TW202330601A - TfR抗原結合蛋白及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公開內容一般涉及包括特異性地結合TfR蛋白,例如哺乳動物TfR或人TfR的抗體,例如單克隆抗體、抗體片段等的組合物,以及此類組合物在預防、減少風險、或治療有此需要的個體中的用途。
Description
本公開內容一般涉及轉鐵蛋白受體(下文稱TfR),並且特別涉及抗TfR抗體以及此類抗體的治療和診斷用途。
經由電子提交的序列表的引用
大小為227 KB,於2022年9月11日創建,並且隨同本申請以電子方式提交給USPTO的專利中心,命名為“UTH-011PCT0_sequence_listing_ST26_FILED.XML”的序列表的XML檔的內容通過引用以其整體併入。
相關申請的交叉引用
本申請要求於2021年9月13日提交的美國臨時申請號63/243,453;於2022年3月15日提交的美國臨時申請號63/320,188;以及於2022年8月18日提交的美國臨時申請號63/399,199的權益。前述申請的內容被依賴並且通過引用以其整體併入本文。
轉鐵蛋白受體是一種膜糖蛋白,其在所有人有核細胞中表達,並且通過與血漿糖蛋白轉鐵蛋白結合來介導鐵的細胞攝取。Tfr可以穿過血腦屏障(BBB)並且介導轉鐵蛋白在腦組織內部的遞送。
TfR受體經由受體介導的配體佔據的TfR內吞進入專門的內體內,介導來自血漿糖蛋白轉鐵蛋白的鐵的細胞攝取。內體內的酸化導致鐵釋放。TfR參與紅細胞和神經系統的發育,並且可以通過鐵攝取正向調控T和B細胞增殖。
本公開內容一般涉及包括特異性地結合TfR蛋白,例如哺乳動物TfR (例如任何非人哺乳動物)或人TfR的抗體,例如單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、抗體片段等以及前述任一種的綴合物的組合物,以及使用此類組合物的方法。
研究人員已產生並表徵了與TfR具有結合特異性的某些單克隆抗體,所述TfR是尤其與人和靈長類動物兩者中跨越血腦屏障的蛋白質(例如,轉鐵蛋白)轉運相關的受體蛋白。抗體與轉鐵蛋白非競爭性地結合TfR,因此對轉鐵蛋白結合和遞送到細胞內沒有影響。另外,抗TfR單克隆抗體可以與治療肽或診斷肽融合或者與治療小分子或診斷小分子綴合。本公開內容提供了針對TfR具有親和力的多肽、編碼所述多肽的多核苷酸、產生所述多肽的方法以及治療人類病況的方法。
這些及其它實施方案的另外細節在附圖和下文說明書中進行闡述。其它特徵、目的和優點根據說明書和所附申請專利範圍將變得顯而易見。
在一個方面,本公開內容提供了分離的單克隆抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體與TfR特異性地結合,並且其中所述抗體與選自以下的抗體競爭結合TfR表位:1B2、1C8、2C3、3H8、4G1、5B6、7A1、7B10、8A5或8G5。
在另一個方面,本公開內容提供了重組多肽,其包含抗體V
L結構域(顯示於表3中),所述抗體V
L結構域包含1B2的V
L結構域的CDR 1-3;1C8的V
L結構域的CDR 1-3;2C3的V
L結構域的CDR 1-3;3H8的V
L結構域的CDR 1-3;4G1的V
L結構域的CDR 1-3;5B6的V
L結構域的CDR 1-3;7A1的V
L結構域的CDR 1-3;7B10的V
L結構域的CDR 1-3;或8A5的V
L結構域的CDR 1-3或8G5的V
L結構域的CDR 1-3。
在再一個方面,本公開內容提供了重組多肽,其包含抗體V
H結構域(顯示於表2中),所述抗體V
H結構域包含1B2的V
H結構域的CDR 1-3;1C8的V
H結構域的CDR 1-3;2C3的V
H結構域的CDR 1-3;3H8的V
H結構域的CDR 1-3;4G1的V
H結構域的CDR 1-3;5B6的V
H結構域的CDR 1-3;7A1的V
H結構域的CDR 1-3;7B10的V
H結構域的CDR 1-3;8A5的V
H結構域的CDR 1-3或8G5的V
H結構域的CDR 1-3。
在再一個方面,本公開內容提供了宿主細胞,其包含編碼上述實施方案中任何一個的多肽的多核苷酸分子。
這些及其它實施方案的另外細節在附圖和下文說明書中進行闡述。其它特徵、目的和優點根據說明書和所附申請專利範圍將變得顯而易見。
數目E5、E6和E7等等在本文中分別可與10
5、10
6和10
7等等互換使用。
術語“包含(comprising)”及其變化(例如,包含(comprises)、包括等)當這些術語在說明書和申請專利範圍中出現時並不具有限制性含義。
如本文使用的,“一個”、“一種”、“該/所述”、“至少一個/至少一種”和“一個或多個/一種或多種”可互換使用,除非上下文另有明確規定。
同樣在本文中,通過端點敘述的數值範圍包括包含在該範圍內的所有數目(例如,500至7000 nm包括500、530、551、575、583、592、600、620、650、700等)。
詞語“優選的”和“優選地”指在某些情況下,可以提供某些益處的本發明的實施方案。然而,在相同或其它情況下,其它實施方案也可能是優選的。此外,一個或多個優選實施方案的敘述並非暗示其它實施方案是無用的,並不預期將其它實施方案排除在本發明的範圍之外。
“激動劑”抗體或“啟動”抗體是在抗體結合抗原後,誘導(例如,增加)抗原的一種或多種活性或功能的抗體。
“拮抗劑”抗體或“阻斷”抗體是在抗體結合抗原後,減少或消除(例如,降低)與一種或多種配體的抗原結合,和/或在抗體結合抗原後,減少或消除(例如,降低)抗原的一種或多種活性或功能的抗體。在一些實施方案中,拮抗劑抗體或阻斷抗體基本上或完全抑制與一種或多種配體的抗原結合和/或抗原的一種或多種活性或功能。
如本文使用的,關於肽、多肽或抗體序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”和“同源性”指在比對序列和必要時引入空位以實現最大百分比序列同一性後,並且不將任何保守取代視為序列同一性的部分,候選序列中與特定肽或多肽序列中的氨基酸殘基等同的氨基酸殘基的百分比。為確定百分比氨基酸序列同一性的目的,比對可以以各種方式實現,所述方式在本領域的技術內,例如,使用可公開獲得的電腦軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN™ (DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於測量比對的適當參數,包括在待比較的序列的全長上實現最大比對所需的本領域已知的任何演算法。
編碼抗體例如本公開內容的抗TfR抗體的“分離的”核酸分子是這樣的核酸分子,其被鑒定且從它在其中產生的環境中與其通常相關的至少一種污染物核酸分子分開。優選地,分離的核酸不含與和生產環境相關的所有組分的結合。編碼本文中的多肽和抗體的分離的核酸分子在形式上不同於它在自然界中發現的形式或背景。因此,分離的核酸分子區別於細胞中天然存在的編碼本文多肽和抗體的核酸。
“宿主細胞”包括各個細胞或細胞培養物,其可以是或已是用於摻入多核苷酸插入物的載體的接受者。宿主細胞包括單個宿主細胞的後代,並且由於天然、偶然或有意的突變,後代可能不一定與原始親本細胞完全等同(在形態或基因組DNA互補物方面)。宿主細胞包括用本發明的多核苷酸在體內轉染的細胞。
術語“分離的分子” (其中所述分子是例如多肽、多核苷酸或抗體)是這樣的分子,由於其起源或衍生來源,所述分子(1)與在其天然狀態下伴隨其的天然相關的組分不相關,(2)基本上不含來自同一物種的其它分子,(3)由來自不同物種的細胞表達,或(4)在自然界中不存在。相應地,本公開內容的抗TfR抗體是這樣的核酸分子,其被鑒定且從它在其中產生的環境中與其通常相關的至少一種污染物核酸分子分開。優選地,分離的核酸不含與和生產環境相關的所有組分的結合。編碼本文中的多肽和抗體的分離的核酸分子在形式上不同於它在自然界中發現的形式或背景。因此,分離的核酸分子區別於細胞中天然存在的編碼本文多肽和抗體的核酸。此外,化學合成、或在與它天然源於其的細胞不同的細胞系統中表達的分子,將是與其天然相關的組分“分離的”。也可以使用本領域眾所周知的純化技術,通過分離致使分子基本上不含天然相關的組分。分子純度或同質性可以通過本領域眾所周知的許多手段進行測定。例如,多肽樣品的純度可以使用本領域眾所周知的技術,使用聚丙烯醯胺凝膠電泳和凝膠染色以顯現多肽進行測定。出於某些目的,可以通過使用HPLC或本領域眾所周知的用於純化的其它手段來提供更高的解析度。
術語“表位”指在抗體分子的一個或多個抗原結合區處,能夠被抗體分子或其抗原結合部分識別且結合的分子的一部分。表位元可以由一級蛋白質結構、二級蛋白質結構或三級蛋白質結構的限定區域組成,並且包括由抗體或其抗原結合部分的抗原結合區識別的靶的二級結構單元或結構域的組合。表位元可以同樣地由分子的確定化學活性表面分組如氨基酸或糖側鏈組成,並且具有特定的三維結構特性以及特定的電荷特性。如本文使用的,術語“抗原表位”定義為抗體分子可以與之特異性地結合的多肽的一部分,如通過本領域眾所周知的任何方法確定的,例如通過常規免疫測定、抗體競爭性結合測定或通過X射線晶體學或相關結構確定方法(例如NMR)。
術語“結合親和力”或“K
D”指特定抗原-抗體相互作用的解離速率。K
D是解離速率(也稱為“離開速率(k
off)”)與結合速率(association rate)或“結合速率(on-rate) (k
on)”的比。因此,K
D等於k
off/k
on並且表示為摩爾濃度(M)。由此可見,K
D越小,結合的親和力越強。因此,與1 nM的K
D相比,1 μM的K
D指示弱結合親和力。抗體的K
D值可以使用本領域充分確立的方法來確定。用於確定抗體K
D的一種方法是通過使用表面等離振子共振(SPR),其通常使用生物感測器系統,例如Biacore.RTM.系統。
如本文使用的,短語“有效量”或“治療有效量”指實現所需治療結果所必需的量(在劑量和時間段下以及對於施用手段)。有效量是對受試者賦予治療益處所必需的活性劑的至少最小量,但小於毒性量。
如本文使用的,關於本發明抗體分子的生物活性的術語“抑制”或“中和”意指抗體基本上拮抗、阻止、預防、遏制、減慢、破壞、消除、停止、減少或逆轉例如被抑制的事物的進展或嚴重程度的能力,所述事物包括但不限於抗體分子對TfR的生物活性或結合相互作用。
如本文使用的,“載體”意指能夠在宿主細胞中遞送並且優選地表達一種或多種目的基因或序列的構建體。載體的實例包括但不限於病毒載體、裸露DNA或RNA表達載體、質粒、黏粒或噬菌體載體、與陽離子縮合劑相關的DNA或RNA表達載體、封裝在脂質體中的DNA或RNA表達載體,以及某些真核細胞例如生產者細胞。
如本文使用的,除非另有說明,否則術語“治療”意指逆轉以下、減輕以下、抑制以下的進展、延遲以下的進展、延遲以下的發作或預防以下:此類術語應用於其的病症或病況、或者此類病症或病況的一種或多種症狀。如本文使用的,除非另有說明,否則術語“治療”指如上定義的治療行為。術語“治療”還包括受試者的輔助治療和新輔助治療。為了避免疑問,本文提及“治療”包括提及治癒性、姑息性和預防性治療。為了避免疑問,本文提及“治療”還包括提及治癒性、姑息性和預防性治療。
術語“包含(comprising)”及其變化(例如,包含(comprises)、包括等)當這些術語在說明書和申請專利範圍中出現時並不具有限制性含義。
除非另有說明,否則本文使用的所有科學和技術術語都具有本領域常用的含義。本文提供的定義是為了促進本申請中頻繁使用的某些術語的理解,並不意味著在本公開內容的上下文中排除這些術語的合理解釋。
應理解,本文描述的本公開內容的方面和實施方案包括“包含”、“由……組成”和“基本上由……組成”的方面和實施方案。
除非另有說明,否則說明書和申請專利範圍中使用的表示特徵大小、量和物理性質的說明書和申請專利範圍中的所有數目都應理解為在所有情況下被術語“約”修飾。相應地,除非有相反的說明,否則在前述說明書和所附申請專利範圍中闡述的數值參數是近似值,其可以取決於待通過本領域技術人員利用本文公開的教導尋求獲得的所需性質而變。最低限度且不是作為將等同原則的應用限制於請求項的範圍內的嘗試,每個數值參數至少應該按照報導的有效數字的數目並通過應用普通的四捨五入技術來解釋。儘管闡述本發明的廣泛範圍的數值範圍和參數是近似值,但在具體實例中闡述的數值盡可能精確地報導。然而,任何數值都固有地含有某些誤差,其必然地起因於它們各自測試測量中發現的標準差。
本發明的上文概述並不意圖描述本發明的每個公開的實施方案或每一個實施。下述的說明書更具體地例示了說明性實施方案。
本公開內容描述了對TfR具有結合親和力的一組單克隆抗體及其片段。抗體與轉鐵蛋白非競爭性地結合TfR,因此對轉鐵蛋白結合和遞送到細胞內沒有影響(N. Zhang,Z. An和P. Zhao;MAbs. 14:2057269 (2022);DOI: 10.1080/ 19420862.2022.2057269)。本公開內容的抗體可以與治療性寡肽融合或與治療性小分子綴合,這兩者均可以跨越血腦屏障(與抗TfR抗體一起)轉運到腦內。
實施方案的抗體
在某些實施方案中,抗體或其片段與TfR蛋白的至少一部分結合,並且促進抗體或片段或其綴合物跨越血腦屏障的轉移。如本文使用的,術語“抗體”預期泛指任何免疫結合劑,例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和遺傳修飾的IgG,以及包含抗體CDR結構域的多肽,其保留抗原結合活性。抗體可以選自嵌合抗體、親和力成熟抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、人抗體、或抗原結合抗體片段或者天然配體或合成配體。優選地,TfR結合抗體是單克隆抗體或人源化抗體。
“抗體分子”包括任何類別的抗體,例如IgG、IgA或IgM (或其亞類),並且抗體無需屬於任何特定類別。取決於抗體重鏈恒定區的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分配到不同的類別。存在免疫球蛋白的五個主要類別:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,並且其中幾個可以進一步分成亞類(同種型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應於免疫球蛋白的不同類別的重鏈恒定區分別稱為α、δ、ε、γ和μ。免疫球蛋白的不同類別的亞基結構和三維構型是眾所周知的。
如本文使用的,術語抗體分子的“抗原結合部分”指完整抗體的一個或多個片段,其保留與靶分子(例如,TfR)特異性地結合的能力。抗體分子的抗原結合功能可以通過完整抗體的片段來執行。在術語抗體分子的“抗原結合部分”內包括的結合片段的實例包括Fab;Fab';F(ab')2;由V
H和CH1結構域組成的Fd片段;由抗體單臂的V
L和V
H結構域組成的Fv片段;單結構域抗體(dAb)片段和分離的互補決定區(CDR)。
術語“Fc區”用於定義免疫球蛋白重鏈的C末端區域。“Fc區”可以是天然序列Fc區或變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈的Fc區的邊界可能不同,但人IgG重鏈Fc區通常定義為從在位置Cys226或Pro230處的氨基酸殘基到其羧基末端的段。Fc區中的殘基編號是如Kabat中的EU索引的編號。免疫球蛋白的Fc區一般包含兩個恒定結構域,CH2和CH3。如本領域已知的,Fc區可以以二聚體或單體形式存在。
抗體的“可變區”指單獨或組合的抗體輕鏈可變區或抗體重鏈可變區。如本領域已知的,重鏈和輕鏈的可變區各自由四個構架區(FR)組成,所述構架區通過三個互補決定區(CDR) (也稱為高變區)連接,促成抗體的抗原結合位點形成。當選擇FR以側接CDR時,例如在使抗體人源化或優化時,來自含有相同規範類別中的CDR序列的抗體的FR是優選的。
如本文使用的,術語“保守取代”指氨基酸由並未顯著有害地改變功能活性的另一種氨基酸的替換。“保守取代”的優選實例是一種氨基酸由在BLOSUM 62取代矩陣中具有大於0的值的另一種氨基酸的替換(參見Henikoff & Henikoff,1992,PNAS 89: 10915-10919)。
因此,通過已知的手段和如本文所述的,可以產生單克隆抗體、抗體片段、以及結合結構域和CDR (包括前述任一種的改造形式),其對TfR蛋白、其各個表位中的一種或多種、或前述任一種的綴合物是特異性的,無論此類抗原或表位是從天然來源中分離的,還是天然化合物的合成衍生物或變體。
適合於本實施方案的抗體片段的實例包括但不限於:(i)由V
L、V
H、CL和CHI結構域組成的Fab片段;(ii)由V
H和CHI結構域組成的“Fd”片段;(iii)由單一抗體的V
L和V
H結構域組成的“Fv”片段;(iv)由V
H結構域組成的“dAb”片段;(v)分離的CDR區;(vi) F(ab')2片段,其為包含兩個連接的Fab片段的二價片段;(vii)單鏈Fv分子(“scFv”),其中V
H結構域和V
L結構域通過肽接頭進行連接,所述肽接頭允許兩個結構域結合以形成結合結構域;(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(參見例如,美國專利號5,091,513);以及(ix)通過基因融合構建的雙抗體、多價或多特異性片段(參見例如,美國專利申請公開號20050214860,其通過引用以其整體併入本文)。Fv、scFv或雙抗體分子可以通過摻入連接V
H和V
L結構域的二硫鍵得到穩定。還可以製備包含與CH3結構域連接的scFv的微型抗體(參見例如,Hu等人,1996,“Minibody: A Novel Engineered Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody Fragment (Single-Chain Fv-CH3) Which Exhibits Rapid,High-Level Targeting of Xenografts”,Cancer Res. 56:3055-3061,其通過引用以其整體併入本文)。
在實施方案中還考慮了抗體樣結合肽模擬物。Liu等人(Murali,R.;Liu,Q.;Cheng,X.;Berezov,A.;Richter,M.;Furuchi,K.;Greene,M.I.;Zhang,H. Antibody like peptidomimetics as large scale immunodetection probes. Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand) 2003,49:209-216,其通過引用以其整體併入本文)描述了“抗體樣結合肽模擬物”(ABiP),其是充當精簡抗體(pared-down antibodies)的肽,並且具有較長的血清半衰期以及較不繁瑣的合成方法的某些優點。
單克隆抗體(或“MAb”)是單一種類的抗體,其中每一個抗體分子識別相同的表位,因為所有產生抗體的細胞都衍生自單一B淋巴細胞細胞系。用於生成單克隆抗體(MAb)的方法一般沿著與用於製備多克隆抗體相同的線路開始。在一些實施方案中,齧齒類動物如小鼠和大鼠用於生成單克隆抗體。在一些實施方案中,兔、綿羊或青蛙細胞用於生成單克隆抗體。大鼠的使用是眾所周知的並且可以提供某些優點。小鼠(例如,BALB/c小鼠)是常規使用的,並且一般給出高百分比的穩定融合物。
雜交瘤技術涉及單個B淋巴細胞與永生骨髓瘤細胞(通常是小鼠骨髓瘤)的融合,所述單個B淋巴細胞來自先前用例如TfR抗原免疫的小鼠。這種技術提供了將產生單一抗體的細胞繁殖無限代的方法,使得可以產生無限數量的具有相同抗原或表位元特異性的結構上等同的抗體(單克隆抗體)。
血漿B細胞(CD45+CD5-CD19+)可以從免疫兔的新鮮製備的兔外周血單核細胞中進行分離,並且對於TfR結合細胞進一步選擇。在富集產生抗體的B細胞後,可以分離總RNA並合成cDNA。可以擴增來自重鏈和輕鏈兩者的抗體可變區的DNA序列,構建到噬菌體展示Fab表達載體內,並且轉化到大腸桿菌(E. coli)內。TfR特異性結合Fab可以通過多輪富集淘選而選出並測序。選擇的TfR結合命中可以使用哺乳動物表達載體系統在人胚腎(HEK293)細胞(Invitrogen)中,以兔和兔/人嵌合形式作為全長IgG進行表達,並且使用蛋白G樹脂與快速蛋白液相層析(FPLC)分離單元進行純化。
在一個實施方案中,抗體是嵌合抗體,例如,包含移植到異源非人、人或人源化序列(例如,構架和/或恒定結構域序列)的來自非人供體的抗原結合序列的抗體。已開發了用人起源的類似結構域替換單克隆抗體的輕鏈和重鏈恒定結構域,而使外源抗體的可變區保持完整的方法。可替代地,“全人”單克隆抗體在對於人免疫球蛋白基因是轉基因的小鼠中產生。還已開發了通過重組構建具有齧齒類動物例如小鼠和人氨基酸序列兩者的抗體可變結構域,以將單克隆抗體的可變結構域轉換為更加人形式的方法。在“人源化”單克隆抗體中,僅高變CDR衍生自小鼠單克隆抗體,而構架區和恒定區衍生自人氨基酸序列(參見例如,美國專利號5,091,513和6,881,557,其通過引用以其整體併入本文)。認為用人抗體的相應位置中發現的氨基酸序列替換抗體中齧齒類動物特有的氨基酸序列,將減少在治療使用過程中的不良免疫反應的可能性。產生抗體的雜交瘤或其它細胞也可能經受遺傳突變或其它變化,其可能改變或可能不改變由雜交瘤產生的抗體的結合特異性。
用於在各種動物物種中產生多克隆抗體以及用於產生各種類型包括人源化、嵌合和全人的單克隆抗體的方法,是本領域眾所周知的並且是高度可預測的。例如,通過引用以其整體併入本文的下述美國專利和專利申請提供了此類方法的有效描述:美國專利申請號2004/0126828和2002/ 0172677;以及美國專利號3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,196,265;4,275,149;4,277,437;4,366,241;4,469,797;4,472,509;4,606,855;4,703,003;4,742,159;4,767,720;4,816,567;4,867,973;4,938,948;4,946,778;5,021,236;5,164,296;5,196,066;5,223,409;5,403,484;5,420,253;5,565,332;5,571,698;5,627,052;5,656,434;5,770,376;5,789,208;5,821,337;5,844,091;5,858,657;5,861,155;5,871,907;5,969,108;6,054,297;6,165,464;6,365,157;6,406,867;6,709,659;6,709,873;6,753,407;6,814,965;6,849,259;6,861,572;6,875,434;和6,891,024。
抗體可以由任何動物來源包括鳥類和哺乳動物產生。優選地,抗體是綿羊、鼠(例如小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞的。另外,較新的技術允許來自人組合抗體文庫的人抗體的開發和篩選。例如,噬菌體抗體表達技術允許在動物免疫的不存在下產生特異性抗體,如通過引用併入本文的美國專利號6,946,546中所述。
在一些實施方案中,編碼結合TrF的單克隆抗體的多核苷酸的生產包括使用人噬菌體抗體文庫,其用重組表達的TrF-His選擇進行淘選,以富集且分離高親和力的結合TrF的噬菌體。確定每個噬菌體克隆的DNA序列,並且使用GeneBank IgBLAST分析序列以鑒定種系V(D)J基因區段。將各個VH和VL基因映射到主要IGL和IGH基因座的種系。根據IMGT (http://www.imgt.org/)命名法來注釋CDR序列。
通過使用基因特異性引物的PCR來擴增編碼VH和VL鏈的DNA片段。使用輸注克隆試劑盒(In-Fusion® HD Cloning試劑盒,Clontech),對VH和VL基因片段的PCR產物進行凝膠提取且純化,以製備全長重鏈(HC)和輕鏈(LC) DNA構建體。
抗TrF單克隆抗體的表達:通過用含有配對的HC和LC的DNA構建體暫態轉染HEK293細胞,在哺乳動物細胞(來自Thermo Fisher的Expi 293細胞)中產生人抗TrF抗體。根據基於製造商(Repligen)的說明書的方法,使用蛋白A樹脂純化(分離)培養基中的抗體。
完全預計針對TfR的抗體(及其綴合物)通過與TfR結合而具有穿過血腦屏障(BBB)的能力,帶著隨同的(例如,結合或綴合的)治療藥物。某些動物物種可能對於生成治療性抗體較不優選,因為它們可能更有可能由於通過抗體的“Fc”部分啟動補體系統而引起過敏應答。然而,完整的抗體可以被酶促消化成“Fc” (補體結合)片段、以及具有結合結構域或CDR的抗體片段。Fc部分的去除減少了抗原抗體片段引發不期望的免疫應答的可能性,並且因此,不含Fc的抗體可能對於預防性或治療性治療是優先的。如上所述,抗體也可以被構建為嵌合的或者部分或全人的,以便減少或消除起因於向動物施用抗體的不良免疫學後果,所述抗體已在其它物種中產生或具有來自其它物種的序列。
取代變體通常在單克隆抗體蛋白內的一個或多個位點處含有一種氨基酸與另一種氨基酸的交換,並且可以被設計為調節多肽的一種或多種性質,伴隨或不伴隨其它功能或性質的損失。取代可能是保守的,即一種氨基酸由具有相似形狀和電荷的一種氨基酸替換。保守取代是本領域眾所周知的,並且包括例如以下的變化:丙氨酸至絲氨酸;精氨酸至賴氨酸;天冬醯胺至穀氨醯胺或組氨酸;天冬氨酸至谷氨酸;半胱氨酸至絲氨酸;穀氨醯胺至天冬醯胺;谷氨酸至天冬氨酸;甘氨酸至脯氨酸;組氨酸至天冬醯胺或穀氨醯胺;異亮氨酸至亮氨酸或纈氨酸;亮氨酸至纈氨酸或異亮氨酸;賴氨酸至精氨酸;甲硫氨酸至亮氨酸或異亮氨酸;苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸;絲氨酸至蘇氨酸;蘇氨酸至絲氨酸;色氨酸至酪氨酸;酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸;以及纈氨酸至異亮氨酸或亮氨酸。可替代地,取代可以是非保守的,使得影響多肽的功能或活性。非保守變化通常涉及用殘基取代化學上不相似的殘基,例如用極性或荷電氨基酸取代非極性或非荷電氨基酸,且反之亦然。
本公開內容的蛋白質(例如,單克隆抗體)可以是分離的(例如,富集和/或純化至一定程度)和/或可以是重組的或體外合成的。可替代地,可以從細菌中分離非重組蛋白或重組蛋白。還考慮了含有此類變體的細菌可以在組合物和方法中實施。因而,蛋白質無需是分離的。
因此,本公開內容提供了與TfR特異性地結合的分離的或重組的單克隆抗體。在某些方面,提供了與1B2、1C8、2C3、3H8、4G1、5B6、7A1、7B10、8A5或8G5單克隆抗體(各自在本文中公開且描述)競爭結合TfR的抗體。在某些方面,抗體可以包含1B2、1C8、2C3、3H8、4G1、5B6、7A1、7B10、8A5、8G5、mTfR-2、mTfR-4、mTfR5、mTfR-42、mTfR-59、hTfR-1、hTfR-1、hTfR-1和hTfR-1單克隆抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區的全部或部分。
考慮了在本公開內容的組合物中,存在約0.001 mg至約10 mg的總多肽、肽和/或蛋白質/ml。因此,組合物中的蛋白質濃度可以是約、至少約或至多約0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 mg/ml或更多(或可從其中得出的任何範圍)。在其中,約、至少約或最多約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%可以是結合TfR的抗體。
抗體或優選地抗體的免疫學部分可以化學綴合至其它蛋白或作為具有其它蛋白的融合蛋白表達。出於本說明書和所附申請專利範圍的目的,所有此類融合蛋白都包括在抗體或抗體的免疫學部分的定義中。
實施方案提供了針對TrF的抗體和抗體樣分子、多肽和肽,其與至少一種試劑連接以形成抗體綴合物或有效負載。為了增加抗體分子作為診斷劑或治療劑的功效,連接或共價結合或複合至少一種所需分子或部分是常規的。此類分子或部分可以是但不限於至少一種效應分子或報導分子。效應分子包含具有所需活性例如細胞毒活性的分子。已附著至抗體的效應分子的非限制性實例包括毒素、治療性酶、抗生素、放射性標記的核苷酸等等。相比之下,報導分子定義為可以使用測定進行檢測的任何部分。已與抗體綴合的報導分子的非限制性實例包括酶、放射性標記、半抗原、螢光標記、磷光分子、化學發光分子、生色團、發光分子、光親和分子、有色顆粒或配體,例如生物素。
本領域已知用於將抗體附著或綴合至其綴合物部分的幾種方法。一些附著方法涉及使用金屬螯合絡合物,採用例如有機螯合劑如二亞乙基三胺五乙酸酐(DTPA);乙三胺四乙酸;N-氯對甲苯磺醯胺;和/或與抗體附著的四氯-3a-6a-二苯基甘脲。單克隆抗體也可以在偶聯劑如戊二醛或高碘酸鹽的存在下與酶反應。在這些偶聯劑的存在下或通過與異硫氰酸酯反應來製備具有螢光素標記物的綴合物。
嵌合抗原受體
如本文使用的,術語“嵌合抗原受體”或“CAR”指人工構建的雜合蛋白或多肽,其含有與結構域或信號傳導,例如T細胞信號傳導或T細胞啟動結構域(其啟動免疫細胞,例如T細胞或NK細胞)連接的抗體的抗原結合結構域(例如,單鏈可變片段(scFv))。CAR能夠利用單克隆抗體的抗原結合性質,以非MHC限制性方式,將免疫細胞的特異性和反應性朝向所選的靶重定向。這種非MHC限制性抗原識別對表達CAR的免疫細胞賦予不依賴於加工而識別抗原的能力,從而繞過腫瘤逃逸機制。在另一個方面,提供的是包含如本文提供的抗原結合片段的嵌合抗原受體(CAR)蛋白。在另一個方面,提供的是編碼如本文提供的CAR蛋白的分離的核酸。
在另一個方面,改造的細胞包含如本文提供的分離的核酸。在某些實施方案中,改造的細胞是T細胞、NK細胞或髓樣細胞。在另一個方面,本公開內容提供了表達嵌合抗原受體(CAR)的免疫細胞。在一些實施方案中,CAR包含本文提供的抗原結合片段。在一些實施方案中,CAR蛋白從N末端到C末端包括:前導肽、抗TfR重鏈可變結構域、接頭結構域、抗TfR輕鏈可變結構域、人IgG1-CH2-CH3結構域、間隔區、CD28跨膜結構域、抗TfR細胞內共刺激信號傳導結構域和CD3z細胞內T細胞信號傳導結構域。
在某些實施方案中,嵌合抗原受體包含與本文公開的任何一種TfR特異性單克隆抗體的抗原結合結構域至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同的抗原結合結構域。在某些實施方案中,改造的細胞表達與本文公開的任何一種TfR特異性單克隆抗體的抗原結合結構域至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同的抗原結合結構域。
疾病的治療
本實施方案的某些方面可以用於預防、治療或診斷人中的疾病或病症(例如,癌症如膠質母細胞瘤和某些癡呆如阿爾茨海默氏病)。TfR活性可以通過任何TfR結合抗體得到增加或減少。優選地,此類抗體將是抗TfR抗體。
“治療(Treatment)”和“治療(treating)”指為了獲得疾病或健康相關狀況的治療益處的目的,向受試者施用或應用治療劑或者對受試者執行程式或模式。例如,治療可以包括施用藥學有效量的調節TfR生物活性的抗體。
治療可以通過將治療劑灌注、直接注射或局部應用到受影響的區域來完成。此類治療可以例如每1、2、3、4、5、6或7天,或每1、2、3、4和5周,或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月進行重複。這些治療也可以具有不同的劑量。
“受試者”和“患者”指人或非人,例如靈長類動物、哺乳動物和脊椎動物。在特定實施方案中,受試者是人。
如本申請自始至終使用的,術語“治療益處”或“治療上有效的”指關於該病況的醫學治療,促進或增強受試者的健康的任何東西。這包括但不限於疾病體征或症狀的頻率或嚴重程度的減少。
藥物製劑
當採取含有抗體的治療組合物的臨床應用時,製備適合於預期應用的藥物或治療組合物一般是有益的。在某些實施方案中,藥物組合物可以包含例如至少約0.1%的活性化合物。在其它實施方案中,例如,活性化合物可以構成單元重量的約2%至約75%、或約25%至約60%,以及可從其中得出的任何範圍。
本實施方案的治療組合物有利地以可注射組合物的形式作為液體溶液或懸浮液進行施用;也可以製備適合於在注射之前溶解或懸浮於液體中的固體形式。這些製劑也可以是乳化的。
短語“藥學或藥理學可接受的”指當適當地施用於動物例如人時,不產生不利、過敏或其它不良反應的分子實體和組合物。按照本公開內容,本領域技術人員將知道包含抗體或另外的活性成分的藥物組合物的製備。此外,對於動物(例如人)施用,應理解製劑應該符合如由FDA生物標準辦公室(FDA Office of Biological Standards)要求的無菌性、熱原性、一般安全性和純度標準。
如本文使用的,“藥學可接受的載體”包括任何和所有水性溶劑(例如,水、醇/水性溶液、鹽水溶液、腸胃外媒介物例如氯化鈉、林格氏右旋糖等)、非水性溶劑(例如,丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有機酯例如油酸乙酯)、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如,抗細菌劑或抗真菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、藥物、藥物穩定劑、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、流體和營養補充劑、此類類似材料及其組合,如本領域普通技術人員已知的。根據眾所周知的參數,調整藥物組合物中的各種組分的pH和確切濃度。
術語“單位劑量”或“劑量”指適用於受試者中的物理上離散的單位,每個單位含有預定數量的治療組合物,其計算為產生上文結合其施用,即適當的途徑和治療方案所討論的所需應答。根據治療次數和單位劑量兩者,待施用的數量取決於所需效應。施用於患者或受試者的本實施方案的組合物的實際劑量的量可以通過身體和生理因素進行確定,所述因素例如受試者的體重、年齡、健康和性別,待治療的疾病類型,疾病滲透的程度,先前或同時的治療干預,患者的特發病,施用途徑,以及特定治療物質的效力、穩定性和毒性。例如,劑量還可以包含約1 mg/kg/體重至約1000 mg/kg/體重(這個此類範圍包括插入劑量)或更多/施用,以及可從其中得出的任何範圍。在可從本文列出的數目得出的範圍的非限制性實例中,可以施用約5 mg/kg/體重至約100 mg/kg/體重、約5 mg/kg/體重至約500 mg/kg/體重等的範圍。在任何情況下,負責施用的從業者將確定組合物中的活性成分的濃度以及用於個別受試者的適當劑量。
活性化合物可以配製用於腸胃外施用,例如配製用於經由靜脈內、肌內、皮下或甚至腹膜內途徑注射。通常,此類組合物可以製備為液體溶液或懸浮液;也可以製備適用於在注射前加入液體後製備溶液或懸浮液的固體形式;並且製劑也可以是乳化的。
適合於注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散體;包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的製劑;以及用於臨時製備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。在所有情況下,形式優選應該是無菌的,並且優選應該流動至它可以容易注射的程度。它還應該在製造和貯存條件下是穩定的,並且優選應該針對微生物如細菌和真菌的污染作用進行防腐。
蛋白質組合物可以配製成中性或鹽形式。藥學可接受的鹽包括酸加成鹽(由蛋白質的游離氨基形成),並且由無機酸例如鹽酸或磷酸,或此類有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等形成。由游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵,以及此類有機堿例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等等。
藥物組合物可以包括溶劑或分散介質,其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)、其合適混合物和植物油。適當的流動性可以例如通過使用包衣例如卵磷脂、通過在分散體的情況下維持所需的細微性以及通過使用表面活性劑得到維持。可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑來達到微生物作用的預防,所述抗細菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等。在許多情況下,優選包括等滲劑,例如糖或氯化鈉。可以通過在組合物中使用延遲吸收的試劑,例如單硬脂酸鋁和明膠,來達到可注射組合物的延長吸收。
試劑盒和診斷
在實施方案的各個方面,設想了含有治療劑和/或其它治療劑和遞送劑的試劑盒。在一些實施方案中,本實施方案考慮了用於製備和/或施用實施方案的療法的試劑盒。試劑盒可以包括一個或多個密封小瓶,其含有本實施方案的任何藥物組合物。試劑盒可以包括例如至少一種抗TfR抗體,以及製備、配製和/或施用實施方案的組分或者執行本發明方法的一個或多個步驟的試劑。在一些實施方案中,試劑盒還可以包括合適的容器,其是不與試劑盒的組分反應的容器,例如Eppendorf管、測定板、注射器、瓶子或管。容器可以由可滅菌的材料例如塑膠或玻璃製成。
試劑盒可以進一步包括說明書,其概述了本文所述方法的程式步驟,並且將遵循與本文所述或本領域普通技術人員已知的基本上相同的程式。說明資訊可以在含有機器可讀指令的電腦可讀介質中,當使用電腦執行時,所述指令導致遞送藥學有效量的治療劑的真實或虛擬程式的展示。
實施例
除非另有說明,否則由本文下文描述的實驗和實施例生成的資料可以在“Enhanced anti-angiogenetic effect of transferrin receptor-mediated delivery of VEGF-trap in a glioblastoma mouse model”,
MABS,2022,第14卷,第1期,e2057269 (12頁)中找到;所述參考文獻通過引用以其整體併入本文。
實驗結果
TfR 抗 體 的生成 為了生成結合muTfR的抗體,利用了來自噬菌體展示的scFv人抗體文庫的篩選策略(Zhao,S.等人,
Partial Leptin Reduction as an Insulin Sensitization and Weight Loss Strategy.Cell Metab,2019.
30(4):第706-719.e6頁)。簡言之,通過噬菌體淘選和噬菌體ELISA富集,並且從由第三輪淘選中挑選的總共400個噬菌體克隆中進行鑒定了與muTfR細胞外結構域(ECD)結合的38個scFv克隆。然後將38個muTfR結合scFv克隆轉換成人IgG1,用於通過生物層干涉法(BLI)測定的結合確認。在BLI測定中確認了與muTfR結合的6種IgG1抗體。令人驚訝的是,當就結合293T細胞的細胞表面上表達的muTfR篩選6種IgG1抗體時,6種抗體中僅1種(Ab4)結合細胞表面表達的TfR。
表徵 Ab4 與 其 為 TfR 的天然配 體 的 轉鐵 蛋白 (Tf) 的 競爭 Tf在中性pH下以高親和力與TfR結合(Giannetti,A.M.等人,
Mechanism for multiple ligand recognition by the human transferrin receptor.PLoS Biol,2003.
1(3):第E51頁)。Tf在血清中以約3 mg/mL的極高濃度存在(Wessling-Resnick,M.,
Crossing the Iron Gate: Why and How Transferrin Receptors Mediate Viral Entry.Annual review of nutrition,2018.
38:第431-458頁)。因此,與Tf競爭的任何抗體將無法與TfR結合,致使抗體無效。此外,與Tf競爭結合TfR可能阻礙正常的鐵遞送到細胞內。使過表達muTfR的HEK293T細胞與Ab4和過高濃度的muTf (10 mM)一起共溫育,並且沒有檢測到與細胞表面muTfR的抗體結合中的差異,提示了Ab4與細胞表面上的muTfR特異性地結合,而不被Tf阻斷。雖然不希望受任何特定機制的束縛,但Ab4可以與TfR的頂端結構域結合。基於其頂端結構域替換為來自muTfR的相應頂端結構域的嵌合huTfR受體的構建(huTfR-muTfR頂端結構域);並且觀察到單獨的muTfR頂端結構域足以允許Ab4與嵌合的huTfR-muTfR頂端結構域受體結合。Ab4不與人TfR交叉反應,儘管小鼠和人TfR的頂端結構域之間的同一性百分比為70%。
VEGF-Trap 雙 特 異 性抗 體 表徵 通過摻入VEGF-Trap和muTfR Ab4產生了兩種雙特異性抗體。VEGF-Trap基於阿柏西普進行設計,所述阿柏西普是VEGFR1的D2結構域、VEGFR2的D3結構域和人Fc片段的融合蛋白(Holash,J.等人,
VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects.Proc Natl Acad Sci U S A,2002.
99(17):第11393-8頁)。Ab4以Fab形式與VEGF-Trap的C末端融合。具有完整Fc效應子功能的TfR靶向抗體已顯示耗竭網織紅細胞並導致急性毒性(Couch,J.A.等人,
Addressing safety liabilities of TfR bispecific antibodies that cross the blood-brain barrier.Sci Transl Med,2013.
5 (183):第183ra57,1-12頁)。為了避免Fc介導的效應子功能,引入了LALAPG突變(L234A、L235A和P329G),以消除與人和小鼠中的Fc受體的相互作用(Wang,X.,M. Mathieu和R.J. Brezski,
IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions.Protein & cell,2018.
9(1):第63-73頁;Schlothauer,T.等人,
Novel human IgG1 and IgG4 Fc-engineered antibodies with completely abolished immune effector functions.Protein Eng Des Sel,2016.
29(10):第457-466頁)。對於單價TfR雙特異性設計(VEGF-Trap/moAb4),引入KiH突變(旋鈕:T366W和S354C;孔:T366S、L368A、Y407V和Y349C),以促進重鏈之間的異源二聚化(Schaefer,W.等人,
Immunoglobulin domain crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG antibodies.Proc Natl Acad Sci U S A,2011.
108(27):第11187-92頁)。TfR Ab融合臂被引入“孔”突變,而另一臂帶有“旋鈕”突變。對於二價TfR雙特異性設計(VEGF-Trap/biAb4),使用從N末端到C末端具有Ab4的VEGF-Trap融合物的同源二聚體,導致關於VEGF-Trap和Ab4兩者的二價。
為了表徵雙特異性抗體,使用基於BLI的夾心捕獲測定。首先經由VEGF165A將雙特異性抗體捕獲到感測器上。在空白緩衝液中平衡後,然後使感測器捕獲的雙特異性抗體與muTfR ECD一起溫育。VEGF-Trap/TfR雙特異性抗體顯示與VEGF165和TfR兩者同時結合。為了進一步驗證抗原結合,我們引入了另外三個對照組,其缺失了三種結合配偶體(VEGFA、Ab或TfR)之一。省略VEGFA顯示了完全平坦的曲線,其確認了曲線A和E中觀察到的結合信號取決於被VEGFA捕獲的蛋白質,曲線B和F)。當感測器浸入TfR溶液內時,省略Ab顯示了平坦的曲線,其確認了曲線A和E中觀察到的TfR結合信號取決於抗體的存在。最後,不含TfR的平坦曲線確認了曲線A和E中觀察到的結合信號是與TfR的抗體結合。總的來說,這些資料顯示了二價和單價TfR雙特異性抗體VEGF-Trap/moAb4和VEGF-Trap/biAb4均可以同時接合VEGF和TfR兩者。
Ab4 不干 擾 TfR 與 其配 體 Tf 的 結 合,提示了抗 體將 不干 擾 TfR 的天然功能 為了證實雙特異性抗體可以觸發細胞內吞作用,其促進了抗體通過TfR的有效轉胞吞作用。使用小鼠內皮BEnd.3細胞,我們顯示了帶有二價或單價TfR Ab4的雙特異性抗體的濃度依賴性內吞作用。作為陰性對照,當細胞和抗體在4℃下溫育時,內吞作用被消除。值得注意的是,帶有二價和單價TfR Ab的雙特異性抗體顯示了跨越所有濃度的相似水準的內吞作用。
抗 體 介 導 的 TfR 內 吞作用 對 TfR 細 胞表面表 達 水 準 具有影 響 天然地,TfR內吞作用將轉鐵蛋白遞送到內體內,在其中Tf釋放鐵,並且TfR-Tf複合物再迴圈回細胞表面(Wessling-Resnick,M.,
Crossing the Iron Gate: Why and How Transferrin Receptors Mediate Viral Entry.Annual review of nutrition,2018.
38:第431-458頁)。我們測量了在與雙特異性抗體溫育後的TfR細胞表面水準。與VEGF-Trap陰性對照類似,帶有單價TfR Ab的雙特異性抗體VEGF-Trap/moAb4未顯示細胞表面TfR水準的減少。相比之下,二價雙特異性抗體(VEGF-Trap/biAb4)處理的BEnd.3細胞證實了細胞表面TfR水準的濃度依賴性減少,並且在100 nM下,表面TfR減少到無法檢測的水準。作為對照,與溶酶體抑制劑Baf一起共溫育顯著降低或消除了通過二價雙特異性抗體VEGF-Trap/biAb4的表面TfR水準減少。雖然不希望受任何特定機制的束縛,但資料提示了二價TfR抗體VEGF-Trap/biAb4通過促進其溶酶體降解來誘導細胞表面TfR水準的降低。通過用兩種雙特異性抗體處理BEnd.3細胞,並且通過蛋白質印跡測量總TfR蛋白水準,消除了二價抗體誘導細胞內TfR重新定位的可能性。BEnd.3細胞中的總TfR水準在VEGF-Trap處理組和VEGF-Trap/moAb4處理組之間是相似的。相比之下,VEGF-Trap/biAb4處理顯著縮減了總TfR蛋白水準。作為對照,溶酶體抑制劑Baf的共溫育能夠預防通過VEGF-Trap/biAb4處理介導的總TfR水準的降低,確認了二價抗體誘導TfR溶酶體降解。
人內皮細胞系HUVEC已成為評估抗血管生成治療劑的功效的金標準(Holash,J.等人,
VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects.Proc Natl Acad Sci U S A,2002.
99(17):第11393-8頁;Robinson,C.J.等人,
The World Health Organization reference reagent for vascular endothelial growth factor , VEGF165.Growth Factors,2006.
24(4):第285-90頁),並且在耗竭生長因數和細胞因數的條件下,通過兩種雙特異性抗體抑制VEGFA刺激的HUVEC細胞增殖。VEGF-Trap/biAb4和VEGF-Trap/moAb4雙特異性抗體顯示了與VEGF-Trap陽性對照相似的VEGFA介導的HUVEC增殖的劑量依賴性抑制。
TfR 雙 特 異 性抗 體 通 過競爭 性 ELISA 對 TfR 的 結 合 親 和力 ELISA板用muTfR ECD進行包被,並且在1 nM生物素化的Ab4的存在下,加入一系列濃度的TfR雙特異性抗體。1 nM Ab4濃度預先確定為在定量未結合TfR的量方面足夠靈敏,但濃度足夠低,而不干擾雙特異性TfR抗體的結合。VEGF-Trap/moAb4和VEGF-Trap/biAb4雙特異性抗體兩者均顯示了與muTfR的劑量依賴性結合,如通過來自生物素化Ab4的OD
450信號降低所指示的。相比之下,與VEGF-Trap/moAb4相比,VEGF-Trap/biAb4顯示了明顯更強(約100倍)的TfR佔據(結合)。不受理論的束縛,這提示了親合力可能在二價雙特異性抗體的TfR結合中起重要作用。
VEGF-Trap TfR 雙 特 異 性 抗體在小鼠的腦和血清中的生物分佈 在抗體以20 mg/kg的單次腹膜內(IP)注射後一天,收集小鼠的血清和腦。根據先前的出版物,選擇二十(20) mg/kg作為治療劑量。在徹底灌注PBS之後收集腦,以避免來自血管系統中的殘留血液的干擾。夾心ELISA用於定量腦內部的雙特異性抗體濃度。在夾心ELISA中,雙特異性抗體首先通過板包被的VEGFA進行捕獲,然後捕獲的抗體通過二抗進行檢測。VEGF-Trap/moAb4雙特異性抗體在腦中以明顯高於VEGF-Trap/biAb4和VEGF-Trap的濃度存在。VEGF-Trap/moAb4顯示了在腦濃度方面超過VEGF-Trap/Ctrl的10倍增加,以及超過VEGF-Trap/biAb4的5倍增加。即使VEGF-Trap/biAb4誘導顯著的TfR溶酶體降解,但它仍顯示了在腦濃度方面超過VEGF-Trap/Ctrl的2倍增加。時間過程跟蹤顯示,腦中的VEGF-Trap/moAb4濃度隨著時間過去而降低,並且在注射後24小時觀察到腦中的最高濃度。在同一時間過程期間,VEGF-Trap/Ctrl維持低於1 nM的持續低水準。
當雙特異性抗體的血清濃度通過相同的夾心ELISA進行定量時。VEGF-Trap/moAb4和VEGF-Trap/biAb4雙特異性抗體的血清濃度顯著低於VEGF-Trap/Ctrl。VEGF-Trap/biAb4濃度是血清中的VEGF-Trap/moAb4的60%。在一周過程內的血清抗體濃度提供了更完整的PK概況。VEGF-Trap/Ctrl在一周內僅經歷了30%的降低,但相比之下,VEGF-Trap/moAb4雙特異性抗體在同一時間段內經歷了明顯更快的清除。
通 過 免疫 螢 光染色 來 定位 腦 中的抗 體 如所示的,VEGF-Trap/moAb4顯示了佔優勢的腦實質分佈。CD31進行共染色以辨別血管,並且抗體截留在血管內部。相比之下,VEGF-Trap/biAb4顯示了在血管內的定位,並且因此很可能截留在血管中,而沒有進入腦實質。值得注意的是,VEGF-Trap/Ctrl顯示幾乎沒有分佈在血管或腦實質中。
由於VEGF-Trap/biAb4在體外誘導TfR的快速降解,因此它在體內進行測試。如通過蛋白質印跡測量的,VEGF-Trap/biAb4誘導腦中的TfR濃度的顯著降低。相比之下,VEGF-Trap/Ctrl和VEGF-Trap/moAb4未誘導腦TfR的量的變化。不受理論束縛,這些綜合資料提示了VEGF-Trap/ biAb4雙特異性抗體誘導體內的TfR降解。
腫 瘤血管生成的抑制 為了確定經由TfR雙特異性抗體遞送VEGF-Trap是否可以通過克服U-87 MG模型中的BBB阻斷來改善VEGF-Trap的抗血管生成效應,所述U-87 MG模型是具有已知BBB滲漏的人GBM模型(Brighi,C.等人,
Comparative study of preclinical mouse models of high-grade glioma for nanomedicine research: the importance of reproducing blood-brain barrier heterogeneity.Theranostics,2020.
10(14):第6361-6371頁)。
在U-87 MG GBM研究中使用了三種抗體。首先驗證了VEGF-Trap治療後BBB滲透性的變化。為了評價BBB滲透性,在處死前2小時給動物注射螢光標記的白蛋白分子。如通過腫瘤中的白蛋白信號所指示的,Ctrl/moAb4治療的小鼠顯示了明顯的BBB滲漏。相比之下,VEGF-Trap/Ctrl治療導致腫瘤中顯著更低的白蛋白信號,其指示了低BBB滲透性。與VEGF-Trap/Ctrl類似,在VEGF-Trap/moAb4治療的腫瘤中檢測到的白蛋白量也很低。不受理論束縛,這些綜合資料提示了VEGF-Trap治療可以恢復BBB的完整性,對大分子具有低滲透性。靶向TfR的VEGF-Trap/moAb4雙特異性抗體通過增加VEGF-Trap的腦接近來增強血管生成的抑制。腫瘤中的血管生成的特徵在於內皮細胞標記物CD31的免疫染色(Scholz,A.等人,
Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma.EMBO Mol Med,2016.
8(1):第39-57頁)。與Ctrl/moAb4相比,VEGF-Trap/moAb4雙特異性抗體治療顯示了腫瘤中顯著減少的CD31強度,而對照抗體構建體VEGF-Trap/Ctrl證實沒有觀察到Ctrl/moAb4和VEGF-Trap/Ctrl之間的CD31強度差異。不受理論束縛,這些綜合資料提示了增強的VEGF-Trap/moAb4雙特異性腦進入轉化為改善的抗血管生成功效。
實 施例: 利用的材料和方法 細 胞系 HEK293T、U-87 MG和BEnd.3細胞系獲自美國典型培養物保藏中心(ATCC),並且在DMEM+10% FBS中進行培養。HUVEC也獲自ATCC,並且在補充有0.1 mg/mL肝素、10% FBS、30 μg/mL內皮細胞生長補充劑(ECGS)的F-12K培養基中維持。
噬菌 體 展示的抗 體 文 庫 的淘 選 先前製備了噬菌體展示的scFv抗體文庫(Zhao,S.等人,
Partial Leptin Reduction as an Insulin Sensitization and Weight Loss Strategy.Cell Metab,2019.
30(4):第706-719.e6頁)。關於muTfR特異性抗體文庫的淘選如先前所述進行,伴隨修改(Zhao,S.等人,
Partial Leptin Reduction as an Insulin Sensitization and Weight Loss Strategy.Cell Metab,2019.
30(4):第706-719.e6頁)。簡言之,MaxiSorp Nunc-Immuno管(Thermo Fisher Scientific)在4℃下用20 μg/mL muTfR-His的DPBS溶液包被過夜。在用DPBS洗滌後去除未結合的抗原。在用5%乳的DPBS封閉表面後,使噬菌體文庫與包被的muTfR一起在室溫下在5%乳中溫育2小時。在用PBS+0.05% tween-20洗滌以去除未結合的噬菌體後,通過與100 mM TEA一起溫育20分鐘來洗脫捕獲的噬菌體。洗脫的噬菌體感染的對數期生長的大腸桿菌TG1在30℃下在2x YTAG瓊脂500cm²方形板(Corning)上擴增過夜。使用M13KO7輔助噬菌體,擴增的噬菌體感染的TG1用於製備噬菌體用於下一輪淘選。使用來自前一輪的輸出作為用於下一輪的輸入,在三輪中完成富集過程。
在三輪淘選後,測量輸出滴度,並且單個菌落用於製備用於ELISA的噬菌體。高結合ELISA板(Corning)在4℃下用2 μg/mL的muTfR-His包被過夜。在用5%乳的PBS封閉後,使在5%乳的PBS中由單個TG1菌落製備的噬菌體與包被的muTfR一起在室溫下溫育1小時。在用PBS+0.05% Tween-20洗滌後,加入1:2000濃度的抗M13-HRP (Santa Cruz Biotechnology),並且在室溫下溫育1小時。在用PBS+0.05% Tween-20洗滌後,加入TMB底物(Thermo Fisher Scientific)並且溫育5分鐘,然後通過1N H
2SO
4終止。在450 nm處讀取OD值。選擇了前20%的高結合克隆。使用Qiagen BioRobot Universal System以96孔形式提取噬菌粒。在DNA測序後,使用IMGT V-quest服務分析序列,以鑒定具有獨特CDR3區的抗體序列。
噬菌 體 scFv 至 IgG 的 轉換 使用具有簡並性的混合通用引物,將獨特的scFv克隆轉換成人IgG1,如先前報導的(Zhao,S.等人,
Partial Leptin Reduction as an Insulin Sensitization and Weight Loss Strategy.Cell Metab,2019.
30(4):第706-719.e6頁)。使用PrimeStar GXL聚合酶(Takara Bio)擴增個別重和輕可變鏈。使用In-Fusion HD克隆酶混合物(Takara Bio),將凝膠純化的可變鏈片段克隆到消化的載體內。在對轉換的質粒進行測序後,將驗證的IgG質粒的序列以2 mL的規模轉染到Expi293細胞內。在培養5天后,去除細胞並收集含有抗體的上清液用於篩選測定。
對於毫克級抗體純化,Expi293產生的抗體使用CaptivA蛋白A親和樹脂(Repligen)進行純化,並且用0.1M甘氨酸(pH=2.5)進行洗脫,然後用1/20體積的1M Tris-HCl (pH=9)進行中和。使用Amicon Ultra-15超濾單元(Mw截斷=30k) (MilliporeSigma)完成至DPBS的緩衝液更換。
表 達 TfR 的 293T 生成 使用慢病毒生成表達全長小鼠和人TfR或嵌合受體的HEK293T。簡言之,將受體基因克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro載體內的CMV啟動子下游。293T細胞系通過用包裝的慢病毒(使用轉移質粒pCMV-VSV-G (Addgene 8454)、pCMV delta R8.2 (Addgene 12263)生成)轉導而生成。表達轉基因的細胞通過1 μg/mL嘌呤黴素進行選擇,直到出現足夠數目的具有轉基因的細胞。
通 過 BLI 的 雙 特 異 性抗 體驗證 鏈黴抗生物素蛋白感測器(Fortebio)用於捕獲生物素化的VEGFA蛋白(Sino Biological)。在所有溫育步驟期間,樣品在室溫下保持,伴隨1000 rpm振盪。在VEGFA裝載步驟中,使100 nM生物素化的VEGFA蛋白與感測器一起溫育指定的時間。在雙特異性抗體相互作用步驟中,使用了200 nM抗體。在muTfR溫育步驟中,使用了100 nM muTfR-His (Sino Biological)。在溫育之間,將感測器浸入空白動力學緩衝液內,以允許蛋白質的自由解離。
抗 體內 吞作用 使總共5x10
4個BEnd.3細胞與抗體一起在指定的濃度和溫度下溫育2小時。抗體用Alexa Fluor 488 NHS (ThermoFisher)進行預標記。在溫育後,通過以500 g離心5分鐘去除未結合的抗體。使台盼藍溶液(0.2%)與細胞一起溫育5分鐘,以淬滅細胞表面結合的抗體螢光。然後將細胞轉移到V形底96孔板內,並且通過350 g 5分鐘離心洗滌兩次。使用收集至少10,000個活細胞的iQue3高通量流式細胞儀(Sartorius),對內吞作用進行定量。
免疫印 跡 通過伴隨振盪,使用NP-40裂解緩衝液(1% NP40,50 mM Tris-HCl,pH=8,150 mM NaCl)裂解細胞或腦組織1小時,來獲得細胞裂解物或腦裂解物,所述NP-40裂解緩衝液具有Halt™ Protease和Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) (ThermoFisher)。在通過離心去除碎片後,總蛋白量通過Pierce BCA Protein Assay Kit (ThermoFisher)進行標準化。蛋白質樣品通過10% SDS-聚丙烯醯胺凝膠(BIO-RAD)進行分辨,然後轉移到Immun-Blot PVDF膜(BIO-RAD)上。用在5% BSA TBST中稀釋的特異性一抗和二抗來探測蛋白質(Zhong,L.等人,
Amyloid-beta modulates microglial responses by binding to the triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2).Mol Neurodegener,2018.
13 (1):第15頁;Zhao,Y.等人,
TREM2 Is a Receptor for β-Amyloid that Mediates Microglial Function.Neuron,2018.
97(5):第1023-1031.e7頁;Chen,H.-M.等人,
Blocking immunoinhibitory receptor LILRB2 reprograms tumor-associated myeloid cells and promotes antitumor immunity.The Journal of Clinical Investigation,2018.
128(12):第5647-5662頁)。使用的抗體是TfR (Santa Cruz,1:1000)和肌動蛋白-β (Santa Cruz,1:1000)。免疫反應條帶用West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate (ThermoFisher)進行顯現。使用ImageJ對免疫反應條帶進行定量。用所示的代表性免疫印跡進行三個獨立的治療重複。
HUVEC 細 胞生 長測 定 維持在完全生長培養基中的HUVEC細胞在測定前1天以1x10
4/孔的密度接種到96孔板內的測定培養基(F12K+ 2% FBS)中,所述測定培養基具有50 ng/mL人VEGFA (Sino Biological),但不含生長因數的補充。為了開始測定,將培養基更換為具有指定抗體的測定培養基並且再培養2天。根據製造商的方案,使用MTS測定(Promega),對細胞活力進行定量。
TfR 佔據測 定 高結合ELISA板(Corning)在4℃下用2 μg/mL的muTfR-His包被過夜。在用1% BSA PBS封閉後,使1% BSA PBS中的各種抗體(以指定濃度)和1 nM生物素化的TfR Ab4與包被的muTfR一起在室溫下溫育2小時。在用PBS+0.05% Tween-20洗滌後,加入1:5000濃度的鏈黴抗生物素蛋白-HRP (Jackson ImmunoResearch),並且在室溫下溫育1小時。在用PBS+0.05% Tween-20洗滌後,加入TMB底物(Thermo Fisher Scientific)並溫育5分鐘,然後通過1N H
2SO
4終止。在450 nm處讀取OD值。
抗 體腦 分 佈 研究 動物實驗根據機構指南與批准的方案AWC-19-0051進行。BALB/C小鼠(雌性,8周齡,Jackson Laboratory)隨機分組成5只小鼠/組。小鼠接受在0.1 mL DPBS中的抗體(20 mg/kg)的腹膜內注射。在指定的時間點,經由尾靜脈收集血液,然後小鼠接受通過DPBS以2 mL/分鐘的經心灌注10分鐘。收集腦,其中一半在液氮中快速冷凍,而另一半準備用於冷凍切片。對於免疫螢光,將半個小鼠腦浸入4% PFA內1天,然後浸入30%蔗糖內2天,然後在OCT介質(Sakura)內包埋,並且使用Leica Cryostat CM1950切片成40 μm浮動切片。浮動切片在4℃下貯存於含有0.01%疊氮化鈉的PBS中直至使用。
腦 和血清中的抗 體濃 度的 測 量 高結合ELISA板(Corning)在4℃下用2 μg/mL的人VEGFA (Sino Biological)包被過夜。在用1% BSA PBS封閉後,使個別腦裂解物與包被的VEGFA一起在室溫下溫育2小時。在用PBS+0.05% Tween-20洗滌後,加入1:5000濃度的抗人Fc-HRP (Jackson ImmunoResearch),並且在室溫下溫育1小時。在用PBS+0.05% Tween-20洗滌後,加入TMB底物(Thermo Fisher Scientific)並溫育5分鐘,然後通過1N H
2SO
4終止。在450 nm處讀取OD值。遵循上文所述相同的方法,使用純化的相應雙特異性抗體建立標準曲線。
小鼠 腦 的免疫 螢 光染色 浮動切片首先在具有0.3% Triton X-100的1% BSA PBS中封閉2小時,然後伴隨輕輕搖動,在4℃下在具有0.3% Triton X-100的1% BSA PBS中用以下相應抗體染色過夜:CD31 (1:500,R&D system)、人Fc (1:1000,Jackson Immunoresearch)、或鏈黴抗生物素蛋白-Alexa Fluor 488 (1:500,Jackson Immunoresearch)。在PBS 0.3% Triton X-100中洗滌後,使具有螢光標記的相應二抗與腦切片一起在4℃下溫育2小時,伴隨輕輕搖動。核用TO-PRO-3 (2 µM)的DPBS染色30分鐘。使用Leica共聚焦顯微鏡,對腦切片進行成像。
U-87 MG 異種 移植模型 將NSG小鼠(雌性,8周齡,Jackson Laboratory)隨機分組成3只小鼠/組。使用立體定向注射框架,小鼠在尾狀核中用5x10
5個U-87 MG細胞進行植入。在腫瘤植入後五天,小鼠接受在0.2 mL無菌PBS中20 mg/kg的指定抗體的腹膜內注射。注射後四天,處死所有小鼠,並且如上所述保存腦並進行冷凍切片。為了觀察小鼠存活,每天記錄體重。達到20%體重降低的任何小鼠都被視為達到實驗終點並被實施安樂死。
蛋白 質 序列分析 使用T-Coffee多重序列比對伺服器執行蛋白質序列比對,並且在ESPript - http://espript.ibcp.fr. (Robert,X.和P. Gouet,Deciphering key features in protein structures with the new ENDscript server. Nucleic Acids Res,2014. 42(Web Server issue):第W320-4頁)中生成比對圖。使用DeepView-Swiss-PdbViewer,版本4.1顯現晶體結構。
統計 分析 GraphPad Prism (v8,GraphPad Software)用於生成圖並且執行統計分析。使用雙尾斯氏t檢驗,將統計差異確定為在p < 0.05下是顯著的。資料表示為平均值± SD。
上文描述且在附圖中說明的實施方案僅通過示例的方式呈現,並不預期作為對本公開內容的概念和原理的限制。因此,本領域普通技術人員將瞭解,要素及其配置和佈置的各種變化是可能的,而不背離本公開內容的精神和範圍。在下述實施方案中闡述了本公開內容的各種特徵和方面。
實施例1:人和食蟹猴TfR交叉反應性克隆的鑒定
淘選以鑒定交叉反應性克隆。通過針對食蟹猴TfR淘選第2輪人TfR噬菌體輸出來富集且鑒定交叉反應性克隆。
淘選方法:通過在第1輪和第2輪中針對人TfR淘選並且在第3輪中針對食蟹猴TfR淘選來進行詳細的淘選。蛋白質購自Sino Biologicals:huTfR 11020-H07H、食蟹猴TfR 90253-C07H。在淘選過程期間,在溶液中包括0.1 mg/mL人轉鐵蛋白(Tf,R&D 2914-HT),以便阻斷與Tf競爭結合TfR的噬菌體。
詳細的淘選方法:先前製備了噬菌體展示的scFv抗體文庫(S. Zhao等人,Partial Leptin Reduction as an Insulin Sensitization and Weight Loss Strategy. Cell metabolism 30,706-719.e706 (2019))。關於TfR特異性抗體文庫的淘選如先前所述進行,伴隨修改。簡言之,MaxiSorp Nunc-Immuno管(Thermo Fisher Scientific)在4℃下用20 μg/mL TfR蛋白的DPBS包被過夜。在用DPBS洗滌後去除未結合的抗原。在用5%乳的DPBS封閉表面後,使噬菌體文庫與包被的TfR一起在室溫下在5%乳中溫育2小時。在用PBS+0.05% tween-20洗滌以去除未結合的噬菌體後,通過與100 mM TEA一起溫育20分鐘來洗脫捕獲的噬菌體。然後,洗脫的噬菌體感染的對數期生長的大腸桿菌TG1在30℃下在2x YTAG瓊脂500cm²方形板(Corning)上擴增過夜。使用M13KO7輔助噬菌體,擴增的噬菌體感染的TG1用於製備噬菌體,用於下一輪淘選。使用來自前一輪的輸出作為用於下一輪的輸入,在三輪中完成富集過程。
噬菌體ELISA法:在三輪淘選後,測量輸出滴度,並且單個菌落用於製備用於ELISA的噬菌體。高結合ELISA板(Corning)在4℃下用2 μg/mL的TfR包被過夜。在用5%乳的PBS封閉後,使在5%乳PBS中由單個TG1菌落製備的噬菌體與包被的TfR一起在室溫下溫育1小時。在用PBS+ 0.05% Tween-20洗滌後,加入1:2000濃度的抗M13-HRP (Santa Cruz Biotechnology),並且在室溫下溫育1小時。在用PBS+0.05% Tween-20洗滌後,加入TMB底物(Thermo Fisher Scientific)並且溫育5分鐘,然後通過1N H
2SO
4終止。在450 nm處讀取OD值。選擇了前20%的高結合克隆。使用Qiagen BioRobot Universal System以96孔形式提取噬菌粒。在DNA測序後,使用IMGT V-quest服務分析序列,以鑒定具有獨特CDR3區的抗體序列。
淘選結果,噬菌體ELISA:在第3輪淘選後鑒定了交叉反應性克隆。在輸出中,約8%的克隆顯示了對人和食蟹猴TfR兩者的交叉反應性。
淘選結果,獨特的克隆:然後,對所有克隆進行測序,並且鑒定了18種獨特的抗體scFv序列。
轉換成人IgG1形式:18種獨特的IgG分子在Expi293F細胞中進行轉換且產生。使用蛋白A瓊脂糖珠來純化蛋白質。
對於結合TfR篩選純化的抗體:
使用Octet對於結合人TfR ECD和Cyno TfR ECD研究純化的抗體。
轉換成人IgG1形式:18種獨特的IgG分子在Expi293F細胞中進行轉換且產生。使用蛋白A瓊脂糖珠來純化蛋白質。
對於結合TfR篩選純化的抗體:
使用Octet對於結合人TfR ECD和Cyno TfR ECD研究純化的抗體。在18種候選物內,10種抗體顯示了與人和cyno TfR ECD兩者的結合:1B2、1C8、2C3、3H8、4G1、5B6、7A1、7B10、8A5、8G5。
4G1和5B6的KD測量:從鑒定的10種結合候選物中,選擇4G1和5B6作為最終候選物,並且使用連續稀釋的抗原濃度進一步測量它們的KD值(表A中的資料)。4G1和5B6具有令人滿意的KD值。
實施方案列表
1. 一種分離的單克隆抗體,其中所述抗體與TfR特異性地結合,並且其中所述抗體與選自1B2、1C8、2C3、3H8、4G1、5B6、7A1、7B10、8A5、8G5、mTfR-2、mTfR-4、mTfR5、mTfR-42、mTfR-59、hTfR-1、hTfR-1、hTfR-1和hTfR-1的抗體競爭結合TfR表位。
2. 實施方案1的抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體包含:
(a)與1B2 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 156)、1C8 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 158)、2C3 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 160)、3H8 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 162)、4G1 VLCDR1 IMGT (SEQ ID NO: 164)、5B6VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 166)、7A1 VL CDR1 IMGT(SEQ ID NO: 168)、7B10 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 170)、8A5 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 172)、8G5 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 174)、mTfR-2LCDR1-AA (SEQ ID NO: 28)、mTfR-4LCDR1-AA (SEQ ID NO: 31)、mTfR-5LCDR1-AA (SEQ ID NO: 34)、mTfR-42LCDR1-AA (SEQ ID NO: 37)、mTfR-59LCDR1-AA (SEQ ID NO: 40)、hTfR-1LCDR1-AA (SEQ ID NO: 43)、hTfR-20LCDR1-AA (SEQ ID NO: 46)、hTfR-13LCDR1-AA (SEQ ID NO: 49)、或hTfR-30LCDR1-AA (SEQ ID NO: 52)至少80%等同的第一V
L區;
(b)與選自QDS、KAS、AAS、GND、GTS、YDS、EVS、LGS、SNI、ANS、SNN、DDN、RNN、EDN和DVS的三肽至少80%等同的第二V
LCDR;
(c)與1B2 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 157)、1C8 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 159)、2C3 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 161)、3H8 L CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 163)、4G1 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 165)、5B6 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 167)、7A1 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 169)、7B10 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 171)、8A5 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 173)、8G5 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 175)、mTfR-2LCDR3-AA (SEQ ID NO: 30)、mTfR-4LCDR3-AA (SEQ ID NO: 33)、mTfR-5LCDR3-AA (SEQ ID NO: 36)、mTfR-42LCDR3-AA (SEQ ID NO: 39)、mTfR-59LCDR3-AA (SEQ ID NO: 42)、hTfR-1LCDR3-AA (SEQ ID NO: 45)、hTfR-20LCDR3-AA (SEQ ID NO: 48)、hTfR-13LCDR3-AA (SEQ ID NO: 51)、或hTfR-30LCDR3-AA (SEQ ID NO: 54)至少80%等同的第三V
LCDR;
(d)與1B2 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 126)、1C8 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 129)、2C3 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 132)、3H8 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 135)、4G1 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 138)、5B6 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 141)、7A1 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 144)、7B10 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 147)、8A5 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 150)、8G5 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 153)、mTfR-2LHCDR1-AA (SEQ ID NO: 1)、mTfR-4HCDR1-AA (SEQ ID NO: 4)、mTfR-5HCDR1-AA (SEQ ID NO: 7)、mTfR-42HCDR1-AA (SEQ ID NO: 10)、mTfR-59HCDR1-AA (SEQ ID NO: 13)、hTfR-1HCDR1-AA (SEQ ID NO: 16)、hTfR-20HCDR1-AA (SEQ ID NO: 19)、hTfR-13HCDR1-AA (SEQ ID NO: 22)、或hTfR-30HCDR1-AA (SEQ ID NO: 25)至少80%等同的第一V
HCDR;
(e)與1B2 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 127)、1C8 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 130)、2C3 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 133)、3H8 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 136)、4G1 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 139)、5B6 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 142)、7A1 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 145)、7B10 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 148)、8A5 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 151)、8G5 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 154)、mTfR-2LHCDR2-AA (SEQ ID NO: 2)、mTfR-4HCDR2-AA (SEQ ID NO: 5)、mTfR-5HCDR2-AA (SEQ ID NO: 8)、mTfR-42-HCDR2-AA (SEQ ID NO: 11)、mTfR-59HCDR2-AA (SEQ ID NO: 14)、hTfR-1HCDR2-AA (SEQ ID NO: 17)、hTfR-20HCDR2-AA (SEQ ID NO: 20)、hTfR-13HCDR2-AA (SEQ ID NO: 23)、或hTfR-30HCDR2-AA (SEQ ID NO: 26)至少80%等同的第二V
HCDR;和
(f)與1B2 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 28)、1C8 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 131)、2C3 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 134)、3H8 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 137)、4G1 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 140)、5B6 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 143)、7A1 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 146)、7B10 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 149)、8A5 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 152)、8G5 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 155)、mTfR-2LHCDR3-AA (SEQ ID NO: 3)、mTfR-4HCDR3-AA (SEQ ID NO: 6)、mTfR-5CDR3-AA (SEQ ID NO: 9)、mTfR-42HCDR3-AA (SEQ ID NO: 12)、mTfR-59HCDR3-AA (SEQ ID NO: 15)、hTfR-1HCDR3-AA (SEQ ID NO: 18)、hTfR-20HCDR3-AA (SEQ ID NO: 21)、hTfR-13HCDR3-AA (SEQ ID NO: 24)、或hTfR-30HCDR3-AA (SEQ ID NO: 27)至少80%等同的第三V
HCDR。
3. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與(SEQ ID NO: 126)等同;
(b)第二V
HCDR與(SEQ ID NO: 127)等同;
(c)第三V
HCDR與(SEQ ID NO: 128)等同;
(d)第一V
LCDR與(SEQ ID NO: 156)等同;
(e)第二V
LCDR與三肽QDS等同;和
(f)第三V
LCDR與(SEQ ID NO: 157)等同。
4. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與(SEQ ID NO: 129)等同;
(b)第二V
HCDR與(SEQ ID NO: 130)等同;
(c)第三V
HCDR與(SEQ ID NO: 131)等同;
(d)第一V
LCDR與(SEQ ID NO: 158)等同;
(e)第二V
LCDR與三肽KAS等同;和
(f)第三V
LCDR與(SEQ ID NO: 159)等同。
5. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與(SEQ ID NO: 132)等同;
(b)第二V
HCDR與(SEQ ID NO: 133)等同;
(c)第三V
HCDR與(SEQ ID NO: 134)等同;
(d)第一V
LCDR與(SEQ ID NO: 160)等同;
(e)第二V
LCDR與三肽AAS等同;和
(f)第三V
LCDR與(SEQ ID NO: 161)等同。
6. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與(SEQ ID NO: 135)等同;
(b)第二V
HCDR與(SEQ ID NO: 136)等同;
(c)第三V
HCDR與(SEQ ID NO: 137)等同;
(d)第一V
LCDR與(SEQ ID NO: 162)等同;
(e)第二V
LCDR與三肽GND等同;和
(f)第三V
LCDR與(SEQ ID NO: 163)等同。
7. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與(SEQ ID NO: 138)等同;
(b)第二V
HCDR與(SEQ ID NO: 139)等同;
(c)第三V
HCDR與(SEQ ID NO: 140)等同;
(d)第一V
LCDR與(SEQ ID NO: 164)等同;
(e)第二V
LCDR與三肽GTS等同;和
(f)第三V
LCDR與(SEQ ID NO: 165)等同。
8. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與(SEQ ID NO: 141)等同;
(b)第二V
HCDR與(SEQ ID NO: 142)等同;
(c)第三V
HCDR與(SEQ ID NO: 143)等同;
(d)第一V
LCDR與(SEQ ID NO: 166)等同;
(e)第二V
LCDR與三肽YDS等同;和
(f)第三V
LCDR與(SEQ ID NO: 167)等同。
9. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與(SEQ ID NO: 144)等同;
(b)第二V
HCDR與(SEQ ID NO: 145)等同;
(c)第三V
HCDR與(SEQ ID NO: 146)等同;
(d)第一V
LCDR與(SEQ ID NO: 168)等同;
(e)第二V
LCDR與三肽EVS等同;和
(f)第三V
LCDR與(SEQ ID NO: 169)等同。
10. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與(SEQ ID NO: 147)等同;
(b)第二V
HCDR與(SEQ ID NO: 148)等同;
(c)第三V
HCDR與(SEQ ID NO: 149)等同;
(d)第一V
LCDR與(SEQ ID NO: 170)等同;
(e)第二V
LCDR與三肽LGS等同;和
(f)第三V
LCDR與(SEQ ID NO: 171)等同。
11. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與(SEQ ID NO: 150)等同;
(b)第二V
HCDR與(SEQ ID NO: 151)等同;
(c)第三V
HCDR與(SEQ ID NO: 152)等同;
(d)第一V
LCDR與(SEQ ID NO: 172)等同;
(e)第二V
LCDR與三肽SNI等同;和
(f)第三V
LCDR與(SEQ ID NO: 173)等同。
12. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與(SEQ ID NO: 153)等同;
(b)第二V
HCDR與(SEQ ID NO: 154)等同;
(c)第三V
HCDR與(SEQ ID NO: 155)等同;
(d)第一V
LCDR與(SEQ ID NO: 174)等同;
(e)第二V
LCDR與三肽ANS等同;和
(f)第三V
LCDR與(SEQ ID NO: 175)等同。
13. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與SEQ ID NO: 1等同;
(b)第二V
HCDR與SEQ ID NO: 2等同;
(c)第三V
HCDR與SEQ ID NO: 3等同;
(d)第一V
LCDR與SEQ ID NO: 28等同;
(e)第二V
LCDR與三肽SNN等同;和
(f)第三V
LCDR與SEQ ID NO: 29等同。
14. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與SEQ ID NO: 4等同;
(b)第二V
HCDR與SEQ ID NO: 5等同;
(c)第三V
HCDR與SEQ ID NO: 6等同;
(d)第一V
LCDR與SEQ ID NO: 30等同;
(e)第二V
LCDR與三肽DDN等同;和
(f)第三V
LCDR與SEQ ID NO: 31等同。
15. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與SEQ ID NO: 7等同;
(b)第二V
HCDR與SEQ ID NO: 8等同;
(c)第三V
HCDR與SEQ ID NO: 9等同;
(d)第一V
LCDR與SEQ ID NO: 32等同;
(e)第二V
LCDR與三肽RNN等同;和
(f)第三V
LCDR與SEQ ID NO: 33等同。
16. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與SEQ ID NO: 10等同;
(b)第二V
HCDR與SEQ ID NO: 11等同;
(c)第三V
HCDR與SEQ ID NO: 12等同;
(d)第一V
LCDR與SEQ ID NO: 34等同;
(e)第二V
LCDR與三肽AAS等同;和
(f)第三V
LCDR與SEQ ID NO: 35等同。
17. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與SEQ ID NO: 13等同;
(b)第二V
HCDR與SEQ ID NO: 14等同;
(c)第三V
HCDR與SEQ ID NO: 15等同;
(d)第一V
LCDR與SEQ ID NO: 36等同;
(e)第二V
LCDR與三肽EDN等同;和
(f)第三V
LCDR與SEQ ID NO: 37等同。
18. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與SEQ ID NO: 16等同;
(b)第二V
HCDR與SEQ ID NO: 17等同;
(c)第三V
HCDR與SEQ ID NO: 18等同;
(d)第一V
LCDR與SEQ ID NO: 38等同;
(e)第二V
LCDR與三肽DVS等同;和
(f)第三V
LCDR與SEQ ID NO: 39等同。
19. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與SEQ ID NO: 19等同;
(b)第二V
HCDR與SEQ ID NO: 20等同;
(c)第三V
HCDR與SEQ ID NO: 21等同;
(d)第一V
LCDR與SEQ ID NO: 40等同;
(e)第二V
LCDR與三肽AAS等同;和
(f)第三V
LCDR與SEQ ID NO: 41等同。
20. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與SEQ ID NO: 22等同;
(b)第二V
HCDR與SEQ ID NO: 23等同;
(c)第三V
HCDR與SEQ ID NO: 24等同;
(d)第一V
LCDR與SEQ ID NO: 42等同;
(e)第二V
LCDR與三肽AAS等同;和
(f)第三V
LCDR與SEQ ID NO: 43等同。
21. 實施方案2的分離的抗體,其中所述抗體包含:
(a)第一V
HCDR與SEQ ID NO: 25等同;
(b)第二V
HCDR與SEQ ID NO: 26等同;
(c)第三V
HCDR與SEQ ID NO: 27等同;
(d)第一V
LCDR與SEQ ID NO: 44等同;
(e)第二V
LCDR與三肽EVS等同;和
(f)第三V
LCDR與SEQ ID NO: 45等同。
22. 實施方案2的抗體,其中所述抗體包含:
(i)與1B2的V
H結構域或1B2氨基酸序列的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與1B2的V
L結構域或1B2氨基酸序列的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(ii)與1C8的V
H結構域或1C8氨基酸序列的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與1C8的V
L結構域或1C8氨基酸序列的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(iii)與2C3的V
H結構域或2C3氨基酸序列的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與2C3的V
L結構域或2C3氨基酸序列的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(iv)與3H8的V
H結構域或3H8氨基酸序列的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與3H8的V
L結構域或3H8氨基酸序列的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(v)與4G1的V
H結構域或4G1氨基酸序列的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與4G1的V
L結構域或4G1氨基酸序列的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(vi)與5B6的V
H結構域或5B6氨基酸序列的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與5B6的V
L結構域或5B6氨基酸序列的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(vii)與7A1的V
H結構域或7A1氨基酸序列的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與7A1的V
L結構域或7A1氨基酸序列的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(viii)與7B10的V
H結構域或7B10氨基酸序列的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與7B10的V
L結構域或7B10氨基酸序列的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(ix)與8A5的V
H結構域或8A5氨基酸序列的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與8A5的V
L結構域或8A5氨基酸序列的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(x)與8G5氨基酸序列的V
H結構域或8G5氨基酸序列的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與8G5氨基酸序列的V
L結構域或8G5 VL氨基酸序列的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(xi)與mTfR-2H-AA的V
H結構域(SEQ ID NO: 46)或mTfR-2H-AA的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與mTfR-2L-AA的V
L結構域(SEQ ID NO: 55)或mTfR-2L-AA的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(xii)與mTfR-4H-AA的V
H結構域(SEQ ID NO: 47)或mTfR-4H-AA的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與mTfR-4L-AA的V
L結構域(SEQ ID NO: 56)或mTfR-4L-AA的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(xiii)與mTfR-5H-AA的V
H結構域(SEQ ID NO: 48)或mTfR-5H-AA的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與mTfR-5L-AA的V
L結構域(SEQ ID NO: 57)或mTfR-5L-AA的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(xiv)與mTfR-42H-AA的V
H結構域(SEQ ID NO: 49)或mTfR-42H-AA的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與mTfR-42L-AA的V
L結構域(SEQ ID NO: 58)或mTfR-42L-AA的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(xv)與mTfR-59H-AA的V
H結構域(SEQ ID NO: 50)或mTfR-59H-AA的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與mTfR-59L-AA的V
L結構域(SEQ ID NO: 59)或mTfR-59L-AA的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(xvi)與hTfR-1H-AA的V
H結構域(SEQ ID NO: 51)或hTfR-1H-AA的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與hTfR-1L-AA的V
L結構域(SEQ ID NO: 60)或hTfR-1L-AA的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(xvii)與hTfR-20H-AA的V
H結構域(SEQ ID NO: 52)或hTfR-20H-AA的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與hTfR-20L-AA的V
L結構域(SEQ ID NO: 61)或hTfR-20L-AA的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;
(xviii)與hTfR-13H-AA的V
H結構域(SEQ ID NO: 53)或hTfR-13H-AA的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與hTfR-13L-AA的V
L結構域(SEQ ID NO: 62)或hTfR-13L-AA的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域;或
(xix)與hTfR-30H-AA的V
H結構域(SEQ ID NO: 54)或hTfR-30H-AA的人源化V
H結構域至少約80%等同的V
H結構域;以及與hTfR-30L-AA的V
L結構域(SEQ ID NO: 63)或hTfR-30L-AA的人源化V
L結構域至少約80%等同的V
L結構域。
23. 實施方案1-22中任何一個的抗體,其中所述抗體是重組的。
24. 實施方案1-22中任何一個的抗體,其中所述抗體是IgG、IgM、IgA或其抗原結合片段。
25. 實施方案1-22中任何一個的抗體,其中所述抗體是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、單價scFv、二價scFv或單結構域抗體。
26. 實施方案1-22中任何一個的抗體,其中所述抗體是人、人源化抗體或去免疫抗體。
27. 實施方案1-22中任何一個的抗體,其中所述抗體與成像劑綴合。
28. 一種嵌合抗原受體,其包含與前述實施方案中任何一個的單克隆抗體的抗原結合結構域至少80%等同的抗原結合結構域。
29. 一種組合物,其包含在藥學可接受的載體中的實施方案1-28中任何一個的抗體。
30. 一種分離的多核苷酸分子,其包含編碼實施方案1-27中任何一個的抗體的核酸序列。
31. 一種重組多肽,其包含抗體V
H結構域,所述抗體V
H結構域包含1B2的V
H結構域的CDR 1-3;1C8的V
H結構域的CDR 1-3;2C3的V
H結構域的CDR 1-3;3H8的V
H結構域的CDR 1-3;4G1的V
H結構域的CDR 1-3;5B6的V
H結構域的CDR 1-3;7A1的V
H結構域的CDR 1-3;7B10的V
H結構域的CDR 1-3;8A5的V
H結構域的CDR 1-3;或8G5的V
H結構域的CDR 1-3。
32. 一種重組多肽,其包含抗體V
L結構域,所述抗體V
L結構域包含1B2的VL結構域的CDR 1-3;1C8的V
L結構域的CDR 1-3;2C3的V
L結構域的CDR 1-3;3H8的V
L結構域的CDR 1-3;4G1的V
L結構域的CDR 1-3;5B6的V
L結構域的CDR 1-3;7A1的V
L結構域的CDR 1-3;7B10的V
L結構域的CDR 1-3;8A5的V
L結構域的CDR 1-3;或8G5的V
L結構域的CDR 1-3。
33. 一種分離的多核苷酸分子,其包含編碼實施方案30或31的多肽的核酸序列。
34. 一種宿主細胞,其包含一種或多種多核苷酸分子,所述多核苷酸分子編碼實施方案1-28中任何一個的抗體或者實施方案30或31的重組多肽。
35. 實施方案34的宿主細胞,其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、纖毛細胞或昆蟲細胞。
36. 一種表達載體,其包含與核酸序列具有至少95%同一性的多核苷酸,所述核酸序列編碼重鏈1B2 (SEQ ID NO: 176)、1C8 (SEQ ID NO: 177)、2C3 (SEQ ID NO: 178)、3H8 (SEQ ID NO: 179)、4G1 (SEQ ID NO: 180)、5B6 (SEQ ID NO: 181)、7A1 (SEQ ID NO: 182)、7B10 (SEQ ID NO: 183)、8A5 (SEQ ID NO: 184)、8G5
(SEQ ID NO: 185)、mTfR-2H (SEQ ID NO: 46)、mTfR-4H (SEQ ID NO: 47)、mTfR-5H (SEQ ID NO: 48)、mTfR-42H (SEQ ID NO: 49)、mTfR-59H (SEQ ID NO: 50)、hTfR-1H (SEQ ID NO: 51)、hTfR-20H (SEQ ID NO: 52)、hTfR-13H (SEQ ID NO: 53)、或hTfR-30H (SEQ ID NO: 54)的可變區。
37. 一種製造抗體的方法,其包括:
(a)在細胞中表達編碼實施方案1-22中任何一個的抗體的V
L和V
H鏈的一種或多種多核苷酸分子;和
(b)從細胞和/或其中設置了細胞的流體介質中純化抗體。
38. 一種用於治療患有神經障礙或腦癌的受試者的方法,其包括向受試者施用有效量的實施方案1-27中任何一個的抗體。
39. 實施方案38的方法,其中所述抗體在藥學合適的組合物中。
40. 實施方案38的方法,其中所述抗體是全身施用的。
41. 實施方案38的方法,其中所述抗體是靜脈內、皮內、瘤內、肌內、腹膜內、皮下、鞘內或局部施用的。
42. 一種分離的雙特異性抗體,其中所述雙特異性抗體的一部分與TfR特異性地結合。
43. 實施方案42的雙特異性抗體,其中所述雙特異性抗體特異性地結合與單價αTfR融合的VEGF-Trap,其中所述抗體可以在體內被血管上皮細胞內吞,而不引起TfR降解的過度誘導。
44. 實施方案42或實施方案43的雙特異性抗體,其中所述抗體可以在體內促進腦組織中的VEGF濃度的達到,所述濃度是腦組織外部的VEGF濃度的大於10倍。
45. 實施方案42至44中任何一個的雙特異性抗體,其中至少所述抗體衍生自鼠抗體。
46. 實施方案42至45中任何一個的雙特異性抗體,其中至少所述抗體衍生自人抗體。
序列表
本公開內容描述了對人轉鐵蛋白受體(TfR)具有結合親和力的單克隆抗體及其片段,使用生物層干涉法(BLI)確定的其特性、親和力和動力學結合性質在圖中進行描述。
[圖1]說明了人轉鐵蛋白受體(TfR)抗體的動力學和結合親和力,並且表示了使用BLI方法與Octet 96-Red儀器確定的動力學結合圖。蛋白A感測器(Fortebio)用於捕獲抗TfR IgG。在所有溫育步驟期間,樣品溫度設定為室溫,伴隨1000 rpm振盪。將個別純化的TfR抗體裝載到感測器上。在抗體捕獲後,使裝載抗體的感測器經受含有指定濃度(通過在每個圖下的彩色線指示)的huTfR-ECD-His的溶液流並持續限定的時間(顯示於X軸中)。在結合後,使感測器在空白動力學緩衝液中溫育,以允許TfR自由解離指定的時間。結合動力學參數通過來自Fortebio的軟體(版本11)使用具有全域擬合的1:1結合模型進行計算。KD通過kdis/kon進行計算並且呈現於表中。
[圖2]說明了TfR單克隆抗體不與TfR的天然配體轉鐵蛋白(TF)競爭。使用BLI方法與Octet 96-Red儀器。將純化的候選TfR抗體裝載到蛋白A感測器(Fortebio)上。將個別純化的TfR抗體裝載到感測器上,並且在抗體捕獲後,使裝載抗體的感測器經受含有指定濃度的huTfR-ECD的結合溶液,持續限定的時間。TF競爭結合測定包含與飽和濃度的huTF (10X的huTfR ECD)混合的huTfR-ECD。
[圖3]說明了鼠轉鐵蛋白受體(TfR)抗體的動力學和結合親和力,並且表示了使用BLI方法與Octet 96-Red儀器確定的動力學結合圖。蛋白A感測器(Fortebio)用於捕獲抗TfR IgG。將個別純化的TfR抗體裝載到蛋白A感測器上,並且經受含有指定濃度(通過在每個圖下的彩色線指示)的muTfR-ECD-His的溶液流並持續限定的時間(顯示於X軸中)。在結合後,使感測器在空白動力學緩衝液中溫育,以允許TfR自由解離指定的時間。
[圖4]說明了結合動力學參數通過來自Fortebio的軟體(版本11)使用具有全域擬合的1:1結合模型進行計算。KD通過kdis/kon進行計算,如由圖3資料確定的。
[圖5]說明了與同種型對照抗體相比,腦組織中的TfR單克隆抗體的存在增加。為了證實TfR單克隆抗體通過血腦屏障的能力,在抗體的IP注射之後,收集血清樣品,然後收穫小鼠腦並用DPBS進行灌注。使用其中雙特異性抗體在板包被的抗人Fc上捕獲的夾心ELISA,確定腦裂解物和血清中的抗體濃度。然後使用抗人Fab-HRP來定量抗體的量。如圖中可見的,與對照抗體的注射相比,TfR抗體的注射導致檢測到顯著更多的腦穿透。
[圖6]說明了TfR單克隆抗體促進融合蛋白運輸到腦內。該圖解說明了使用在Fc中的旋鈕/孔配對的TfR抗體融合蛋白構建。實施例中使用的融合蛋白序列來自VEGFR的R1D2和R2D3結構域,並且這些序列在上鉸鏈區處與人Fc片段融合。如圖中所示的,使用3X GGGS接頭,將抗TfR抗體Fab和對照IgG Fab融合到Fc的C末端。共聚焦圖像證實了使用免疫螢光染色在小鼠腦實質中檢測到TfR抗體融合蛋白,但未檢測到同種型對照抗體融合蛋白。在小鼠用抗體融合蛋白或對照中的任一腹膜內(ip)注射後24小時,收穫小鼠腦並用DPBS進行灌注並在PFA中固定。共聚焦圖像代表40 µm浮動腦組織切片,其用螢光抗人IgG和TO-PRO-3 (標記核)染色過夜,並且使用Leica TS5系統進行拍攝。比例尺=20 µm,放大率63x。
[圖7]說明了在單次腹膜內注射之後,小鼠的腦和血液兩者中的TfR單克隆抗體融合蛋白以及對照IgG融合蛋白(圖6中描述)的動力學。在融合蛋白的腹膜內注射之後的指定時間,首先收集血清,然後收穫小鼠腦並用DPBS進行灌注。使用夾心ELISA確定腦裂解物(a)或血清(b)中的抗體濃度:簡言之,將TfR抗體融合物或對照抗體融合物捕獲到板包被的人VEGFA165 (其與VEGFR的融合物結合)上,然後使用抗人Fc-HRP檢測存在的抗體量。採樣點(X軸)指示了TfR抗體或對照抗體融合蛋白注射後的天數(d)。
[圖8]抗muTfR mAb的篩選和表徵。鑒定抗muTfR Ab4的過程。使用Qpix儀器從第3輪淘選輸出中挑取總共400個scFv噬菌體菌落;並且發現38個克隆在針對muTfR-His的噬菌體ELISA中呈陽性。在測序後,將6個獨特的scFv克隆轉換為完整的IgG1。BLI測定顯示了6種抗體能夠與muTfR-His結合。
[圖9]VEGF-Trap/αTfR雙特異性抗體的表徵。A. VEGF-Trap和VEGF-Trap/αTfR雙特異性抗體的設計。在VEGF-Trap/moAb4設計中,引入了旋鈕入孔(knob-into-hole)突變以促進異源二聚化。αTfR Fab融合到CH3的C末端。儘管並未描述,但人Fc區含有LALAPG突變以消除Fc介導的免疫效應子功能。B. 顯示TfR通過VEGF-Trap/αTfR雙特異性抗體的劑量依賴性結合的滴定曲線。與VEGF-Trap/moAb4相比,VEGF-Trap/biAb4顯示了與TfR顯著更強的結合,n=3個獨立重複。具有誤差條的資料點代表平均值±SD。
[圖10]VEGF-Trap/αTfR雙特異性抗體腦進入的表徵。A. 顯示雙特異性抗體設計的插圖。在治療後的指定時間點,灌注腦中的抗體濃度。C. 顯示處理後24小時小鼠腦裂解物中的總TfR水準的蛋白質印跡。對蛋白質印跡信號進行定量並顯示於橫條圖中。對於所有動物研究,n=5只小鼠/組。誤差條代表平均值±SD。對於統計分析,ns=無統計學不同,*** P<0.001,雙尾斯氏t檢驗。
[圖11]VEGF-Trap/moAb4雙特異性抗體顯著增強了VEGF-Trap的抗血管生成功效。A. 顯示該圖中使用的雙特異性抗體設計的插圖。B. 顯示U-87 MG腫瘤中螢光標記的白蛋白水準的免疫螢光染色,所述白蛋白水準充當BBB完整性的指標。比例尺=20 μm。對免疫螢光資料進行定量並顯示於橫條圖中,n=3只獨立小鼠。C. 顯示U-87 MG腫瘤中的CD31水準的免疫螢光染色。比例尺=20 μm。對免疫螢光資料進行定量並顯示於橫條圖中,n=3只獨立小鼠。具有誤差條的橫條圖代表平均值±SD。對於統計分析,ns=無統計學不同,*** P<0.001,雙尾斯氏t檢驗。
[圖12]僅顯示從第3輪淘選輸出中鑒定的人-食蟹猴TfR交叉反應性克隆的噬菌體ELISA結果。用TfR蛋白包被板,然後使噬菌體顆粒與抗原一起溫育2小時。然後,添加抗M13 HRP以檢測結合的噬菌體。整個檔中始終使用噬菌體克隆編號來標記發現的各種抗體。
[圖13]獨特噬菌體克隆(來自圖1中呈現的克隆)的噬菌體ELISA OD450值。
[圖14]針對TfR細胞外結構域(ECD)和Cyno TfR ECD篩選18種純化的IgG1分子的Octet研究。將抗體(30 μg/mL)裝載到蛋白A生物感測器上,然後使用200 nM抗原濃度研究與huTfR或CyTfR的結合。繪製了最大Octet締合信號。
[圖15]關於4G1針對人TfR ECD的抗體親和力測量曲線。
[圖16]關於4G1針對Cyno TfR ECD的抗體親和力測量曲線。
[圖17]關於5B6針對人TfR ECD的抗體親和力測量曲線。
[圖18]關於5B6針對Cyno TfR ECD的抗體親和力測量曲線。
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Claims (27)
- 一種分離的單克隆抗體,其中所述抗體與TfR特異性地結合,並且其中所述抗體與選自1B2、1C8、2C3、3H8、4G1、5B6、7A1、7B10、8A5、8G5、mTfR-2、mTfR-4、mTfR5、mTfR-42、mTfR-59、hTfR-1、hTfR-1、hTfR-1和hTfR-1的抗體競爭結合TfR表位。
- 如請求項1的抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體包含: (a)與1B2 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 156)、1C8 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 158)、2C3 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 160)、3H8 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 162)、4G1 VLCDR1 IMGT (SEQ ID NO: 164)、5B6VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 166)、7A1 VL CDR1 IMGT(SEQ ID NO: 168)、7B10 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 170)、8A5 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 172)、8G5 VL CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 174)、mTfR-2LCDR1-AA (SEQ ID NO: 28)、mTfR-4LCDR1-AA (SEQ ID NO: 31)、mTfR-5LCDR1-AA (SEQ ID NO: 34)、mTfR-42LCDR1-AA (SEQ ID NO: 37)、mTfR-59LCDR1-AA (SEQ ID NO: 40)、hTfR-1LCDR1-AA (SEQ ID NO: 43)、hTfR-20LCDR1-AA (SEQ ID NO: 46)、hTfR-13LCDR1-AA (SEQ ID NO: 49)、或hTfR-30LCDR1-AA (SEQ ID NO: 52)至少80%等同的第一V L區; (b)與選自QDS、KAS、AAS、GND、GTS、YDS、EVS、LGS、SNI、ANS、SNN、DDN、RNN、EDN和DVS的三肽至少80%等同的第二V LCDR; (c)與1B2 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 157)、1C8 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 159)、2C3 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 161)、3H8 L CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 163)、4G1 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 165)、5B6 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 167)、7A1 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 169)、7B10 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 171)、8A5 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 173)、8G5 VL CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 175)、mTfR-2LCDR3-AA (SEQ ID NO: 30)、mTfR-4LCDR3-AA (SEQ ID NO: 33)、mTfR-5LCDR3-AA (SEQ ID NO: 36)、mTfR-42LCDR3-AA (SEQ ID NO: 39)、mTfR-59LCDR3-AA (SEQ ID NO: 42)、hTfR-1LCDR3-AA (SEQ ID NO: 45)、hTfR-20LCDR3-AA (SEQ ID NO: 48)、hTfR-13LCDR3-AA (SEQ ID NO: 51)、或hTfR-30LCDR3-AA (SEQ ID NO: 54)至少80%等同的第三V LCDR; (d)與1B2 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 126)、1C8 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 129)、2C3 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 132)、3H8 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 135)、4G1 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 138)、5B6 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 141)、7A1 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 144)、7B10 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 147)、8A5 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 150)、8G5 VH CDR1 IMGT (SEQ ID NO: 153)、mTfR-2LHCDR1-AA (SEQ ID NO: 1)、mTfR-4HCDR1-AA (SEQ ID NO: 4)、mTfR-5HCDR1-AA (SEQ ID NO: 7)、mTfR-42HCDR1-AA (SEQ ID NO: 10)、mTfR-59HCDR1-AA (SEQ ID NO: 13)、hTfR-1HCDR1-AA (SEQ ID NO: 16)、hTfR-20HCDR1-AA (SEQ ID NO: 19)、hTfR-13HCDR1-AA (SEQ ID NO: 22)、或hTfR-30HCDR1-AA (SEQ ID NO: 25)至少80%等同的第一V HCDR; (e)與1B2 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 127)、1C8 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 130)、2C3 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 133)、3H8 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 136)、4G1 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 139)、5B6 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 142)、7A1 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 145)、7B10 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 148)、8A5 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 151)、8G5 VH CDR2 IMGT (SEQ ID NO: 154)、mTfR-2LHCDR2-AA (SEQ ID NO: 2)、mTfR-4HCDR2-AA (SEQ ID NO: 5)、mTfR-5HCDR2-AA (SEQ ID NO: 8)、mTfR-42-HCDR2-AA (SEQ ID NO: 11)、mTfR-59HCDR2-AA (SEQ ID NO: 14)、hTfR-1HCDR2-AA (SEQ ID NO: 17)、hTfR-20HCDR2-AA (SEQ ID NO: 20)、hTfR-13HCDR2-AA (SEQ ID NO: 23)、或hTfR-30HCDR2-AA (SEQ ID NO: 26)至少80%等同的第二V HCDR;和 (f)與1B2 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 28)、1C8 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 131)、2C3 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 134)、3H8 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 137)、4G1 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 140)、5B6 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 143)、7A1 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 146)、7B10 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 149)、8A5 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 152)、8G5 VH CDR3 IMGT (SEQ ID NO: 155)、mTfR-2LHCDR3-AA (SEQ ID NO: 3)、mTfR-4HCDR3-AA (SEQ ID NO: 6)、mTfR-5CDR3-AA (SEQ ID NO: 9)、mTfR-42HCDR3-AA (SEQ ID NO: 12)、mTfR-59HCDR3-AA (SEQ ID NO: 15)、hTfR-1HCDR3-AA (SEQ ID NO: 18)、hTfR-20HCDR3-AA (SEQ ID NO: 21)、hTfR-13HCDR3-AA (SEQ ID NO: 24)、或hTfR-30HCDR3-AA (SEQ ID NO: 27)至少80%等同的第三V HCDR。
- 如請求項2的抗體,其中所述抗體包含: (i)與1B2的V H結構域或1B2氨基酸序列的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與1B2的V L結構域或1B2氨基酸序列的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (ii)與1C8的V H結構域或1C8氨基酸序列的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與1C8的V L結構域或1C8氨基酸序列的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (iii)與2C3的V H結構域或2C3氨基酸序列的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與2C3的V L結構域或2C3氨基酸序列的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (iv)與3H8的V H結構域或3H8氨基酸序列的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與3H8的V L結構域或3H8氨基酸序列的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (v)與4G1的V H結構域或4G1氨基酸序列的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與4G1的V L結構域或4G1氨基酸序列的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (vi)與5B6的V H結構域或5B6氨基酸序列的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與5B6的V L結構域或5B6氨基酸序列的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (vii)與7A1的V H結構域或7A1氨基酸序列的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與7A1的V L結構域或7A1氨基酸序列的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (viii)與7B10的V H結構域或7B10氨基酸序列的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與7B10的V L結構域或7B10氨基酸序列的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (ix)與8A5的V H結構域或8A5氨基酸序列的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與8A5的V L結構域或8A5氨基酸序列的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (x)與8G5氨基酸序列的V H結構域或8G5氨基酸序列的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與8G5氨基酸序列的V L結構域或8G5 VL氨基酸序列的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (xi)與mTfR-2H-AA的V H結構域(SEQ ID NO: 46)或mTfR-2H-AA的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與mTfR-2L-AA的V L結構域(SEQ ID NO: 55)或mTfR-2L-AA的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (xii)與mTfR-4H-AA的V H結構域(SEQ ID NO: 47)或mTfR-4H-AA的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與mTfR-4L-AA的V L結構域(SEQ ID NO: 56)或mTfR-4L-AA的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (xiii)與mTfR-5H-AA的V H結構域(SEQ ID NO: 48)或mTfR-5H-AA的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與mTfR-5L-AA的V L結構域(SEQ ID NO: 57)或mTfR-5L-AA的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (xiv)與mTfR-42H-AA的V H結構域(SEQ ID NO: 49)或mTfR-42H-AA的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與mTfR-42L-AA的V L結構域(SEQ ID NO: 58)或mTfR-42L-AA的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (xv)與mTfR-59H-AA的V H結構域(SEQ ID NO: 50)或mTfR-59H-AA的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與mTfR-59L-AA的V L結構域(SEQ ID NO: 59)或mTfR-59L-AA的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (xvi)與hTfR-1H-AA的V H結構域(SEQ ID NO: 51)或hTfR-1H-AA的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與hTfR-1L-AA的V L結構域(SEQ ID NO: 60)或hTfR-1L-AA的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (xvii)與hTfR-20H-AA的V H結構域(SEQ ID NO: 52)或hTfR-20H-AA的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與hTfR-20L-AA的V L結構域(SEQ ID NO: 61)或hTfR-20L-AA的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域; (xviii)與hTfR-13H-AA的V H結構域(SEQ ID NO: 53)或hTfR-13H-AA的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與hTfR-13L-AA的V L結構域(SEQ ID NO: 62)或hTfR-13L-AA的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域;或 (xix)與hTfR-30H-AA的V H結構域(SEQ ID NO: 54)或hTfR-30H-AA的人源化V H結構域至少約80%等同的V H結構域;以及與hTfR-30L-AA的V L結構域(SEQ ID NO: 63)或hTfR-30L-AA的人源化V L結構域至少約80%等同的V L結構域。
- 如前述請求項中任一項的抗體,其中所述抗體是重組的。
- 如請求項1至3中任一項的抗體,其中所述抗體是IgG、IgM、IgA或其抗原結合片段。
- 如請求項1至3中任一項的抗體,其中所述抗體是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、單價scFv、二價scFv或單結構域抗體。
- 如請求項1至3中任一項的抗體,其中所述抗體是人、人源化抗體或去免疫抗體。
- 如請求項1至3中任一項的抗體,其中所述抗體與成像劑綴合。
- 一種嵌合抗原受體,其包含與如前述請求項中任一項的單克隆抗體的抗原結合結構域至少80%等同的抗原結合結構域。
- 一種組合物,其包含在藥學可接受的載體中的如請求項1至8中任一項的抗體。
- 一種分離的多核苷酸分子,其包含編碼如請求項1至8中任一項的抗體的核酸序列。
- 一種重組多肽,其包含抗體V H結構域,所述抗體V H結構域包含1B2的V H結構域的CDR 1-3;1C8的V H結構域的CDR 1-3;2C3的V H結構域的CDR 1-3;3H8的V H結構域的CDR 1-3;4G1的V H結構域的CDR 1-3;5B6的V H結構域的CDR 1-3;7A1的V H結構域的CDR 1-3;7B10的V H結構域的CDR 1-3;8A5的V H結構域的CDR 1-3;或8G5的V H結構域的CDR 1-3。
- 一種重組多肽,其包含抗體V L結構域,所述抗體V L結構域包含1B2的V L結構域的CDR 1-3;1C8的V L結構域的CDR 1-3;2C3的V L結構域的CDR 1-3;3H8的V L結構域的CDR 1-3;4G1的V L結構域的CDR 1-3;5B6的V L結構域的CDR 1-3;7A1的V L結構域的CDR 1-3;7B10的V L結構域的CDR 1-3;8A5的V L結構域的CDR 1-3;或8G5的V L結構域的CDR 1-3。
- 一種分離的多核苷酸分子,其包含編碼如請求項12或13的多肽的核酸序列。
- 一種宿主細胞,其包含一種或多種多核苷酸分子,所述多核苷酸分子編碼如請求項1至8中任一項的抗體或者如請求項12或13的重組多肽。
- 如請求項15的宿主細胞,其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、纖毛細胞或昆蟲細胞。
- 一種表達載體,其包含與核酸具有至少95%同一性的多核苷酸,所述核酸編碼1B2 (SEQ ID NO: 176)、1C8 (SEQ ID NO: 177)、2C3 (SEQ ID NO: 178)、3H8 (SEQ ID NO: 179)、4G1 (SEQ ID NO: 180)、5B6 (SEQ ID NO: 181)、7A1 (SEQ ID NO: 182)、7B10 (SEQ ID NO: 183)、8A5 (SEQ ID NO: 184)、8G5 (SEQ ID NO: 185)、mTfR-2H (SEQ ID NO: 46)、mTfR-4H (SEQ ID NO: 47)、mTfR-5H (SEQ ID NO: 48)、mTfR-42H (SEQ ID NO: 49)、mTfR-59H (SEQ ID NO: 50)、hTfR-1H (SEQ ID NO: 51)、hTfR-20H (SEQ ID NO: 52)、hTfR-13H (SEQ ID NO: 53)、或hTfR-30H (SEQ ID NO: 54)的重鏈多肽的可變區。
- 一種製造抗體的方法,其包括: (a)在細胞中表達編碼如請求項1至8中任一項的抗體的V L和V H鏈的一種或多種多核苷酸分子;和 (b)從細胞和/或其中設置了細胞的流體介質中純化抗體。
- 一種用於治療患有神經障礙或腦癌的受試者的方法,其包括向受試者施用有效量的如請求項1至8中任一項的抗體。
- 如請求項19的方法,其中所述抗體在藥學合適的組合物中。
- 如請求項19的方法,其中所述抗體是全身施用的。
- 如請求項19的方法,其中所述抗體是靜脈內、皮內、瘤內、肌內、腹膜內、皮下、鞘內或局部施用的。
- 一種分離的雙特異性抗體,其中所述雙特異性抗體的一部分與TfR特異性地結合。
- 如請求項23的雙特異性抗體,其中所述雙特異性抗體特異性地結合與單價αTfR融合的VEGF-Trap,其中所述抗體可以在體內被血管上皮細胞內吞,而不引起TfR降解的過度誘導。
- 如請求項23或24的雙特異性抗體,其中所述抗體可以在體內促進腦組織中的VEGF濃度的達到,所述濃度是腦組織外部的VEGF濃度的大於10倍。
- 如請求項23至25中任一項的雙特異性抗體,其中至少所述抗體衍生自鼠抗體。
- 如請求項23至26中任一項的雙特異性抗體,其中至少所述抗體衍生自人抗體。
Applications Claiming Priority (6)
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