KR20180028519A

KR20180028519A - 항-TfR 항체 및 증식성 및 염증성 장애의 치료에서의 그의 용도

Info

Publication number: KR20180028519A
Application number: KR1020187004745A
Authority: KR
Inventors: 피에르 로네이; 코랄리 베란즈; 에르브 쏘쉐
Original assignee: 이나터리
Priority date: 2015-07-22
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2018-03-16
Also published as: LT3325509T; EP3325509A1; SI3325509T1; US20190092870A1; CN107849136A; HK1256088A1; EP3325509B1; AU2016296321B2; HUE053296T2; RU2018106364A; AU2016296321A1; ES2860988T3; JP6858185B2; CN107849136B; US11230605B2; CA2992509A1; RU2737637C2; IL257065B; BR112018000650A2; RS61586B1

Abstract

본 발명은 인간 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 및 암 및 염증성 장애를 치료하는데 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

항-TfR 항체 및 증식성 및 염증성 장애의 치료에서의 그의 용도

트랜스페린 수용체인 TfR에 특이적으로 결합하는 항체가 이하에서 개시된다. 이러한 항체는 특히 증식성 및 염증성 장애, 예컨대 림프종 또는 백혈병을 치료하는 데 유용하다. 본 개시내용은 보다 구체적으로 A24의 상응하는 모 뮤린 항체 또는 인간 IgG1 불변 영역을 갖는 그의 키메라 버전에 비해 동등하거나 개선된 특성을 갖는 특정한 인간화 항-TfR 항체에 관한 것이다.

트랜스페린 수용체 (CD71) (이하에서 "TfR"로 지칭됨)는 각각 대략 90 kDa의 2개의 760개-아미노산 단량체로 이루어진 디술피드-연결된 동종이량체 막횡단 당단백질이다. TfR은 철 섭취 및 세포 성장의 조절에서 중대한 역할을 한다 (Gill et al., N Engl J Med., 332,1744-1748, 1995 - Hermine et al., N Engl J Med., 332, 1749-1751, 1995). 이철 트랜스페린이 그의 세포 표면 수용체에 결합할 때, 그는 클리트린-피복 소공을 통해 산성 소포로 내재화되고 여기서 철-트랜스페린 복합체가 해리된다. 방출 후에, 수용체 및 아포-트랜스페린은 세포 표면으로 돌아가서 재순환한다.

TfR은 지속적으로 재생되는 조직, 예컨대 골수에서의 혈액 세포의 전구체, 간에서의 간세포, 표피에서의 각질세포 및 장 상피의 음와에서의 장세포의 세포 형질 막에서 구성적으로 발현된다.

여러 연구는 TfR이 악성 조직에서 그의 건강한 대응부에서보다 더 풍부하게 발현된다는 것을 밝혀냈다 (Gatter et al., J Clin Pathol., 36,539-545, 1983 - Faulk et al., Lancet., 2,390-392, 1980 - Shindelman et al., Int J Cancer, 27,329-334, 1981). 여러 저자는 악성 세포를 사멸시키기 위해 약물에 접합된 항-TfR 항체 또는 트랜스페린 자체를 사용하는 이 아이디어에 기초한 치료 접근법을 보고하였다.

또한 트랜스페린 및 TfR 사이의 상호작용을 차단하기 위해 항-TfR 항체를 사용하는 것이 제안된 바 있으며, 이는 결과적으로 철 섭취를 방지하여, 철 고갈 및 세포 성장의 음성 조절을 발생시켰다. 그러나, 많은 공개가 항-TfR 항체의 제조를 기재하지만, 항증식 활성을 갖는 항-TfR 모노클로날 항체 (mAb)에 대한 보고는 거의 없다.

트로브리지(Trowbridge) 및 로페즈(Lopez) (Proc. Natl Acad Sci USA, 79, 1175-1179, 1982)는 세포 주기의 S 기에서 세포를 차단함으로써, 트랜스페린의 그의 수용체에 대한 결합을 차단하고 인간 T 백혈병 세포주의 시험관내 성장을 억제할 수 있는, 42/6으로 지정되고 IgA (k)로 분류되는 모노클로날 항체의 특성을 보고한다. 42/6 항체 및 그를 생산하는 하이브리도마 (ATCC HB-8094)는 미국 특허 4,434,156에 개시되어 있다.

레슬리(Lesley) 등 (Mol Cell Biol. 5, 1814-21, 1985)은 트랜스페린의 결합 및 시험관내 뮤린 림프종 세포 성장에 대한, IgG 또는 IgM 부류에 속하는 항-뮤린 트랜스페린 수용체 모노클로날 항체의 효과를 연구하였다. 그들은 IgM 및 IgG가 TfR의 하향-조절 및 분해를 유도할 수 있음에도 불구하고, IgM은 세포 성장을 억제하였지만 IgG는 그러지 않았다는 것을 관찰하였다. 그러나, 항-이뮤노글로불린 항체에 의해 가교된 IgG는 세포 성장을 억제할 수 있었다. 후속 연구에서, 동일한 팀 (Lesley et al., Exp Cell Res., 182,215-33, 1989)은 뮤린 림프종 세포 성장 및 TfR 발현에 대한 IgG 및 IgM 모노클로날 항-TfR 항체 및 그의 1가 및 2가 단편의 효과를 연구하였다. 그들은 이들 효과가 항체 결합가의 결과인, 항체에 의한 트랜스페린 수용체의 가교의 정도에 따라 달라진다는 것을 보고한다. 1가 항체 단편은 유의한 효과를 가지지 않았고; 2가 항체 단편은 세포-표면 수용체 발현의 하향-조절을 그의 내재화 및 재순환을 손상시키지 않고 세포 성장을 손상시키지 않으면서 유도하였고; 다가 IgM은 세포 표면 상의 항체-복합체화된 수용체의 축적을 그의 내재화를 차단하고 세포 성장의 강한 억제를 일으키면서 유도하였다.

상기 인용된 선행 기술로부터 항-TfR 항체의 항증식 특성이 항체에 따라 강하게 달라지고 이는 트랜스페린의 그의 수용체에 대한 결합을 차단하거나 차단하지 않는 그의 능력에 기초하여 예측될 수 없는 것으로 보인다.

이전의 공개 (Moura et al., J Exp Med, 194, 417-425, 2001)에서, 본 발명자들은 인간 TfR에 결합하는, A24로 지정된 마우스 모노클로날 IgG (IgG2카파)를 보고하였다.

WO2005/111082는 T 세포 증식을 차단할 수 있는 뮤린 항체인 A24 항체를 개시하며, 이는 T 세포의 증식을 억제하는 데 있어 이전에 기재된 mAb 42/6보다 더 효율적인 것으로 보였다. A24는 Tf가 TfR에 결합하는 것을 경쟁적 방식으로 방지한다. A24는 또한 TfR 발현을 감소시키고 TfR 재순환을 손상시켰다. A24는 또한 ATL의 급성 및 만성 형태 둘 다로부터의 악성 T 세포의 생체외 증식을 차단할 수 있다 (Moura et al., Blood, 103,5, 1838-45,1 March 2004, Callens et al., 2010; J. Exp. Med., Vol 207 No 4, pp731-750). 이 항체는 또한 시험관내 및 생체내 둘 다에서 외투 세포 림프종 종양 발생을 방지할 수 있는 것으로 기재되었다 (Lepelletier et al. Cancer Res 2007; 67:1145-1154; Callens et al. 2008, Leukemia, 22, 42-48).

인간에게의 투여를 위해, 면역원성 반응을 회피하기 위해 뮤린 기원의 항체를 인간화하는 것이 오늘날 필수적이다. 그러나, A24 항체의 제1 인간화 방법을 수행할 때, 본 발명자들은 모든 인간화 변이체 중에서 결합의 손실 및 아폽토시스 특성을 발견하였다. 따라서 본 발명자들은 인간화의 여러 단계에서 A24의 특정한 변이체를 설계해야 했으며, 이는 A24 모 항체의 유지된 기능적 특성을 인간에 대한 예측된 감소된 면역원성과 조합하는 것이다.

따라서 본 개시내용은

(a) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 5의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;

(b) 서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 8의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;

(c) 서열식별번호: 11의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 13의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;

(d) 서열식별번호: 11의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 14의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;

(e) 서열식별번호: 11의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 15의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;

(f) 서열식별번호: 12의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 13의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;

(g) 서열식별번호: 12의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 14의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드; 또는

(h) 서열식별번호: 12의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 15의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드

를 포함하며, 서열식별번호: 16의 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는, 단리된 항-TfR 항체 또는 항-TfR 항체의 항원-결합 부분을 갖는 단백질에 관한 것이다.

구체적 실시양태에서, 상기 항체 또는 단백질은 트랜스페린 수용체에 10nM 이하의 K_D로, 바람직하게는 1nM 이하의 K_D로 결합한다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 항체 또는 단백질은 서열식별번호: 9의 VH 및 서열식별번호: 10의 VL을 갖는 모 뮤린 가변 영역을 갖는 상응하는 키메라 항체에서 측정된 유도 수준과 동등하거나 보다 우수한 수준으로 HL-60 세포주의 아폽토시스를 유도한다.

바람직하게는, 본 개시내용에 따른 이러한 항-TfR 항체는 인간화 항-TfR 항체이다.

이전의 실시양태와 조합될 수 있는 또 다른 구체적 실시양태에서, 상기 항-TfR 항체는 인간 IgG4 이소형 불변 영역, 또는 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 불변 영역을 포함하며, 여기서 상기 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 불변 영역은 야생형 IgG1 이소형 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교할 때 상기 항체에 대해 감소된 ADCC 활성을 부여하거나 또는 부여하지 않는다. 대안적으로, 상기 항-TfR 항체 또는 단백질은 인간 IgG1 이소형 불변 영역, 또는 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 불변 영역을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 불변 영역은 야생형 IgG1 이소형 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교할 때 상기 항체의 증가된 ADCC 활성을 부여한다.

본 발명에 따른 항체의 예는 하기, 특히 표 1에 기재된 바와 같은 인간화 항-TfR 항체 mAb1 내지 mAb16을 포함한다.

또한 의약으로서, 또는 진단에 사용하기 위한, 예를 들어, 종양의 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 단리된 항-TfR 항체 또는 단백질이 본원에 개시된다. 상기 종양은 바람직하게는 혈액 종양, 예를 들어 림프종 또는 백혈병이다.

대안적으로, 상기 단리된 항-TfR 항체 또는 단백질은 또한 HAM/TSP, 다발근염, 및 관절염을 포함한, HTLV-1 감염과 연관된 염증성 장애에서 바이러스 로드를 감소시키기 위해, HTLV-1 관련 질환의 치료에 사용될 수 있다.

본 개시내용은 추가로 상기 정의된 바와 같은 항-TfR 항체 또는 단백질을 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 제약 조성물은 추가적으로 다른 활성 성분을 포함할 수 있다.

구체적 실시양태에서, 상기 조성물은 상기 정의된 바와 같은 치료상 허용되는 양의 항-TfR 항체 또는 단백질을 포함하는, 동결건조물 제제, 또는 사전-충전된 시린지 또는 사전-충전된 바이알이다.

본 개시내용은 또한 상기 정의된 바와 같은 항체 또는 단백질의 적어도 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역(들)을 코딩하는 단리된 핵산; 이러한 핵산 중 하나 이상을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터, 또는 숙주 세포에서의 상기 정의된 바와 같은 항-TfR 항체의 재조합 생산을 위한 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다.

구체적 실시양태에서, 클로닝 또는 발현 벡터는 하기 실시예에 정의된 바와 같은 mAb1 내지 mAb16 중 어느 하나의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 하기 핵산 중 적어도 하나를 포함한다.

본 개시내용은 또한 상기 정의된 바와 같은 1종 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 개시내용은 추가로 상기 정의된 바와 같은 항-TfR 항체 또는 단백질을 생산하는 방법이며, (i) 본 개시내용의 숙주 세포를 숙주 세포에 의한 상기 항체 또는 단백질의 발현을 위해 배양하는 것; 임의로 (ii) 상기 항체 또는 단백질을 정제하는 것; 및 (iii) 상기 항체 또는 단백질을 회수하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 HL-60 아폽토시스 유도 검정에 따라 측정된 경우에 모 A24 가변 영역을 갖는 키메라 INA01 항체에 비한 INA01의 6종의 제1 인간화 변이체 (INA01 변이체 1-6)의 아폽토시스의 유도의 결여를 보여주는 그래프이다.
도 2는 HL-60 아폽토시스 유도 검정에 따라 측정된 경우에, 제2 라운드의 인간화 변이체 (INA01 변이체 7-11)의 아폽토시스 효과가 개선되었지만, 여전히 모 A24 가변 영역을 갖는 키메라 INA01 항체 아래인 것을 보여주는 그래프이다.
도 3은 HL-60 아폽토시스 유도 검정에 따라 측정된 경우에, 모 A24 가변 영역을 갖는 키메라 INA01 항체보다 우수한, 제3 라운드의 인간화 변이체 (INA01 변이체 12-17)의 아폽토시스의 효과적인 유도를 보여주는 그래프이다.
도 4 mAb1 내지 mAb16의 생산성 수율: 각각의 생산된 항체 mAb1 내지 mAb16의 양 (mg)은 2개의 생산 배치에 기초하여 제시된다.
도 5는 모 A24 VL을 포함한 본 개시내용에 따른 VL 서열의 정렬 (도 5a) 및 모 A24 VH를 포함한 본 개시내용에 따른 VH 서열의 정렬 (도 5b)을 보여준다.

정의

본 개시내용을 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.

용어 "면역 반응"은 병원체가 침입한 인간 신체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 그의 파괴 또는 그에서의 제거를 발생시키는, 예를 들어 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산되는 가용성 거대분자 (항체, 시토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.

"신호 전달 경로" 또는 "신호전달 활성"은 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로의 신호의 전송을 발생시키는 단백질-단백질 상호작용 예컨대 수용체에 대한 성장 인자의 결합에 의해 일반적으로 개시되는 생화학적 인과 관계를 지칭한다. 일반적으로, 전송은 신호 전달을 일으키는 일련의 반응에서 1종 이상의 단백질 상의 하나 이상의 티로신, 세린, 또는 트레오닌 잔기의 특이적 인산화를 포함한다. 끝에서 두번째 방법은 전형적으로 유전자 발현에서의 변화를 발생시키는 핵 사건을 포함한다.

달리 기재되지 않는 한, 용어 CD71 또는 트랜스페린 수용체 또는 TfR은 서열식별번호: 16에 규정된 바와 같은 인간 TfR을 지칭한다.

본원에 지칭된 용어 "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 그의 단일 쇄를 포함한다.

자연 발생 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 보다 더 보존되어 있는 영역 사이에 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 단순히 "항원 부분")은 항원 (예를 들어, TfR의 부분)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 전장 또는 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포괄되는 결합 단편의 예는 V_L, V_H, C_L 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)₂ 단편; V_H 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 V_L 및 V_H 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 힌지 영역에 변형된 IgG 중쇄, 예를 들어 IgG4를 갖는 단일 아암으로 이루어진 유니바디(Unibody), 도메인 항체 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), 또는 V_H 도메인으로 이루어진 나노바디 단편; 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 또는 이러한 항원-결합 부분을 포함하는 임의의 융합 단백질을 포함한다.

또한, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 쇄 단백질 (단일 쇄 Fv (scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426; 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)이 되도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.

본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, TfR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 TfR 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, TfR에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 TfR 분자에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류 (예를 들어, IgM, IgE, IgG 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다.

어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환가능하게 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, "항원에 특이적으로 결합하는", 예를 들어 "TfR에 특이적으로 결합하는" 항체 또는 단백질은 상기 항원 (예를 들어 서열식별번호: 16의 인간 TfR)에 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 K_D로 결합하는 항체 또는 단백질을 지칭하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 용어 "K_D"는 K_d 대 K_a의 비 (즉 K_d/K_a)로부터 수득되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되고, 몰 농도 (M)로 표현된다. 항체에 대한 K_D 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 K_D를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하거나 또는 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(Biacore)^® 시스템을 사용하는 것에 의한다. 비아코어^® 시스템으로 항-TfR 항체 K_D를 측정하는 검정은 하기 실시예에 기재된다.

본원에 사용된 용어 "K_assoc" 또는 "K_a"는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 것으로 의도되는 반면, 본원에 사용된 용어 "K_dis" 또는 "K_d"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서의 항체 및 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 수많은 부위에서 약한 비-공유 결합력을 통해 항원과 상호작용하고; 상호작용이 더 많을수록 친화도가 더 강하다.

본원에 사용된 용어 "결합력"은 항체-항원 복합체의 전체 안정성 또는 강도의 유익한 척도를 지칭한다. 이는 3가지 주요 인자: 항체 에피토프 친화도; 항원 및 항체 둘 다의 원자가; 및 상호작용하는 부분의 구조적 배열에 의해 제어된다. 궁극적으로 이들 인자는 항체의 특이성, 즉, 특정한 항체가 정확한 항원 에피토프에 결합할 가능성을 규정한다. 구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 상기 항-TfR 항체는 2가 항체이다.

본원에 사용된 용어 "HL-60 세포주"는 문헌 [Collins et al. (PNAS 1978, 75:2458-1462)]에 의해 유래되고 또한 문헌 [Gallagher et al. (Blood, 1979, 54:713-733)]에 기재된, 예를 들어 카탈로그 번호 CCL-240^TM 하에 ATCC® 콜렉션에서 입수가능한 전골수구를 지칭한다.

본원에 사용된 항체 A24는 WO2005/111082에 개시된 바와 같은 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "ADCC" 또는 "항체 의존성 세포성 세포독성" 활성은 세포 고갈 활성을 지칭한다. ADCC 활성은 상업적으로 입수가능한 ADCC 검정, 예를 들어, Ref# G7015 하에 프로메가(Promega)에 의해 상업화되고, 실시예에 간략하게 기재된 바와 같은 ADCC 리포터 생물검정(ADCC Reporter Bioassay)에 의해 측정될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "최적화된"은 뉴클레오티드 서열이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 것을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 코딩되는 아미노산 서열을 완전히 또는 가능한 많이 보유하도록 조작된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열은 또한 최적화된 것으로 지칭된다.

본원에 사용된, 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 및 각 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100). 2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 기재된 바와 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.

2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된 이. 메이어스(E. Meyers) 및 더블유. 밀러(W. Miller) (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 두 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로썸(Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 내로 혼입된, 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch) (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

2개의 뉴클레오티드 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한 디폴트로서 워드 길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=4, 및 두 가닥의 비교를 사용하여, 예를 들어 핵산 서열에 대한 알고리즘, 예컨대 BLASTN 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.

재조합 항체

본 개시내용의 항체는 하기 표 1에 기재된 바와 같은 그의 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열 및 인간 불변 이소형에 의해 단리되고 구조적으로 특징화된 인간화 재조합 항체 mAb1-mAb16을 포함한다:

표 1: mAb1-mAb16의 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열

mAb1 내지 mAb16을 생성하는 데 사용된 IgG4, IgG1 및 그의 돌연변이체 버전 IgG1 AA 및 IgG1 N297A의 불변 이소형 영역의 상응하는 아미노산 및 뉴클레오티드 코딩 서열은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

mAb1의 전장 경쇄 및 중쇄 및 상응하는 코딩 서열은 하기 표 2에 제시된다.

표 2: 전장 중쇄 및 경쇄 DNA 코딩 서열

본 개시내용에 따른 일부 항체의 VH CDR1 (HCDR1로도 불림), VH CDR2 (HCDR2로도 불림), VH CDR3 (HCDR3으로도 불림), VL CDR1 (LCDR1로도 불림), VL CDR2 (LCDR2로도 불림), VL CDR3 (LCDR3으로도 불림)의 아미노산 서열의 예는 표 3에 제시된다.

표 3에서, 본 개시내용의 일부 항체의 CDR 영역은 코티아(Chothia) 시스템 (Chothia C, Lesk AM. 1987, J Mol Biol 196, 901-917)을 사용하여 서술된다.

읽기 쉽도록, CDR 영역을 이하에서 각각 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3으로 부른다.

표 3: 코티아 정의에 따른 mAb1 내지 mAb16 및 참조 A24 항체의 CDR 영역

한 실시양태에서, 단리된 재조합 항체는 서열식별번호: 1의 HCDR1; 서열식별번호: 2의 HCDR2; 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열식별번호: 4의 LCDR1; 서열식별번호 5 또는 8의 LCDR2; 및 서열식별번호 6의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖고; 여기서 상기 항체는 서열식별번호: 16의 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합한다.

구체적 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 단리된 재조합 항체는

(a) 서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 5의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;

를 포함하며, 여기서 상기 항-TfR 항체는 서열식별번호: 16의 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합한다.

구체적 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 상기 재조합 항-TfR 항체는 하기 특성 중 1개 이상을 갖는다:

(i) 그는 예를 들어 하기 실시예에 기재된 바와 같이, SPR에 의해 측정된 경우에, 10nM 이하의 K_D, 바람직하게는 1nM 이하의 K_D로 트랜스페린 수용체에 결합한다;

(ii) 그는 하기 실시예에 기재된 바와 같이 ELISA 검정에서 측정된 경우에, 0.1 μg/ml 이하, 바람직하게는 0.05 μg/ml 이하의 EC50으로 트랜스페린 수용체에 결합한다;

(iii) 그는 예를 들어 HL-60 아폽토시스 유도 검정을 사용하여 측정된 경우에, 서열식별번호: 9의 VH 및 서열식별번호: 10의 VL을 갖는 모 뮤린 가변 영역을 갖는 상응하는 참조 키메라 항체로 측정된 유도 수준과 동등하거나 보다 우수한 수준으로 HL-60 세포주의 아폽토시스를 유도한다. 전형적으로, 10 μg/ml의 양의 본 개시내용의 재조합 항체는 서열식별번호: 9의 VH 및 서열식별번호: 10의 VL을 포함하는 A24의 모 뮤린 가변 영역을 갖는 동일한 양의 참조 키메라 항체에 비한 HL-60 세포주의 아폽토시스의 유도에 대해 검정될 수 있다. 시험된 항체의 HL-60 아폽토시스 유도 검정에서 아폽토시스의 유도는 시험된 항체로 측정된 양성 세포의 백분율이 참조 항체로 측정된 양성 세포의 백분율보다 유의하게 낮지 않으면, 참조 항체와 동등하다.

본원에 사용된 바와 같은, "상응하는" 참조 키메라 항체는 특정한 특성, 예를 들어 아폽토시스의 유도에 대해 시험될 항체의 이소형 불변 영역과 100% 동일한 이소형 불변 영역을 갖는 참조 항체를 지칭한다.

이전의 실시양태와 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 상기-정의된 항체의 항체 단편이다.

항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 유니바디, 및 scFv 단편, 디아바디, 단일 도메인 또는 나노바디 및 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) (VH-VL)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하도록 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성한다.

단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 모두 또는 부분 또는 경쇄 가변 도메인의 모두 또는 부분을 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).

항체 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 적어도 동일한 친화도 (또는 보다 우수한 친화도)를 가지면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 모 항체 A24의 인간화 항체이다.

일반적으로, 인간화 항체는 CDR (또는 그의 부분)이 비-인간 항체, 예를 들어 뮤린 A24 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 부분을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 내의 일부 FR 잔기는 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 개선시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, CDR 잔기가 유래된 A24 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다. 일부 구체적 실시양태에서, 인간화 항체 내의 일부 CDR 잔기는 또한 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 개선시키기 위해 치환된다.

인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어, 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 그라프팅 기재); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("재표면화" 기재); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링" 기재); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근법 기재)]에 추가로 기재되어 있다.

바람직하게는 본 개시내용에 따른 재조합 항체는 인간화 침묵 항체, 바람직하게는 인간화 침묵 IgG1 또는 IgG4 항체이다.

본원에 사용된 용어 "침묵" 항체는 ADCC 활성 검정에서 측정된 경우에 ADCC 활성이 없거나 보다 낮은 ADCC 활성을 나타내는 항체를 지칭한다.

한 실시양태에서, 용어 "ADCC 활성이 없거나 낮은 ADCC 활성"은 침묵 항체가 야생형 인간 IgG1 이소형을 갖는 상응하는 항체에서 관찰된 ADCC 활성의 적어도 10% 미만, 예를 들어 50% 미만인 ADCC 활성을 나타낸다는 것을 의미한다.

침묵 이펙터 기능은 항체의 Fc 불변 부분에서의 돌연변이에 의해 수득될 수 있고, 문헌 [Art: Strohl 2009 (AA & N297A); Baudino 2008, D265A (Baudino et al., J.Immunol. 181 (2008): 6664-69, Strohl, CO Biotechnology 20 (2009): 685-91)]에 기재되어 있다. 침묵 IgG1 항체의 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열에서의 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 소위 AA 돌연변이체를 포함한다. 또 다른 침묵 IgG1 항체는 비글리코실화 또는 비-글리코실화 항체를 생성하는 N297A 돌연변이를 포함한다.

돌연변이체 아미노산 서열을 갖는 항체는 코딩 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어, 변경된 코딩 항체를 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능 (즉, 상기 제시된 기능)에 대해 시험하는 것에 의해 수득될 수 있다.

보존적 변형을 갖는 항체

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 (또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는 결합 단백질)는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지며, 여기서 이들 CDR 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 mAb1 내지 mAb16 항체에 기초한 명시된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 갖고, 항체 또는 단백질은 본 개시내용의 항-TfR 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.

항-TfR 항체의 바람직한 기능적 특성은 비제한적으로 하기를 포함한다:

(i) 예를 들어 비아코어®를 사용하여, 예를 들어 SPR 검정에 의해 측정된 경우에, 10nM 이하의 K_D, 바람직하게는 1nM 이하의 K_D로 트랜스페린 수용체에 결합하는 것;

(ii) 그는 하기 실시예에 기재된 바와 같은 ELISA 검정에서 측정된 경우에, 0.1 μg/ml 이하, 바람직하게는 0.05 μg/ml 이하의 EC50으로 트랜스페린 수용체에 결합한다;

(iii) 그는 예를 들어 HL-60 아폽토시스 유도 검정을 사용하여 측정된 경우에, 서열식별번호: 9의 VH 및 서열식별번호: 10의 VL을 갖는 모 뮤린 가변 영역을 갖는 상응하는 참조 키메라 항체로 측정된 유도 수준과 동등하거나 보다 우수한 수준으로 HL-60 세포주의 아폽토시스를 유도한다. 전형적으로, 10μg/ml의 양의 본 개시내용의 재조합 항체는 서열식별번호: 9의 VH 및 서열식별번호: 10의 VL을 포함하는 A24의 모 뮤린 가변 영역을 갖는 동일한 양의 참조 키메라 항체에 비한 HL-60 세포주의 아폽토시스의 유도에 대해 검정될 수 있다. 시험된 항체의 HL-60 아폽토시스 유도 검정에서의 아폽토시스의 유도는 시험된 항체로 측정된 양성 세포의 백분율이 참조 항체로 측정된 양성 세포의 백분율보다 유의하게 낮지 않으면, 참조 항체와 동등하다.

본원에 사용된 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체한 아미노산 치환을 지칭하는 것으로 의도된다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 규정되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 항체의 CDR 영역 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능에 대해 시험될 수 있다.

변형은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 개시내용의 항체 내로 도입될 수 있다.

프레임워크 또는 Fc 조작

본 개시내용의 조작된 항체는, 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형을 가한 것을 포함한다. 전형적으로 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 항체가 유래된 배선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배열로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "복귀돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이"된 항체는 또한 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

또 다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포-에피토프를 제거하여 그에 의해 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키도록 프레임워크 영역 내, 또는 심지어 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 수반한다.

특히, 회사 안티토프(Antitope) (영국 캠브리지)는 치료 항체 및 단백질에서의 T 세포 에피토프의 위치를 확인하는 것에 기초한, 면역원성을 평가하고 제거하기 위한 다양한 특허 기술을 개발하였다. 이들 기술은 하기에 요약된다:

□ iTope™ - 인간 MHC 부류 II 대립유전자에 결합하는 펩티드의 예측을 위한 인 실리코 기술 (Perry et al. 2008 Drugs in R&D, 9(6):385-396).

□ TCED™ - 특히 항체 V 영역의 에피스크린(EpiScreen)™ T 세포 에피토프 맵핑 검정을 사용하는 연구에서 확인된 공지된 T 세포 에피토프의 데이터베이스 (Bryson et al. 2010 Biodrugs 24(1):1-8). 데이터베이스는 공통 모티프를 확인하기 위해 BLAST 검색에 의해 조사될 수 있다 (Altschul et al. 1997 Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402).

프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 더하여 또는 그에 대안적으로, 본 개시내용의 항체는, 전형적으로 항체의 1개 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내의 변형을 포함하도록 조작될 수 있다.

또한, 본 개시내용의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 다시 항체의 1종 이상의 기능적 특성을 변경하기 위해 그의 글리코실화를 변경하도록 변형될 수 있다. 이들 실시양태 각각은 하기에 추가로 상세하게 기재된다.

본원에 사용된 용어 "이소형 불변 영역" 또는 "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하여, 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 IgG 항체의 위치 C226 또는 P230으로부터 카르복실-말단까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 정의된다. Fc 영역에서 잔기의 넘버링은 카바트(Kabat)의 EU 인덱스의 것이다. Fc 영역의 C-말단 리신 (잔기 K447)은 예를 들어, 항체의 생산 또는 정제 동안 제거될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, 어떠한 K447 잔기도 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기를 갖는 항체와 갖지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.

하나의 구체적 실시양태에서, CH1의 힌지 영역이 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어, 증가되거나 또는 감소되도록 변형된다. 이 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가시키거나 또는 감소시키도록 변경된다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입된다. 이 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 하기 돌연변이: 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같은 T252L, T254S, T256F 중 하나 이상이 도입될 수 있다. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이, 항체는 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경시키기 위해 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다 Winter et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산은 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소된 또는 없어진 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 그에 의해 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경한다. 이 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이 접근법은 PCT 공개 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 더욱이, 인간 IgG1 상의 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 부위가 맵핑되었고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem 276:6591-6604] 참조).

다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 감소시키고/거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 감소시키도록 변형된다. 감소된 이펙터 기능, 및 특히 감소된 ADCC를 갖는 이러한 항체는 침묵 항체를 포함한다.

특정 실시양태에서, IgG1 이소형의 Fc 도메인이 사용된다. 일부 구체적 실시양태에서, 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하고/거나 Fcγ 수용체에 결합하는 융합 폴리펩티드의 능력을 감소시키거나 제거한 IgG1 Fc 단편의 돌연변이 변이체, 예를 들어 침묵 IgG1 Fc가 사용된다. IgG1 이소형 침묵 돌연변이체의 예는 문헌 [J. Virol 2001 Dec;75(24):12161-8 (Hezareh et al.)]에 기재된 바와 같이 아미노산 위치 234 및 235에서 류신이 알라닌에 의해 대체된 IgG1이다.

특정 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 위치 297에서 글리코실화를 방지하는 침묵 Fc 돌연변이체이다. 예를 들어, Fc 도메인은 위치 297에서 아스파라긴의 아미노산 치환을 함유한다. 이러한 아미노산 치환의 예는 글리신 또는 알라닌에 의한 N297의 대체이다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화는 변형된다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내의 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 유발하는 1개 이상의 아미노산 치환이 이루어져 그에 의해 그 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

추가적으로 또는 대안적으로, 글리코실화의 변경된 유형을 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 항체 또는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본 개시내용의 재조합 항체를 발현시켜 그에 의해 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하기 위한 숙주 세포로 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1 176 195 (Hang et al.)은 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이는 이러한 세포주에서 발현된 항체가 저푸코실화를 나타내도록 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 저푸코실화 패턴을 나타내는 세포주, 예를 들어 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자의 발현이 결핍된 포유동물 세포주에서의 재조합 발현에 의해 생산된다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소되어 또한 그 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화가 일어나는 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재한다 (또한 문헌 [Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342 (Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주에서 발현된 항체가 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성을 증가시키도록 조작된 세포주를 기재한다 (또한 문헌 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).

본 개시내용에서 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형은 PEG화 또는 HES화 또는 관련 기술이다. 항체는 예를 들어, 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화될 수 있다. 항체를 PEG화시키기 위해, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 전형적으로 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응한다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화될 항체는 비글리코실화된 항체이다. 단백질을 PEG화시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 개시내용의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.

본 개시내용에서 고려되는 항체의 또 다른 변형은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위한, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민에 대한 본 개시내용의 항체 또는 그의 단편의 적어도 항원-결합 영역의 접합 또는 단백질 융합이다. 이러한 접근법은 예를 들어 EP 0 322 094 (Ballance et al.)에 기재되어 있다.

또 다른 가능성은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위한, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 단백질에 대한 본 개시내용의 항체의 적어도 항원-결합 영역의 융합이다. 이러한 접근법은 예를 들어 EP 0 486 525 (Nygren et al.)에 기재되어 있다.

하나의 구체적 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체의 이펙터 기능 또는 보체 활성화 기능은 동일한 이소형의 야생형 항체에 비해 감소되거나 제거되었다. 한 측면에서, 이펙터 기능은 항체의 글리코실화의 감소, 항체 이소형의 자연적으로 감소된 또는 제거된 이펙터 기능을 갖는 이소형으로의 변형, 및 Fc 영역의 변형으로부터 선택되는 방법에 의해 감소되거나 제거된다. 구체적 관련 실시양태에서, 감소된 또는 제거된 이펙터 기능을 갖는 상기 이소형은 IgG4 이소형이다.

본 개시내용의 항체를 코딩하는 핵산 분자

또한 본 개시내용의 항-TfR 항체 또는 관련 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 본원에 개시된다. 가변 경쇄 뉴클레오티드 서열의 예는 mAb1 내지 mAb16 중 어느 하나의 가변 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 것이며, 후자의 서열은 표 1 및 표 2로부터 용이하게 유래되고, 유전자 코드를 사용하고, 임의로 숙주 세포 종에 따른 코돈 편향을 고려한다.

본 개시내용은 또한 포유동물 세포, 예를 들어, CHO 세포주에서의 단백질 발현을 위해 최적화된, 후자의 서열로부터 유래된 핵산 분자에 관한 것이다.

핵산은 전세포, 세포 용해물에 존재할 수 있거나, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태의 핵산일 수 있다. 핵산은 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 기술을 포함하는 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우에 "단리"되거나 "실질적으로 순수한" 상태이다. 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조한다. 본 개시내용의 핵산은 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 벡터 예컨대 파지 디스플레이 벡터, 또는 재조합 플라스미드 벡터에 존재할 수 있다.

본 개시내용의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편이 수득되면, 이들 DNA 단편은 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자로, Fab 단편 유전자로, 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위한 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작될 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편 (예를 들어 표 1에 규정된 VL 및 VH)은 또 다른 DNA 분자에, 또는 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 단편에 작동가능하게 연결된다. 이 문맥에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편이 기능적 방식으로, 예를 들어, 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 인-프레임으로 유지되도록, 또는 단백질이 바람직한 프로모터의 제어 하에 발현되도록 연결되는 것을 의미하는 것으로 의도된다.

VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 이소형, 예를 들어 인간 IgG1 이소형 중에서 선택된다. 다른 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgG4 이소형, 예를 들어 인간 IgG4 이소형 중에서 선택된다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대해, VH-코딩 DNA는 오직 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.

VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH 공개 번호 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.

scFv 유전자를 생성하기 위해, VH 및 VL 서열은 VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결된 인접 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있도록 VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4 -Ser)₃을 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결시킨다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554] 참조).

모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성

본 개시내용의 항체는 예를 들어, 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산될 수 있다 (예를 들어, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 또는 생화학 기술 (예를 들어, DNA 화학적 합성, PCR 증폭, 또는 관심 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝)에 의해 수득할 수 있고, DNA를 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이 문맥에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 제공하도록, 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션된 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 또는 보다 전형적으로는, 유전자 둘 다가 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, 이들을 목적하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하는 발현 벡터 내로 삽입하여 VH 절편이 벡터 내 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 절편이 벡터 내 CL 절편에 작동가능하게 연결되도록 함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 인 프레임으로 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 쇄 유전자에 더하여, 본원에 개시된 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어, 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열의 선택을 포함하여, 발현 벡터의 설계가 인자 예컨대 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현의 수준 등에 따라 달라질 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 대한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 또한 추가로, 조절 요소는 SV40 초기 프로모터 및 제1형 인간 T 세포 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복부로부터의 서열을 함유하는 SRa 프로모터 시스템과 같은, 다양한 공급원으로부터의 서열로 구성된다 (Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 Axel et al.) 참조). 예를 들어, 전형적으로 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여한다. 선택 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭으로 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위함)를 포함한다.

경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로의 외인성 DNA의 도입을 위해 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것은 이론적으로 가능하다. 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포, 효모 또는 사상 진균에서의 항체의 발현이 논의되며, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 가능성이 원핵 세포보다 더 높기 때문이다.

하나의 구체적 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 클로닝 또는 발현 벡터는 적합한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 mAb1 내지 mAb16 중 어느 하나의 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열 중 하나를 포함한다.

본 개시내용의 재조합 항체를 발현하기 위한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어, 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선택가능 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 포함), CHOK1 dhfr+ 세포주, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포, 예를 들어 GS Xceed™ 유전자 발현 시스템 (론자(Lonza))과 함께 GS CHO 세포주를 포함한다.

항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서의 항체의 발현 및, 임의로, 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 항체의 분비에 충분한 시간의 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 그의 분비 후에 표준 단백질 정제 방법 (예를 들어, 문헌 [Abhinav et al. 2007, Journal of Chromatography 848:28-37] 참조)을 사용하여 예를 들어 배양 배지로부터 회수되고 정제될 수 있다.

하나의 구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 적합한 프로모토 서열에 작동가능하게 연결된, 각각 mAb1-mAb16의 발현에 적합한 코딩 서열을 갖는 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포이다.

이어서 후자의 숙주 세포는 각각 mAb1-mAb16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 본 개시내용의 항체의 발현 및 생산에 적합한 조건 하에 추가로 배양될 수 있다.

면역접합체

또 다른 양상에서, 본 개시내용은 치료 모이어티, 예컨대 세포독소, 약물 (예를 들어, 면역억제제) 또는 방사성독소에 접합된 본원에 개시된 바와 같은 항-TfR 항체 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 이러한 접합체는 본원에서 "면역접합체"로 지칭된다. 1종 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에게 해로운 (예를 들어, 사멸시키는) 임의의 작용제를 포함한다. 예는 탁손, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브로민화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, t. 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 그의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 치료제는 또한, 예를 들어, 항대사물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 제거제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴, 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다.

세포독소는 관련 기술분야에서 이용가능한 링커 기술을 사용하여 본 개시내용의 항체에 접합시킬 수 있다. 세포독소를 항체에 접합시키는데 사용되는 링커 유형의 예는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 리소솜 구획 내의 낮은 pH에 의한 절단에 감수성이거나 또는 프로테아제, 예컨대 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제, 예컨대 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 감수성인 링커가 선택될 수 있다.

치료제를 항체에 접합시키는 세포독소, 링커 및 방법의 유형의 추가 논의를 위해, 또한 항체 약물 접합체에 대한 검토를 위한 문헌 [Panowksi S et al. 2014 Jan 1; 6(1): 34-45]를 참조한다.

본 개시내용의 항체는 또한 방사성 동위원소에 접합되어 방사성면역접합체로도 지칭되는 세포독성 방사성제약을 생성할 수 있다. 진단상 또는 치료상 사용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 예는 아이오딘¹³¹, 인듐¹¹¹, 이트륨⁹⁰, 및 루테튬¹⁷⁷을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 방사성면역접합체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있다.

이중특이적 또는 다중특이적 분자

또 다른 측면에서, 본 개시내용의 항-TfR 항체를 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자가 본원에 추가로 개시된다. 항체는 유도체화되거나 또는 또 다른 기능적 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 연결되어, 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 항체는 실제로 유도체화되거나 또는 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고; 이러한 다중특이적 분자는 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 의해 포괄되는 것으로 의도된다. 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체를 1종 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체와 기능적으로 연결시켜 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 연합 등에 의함) 이중특이적 분자가 생성되도록 할 수 있다.

따라서, 본 개시내용은 TfR에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이체, 예를 들어, mAb1-mAb16 중 어느 하나의 하나의 항원-결합 부분 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이체를 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한 TfR의 또 다른 에피토프이다.

추가적으로, 이중특이적 분자가 다중-특이적인 실시양태의 경우에, 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 더하여 제3 결합 특이체를 추가로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 유니바디 또는 단일 쇄 Fv를 포함하여, 적어도 1종의 항체 또는 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner et al.)에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있다.

본원에 개시된 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.

본 개시내용의 이중특이적 분자는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시킴으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각각의 결합-특이체를 개별적으로 생성하고 이어서 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교제가 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83, 및 Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다.

대안적으로, 결합 특이체 둘 다는 동일한 벡터에서 코딩되고 동일한 숙주 세포 내에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')₂ 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 개시내용의 이중특이적 분자는 1개의 단일 쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다.

이중특이적 분자의 그의 특이적 표적에 대한 결합은, 예를 들어, 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA), 방사선면역검정 (REA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어, 성장 억제 및 아폽토시스), 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 확인될 수 있다. 각각의 이들 검정은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용함으로써 특정한 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.

본 개시내용의 항체는 또한 인공 T 세포 수용체 (키메라 T 세포 수용체, 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)로도 알려짐)를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체의 가변 영역은 스페이서를 통해 TCR의 막횡단 도메인 및 신호전달 엔도도메인 (예를 들어 CD3 제타)에 연결된 scFv를 형성하는데 사용될 수 있고 T 세포의 표면에서 생성될 수 있다. 이러한 CAR은 예를 들어 증식성 장애를 치료하기 위한 입양 전달 요법에 사용될 수 있다.

제약 조성물

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 항체 중 1종 또는 그의 조합, 예를 들어, mAb1-mAb16으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 항체를 함유하며, 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 조성물, 예컨대, 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 (예를 들어, 2종 이상의 상이한) 항체 중 1종 또는 그의 조합, 또는 상기 기재된 바와 같은 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 포함할 수 있다.

본원에 개시된 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉, 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 1종의 항바이러스제, 항염증제 또는 또 다른 항증식제와 조합된 본 개시내용의 항-TfR 항체, 예를 들어 mAb1-mAb16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 항체를 포함할 수 있다. 조합 요법에 사용될 수 있는 치료제의 예는 하기 본 개시내용의 항체의 용도에 대한 섹션에서 매우 상세하게 기재된다.

본원에 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하여야 한다 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함). 한 실시양태에서, 담체는 피하 경로에 적합하여야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.

멸균 포스페이트-완충 염수는 제약상 허용되는 담체의 한 예이다. 다른 적합한 담체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)] 참조). 제제는 추가로 1종 이상의 부형제, 보존제, 가용화제, 완충제, 바이알 표면 상에서 단백질 손실을 막기 위한 알부민 등을 포함할 수 있다.

제약 조성물, 투여 경로, 투여량 및 요법의 형태는 환자의 치료될 상태, 질병의 중증도, 연령, 체중, 및 성별 등에 따라 자연스럽게 달라진다.

본 개시내용의 제약 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안내 투여 등을 위해 제제화될 수 있다.

바람직하게는, 제약 조성물은 주사될 수 있는 제제에 대해 제약상 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성의 멸균 염수 용액 (인산일나트륨 또는 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 상기 염의 혼합물), 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리학적 염수의 첨가 시에 주사가능한 용액의 구성을 허용하는 건조된, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다.

투여에 사용되는 용량은 다양한 파라미터의 함수, 특히 사용되는 투여 방식, 관련 병리상태, 또는 대안적으로 바람직한 치료 지속기간의 함수에 따라 조정될 수 있다.

제약 조성물을 제조하기 위해, 유효량의 항체는 제약상 허용되는 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산될 수 있다.

주사가능한 용도에 적합한 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제제; 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 또는 동결건조물을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균되어야 하고, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.

유리 염기 또는 약리학상 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 그의 혼합물 중에서 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 상용 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.

본 개시내용의 항체는 중성 또는 염 형태의 조성물로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 무기 산 예컨대 염산 또는 인산, 또는 유기 산 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등으로 형성되는 산 부가염 (단백질의 유리 아미노 기로 형성됨)을 포함한다. 유리 카르복실 기로 형성된 염은 또한, 무기 염기 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 또는 수산화제2철, 및 유기 염기 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다.

담체는 또한, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 조성물에서의 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 이루어질 수 있다.

멸균 주사가능한 용액은 필요량의 활성 화합물을 상기 열거된 다양한 다른 성분을 함유하는 적절한 용매에 혼입시킨 후, 필요에 따라 멸균 여과하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 플러스 그의 이전 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.

직접 주사를 위한 보다 더 또는 고도로 농축된 용액의 제조가 또한 고려되며, 여기서 용매로서의 DMSO의 사용은 매우 신속한 침투, 고농도 활성제의 작은 종양 영역으로의 전달을 초래하는 것으로 구상된다.

제제화 시에, 용액은 예컨대 치료 유효한 양으로 투여 제제와 상용성인 방식으로 투여될 것이다. 제제는 다양한 투여 형태, 예컨대 상기 기재된 주사가능한 용액의 유형으로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등이 또한 사용될 수 있다.

수용액 중의 비경구 투여의 경우에, 예를 들어 용액은 필요하다면 적합하게 완충되어야 하고, 먼저 액체 희석제는 충분한 염수 또는 글루코스와 등장성이 되도록 한다. 이들 특정한 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 하나의 투여량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고 1000 ml의 피하주입액에 첨가하거나 제시된 주입 부위에 주사할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 투여량에서의 일부 변경은 치료될 대상체의 상태에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어느 경우에서든 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.

본 개시내용의 항체는 투여당 약 0.0001 내지 1.0 mg, 또는 약 0.001 내지 0.1 mg, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 심지어 1.0 내지 약 10 mg이 포함되도록 치료 혼합물 내에 제제화될 수 있다. 다중 투여량이 또한 투여될 수 있다.

비경구 투여, 예컨대 정맥내 또는 근육내 주사를 위해 제제화된 화합물에 더하여, 다른 제약상 허용되는 형태는, 예를 들어 경구 투여를 위한 정제 또는 다른 고형제; 시간 방출형 캡슐; 및 최근 사용된 임의의 다른 형태를 포함한다.

특정 실시양태에서, 리포솜 및/또는 나노입자의 사용는 숙주 세포 내로의 항체의 도입을 위해 고려된다. 리포솜 및/또는 나노입자의 형성 및 사용은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

일반적으로 나노캡슐은 안정적이고 재현가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미립자 (약 0.1 μm 크기)는 일반적으로 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계된다. 이들 요구사항을 충족시키는 생체분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 본 개시내용에서의 사용을 위해 고려되고, 이러한 입자는 용이하게 제조될 수 있다.

리포솜은 수성 매질 중에 분산된 인지질로부터 형성되고, 다층 동심원 이중층 소포 (다층 소포 (MLV)로도 불림)를 자발적으로 형성한다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV의 초음파처리는 코어에 수용액을 함유하는, 직경이 200 내지 500 Å인 소형 단층 소포 (SUV)의 형성을 발생시킨다. 리포솜의 물리적 특성은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 따라 달라진다.

본 개시내용의 항체 또는 단백질의 용도 및 방법

본 개시내용의 항체 또는 단백질은 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 배양물 내의 세포에, 예를 들어 시험관내 또는 생체내 투여되거나 또는 대상체에, 예를 들어 생체내 투여되어 다양한 장애를 치료, 예방 또는 진단할 수 있다.

본 개시내용의 항체는 세포 증식을 억제할 뿐만 아니라, 고도의 증식성 세포, 예컨대 T 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있다.

약물로서의, 특히 세포 증식성 장애, 예컨대 높은 수준의 TfR을 발현하는 종양, 보다 구체적으로, 혈액 종양, 예컨대 림프종, 특히, ATL, MCL, 호지킨병, 대 B 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 급성 백혈병 (골수성 및 림프성)뿐만 아니라 고형 종양, 예컨대 신암종, 폐암 (소세포) 등의 치료, 예방 또는 진단에 사용하기 위한 본 개시내용의 항-TfR 항체 또는 단백질이 본원에서 고려된다.

HTLV-1 관련 장애의 치료, 예방 또는 진단에, 특히 HAM/TSP, 다발근염, 및 관절염을 포함한, HTLV-1 감염과 연관된 염증성 장애에서 바이러스 로드를 감소시키기 위해 사용하기 위한 본 개시내용의 항체가 추가로 개시된다.

본 개시내용은 또한 치료 유효 용량의 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 투여함으로써 인간 혈액 세포에서 트랜스페린 섭취를 감소시키거나 억제하는 방법에 관한 것이다.

상기 개시된 바와 같이 사용하기 위한 항체 또는 단백질은 예를 들어 상기 언급된 질환의 치료 또는 예방을 위해 단독 활성 성분으로서, 또는 다른 약물 예를 들어 항바이러스제, 항염증제 또는 세포독성제, 항증식제, 화학요법제 또는 항종양제와 함께, 예를 들어 그에 대한 아주반트로서 또는 그와 조합하여 투여될 수 있다.

예를 들어, 상기 개시된 바와 같이 사용하기 위한 항체는 AZT, IFN-알파, 항-CD20 mAb, 항-CD25 mAb, 화학요법제와 조합하여 사용될 수 있다.

적합한 항신생물제는 알킬화제 (예컨대 시클로포스파미드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 니트로스우레아, 테모졸로미드), 안트라시클린 (예컨대 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 발루비신), 탁산 (예컨대 파클리탁셀, 도세탁셀), 에포틸론, 토포이소머라제 I의 억제제 (예컨대 이리노테칸 또는 토포테칸), 토포이소머라제 II의 억제제 (예컨대 에토포시드, 테니포시드, 또는 타플루포시드), 뉴클레오티드 유사체 및 전구체 유사체 (예컨대 아자시티딘, 아자티오프린, 카페시타빈, 시타라빈, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 또는 티오구아닌), 펩티드 항생제 (예컨대 카르보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴), 레티노이드 (예컨대 트레티노인, 알리트레티노인, 벡사로텐), 빈카 알칼로이드 및 유도체 (예컨대 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈), 표적화 요법 예컨대 키나제 억제제 (예컨대 이브루티닙, 이델라리십, 에를로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 베무라페닙, 비스모데깁), 프로테아솜 억제제 (예컨대 보르테조밉, 카르필조밉), 히스톤 데아세틸라제 억제제 (예컨대 보리노스타트 또는 로미뎁신)를 비제한적으로 포함할 수 있다.

상기에 따라 본 개시내용은 추가 측면을 제공한다:

상기 정의된 바와 같은 방법은 치료 유효량의 본 개시내용의 항-TfR 항체 또는 단백질, 및 적어도 1종의 제2 약물 물질을 예를 들어 병용으로 또는 순차적으로 공-투여하는 것을 포함하며, 상기 제2 약물 물질은 예를 들어 상기 제시된 바와 같은 항바이러스제 또는 항증식제이다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 단백질은 TfR의 수준 또는 TfR을 함유하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있다. 이는 예를 들어, 샘플 (예컨대 시험관내 샘플) 및 대조군 샘플을 항체 및 TfR 사이의 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 항-TfR 항체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 항체 및 TfR 사이에 형성된 임의의 복합체는 샘플 및 대조군에서 검출되고 비교된다. 예를 들어, 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 검출 방법, 예컨대 ELISA 및 유동 세포측정 검정은 본 개시내용의 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.

따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 샘플 및 대조군 샘플을 TfR에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 항체 또는 단백질, 또는 그의 항원 결합 영역과, 항체 또는 그의 부분 및 TfR 사이의 복합체의 형성을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 내에서 TfR (예를 들어, 인간 TfR 항원)의 존재를 검출하거나 TfR의 양을 측정하는 방법을 추가로 제공한다. 이어서 복합체의 형성이 검출되고, 여기서 대조군 샘플에 비한 샘플 사이의 복합체 형성의 차이는 샘플 내 TfR의 존재를 나타낸다.

또한, 본원에 개시된 조성물 (예를 들어, 항체, 단백질, 인간화 항체, 접합 항체 및 다중특이적 분자) 및 사용에 대한 지침서로 이루어진 키트가 본 개시내용의 범주 내에 있다. 키트는 적어도 1종의 추가의 시약, 또는 1종 이상의 추가의 항체 또는 단백질 (예를 들어, 제1 항체와 별개로 표적 항원 상의 에피토프에 결합하는 보충 활성을 갖는 항체)을 추가로 함유할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트의 내용물의 의도되는 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나, 또는 달리 키트에 동반되는 임의의 문서 또는 기록물을 포함한다. 키트는 환자가 상기 규정된 바와 같은 항-TfR 항체 치료에 반응할 군에 속하는지 여부를 진단하기 위한 도구를 추가로 포함할 수 있다.

상세하게 기재된 본 발명은 이제 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 단지 예시적인 것이며 추가로 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

방법

1. ELISA에 의한 친화도 시험

항체의 특이성의 결정을 위해 ELISA 시험이 하기 프로토콜을 사용하여 적용될 수 있다. 재조합 인간 TfR (알앤디 시스템즈(R&D Systems), 카탈로그 번호 2474-TR로부터 입수함)을 96 웰 플레이트 상에 밤새 직접 코팅하고 2회 세척한 후 항체 (뮤린 및 인간화 mAb)를 여러 번 희석 (10회)하면서 (희석은 50 μg/ml 내지 0.001 ug/ml의 농도에서 시작할 수 있음) 인큐베이션하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 2회 세척 후에 2차 항체 염소-항 인간 IgG를 실온에서 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 2회 세척하고 10분 동안 TMB 용액과 함께 인큐베이션한 후 450 nm에서 흡광도를 판독한다.

2. 표면 플라즈몬 공명 (비아코어 시스템)을 사용한 친화도 결정

K_D 값의 결정을 위해, 표면 플라즈몬 공명 기술은 하기 기재된 바와 같은 비아코어™ 기술을 사용하여 적용될 수 있다:

히스티딘-태그부착된 인간 TfR (알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 2474-TR로부터 입수함)을 계대 후 공유 고정화된 펜타-His mAb CM5 센서 칩 상에 결합시켰다. 10종의 상이한 농도의 항체 (1 내지 500 nM)를 항-His/TfR-His 표면에 걸쳐 4분 동안 주사한 후 해리 복합체를 5분 동안 주사하였다. 회합 및 해리 프로파일 둘 다를 시간의 단일-지수 함수를 사용하는 비아이밸루에이션(BIAevaluation) 소프트웨어에서 구현되는 비선형 스퀘어 알고리즘으로 분석한다.

3. ADCC 검정

항체-의존성 세포-매개 세포독성은 항체-기반 약물을 사용하여 표적 암 세포를 사멸시키기 위한 바람직한 메카니즘이다. 항체는 세포 표면 상의 표적 항원에 결합한다. 또한 표적-결합된 항체의 Fc 이펙터 부분이 이펙터 세포의 세포 표면 상의 FcγRIIIa 수용체에 결합하는 경우 (우세하게 자연 킬러 세포), 2종의 세포 유형의 다중 가교가 발생하여 ADCC의 경로 활성화를 일으킨다. 표적 세포의 사멸은 이 경로 활성화의 종점이고, 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 자연 킬러 (NK) 세포 하위집단을 이펙터 세포로서 사용하는 전형적 ADCC 생물검정에서 사용된다. ADCC 리포터 생물검정 완성형 키트 (프로메가, G7015)는 항-CD20-기반 ADCC 리포터 생물검정을 수행하는데 필요한 모든 성분 및 시약을 함유한다. ADCC 리포터 생물검정은 ADCC 경로 활성화에서 보다 이른 지점에서 대안적 판독을 사용한다: 이펙터 세포에서 NFAT (활성화된 T-세포의 핵 인자) 경로를 통한 유전자 전사의 활성화. 또한, ADCC 리포터 생물검정은 FcγRIIIa 수용체를 안정하게 발현하는 조작된 Jurkat 세포 및 이펙터 세포로서의 반딧불이 루시페라제의 발현을 구동하는 NFAT 반응 요소를 사용한다. ADCC에서의 항체 생물학적 활성은 NFAT 경로 활성화의 결과로서 생산되는 루시페라제를 통해 정량화되고; 이펙터 세포에서의 루시페라제 활성은 발광 판독으로 정량화된다. 키트는 인간화 mAb와 비교하기 위한 양성 대조군으로서의 항-CD20 항체를 제공한다.

4. HL-60 및 PHA 활성화된 T 세포 아폽토시스 유도 검정

아폽토시스 검정을 위해, 세포를 24 웰 플레이트에서 400　μl의 웰당 100.10³개 세포의 농도로 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포를 뮤린 또는 인간화 항체에 대해 여러 번 희석하면서 (200　μg/ml로부터 3　μg/ml까지) 3 및 4일 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 후에, 세포를 원심분리하고 아넥신 V 및 트로포 3의 존재 하에 15분 동안 표지한 후 유동 세포측정법 분석을 수행한다.

5. 생산성 검정 (400ml)

생산성의 시험을 위해, VH 유전자를 합성하고 중쇄에 대한 발현 벡터 pXCIgG (ΔK)로 클로닝하였다. 경쇄를 이전에 pXC카파 벡터로 서브클로닝하였다. 16종의 항체를 400 ml (진탕 플라스크)의 부피의 CHOK1SV GS-KO 세포에서 일시적으로 발현하였다. 생산된 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 항체 농도를 모든 항체 변이체에 대해 예측된 흡광 계수 (1.49)를 사용하여 결정하였다. 변이체의 완전성을 환원 및 비-환원 조건 둘 다에서의 SDS-PAGE에 의해 결정하였다.

실시예 mAb1 내지 mAb16

표 1에 기재된 바와 같은 실시예 mAb1 내지 mAb16은 통상적인 항체 재조합 생산 및 정제 방법을 사용하여 생산될 수 있다.

예를 들어, 코딩 서열은 포유동물 생산 세포주에서의 재조합 발현을 위한 생산 벡터로 클로닝된다.

하기 표 4 및 5는 본 발명을 실시하기 위해, 특히 본 개시내용의 핵산, 발현 벡터 및 항체를 생산하기 위해 유용한 상세한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

표 4: 본 발명을 실시하기 위한 유용한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열의 간단한 설명

표 5: 본 발명을 실시하기 위한 유용한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열의 간단한 설명

결과

A24의 기능적 인간화 항체의 설계

인간화

인간화 절차를 하기 약술된 바와 같이 수행하였다:

1. 모 항체 도메인 및 영역을 확인하였다.

2. 모 항체 서열을 참조 서열의 세트를 따라 정렬하였다.

3. 모 단백질의 3D 구조적 모델을 구축하였다.

4. 수집된 데이터에 기초하여 각각의 위치를 치환할 가능성의 초기 평가를 수행하고 위치를 카테고리화하였다.

5. 인간화 변이체의 구조적 모델을 필요시 구축하고 잠재적 치환의 구조적 분석을 위한 모 모델과 비교하였다.

6. 모 및 수용자 서열 사이에 상이한 위치를 분석함으로써 CDR-그라프팅을 수행하였다. 기여 위치는 일반적으로 유지되고 이러한 치환이 수용자 프레임워크와의 친화도 및 호환성에 대한 그의 잠재적인 영향에 기초하여 비교적 유리한 경우에만 치환되었다.

7. 인간화 경쇄 및 중쇄의 변이체 조합의 최종 세트를 설계하였다.

서열 주석

보존된 도메인 데이터베이스 (CDD) (Marchler-Bauer et al. 2011)가 각 아미노산 쇄의 도메인 함량 및 각 도메인의 대략적인 경계를 결정하는데 사용되었다. 가변 도메인 경계는 여러 통상적으로 사용되는 정의에 따른 상보성-결정 영역 (CDR)의 경계에 따라 정확하게 결정되었다 (Kabat and Wu 1991, Chothia and Lesk 1987 updated in Al-Lazikani et al. 1997, Honegger and Plucktuhn 2001). 업데이트된 코티아 CDR 정의 (Al-Lazikani et al. 1997)가 사용되었고 위치 넘버링, 이 경우에는 코티아 1987 넘버링이 사용되었다.

서열 정렬

마우스 및 인간 배선 서열에 대한 모 서열의 다중 정렬을 MAFFT (Katoh et al. 2002)를 사용하여 생성하고 각 정렬에서의 엔트리를 모 서열에 대한 서열 동일성 (SeqID)에 따라 순서화하였다. 참조 세트를 100% SeqID에서 클러스터링하고 중복 엔트리를 제외함으로써 고유한 서열 세트로 감소시켰다.

결정적 위치에 있는 잔기의 확인

항체의 Fv는 VH/VL 쇄 간 계면을 구성하거나 또는 CDR 중 5개에 대해 정의된 정규 구조의 개별 세트를 담당하는 다수의 결정적 위치를 갖는다 (Chothia and Lesk 1987, Martin and Thornton 1996, Al Laziniki et al. 1997); 이들 위치는 치환이 그들에 대해 제안되기 전에 상세히 고려되어야 한다. 인간 배선에 대한 모 항체 서열 정렬에 기초하여, 가장 근접한 매칭 엔트리가 확인되었다. 수용자로서의 최적 인간 배선의 확인은 하기 나열된 순서화된 기준에 기초하였다:

1. 프레임워크에 걸친 서열 동일성

2. 동일하거나 상용성인 쇄간 계면 잔기

3. 모 CDR 정규 입체형태를 갖는 지지 루프

4. 발현된 항체에서 발견되는 중배선 및 경배선의 조합

3D 모델의 구축

모 뮤린 항체 및 그의 변이체에 대한 Fv-영역의 구조적 모델을 론자의 모델링 플랫폼을 사용하여 생성하였다. 프레임워크 (FR) 및 상보성-결정 영역 (CDR)뿐만 아니라 완전한 Fv에 대한 후보 구조적 주형 단편을 표적에 대한 그의 서열 동일성, 뿐만 아니라 주형 구조의 정성적 결정학적 척도, 예컨대 해상도 (옹스트롬 (Å))에 기초한 사내 항체 데이터베이스로부터 점수화하고, 등급화하고, 선택하였다.

FR 주형에 대해 CDR을 구조적으로 정렬하기 위해, CDR의 양측의 5개의 잔기를 CDR 주형에 포함시켰다. 단편의 정렬을 중첩 절편에 기초하여 생성하고 구조적 서열 정렬을 생성하였다. 정렬에 따른 주형 단편을 모델러(MODELLER) (Sali et al. 1993)를 사용하여 처리하였다.

이 프로토콜은 정렬된 구조적 주형의 세트로부터 유래된 입체형태적 제약을 생성한다. 이 제약을 충족시키는 구조의 앙상블은 접합체 변화도 및 모의 어닐링 최적화 절차에 의해 생성된다. 1개 이상의 모델 구조는 단백질 구조의 점수 및 입체형태적 제약의 충족으로부터 유래된, 에너지 점수에 기초하여 이 앙상블로부터 선택된다. 모델은 검사되었고 표적 및 주형 사이에서 상이한, 위치의 측쇄는 측쇄 최적화 알고리즘을 사용하여 최적화되었고 에너지는 최소화되었다.

시각화 및 계산 도구의 묶음이 CDR의 입체형태적 변동성, 뿐만 아니라 도메인 및 영역의 코어 및 국부 패킹을 평가하기 위해 사용되고 표면 분석이 1개 이상의 바람직한 모델을 선택하기 위해 사용되었다.

모델링된 구조의 비교

모 및 인간화 Fv-영역에 대한 구조적 모델은 이전에 기재된 바와 같이, 변이체 모델이 모 모델 구조를 향한 어떠한 고유 편향도 없이 구축되도록 보장하기 위해 개별적으로 모델링된다. 그러나, 모 서열에 대한 인간화 변이체의 높은 서열 동일성은 종종 동일한 구조적 주형이 많은 모델에 대해 선택되게 한다.

친화도 및 안정성에 대한 상이한 치환의 영향을 평가하기 위해, 다수의 구조적 기준이 사용된다. 예측되는 항원 결합 계면 또는 Fv 이량체 계면에 대한 용매 접근성, 국부 원자 패킹 및 치환의 위치가 중요한 기준이다. 불리한 용매화 상태, 불량한 원자간 접촉 또는 중요 위치에서의 부적절한 잔기의 열악한 배치는 잠재적 치환의 거부를 초래한다. 다른 기준, 예컨대 정전기적 효과, 수소 결합 패턴 또는 잠재적 수소 결합 패턴은 또한 치환의 적합성을 평가하는데 사용된다. 결정적 위치의 세트가 개별 도메인 코어 또는 도메인-간 계면의 패킹인 CDR의 정규 부류를 지지하는 데 역할을 하므로, 일부 위치는 치환의 수용에 대해 다른 것들보다 더 적합하다.

잠재적 치환의 평가

모 및 수용자 프레임워크 또는 근처 예측되는 에피토프 사이에서 상이한 모든 위치를 결합 친화도 및 안정성에 대한 그의 잠재적 영향에 기초하여 평가하였다.

친화도 및 안정성 둘 다에 대한 관심으로부터 유래한, 이 분류에 기여하는 많은 인자가 있다. 이 분류에 기여하는 인자는 하기와 같다:

● 항원 결합을 담당하는 위치

● 결정적 위치

○ VH/VL 계면 내의 보존된 잔기

○ CDR 정규 부류를 결정하는 위치

● CDR로부터의 거리

● 참조 정렬 내의 위치에서의 보존 또는 변형

● 용매 접근성

● 국부 원자 패킹

● 국부 2차 구조

● 정전기적 효과

● 수소 결합 패턴

● 수소 결합 전위

● 번역후 변형

○ N-글리코실화

○ 탈아미드화

결정적 위치는 처음에 코티아 CDR에서의 것으로 정의되고, VH/VL 계면에서의 결정적 위치; CDR 입체형태를 결정하는 것을 돕거나 참조 정렬에서 고도로 보존된 위치에 있는 것으로 결정된다. 많은 위치는 보존되고 오직 작은 세트의, 또는 오직 1종의 유형의 아미노산만을 수용할 것이다.

최적 수용자 프레임워크 선택

모 가변 도메인을 인간 배선과 비교하는 서열 정렬을 생성하였다. 전체 서열 동일성, 매칭 계면 위치 및 유사하게 분류된 CDR 정규 위치를 고려할 때 경쇄는 여전히 여러 동등하게 적합한 수용자 프레임워크를 가졌으며; 종종 하나가 하나의 영역에 대해 약간 더 적합하지만 또 다른 영역에 대해서는 덜 적합하였다. 결과적으로 2개의 경쇄 수용자 프레임워크 VK6-A26 및 VK3-L6이 선택되었다.

중쇄는 인간 배선 VH7-7-4.1과 가장 잘 매칭되었다. VH7 배선 부류는 오직 1개의 구성원을 함유하며, 이는 VH1 부류에 혼입될 수 있다 (Knappik et al. 2000). VH7 배선이 VH1 배선보다 덜 빈번하게 발견될 가능성이 있으므로 후자를 수용자 프레임워크로서 사용하는 것이 바람직하다고 여겨졌다. 그러나, 잠재적 복귀-돌연변이를 갖는 위치를 분석할 때 VH7 배선이 이미 적절한 잔기를 함유한다는 것이 명백해졌다. 따라서 2개의 IGHV 배선을 수용자 프레임워크; VH7-7-4.1 및 VH1-1-03으로서 사용하였다.

J-절편 유전자를 FR4 및 J-절편에 걸쳐 A24 모 서열과 비교하였다. JK4 및 JH4는 각각 경쇄 및 중쇄에 대한 최상의 매치로 확인되었고, 따라서 J-절편 수용자 프레임워크로 선택되었다.

인간화

모 및 수용자 프레임워크 사이의 상이한 잔기를 갖는 모든 위치의 목록을 생성하였다. 모든 위치를 단리 및 다른 잠재적 치환의 맥락 둘 다에서 분석하고 고려하였다. 각각의 위치를 등급화하고 인간화 변이체 내의 어느 잔기를 치환하고 평가할 지에 대한 제안이 이루어졌다. 3개의 인간화 쇄를 경쇄에 대해 제안하였으며; 1개는 수용자 VK3-L6을 사용하고 2개는 수용자 VK6-A26을 사용하며 여기서 1개는 모 서열로부터 유지된 추가의 기여 위치를 갖는다 (복귀-돌연변이). 2개의 인간화 쇄를 중쇄에 대해 제안하였으며; 1개는 각각의 선택된 수용자를 사용하였다. VH7-7-4.1 그라프트는 보다 더 보존적이다 (표 6 참조).

6종의 인간화 항체의 제1 세대는 A24 기능적 특성을 유지하는 데 실패하였다

이전의 섹션에서 기재된 방법에 기초하여, 본 발명자들은 먼저 A24의 3개의 인간화 경쇄 변이체 (이하에서 VL1, VL2 및 VL3으로 불림) 및 A24의 2개의 인간화 중쇄 변이체 (이하에서 VH1 및 VH2로 불림)를 설계하였다. 본 발명자들은 A24의 상응하는 VH 및 VL을 VH0 및 VL0으로 불렀다.

본 발명자들은 인간화 VH 및 VL 및 인간 IgG1 이소형의 하기 조합을 갖는 하기 6종의 인간화 항체를 생성하였다:

INA01 변이체 1 인간화 항체: VH1/VL1

INA01 변이체 2 인간화 항체: VH2/VL1

INA01 변이체 3 인간화 항체: VH1/VL2

INA01 변이체 4 인간화 항체: VH2/VL2

INA01 변이체 5 인간화 항체: VH1/VL3

INA01 변이체 6 인간화 항체: VH2/VL3

본 발명자들은 상기 기재된 바와 같은 검정에 따라 HL-60 세포의 아폽토시스의 유도에 대해 이들 6종의 인간화 항체를 분석하고, 아폽토시스를 유도하는 이러한 특성을 동일한 인간 IgG1 이소형을 갖는 참조 뮤린 항체 A24의 키메라 형태 (VH0/VL0)와 비교하였다. 결과는 도 1에 제시된다.

도 1에 제시된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 모든 시험 인간화 항체가 그의 결합 특성을 잃었다는 것을 발견하였다. 이는 변이체 중 일부가 그의 모 뮤린 A24 항체와 공통으로 모든 6개의 CDR을 가졌다는 사실을 고려할 때 특히 놀랍다.

5종의 새로운 인간화 항체의 생성

본 발명자들은 이어서 새로운 중쇄 (VH3)를 설계하고 하기 인간화 항체를 생성하였다:

INA01 변이체 7 인간화 항체: VH0/VL1

INA01 변이체 8 인간화 항체: VH3/VL1

INA01 변이체 9 인간화 항체: VH3/VL2

INA01 변이체 10 인간화 항체: VH3/VL3

INA01 변이체 11 인간화 항체: VH3/VL0

다시, 본 발명자들은 이들 인간화 항체를, 모 뮤린 A24 가변 영역 및 인간 IgG1 이소형을 갖는 항체에 상응하는 키메라 INA01에 비해 상기 기재된 바와 같은 HL-60 아폽토시스 유도 검정에 기초하여 아폽토시스를 유도하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 결과는 도 2에 제시된다.

도 2에 제시된 바와 같이, 인간화 항체는 아폽토시스를 유도하는 그의 특성을 적어도 부분적으로 다시 잃었다.

6종의 새로운 인간화 항체의 생성

상기 3종의 새로운 항체에서 수득한 결과에 기초하여, 본 발명자들은 다시 3개의 새로운 경쇄 및 2개의 새로운 중쇄를 설계하였다.

특히, 본 발명자들은 모 항체 A24의 유리한 특성을 여전히 유지하면서 면역원성을 감소시키는 아미노산 (프레임워크에서든 또는 CDR 영역에서든)의 변화를 예측하기 위해 인 실리코 분석을 사용하였다.

현재 분석에서, 인간 MHC 부류 II에 대한 무차별적 고친화도 결합제에 대한 A24 유래된 서열을 분석하는데 iTope™를 사용하였다. 배지 및 저친화도 결합제 또한 T 세포 반응을 촉발할 수 있지만, 무차별적 고친화도 MHC 부류 II 결합 펩티드가 T 세포 에피토프의 존재와 상관된다고 생각된다 (Hill et al. 2003 Arthritis Res Ther. (2003) 1:R40-R48). 따라서 잠재적 T 세포 에피토프의 위치에 대한 유용한 초기 "저해상도" 스크리닝을 제공하기 위해 iTope™를 사용하였다. 또한, 서열을 다른 단백질 서열의 에피스크린™ 분석에 의해 이전에 확인된 임의의 T 세포 에피토프의 위치를 확인하기 위해 TCED™ BLAST 서치에 의해 분석하였다.

표 7에 제시된 바와 같이; 인 실리코 분석 iTope™는 LCDR2에서의 아미노산 치환 L53R 및/또는 S55T가 면역원성을 감소시킬 수 있다는 것을 밝혀냈다.

표 7

따라서 본 발명자들은 3개의 새로운 경쇄를 시험하기로 결정하였는데, 1개 (VL4)는 A24의 LCDR2에 비해 LCDR2에서 2개의 아미노산 치환을 포함하고, 1개 (VL5)는 LCDR2에서 오직 1개의 아미노산 치환을 포함하고, 1개 (VL6)는 A24에 비해 동일한 LCDR2를 가졌다.

IgG1 이소형 불변 영역을 갖는 하기 6종의 새로운 인간화 항체를 생성하였다.

INA01 변이체 12 VH4/VL4

INA01 변이체 13 VH5/VL4

INA01 변이체 14 VH4/VL5

INA01 변이체 15 VH5/VL5

INA01 변이체 16 VH4/VL6

INA01 변이체 17 VH5/VL6

도 5a는 A24 항체의 VL과 함께 VL4, VL5, VL6의 정렬을 보여준다.

도 5b는 A24 항체의 VH와 함께 VH4 및 VH5의 정렬을 보여준다.

본 발명자들은 이들 인간화 항체를, 모 뮤린 A24 가변 영역 및 인간 IgG1 이소형을 갖는 항체에 상응하는 키메라 INA01과 비교하여 상기 기재된 바와 같이 HL-60 72h 아폽토시스 검정에 기초하여 아폽토시스를 유도하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 결과는 도 3에 제시된다.

도 3에 제시된 바와 같이, 모든 6종의 새로운 시험된 인간화 항체는 모 뮤린 A24 가변 영역 및 인간 IgG1 이소형을 갖는 항체에 상응하는 키메라 INA01에 비해 이제 유사하거나 심지어 보다 우수한 특성을 갖는다.

특히 LCDR2에서 2개의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체 12 및 변이체 13은 이제 놀랍게도 모 키메라 INA01 항체에 비해 보다 우수한 유도 특성을 보여주었다.

IgG로의 전환

전장 IgG를 발현하기 위해, 4개의 리드 후보 변이체 12, 14, 15 및 17의 중쇄 (V_H) 및 경쇄 (V_L)의 가변 도메인 단편을 Fab 발현 벡터로부터 인간 IgG4, 인간 IgG1 야생형, 인간 IgG1L234AL235A 및 인간 IgG1N297A에 대한 적절한 발현 벡터 내로 서브클로닝하여 발현 벡터가 본 발명에 따른 16종의 항체, 하기 표 8에 기재된 바와 같은 mAb1-mAb16을 생산하도록 하였으며, 상기 인간 IgG1 L234AL235A는 본원에서 "AA"로 지칭된다.

표 8: mAb1-mAb16의 가변 영역 및 IgG Fc 영역의 기재

인간 IgG의 일시적 발현 및 정제

세포를 IgG mAb1 내지 mAb16의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다.

결과는 도 4에 제시된다. 결과는 IgG4 이소형을 사용하여 생산된 항체가 다른 이소형, IgG1 및 돌연변이 침묵 IgG1에 비해 더 우수한 수율로 생산된다는 것을 밝혀냈다.

mAb1과 관련된 프로파일링 데이터

표 9: mAb1의 프로파일링 데이터

현저하게, 본 발명의 항체는 10nM 미만, 심지어 1nM 미만의 K_D친화도 및 EC₅₀을 갖고, HL-60 아폽토시스 검정에서 측정된 경우에 A24보다 아폽토시스를 더 잘 유도하며, 따라서 약물로서 사용하기에 특히 적합하다.

더욱이, 이들은 특히 예측된 감소된 면역원성으로 인해 진핵 세포주에서의 생산 및 인간에 대한 투여에 대한 유리한 발생가능성 특성을 보유한다.

가변 영역을 코딩하는 코딩 서열은 예를 들어 L234A L235A 돌연변이를 함유하는 IgG1 Fc 변이체, 또는 N297A 돌연변이를 함유하는 IgG1 Fc 변이체를 포함하는 침묵 IgG1 항체를 생성하기 위한 적합한 발현 벡터 및 세포주에서 용이하게 형질감염될 수 있다.

대안적으로, 가변 영역을 코딩하는 코딩 서열은 또한, 예를 들어 N297 아미노산 위치에 양분성 GlcNAc 또는 글리칸의 저푸코실화를 갖는 및/또는 IgG1 Fc 야생형을 포함하는, 높은 ADCC 활성을 갖는 항체를 생성하기 위한 발현 벡터 및 세포주로 전달될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> INATHERYS <120> Anti-TfR antibodies and their use in treating proliferative and inflammatory disorders <130> INA001 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Gln 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Thr Tyr Thr Gly Glu 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Gly Trp Asp Ser Met Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Thr Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Thr Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Gln 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ile Asn Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Glu Gly Trp Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Gln 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ile Asn Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Ile Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Glu Gly Trp Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Gln Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ile Asn Ala 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Ile Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Val Arg Glu Gly Trp Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 16 <211> 760 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly 50 55 60 Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly 65 70 75 80 Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr 85 90 95 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro 100 105 110 Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile 130 135 140 Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln 145 150 155 160 Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val 180 185 190 Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg 195 200 205 Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys 210 215 220 Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile 245 250 255 Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu 260 265 270 Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe 275 280 285 Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly 290 295 300 Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln 305 310 315 320 Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp 340 345 350 Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser 355 360 365 Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile 370 375 380 Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp 385 390 395 400 His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala 405 410 415 Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met 420 425 430 Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile 435 440 445 Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr 450 455 460 Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr 465 470 475 480 Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val 485 490 495 Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn 500 505 510 Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp 515 520 525 Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe 530 535 540 Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp 545 550 555 560 Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu 565 570 575 Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu 580 585 590 Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn 595 600 605 Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp 610 615 620 Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln 625 630 635 640 Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu 645 650 655 Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys 660 665 670 Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro 675 680 685 Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser 690 695 700 Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys 705 710 715 720 Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala 725 730 735 Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp 740 745 750 Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe 755 760 <210> 17 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser 35 40 45 Val Asn Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser 100 105 110 Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 18 <211> 462 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Gln Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Ile Asn Ala 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Ile Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Val Arg Glu Gly Trp Asp Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 225 230 235 240 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 450 455 460 <210> 19 <211> 724 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 aagcttgccg ccaccatgtc cgtgcctacc caggtgctgg gactgctgct gctgtggctg 60 accgatgcca ggtgccagat cgtgctgacc cagtctcctg ccaccctgtc tgtgtctccc 120 ggcgagagag ctaccctgtc ctgctccgcc tcctcctccg tgaactacat gcactggttc 180 cagcagaagc ccggccagtc ccccagactg ctgatctact ccacctccaa ccgggccacc 240 ggcatccctg ccagattttc cggctctggc tccggcacct cctataccct gaccatctcc 300 agcctggaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgccagc agcggtcctc ctaccccctg 360 acctttggcc agggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 420 atcttccccc caagcgacga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg 480 aacaacttct accccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 540 ggcaacagcc aggagagcgt caccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 600 agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 660 acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca acaggggcga gtgctgatga 720 attc 724 <210> 20 <211> 1411 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 aagcttgccg ccaccatgga atggtcctgg gtgttcctgt tcttcctgtc cgtgaccacc 60 ggcgtgcact cccaggtgca gctggtgcag tctggccccg agctgaagaa acctggcgcc 120 tccgtgaagg tgtcctgcaa ggcttccggc tacaccttta caaaccaggg catgaactgg 180 gtcaagcagg cccctggcaa gggcctgaag tggatgggct ggatcaacac ctacaccggc 240 gagcccatca acgccgacga cttcaagggc agattcgtga tctccctgga cacctccgcc 300 tccaccgcct acctgcagat cagctctctg aaggccgagg ataccgccgt gtacttctgc 360 gtgcgggaag gctgggactc catggactat tggggccagg gcacctccgt gaccgtgtct 420 agcgcttcta caaagggccc aagcgtgttc cccctggccc cctgctccag aagcaccagc 480 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 540 tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 600 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcaccaag 660 acctacacct gtaacgtgga ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagggtggag 720 agcaagtacg gcccaccctg ccccccctgc ccagcccccg agttcctggg cggacccagc 780 gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagcagaac ccccgaggtg 840 acctgtgtgg tggtggacgt gtcccaggag gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg 900 gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagcccagag aggagcagtt taacagcacc 960 taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagagtac 1020 aagtgtaagg tctccaacaa gggcctgcca agcagcatcg aaaagaccat cagcaaggcc 1080 aagggccagc ctagagagcc ccaggtctac accctgccac ccagccaaga ggagatgacc 1140 aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aagggcttct acccaagcga catcgccgtg 1200 gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc agtgctggac 1260 agcgacggca gcttcttcct gtacagcagg ctgaccgtgg acaagtccag atggcaggag 1320 ggcaacgtct ttagctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1380 agcctgagcc tgtccctggg ctgatgaatt c 1411 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Arg Ala Ser 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5

Claims

(a) 서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 5의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;
(b) 서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 8의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;
(c) 서열식별번호: 11의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 13의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;
(d) 서열식별번호: 11의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 14의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;
(e) 서열식별번호: 11의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 15의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;
(f) 서열식별번호: 12의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 13의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드;
(g) 서열식별번호: 12의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 14의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드; 또는
(h) 서열식별번호: 12의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 15의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드
를 포함하며, 서열식별번호: 16의 트랜스페린 수용체 (TfR)에 특이적으로 결합하는, 단리된 항-TfR 항체 또는 항-TfR 항체의 항원-결합 부분을 갖는 단백질.
제1항에 있어서, 트랜스페린 수용체에 10nM 이하의 K_D로, 바람직하게는 1nM 이하의 K_D로 결합하는 단리된 항-TfR 항체 또는 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열식별번호: 9의 VH 및 서열식별번호: 10의 VL을 갖는 상응하는 참조 키메라 항체의 유도 수준과 동등하거나 보다 우수한 수준으로 HL-60 세포주의 아폽토시스를 유도하는 단리된 항-TfR 항체 또는 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG4 이소형 불변 영역, 또는 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 불변 영역을 포함하며, 여기서 상기 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 불변 영역은 야생형 IgG1 이소형 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교할 때 상기 항체에 대해 감소된 ADCC 활성을 부여하거나 또는 부여하지 않는 것인, 단리된 항-TfR 항체 또는 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG1 이소형 불변 영역, 또는 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 불변 영역을 포함하며, 여기서 상기 돌연변이 또는 화학적으로 변형된 불변 영역은 야생형 IgG1 이소형 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교할 때 상기 항체에 대해 증가된 ADCC 활성을 부여하는 것인, 단리된 항-TfR 항체 또는 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 18의 중쇄 및 서열식별번호: 17의 경쇄를 포함하는 mAb1인, 단리된 항-TfR 항체 또는 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 의약으로서 또는 (ii) 진단제로서 사용하기 위한, 단리된 항-TfR 항체 또는 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 종양, 예를 들어 혈액 종양, 보다 구체적으로 림프종 또는 백혈병의 치료에 사용하기 위한, 단리된 항-TfR 항체 또는 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양 또는 이식편-대 숙주 질환의 치료에 사용하기 위한, 단리된 항-TfR 항체 또는 단백질.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항-TfR 항체 또는 단백질을 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하고, 다른 활성 성분을 임의로 포함하는 제약 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-TfR 항체 또는 단백질을 포함하는 동결건조물 제제, 사전-충전 시린지 또는 바이알.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-TfR 항체를 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 숙주 세포에서의 상기 항-TfR 항체의 재조합 생산을 위한 클로닝 또는 발현 벡터.
제12항에 있어서, 제6항에 정의된 바와 같은 mAb1을 코딩하는 핵산 중 적어도 하나를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
제12항 또는 제13항에 따른 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항-TfR 항체 또는 단백질을 생산하는 방법이며, (i) 제14항의 숙주 세포를 숙주 세포에 의한 상기 항체 또는 단백질의 발현을 위해 배양하는 것; 임의로 (ii) 상기 항체 또는 단백질을 정제하는 것; 및, (iii) 상기 항체 또는 단백질을 회수하는 것을 포함하는 방법.