する工程を含む、項目17に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目19)
前記発生頻度の減少が、in vitro限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ヒト腫瘍細胞の生細胞を限界希釈しin vitroのコロニー支持条件に配置する工程を含む、項目16に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目20)
前記発生頻度の減少が、in vitro限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ポワソン分布を用いがん起始細胞の発生頻度を定量する工程を含む、項目19に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目21)
前記がん起始細胞が腫瘍永続化細胞を含む、項目14に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目22)
治療有効量のCD46モジュレータを、モジュレータを必要としている対象者に投与する工程を含む、CD46関連性疾患の治療方法。
(項目23)
前記CD46モジュレータがCD46アンタゴニストを含む、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記CD46モジュレータが抗体又はそれらの免疫反応性断片を含む、項目22に記載の方法。
(項目25)
前記抗体又はそれらの免疫反応性断片がモノクローナル抗体を含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記モノクローナル抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択される、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記モノクローナル抗体が、3つの相補性決定領域を有する軽鎖可変領域と、3つの相補性決定領域を有する重鎖可変領域とを含み、前記重鎖及び軽鎖相補性決定領域が、図11Bに示す相補性決定領域を含む、項目25に記載の方法。
(項目28)
前記モノクローナル抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなり、前記軽鎖可変領域が、配列番号配列番号17、配列番号21、配列番号25、配列番号29、配列番号33、配列番号37、配列番号41、配列番号45、配列番号49、配列番号53、配列番号57、配列番号61、配列番号65、配列番号69、配列番号73、配列番号77、配列番号81及び配列番号85で示す通りのアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%配列相同性であり、かつ前記重鎖可変領域が、配列番号15、配列番号19、配列番号23、配列番号27、配列番号31、配列番号35、配列番号39、配列番号43、配列番号47、配列番号51、配列番号55、配列番号59、配列番号63、配列番号67、配列番号71、配列番号75、配列番号79及び配列番号83からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60%配列相同性である、項目25に記載の方法。
(項目29)
前記モノクローナル抗体がpan−CD46抗体を含む、項目25に記載の方法。
(項目30)
前記モノクローナル抗体が、1種以上のCD46スプライス変異体と免疫特異的に会合する、項目25に記載の方法。
(項目31)
前記1種以上のCD46スプライス変異体が、CD46D、CD46F及びCD46Jからなる群から選択されるスプライス変異体を含む、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記異常増殖性疾患が腫瘍性疾患を含む、項目22に記載の方法。
(項目33)
前記腫瘍性疾患が固体腫瘍を含む、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記腫瘍性疾患が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん又は乳がんを含む、項目32に記載の方法。
(項目35)
前記対象者において、がん起始細胞の発生頻度を減少させる工程を更に含む、項目22に記載の方法。
(項目36)
前記発生頻度の減少が、がん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析を用い評価されるものである、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記発生頻度の減少が、がん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーの、免疫組織化学的検出を用い評価されるものである、項目35に記載の方法。
(項目38)
前記発生頻度の減少が、in vitro又はin vivo限界希釈法を用い評価されるものである、項目35に記載の方法。
(項目39)
前記発生頻度の減少が、in vivo限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ヒト腫瘍細胞の生細胞を、免疫不全マウスに移植する工程を含む、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記発生頻度の減少が、in vivo限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ポワソン分布を用いがん起始細胞の発生頻度を定量する工程を含む、項目39に記載の方法。
(項目41)
前記発生頻度の減少が、in vitro限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ヒト腫瘍細胞の生細胞を限界希釈しin vitroのコロニー支持条件に配置する工程を含む、項目38に記載の方法。
(項目42)
前記発生頻度の減少が、in vitro限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ポワソン分布を用いがん起始細胞の発生頻度を定量する工程を含む、項目41に記載の方法。
(項目43)
抗がん剤を投与する工程を更に含む、項目22に記載の方法。
(項目44)
前記CD46モジュレータが、CD46変異体A又はそれらの断片を含む、項目22に記載の方法。
(項目45)
前記CD46モジュレータが、免疫グロブリン定常領域又はそれらの断片を更に含む、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記CD46モジュレータが融合タンパク質を含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
第2CD46モジュレータを投与する工程を更に含み、該第2CD46モジュレータが前記CD46モジュレータとは異なるものである、項目22に記載の方法。
(項目48)
がん起始細胞の発生頻度を減少させる必要のある対象者において、がん起始細胞の発生頻度を減少させる方法であって、CD46モジュレータを前記対象者に投与する工程を含む、方法。
(項目49)
前記がん起始細胞が腫瘍永続化細胞を含む、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記腫瘍永続化細胞が1つ以上のマーカーを含む、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記CD46モジュレータがCD46アンタゴニストを含む、項目48に記載の方法。
(項目52)
前記CD46モジュレータが抗体を含む、項目48に記載の方法。
(項目53)
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記対象者が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、及び乳がんからなる群から選択される腫瘍性疾患に罹患している、項目48に記載の方法。
(項目55)
前記がん起始細胞の発生頻度が少なくとも10%減少する、項目48に記載の方法。
(項目56)
前記発生頻度の減少が、がん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーのフローサイトメトリー解析を用い評価されるものである、項目48に記載の方法。
(項目57)
前記発生頻度の減少が、がん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーの、免疫組織化学的検出を用い評価されるものである、項目48に記載の方法。
(項目58)
前記発生頻度の減少が、in vitro又はin vivo限界希釈法を用い評価されるものである、項目48に記載の単離したCD46モジュレータ。
(項目59)
前記発生頻度の減少が、in vivo限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ヒト腫瘍細胞の生細胞を、免疫不全マウスに移植する工程を含む、項目58に方法。
(項目60)
前記発生頻度の減少が、in vivo限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ポワソン分布を用いがん起始細胞の発生頻度を定量する工程を含む、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記発生頻度の減少が、in vitro限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ヒト腫瘍細胞の生細胞を限界希釈しin vitroのコロニー支持条件に配置する工程を含む、項目58に記載の方法。
(項目62)
前記発生頻度の減少が、in vitro限界希釈法を用い評価されるものであり、該希釈法は、ポワソン分布を用いがん起始細胞の発生頻度を定量する工程を含む、項目61に記載の方法。
(項目63)
抗がん剤により対象者を治療するにあたって腫瘍を感作させる方法であって、前記対象者にCD46モジュレータを投与する工程を含む、方法。
(項目64)
前記CD46モジュレータが抗体である、項目63に記載の方法。
(項目65)
前記腫瘍が固体腫瘍である、項目63に記載の方法。
(項目66)
前記抗がん剤が化学療法剤を含む、項目63に記載の方法。
(項目67)
前記抗がん剤が生物学的製剤を含む、項目63に記載の方法。
(項目68)
異常増殖性疾患の診断を必要としている対象者に、次の工程を含む診断を行う方法:
前記対象者から組織試料を得る工程、
前記組織試料を少なくとも1種のCD46モジュレータと接触させる工程、並びに
前記試料と会合した前記CD46モジュレータを検出又は定量する工程。
(項目69)
前記CD46モジュレータがモノクローナル抗体を含む、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記抗体を、制御可能にレポータと会合させた、項目69に記載の方法。
(項目71)
CD46関連性疾患の診断又は治療に有用な製造物品であって、CD46モジュレータを収容する容器と、前記CD46関連性疾患の治療又は診断に前記CD46モジュレータを使用するための取扱説明書とを含む、製造物品。
(項目72)
前記CD46モジュレータがモノクローナル抗体である、項目71に記載の製造物品。
(項目73)
前記容器が読み取り可能なプレートを含む、項目72に記載の製造物品。
(項目74)
固体腫瘍を含む腫瘍性疾患に罹患している対象者の治療法であって、1種以上のCD46スプライス変異体と免疫特異的に会合するCD46モジュレータを治療有効量で投与する工程を含む、治療法。
(項目75)
前記1種以上のCD46スプライス変異体が、CD46D、CD46F及びCD46Jからなる群から選択されるスプライス変異体を含む、項目74に記載の方法。
(項目76)
前記CD46モジュレータがアンタゴニストを含む、項目74に記載の方法。
(項目77)
前記CD46モジュレータが抗体を含む、項目74に記載の方法。
(項目78)
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、項目77に記載の方法。
(項目79)
前記対象者が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、及び乳がんからなる群から選択される腫瘍性疾患に罹患している、項目74に記載の方法。
(項目80)
腫瘍性疾患に罹患している患者の治療法であって、細胞毒性剤と会合させた少なくとも1種のCD46モジュレータを治療有効量で投与する工程を含む、治療法。
(項目81)
前記CD46モジュレータが前記細胞毒性剤と複合している、項目80に記載の方法。
(項目82)
前記CD46モジュレータが抗体を含む、項目81に記載の方法。
(項目83)
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、項目82に記載の方法。
(項目84)
前記対象者が、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、及び乳がんからなる群から選択される腫瘍性疾患に罹患している、項目80に記載の方法。
(項目85)
がん起始細胞の集団を識別、単離、分画又は濃縮する方法であって、前記がん起始細胞をCD46モジュレータと接触させる工程を含む、方法。
(項目86)
前記CD46モジュレータが抗体を含む、項目82に記載の方法。
(項目87)
前記抗体がモノクローナル抗体を含む、項目83に記載の方法。
(項目88)
前記がん起始細胞をフローサイトメトリー解析にかける工程を更に含む、項目82に記載の方法。
(項目89)
前記フローサイトメトリー解析がFACSを含む、項目85に記載の方法。
(項目90)
異常増殖性疾患に罹患している患者において、がん起始細胞を除去させる方法であって、CD46モジュレータを投与する工程を含む、方法。
(項目91)
前記CD46モジュレータがモノクローナル抗体を含む、項目90に記載の方法。
(項目92)
前記モノクローナル抗体が細胞毒性剤と会合している、項目91に記載の方法。
(項目93)
前記モノクローナル抗体がpan−CD46抗体である、項目92に記載の方法。
(項目94)
前記モノクローナル抗体が、単一のCD46スプライス変異体と免疫特異的に会合する、項目92に記載の方法。
(項目95)
前記単一のCD46スプライス変異体が、CD46D、CD46F及びCD46Jからなる群から選択されるスプライス変異体を含む、項目94に記載の方法。
(項目96)
ヒト化抗体を含むCD46モジュレータであって、前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は実質的に配列番号199に記載の通りのものであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は実質的に配列番号201に記載の通りのものである、CD46モジュレータ。
(項目97)
hSC1.N71抗体及び製薬上許容され得る担体を含む、組成物。
(項目98)
ヒト化抗体を含むCD46モジュレータであって、前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は実質的に配列番号203に記載の通りのものであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は実質的に配列番号205に記載の通りのものである、CD46モジュレータ。
(項目99)
hSC1.N149抗体及び製薬上許容され得る担体を含む、組成物。
(項目100)
治療を必要としている対象者において、転移を阻害又は予防する方法であって、製薬学的有効量のCD46モジュレータを投与する工程を含む、方法。
(項目101)
前記対象者が、CD46モジュレータ投与の前又は後に腫瘍減量法により治療される、項目100に記載の方法。
(項目102)
前記腫瘍減量法が、少なくとも1種の抗がん剤の投与を含む、項目101に記載の方法。
(項目103)
前記対象者が、CD46モジュレータの投与時に寛解状態である、項目100に記載の方法。
(項目104)
治療を必要としている対象者に対し維持療法を実施する方法であって、製薬学的有効量のCD46モジュレータを投与する工程を含む、方法。
(項目105)
前記対象者が、前記CD46モジュレータ投与前に腫瘍性疾患の治療を受けている、項目104に記載の方法。
(項目106)
前記対象者が、前記CD46モジュレータの投与時に、腫瘍性疾患に関しては無症状である、項目104に記載の方法。
(項目107)
前記対象者を腫瘍性疾患に関し治療した後、前記CD46モジュレータを6ヶ月以上投与する、項目105に記載の方法。
(項目108)
前記CD46モジュレータがモノクローナル抗体を含む、項目105に記載の方法。
広義には、本発明の実施形態は、新規CD46モジュレータ、並びにがんなどの異常増殖性疾患を治療、管理、緩和又は予防する際の本モジュレータの使用を目的とする。任意の特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本開示のモジュレータは、腫瘍の成長の抑制又は遅延、及び腫瘍原性細胞の排除又は中和、並びに抗がん剤に対する細胞の感受性の変更に効果的であることが判明している。更に、驚くべきことに、従来では知られていなかったことだが、選別した腫瘍永続化細胞(TPC)と、CD46として公知のタンパク質とが、表現形特異的に会合することが判明した。この点に関し、選別したTPC(すなわち、がん幹細胞又はCSC)は、正常組織と比較した場合に、並びに固体腫瘍の大部分を構成している腫瘍前駆細胞(TProg)及び非腫瘍原生(NTG)細胞と比較した場合に、CD46の発現レベルが高く、特異的なスプライス変異体を含む。したがって、選択された実施形態では、腫瘍の微小環境において、選別された細胞表面と会合するタンパク質濃度が上昇することから、CD46は腫瘍関連性のマーカー(又は抗原)を含み、TPC及び関連する新生物の検出、感作及び/又は抑圧に有効な剤を提供することが判明している。より詳細には、並びに更により驚くべきことに、CD46は分泌性の物質のようであり(少なくともある程度)、腫瘍永続化細胞の除去、感作、排除、減少、リプログラミング、分化促進に関し、あるいはこれらの腫瘍永続化細胞を拡散及び/又は持続させて患者において腫瘍を成長又は再発させる能力の防止又は制限に関し、Fc−CD46コンストラクト及び免疫応答性アンタゴニスト(例えば、該当するタンパク質に結合する抗体)などのCD46モジュレータが有用であることが更に確認されている。
CD46は、補体調節タンパク質又はMCPとしても既知である。CD46は広範に発現するI型の膜貫通型タンパク質であり、エキソンスプライシング及びグリコシル化により、数多くのアイソフォームが存在する。引用によりその全文が本明細書に組み込まれるRecently Karosi et al.,Laryngoscope 118:1669〜1676(Sept.2008)は、CD46分子のアイソフォームを14種検出したことを報告している。mRNAは染色体1q32の単一遺伝子座から転写され、大規模な選択的スプライシングを経て、各種タンパク質のアイソフォームをコードしている複数の転写産物が生成される。遺伝子を構成している14のエキソンのうち、エキソン1〜6が、すべてのCD46タンパク質アイソフォームにおいて保存されている一方で、7〜9は可変的に利用されるセリン−スレオニン−プロリン(「STP」)リッチ領域をコードしており、これにより、タンパク質アイソフォームにおいて主要な超可変部がもたらされることが判明している。エキソン11及び12はCD46の膜貫通領域をコードするのに対し、エキソン13及び14は、タンパク質の細胞質側末端をコードする。最長のmRNA転写産物である変異体A(NM_002389)は、遺伝子に含まれる14のエキソンをすべて含む配列を含有する。エキソン7、8、9、及び13の可変的スプライシングにより、CD46の14のアイソフォームのうちのほとんどが生成されると考えられ、タンパク質アイソフォームは、エキソン8のオルタナティブな組み込み又は除外により、主に66及び56kDaで観察される。エキソン13のオルタナティブな組み込み/除外により、分子の細胞質側末端をコードしている配列に変化が生じることから、これらを変化させることで、タンパク質の細胞内輸送、安定性、及びシグナル伝達特性に影響が出るものと考えられる。
従来の任意の技術とは対照的に、本発明は、がん起始細胞を標的化するのに、特に腫瘍永続化細胞を標的化するのに特に有用なCD46モジュレータを提供し、これにより腫瘍性疾患の治療、管理又は予防を促進する。より詳細には、これまでに示された通り、驚くべきことに、特定の腫瘍細胞の下位集団がCD46を発現しており、かつがん幹細胞の自己複製及び細胞の生存にとって重要な形態形成シグナル伝達の局在的な協調を改変するようであることが判明している。したがって、好ましい実施形態では、本開示の技術に従って、がん起始細胞の発生頻度を減少させるためにCD46のモジュレータを使用し、それにより異常増殖性疾患の治療又は管理を促進することができる。
任意のイベントにおいて、本発明は、数多くのCD46介在性悪性腫瘍のうちのいずれか1つを診断、治療及び/又は予防する際の、CD46アンタゴニストなどのCD46モジュレータの使用を目的とする。本開示のモジュレータは、単独で、あるいは化学療法剤又は免疫療法剤又は生体応答修飾物質などの様々な抗がん剤化合物と共に使用することができる。他に選択される実施形態では、2種以上の別個のCD46モジュレータを組み合わせて使用して抗腫瘍効果を増強させても、あるいは2種以上の別個のCD46モジュレータを用い多選択制のコンストラクトを作製してもよい。
a.概論
これまでに言及した通り、本発明の特に好ましい実施形態には、CD46モジュレータは抗体の形態で含まれる。本明細書において、用語「抗体」は、幅広い意味で使用され、具体的には、合成抗体、モノクローナル抗体、オリゴクローナル又はポリクローナル抗体、他クローン性抗体、組み換え法により産生された抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価の抗体、多価の抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、キメラ(primatized)抗体、Fab断片、F(ab’)断片、一本鎖FvFcs(scFvFc)、一本鎖Fvs(scFv)、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、及び所望の生物活性(すなわち、CD46と会合する、又はこれと結合する)を示す免疫的に活性な任意のその他の抗体断片をその範囲に含む。幅広い意味で、本発明の抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原結合部位を含有する分子を包含する。これらの断片は、他の免疫グロブリンドメイン、例えば、限定するものではないが例えばFc領域又はそれらの断片などと融合させてもよく、あるいは融合させなくてもよい。更に、本明細書においてより詳細に記載される通り、用語「抗体」には、具体的には、以下に記載の通りの、完全長の抗体、並びにFc領域又は所望により、少なくとも1種のアミノ酸残基を変更させ、かつ免疫学的に活性な免疫グロブリン断片と融合させた、Fc領域の断片を含むFc融合変異体を包含する。
2残基にはChothia et al.(上掲)の付番法に従って付番した
3残基にはMacCallum et al.(上掲)の付番法に従って付番した
便宜上、図11Bに掲載するCDRは、本開示の内容により当業者であれば容易に確認することができ、かつそれぞれ重鎖及び軽鎖配列についてKabat et al.又はMacCallum et al.の定義する通りのCDRを列挙することができるであろう。この観点から、実施例16に掲載するヒト化抗体の解析にはKabat et al.により定義される通りのCDRを使用し、このCDRについては、ヒト化抗体の配列を示す図13A及び13Bにおいて下線を付した。したがって、CDRを含む抗体は、すべてこのような命名法により定義し、本発明の範囲内に例示的に組み込む。より広範には、用語「可変領域のCDRアミノ酸残基」には、上掲の方法に基づき、任意の配列又は構成を用い識別されたCDRのアミノ酸が包含される。
本明細書に記載の技術に従って抗体を生成する目的で、周知の通りに、ウサギ、マウス、ラットなどの各種宿主動物に接種を行い、使用できる。免疫応答を増強するために使用できる、当該技術分野において公知のアジュバントとしては、限定するものではないが、接種する種に応じ、フロイントの(完全及び不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムなどを含むミネラルゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロン酸ポリオール、多価アニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノールが挙げられ、並びにBCG(ウシ型弱毒結核菌ワクチン)及びコリネバクテリウム・パルバムなどのヒト用アジュバントも有用である可能性がある。このようなアジュバントは、抗原を局所的に付着させて、抗原の急速な分散を防ぐことができ、あるいは宿主を刺激して、マクロファージ及び免疫系の他の構成要素が走化性を示す因子を分泌させる、物質を含有し得る。好ましくは、ポリペプチドを投与する場合には、免疫スケジュールは、数週間の間隔をとってポリペプチドを2回以上投与することを包含する。
本発明の特定の態様では、ポリクローナル抗体を複合させて使用することができるが、好ましい実施形態にはCD46反応性モノクローナル抗体の使用法が含まれる。本明細書で使用するとき、用語「モノクローナル抗体」又は「mAb」は、実質的に均一な抗体集団、すなわち、生じ得る変異体、例えば、自然に生じ、微量に存在する可能性のある変異体を除き、それぞれの抗体が同一のものである集団から得られる抗体を指す。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、この語句により修飾を受けている抗体が、別種の抗体の混合物ではないことを示すものであり、任意の種類の抗体に組み合わせて使用できる。特定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体としては、CD46と結合又は会合するポリペプチド配列を含む抗体が挙げられる。CD46結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選別する工程を含む方法により得られる。
他の実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも2つの異なる種又は型の抗体のタンパク質断片を共有結合させて得たキメラ抗体を含み得る。本明細書で使用するとき、用語「キメラ抗体」は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が、特定の種から誘導された抗体、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の相当する配列と同一であり、すなわち相同であり、その一方、鎖中の残部は、他の種から誘導された抗体、又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の、並びに所望の生物活性を示す場合に限り抗体断片中の、相当する配列と同一であり、すなわち相同であるコンストラクトを目的としていることは明らかであろう(米国特許第4,816,567号;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851〜6855(1984))。1つの例示的な実施形態では、本開示の技術に従うキメラ抗体には、ヒト種由来のマウスVH及びVLアミノ酸配列及び定常領域を含み得る。他の準拠する実施形態では、本発明のキメラ抗体には、以下に記載のCDRグラフト化又はヒト化抗体を含み得る。
ヒト化抗体は、CDRグラフト化抗体と同類である。一般的に、ヒト化抗体は、まずヒト以外の動物を免疫することで得られたモノクローナル抗体から生成される。本明細書で使用するとき、ヒト化形態の非ヒト(例えば、マウス)抗体とは、ヒト以外の免疫グロブリン由来の配列を、最小限度で含有しているキメラ抗体を指す。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのCDR残基を所望の特異性、親和性、及び/又は結合能を有する、マウス、ラット、ウサギ、又はヒト以外の霊長類などのヒト以外の種由来のCDR残基(ドナー抗体)により置き換えたヒト免疫グロブリンである。
前述の抗体に加え、当業者であれば、本発明の抗体には完全なヒト抗体も含まれ得ることが理解されるであろう。本開示の目的に際し、用語「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された抗体のものと一致するアミノ酸配列を保有しており、本明細書で開示される通りのヒト抗体の製造に際し使用される、任意の手法により作製された抗体を含む。このヒト抗体の定義には、具体的には非ヒト型抗原結合残基を含むヒト化抗体は除外される。
作製方法又は前述した抗体モジュレータの形態(例えば、ヒト化及びヒトなど)とは関係なく、本開示のモジュレータの好ましい実施形態は各種特性を示し得る。この点で、抗CD46抗体産生細胞(例えば、ハイブリドーマ又は酵母コロニー)は、選別し、クローン化することができ、更には、望ましい特性に関し、例えば着実に成長する、及び抗体産生性が高いなどの望ましい特性、並びに以降により詳細に議論される望ましい抗体特性に関し、スクリーニングすることができる。ハイブリドーマは、例えば、ヌードマウスなどの、免疫系を欠損している同系の動物を用い、in vivoで増殖させることができ、あるいは細胞培養法を用いin vitroで増殖させることができる。それぞれ別個の抗体種を産生する、ハイブリドーマ及び/又はコロニーの選別、クローニング及び増殖法は、当業者には周知である。
特に好ましい実施形態では、本発明のモジュレータは、中和抗体又はそれらの誘導体若しくは断片が含まれる。用語「中和抗体」又は「中和アンタゴニスト」は、CD46又は任意のリガンド又は酵素に結合し、あるいはこれらと相互作用し、リガンド又は酵素がその結合パートナー(例えば、CD46)、すなわち基質と結合するのを阻害することで、分子の相互作用により生じ得る生物学的な応答を妨げる抗体又はアンタゴニストを指す。抗体、又はそれらの免疫学的な機能断片若しくは誘導体の結合性及び特異性を評価する際、過剰量の抗体により、結合パートナーが標的分子と結合する量が少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%又は99%以上減少した場合に(本明細書において、実施例に示される通りのin vitroでの競合的結合アッセイで測定された場合に)、抗体又は断片は、リガンド又は酵素と、その結合パートナーすなわち基質との結合を実質的に阻害するとされる。CD46に対する抗体の場合、中和抗体又はアンタゴニストは、好ましくは血清第I因子により補体成分C3b及びC4bを不活性化させるというCD46の能力を少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%又は99%以上消失させ、これにより遊離グリピカンの濃度は低下する。この活性の消失度は、当該技術分野で認識されている手法を用い直接測定でき、あるいはこのような減少が補体活性に対して示す影響を測定することにより測定できることは明らかであろう。
CD46が細胞から分泌され得ることを示すデータが存在する一方で、少なくとも一部のCD46は細胞表面と会合したままであり、これにより開示のモジュレータの内部移行が可能になる。したがって、抗CD46抗体は、CD46を発現する細胞により、少なくともある程度は内部移行され得る。例えば、がん起始細胞の表面でCD46に結合する抗CD46抗体は、がん起始細胞に内部移行され得る。特に好ましい実施形態では、このような抗CD46抗体に細胞毒性部分を会合させるか、又は細胞毒性基と複合させて、内部移行時に細胞を殺傷させることができる。
他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレータは、除去抗体又はそれらの誘導体若しくは断片が含まれる。用語「除去抗体」は、細胞表面上又は細胞表面付近のCD46に結合又は会合し、細胞死又は細胞除去を誘導、促進、又は引き起こす(例えば補体依存性の細胞毒性又は抗体依存性の細胞傷害活性により)抗体又は断片を指す。以降により詳細に議論される一部の実施形態では、選別した除去抗体は細胞毒性剤と会合又は複合させる。好ましくは、除去抗体は、所定の細胞集団に含まれる腫瘍永続化細胞のうち、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、又は99%を除去、排除又は殺傷することができる。一部の実施形態では、この細胞集団は濃縮、分画、精製又は単離した腫瘍永続化細胞から構成され得る。他の実施形態では、細胞集団は、完全な腫瘍試料、あるいは腫瘍永続化細胞を含む不均一な腫瘍抽出物から構成され得る。当業者であれば、本開示の技術に従った腫瘍永続化細胞の除去をモニター及び定量するために、下記実施例に記載の標準的な生化学法を使用できることは明らかであろう。
本開示の抗CD46抗体が、選別した標的の示す別個のエピトープ又は抗原決定基と会合、又は結合し得ることが更に理解されるであろう。本明細書で使用するとき、用語「エピトープ」は、特定の抗体が認識し、及び特異的に結合することのできる標的抗原基を指す。抗原がCD46などのポリペプチドである場合、エピトープは、連続的なアミノ酸、及びタンパク質の3次元折り畳構造により並置される非連続的なアミノ酸の両方から形成され得る。連続的なアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的にはタンパク質の変性時にも保持される一方で、3次元折り畳構造により形成されるエピトープは、一般的には、タンパク質の変性時に損なわれることになる。エピトープは一般的には少なくとも3個、及びより一般的には、少なくとも5個又は8〜10個のアミノ酸を、特有の空間配置の下含有する。より詳細には、当業者であれば、用語「エピトープ」には、免疫グロブリン又はT細胞受容体と特異的に結合することのできる、あるいは分子と相互作用することのできる任意のタンパク質の抗原決定基が包含されることを理解されるであろう。エピトープとなる抗原決定基は、通常、アミノ酸、又は炭水化物若しくは糖側鎖等の、化学的に活性な表面分子の集団からなり、特異的な3次元構造特性、並びに特異的な電荷特性を有する。加えて、エピトープは直線構造であっても、又は立体構造であってもよい。直線構造のエピトープでは、タンパク質及び相互作用分子(抗体など)間の相互作用点のすべてが、タンパク質の一次アミノ酸配列に従って直線状に現れる。立体構造を以って形成されるエピトープでは、相互作用点は、タンパク質の一次構造では互いに分離されているアミノ酸残基間で形成される。
この観点から、本発明は更に、CD46に対する結合親和性の高い抗体の使用法を包含する。本発明の抗体は、解離定数Kd(koff/kon)が10−8M以下である場合にその標的とする抗原に特異的に結合するものである。抗体は、Kdが5×10−9M以下である場合に抗原に対し高親和性かつ特異的に結合し、Kdが5×10−10M以下である場合には非常に高親和性に結合する。本発明の一実施例では、抗体のKdは10−9M以下であり、解離速度は約1×10−4/秒である。本発明の一実施例では、解離速度は1×10−5/秒以下である。本発明の他の実施形態では、抗体は、約10−8M〜10−10MのKdでCD46に結合し、更に他の実施形態では、2×10−10M以下のKdで結合する。本発明の更に他の選択的な実施形態は、解離定数すなわちKd(koff/kon)が10−2M未満、5×10−2M未満、10−3M未満、5×10−3M未満、10−4M未満、5×10−4M未満、10−5M未満、5×10−5M未満、10−6M未満、5×10−6M未満、10−7M未満、5×10−7M未満、10−8M未満、5×10−8M未満、10−9M未満、5×10−9M未満、10−10M未満、5×10−10M未満、10−11M未満、5×10−11M未満、10−12M未満、5×10−12M未満、10−13M未満、5×10−13M未満、10−14M未満、5×10−14M未満、10−15M、又は5×10−15M未満である抗体を含む。
前述の結合特性に加え、抗CD46抗体、及びすべてのポリペプチドなどのそれらの断片は、一般的には、ポリペプチドが正味電化を担持しなくなるpHとして定義される、等電点(pI)を有する。当該技術分野では、タンパク質の溶解度は、溶液のpHがタンパク質の等電点(pI)と等しい場合に、最も低くなることが既知である。したがって、溶解性は、抗体に含まれるイオン化可能な残基の数及び位置を変更し、pIを調節することで、最適化できる。例えば、ポリペプチドのpIは、適切なアミノ酸置換を施すことで操作できる(例えば、リジンなどの帯電しているアミノ酸を、アラニンなどの非帯電残基に置換する)。任意の特定の理論に束縛されることを望むものではないが、抗体のpIが変更されるよう抗体にアミノ酸置換を行うと、抗体の溶解性及び/又は安定性が改善され得る。当業者であれば、特定の抗体に所望のpIをもたせるにはアミノ酸置換が最も適切であることを理解されるであろう。
更に、抗体のFabドメインのTmは、抗体の熱安定性に関する良好な指標となり得、更には貯蔵寿命の指標になり得ることも認識されるであろう。Tmは単に、所定のドメイン又は配列の50%の立体構造がほどけることを意味する。Tmが低ければ、より凝集性が高く/安定性が乏しいことを意味し、それに対しTmが高ければ、より凝集性が低く/安定性が高いことを意味する。したがって、抗体又は断片若しくは誘導体は、Tmが高い方が好ましい。更に、当該技術分野で認められている手法により、抗CD46抗体又はそれらのドメインの構成に変更を加えて、分子安定性を向上させたり、あるいは最適化することもできる。例えば、米国特許第7,960,142号を参照されたい。したがって、一実施形態では、選別した抗体のFabドメインが有するTm値は、少なくとも50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃又は120℃より高い。他の実施形態では、抗体の有するFabドメインが有するTm値は、少なくとも約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃、約90℃、約95℃、約100℃、約105℃、約110℃、約115℃又は約120℃より高い。タンパク質ドメイン(例えば、Fabドメイン)の溶解温度(Tm)は、当該技術分野において既知である、任意の標準的な手法により、例えば、示差走査熱量測定により測定できる(例えば、いずれも引用により本開示に組み込まれるVermeer et al.,2000,Biophys.J.78:394〜404、Vermeer et al.,2000,Biophys.J.79:2150〜2154を参照されたい。)
VII.CD46モジュレータ断片及び誘導体
インタクト融合コンストラクト、抗体、断片、又は誘導体のいずれであったとしても、本発明の選別したモジュレータは、CD46と反応、結合、合体、複合、接続、付着、連結、相互作用、又は会合することで、所望の抗腫瘍性効果をもたらす。当業者であれば、抗CD46抗体を含むモジュレータは、抗体に発現した1つ以上の結合部位を介して、CD46と相互作用又は会合することを認識されるであろう。より詳細には、本明細書で使用するとき、用語「結合部位」は、対象とする標的分子(例えば、酵素、抗原、リガンド、受容体、基質又は阻害物質)に対する選択的な結合に関与する、ポリペプチド領域を含む。結合ドメインは、結合部位を少なくとも1つ含む(例えば、インタクトIgG抗体は、2つの結合ドメインと2つの結合部位を有する)。例示的な結合ドメインとしては、抗体可変領域、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体のリガンド結合ドメイン、又は酵素ドメインが挙げられる。本発明の目的に際し、CD46の酵素活性領域(例えば、Fc−CD46融合コンストラクトの一部分など)は基質結合部位(例えば、グリピカン)を含み得る。
本発明を実施するにあたり選択されるモジュレータの形態(例えば、キメラ、ヒト化など)とは関係なく、同一の免疫反応性断片を本開示の手法に従って使用できることは理解されるであろう。広義に、用語「抗体断片」は、インタクト抗体(例えば、天然に生じる免疫グロブリン)の少なくとも一部分を含む。より詳細には、用語「断片」は、インタクト又は完全な抗体又は抗体鎖よりも少数のアミノ酸残基を含む、抗体又は抗体鎖(又はFc融合体の場合にはCD46分子)の一部分又は部分を指す。用語「抗原結合性断片」は、抗原に結合する、又は抗原結合(すなわち、特異的結合)においてインタクト抗体(すなわち、その断片が派生したインタクト抗体)と競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を意味する。本明細書で使用するとき、用語「抗体分子の断片」としては、抗体の抗原結合性断片、例えば、抗体軽鎖(VL)、抗体重鎖(VH)、一本鎖抗体(scFv)、F(ab’)2断片、Fab断片、Fd断片、Fv断片、単ドメインの抗体断片、二量体、線状(linear)抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から生成される多選択性抗体(multispecific antibodies)が挙げられる。同様にして、CD46の酵素活性断片は、インタクトCD46と同様の様式(ある程度効果が劣る場合もあるものの)でCD46基質と相互作用し及びこの基質を改変する(例えば、基質を切り出す能力を保持している、CD46分子の一部分を含む。
他の実施形態では、本発明のモジュレータは一価又は多価(例えば、二価、三価など)であってよいことが更に理解されるであろう。本明細書で使用するとき、用語「結合価」は、抗体と会合する標的(すなわち、CD46)結合部位となり得る部位の数を指す。各標的結合部位は、1つの標的分子又は特異的な位置又は標的分子上の部位に特異的に結合する。本発明の抗体が標的結合部位を1つ以上含む(多価である)場合、各標的結合部位は同一又は異なる分子(例えば、異なるリガンド若しくは異なる抗原、異なるエピトープ若しくは同一抗原の異なる位置)に特異的に結合し得る。本発明の目的に関し、対象とする抗体は、好ましくは、ヒトCD46に特異的な結合部位を少なくとも1つ有する。一実施例では、本発明の抗体は、分子の各結合部位が単一のCD46位置又はエピトープに特異的に結合するものであり、一価である。他の実施形態では、抗体は、1つ以上の位置又はエピトープと特異的に会合する1つ以上の結合部位及び異なる結合部位を含み、多価である。抗体が多価である場合、選別されたCD46ポリペプチド又はスプライス変異体上には複数のエピトープが存在してよく、あるいはCD46上には1つのエピトープが存在し、かつ他の分子又は表面上に第2の異なるエピトープが存在していてもよい。例えば、米国特許出願公開第2009/0130105号を参照されたい。
a.Fc領域及びFc受容体
上記本開示のモジュレータ(例えば、Fc−CD46又は抗CD46抗体)の可変又は結合領域に対する各種変更、置換、付加又は欠失に加えて、当業者であれば、本発明の実施形態のうち一部のものは、定常領域(すなわち、Fc領域)にも置換又は変更を含み得ることを理解するであろう。より具体的には、本発明のCD46モジュレータは、とりわけ、得られるモジュレータに好ましい特性、例えば、限定するものではないが、薬物動態の変更、血清中半減期の延長、結合親和性の向上、免疫原性の減少、産生性の向上、Fcリガンド結合性の向上、ADCC又はCDC活性の増感又は減感、グリコシル化及び/又はジスルフィド結合の変更、並びに結合特異性の変更などの、好ましい特性をもたらし得る、1つ以上の付加的アミノ酸置換、変異及び/又は変更を含有し得ることが企図される。この観点から、これらのFc変異体は、本開示のモジュレータの有する抗腫瘍特性の有効性を増感させるにあたって有利に使用できる。
本明細書で使用するとき、補体依存性細胞障害及びCDCは、補体の存在下で、標的細胞が可溶化することを指す。補体活性化経路は、補体系(C1q)の第1構成成分が同種抗原と複合した分子、例えば抗体に結合することで開始する。補体活性を評価するために、CDCアッセイ、例えば、Gazzano−Santoro et al.,1996,J.Immunol.Methods,202:163において説明されるようなCDCアッセイを実施してもよい。
更に他の実施形態では、本発明の抗体のグリコシル化パターン又は組成は変更される。より具体的には、本発明の好ましい実施形態は、グリコフォームが1つ以上操作されており、すなわち、グリコシル化パターンの変更又はFc領域を構成する分子に共有結合している糖鎖組成の変更を含む。グリコフォームの操作は、限定するものではないが、エフェクタ機能の増感又は減感、標的抗原に対する抗体の親和性の向上、又は抗体産生の促進などの様々な目的に関し有用なものであり得る。エフェクタ機能の減感が所望される場合、分子は糖鎖不含有の形態で発現するように操作され得ることは理解されるであろう。このような糖鎖修飾は、例えば、抗体配列内の、グリコシル化に関する1つ以上の部位を改変することで実施できる。すなわち、可変領域フレームワークのグリコシル化部位を1つ以上除去することで、除去された部位に対するグリコシル化が生じなくなるようなアミノ酸置換を1箇所以上に行うことができる(例えば、米国特許第5,714,350号及び同第6,350,861号を参照されたい)。反対に、Fc含有分子のエフェクタ機能を増感させるか、又は結合性を向上させたければ、グリコシル化部位を1箇所以上に追加設計することもできる。
a.概論
所望のCD46モジュレータをコードしているDNAは、従来の手法を用い(例えば、抗体重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを用い)容易に単離し、配列決定することができる。モジュレータが抗体である場合、単離し、サブクローニングしたハイブリドーマ細胞(又はコロニー由来のファージ若しくは酵母)を、このようなDNAの好ましい供給源として提供できる。この核酸は、融合タンパク質、又はキメラ、ヒト化若しくは完全ヒト抗体などの剤を生成するにあたって、必要に応じて、本明細書に記載の通りに更に操作することができる。より詳細には、米国特許第7,709,611号に記載の通り、抗体を製造する際に、定常及び可変領域の配列をクローン化するにあたって、単離したDNA(改変されていてもよい)を使用できる。
記載の通り、本発明は更に、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸とハイブリッド形成する核酸を提供する。核酸にハイブリッド形成させる手法は、当該技術分野において周知である。例えば、現行のプロトコルについては、Molecular Biology,John Wiley and Sons,N.Y.(1989),6.3.1〜6.3.6を参照されたい。本開示の目的に関し、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、5x塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)、ハイブリダイゼーション緩衝液(約50%ホルムアミドを含む)、6xSSCを含有している前洗浄用液を用い、ハイブリダイゼーション温度は55℃(又は約50%ホルムアミドを含む他の同様のハイブリダイゼーション溶液を用い、ハイブリダイゼーション温度は42℃で)、及び洗浄条件では60℃(0.5xSSC、0.1% SDS)で行うものである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、45℃にて6xSSCでハイブリッド形成させ、続いて68℃にて0.1xSSC、0.2% SDSで1回以上洗浄を行う。更に、当業者は、ハイブリダイゼーション及び/又は洗浄条件を操作して、互いに少なくとも65、70、75、80、85、90、95、98又は99%同一であるヌクレオチド配列を構成している核酸が、典型的には互いにハイブリッド形成をしたままとどまるなどするように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加又は減少させることができる。より一般的な本開示の目的に関し、核酸配列に関する用語「実質的に同一」は、参照核酸配列に対し少なくとも約85%、又は90%、又は95%、又は97%配列相同性を示すヌクレオチド配列として解釈することができる。
RNA及び/又はタンパク質又はペプチドを発現する核酸と、発現制御配列とは、この核酸の発現又は転写が、制御下にある、すなわち発現制御配列の影響下にあるよう互いに共有結合している場合には、互いに機能的に連結している。次に、核酸が機能性タンパク質へと翻訳される場合、発現制御配列がコード配列に機能的に連結され、この発現制御配列の導入により、コード配列をフレーム・シフトさせずに核酸の転写が行われ、あるいは前記コード配列は所望のタンパク質又はペプチドへと翻訳され得ない。
当業界で認知されている分子生物学的手法及び現行のタンパク質発現法を用い、所望のモジュレータを大量に産生することができる。より詳細には、所望の製薬学的生成物を前臨床的、臨床的、又は商業的量で産生させるための様々な宿主細胞を含む、周知の及び市販のタンパク質産生系に、上記のように得、操作した抗体などのモジュレータをコードしている核酸分子を組み込むことができる。好ましい実施形態では、モジュレータをコードしている核酸分子を、選択した宿主細胞の中に効果的に組み込まれかつ続いて所望のCD46モジュレータを高発現するベクター又は発現ベクター内に設計する。
多くは市販されている、各種宿主発現ベクター系は、本明細書に記載の技術に準拠するものであり、本発明のモジュレータを発現させるために使用することができる。このような宿主発現系は、対象とするコード配列を発現し、続いて精製することのできる媒介物を意味するが、in situで本発明の分子を発現する適切なヌクレオチドコード配列により、形質転換又は遺伝子導入した細胞も意味する。このような系としては、限定するものではないが、組み換えバクテリオファージDNAにより形質転換した、バクテリアなどの微生物(例えば、大腸菌、枯草菌、ストレプトミセス)、モジュレータコード配列を含有している、プラスミドDNA又はコスミドDNA発現ベクター、モジュレータコード配列を含有している組み換え酵母発現ベクターにより遺伝子導入した酵母(例えば、サッカロミセス、ピキア)、モジュレータコード配列を含有している組み換えウイルスベクター(例えば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系、組み換えウイルスベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)、タバコモザイクウイルス(TMV))又はモジュレータコード配列を含有している組み換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)を感染させた植物細胞系(例えば、タバコ、シロイヌナズナ、アオウキクサ、トウモロコシ、小麦、ジャガイモなど)、あるいは哺乳動物細胞(例えば、メタロチオネインプロモーター)のゲノム又は哺乳動物感染性ウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニア・ウイルス7.5Kプロモーター)由来のプロモーターを含有している組み換え発現コンストラクトを内包している哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3細胞)が挙げられる。
前述の宿主細胞系に加え、本発明のモジュレータは、当該技術分野において既知の手法を用い、化学合成することもできることは理解されるであろう(例えば、Creighton,1983,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman & Co.,N.Y.,and Hunkapiller,M.,et al.,1984,Nature 310:105〜111を参照されたい)。例えば、本発明のポリペプチド断片に相当するペプチドを、ペプチド合成器を使用して合成することができる。更に、必要に応じて、ポリペプチド配列には非古典的なアミノ酸又は化学的なアミノ酸類似体を、置換又は付加などにより導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定するものではないが、一般的なアミノ酸のD型異性体、2,4−ジアミノブタン酸、α−アミノイソ酪酸、4−アミノブタン酸、Abu、2−アミノブタン酸、g−Abu、e−Ahx、6−アミノヘキサン酸、Aib、2−アミノイソ酪酸、3−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、b−アラニン、フルオロアミノ酸、合成アミノ酸、例えば、β−メチルアミノ酸、Ca−メチルアミノ酸、Na−メチルアミノ酸、及び一般的なアミノ酸誘導体などが挙げられる。更に、アミノ酸はD体(右旋性)又はL体(左旋体)であってよい。
本発明のCD46モジュレータは、対象とする免疫グロブリン重鎖及び軽鎖配列(あるいはこれらの断片又は誘導体又は変異体)をもつよう遺伝子組み換えされた哺乳動物又は植物を生成し、所望の化合物を回復可能な形態で産生させる、遺伝子組み換え法により製造することもできる。哺乳動物による遺伝子組み換え体の産生との関連において、抗CD46抗体は、例えば、ヤギ、雌牛、又は他の哺乳動物の乳中に産生させ、これらから回収することができる。例えば、米国特許第5,827,690号、同第5,756,687号、同第5,750,172号、及び同第5,741,957号を参照されたい。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む遺伝子組み換え非ヒト動物を、上記の通りのCD46又はこれらの免疫原性の部分により免疫化する。植物を用いる抗体製造法は、例えば、米国特許第6,046,037号及び同第5,959,177号に記載される。
本発明のモジュレータは、組み換え発現系又は本明細書で開示される任意の他の手法により製造したならば、免疫グロブリンの精製に関する当該技術分野で既知の任意の手法により、あるいはタンパク質の精製に関する、より一般的な任意の他の標準的な手法により、精製することができる。この点により、モジュレータは単離することができる。本明細書で使用するとき、単離されたCD46モジュレータは、自然な環境に含まれる成分から、同定、及び分離及び/又は回収されたものである。自然環境由来の夾雑物は、診断又は治療用途でポリペプチドを使用する際に干渉する場合があり、このような夾雑物としては、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性の溶質が挙げられる。ポリペプチドの天然環境にまつわる少なくとも1つの成分が存在しないことから、単離したモジュレータには、組み換え細胞内部に元々存在するモジュレータも包含される。
本発明のモジュレータは、本開示の手法に従い精製したならば、医薬活性剤又は診断基又は生体適合性の修飾剤と、結合させる、融合させる、又は複合させる(例えば、共有結合的に又は非共有結合的に複合する)、又はこれらと会合させることもできる。本明細書で使用するとき、用語「複合する」は、広範に使用され、会合させる手法とは無関係に、本開示のモジュレータと会合する任意の分子を意味する。この点において、このような複合体には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ポリマー、核酸分子、小分子、模倣剤、合成剤、無機分子、有機分子及び放射性同位体が含まれ得ることは理解されるであろう。更に、上記に示す通り、選別した複合体は、共有結合的又は非共有結合的にモジュレータと結合させることができ、複合体を作用させるのに使用する方法に少なくとも一部基づき、様々なモル比を示し得る。
好ましい実施形態では、本発明のモジュレータは、所望される通りにモジュレータ特性を調節、変更、改良又は緩和させるために使用できる生体適合性の修飾因子と複合することができ、あるいはこれと会合させることができる。例えば、市販のポリエチレングリコール(PEG)又は同様の生体適合性のポリマーなどの比較的高分子量のポリマー分子を結合させることで、抗体又は融合コンストラクトの、in vivoでの半減期を延長させることができる。当業者であれば、PEGは、多くの異なる分子量及び分子組成で得ることができ、これらは抗体に対し特定の特性を付与するよう(例えば、半減期を調整するなど)選択できることを理解するであろう。多官能性リンカーを用い、又はこれを用いずに、PEGを抗体又は抗体断片のN−又はC末端と部位特異的に複合体形成させることにより、あるいはリシン残基上に存在するε−アミノ基を介し複合体形成させることにより、PEGをモジュレータ又は抗体断片又は誘導体に取り付けることができる。生物活性の低下を最小限に抑える直鎖又は分枝鎖ポリマー誘導体化を使用することもできる。抗体分子がPEG分子により最適に修飾されていることを確認するために、SDS−PAGE及び質量分析法により、結合の程度を厳密にモニターすることができる。未反応のPEGは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを用いPEG化抗体から分離することができる。同様の方法で、本開示のモジュレータは、in vivoにおいて抗体又は抗体断片がより安定的になるよう、あるいはこれらのin vivo半減期が延長されるよう、アルブミンと複合させることもできる。この手法は当該技術分野において周知のものであり、例えば、国際公開第93/15199号、同第93/15200号、及び同第01/77137号、及び欧州特許第0413,622号を参照されたい。当業者には他の生体適合性の結合分子も明白であり、このような結合分子は本開示の技術に従って容易に決定することができる。
他の好ましい実施形態では、本発明のモジュレータ、又はそれらの断片、又は誘導体は、生物由来の分子(例えば、ペプチド又はヌクレオチド)、あるいは小分子又は放射性同位体などの診断薬又は検出薬と結合させる。このようなモジュレータは、異常増殖性疾患の発達又は進行を監視するのに、あるいは臨床試験手順の一貫として本開示のモジュレータを含む具体的な治療の有効性を評価するのに有用なものであり得る。このようなマーカーは、選別したモジュレータの精製、TICの分離若しくは単離、又は前臨床試験若しくは毒性試験においても有用であり得る。
これまでに言及した通り、モジュレータ又はこれらの断片又は誘導体は、細胞毒又は細胞傷害性薬物(例えば細胞分裂阻害剤又は細胞破壊剤)、治療薬、あるいは放射活性金属イオン(例えば、α又はβ−放射体などの治療用部分)と複合、結合又は融合させるか、ないしは別の方法で会合させることもできる。本明細書で使用するとき、細胞毒又は細胞毒性剤には、任意の剤又は治療用部分、すなわち細胞にとって有害であり、細胞の増殖又は生存を阻害し得る部分が包含される。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラチン(dihydroxy anthracin)、DM−1及びDM−4(Immunogen Inc.)などのマイタンシノイド、ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、及びシクロホスファミド及び誘導体、あるいはこれらの相同体が挙げられる。その他の細胞毒としては、アウリスタチン、例えば、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)及びモノメチルアウリスタチンF(MMAF)(Seattle Genetics,Inc.)、アマニチン、例えば、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン又はε−アマニチン(Heidelberg Pharma AG)、DNA副溝結合剤、例えば、デュオカルマイシン誘導体(Syntarga,B.V.)及び修飾ピロロベンゾジアゼピン二量体(PBDs,Spirogen,Ltd)などが挙げられる。更に、一実施例では、本発明のCD46モジュレータを抗CD3結合分子と会合させて、細胞毒性T細胞を補充させ、それらにがん起始細胞を標的とさせることもできる(BiTE technology;例えば、引用により本明細書に組み込まれるFuhrmann,S.et.al.Annual Meeting of AACR Abstract No.5625(2010)を参照されたい)。
記載の通り、本発明は、異常増殖性疾患の検出又は診断、並びにがん起始細胞の識別を目的とした、患者由来の細胞のスクリーニング法を提供する。このような手法には、治療に際し、がん患者を識別する工程、又はがんの進行を監視する工程が包含され、これらの工程には、患者から得た試料を、本明細書に記載されるようなCD46モジュレータと接触させ、試料中のCD46と結合した又は未結合のモジュレータの存在又は非存在を検出すること、あるいは、モジュレータがCD46と会合している程度について検出することが含まれる。モジュレータが、抗体又はそれらの免疫学的に活性な断片を含むものである場合、このモジュレータは試料中のCD46と会合し、その試料が腫瘍永続化細胞(例えば、がん幹細胞)を含有している可能性と、そのがん患者が本明細書に記載される通りのCD46モジュレータにより効果的に治療され得ることを示す。この手法は、更に、結合強度を対照と比較する工程を含んでもよい。反対に、選択したモジュレータがFc−CD46である場合、このモジュレータを試料と接触させて、本明細書に記載される通りの、分子の酵素特性を(直接的に又は間接的に)監視し、所望の情報を得ることができる。本明細書における教示に準拠する他の診断法は当該技術分野において周知であり、市販品(例えば、専用の検出系など)を用い、実施することができる。
a.処方及び投与経路
任意の所望の複合物形態を取るモジュレータの形態、意図する送達形態、治療又は監視する疾患、及び数多くの他の可変要素に応じ、本発明の組成物は、当業界で認知されている手法を用い所望の通りに配合することができる。すなわち、CD46モジュレータを含む本発明の組成物の、各種実施形態は、製薬上許容可能な多様な担体と共に処方される(例えば、Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons:Drugfacts Plus,20th ed.(2003)、Ansel et al.,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,7th ed.,Lippencott Williams and Wilkins(2004)、Kibbe et al.,Handbook of Pharmaceutical Excipients,3rd ed.,Pharmaceutical Press(2000)を参照されたい)。賦形剤、アジュバント、及び希釈剤などの各種製薬上許容可能な担体は、数多くの市販元から容易に利用できる。更に、pH調整剤及び緩衝剤、浸透圧調節剤、安定剤、及び湿潤剤などの、製薬上許容可能な種別の補助剤も利用することができる。特定の非限定例的な担体としては、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの混合物が挙げられる。
同様にして、特定の投与レジメン、すなわち、投与量、時期、及び反復頻度は、具体的な患者及び患者の治療歴によって異なる。半減期などの経験的考察は、一般的に、投与量の決定に寄与する。投与頻度は、治療過程にわたって決定し、調節することができ、がん起始細胞などの異常増殖性細胞又は腫瘍性細胞数の抑制、このような腫瘍性細胞の抑制維持、腫瘍性細胞の増殖抑制、又は転移がんの発達の遅延などに基づく。あるいは、対象とする治療用組成物が徐放性製剤であることが適切な場合もある。これまでに示唆した通り、徐放性を得るための各種処方及びデバイスが当該技術分野において既知である。
本発明により想到される併用療法は、望ましくない腫瘍細胞の増殖の抑制又は阻害(例えば、内皮細胞)、がん発生の抑制、がんの再発の抑制又は予防、あるいはがんの広がり又は転移の抑制又は予防に特に有用であり得る。このような場合、本発明の化合物は、腫瘍塊(例えば、NTG細胞)を支え、永続化させるTPCを除去し、感作剤又は化学的感作剤として機能し得るため、現行の標準的な腫瘍減量剤(care debulking)又は抗がん剤をより効果的に使用できるようになる。すなわち、CD46モジュレータ及び1種以上の抗がん剤を含む併用療法を使用することで、既にある程度成長しているがんを減少させることもでき、例えば、存在しているがん細胞数を減少させること、及び/又は腫瘍量を減少させること、あるいは少なくとも1つの症状又はがん副作用を寛解させることができる。このような場合、併用療法とは、CD46モジュレータ及び1種以上の抗がん剤の投与を指し、抗がん剤の例としては、限定するものではないが、細胞毒性剤、細胞増殖阻害剤、化学療法剤、分子標的薬、生体応答修飾物質、免疫療法剤、がんワクチン、抗血管新生薬、サイトカイン、ホルモン療法剤、放射線療法剤及び抗転移剤が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「抗がん剤」は、がんなどの細胞増殖障害を治療するために使用できる、細胞毒性剤、細胞増殖阻害剤、抗血管新生薬、腫瘍減量剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線治療薬、標識化抗がん剤、生体応答修飾物質、抗体、及び免疫療法剤などの任意の剤を意味する。当然のことながら、これまでに示した通りに選択した実施形態では、抗がん剤には複合体を含んでよく、及び投与前にモジュレータと会合させてもよい。
本発明は、CD46モジュレータと放射線療法(すなわち、ガンマ線照射、X線照射、UV−照射、マイクロ波照射、及び電子線照射などの、局所的に腫瘍細胞内でDNAの損傷を引き起こす任意の機序)の併用法も提供する。放射性同位体を腫瘍細胞に標的特異的に送達することによる併用療法も企図され、かつ分子標的薬又は他の標的手法と併用することができる。典型的には、放射線治療は、約1週間〜約2週間にわたって行う。放射線治療は、頭部及び頸部がんに罹患している対象者に対し約6〜7週にわたって行うことができる。所望により、放射線治療は、1回又は順次複数回行うことができる。
本発明のCD46モジュレータは、単独で投与した場合にも、あるいは抗がん剤若しくは放射線療法と併用した場合にも、患者又は対象者において、良性又は悪性腫瘍(例えば、腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺、甲状腺、肝細胞がん、肉腫、神経膠芽腫、及び各種頭部及び頸部腫瘍)、白血病及びリンパ性腫瘍、神経細胞、膠細胞、星状細胞、視床下部の及び他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性及び胞胚腔性疾患などの他の疾患、並びに炎症性、血管原生、免疫性疾患及び病原菌により発症する疾患を包含し得る腫瘍性状態を治療するのに特に有用である。本発明の治療用組成物及び方法を用いる治療に際し、特に好ましい標的は、固体腫瘍を含む腫瘍性状態である。他の好ましい実施例では、本発明のモジュレータは、血液系腫瘍の診断、予防又は治療に使用できる。好ましくは治療を行う患者又は対象者はヒトであるものの、本明細書で使用するとき、この用語は任意の哺乳動物種を明白に包含する。
用量1回分以上のCD46モジュレータを含む1つ以上の容器からなる医薬梱包体及びキットも提供する。特定の実施形態では、単位用量を提供し、この場合の単位用量は、例えば、抗CD46抗体に加え1種以上の追加の剤を含む、あるいは追加の剤は含まない組成物を、規定量で含有するものである。他の実施形態では、このような単位用量は、注射用に1回用量を事前充填したシリンジとして供給する。更に他の実施形態では、単位用量で収容させる組成物には、生理食塩水、ショ糖あるいは同様物、緩衝剤(リン酸塩など)を含有させ、及び/又は安定でかつ有効なpH範囲内で処方する。あるいは、特定の実施形態では、組成物は、適切な液体、例えば、滅菌水に溶解させ得る凍結乾燥粉末剤として提供できる。特定の好ましい実施形態では、組成物は、タンパク質の凝集を阻害する1種以上の物質(限定するものではないが、ショ糖及びアルギニンなど)を含む。容器に対し任意のラベル付け、あるいは関係付け(1つ以上)を行うことで、その容器が収容している組成物が、選択肢に含まれる疾患症状を診断又は治療する際に使用されるものであることを示す。
本発明の他の好ましい実施形態は、蛍光標示式細胞分取(FACS)、磁気活性化細胞選別法(MACS)又はレーザー介在型分画法などの方法において、がん起始細胞集団又は下位集団を識別、単離、分画又は濃縮するのに有用な手段として、本開示のモジュレータの特性を引き出すものでもある。当業者であれば、本モジュレータは、がん幹細胞などのTICの特徴付け及び操作に適合性のあるいくつかの技術にも使用できることを理解するであろう(例えば、米国特許出願第12/686,359号、同第12/669,136号、及び同第12/757,649号を参照されたい。これらの各々は引用によりその全体が本発明に組み込まれる)。
本明細書において、別途記載のない限り、本明細書に関連して使用される科学用語及び専門用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更には、文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数を包含し、複数形の用語は単数を包含するものとする。より詳細には、本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「a」、「an」及び「the」は、その文脈において別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「タンパク質(a protein)」を参照する場合には複数のタンパク質が包含され、及び同様に、「細胞(a cell)」を参照する場合には細胞混合物が包含される。これに加え、本明細書及び添付の特許請求の範囲に提供される範囲には、範囲を形成する両側の端点と、その点に挟まれるすべての点とが包含される。したがって、範囲2.0〜3.0には、2.0及び3.0と、2.0及び3.0に挟まれるすべての点とが包含される。
がん起始細胞集団におけるCD46発現
がん患者において存在する固体腫瘍の細胞不均一性を特徴づけ、特定の表現型マーカーを用い腫瘍永続化細胞(TPC;すなわち、がん幹細胞:CSC)のアイデンティティを解明し、臨床的に関連性のある治療対象を同定するために、巨大な非従来的な異種移植片(NTX)腫瘍バンクを作製し、当業界で認知されている技術を用い維持した。様々な固体悪性腫瘍に罹患している数多くのがん患者を基に得た、不均一な腫瘍細胞を複数回継代させて、多数の別個の腫瘍細胞株からなるNTX腫瘍バンクを免疫不全マウスで増殖させた。多数の、良好に定義されている別個のNTX腫瘍細胞初期継代株が持続的に利用可能であると、細胞を細胞株から再現性よくかつ繰り返し精製できることから、TPCの同定及び単離が非常に促進される。より詳細には、マウスにおいて、表現型及び形態が不均一のものである腫瘍を生成する能力を基に、単離又は精製TPCを後ろ向きに非常に正確に定義する。この定義により、単離又は精製TPCが由来している患者の腫瘍試料が再現されることになる。したがって、単離した細胞小集団が、マウスにおいて完全に不均一の腫瘍を生成したならば、単離した細胞集団にはTPCが含まれていることが強く示唆される。この試験において、NTX細胞株の継代数を最小限に抑えることで、in vivo実験が非常に単純化され、容易に検証しやすい結果が得られる。更に、初期継代NTX腫瘍は、イリノテカン(すなわち、Camptosar(登録商標))などの治療薬にも応答するため、腫瘍の成長、現行の治療法に対する耐性、並びに再発を駆り立てる機序についての、臨床的に意義のある洞察が得られる。
FACSによるがん起始細胞集団の濃縮例及び移植例
対象とする特定のタンパク質を不均一に発現する腫瘍に含まれる細胞を、対象とする特定のタンパク質の高発現又は非/低発現に基づき単離し、次に免疫不全マウスに移植した。驚くべきことに、専用のPhenoPrintアレイにより、不均一に発現したものとして同定したそれぞれのマーカーのうち、ほとんどのものが、がん起始細胞の濃縮に有用性を示さなかったことが観察された。細胞表面のCD46発現が高い又は低い結腸直腸及び膵臓腫瘍細胞が、免疫不全マウスにおいて強い腫瘍原生活性をもつか否かを評価するために、異なるそれぞれの細胞集団を、当業者に周知の手法である細胞分散及びFACS法を用いTNX腫瘍から単離し、細胞をマウス1匹あたりに1,000〜3個移植した。腫瘍の大きさが800〜2,000mm3に達したなら、表現型を特性評価して、生成された腫瘍が移植細胞を単離した親腫瘍を表現しているか否かを判定するために、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、酵素消化により単個細胞懸濁液へと分散させた。
CD46hiがん起始細胞下位集団は、NTXモデルにおいて連続継代することで腫瘍永続化能を示す。
イリノテカン処理によるCD46hi腫瘍永続化細胞の発生頻度の上昇
がん幹細胞のパラダイムにおいて中心的な協議では、CSC(すなわち、TPC)は、イリノテカンなどの化学療法剤に対し比較的耐性である。CD46hi TPCが化学療法に耐性であるか否かを評価するため、マウスにSCRx−CR4及びCR14結腸直腸腫瘍を起始させた。腫瘍容量の中央値が約300mm3に達したならば、マウスは無作為化し、20日間にわたって、15mg/kgイリノテカン又は対照(PBS)の何れかにより週に2回処置し、20日経過時点でマウスを安楽死させた(図4A)。腫瘍を採取したところ、賦形剤処理したマウスが約700mm3の腫瘍を有していた一方で、イリノテカンで処理したマウスでは、腫瘍は対照マウスのおよそ半分の大きさであった(約388mm3)。各処理群の腫瘍内TPC発生頻度を、上記に定義した表現型ESA+ CD46hi CD324+ CD66c−を用い定義したところ、腫瘍内TPCは、対照群のマウスと比較してイリノテカン処理群のマウスで2.5倍豊富に含まれていた(n=7;P<0.0001;図4B)。イリノテカン処理群では、それぞれ対照処理マウスと比較した場合に、小腫瘍においても明らかに豊富にTPCが存在していたため、TPC発生頻度の高さは腫瘍の大きさにより偏るものではなかった(図4C)。
SOLiDによるすべてのトランスクリプトームの配列決定により、腫瘍永続化細胞集団中に存在するCD46スプライス変異体を明らかにする
いくつかの結腸直腸がん(SCRx−CR2、CR4、CR11及びCR14)及び膵臓(SCRx−PA3及びPA6)がんNTX細胞株を生成し、実施例1に記載の通りに継代し、免疫不全マウスに用い腫瘍を起始させた。これらのNTX株から生じた腫瘍を摘出し、摘出したばかりのNTX腫瘍から、各TPC、TProg及びNTG細胞を、実施例1に示した通りにFACSを用い単離した。より具体的には、細胞集団は、CD46、CD324及びCD66cマーカーを用い、蛍光標識細胞分取(FACS)により単離し、直ちにペレット化させ、Qiagen RLTPlus RNA溶解緩衝液(Qiagen Inc.)に溶解させた。この溶解液は、使用するまでの間−80℃で保管した。解凍し、販売元の指示書に従ってQiagen RNEasy単離キット(Qiagen社)を用い全RNAを抽出し、次に、販売元のプロトコル及び推奨される装置設定に従い、Nanodrop(Thermo Scientific)及びBioanalyzer 2100(Agilent)を用い定量化した。得られた全RNA調製物は、遺伝子の配列決定及び解析に好適なものであった。
RT−PCRによる、がん起始細胞濃縮細胞集団で発現しているCD46スプライス変異体の同定
SOLiD全トランスクリプトーム配列決定により観察されたCD46のスプライス型が、NTX腫瘍からFACSにより単離したそれぞれの細胞集団において発現しているCD46型と実際に同一であるか評価するために、可溶化液を、1% β−メルカプトエタノールを含有しているRLT−Plus緩衝液(製造元により供給)中で−70℃にて保存した後、RNeasy Plusマイクロキット(Qiagen,Inc.)を用い全RNAを単離した。具体的には、解凍した可溶化液を、QIAshredderスピンカラム(Qiagen)を用い懸濁し、gDNA Eliminatorカラムを用いゲノムDNAを除去した後に、RNeasy MiniEluteスピンカラムに加え、全RNAを捕捉した。洗浄後、RNaseを不含有の水を用い全RNAを溶出した。単離した全RNAを、RNA 6000 Picoキットを用い、NanoDrop 1000分光光度計又はAgilent 2100バイオアナライザのいずれかを使用して、製造元のプロトコルに従い定量した。次に、Quanta qScript cDNA SuperMixを用い、20ngの全RNAを逆転写し、AmpliTaqGold DNAポリメラーゼと、図5Aに掲載のe6順方向及びe14逆方向プライマーを用い、PCRにより増幅させた(アニーリング温度54℃及び伸長温度72℃で1分を40サイクル)。観察された変異体間で保存されていたエキソン、すなわちエキソン6及び14を利用し、Integrated DNA TechnologiesのPrimerQuest及びOligoAnalyzer3.0プログラムを用い、プライマー(配列番号1及び配列番号2)を設計した。100bpラダーのDNA分子量マーカーを用い、2% E−Gelで増幅産物を解析した。増幅後、QIAGEN QIAquick PCR精製キットを用いPCR産物を精製し、pCR4−TOPOベクターにクローン化した。次にTOP10細胞(配列決定用TOPO TA クローニングキット、Invitrogen)を用いベクターを形質転換し、コロニーを挿入断片の存在の有無についてPCRにより選別した。正しい挿入断片を含有しているプラスミドを、EZNAプラスミドミニプレップキットI(Omega Bio−Tek)を用い単離し、T3及びT4配列決定プライマーを用い配列決定した。
腫瘍及び濃縮細胞集団におけるCD46スプライス変異体の発現を決定するために設計したスプライス変異体特異的なプライマー/プローブを用いるqRT−PCR
所定の細胞集団及び/又は全組織標本において、CD46スプライス変異体の発現レベルをより迅速に確認するために、具体的には、エキソン6〜12の利用について確認するために、ABI 7900HTリアルタイム定量的PCR装置に適するよう特注でqRT−PCRプライマー及びFAMプローブを設計した(図6)。各FAMプローブは、それぞれ、特定のスプライス変異体に特有の、特定のCD46エキソン−エキソンジャンクションを検出するよう設計し、標準的なTaqman(登録商標)qRT−PCRプロトコルを用い、少なくとも各サンプルを2本ずつ用意し、384ウェルプレートでPCRを実施した。例えば、FAM標識プローブは、エキソン8〜9ジャンクションを含むよう設計し、エキソン6、8、9及び10を利用する転写物の使用率と区別した(CD46変異体C、D及びM)及び6、7、8、9及び10(CD46変異体A及びB)。同様にして、エキソン6〜9及び8〜10の使用を捕捉するよう各FAM標識プローブを設計したことで、転写物が、エキソン6、9及び10(CD46変異体E及びF)を利用しているのか、エキソン6、8及び10(CD46変異体I及びJ)を利用しているのかを迅速に区別しかつqRT−PCRで定量することもできた。
例示的な腫瘍試料におけるCD46タンパク質発現
これまでの実施例に記載される通り、TIC上のCD46の表面発現の増加を記録し、これらの細胞及び腫瘍において、CD46のコードに利用されているエキソンジャンクションを特徴付けした後で、同様の腫瘍試料においてCD46タンパク質が対応して増加することについての根拠を探索した。この観点から、逆相癌タンパク質ライセートアレイ(ProteoScan(商標)アレイ、OriGene Technologies)には、11の腫瘍型由来の432の組織ライセートの4種の希釈物、又はそれらの各々の隣接する正常な細胞組織と、外因性プロモーターによりTP53を過剰発現させていない、又は過剰発現させたHEK−293細胞からなる対照と共に用意した。このアレイで、抗ヒトCD46ウサギポリクローナル抗体(HPA、Sigma Aldrich)又は抗タンパク質コンストラクト(CD46のエキソン6、8、9及び10をコード)マウスモノクローナル抗体(以降実施例10のSC1.N29)のいずれかを用い、ライセート中のCD46タンパク質発現を検出した。比色検出試薬及びプロトコルは、ProteoScanアレイの製造元により得た。作製したアレイ上のスポットは、BZScan2 javaソフトウェア(http://tagc.univ−mrs.fr/ComputationalBiology/bzscan/)を用い、平台型スキャナによりデジタルイメージへと変換し、スポット強度を定量した。
可溶性CD46コンストラクトの作製及び発現
CD46モジュレータの生成及び特徴付けに使用するため、D、F及びJ型アイソフォームを用い、可溶性CD46コンストラクトを3種作製した。
CD46モジュレータの生成
本開示の技術に従って、CD46D−Hisを用い接種を行い、CD46モジュレータをマウス型抗体の形態で調製した。この調製に関し、マウス細胞株を3種用い、異常増殖性疾患の治療の際に、CD46の作用を阻害するために使用することのできる、高親和性のマウスモノクローナル抗体を生成した。具体的には、ヒト組み換えCD46により、Balb/c、CD−1、及びFVBマウスの細胞株を免疫化し、次のとおりにハイブリドーマの調製に使用した:
抗原
マウスを、実施例9のCD46−D−Hisの細胞外ドメインを含む組み換え融合タンパク質と、CD46タンパク質配列に由来しかつエキソン−エキソンジャンクションがエキソン6〜8及び6〜9に位置する2種類の合成ペプチドと、の両方により免疫化した。
エキソン6〜9ジャンクション PVPKSLKGPRPTYKPPVSNYPG(配列番号13)
免疫
雌Balb/c、CD−1及びFVBマウスの細胞株を用い、抗CD46マウスモノクローナル抗体を調製した。合成CD46ペプチド1及び2(各免疫につき、マウス1匹あたり50μg)を、組み換え型CD46D−His(マウス1匹あたり10μg)と組み合わせた混合物を、足底注射により10回投与し、マウスを免疫した。注射前に、免疫原混合物は等量のTITERMAX又はアラムアジュバントにより乳化した。
血清が陽性を示した免疫マウスを屠殺し、流入領域リンパ節を(拡張されているならば膝窩及び鼠径部)を取り外し、抗体産生細胞の供給源として使用した。電気融合法により、1:1比でB細胞の単個細胞懸濁液(6.35×107細胞)を、非分泌型P3x63Ag8.653骨髄腫細胞(ATCC #CRL−1580)と融合させた。ECM2001型fusion generator(Genetronic社)を用い、電気的細胞融合を実施した。HAT(Sigma #A9666)を添加し、15% Fetal Clone I serum (Hyclone)、1mMピルビン酸ナトリウム、4mM L−グルタミン、10μg/mLゲンタマイシン、50μM 2−メルカプトエタノール、100μMヒポキサンチン、0.4μMアミノプリテン、及び16μMチミジンを含有させたハイブリドーマ選別培地(DMEM(Cellgroカタログ番号15−017−CM))に、細胞を再懸濁し、次いで最終的なB細胞播種数が96ウェルプレートあたり2×106個になるように、200μL/ウェルを20枚の96ウェル平底組織培養プレートに播種した。次に、このプレートを、5% CO2及び95%大気に設定した、調湿した37℃インキュベータに7〜10日間入れた。
15枚の96ウェルプレートから得た培養上清をELISAによりスクリーニングした。より具体的には、遺伝子導入したHEK−293細胞由来の、精製組み換え型CD46D−His融合タンパク質の炭酸緩衝液溶液により、ELISAマイクロタイタープレートを100ng/ウェルでコーティングした。プレートを4℃で一晩インキュベートし、次に200μl/ウェルの3% BSA/PBS/Tween(0.05%)でブロッキングした。ハイブリドーマを培養したプレートから得た上清を各ウェルに加え、室温で1〜2時間インキュベートした。このプレートをPBS/Tweenで洗浄し、次に(than)抗ヤギマウスIgG(Fc断片特異的)を西洋ワサビペルオキシダーゼ(horseradish proxidase)(Jackson ImmunoResearch)で室温で1時間標識した。洗浄後、このプレートはTMB(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)基質(Thermo Scientific 34028)で発色させ、分光光度計によりOD 450で解析した。
フローサイトメトリーによるCD46モジュレータ評価
フローサイトメトリーアッセイ用に、50×106個のSW480細胞(ATCCカタログ番号CCL−228;ヒトCD46を天然に高発現することが既知)を、最終濃度が2.5×106細胞/mLになるように同数のチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO−S;ヒトCD46を発現しない)と混合した。15枚の96ウェルプレートの各ウェルで、実施例10に記載のとおりに得た異なるクローンから得られたCD46抗体を含有している細胞上清25μLに細胞混合物20μLを加えた。試料を穏やかにボルテックス処理し混合して、プレートを4℃にて30分間インキュベートした。次に細胞をPBSで1回洗浄し、次に4℃の暗所にてDyLight649抗マウスIgG(BioLegend Inc.)により30分間染色した。インキュベート後、細胞をPBSにより洗浄し、DAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール;死細胞を解析から除外するため)により対比染色した。陽性対照試料は、1:100希釈した市販のマウスモノクローナルCD46抗体(MEM−258;BioLegend)を用い調製し、陰性対照は抗マウスIgGのみで標識した。試料はフローサイトメトリーにより解析した。
CD46モジュレータの内部移行
抗CD46抗体を産生するハイブリドーマから上清を得、この上清を、細胞表面にCD46を発現するK562細胞に内部移行する能力についてスクリーニングした。初期濃度106/mlのK562細胞(単個細胞懸濁液)を、Human TruStain(BioLegend Inc.)により室温で10分間ブロッキングし、各条件につき5×104細胞に希釈した。2つずつ用意した試料を、次に最終容量50μLにて、氷上で、抗体を含有している細胞上清を用い、30分間染色した。細胞を次にFACS染色培地(FSM;2%ウシ胎児血清/ハンクス平衡塩類溶液/25mM HEPES[pH7.4])で洗浄し、未結合の抗体を除去した。この工程後、抗マウスロバ抗体Alexa647(Life Technologies)により氷上で30分第2染色した。試料を再度洗浄し、未結合の抗体を除去し、次いで内部移行培地に再懸濁した(2%ウシ胎仔血清/イスコフ改変ダルベッコ培地)。
標的部位としてのCD46モジュレータ
抗体に安定的に結合させた細胞毒性薬を標的化させることで、固体腫瘍に罹患している患者に対し優れた治療効果を有し得る抗体によるアプローチが示される。上記のCD46特異的抗体が生細胞への細胞毒性剤の送達を介在し得るか否かを評価するため、in vitroで細胞致死アッセイを実施した。このアッセイでは、リボソーム不活性化タンパク質のサポリン(Advanced Targeting Systems)と複合体形成させた抗マウス2次抗体をマウスFc領域を介しCD46抗体に結合させ、これらのサポリン複合体が細胞に内部移行しかつ細胞を殺傷する能力を、72時間後に細胞の生存能を評価することで評価した。
CD46モジュレータの配列決定
ここまでの例により、固定化したヒトCD46と明らかに高親和的に結合する、数多くの例示的な異なるモノクローナル抗体を選別した。図11A及び図11Bに表で示す通り、実施例10のmAbsをコードしているDNAの配列解析により、その多くが特有のVDJ再編成を有し、かつ新規相補性決定領域を示していたことが確認された。(注;相補性決定領域は、図11Bに示される)
配列決定を始めるにあたり、TRIZOL試薬をInvitrogen(Life Technologies)から購入した。ワンステップRT PCRキット及びQIAquick PCR精製キットはQiagen,Inc.から購入し、RNasinはPromegaから購入した。カスタムオリゴヌクレオチドはIntegrated DNA Technologiesから購入した。
CD46モジュレータのエピトープ決定
上記のように、CD46はI型膜糖タンパク質であり、細胞外ドメインであるアミノ末端ドメイン(すなわち、エキソン1〜6にコードされ、すべてのCD46転写物に共通)は4つのショートコンセンサスリピート(SCR)からなる。これらの各SCRは約60個のアミノ酸からなるシステインリッチドメインである。CD46の4つのSCRの後にはSTPドメインが続き、上掲Karosi et al.(引用によりその全体を本明細書に組み込む)に記載の通りに、このドメインにより3種のスプライス変異体、すなわちCD46D、CD46F及びCD46Jが定義される。pan−CD46抗体(すなわち、1種以上のSCRを結合する抗体)と抗CD46抗体アイソフォームとを区別するため、概して実施例9に示す通りにpSec−Tagベクターによりpan−CD46 ECD−Fcコンストラクトを生成した。このコンストラクトは4種のSCR(すなわち、エキソン1〜6)をコードするものであり、CD46 ECD変異体に関する上記の手法と同様の手法を用い、HEK−293T細胞においてCD46 ECD−Fcを発現させる際に使用した(データ不掲載)。各ハイブリドーマの上清を、pan−又はアイソフォーム特異的CD46 ECDタンパク質のそれぞれとの結合性について試験した。CD46抗原を、実施例9のCD46エキソン1〜6及びCD46D−His、CD46F−His及びCD46J−Hisから誘導し、His−タグ精製し、これによりELISAプレートをコーティングした。各モノクローナル抗体を、HRP標識した抗マウスヤギIgGにより検出した。Pan−CD46抗体を、CD46細胞外ドメインの最初の6つのエキソンを含み、エキソン7〜10は欠落しているCD46抗原と反応する能力をもとに識別した。160のうち155のmAbsが、外部ドメインを発現していたすべてのCD46組み換え体と結合し、pan抗体であることが判明した。5つのmAbはCD46の最初の6つのエキソン中のエピトープは認識しなかったものの、3種のスプライス変異体、すなわちCD46D、CD46F及びCD46Jを定義するSTPドメインは認識した。
CD46モジュレータ用モノクローナル抗体のヒト化処理
コンピュータを用いるCDRグラフト法(Abysis Database,UCL Business Plc.)並びに標準的な分子設計法によりマウス抗体SC1.N71及びSC1.N149をヒト化し、hSC1.N71及びhSC1.N149モジュレータを得た。マウスフレームワーク配列に対して最も相同性が高くなる配列、及びそのカノニカル構造に基づき、可変領域のヒトフレームワーク領域を選別した。各CDRドメインに割り当てられたアミノ酸を解析するにあたり、Kabat et alの付番に従う。最適なヒト化抗体を精製するために、いくつかのヒト化抗体変異体を作成した。いずれのヒト化抗体も、マウスハイブリドーマ由来の抗原結合相補性決定領域(CDR)をヒトフレームワーク領域と会合させて保持する。ヒト化SC1.N71mAbは、CD46抗原に結合する際の結合親和性が改善されていたのに対し、ヒト化SC1.N149 mAbは、マウス対応物の場合と同様の抗原結合親和性を保有している。
CD46モジュレータの結合特性評価
上記の通りに生成し選別したCD46モジュレータの結合特性を、各種手法により解析した。具体的には、概して標準的な手法を用い、上記実施例9に示した通りに、生成し及び発現させた3種のCD46相同体に対する親和性、動態学、ビニング、及び交差反応について数多くのCD46抗体を特性評価した。より詳細には、マカク(社内でタンパク質の配列決定を行い及び発現させた、データ不掲載)、マーモセット(Callithrix jacchus;GenBank受入番号:Q8HYX8.2)、及びリスザル(Saimiri sciureus;GenBank受入番号:AAB66819.1及びAAC39671.1を組み合わせて作成したコンストラクト、データ不掲載)のCD46相同体を発現させ、ForteBIOによる解析を行う前に精製した。ウェスタンブロットにより、還元又は非還元の抗原に対する抗体反応性も測定し、還元させた抗原に結合した数少ない抗体を試験した。これらの実験結果を図14に表として示す。
選別したCD46モジュレータのエピトープの決定
上記の通りに生成し選別したCD46モジュレータによりエピトープが認識されるか評価する目的で、複数種の異なるCD46 ECD変異体を構築し発現させた。より詳細には、各種CD46 SCRドメイン(引用によりその全体を本明細書に組み込むAdams et al.,Journ.Immunol.,Vol.147:3005,1991に記載の通りのもの)を増幅させ、かつこれらのドメインをアフィニティー精製(Qiagen,Ni−NTA)用のHis tagと融合させるプライマーを用い、CD46欠失変異体を設計した。次に、標準的な生化学法を用い、概して実施例9に示される通りに、それぞれ4種のSCRドメインのうちの1種を欠失している4種の別個のHis融合コンストラクトをクローン化し、発現させた。内毒素不含有のプラスミドDNA(Qiagen)を単離し、293Fectin(Life Technologies)を用い、接着性のHEK−293細胞遺伝子導入に使用した。遺伝子導入の72時間後に、遺伝子導入したHEK−293細胞により発現された欠失変異体を含む、培養上清を回収した。特定のSCRドメインを欠失させた各種CD46タンパク質に対する認識能について、数種の抗CD46モノクローナル抗体を試験した。より具体的には、本開示においてこれまでに他の節で記載した方法を用い、ELISAアッセイを実施し、これまでに選別した抗体モジュレータが、SCRドメイン1〜4をそれぞれ任意に組み合わせたCD46を認識するものであるか同定した。12種のこれらのモジュレータに関するデータは、図14中の表に見出し「ドメイン」の下、見出すことができる。表中のこの項には、由来する結合ドメインを明記してある。抗体SC1.N29はいずれのsushiドメインにも結合しなかったが、実施例15に示す通りのエキソン9には結合した。
モノクローナル抗体製CD46モジュレータの特徴付け
実施例17に示した手法を用い、ヒト化コンストラクトhSC1.N71及びhSC1.N149を解析して、結合特性を評価した。より具体的にはヒト化抗体の結合性能を、マウス親抗体と直接的に比較して、いずれの抗体に関しても、ヒト化加工により、速度定数にある程度微細な変化が生じたことが確認された。
CD46モジュレータは診断薬として使用され得る
本開示に記載の手法に従い、本開示のCD46モジュレータを診断薬として使用して、患者から得た生体試料に含まれるCD46関連性のバイオマーカーを検出することもできる。
CD46モジュレータは標的部位として機能する
抗体に安定的に結合させた細胞毒性薬を標的化させることで、固体腫瘍に罹患している患者に対し優れた治療効果を有し得る抗体によるアプローチが示される。上記のCD46特異的抗体が生細胞への細胞毒性剤の送達を介在し得るか否かを評価するため、in vitroで細胞致死アッセイを実施した。このアッセイでは、リボソーム不活性化タンパク質のサポリン(Advanced Targeting Systems)と複合体形成させたストレプトアビジンを、ビオチン化マウスCD46抗体モジュレータに結合させ、これらのサポリン複合体が細胞に内部移行しかつ細胞を殺傷する能力を、72時間後に細胞の生存能を評価することで評価した。具体的には、ウェルあたり10,000個のHEK−293T細胞を96ウェルプレートのウェルに蒔いた。翌日、上記の精製しビオチン標識した抗CD46抗体を100nMに希釈した。各抗体のアリコートを、それぞれモル比1:1でストレプトアビジン−ZAP(Advanced Targeting Systems)と混合し、次いで室温で30分インキュベートした。抗体−ストレプトアビジン−ZAP複合体を連続希釈し、このすべての希釈物をそれぞれ細胞に加えた。次に細胞/抗体−サポリン混合物を37℃/5%CO2で72時間インキュベートした。このインキュベート後、製造元のプロトコルに従いCellTiter−Glo(Promega Corp.)を用い、生存細胞数を計数した。抗体−ストレプトアビジン−ZAPを添加しなかった培養物を参照として用い、参照の発光強度を、「100%の細胞が生存」している場合の値として設定した。
CD46モジュレータは細胞表面上の受容体と相互作用する
細胞の殺傷が、CD46モジュレータと、細胞表面上に発現したCD46受容体との相互作用により介在されるものであることを実証するために、レンチウイルスを用い、宿主細胞に対し遺伝子導入して低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を安定的に送達し、宿主細胞のゲノムに組み込み、発現させ、CD46 mRNAの領域に特異的に結合させ、細胞内でmRNAを急速に分解させ、宿主細胞によるCD46発現を減少又は消失させた。
CD46モジュレータは受容体依存性の毒素の取り込みを介在する
何代にもわたってin vitroで増殖させた従来の細胞株は、患者から得た初代腫瘍細胞と比べてそのバイオロジーが非常に異なる。患者の腫瘍に似ているがん細胞を用い、CD46モジュレータが、受容体依存性の毒素の取り込みを介在し得るか評価するために、免疫不全マウスに対し、患者由来のがん細胞を非従来式に異種移植して、in vitro殺傷アッセイで試験した。
CD46モジュレータは化学療法に対する膵臓腫瘍の感受性を増感させる
本開示のモジュレータが、膵臓腫瘍の化学受容性を増感させ得るか評価するために、in vivoアッセイにおいて、抗CD46抗体を抗がん剤と組み合わせた。
CD46モジュレータはNTXマウスにおいてがん起始細胞減少し得る
少なくともCD46を発現している下位集団に関する、ヒト腫瘍断片又はヒト腫瘍細胞の単個細胞懸濁物を用い、マウス腎被膜下に異種移植を行い、又は異所性移植を行い、ヒト型の腫瘍を発生させた。次に、ヒト腫瘍の発生したマウスを無作為化し、次に、腫瘍体積が100〜500mm3に達したならば無作為化し、抗ヒトCD46抗体薬剤複合体(ADC)を用い、例えば、単独で、あるいはイリノテカン又はゲムシタビンなどの標準的な化学療法剤と組み合わせてのいずれかで、週に1回又は2回、最大で10mg/kgを投与して処理した。好ましくはADCは、細胞毒性剤又は毒素と複合体形成させた抗CD46抗体を含む。
Claims (17)
- a)CDR−H1について配列番号30として記載されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの残基31〜35、CDR−H2について配列番号30として記載されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの残基50〜65、およびCDR−H3について配列番号30として記載されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの残基95〜102として記載される3つの重鎖相補性決定領域を含み、そしてCDR−L1について配列番号33の残基24〜34、CDR−L2について配列番号33の残基50〜56、およびCDR−L3について配列番号33の残基89〜97として記載される3つの軽鎖相補性決定領域を含む抗体であって、該残基はKabatにしたがって番号付けされたものである、抗体;
b)CDR−H1について配列番号47の残基31〜35、CDR−H2について配列番号47の残基50〜65、およびCDR−H3について配列番号47の残基95〜102として記載される3つの重鎖相補性決定領域を含み、そしてCDR−L1について配列番号49の残基24〜34、CDR−L2について配列番号49の残基50〜56、およびCDR−L3について配列番号49の残基89〜97として記載される3つの軽鎖相補性決定領域を含む抗体であって、該残基はKabatにしたがって番号付けされたものである、抗体;
c)CDR−H1について配列番号199の残基31〜35、CDR−H2について配列番号199の残基50〜65、およびCDR−H3について配列番号199の残基95〜102として記載される3つの重鎖相補性決定領域を含み、そしてCDR−L1について配列番号201の残基24〜34、CDR−L2について配列番号201の残基50〜56、およびCDR−L3について配列番号201の残基89〜97として記載される3つの軽鎖相補性決定領域を含む抗体であって、該残基はKabatにしたがって番号付けされたものである、抗体;ならびに、
d)CDR−H1について配列番号203の残基31〜35、CDR−H2について配列番号203の残基50〜65、およびCDR−H3について配列番号203の残基95〜102として記載される3つの重鎖相補性決定領域を含み、そしてCDR−L1について配列番号205の残基24〜34、CDR−L2について配列番号205の残基50〜56、およびCDR−L3について配列番号205の残基89〜97として記載される3つの軽鎖相補性決定領域を含む抗体であって、該残基はKabatにしたがって番号付けされたものである、抗体;
からなる群から選択される、単離した抗CD46抗体又はそれらの抗原結合断片。 - 前記抗体又はそれらの抗原結合断片が、
a)配列番号30として記載されるポリヌクレオチドによりコードされる重鎖可変領域を含み、そして配列番号32として記載されるポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖可変領域を含む、抗体;及び
b)配列番号46として記載されるポリヌクレオチドによりコードされる重鎖可変領域を含み、そして配列番号48として記載されるポリヌクレオチドによりコードされる軽鎖可変領域を含む、抗体;
からなる群から選択される、請求項1に記載の単離した抗CD46抗体又はそれらの抗原結合断片。 - エキソン1〜6を含むヌクレオチド配列によりコードされる複数のCD46アイソフォーム間で保存されているドメインと反応するように選択された、請求項1又は2に記載の単離した抗CD46抗体又はそれらの抗原結合断片。
- モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDRグラフト化抗体、及びヒト化抗体からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単離した抗CD46抗体又はそれらの抗原結合断片。
- 配列番号199として記載される重鎖可変領域を含み、そして配列番号201として記載される軽鎖可変領域を含む、単離した抗CD46抗体又はそれらの抗原結合断片。
- 配列番号203として記載される重鎖可変領域を含み、そして配列番号205として記載される軽鎖可変領域を含む、単離した抗CD46抗体又はそれらの抗原結合断片。
- 細胞毒性剤と複合されたものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の単離した抗CD46抗体又はそれらの抗原結合断片。
- ポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ポリヌクレオチドは、請求項1に記載の単離した抗CD46抗体又はそれらの抗原結合断片の重鎖可変領域あるいは軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする、ベクター。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離した抗CD46抗体又はそれらの抗原結合断片を含む、製薬組成物。
- がん起始細胞の発生頻度を減少させる必要のある対象者において、がん起始細胞の発生頻度を減少させるための、請求項9に記載の製薬組成物。
- がん起始細胞の発生頻度の前記減少が、in vitro限界希釈法を用いて判定されるものである、請求項10に記載の製薬組成物。
- がん起始細胞の発生頻度の減少が、がん起始細胞に豊富に存在することが既知である腫瘍細胞表面マーカーの分析を用いて判定されるものである、請求項10に記載の製薬組成物。
- 前記対象者においてがんを治療するためのものである、請求項9〜12のいずれかに記載の製薬組成物。
- 前記がんが、膵臓がん、結腸直腸がん、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん及び乳がんからなる群より選択される、請求項13に記載の製薬組成物。
- がん起始細胞の発生頻度を減少させる必要のある対象者において、がん起始細胞の発生頻度を減少させるための医薬の製造のための、請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離した抗CD46抗体又はそれらの抗原結合断片の使用。
- 前記医薬が、前記対象者においてがんを治療するためのものである、請求項15に記載の使用。
- 前記がんが、膵臓がん、結腸直腸がん、副腎がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん及び乳がんからなる群より選択される、請求項16に記載の使用。
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