JP2023113599A - α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途 - Google Patents

α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途 Download PDF

Info

Publication number
JP2023113599A
JP2023113599A JP2023065309A JP2023065309A JP2023113599A JP 2023113599 A JP2023113599 A JP 2023113599A JP 2023065309 A JP2023065309 A JP 2023065309A JP 2023065309 A JP2023065309 A JP 2023065309A JP 2023113599 A JP2023113599 A JP 2023113599A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
igf1r
seq
amino acid
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023065309A
Other languages
English (en)
Inventor
ソンウォン アン，
Sungwon An
チヒョン アン，
Jinhyung Ahn
ビョンジェ スン，
Byungje Sung
ドンジン キム，
Dongin Kim
テヘ ソン，
Daehae Song
ジェヒョン オン，
Jaehyun Eom
ヨンギュ ソン，
Yong-Gyu Son
キョンジン パク，
Kyungjin Park
ジュヒ キム，
Juhee Kim
ジノン ジュン，
Jinwon Jung
ボラ リー，
Bora Lee
ヘス ユン，
Hyesu Yun
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ABL Bio Inc
Original Assignee
ABL Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ABL Bio Inc filed Critical ABL Bio Inc
Publication of JP2023113599A publication Critical patent/JP2023113599A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

【課題】抗ＩＧＦ１Ｒ抗体又はその抗原結合断片を提供する。【解決手段】特定の配列を有する抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片、該抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、並びに該抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片、および、希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤またはアジュバントを含む、薬学的組成物を提供する。また、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体を個体に投与することを含む、個体の血液脳関門を通過させて抗体を伝達させる方法も提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、アルファ－シヌクレインおよびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体、前記二重特異抗体を含むシヌクレイン病（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）の予防および／または治療用薬学的組成物、および前記二重特異抗体を含むアルファ－シヌクレイン凝集体検出またはシヌクレイン病診断のための情報を提供する方法に関するものである。
アルファ－シヌクレイン（α－Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、α－ｓｙｎ）は、ニューロンの前シナプス末端で主に発現し、正常状態では自然に折り畳まれていない状態の単量体として存在する。アルファ－シヌクレインは、随意および不随意運動の開始と停止を制御する重要な一種の神経伝達物質であるドーパミンの放出を規制することを助ける。特に、アルファ－シヌクレインの機能はシナプス活動の増加および年を取るにつれて重要であり、神経退化の重要な因子である。
しかし、病的な状態でアルファ－シヌクレインは、液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）、リン脂質二重膜または脂質膜などとの結合および相互作用を通じて構造的変化を起こして折り畳まれた、またはフォールディングされたα－ヘリカル形態の２次構造を形成して、二量体（ｄｉｍｅｒ）、オリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）および／または線維状形態の分子を含む凝集体を形成するようになる。
このようなアルファ－シヌクレイン凝集体は、細胞に毒性を誘発すると知られており、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、その他多様な疾患の神経細胞内で発見される異常タンパク質凝集体であるレビー小体の主成分である。また、アルファ－シヌクレインのリン酸化、またはユビキチン化のような翻訳後修飾も、アルファ－シヌクレインの凝集および神経毒性と関連があると知られている。アルファ－シヌクレインは、動物実験および細胞実験でもドーパミン神経細胞を死滅させて炎症反応を誘発し、実験動物でパーキンソン病症と類似の運動症状を誘発すると知られている。また、アルファ－シヌクレイン凝集は、パーキンソン病、パーキンソン疾患性認知症、レビー小体認知症、多系統萎縮症およびその他多数の神経軸索疾患を含むシヌクレイン病（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）と呼ばれる一群の神経退行性疾患の病因と関連があると知られている。
アルファ－シヌクレインに対する抗体またはそのような抗体を誘導するためのアルファ－シヌクレインの切片は、シヌクレイン病に対する免疫療法の方法として提案されてきた。しかし、抗体の脳浸透は、血液脳関門（ＢＢＢ）によって制限されることがある。
また、高度－特異性のＢＢＢ輸送体の欠乏は、脳腫瘍および神経変性疾患を含む脳から起こる疾患のための新たな治療剤および診断剤の開発を遅延させている。ＢＢＢの生理学および恒常性を崩壊させないながら、脳に薬学的に効能のある投与量で治療剤および診断剤分子を伝達するための方法に対する必要性が明らかに存在する。
本発明の一例は、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）に対する抗原結合部位およびＩＧＦ１Ｒに対する抗原結合部位を含む抗体または前記抗体の製造方法を提供する。
他の例は、前記抗体をコーディングするポリヌクレオチド、これを含む組換えベクター、およびこれを含む組換え細胞を提供する。
また他の例は、前記α－ｓｙｎおよびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤を含む、アルファ－シヌクレイン病（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）の予防および／または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明による抗体または抗原結合断片を用いたアルファ－シヌクレイン病の診断、治療または予防に使用される薬物を脳に伝達する方法を提供する。
本発明の一例は、ＩＧＦ１Ｒ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を特異的に認識しながらも、ＩＧＦ１Ｒリガンドの結合に影響がなく、ＩＧＦ１Ｒ受容体を通じた信号伝達を抑制せず、トランスサイトーシスが可能な抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片を提供しようとする。
他の様態で、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片をコーディングする分離されたポリヌクレオチドを提供する。
他の様態で、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片を含む血液脳関門通過のための生理活性物質の伝達用組成物を提供する。
本発明のまた他の一例は、前記抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片が生理活性物質、例えば、脳で作用する生理活性物質をＩＧＦ１Ｒ受容体を通じて血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過して脳に伝達することができる、血液脳関門伝達体を提供しようとする。
また他の実施形態で、前記抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片が生物学的活性分子、例えば、脳で作用する生理活性物質にコンジュゲーションされた形態である、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過して脳に伝達することができるタンパク質複合体を提供しようとする。
他の様態で、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片を提供する段階および前記抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片をＩＧＦ１Ｒ発現検出が必要な生物学的試料と接触する段階を含んで生物学的試料からＩＧＦ１Ｒを検出する方法を提供する。
本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片を用いた脳疾患の診断、治療または予防に使用される生理活性物質を血液脳関門を通過して脳内部に伝達する方法を提供する。
以下、本発明をさらに詳しく説明する。本明細書で“抗体”は、任意のアイソタイプの完全な免疫グロブリン、標的抗原への結合のために完全な抗体と競争できる抗原結合断片、またはこれらの組み合わせを意味する。例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト抗体、これらの抗原結合断片およびこれらの組み合わせを含む。抗体はそれ自体で抗原結合タンパク質の一種でもある。抗体は一般に少なくとも２個の全長重鎖と２個の全長軽鎖を含むが、一部の場合に抗体がただ重鎖のみを含んでもよい。前記抗体は一つのターゲットに特異的に結合する単一特異抗体、および複数のターゲットに特異的に結合する多重特異抗体（例えば、二重特異抗体および三重特異抗体）を含む。
前記抗体はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体も含み、前記モノクローナル抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体であってもよい。前記モノクローナル抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型である、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体である。
本願で“軽鎖”は、抗原またはエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長の軽鎖およびその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメインＶＬ、および不変領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、軽鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在する。軽鎖の種類にはカッパおよびラムダ鎖が含まれる。
本明細書で、“相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲ）”とは、抗体の可変領域中の抗原との結合特異性を付与する部位を意味する。
本願で“重鎖”は、抗原またはエピトープに対する結合特異性を提供するのに十分な可変領域配列を有する全長重鎖およびその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインは重鎖ポリペプチドのアミノ末端に存在し、ＣＨドメインはカルボキシ末端に存在し、ＣＨ３がカルボキシ－末端に最も近く位置する。重鎖はＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプ含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプ含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥのアイソタイプを含む。
前記抗体は、全てのサブタイプの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、など）より選択されたものであってもよい。前記ＩｇＧ形態の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプ形態であってもよい。前記ＩｇＧ形態の抗体は二つの重鎖と二つの軽鎖を含み、それぞれの重鎖および軽鎖はジスルフィド結合を通じて結合されて二つの重鎖－軽鎖構造体（ｄｉｍｅｒ）を形成し、前記形成された二つの重鎖－軽鎖は重鎖のＦｃ部位でジスルフィド結合を通じて連結された形態を有する。前記ＩｇＧ形態の抗体は、両側重鎖－軽鎖構造体に同一な抗原に対する抗原結合部位を含んで一つの抗原を標的とする単一標的抗体、または両側重鎖－軽鎖構造体に互いに異なる抗原に対する抗原結合部位を含んで二つの抗原を標的とする二重特異抗体であってもよい。
本発明による抗体は二重特異的抗体、完全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または合成抗体）、抗体融合体（または抗体接合体）、その断片およびこれらの組み合わせを含むが、これに限定されない。多様な抗体の構造が以下の本発明で追加的に開示される。
本発明で、例えば、抗原結合断片、タンパク質、または抗体のようなポリペプチドの“変異体”は他のポリペプチド配列と比較して一つ以上のアミノ酸残基に挿入、欠失、付加および／または置換が発生したポリペプチドであり、融合ポリペプチドを含む。例えば、抗体の一部は、前記重鎖または軽鎖、可変領域またはＣＤＲ配列の一つ以上の残基で保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換を含む。
本発明でポリペプチドの“誘導体”は、挿入、欠失、付加または置換変異体とは異なる、他の化学的モイエティとのコンジュゲーションを通じて化学的に変形されたポリペプチドを意味する。
本発明による抗体はハイブリドーマ技術を使用して、目的とする特異性を有する抗原－特異的ヒトｍＡｂが遺伝子導入マウス、例えば、先に記述されたものから生成され選択できる。このような抗体は適切なベクターおよび宿主細胞を使用してクローニングされ発現するか、または前記抗体は培養されたハリブリドーマ細胞から収穫できる。また、前記抗体はファージ－ディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ－ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ）に由来し得る。ファージディスプレイ技術は、フィラメント（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ）バクテリオファージの表面上で抗体レパートリーをディスプレーして、これから目的とする抗原に結合するファージを選別する一種の免疫選択（ｉｍｍｕｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を模倣した方法である。このような技術は本発明の実施例またはＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／１０４９４号を参照することができる。一実施形態で、本発明のヒト化抗体はファージディスプレイ方法を通じて選別される。
抗体またはその抗原結合断片は、ただ単一源（ｓｏｕｒｃｅ）に由来するか、またはキメラであってもよい。キメラ抗体は、２種類の異なる抗体に由来する部分を含み、以下、より詳細に記述される。抗体またはその抗原結合断片は、ハリブリドーマ、組換えＤＮＡ技術または完全な抗体の酵素的または化学的切断によって生産できる。他の言及がなければ、本願で用語抗体は２個の全長重鎖と２個の全長軽鎖を含む抗体はもちろん、これらの誘導体、変異体、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片、突然変異体およびこれらの組み合わせを含み、例えば、２個の全長重鎖と２個の全長軽鎖以外に１個または２個のｓｃＦｖを含むことができ、これらの例は以下に述べる通りである。
本明細書に記載された“抗原結合断片”は、抗原に対する特異的結合能を有する抗体の一部またはこれを含むポリペプチドを意味する。例えば、抗原結合断片は、抗原（例えば、エピトープ）と相互作用して、抗体に抗原に対する特異性および／または親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗体の一部またはこれを含むポリペプチドであってもよい。このような断片は全長軽鎖または重鎖内に存在する少なくとも一つのＣＤＲを含み、一部実施形態で、単鎖重鎖および／または軽鎖、またはその一部を含む。このような生物学的活性断片は組換えＤＮＡ技術によって生産されるか、または例えば完全な抗体を酵素的または化学的切断して生産できる。
免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片にはこれで制限するのではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃなど）を含む。また、これで制限するのではないが、ヒト、マウス、ラット、カメリドまたはウサギを含む任意の哺乳動物に由来し得る。本明細書に開示された一つ以上のＣＤＲのような抗体の機能的な部分は第２のタンパク質または低分子化合物と共有結合で連結されて特定標的に対する標的治療剤として使用できる。
本願で“単鎖抗体”は、重鎖および軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって連結された抗原結合領域の単一ポリペプチド鎖である。例えば、前記単鎖抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、およびＦｃが単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ－Ｆｃなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。単鎖抗体は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号を参照することができる。
本明細書で“親和性または親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）”は抗体またはその抗原結合断片と抗原の間の相互作用の強度であり、抗体または抗原結合断片のＣＤＲ配列、および／または抗体または抗原結合断片の物理化学的特性（親水性／疎水性、静電気的特性など）、抗原の大きさ、形状、および／または電荷のような抗原の特徴などによって決定できる。このような親和度を決定する方法は当業界に公知されており、通常解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）で示すことができるが、これに制限されるわけではない。
全長の軽鎖および重鎖で、可変領域および不変領域は約１２個以上のアミノ酸長さの“Ｊ”領域によって結合され、重鎖はまた約１０個以上のアミノ酸の“Ｄ”領域を含む。
例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２ｎｄ ｅｄ．、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ、Ｗ．、ｅｄ．）１９８９、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓを参照することができる。典型的に抗体の軽鎖／重鎖対の可変領域が抗原結合部位を形成する。
本発明の一例は、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）に対する抗原結合部位およびＩＧＦ１Ｒに対する抗原結合部位を含む抗体、具体的には、アルファ－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）およびＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体（以下、抗α－ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒ二重特異抗体）に関するものである。よって、本発明による二重特異抗体は、アルファ－シヌクレインとＩＧＦ１Ｒを全て抗原として認識および結合することができる。
本発明による抗α－ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒ二重特異抗体は、前記抗α－ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片を含み、アルファ－シヌクレインを特異的に認識して結合することができ、特にアルファ－シヌクレインのＣ－末端部位に結合することができ、アルファ－シヌクレインまたはその凝集体に関連した疾病であるシヌクレイン病の予防、治療および／または診断用途として使用できる。
本願で“２価の抗原結合タンパク質”または“２価抗体”は２個の抗原結合部位を含む。このような２価抗体に含まれている２個の抗原結合部位は同一な抗原特異性を有するか、またはそれぞれ異なる抗原に結合する二重特異的抗体であってもよい。本願で“多重特異的抗原結合タンパク質”または“多重特異的抗体”は、二つ以上の抗原またはエピトープを標的とするものである。
本願で“二特異的”、“二重特異的”抗原結合タンパク質または抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。このような二特異的抗体は多重特異的抗原結合タンパク質または多重特異的抗体の一種であって、公知された多様な方法、例えば、ハリブリドーマの融合またはＦａｂ’断片あるいはｓｃＦｖ断片の連結によって生産できる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０、７９：３１５－３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２、１４８：１５４７－１５５３などを参照することができる。二特異的抗原結合タンパク質または抗体の２個の抗原結合部位が結合する２個の互いに異なるエピトープは、同一または異なるタンパク質標的に配置できる。本願による一実施形態で、本願による抗体は、血液脳関門を通過して伝達されるために伝達体に対する結合を追加的に含む二重特異的抗体の形態を取ることができる。血液脳関門を通じて薬物を伝達するための一つの方法は、細胞に内在したグルコースおよびアミノ酸伝達体、インスリンまたはトランスフェリンの受容体媒介トランスサイトーシスのような伝達システムの使用を含む。
本発明によれば、用語“シヌクレイン病”は、病理学的シヌクレイン凝集体を特徴とする全ての神経退行性障害を含む。パーキンソン病、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、レビー小体病、レビー小体を伴う認知症、認知症を伴うパーキンソン症候群、多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）、多発性神経系萎縮および脳鉄沈着を伴う神経変性Ｉ型（ＮＢＩＡ Ｔｙｐｅ Ｉ）を含むいくつかの神経退行性障害はシヌクレイン病として集合的にグループ化される。また、アルファ－シヌクレイン凝集は二次的にアルツハイマー疾患でも発見される（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１４、６：７３）。
シヌクレイン病は、共通的な病理学的特性を共有する神経退行性障害の多様なグループである：神経病理的実験で、特有の病変はニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）および希少突起神経膠（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）の選択された集団内でアルファ－シヌクレインタンパク質の非正常的凝集を含んで感知できる。アルファ－シヌクレイン（最初にＰＡＲＫｌおよびＰＡＲＫ４と判明する）は、新皮質、海馬、歯状回、嗅球、線条体、視床および小脳で広範囲に発現される１４０個アミノ酸のタンパク質である。アルファ－シヌクレインはまた、Ｂ－、Ｔ－、およびＮＫ細胞をはじめとして蛋白球および血小板を含む造血細胞で高く発現される。このような細胞内でアルファ－シヌクレインの正確な役割知られていないが、巨核球（血小板前駆体）の分化と関連があると見なされている。
本発明で“アルファ－シヌクレイン凝集体に関連する疾患”はシヌクレイン病と呼ばれる一群の神経退行性疾患であって、ニューロンおよび膠細胞（ｇｌｉａ）集団を含む病巣でアルファ－シヌクレイン凝集体が発見される特徴を有する。このような疾患にはパーキンソン疾患、パーキンソン疾患性認知症、レビー小体認知症、アルツハイマーレビー小体疾患、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病、多系統萎縮症およびその他多数の神経軸索疾患を含むが、これに制限するのではない。一実施形態で、本願による抗体はパーキンソン病の治療に効果的に使用される。
また、本発明による抗－α－ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒ二重特異抗体は、抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片を含んで、抗α－ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片を血液脳関門を通過できるようにして脳でその作用を発揮することができるようにし、半減期を延長して薬効を長期間維持することができるようにする。
さらに、本発明による抗α－ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒ二重特異抗体は、細胞表面のＩＧＦ１Ｒに結合するが、リガンドの結合に影響を与えず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達経路には影響を与えない特性を有する。よって、ＩＧＦ１Ｒとそのリガンド結合およびＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を抑制しないので血液脳関門を通過するシャトル手段として使用できる。
特に、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を特異的に認識し、ＩＧＦ１Ｒ、特にヒトＩＧＦ１Ｒ、マウスＩＧＦ１Ｒ、ラットＩＧＦ１Ｒ、およびサルＩＧＦ１Ｒに認識および結合し、ＩＧＦ１ＲのリガンドであるＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはインスリンがＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害せず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を阻害せず、トランスサイトーシスに使用できて血液脳関門通過能を有し、ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有しなくて動物に反復投与した場合にも脳のＩＧＦ１Ｒ水準を減少させなくて、毒性を有しない。
特に、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体は、ＢＢＢを構成する脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の表面に存在するＩＧＦ１Ｒに結合して細胞内部に内在化（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）される。
例えば、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体はｓｃＦｖ形態を有することができ、多様な方式で治療用抗体に結合して製作できる。例えば、抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖは治療用抗体、例えばα－ｓｙｎ抗体のＣ－末端に二つが結合した二重特異抗体、即ち、２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態二重抗体に、あるいは一つが結合した二重特異抗体、即ち、１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態二重特異抗体として製作でき、当該二重特異抗体は全てＩＧＦ１Ｒを発現する細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）される。細胞表面の抗原に対するＩＧＦ１Ｒ抗体の高い結合力が内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）効果を高め、これはＢＢＢ通過能につながることになる。当該抗体がＢＢＢ通過能を有しながらＩＧＦ１Ｒのシグナリングに干渉を与える場合、副作用を引き起こすことがあり、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体はＢＢＢシャトル（ＢＢＢ ｓｈｕｔｔｌｅ）として機能し得る結合力を有しながら同時にＩＧＦ１Ｒシグナルに対するｎｏｎ－ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体である。
前記抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は優れた開発容易性を有する。これに関し、前記抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のＣＤＲ領域に発生して抗体の安定性と効能を減少させる翻訳後修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、例えば脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）を除去しようとした。
代案的に、前記抗体の脱アミド化部位（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）の両側に位置するアミノ酸のうちの少なくとも一つを置換することができ、好ましくは抗体の脱アミド化部位（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）のＣ末端側直ぐ横のアミノ酸を置換することができる。例えば、抗体の脱アミド化部位（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）に位置するＡｓｎの横に位置したＧをＡで、またはＡｓｎの横に位置したＳをＶで置換することによって、ｐａｒｅｎｔａｌ抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体と類似の結合力を有すると共に優れた安定性とＢＢＢ通過能を有する脱アミド化抗体を製造することができる。
追加的に、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体は脳で作用する生理活性物質と連結された時、前記生理活性物質単独に比べて向上したＢＢＢ通過能および効能を誘導することができる。
本発明の一例による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体は、多様な治療用第２抗体を含む二重特異抗体として活用でき、ヒトｉＰＳＣ由来ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢシステムの通過実験で、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べて約１５倍高いＢＢＢ通過能を示す。前記二重特異抗体で前記第２抗体に結合された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体が１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）あるいは２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態で結合されたものであってもよい。例えば、抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体が１価または２価である二重特異抗体を正常ラットに単回投与後、血中抗体量およびＣＳＦでの抗体量を分析した時、抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体が１価または２価である二重特異抗体は、ｐａｒｅｎｔａｌ抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体（１５６４クローン）に比べて最大５倍増加された血中抗体量と最大５倍増加されたＣＳＦ抗体量を示した。Ｐａｒｅｎｔａｌ抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体（１５６４クローン）に比べて約３倍増加されたＣＳＦおよび約４．５倍増加されたｂｒａｉｎ通過量を示す。したがって、前記の方法で改善された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体の二重特異抗体は、治療用第２抗体のみから構成される単独抗体に比べて最大約１５倍のＣＳＦおよび約２３倍のＢｒａｉｎ通過能を示すことが期待される。
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体はＩＧＦ１Ｒ、特にヒト、サル、ラット、およびマウスを含む哺乳動物のＩＧＦ１Ｒに結合することが確認されて、薬物開発のためのスクリーニング、臨床試験などに有用に使用できる。
本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片である。
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）が≦１×１０－６Ｍの親和度で結合する時、抗原のようなその標的に“特異的に結合する”といわれる。抗体は、ＫＤが≦１×１０－８Ｍである時、あるいはＥＣ５０（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ５０）が２ｎＭ以下である時、高い親和性で標的に特異的に結合する。一実施形態で、抗体またはその抗原結合断片はＫＤ≦１×１０－８でＩＧＦ１ＲまたはヒトＩＧＦ１Ｒに結合できる。
本明細書で、用語“エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）”は抗原決定部位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であって、抗体によって認知される抗原の一部分を意味すると解釈される。一実施形態によれば、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体の結合部位は、ＩＧＦ１Ｒタンパク質、例えばヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）であってもよい。さらに具体的に、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体、例えば１５６４クローン抗体のヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質に対する結合部位は、ヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質で、結合部位１はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８およびＧｌｕ７７９を含み、結合部位２はＬ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９およびＬ８１３を含み、結合部位３はＶ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０およびＣ４８８を含む。よって、本発明によるＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープは立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）であって、上記の３個の結合部位を全てあるいは一部を含むものであってもよい。
本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１ＲのリガンドであるＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはインスリンがＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害しない。具体的に、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒを発現する細胞でＩＧＦ１Ｒのリガンドが細胞膜に位置する前記ＩＧＦ１Ｒに結合することを妨害せず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を抑制せず、また細胞表面のＩＧＦ１Ｒ発現にも影響を与えない長所がある。よって、本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体または抗原結合断片は、トランスサイトーシスを通じて血液脳関門を通過するのに効果的に使用できる。ＩＧＦ１Ｒは現在まで主に使用されるＢＢＢ通過能向上のための、脳の内皮細胞でその発現されると知られた他のトランスサイトーシス標的と比較して、ＩＧＦ１Ｒの発現は脳に相対的に高い発現量を示すことが明らかになった。一実施形態で、ＩＧＦ１Ｒは治療抗体のＢＢＢ通過能向上用途として現在開発されている他の標的、例えば、トランスフェリン受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、インスリン受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などと比較した時、末梢組織（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｉｓｓｕｅ）、例えば、肝、肺、大腸などに相対的に低い発現量を示すことが明らかになった。
ＩＧＦ１Ｒは、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過して有用な物質を脳の内部に伝達できるＲＭＴ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）の標的になっている。しかし、血液脳関門通過のための薬物伝達標的として使用されるためには、細胞表面のＩＧＦ１Ｒに結合するが、リガンドの結合に影響を与えず、ＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達経路には影響を与えない特性を有してこそ好ましい。したがって、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、ＩＧＦ１Ｒとそのリガンド結合およびＩＧＦ１Ｒを通じた信号伝達を抑制しないので血液脳関門を通過するシャトル手段として使用できる。
本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片はトランスサイトーシス（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）が可能であり、脳の内皮細胞を通過することができる。また、本発明による抗体は、マウスに血管注射した場合、マウスの脳血管と同一の位置に位置する。このような結果は、本発明による抗体または抗原結合断片が血液脳関門を通過する薬物伝達体として効果的に使用できるのを示すことである。
したがって、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、脳で作用する生理活性物質が血液脳関門を通過できるようにする。本発明で、生物学的障壁は細胞、組織、膜または生物学的分子の効果的な通過、拡散または伝達を防ぐ細胞、膜、または構造をいう。このような生物学的障壁は神経細胞／組織、結合組織、筋肉、膜または上皮（例えば、粘膜または血管）細胞を含む。代表的な例として血液脳関門が挙げられる。
本発明で“血液脳関門”またはＢＢＢは、脳および脊椎とその周辺循環系の間に存在する脳の毛細血管内皮細胞膜内にタイト結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）によって形成された障壁である。このような障壁は非常に堅固であって、約６０Ｄａ分子量の低分子物質が脳に通過することも制限する。脳の血液脳関門、脊椎の血管脊髄障壁、そして網膜の血管網膜障壁は中枢神経系内の連続的な毛細血管障壁であって、通常ＢＢＢと称する。
本発明で“血液脳関門伝達体”はこのような血液脳関門を通過して、前記脳作動因子物質を伝達することができ、前記脳作動因子物質は例えば、化合物、ペプチド、およびポリペプチドを含むタンパク質、核酸、抗体、または低分子化合物を含む。
本発明はＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する分離された抗体またはその抗原結合断片に関するものであって、前記抗体または抗原結合断片は重鎖の相補性決定部位と軽鎖の相補性決定部位を含んで、ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するポリペプチド、タンパク質または抗体またはその抗原結合断片であってもよい。
具体的な一例は、抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、
（ｉ）表１に記載されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３からなる群より選択された一つ以上の重鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域；
（ｉｉ）表１に記載されたＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３からなる群より選択された一つ以上の軽鎖相補性決定領域、または前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域；
前記一つ以上の重鎖相補性決定領域および前記一つ以上の軽鎖相補性決定領域の組み合わせ；または
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の組み合わせ
を含むものであってもよい。
追加的に、前記重鎖可変領域、前記軽鎖可変領域、または前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域の組み合わせで、前記重鎖可変領域はＨ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、およびＨ－ＦＲ４からなる群より選択された一つ以上の重鎖フレームワークを含むことができ、前記軽鎖可変領域はＬ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、およびＬ－ＦＲ４からなる群より選択された一つ以上の軽鎖フレームワークを含むことができる。
本発明の一例で、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体内アミノ酸の脱アミド化（Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）発生の除去によって、抗原であるＩＧＦ１ＲのＥＣＤに対する結合力に変化がないながら工程開発、保管などに不利な抗体の分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）危険性が減少する。抗ＩＧＦ１Ｒ抗体で脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）が除去されるアミノ酸位置は、例えば１５６４（ＩｇＧ）、１５６４（ｓｃＦｖ）、または１５６４－３で軽鎖ＬＣＤＲ２のＮ５１Ｄ、Ｎ５１Ｑ、Ｓ５２Ｖ、ＬＣＤＲ３のＮ９５ａＫ、Ｎ９５ａＨ、Ｎ９５ａＲ、Ｎ９５ａＤ、Ｇ９５ｂＡまたは重鎖のＨＣＤＲ２でＮ５４Ｄ、Ｎ５４ＱまたはＧ５５Ａであってもよい。脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）除去は前記で言及されたクローンにのみ限定されず、表１４に記載された方法によって他のクローンに対しても可能である。
Figure 2023113599000002
Figure 2023113599000003
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、配列番号１または配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号２～７および配列番号１１～１８のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、配列番号８～９および配列番号１９のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号２１～２３のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および配列番号２４～２８および配列番号２９～３１のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含むものであってもよい。
本発明の一例で、前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号３および配列番号５～７のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、および配列番号８～９のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号２２および２３のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および配列番号２６～２８のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含むものであってもよい。
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の重鎖可変領域は前記表１に記載されたＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、およびＨ－ＣＤＲ３を含むか、追加的に配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ１、配列番号３３または配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ２、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ３、および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ４を含むことができる。
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の軽鎖可変領域は前記表１に示したＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３を含むか、追加的に配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ１、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ２、配列番号３９または配列番号４０のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ３、および配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ４を含むことができ、具体的例示は表３に示したＬ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、およびＬ－ＦＲ４の軽鎖フレームワークを含むことができる。
前記重鎖または軽鎖のフレームワーク１～４のうち、フレームワーク１（ＦＲ１）はＣＤＲ１のＮ－末端側に位置し、フレームワーク２（ＦＲ２）はＣＤＲ１とＣＤＲ２の間に位置し、フレームワーク３（ＦＲ３）はＣＤＲ２とＣＤＲ３の間に位置し、フレームワーク４（ＦＲ４）はＣＤＲ３のＣ－末端に位置する。
具体的に、１５６４（ＩｇＧ）クローン重鎖可変領域のフレームワーク配列は配列番号３２、３３、３５および３６のアミノ酸配列を含み、表１に記載されたクローンのうちの１５６４（ＩｇＧ）クローンを除いた残りのクローンは配列番号３２、３４、３５および３６のアミノ酸配列を含む。
具体的に、本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体の軽鎖可変領域のフレームワーク配列は下記表３に示した通りである。
Figure 2023113599000004
本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む抗体であってもよく、本明細書に開示された多様な重鎖および軽鎖可変領域は表４と表５に例示的に記載される。下記表４と表５に記載された前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は多様な形態の抗体の製造のために自由に組み合わせることができる。このようなそれぞれの可変領域は完全な抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖を形成するために前記重鎖および軽鎖不変領域に結合できる。
Figure 2023113599000005
Figure 2023113599000006
本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片重鎖可変領域は、さらに詳しくは、配列番号４３～配列番号８７のアミノ酸配列からなる群より選択された一つを含むことができる。本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域は、配列番号８８～配列番号１３２のアミノ酸配列からなる群より選択された一つを含むことができる。前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域の例は上記表４および表５に記載されている。
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７４のアミノ酸配列を有するヒトのＩＧＦ１Ｒタンパク質でＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８、Ｇｌｕ７７９、Ｌ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９、Ｌ８１３、Ｖ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０およびＣ４８８からなる群より選択された少なくとも一つ以上のアミノ酸を特異的に認識して結合するものである、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片であってもよい。具体的に、本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＩＧＦ１Ｒに関する配列番号１７４のアミノ酸配列を含むタンパク質で結合部位１～結合部位３からなる群より選択された少なくとも一つ以上の結合部位に結合するものであり、前記結合部位１はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８およびＧｌｕ７７９からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位２はＬ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９およびＬ８１３からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位３はＶ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０およびＣ４８８からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含むものであってもよい。
前記表４および表５に記載された重鎖可変領域および軽鎖各可変領域はそれぞれ別途のドメイン抗体として使用されるか、互いに自由に組み合わせられて多様な抗体を形成することができ、単一鎖形態に連結されてｓｃＦｖのような単鎖抗体を形成することもできる。
本発明で“ドメイン抗体”は、重鎖の可変領域および／または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。一実施形態では２個以上のＶＨ領域がペプチドリンカーによる共有結合で連結されて、２価のドメイン抗体を形成する。このような２価ドメイン抗体の２個のＶＨ領域は同一または異なる抗原を標的とすることができる。
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の抗原結合断片は、相補性決定領域を一つ以上含む抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ミニボディおよびジアボディからなる群より選択できる。
前記抗原結合断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖可変領域および重鎖可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造で１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、Ｆａｂで重鎖ＣＨ１ドメインのＣ－末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、２個のＦａｂ’がＦａｂ’ヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。
Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体断片であって、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）および二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含む。二重鎖Ｆｖは非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結できる。単鎖Ｆｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が直接またはペプチドリンカーを通じて共有結合で連結されるか、またはＣ－末端で直ちに連結されていて、二重鎖ＦｖのようにｓｃＦｖダイマーと同じ構造（ｄｉ－ｓｃＦｖ）を成すことができる。本発明で、単鎖Ｆｖは重鎖および軽鎖可変領域が直接またはリンカーによって連結された抗原結合領域の単一ポリペプチド鎖であって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ、ｓｃＦｖダイマーと同じ構造（ｄｉ－ｓｃＦｖ）、および重鎖可変領域、軽鎖可変領域、およびＦｃが単一鎖形態に連結されたｓｃＦｖ－Ｆｃなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。
前記ペプチドリンカーは前述の通りであってもよく、例えば、１～１００個、例えば２～５０個または５～２５個アミノ酸長さのものであってもよく、前記ペプチドリンカーは抗体の機能に影響を与えない限度内で、その長さを多様に決定することができる。前記ペプチドリンカーに含まれているアミノ酸種類は例えば、Ｇｌｙ、ＳｅｒおよびＬｅｕからなる群より選択された１種以上のアミノ酸から構成でき、具体的な例として、ＧｌｙとＳｅｒ残基から構成されるか、ロイシン（Ｌｅｕ）とセリン（Ｓｅｒ）から構成できる。具体的一例として、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎであってもよく、前記ｎは（Ｇ４Ｓ）の反復数であって、１～１０の整数、例えば２～５、特に３または４の整数で表現されるものであってもよい。前記ペプチドリンカーの一例は、配列番号１３３または１３４のアミノ酸からなるペプチドであってもよい。
配列番号１３３：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１３４：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
このような単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２個の可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコーディングするＤＮＡの間にペプチドリンカーをコーディングするＤＮＡを融合することによって製造できる。製造されたポリペプチドは折りたたみによって抗原－結合単量体を形成するか、または２個の可変ドメインの間に柔軟性リンカーの長さによって、多量体（例えば、二量体、三量体または四量体）を形成することができる。異なるＶＬとＶＨを含むポリペプチドを組み合せることによって、異なるエピトープに結合する多量体性ｓｃＦｖを形成することができる。
前記抗原結合断片はタンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術を通じて製作することもできる。
本発明に開示された単鎖抗体は重鎖および軽鎖可変領域のドメイン組み合わせを含むｓｃＦｖ、またはＣＤＲを含む軽鎖および重鎖可変ドメインの組み合わせが含まれるが、これで制限されるわけではない。
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の抗原結合断片は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを媒介とするかまたはせずに連結できる。また、抗原結合断片内の重鎖部分と軽鎖部分、例えばｓｃＦｖ断片内の重鎖可変領域と軽鎖可変領域もペプチドリンカーを媒介とするかまたはせずに連結できる。前記ペプチドリンカーは前述の通りであってもよい。
前記二重特異抗体で、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、結合された異なる抗原またはエピトープを標的とする第２抗体またはその抗原結合断片を血液脳関門を通過させて脳に伝達させる機能を遂行することができる。前記第２抗体は脳で効能を発揮する抗体であってもよいが、特に限定されるのではないが、本発明による抗アルファ－シヌクレイン抗体またはその結合断片であってもよい。
本発明による抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、異なる第２抗体と特定領域または配列を共有することができる。例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は第２抗体の抗体または抗原結合断片の不変領域を共有するか、Ｆｃ領域を共有することができる。
また、本発明で二重特異的抗体の構造は、完全な免疫グロブリンの２個重鎖のＦｃ領域、例えば重鎖の末端に直接またはリンカーを媒介として各Ｆｃに抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖが連結された形態である２価形態（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｆｏｒｍ）二重抗体と、完全な免疫グロブリンの２個重鎖のうちの１個重鎖の末端にのみ直接またはリンカーを媒介として抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖ行って連結された形態である１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）二重抗体を全て含むか、１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）二重抗体が好ましい。
具体的に、本発明の一例で１価形態（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｆｏｒｍ）のクローンが２価形態（ｂｉｖａｌｅｎｔ ｆｏｒｍ）のクローンより半減期が向上する場合があり、この時、１価形態（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｆｏｒｍ）クローンの構造は完全な免疫グロブリンの形態で１個の重鎖末端にのみリンカーでＩＧＦ１Ｒに結合するドメイン抗体（ｓｃＦｖ）が連結された形態である。例えば、完全な免疫グロブリン形態で１個の重鎖にはＣ末端にリンカーが含まれているＩＧＦ１Ｒ抗原に結合するドメイン抗体が連結されており、残り１個の重鎖には不変領域Ｃ末端の後にいずれのものも連結されていない２つの互いに異なる重鎖を含むＫｎｏｂ－Ｉｎ－ｈｏｌｅ技法が適用された異種二量体の形態であってもよい。
前記二重特異抗体において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片に結合する前記第２抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってもよい。前記第２抗体は、完全な抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、抗体模倣体（または合成抗体）、抗体融合体（または抗体接合体）、およびその断片を含むが、これに限定されない。前記二重特異抗体において、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片に結合する前記第２抗体の一例は、本発明による抗－ｓｙｎ抗体およびその抗原結合断片であってもよい。
以下、本発明による抗－ｓｙｎ抗体およびその抗原結合断片に関するものである。
本明細書で提供される抗体が抗原として認識するアルファ－シヌクレインはヒトアルファ－シヌクレイン、サルアルファ－シヌクレイン（例えば、Ｒｈｅｓｕｓアルファ－シヌクレイン）、マウスアルファ－シヌクレイン、ラットアルファ－シヌクレインなどの哺乳動物アルファ－シヌクレインのうちから選択されたものであってもよく、例えば、ヒトアルファ－シヌクレインはアルファ－シヌクレイン（ＮＣＢＩ ＩＤ：ＮＰ＿０００３３６）であってもよいが、これに制限されるわけではない。本明細書に異なって言及されない限り、アルファ－シヌクレインはヒトアルファ－シヌクレインを称するものであってもよく、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合断片はヒトアルファ－シヌクレインだけでなく、サル（例えば、Ｒｈｅｓｕｓ）、ラット、および／またはマウスアルファ－シヌクレインにも特異的結合能を有するものであってもよい。
前記抗体またはその抗原結合断片が結合するアルファ－シヌクレインのＣ－末端部位に結合し、具体的にヒトアルファ－シヌクレインタンパク質は配列番号１７３のアミノ酸配列で、Ｃ－末端領域、例えば１１０番残基～１２０番残基または１１１番残基～１２２番残基を含む連続する少なくとも１１個または１２個アミノ酸から構成されたペプチドを含むＣ－末端領域であってもよい。本発明による抗体またはその抗原結合断片は、前記抗原認識部位を認識してアルファ－シヌクレイン凝集体に対する高い親和度で結合することが確認された。
本明細書で、“アルファ－シヌクレインタンパク質またはアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的結合する”とは、アルファ－シヌクレインタンパク質またはアルファ－シヌクレイン凝集体に対する親和度が他の抗原と比較して相対的に高いのを意味することであって、例えば、アルファ－シヌクレイン凝集体、具体的に、アミロイドフィブリル（ａｍｙｌｏｉｄ ｆｉｂｒｉｌｓ）、プロトフィブリル（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｓ）およびオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ）、特にアミロイドフィブリルに対して親和度がＯｃｔｅｔおよびＳＰＲ分析でそれぞれ解離定数（ＫＤ）０．１×１０－１０Ｍ～２×１０－１０Ｍ、または０．０５×１０－１０Ｍ～０．３×１０－９Ｍであるが、これに制限されるわけではない。
本発明の一例による軽鎖および重鎖を含むヒト化アルファ－シヌクレイン抗体、例えばＨｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）の場合、キメラアルファ－シヌクレイン抗体に比べて高い食細胞作用促進活性を示す。Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）、ＡＢＬ２－４の場合、キメラアルファ－シヌクレイン抗体に比べてフィブリルの神経細胞膜結合に対する高い抑制能を示し、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）、ＡＢＬ２－４の場合、キメラアルファ－シヌクレイン抗体に比べて、アルファ－シヌクレイン過発現細胞から分泌されたアルファ－シヌクレインの他の神経細胞への電波に対する高い抑制能を示す。アルファ－シヌクレイン凝集体に対する結合力、例えば、ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙでは測定した結合力はキメラアルファ－シヌクレイン抗体と類似するか、優れた活性を有する。
本発明によるアルファ－シヌクレイン抗体は、適用対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の神経系で神経細胞外部に分泌されたアルファ－シヌクレイン凝集体が細胞外空間（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐａｃｅ）で他の正常細胞に移動して当該神経細胞を一種の感染させる作用を抑制し（ｉｎｈｉｂｉｔ ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）、また、小膠細胞が細胞外空間に位置するアルファ－シヌクレイン凝集体に対する食細胞作用促進能を有する。アルファ－シヌクレイン凝集体は、プリオンのように、一つの細胞から他の細胞に伝播しながら当該正常細胞内にもアルファ－シヌクレイン、特にアルファ－シヌクレイン凝集体が脳全般に広がりながらシヌクレイン病を招く。したがって、アルファ－シヌクレイン凝集体は、脳神経細胞に対して毒性があり、脳神経細胞死滅（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、脳炎症反応（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を起こすとよく知られている。したがって、アルファ－シヌクレイン凝集体が脳の様々な部位に広がるにつれて脳細胞死滅と脳炎症反応が増加し、これによってシヌクレイン病、例えばパーキンソン病が進行しながら確認される脳細胞死滅およびこれによる行動、認知機能の障害が現れる。
よって、本発明のアルファ－シヌクレイン抗体は、アルファ－シヌクレインまたはアルファ－シヌクレイン凝集体の神経細胞間移動を抑制してアルファ－シヌクレイン凝集体が脳の多様な領域に広がる現象を防止することができ、また、小膠細胞の食細胞作用を促進して、対象の神経系で神経細胞外部に存在するアルファ－シヌクレイン凝集体自体の減少または除去によってシヌクレイン病の重要な原因であるアルファ－シヌクレイン凝集体の水準を減少させて、脳神経細胞死滅および脳炎症反応を減らし、ひいてはシヌクレイン病、例えば、パーキンソン病の症状および病の進行を改善、軽減または予防する効果を期待することができる。
また、本発明によるアルファ－シヌクレイン抗体は、（ｉ）アルファ－シヌクレインまたはアルファ－シヌクレイン凝集体の神経細胞間移動を抑制、および（ｉｉ）小膠細胞の食細胞作用の促進を通じた脳神経系のアルファ－シヌクレイン凝集体の水準減少と関連して二つの機能を全て遂行することができる点から優れた活性を有する。特に、現在まで臨床試験が進行中であるか論文に公開されたアルファ－シヌクレイン抗体は、前記（ｉ）および（ｉｉ）活性のうちの一つの活性を有するので、これは本願のアルファ－シヌクレイン抗体は知られたアルファ－シヌクレイン抗体に比べて優れたシヌクレイン病の予防または治療に長所があるのを示す。したがって、本願発明によるアルファ－シヌクレイン抗体はアルファ－シヌクレイン凝集体の除去および減少と、病因としての作用を抑制する効能がさらに優れており、したがって、シヌクレイン病またはこれに関連した症状的疾病（例、認知障害など）にさらに効果的である。
アルファ－シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は、アルファ－シヌクレイン凝集体形成を減少させることができ、脳の凝集体の濃度を低めることができる。また、アルファ－シヌクレイン凝集体に対する高い親和度を有する本願による抗体または抗原結合断片は中枢神経系外側でのアルファ－シヌクレイン凝集体形成を減少させることができ、結局、脳血管障壁を境界にしたアルファ－シヌクレイン形態間の平衡状態を変更させて、中枢神経系内の凝集体の濃度を低める効果をもたらすことができる。これは、抗体を、例えばこれで制限されるのではないが、より簡便な皮下注射のような方式で投与しても十分な効能を得ることができるため、臨床で大きな長所がある。
本願による抗体または抗原結合断片は、単量体の除去を通じた凝集体形成抑制、または単量体と凝集体を全て除去することができる。
本明細書で提供されるアルファ－シヌクレインタンパク質またはアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、自然的に生産されたものではなくてもよい（ｎｏｎ－ｎａｔｙｕｒａｌｌｙ ｏｃｕｒｒｉｎｇ；例えば、化学的合成または組換え的に生産されたものであってもよい）。前記のような組換え技術は、当該技術分野に広く公知されている。
本発明によるアルファ－シヌクレイン抗体またはこれを含む二重特異抗体はアルファ－シヌクレイン病（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ）の予防または治療用薬学組成物として使用でき、前記アルファ－シヌクレイン病（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ）はパーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）を含むものであってもよいが、これに限定されない。
本発明によるアルファ－シヌクレインまたはその凝集体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の相補性決定部位を含む重鎖可変領域；およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３の相補性決定部位を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
一実施形態で、前記抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は下記ＣＤＲ配列を含むことができる：
配列番号１３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、
配列番号１３６または１３７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、
配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）、
配列番号１３９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、
配列番号１４０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および
配列番号１４１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）。
前記重鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列と軽鎖ＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列を表６および表７に整理した。表７に示すＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃおよびＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬ４の軽鎖はＣＤＲ１～ＣＤＲ３のアミノ酸配列は同一であるが、フレームワーク配列が異なる。
Figure 2023113599000007
Figure 2023113599000008
本明細書に開示された多様な重鎖および軽鎖可変領域は完全な抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖を形成するために前記重鎖および軽鎖不変領域に結合できる。また、このように生成されたそれぞれの重鎖および軽鎖配列はまた、完全な抗体構造を形成するために組み合わせることができる。
例えば、本発明による抗－アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４２～配列番号１４６のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４７～配列番号１４８のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域の例示的な配列を下記表８に示す。
Figure 2023113599000009
また、一実施形態による抗体または抗原結合断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを通じた例示的な抗体を表９に記載した。
Figure 2023113599000010
他の実施形態で、抗－アルファ－シヌクレイン抗体は、前記記載された軽鎖または重鎖のみからなるものであってもよい。他の実施形態で、抗－アルファ－シヌクレイン抗体は、軽鎖可変領域または重鎖可変領域のみからなるものであってもよい。
また他の実施形態で、前記表８に開示された重鎖可変領域および軽鎖各可変領域は組み合わせられて多様な抗体を形成することができ、単一鎖形態に連結されてｓｃＦｖのような単鎖抗体を形成することもできる。
本明細書に開示された抗体は、本明細書に開示された他の抗体と特定領域または配列を共有する。一実施形態では、抗体または抗原結合断片の不変領域を共有することができる。他の実施形態では、Ｆｃ領域を共有することができる。
前記重鎖可変領域を含む重鎖および前記軽鎖可変領域を含む軽鎖を含むことができる。具体的に、前記重鎖可変領域および軽鎖可変領域は重鎖不変領域および軽鎖不変領域に結合でき、前記重鎖および軽鎖配列はまた、完全な抗体構造を形成するために組み合わせることができる。
本発明による可変領域と組み合わせられるこのような不変領域配列は例示的であり、前記不変領域は免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）の重鎖不変領域および軽鎖不変領域から適切に選択できる。例えば、重鎖不変領域はＩｇＧ１重鎖不変領域、ＩｇＧ３重鎖不変領域、またはＩｇＧ４重鎖不変領域であってもよく、軽鎖不変領域はカッパ不変領域またはラムダ軽鎖不変領域であってもよいが、これに制限されるわけではない。
一実施形態による抗α－ｓｙｎ抗体または抗原結合断片の可変領域および不変領域を含む例示的な抗体であって、抗－アルファ－シヌクレイン抗体ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）クローンは配列番号１４９のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号１５０のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体であってもよい。
本願による抗アルファ－シヌクレイン抗体は、治療抗体として単独で使用することもあるが、血液脳関門を通過させて脳に伝達させる機能を遂行することができる他の抗体と組み合わせて二重特異抗体として使用できる。前記血液脳関門を通過させて脳に伝達させる機能を遂行することができる抗体の一例は、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片であってもよい。二重特異抗体を製造することができる、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片は、前述の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体およびその抗原結合断片を全て含むことができ、例えば完全な抗体であってもよく、前記抗原結合断片はドメイン抗体、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖＦｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものであってもよい。
前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の抗原結合断片は、リンカー、例えば、ペプチドリンカーを媒介とするかまたはせずに連結できる。また、抗原結合断片内の重鎖部分と軽鎖部分、例えばｓｃＦｖ断片内の重鎖可変領域と軽鎖可変領域もペプチドリンカーを媒介とするかまたはせずに連結できる。前記ペプチドリンカーは前述の通りであってもよい。
本発明による抗アルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片は二重特異抗体の製造に使用でき、二重特異抗体の製造のための重鎖組み合わせ物の製造に使用される抗アルファ－シヌクレイン抗体の重鎖の例示は、抗アルファ－シヌクレイン抗体ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）に関するものであって、配列番号１４９のアミノ酸配列を有するｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）（ＩＧＧ）、配列番号１５１のアミノ酸配列を有するｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）（ＩＧＧ） ＷＩＴＨ ＨＯＬＥ ＭＵＴＡＴＩＯＮ ＡＴ ＦＣを含むことができる。
前述の抗アルファ－シヌクレイン抗体ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）を含んで二重特異抗体の製造のための重鎖組み合わせ物の製造に使用される抗アルファ－シヌクレイン抗体の重鎖の例示は下記表１０に記載されており、これら重鎖配列は配列番号１５１～配列番号１７２に表し、これに限定されない意図である。また、前記抗アルファ－シヌクレイン抗体の重鎖を用いた重鎖組み合わせ物と軽鎖を組み合わせた二重特異抗体クローンの具体的成分を下記表１０に示す。以下に提示された二重抗体は例示的に記載されたものであって、配列番号で表されていない場合でも二重抗体重鎖組み合わせ物の説明から構成が明確である。例示的二重特異抗体は下記表１０に具体的に示す。
Figure 2023113599000011
Figure 2023113599000012
Figure 2023113599000013
Figure 2023113599000014
本発明によるアルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片、またはこれを含む二重特異抗体を含むアルファ－シヌクレイン病の予防または治療用薬学組成物は、薬学的に有効量でアルファ－シヌクレイン抗体または二重特異抗体を含むことができる。
本明細書で、“治療”は疾病または疾病症状を減少、緩和、軽減、または除去するか、疾病の症状または病的状態をさらによく耐えられる状態になるようにすること、または疾病の症状または病的状態の悪化速度を遅らせることなどを含む、疾病または疾病の症状または病的状態の軽減または除去と関連する全ての作用を意味することができる。用語“対象”または“患者”はヒトまたはヒト患者を含む。
抗体の治療的有効量、および薬学的に許容可能な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／または補助剤を含む薬学的組成物もまた提供される。また、例えば、このような薬学的組成物を投与することによってアルファ－シヌクレインと関連した患者を治療する方法が含まれる。生体内投与に使用される薬学的組成物は典型的に無菌製剤として提供される。一応薬学的組成物が剤形化されると、これは溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶、または脱水されるか凍結乾燥された粉末として無菌バイアル内に貯蔵できる。このような剤形は即時使用可能な形態、または投与直前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥される）で貯蔵できる。
薬学的組成物の投与経路は公知された方法、例えば、経口；静脈内、腹膜内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、門脈内、または病巣内経路を通じた注射；持続放出システムまたは移植装置が使用できる。特定実施形態で、組成物はボーラス注射によって、または注入または移植装置によって連続的に投与できる。
本願に記載された本発明によるアルファ－シヌクレイン抗体またはその抗原結合断片、またはこれを含む二重特異抗体はアルファ－シヌクレインと関連する疾患および／または症状を検出、診断、またはモニタリングするための診断目的に使用できる。診断用途のために抗体は典型的に検出可能な標識物質で標識できる。
本発明の一例で製造された抗体はＩＧＦ１Ｒに脳内皮（ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）のトランスサイトーシス（ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）に最適化した結合力でＩＧＦ１Ｒ特異的に結合し、低い血液脳関門通過能で治療効能が制約的であった退行性脳疾患および脳ガン治療抗体の伝達に有用に使用できる。特に、本発明に開示された抗体はリガンドであるＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２およびそのホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）であるインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）がＩＧＦ１Ｒに結合することに影響を与えなく、ＩＧＦ１Ｒ受容体を通じた信号伝達を抑制しないなどの効果を示すので、血液脳関門通過と関連して有用性を有する。本願に開示された抗体はアルファ－シヌクレイン凝集体を効果的に除去するか分解を促進することができ、アルファ－シヌクレインの細胞間伝達を抑制することができて、アルファ－シヌクレインの凝集体蓄積と関連する疾患の治療に有用に使用できる。本発明によるアルファ－シヌクレイン抗体またはこれを含む二重特異抗体はアルファ－シヌクレイン病（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ）の予防または治療用薬学組成物として使用できる。
本発明の一例で製造された抗α－ｓｙｎキメラ抗体とヒト化１１Ｆ１１抗体の親和度をＥＬＩＳＡで測定した結果である。 本発明の一例で製造された抗α－ｓｙｎキメラ抗体とヒト化１１Ｆ１１抗体がアルファ－シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。 本発明の一例で製造された抗α－ｓｙｎキメラ抗体とヒト化１１Ｆ１１抗体がアルファ－シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。 本発明の一例で製造された抗α－ｓｙｎキメラ抗体とヒト化１１Ｆ１１抗体がアルファ－シヌクレイン凝集体に対する選好的結合特異性および親和度をＢＩＡｃｏｒｅで分析した結果である。 本願の一例で製造された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒタンパク質に対する結合データである。 本願の一例で製造された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒタンパク質に対する結合データである。 本願の一例で製造された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株に対する結合データである。 本願の一例で製造された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株に対する結合データである。 本願の一例で製造された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株に対する結合データである。 本願の一例で製造された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株への内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および細胞（ｃｅｌｌ）内でのｆａｔｅ関連データである。 本願の一例で製造された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株への内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および細胞（ｃｅｌｌ）内でのｆａｔｅ関連データである。 本願の一例で製造された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ発現細胞株への内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）および細胞（ｃｅｌｌ）内でのｆａｔｅ関連データである。 本願の一例で製造された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩＧＦ１あるいはインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）によるＩＧＦ１Ｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇに影響を与えないというデータである。 本願の一例で製造された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩＧＦ１あるいはインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）によるＩＧＦ１Ｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇに影響を与えないというデータである。 本願の一例で製造された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩＧＦ１あるいはインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）によるＩＧＦ１Ｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇに影響を与えないというデータである。 抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢを、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてさらによく通過するということを示す。 抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢを、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてさらによく通過するということを示す。 抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢを、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてさらによく通過するということを示す。 抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢを、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてさらによく通過するということを示す。 抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢを、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてさらによく通過するということを示す。 抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体と治療抗体の二重特異抗体および抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢを、治療抗体のみから構成された単独抗体に比べてさらによく通過するということを示す。 抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体の脱アミド化位置を確認した結果である。 抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープマッピング結果である。 本願の一例で製造された二重特異抗体の各抗原に対する結合力を測定するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。 本願の一例で製造された二重特異抗体の各抗原に対する結合力を測定するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。 キメラ抗体とヒト化した抗体の各抗原に対する結合力を比較するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。 キメラ抗体とヒト化した抗体の各抗原に対する結合力を比較するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。 本願の一例で製造された二重特異抗体に対して小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）の食細胞作用に対する活性を評価した結果である。 本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。 本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。 本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。 本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。 本願の一例で製造された二重特異抗体に対して単独抗体と比較してマウス動物モデルでの効能を評価した結果である。 本願の一例で製造された二重特異抗体に対してＦｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを行って半減期増大およびＢＢＢ通過向上を確認した結果である。 本願の一例で製造された二重特異抗体に対してＦｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを行って半減期増大およびＢＢＢ通過向上を確認した結果である。 本願の一例で製造された二重特異抗体に対してＦｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを行って半減期増大およびＢＢＢ通過向上を確認した結果である。 本願の一例で製造された二重特異抗体に対してマウス動物モデルでのα－ｓｙｎ減少能を評価した結果である。 それぞれ、本願の一例で製造された脱アミド化抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体と対照群抗体の抗原結合力をＥＬＩＳＡで比較分析した結果である。 それぞれ、本願の一例で製造された脱アミド化抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体と対照群抗体の抗原結合力をＥＬＩＳＡで比較分析した結果である。 それぞれ、本願の一例で製造された脱アミド化抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体と対照群抗体の抗原結合力をＥＬＩＳＡで比較分析した結果である。 本願の一例で製造された脱アミド化二重特異抗体のＩＧＦ１Ｒ特異的結合力をＦＡＣＳで分析した結果である。 本願の一例で製造された脱アミド化二重特異抗体のＩＧＦ１Ｒ特異的結合力をＦＡＣＳで分析した結果である。 本願の一例で製造された脱アミド化二重特異抗体のＩＧＦ１Ｒ特異的結合力をＦＡＣＳで分析した結果である。 本願の一例で製造された脱アミド化二重特異抗体と対照群抗体のｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢ通過能を比較分析した結果である。 本願の一例で製造された脱アミド化二重特異抗体と対照群抗体のｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢ通過能を比較分析した結果である。
本発明を下記実施例を挙げてさらに詳しく説明するが、本発明の範囲が下記実施例で限られる意図ではない。
実施例１．マウスアルファ－シヌクレイン抗体の製造
１－１：免疫化およびハリブリドーマ生産
抗原としては全長（１４０残基）またはＣ－末端２１個残基が切断されたアルファ－シヌクレイン単量体を３７℃温度ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃに入れて１４日間１０５０ｒｐｍで振って凝集化させソニケーションして使用した。前記製造された１ｍｇ／ｍｌ濃度の１４０個および１１９個残基のアルファ－シヌクレインフィブリルそれぞれをアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）と１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合してよく混ぜた。ヒトアルファ－シヌクレイン（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）のアミノ酸配列を配列番号１７３に示す。
その次に、前記準備した混合物２００μＬを５～７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの皮下に注射し、２週後に、同様な方法で製造した混合物２００μＬを追加的に皮下注射してブースティングさせた。ブースティング１週後に血液を採取して投与抗原を付けたＥＬＩＳＡ方法を使用して免疫化滴定（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｔｅｒａｔｉｏｎ）を行った。その次に、３次ブースティングは、抗原のみを皮下注射した。
その次に、前記のように免疫が完了したマウスの脾臓を除去して、これから細胞を確保した。その次に、脾臓細胞を１０％ＦＢＳが添加されたＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に懸濁させた。ハリブリドーマを製造するためにミュリン骨髄腫細胞であるＳＰ２／０－Ａｇ１４と脾臓細胞を血清が含まれていないＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地で混合した後、遠心分離を行って培地を除去した。その次に、細胞ペレットにＰＥＧを添加した後、３７℃で１分間培養して細胞融合を誘導した。
１－２：単細胞クローニングおよび抗体精製
融合２週後に、細胞培養培地を用いてマウスに投与した抗原を付けたＥＬＩＳＡ方法を使用して抗体を生産するマウスＢ細胞との融合を確認した。その次に、ハリブリドーマを用いて単細胞クローニングを行って単クローン抗体を生産するハリブリドーマを総１６個選別した。全長（１４０残基）アルファ－シヌクレイン凝集体を抗原として用いて９Ｂ１１（それぞれＩｇＧ１ ｋａｐｐａ）クローンを得て、Ｃ－末端２１個残基が切断されたアルファ－シヌクレイン凝集体を抗原として用いて３Ａ９および１１Ｆ１１（それぞれＩｇＧ２ｂ ｋａｐｐａ、ＩｇＧ２ｂ ｋａｐｐａ）のクローンを得た。
前記抗体の精製のために、１０％ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ１６４０培地で各ハリブリドーマを培養し、抗体生産のために血清（ｓｅｒｕｍ）のないＳＦＭ培地に培養培地を交替した後、４日程度培養する。細胞培養上清液を分離して遠心分離した後、０．２２μｍフィルターでろ過した後、ＩｇＧ１タイプはｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ｃｏｌｕｍｎで、残り抗体はｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｃｏｌｕｍｎで精製した。
１－３：可変領域配列決定
可変領域およびＣＤＲ配列はＡｈｎ ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ ２００４、１８（２）：２３７－２４１論文を参照して決定した。ハリブリドーマを培養した後、遠心分離して細胞のみを分離した。分離されたハリブリドーマにトリゾールを入れてＲＮＡを分離し、これをテンプレートにしてｃＤＮＡを合成した後、塩基配列分析を通じて可変領域およびＣＤＲ配列を確認した。
実施例２．キメラ抗アルファ－シヌクレイン抗体の製造
２－１：抗体クローニングおよび発現
確保した重鎖可変領域および軽鎖可変領域の抗体ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列を用いて、短い断片のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であるｇｂｌｏｃｋ（ｍ．ｂｉｏｔｅｃｈ）を合成し、これを用いて動物細胞培養用ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）にクローニングした。可変領域前後に重畳したヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を約２０ｂｐ程度含んでｇｂｌｏｃｋを合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ベクターの可変領域を除いた部分をＰＣＲで増幅後準備して、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ方法でクローニングした。
前記クローニングされた抗体をトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）および発現するために、前記製造されたベクターをｍａｘｉ－ｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）して、多量のｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを確保後、次の通り細胞に導入した。形質注入前日、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標名）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２７）細胞をＥｘｐｉＣＨＯ（商標名）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１００－０１）培地に３×１０Ｅ６～４×１０Ｅ６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度を合わせた後、８％ ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍで１日間培養した。ＤＮＡ形質注入当日、７×１０Ｅ６～１０×１０Ｅ６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率は９５％以上で育った細胞を新鮮な培地を用いて６×１０６ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで希釈して準備した。
準備された母細胞への形質注入のため、にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標名）ＣＨＯ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２９）を使用して、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標名）ＣＨＯ ＆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ複合体を準備した。冷たいＯｐｔｉＰＲＯ（商標名）ＳＦＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：１２３０９０１９）培地をそれぞれ分注して、適正濃度で準備したＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標名）ＣＨＯ試薬をそれぞれ接種後、ｍｉｘして常温で５分間静置し、母細胞に接種して形質注入後、培養を始めた。形質注入翌日にはＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標名）ＣＨＯ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔに含まれているｅｎｈａｎｃｅｒおよびｆｅｅｄを形質注入細胞に接種し、５日後にはｆｅｅｄを追加接種後、８％ ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍ条件で１０日間培養して生産を完了した。
生産が完了した培養液の収得のために遠心分離用瓶に培養液を移して４℃、６５００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、０．２μｍの大きさのフィルターでフィルタリングを行って、浮遊物を除いた培養液を確保して以後精製過程を行った。
２－２：抗体の精製および配列確認
ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１１－００３４－９４）を使用して培養液を精製した。平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ）を使用して平衡化させた後、回収された培養液をカラムにローディングした。ローディングが完了すれば、５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ５．０で中間洗浄後、５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ３．４を用いて溶出を行った。溶出液に１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０を添加してｐＨ６．０になるように中和した。その後、溶出液をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）でバッファー交換および濃縮して、使用時まで４℃に保管した。
追加精製が必要な場合、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムに１Ｘ ＰＢＳをバッファーにして１次精製分を通過させて溶出試料の大きさに基づいて２次精製を行った。前記精製された抗体のアミノ酸配列を質量分析方法で分析し、マウス（ｍｏｕｓｅ）由来単一クローン抗体の可変領域と一致することを確認した。
前記方法で確認された３Ａ９、９Ｂ１１、１１Ｆ１１抗体の可変領域をヒトＩｇＧ１アイソタイプのｂａｃｋｂｏｎｅ可変領域部分に置換してキメラ形態のヒトＩｇＧ１抗体を製作した。前記得られたキメラ抗体のうち、特にＣｈ１１Ｆ１１抗体はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号１７６重鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１－ＶＨ）と配列番号１７６の軽鎖可変領域配列（ｃｈ１１Ｆ１１－ＶＬ）の組み合わせを含む。下記表１１で太く下線で表示された部分がＣＤＲ配列である。
Figure 2023113599000015
実施例３．ヒト化抗体の製造
３－１：ライブラリーファージ（Ｌｉｂｒａｒｙ ｐｈａｇｅ）準備
キメラ抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３ ｒｅｓｉｄｕｅにヒトフレームワーク（ｈｕｍａｎ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を結合させながら各ＣＤＲ ｒｅｓｉｄｕｅにマウス（ｍｏｕｓｅ）あるいはヒト由来シークエンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が導入されたミニ（ｍｉｎｉ）ライブラリーを製作した。当該ライブラリーのコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）をクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ、Ｃ０８５７）３４μｇ／ｍｌ、２％グルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｇ５４００）および５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ、Ｍ２３９３）が含まれている２Ｘ ＹＴ［Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＣＯＮＤＡ、１６１２．００）１７ｇ、イースト抽出物（ＣＯＮＤＡ、１７０２．００）１０ｇ、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）５ｇ］培地に接種後、３７℃で３時間程度培養してＯＤ６００値が０．５から０．７になるようにした後、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ）を感染させた後、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｋ１８７６）７０μｇ／ｍｌ、１ｍＭ ＩＰＴＧ（ＥＬＰＩＳＢＩＯ、ＩＰＴＧ０２５）を添加した２Ｘ ＹＴ培地で３０℃、１６時間培養してファージパッキングを誘導した。その次に、培養液を４５００ｒｐｍ、４℃条件で１５分間遠心分離した後、上澄み液に４％ ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ、８１２５３）と３％ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）を添加してよく溶かした後、氷で１時間反応させた。これを再び４℃条件で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、ペレットをＰＢＳで懸濁した後、再び４℃条件で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してライブラリーファージを含む上澄み液を得て、新たなチューブに入れて使用時まで４℃で保管した。
３－２：ファージディスプレイパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）
具体的に、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ｍａｘｉｓｏｒｐ ４４４２０２）に１０μｇ／ｍｌ濃度の組換えアルファ－シヌクレイン凝集体をＰＢＳに添加して４℃で一晩試験管表面にタンパク質を吸着させた後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）３％溶液を試験管に添加して、アルファ－シヌクレイン凝集体が吸着していない表面を保護した。試験管を空けた後、ＢＳＡ３％溶液に分散された１×１０１２ｃｆｕ抗体ファージライブラリーをアルファ－シヌクレイン単量体タンパク質が吸着されている免疫試験管に入れて常温で１時間反応させた（ネガティブ選別）。アルファ－シヌクレイン単量体に非結合されたファージを回収してアルファ－シヌクレイン凝集体が付着された免疫試験管に常温で２時間結合させた。その次に、非特異的に結合したファージをＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）溶液で５回～３０回洗い落とした後、残っている抗原特異的ファージ抗体を１００ｍＭトリエチルアミン溶液を用いて回収した。回収されたファージを１Ｍトリスバッファー（ｐＨ７．４）で中和させた後、ＥＲ２５３７大腸菌に３７℃で１時間感染させ、感染した大腸菌をカルベニシリンを含有する２Ｘ ＹＴ寒天培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。翌日培養された大腸菌を４ｍｌの２Ｘ ＹＴカルベニシリン培養液に懸濁し１５％グリセロールを添加して、一部は－８０℃に保管し、残りは次のラウンドのパニングのためにファージを製造した。このような過程を総３ラウンド繰り返して抗原特異的な抗体を増幅させた。パニングラウンドが進行するほど、ＰＢＳ－Ｔを用いた洗浄回数を増加させて抗原特異的ファージを増幅および濃縮した。
３－３：単一クローンファージ抗体選別（ｓｉｎｇｌｅ ｃｌｏｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
前記パニングを通じて得られたファージプール（ｐｈａｇｅ ｐｏｏｌ）からアルファ－シヌクレイン凝集体に特異的に結合する単一クローン抗体を選別するために次のような実験を行った。
濃縮されたプールから単一クローンを分離するために、ＬＢ－テトラサイクリン／カルベニシリン寒天培地に前記ファージプールを塗抹した後、培養して単一コロニーを確保した。その次に、単一クローンをウェル当り４００μｌの２Ｘ ＹＴ－テトラサイクリン／カルベニシリン培地が入った９６ディープウェルプレートに接種して一晩育てた後、培養液１０μｌを新たな３９０μｌの２Ｘ ＹＴ－テトラサイクリン／カルベニシリン培地が含まれている９６ディープウェルプレートに入れて３７℃で４時間培養した。前記培養液に１ｍＭ ＩＰＴＧになるように入れて、３０℃で一晩培養した。一晩培養した培養液を遠心分離して上澄み液を取った。
その次に、ＥＬＩＳＡ方法を使用してアルファ－シヌクレイン凝集体と結合する単一クローン可溶性ｓｃＦｖを発現するクローンを選択した。具体的に、９６ウェルプレートに実施例１－１で選別された７Ｂ７抗体を入れて、４℃で一晩コーティングした。３％ＢＳＡを各ウェル当り２００μＬずつ入れて３７℃で２時間ブロッキングした。その次に、アルファ－シヌクレイン凝集体と単量体を１００ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度でそれぞれローディングした後、３７℃で２時間反応させた。その次に、ＰＢＳ－Ｔ ３００μＬで５回洗浄した。前記準備された単一クローン上澄み液は３％ ＢＳＡと１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した後、前記混合液を前記凝集体および単量体と結合させたプレートに１００μＬずつローディングした後、３７℃で２時間反応させた。その次に、ＰＢＳ－Ｔ ３００μＬで５回洗浄した後、抗－ＨＡ ＨＲＰ結合抗体を入れて３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した。ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）１００μＬを入れて発色した後、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４ ５０μＬを入れて反応を停止した後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度が０．５以上であるクローンを結合による陽性反応と見なし、ＢＳＡ非特異的に結合するクローンは排除させた。
ライブラリーで発見されたクローンのＣＤＲ ｒｅｓｉｄｕｅはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方式で分析を併行してフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）との結合に深刻な問題が発生するかＣＤＲを除いたフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）部分にＴ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ、Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅおよびＭＨＣＩＩ ｅｐｉｔｏｐｅが存在しないクローンを選別した。
その後、前記選別されたクローンの可変領域をヒトＩｇＧ１アイソタイプのｂａｃｋｂｏｎｅ可変領域部分に置換してＩｇＧ１ ｂａｃｋｂｏｎｅのヒト化抗体を製作した。具体的に、ｈｕ１１Ｆ１１（Ｈ２Ｌ４）はＩｇＧ形態の抗体であって、配列番号１４６のＨｕ１１Ｆ１１－ＶＨ２と配列番号１４８のＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬ４の組み合わせであり、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．１）は配列番号１４２のＨｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ１と配列番号１４７のＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃ）の組み合わせを含むＩｇＧ形態の抗体であり、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．２）は配列番号１４３のＨｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ２と配列番号１４７のＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせを含むＩｇＧ形態の抗体であり、Ｈｕ１１Ｆ１１＿（ｖｅｒ．３）は１４４のＨｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ３と配列番号１４７のＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせを含むＩｇＧ形態の抗体であり、Ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）は配列番号１４５のＨｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ４と配列番号１４７のＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせたＩｇＧ形態の抗体であるのを確認した。
実施例４．抗－アルファ－シヌクレイン抗体のＥＬＩＳＡ分析試験
実施例２で得られたキメラ抗体（Ｃｈ１１Ｆ１１）および実施例３で得られたヒト化抗体（Ｈｕ１１Ｆ１１）の結合力を定量的に分析するためにｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡを行った。
具体的に、それぞれ抗体を０．０４～４００ｎＭの濃度で１／１０ずつ希釈して９６ウェルプレートにコーティングした後、ここに２０００ｎｇ／ｍｌの凝集体を各ウェルに処理した。１ＸＰＢＳで洗浄後、その次に、ビオチンが結合されたｃａｐｔｕｒｅ抗体およびＨＲＰが結合されたストレプタビンを処理した後、基質としてＴＭＢと反応させた後、その吸光度を測定した。結果は図７に記載されている。
図１に示したように、本発明によるヒト化された抗体、特にキメラ１１Ｆ１１に由来したヒト化抗体（ヒト化１１Ｆ１１抗体）はキメラ１１Ｆ１１クローンと同等な結合力を示すことが？確認された。ヒト化抗体、特に１１Ｆ１１由来ｖａｒｉａｎｔである、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．１）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ１とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ２とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ３とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃの組み合わせ、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）、即ち、Ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ－ｖ４とＨｕ１１Ｆ１１－ＶＬｖ３ ４ｃはキメラ１１Ｆ１１クローンと類似の結合力を示すことが確認され、そのＥＣ５０は１１．５～１５．１ｎＭであって、キメラ１１Ｆ１１抗体のＥＣ５０である１２．５ｎＭと類似の値を示した。
実施例５：抗アルファ－シヌクレイン抗体を用いたＢＩＡｃｏｒｅ分析
実施例２で得られたキメラ抗体および実施例３で得られたヒト化抗体の結合力をＢＩＡｃｏｒｅを使用して定量的に分析した。
分析に使用された機器はＴ２００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓ／Ｎ：１５６５８８８）を使用した。ＣｈｉｐはＰｒｏｔｅｉｎ Ａを使用し（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．２９－１２７５－５６）、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒは１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ ｐＨ１．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．ＢＲ－１００３－５４）、Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒとａｎａｌｙｔｅ希釈、サンプル希釈緩衝液としてはＨＢＳ－ＥＰを使用した。実施例２および実施例３で製造された抗体は１Ｘ ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．ＢＲ－１００６－６９）で希釈し、α－ｓｙｎ単量体（１ｍｇ／ｍｌ）またはフィブリルタンパク質（３ｍｇ／ｍｌ）（ａｎａｌｙｔｅ）は２倍ずつ順次に希釈して、０ｎＭ含む総６個濃度（０、０．３９、１．５６、６．２５、２５、１００ｎＭ）で分析した。キャプチャの場合、単量体は標的ＲＵを８００（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ）とし、フィブリルは標的ＲＵを１００（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ）とし、キャプチャｐｈａｓｅをｃｏｎｔａｃｔ ｔｉｍｅを６０秒、ｆｌｏｗ ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとし、ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄを１８０秒として行った。ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅではａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅを１２０秒とし、ｆｌｏｗ ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとし、ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅではｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｔｉｍｅを３６０秒とし、ｆｌｏｗ ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとした。Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅでは、ｆｌｏｗ ｒａｔｅを３０μｌ／ｍｉｎとしてｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅを２４０秒（１次）、６０秒（２次）、二回にわたって行った。１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを使用してｆｉｔｔｉｎｇし、ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅはＢＩＡＣｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。
前記分析結果を図２ａ～図２ｃ、および下記表に示す。
Figure 2023113599000016
その結果、本願に記載されたヒト化抗体、特に１１Ｆ１１のｖａｒｉａｎｔ、即ち、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．３）およびｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．４）はキメラ１１Ｆ１１クローンと類似なＫＤ値を示すことが確認され、その結合程度としてはヒト化クローンが０．０２～０．０６×１０－９ＭのＫＤ、キメラ１１Ｆ１１クローンが０．０２×１０－９Ｍの低いＫＤ値、即ち、凝集体に対する高い結合力を示した。
実施例６．ＩＧＦ１Ｒ抗体製造（ｓｃＦＶ）
６－１：ＩＧＦ１Ｒ抗体（ｓｃＦＶ）の製造
ファージディスプレイ／パニング技術を用いて単一クローン抗体を製造した。
具体的に、抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体製造のためのファージディスプレイパニング遂行およびその他分析に使用される抗原を次のようなタンパク質を使用した。ヒトＩＧＦ１Ｒの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）で信号配列が除去された配列番号１７４のアミノ酸残基の３１番から９３２番のアミノ酸配列のＣ－末端にヒスチジン－タグ（Ｈｉｓ ｔａｇ）が結合されたものを使用した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ、３９１－ＧＲ）。
また、種間交差反応性を確認するために、Ｃ末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ ｔａｇ）が融合されたサルＩＧＦ１Ｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｃａｎａｄａ）、マウスＩＧＦ１Ｒ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、６６３０－ＧＲ／ＣＦ）、およびラットＩＧＦ１Ｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｃａｎａｄａ）のタンパク質を抗原として使用した。
多様性を有するヒト由来ＳｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリー細胞（ＯＰＡＬ ｌｉｂｒａｒｙ、梨花女子大学校のシムヒョンボ教授製作）１×１０１０個をクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ、Ｃ０８５７）３４ｕｇ／ｍｌ、２％グルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｇ５４００）および５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ、Ｍ２３９３）が含まれている２Ｘ ＹＴ［Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＣＯＮＤＡ、１６１２．００）１７ｇ、イースト抽出物（ＣＯＮＤＡ、１７０２．００）１０ｇ、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）５ｇ］培地に接種後、３７℃で３時間程度培養してＯＤ６００値が０．５から０．７になるようにした後、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ）を感染させた後、クロラムフェニコール３４ｕｇ／ｍｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、カナマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｋ１８７６）７０ｕｇ／ｍｌ、１ｍＭ ＩＰＴＧ（ＥＬＰＩＳＢＩＯ、ＩＰＴＧ０２５）を添加した２Ｘ ＹＴ培地で３０℃で１６時間培養してファージパッキングを誘導した。その次に、培養液を４５００ｒｐｍ、４℃条件で１５分間遠心分離した後、上澄み液に４％ＰＥＧ６０００（Ｆｌｕｋａ、８１２５３）と３％ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ７６５３）を添加してよく溶かした後、氷で１時間反応させた。これを再び４℃条件で８０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、ペレットをＰＢＳで懸濁した後、再び４℃条件で１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してライブラリーファージを含む上澄み液を得て、新たなチューブに入れて使用時まで４℃で保管した。
６－２：ファージディスプレイパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）
ヒトＩＧＦ１Ｒ抗体をスクリーニングするために次のような方法で総３回パニングを行った。本発明に使用されたファージライブラリーは合成ヒトｓｃＦｖライブラリーであり、ファージディスプレイパニング過程および結果は次の表の通りである。
Figure 2023113599000017
具体的に、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、ｍａｘｉｓｏｒｐ ４４４２０２）に５ｕｇ／ｍｌ濃度の組換えヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ、３９１－ＧＲあるいはＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ、１０１６４－Ｈ０８Ｈ－５０Ｒ）を１ｍｌ添加して４℃で１６時間試験管表面にコーティングした後、上澄み液を除去しＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）３％が含まれているＰＢＳ溶液を４ｍｌ添加して３７℃で１時間反応させてＩＧＦ１Ｒが吸着していない表面にＢＳＡを結合させることによって非特異的な結合を遮断した。その次に、上澄み液を除去した後、実施例１１－１で準備したファージライブラリーをＢＳＡ １．５％溶液と混合して前記免疫試験管に３７℃で１時間反応させて、ＩＧＦ１Ｒ特異的なファージが抗原に結合するようにした。その次に、ＰＢＳ－Ｔ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）溶液で１回洗い落として、非特異的に結合されたファージを除去した後、１００ｍＭトリエチルアミン溶液を用いてＩＧＦ１Ｒに結合したファージを回収した。
回収されたファージを１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で中和させた後、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＥＲ２７３８大腸菌に３７℃で１時間感染させた後、前記大腸菌をテトラサイクリンとカルベニシリンを含有するＬＢ寒天培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。翌日、培養された大腸菌をテトラサイクリンとカルベニシリンを含有した５ｍｌのＳＢ（ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）培地に懸濁し、同一体積の５０％グリセロールを添加して一部は８０℃に保管し、残りの中の５０ｕｌを４０ｍｌのＳＢ－テトラサイクリン／カルベニシリン培地に懸濁した後、１０１２ＰＦＵのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ）を入れて徐々に攪拌し、３７℃で１時間培養した。その後、培養液にカナマイシンを添加後、３０℃で約１６時間培養してヘルパーファージが感染された大腸菌のみが培養されるようにした。
翌日、培養液を遠心分離した後、上澄み液を取って４％ＰＥＧ８０００、３％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むバッファーを添加して４℃で約１時間反応させてファージを沈殿させ遠心分離した。その次に、上澄み液を除去し沈殿したファージを１％ＢＳＡが含まれているＰＢＳバッファーで再懸濁してこれを次のラウンドのパニングに使用した。前記のような過程を４回繰り返し、パニングラウンドが進行するほどＰＢＳ－Ｔを用いた洗浄回数を増加させて抗原特異的ファージを増幅および濃縮した。
６－３：単一クローンファージ抗体選別（ｓｉｎｇｌｅ ｃｌｏｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
ヒトＩＧＦ１ＲのＥＣＤ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）に対する結合力（ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）だけでなく、ＩＧＦ１Ｒ発現細胞株であるＭＣＦ－７に対する結合力（ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）を示すクローンを選別した。
具体的に、実施例を通じて得られたファージプール（Ｐｈａｇｅ ｐｏｏｌ）からＩＧＦ１Ｒに特異的に結合する単一クローン抗体を選別するために次のような実験を行った。
濃縮されたプールから単一クローンを分離するために、ＬＢ－テトラサイクリン／カルベニシリン寒天培地に得られたファージプールを塗抹、培養して単一コロニーを確保した。このコロニーを９６－ディープウェルプレートに接種して一晩培養した後、培養液１０ｕｌを同じ方法で９６－ディープウェルプレートに再接種して３７℃で約４時間培養して滴定ＯＤ（０．５～０．７）になるようにした。前記培養液に２０ＭＯＩヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ）を入れた後、３７℃で１時間反応させた。その後、培養液にカナマイシンを入れ、３０℃で一晩培養した。翌日、培養液を遠心分離して上澄み液を取ってＩＧＦ１Ｒ特異的ファージを選別するためのＥＬＩＳＡを行った（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ． Ｒａｄｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ． ２０００． Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． １ ｓｔｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ． ＮＹ． ＵＳＡ． ｐｐ．１１．９－１１．１２）。
ＥＬＩＳＡプレートに組換えＩＧＦ１Ｒを各ウェル当り１００ｎｇ入れ、４℃で約１５時間反応させて抗原をプレート（ｐｌａｔｅ）上にコーティングした。非特異的結合を防止するために３％ＢＳＡが含まれているＰＢＳバッファーをウェル当り２００ｕｌずつ添加した後、３７℃で約１時間反応させた。上澄み液を捨てた。
前記準備した単一クローンファージが含まれている１００ｕｌの溶液を各ウェルに入れて３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ－Ｔ ３００ｕｌで３回洗浄した。ＩＧＦ１Ｒ抗原に結合されたファージ（ｐｈａｇｅ）を検出するために３％ＢＳＡが含まれているＰＢＳバッファーに抗－ＨＡ ＨＲＰを１：５０００で希釈した後、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ－Ｔ ３００ｕｌを用いた洗浄過程を３回行った後、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）１００ｕｌを入れて発色させた後、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４ ５０ｕｌを入れて反応を終了した。これを４５０ｎｍで吸光度を測定して、対照群であるＢＳＡに比べて吸光度が高いクローンを抗原特異的抗体クローンとして選別した。２回のスクリーニングにわたって１５６４などクローンを選別した。
実施例７．ＩＧＦ１Ｒ抗体の変異体（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔ）の製造
リガンド結合力およびＢＢＢ通過能を評価して選別されたクローンに対してａｆｆｉｎｉｔｙ ｖａｒｉａｔｉｏｎを行って抗体を最適化した。１次試みでは１５６４ｓｃＦｖを基盤にして重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）のＣＤＲ２と軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）のＣＤＲ３をｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎするためのＮＮＳ ｈａｎｄ－ｍｉｘ ｐｒｉｍｅｒを製作し、ＰＣＲ技法を用いてｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ配列が含まれている１５６４ｓｃＦｖ遺伝子を増幅させた。増幅された遺伝子はｐＣｏｍｂ３ｘ ｖｅｃｔｏｒに挿入することによってファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）に適したライブラリー形態に作り、ライブラリーパニング（ｌｉｂｒａｒｙ ｐａｎｎｉｎｇ）およびＥＬＩＳＡスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を通じてＩＧＦ１Ｒに結合する複数のｓｃＦｖクローンを選別することができた。選別されたクローンは遺伝子シークエンシングを通じて可変部位のアミノ酸配列を確認した。
２番目の試みではＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３にそれぞれｇｅｒｍｌｉｎｅ ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎを導入した重鎖、軽鎖（ｈｅａｖｙ、ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）に対する２個のミニライブラリー（ｍｉｎｉ ｌｉｂｒａｒｙ）を製作した。当該クローンの生産性および抗原結合力を基にして変異体（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔ）を選別して最終的にクローンを確保した。
実施例８．Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｄｕｅ変異抗体製造
８－１：Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｄｕｅ確認
脱アミド化反応は例えばアスパラギンの側鎖ペプチド結合を攻撃して対称構造のスクシンイミド中間産物を作ることを意味し、この中間産物は加水分解によってアスパラギン酸あるいはイソアスパラギン酸のうちの一つに変わるようになる。特に、ＣＤＲに脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）が発生すれば抗体が分解されながら抗原への結合が弱くなって効能低下およびｓａｍｐｌｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙが誘発されることがあり、Ｓａｍｐｌｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙは向後の臨床承認などでそのｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎのため複雑性を誘発する。したがって、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析およびペプチドマッピング（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｐｐｉｎｇ）を通じて脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）が発生する位置を確認し、脱アミド化を防止して安定性を確保すると同時に、優れた物性および効能を得ようとした。
図８に示したように、ｐａｒｅｎｔａｌである１５６４クローンのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析とペプチドマッピング（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍａｐｐｉｎｇ）で実際脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）が起こることを確認した。この時、試料を４℃あるいは４０℃に１週間保管した後に分析を行い、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２で脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）が発生するのを確認した。実施例７に記載されたａｆｆｉｎｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔに対しても分析を行って脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）発生位置を確認した。
８－２：変異抗体製造
Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｒｅｓｉｄｕｅを除去するために以下のようにｒｅｓｉｄｕｅを置換したｍｕｔａｎｔを生産した。
１）アミノ酸配列でＡｓｎをＡｓｎと類似なＤあるいはＱに変えた。結合力に変化がないことが確認されれば、当該ｒｅｓｉｄｕｅは全てＱで置換する。
２）ＬＣＤＲ３の脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）発生ｒｅｓｉｄｕｅであるＮ９５ａはｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅを帯びるＨ、Ｒ、Ｋで置換した。このような脱アミド化工程が適用されたクローンは（ｄｅ）（ＳｔｏＰ）脱アミド化クローンとも呼ばれる。
３）脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）が発生するＣＤＲのすぐ次に位置したｒｅｓｉｄｕｅを置換した。これらｒｅｓｉｄｕｅは比較的大きさが小さく、ｃｈａｒｇｅが大きくないｒｅｓｉｄｕｅである（例：グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）あるいはセリン（ｓｅｒｉｎｅ））。したがって、当該ｒｅｓｉｄｕｅを、また相対的に大きさが大きくなく疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）の他のｒｅｓｉｄｕｅで置換することによって（例：バリン（ｖａｌｉｎｅ）あるいはアラニン（ａｌａｎｉｎｅ））、ｐａｒｅｎｔａｌ抗体（ｒｅｓｉｄｕｅが置換される前のクローン）との結合力差を最少化しようとした（表２１）。このような脱アミド化工程が適用されたクローンは（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化クローンとも呼ばれる。脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）が発生するｒｅｓｉｄｕｅの横のｒｅｓｉｄｕｅを置換する方法を下記表に示す。
Figure 2023113599000018
 イタリック体：脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）発生ｒｅｓｉｄｕｅ；
下線を引いた太字：置換されるｒｅｓｉｄｕｅ
実施例９．多様な形態の抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体の製造
９－１：抗－ＩＧＦ１Ｒミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）形態の抗体製造
実施例６～８で確保したＩＧＦ１Ｒ特異的単一クローンファージ抗体のｓｃＦｖ全体をＦｃのＣ－末端に連結してミニボディを製造した。このために本願に開示されたｓｃＦＶのアミノ酸配列を暗号化する核酸配列を製造し、この配列を制限酵素で切断して、Ｆｃをコーディングする核酸を含むｐｃＤＮＡ基盤の発現ベクターにクローニングした。
９－２：抗－ＩＧＦ１Ｒ２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態の抗体製造
実施例６～８で確保したＩＧＦ１Ｒ特異的単一クローンファージ抗体のｓｃＦｖ全体を、治療抗体ＩｇＧ形態のＣ－末端それぞれに二つを連結した２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態を製作した。このために本願に開示されたｓｃＦＶのアミノ酸配列を暗号化する核酸配列を製造し、この配列を制限酵素で切断して、治療抗体をコーディングする核酸を含むｐｃＤＮＡ基盤の発現ベクターにクローニングした。
９－３：抗－ＩＧＦ１Ｒ ＩｇＧ（Ｆｕｌｌ－ＩｇＧ）形態の抗体製造
実施例６および７で確保したＩＧＦ１Ｒ特異的単一クローンファージ抗体のうち、１５６４抗体およびＦ０６抗体の配列を全体ＩｇＧ１（Ｆｕｌｌ ＩｇＧ）形態に変換するために、重鎖と軽鎖領域の遺伝子配列を合成した（ジェノテック）。合成した重鎖および軽鎖遺伝子は、発現ベクターにクローニングした。
９－４：抗－ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態の抗体製造
実施例９－２が重鎖二つのＦｃのＣ－末端それぞれに抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がｓｃＦｖ形態に結合した２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態であれば、本実施例では重鎖中の一箇所のＦｃ Ｃ－末端にのみｓｃＦｖ一つが結合した１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態に抗体を製造した。このために実施例６～８で確保したＩＧＦ１Ｒ特異的単一クローンファージ抗体のうちの１５６４、Ｆ０６、Ｃ０４、ＶＨ５、ＶＨ１６、ＶＨ３５、ＶＨ９、ＶＨ２、ＶＨ７、ＶＨ３２をＦｃ Ｃ－末端中の一箇所にのみ結合させたベクター、Ｃ－末端に抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体が結合されていないベクターを製作した。当該Ｆｃ内にはｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎを導入して、細胞で抗体生産時、ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ形態が製作されるようにした。抗体生産のためにＣＨＯ－Ｓ細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）時には、治療抗体のＦｃ Ｃ－末端に抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体が結合された重鎖に対するベクター、治療抗体のＣ－末端に抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体が結合されていない重鎖に対するベクター、治療抗体の軽鎖に対するベクター、総３個のベクターを注入した。
９－５：多様な抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体の発現および精製
実施例９－１～９－４で製造されたベクターを次のように細胞に導入した。
具体的に、ＣＨＯ－Ｓ細胞をＣＤ－ＣＨＯ（Ｇｉｂｃｏ、１０７４３）培地に１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで濃度を合わせた後、８％ＣＯ２、３７℃で１日間培養した。ＤＮＡ形質注入当日２．５～３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに育った細胞を１％ＤＭＳＯが含むされているＣＤ－ＣＨＯ培地を用いて２．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で準備した後、８％ ＣＯ２、３７℃で３時間培養した。３０００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心分離後、上澄み液を除去した後、２．５％ ＦＢＳが含まれているＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。
その次に、ベクターの組み合わせを培地ｍｌ当り１μｇずつＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に希釈し、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６、ｓｔｏｃｋ濃度：１ｍｇ／ｍｌ）は培養培地ｍｌ当り８μｇ希釈した。ＤＮＡおよびＰＥＩ混合物を混合して、常温で１０分間静置した後、細胞が含まれているフラスコに入れた後、５％ ＣＯ２、３７℃、１００ｒｐｍで４時間培養した後、培養ボリュームの同一なボリュームのＣＤ－ＣＨＯ培地を入れた後、８％ ＣＯ２、３７℃、１１０ｒｐｍで４日間培養した。
前記得られた培養液を、平衡化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ）を通過させて平衡化したＭａｂ ｓｅｌｅｃｔｓｕｒｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、５ｍＬ）に通過させて発現された抗体がカラムに結合するようにした。その後、５０ｍＭ Ｎａ－ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液で溶出させた後、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を用いて中和させて最終ｐＨが７．２になるようにした。その後、緩衝液をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）に交換して、純度が高い場合、剤形化後、－２０℃に冷凍保管し、追加精製が必要な場合、追加精製時まで４℃に保管した。
追加精製が必要な場合、Ｈｉｌｏａｄ ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｃａｔ． Ｎｏ．２８－９８９３－３６）を使用して精製し、多様な他のｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを使用して精製することができる。平衡化バッファー（１ｘ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｐＨ７．４， Ｇｉｂｃｏ， Ｃａｔ． Ｎｏ． １００１０－０２３）を使用して平衡化させた後、１次精製が完了した試料をカラムにローディングした。精製完了した試料は剤形化後、－２０℃に冷凍保管した。
実施例１０．二重特異抗体の製造
本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体をリンカー（配列番号１３４）を使用して重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結してｓｃＦｖに製造し、抗α－ｓｙｎ抗体の完全な形態のＩｇＧ抗体重鎖不変領域のＣ末端にリンカー（配列番号１３３）を通じて連結して二重抗体を製造した。また、二重抗体のフォーマットとして、抗α－ｓｙｎ抗体の完全な形態のＩｇＧ抗体１分子当り抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖ一つ分子を連結して製造した１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）抗体と、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のｓｃＦｖ二つ分子を連結して製造した２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）抗体をそれぞれ製造した。
本実施例で二重抗体製造のために使用した抗α－ｓｙｎ抗体の配列およびこの発明によって製造した二重抗体の組み合わせ配列の例示は表１０に記載された通りである。２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）二重抗体および１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）二重抗体の具体的な製造方法は以下の通りである。
１０－１：２価（Ｂｉｖａｌｅｎｔ）二重抗体クローニング
２価（Ｂｉｖａｌｅｎｔ）二重抗体発現ベクターを製作するために、ｐｃＤＮＡ３．４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターのＭＣＳ（Ｍｕｌｔｉ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）内にｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅを含む抗体ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列を挿入した。二重抗体発現ベクターはモノシストロニックベクターであって、重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターをそれぞれ製作した。
重鎖発現ベクターに挿入された重鎖配列の場合、抗α－ｓｙｎ抗体をコーディングする重鎖可変領域およびヒト重鎖不変領域が連結された免疫グロブリンＣ末端に抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖがリンカーで連結された形態である。軽鎖発現ベクターに挿入された軽鎖配列の場合、抗α－ｓｙｎ抗体をコーディングする軽鎖可変領域およびヒト軽鎖不変領域が連結された形態である。
１０－２：１価（Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）二重抗体クローニング
１価（Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）二重抗体は、抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖがＣ ｔｅｒｍｉｎａｌにリンカーで接合されている抗α－ｓｙｎ免疫グロブリン重鎖（ｈｏｌｅ）とｓｃＦｖが連結されていない抗α－ｓｙｎ免疫グロブリン重鎖（ｋｎｏｂ）が結合した異種二量体に抗体軽鎖が接合された形態である。
重鎖異種二量体の接合効率を高めるために、Ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ技法が用いられた。即ち、Ｈｏｌｅ ｔｙｐｅの重鎖コーディング（ｃｏｄｉｎｇ）配列はＣＨ３部分でＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０６Ｖで置換し、ｋｎｏｂ ｔｙｐｅ重鎖コーディング（ｃｏｄｉｎｇ）配列はＣＨ３部分でＴ３６６Ｗにアミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）で置換した。
１０－３：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
前記製造されたベクターをｍａｘｉ－ｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）して、多量のプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡを確保後、次のように細胞に導入した。ＢｓＡｂを生産するために重鎖発現ベクターＤＮＡおよび軽鎖発現ベクターＤＮＡを１：１の比率で形質導入した。１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）ＢｓＡｂを生産するためにはｈｏｌｅ ｔｙｐｅ重鎖発現ベクターＤＮＡ、ｋｎｏｂ ｔｙｐｅ重鎖発現ベクターＤＮＡおよび軽鎖発現ベクターＤＮＡを０．５：０．５：１の比率で形質導入した。
形質注入前日、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標名）Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２７）細胞をＥｘｐｉＣＨＯ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１００－０１）培地に３×１０６～４×１０６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度を合わせた後、８％ ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍで１日間培養した。ＤＮＡ形質注入当日７×１０６～１０×１０６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、生存率は９５％以上に育った細胞を新鮮な培地を用いて６×１０６ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで希釈して準備した。
準備された母細胞に形質注入のために、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：Ａ２９１２９）を使用して、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ ＆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ複合体を準備した。冷たいＯｐｔｉＰＲＯ（商標名）ＳＦＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ：１２３０９０１９）培地をそれぞれ分注して、滴定濃度で準備したＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標名）ＣＨＯ試薬をそれぞれ接種後、混合（ｍｉｘ）して常温で５分間静置し、母細胞に接種して形質注入後、培養を始めた。形質注入翌日にはＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標名）ＣＨＯ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔに含まれているｅｎｈａｎｃｅｒおよびｆｅｅｄを形質注入細胞に接種し、５日後にはｆｅｅｄを追加接種後、８％ ＣＯ２、３７℃、１２０ｒｐｍ条件で１０日間培養して生産を完了した。
１０－４：Ｍｅｄｉｕｍ ｈａｒｖｅｓｔ
生産が完了した培養液の収得のために遠心分離用瓶に培養液を移して４℃、６５００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、０．２μｍの大きさのフィルターでフィルタリングを行って、浮遊物を除いた培養液を確保して以後の精製過程を行った。
実施例１１．抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ特異的結合力分析
１１－１：ミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｙ）形態抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒに対する結合力分析（ＥＬＩＳＡ）
実施例９－１で製作した９９６、１２２６、１５６４、ＭＫＪＰ２クローンのミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）形態が組換えＩＧＦ１Ｒに対する結合力および濃度依存的に結合するかどうかを確認するためにＥＬＩＳＡ分析を行った。
具体的に、抗体結合対象であるヒト組換えＩＧＦ１Ｒは細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ（ＥＣＤ））であって、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入した（６６３０－ＧＲ／ＣＦ）。９６－ウェルＥＬＩＳＡプレートに（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅｓ、ＮＵＮＣ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）ヒトＩＧＦ１ＲをＰＢＳバッファーに１ｕｇ／ｍｌで希釈してウェル当り１００ｕｌ入れた後、４℃で１６時間反応してコーティング後、上澄み液を除去した。３％ ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が含まれているＰＢＳバッファーをウェル当り２００ｕｌ入れ、２時間反応させて非特異的結合を遮断させた。
実施例９－１で製造した９９６、１２２６、１５６４、ＭＫＪＰ２クローンのミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）抗体を最高濃度２０ｎＭを基準にして３倍ずつ希釈して１２ポイントを作った後、各ウェルに１００μｌずつ移した後、常温で１時間処理後に、Ｔｗｅｅｎ２０が０．０５％含まれているＰＢＳバッファーを用いて４回洗浄し、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）に存在するｈｕｍａｎ Ｆｃを認知する抗－ｈｕｍａｎ ＨＲＰをブロッキングバッファーに１：５０００で希釈して各ウェルに１００ｕｌずつ移して１．５時間常温で反応させた。再び、ＰＢＳ－Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％）３００ｕｌを用いて４回洗浄した後、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）を使用して発色させた。酵素反応を０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸によって中止させ、マイクロプレートリーダー機（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を記録および分析した。
ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）４種クローンがヒトＩＧＦ１Ｒ組換えタンパク質に濃度依存的に結合し、具体的に、ＭＫＪＰ２が最も優れた結合力を、その次に９９６と１５６４が類似の結合力を示すのを確認し、１２２６はそれより若干劣る結合力を示すのを確認した。
１１－２：ＩＧＦ１Ｒ抗体の種間交差反応性のＥＬＩＳＡ分析
実施例９－２の方法によって製作した１５６４抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体と実施例６－３で確保した抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体の種間交差結合有無をＥＬＩＳＡ技法を通じて分析した。このために、まず、ヒト、サル、マウスおよびラットＩＧＦ１Ｒ抗原を１ｕｇ／ｍｌで希釈して各ウェルに１００ｕｌずつ入れ、４℃で１５時間反応してプレートの底にコーティングされるようにした。上澄み液を除去した後、３％ＢＳＡが含まれているＰＢＳバッファー２００ｕｌを各ウェルに処理して非特異的結合を遮断した。抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体を最高濃度４００ｎＭにして、ＰＢＳＢ（ＢＳＡ ３％ ｉｎ ＰＢＳ）に５倍ずつ希釈して前記各ウェルに処理した後、３７℃で１時間反応した。その次に、ＰＢＳバッファーを用いて５回洗浄した後、結合された抗体のＦａｂ部分を認知する抗－ヒトＦａｂ ＨＲＰを１：２００００で希釈して各ウェルに１００ｕｌ処理した後、３７℃で１時間反応させた。その次に、ＰＢＳバッファーで５回洗浄してＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）を使用して製造者の方法通りに発色させた。酵素反応を０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸によって中止させ、マイクロプレートリーダー機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡ遂行時、サンプルが多い場合はプレートを２つに分けて行い、実験結果は下記の表１５に示した。
具体的に、表１５でヒトＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体のＥＬＩＳＡ結果、１５６４ ＩｇＧと二重特異抗体のヒトＩＧＦ１Ｒに対するＥＬＩＳＡ結果、マウスＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体のＥＬＩＳＡ結果、ラットＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体のＥＬＩＳＡ結果、サルＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体のＥＬＩＳＡ結果を下記表に整理した。
下記の実験結果は多様な種の動物モデルを用いて効能を評価することができる長所を示すものであって、本願発明による抗体を用いて多様な種の疾患モデルを通じた治療剤を効能評価が可能であるのが分かる。
Figure 2023113599000019
 ＊：ｎｏｔ ａｖａｉｌａｂｌｅ
＊＊２０１：ｓｃＦｖ ｆｏｒｍ ｏｆ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ
１１－３：Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔのＩＧＦ１Ｒに対する結合力分析（ＦＡＣＳ）
実施例７で製作されたａｆｆｉｎｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔの結合力をＩＧＦ１Ｒタンパク質のＥＣＤに対するＥＬＩＳＡ遂行およびＭＣＦ－７に対する結合力をＦＡＣＳで分析した。
１次クローンに対する分析であって、表１６は１次選別された当該クローンの二重特異抗体形態でのＩＧＦ１Ｒ ＥＣＤタンパク質に対する結合ＥＬＩＳＡ分析結果であり、表１７はＭＣＦ－７細胞株への結合をＦＡＣＳで分析した結果である。
Figure 2023113599000020
Figure 2023113599000021
その結果、Ｆ０６が最もｐａｒｅｎｔａｌクローン（１５６４クローン）と比較して細胞結合において最も高い結合力を有するクローンに選定され（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒｅｄ）、Ｃ０４はｐａｒｅｎｔａｌ（１５６４クローン）より細胞結合力が最も劣るクローンとして選定された（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｄｕｃｅｄ）。
２次クローンに対する分析であって、表１８は２次製作方法で製作されたクローンの二重特異抗体形態でのＩＧＦ１Ｒ ＥＣＤタンパク質に対する結合ＥＬＩＳＡである。
Figure 2023113599000022
２次製作されたクローンのうちの生産性および物性が劣るクローンを除いた後、ＦＡＣＳ分析を行うクローンを表１９のように選定した。
Figure 2023113599000023
図４ｃは当該クローンのＭＣＦ－７細胞株への結合をＦＡＣＳで分析した結果であり、分析クローン全てがｐａｒｅｎｔａｌクローンである１５６４に比べてＭＣＦ－７に対する結合力が低下した。当該結果は、ＥＬＩＳＡで結合力低下を示したクローンがＦＡＣＳでも結合力低下を示すのを示す。
選別された抗体クローンはＦ０６、Ｃ０４、ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２であり、これら抗体に対する重鎖可変領域および軽鎖可変領域に対するアミノ酸配列は前記表４および表５に示した。
抗体クローンのうち、ＶＨ５、ＶＨ１６、Ｆ０６ ｖａｒｉａｎｔ内に存在するｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ｈｏｔ ｓｐｏｔを実施例８－２の、表２１によって除去してｍｕｔａｎｔを製造し、当該ｖａｒｉａｎｔを実施例１０によって二重特異抗体として準備した。ＶＨ５、ＶＨ１６の場合、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）との二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）二重特異抗体として製作し、Ｆ０６の場合、ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）との一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）二重特異抗体として製作した。準備した二重特異抗体を用いて、ＶＨ５、ＶＨ１６、Ｆ０６の三つｖａｒｉａｎｔｓ（即ち、二重抗体としてｈｕ１１ｆ１１－Ｆ０６、ｈｕ１１ｆ１１－ＶＨ５、ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ１６）および脱アミド化したｍｕｔａｎｔｓ（即ち、二重抗体としてｈｕ１１ｆ１１－Ｆ０６（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）、ｈｕ１１ｆ１１－ＶＨ５（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）、ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ１６（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ））のＭＣＦ－７に対する結合力を前記のＦＡＣＳ分析法によって分析した。前記具体的二重抗体の構成成分は前記表１０に記載されており、これら抗体の脱アミド化（ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）位置置換については前記実施例８－２の表１４に記載されている。
前記ＦＡＣＳ分析結果を下記の表２０に示した。三つの脱アミド化したｍｕｔａｎｔｓ（ｈｕ１１ｆ１１－Ｆ０６（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）、ｈｕ１１ｆ１１－ＶＨ５（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）、ｈｕ１１Ｆ１１－ＶＨ１６（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ））は全てｐａｒｅｎｔａｌ抗体（ＶＨ５、ＶＨ１６、Ｆ０６）に比べて結合力が減少しないのを確認した。
Figure 2023113599000024
 ＊ＭＦＩ＝ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（２ｎｄａｒｙ Ａｂ ｏｎｌｙ）’ｓ ＭＦＩ：２．２９
前記で準備された二重特異抗体を用いて、ＶＨ５、ＶＨ１６、Ｆ０６の三つのｖａｒｉａｎｔと脱アミド化したｍｕｔａｎｔのヒトＩＧＦ１Ｒタンパク質に対する結合力を実施例１５－２の方法によってＥＬＩＳＡで分析した結果である。その結果を下記の表に示した。三つのＭｕｔａｎｔは全てｐａｒｅｎｔａｌ抗体に比べて結合力が減少しないのを確認した。
Figure 2023113599000025
１１－４：ヒト（Ｈｕｍａｎ）ＩＧＦ１Ｒに対するＢＩＡｃｏｒｅ分析
本発明による抗体とヒトＩＧＦ１Ｒ間の結合力を分析しようとした。
１５６４クローンのＩｇＧ形態に対してＳＰＲ分析でヒトＩＧＦ１Ｒに対する結合程度を分析した。抗原であるヒトＩＧＦ１Ｒ ＥＣＤに結合されたＨｉｓ ｔａｇに対する抗－ｈｉｓ抗体をアセテート（ａｃｅｔａｔｅ）ｐＨ４．０バッファーに２０μｇ／ｍｌで希釈した後、ＣＭ４ ｃｈｉｐにａｍｉｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ方法でｒｅｆｅｒｅｎｃｅ／ａｎａｌｙｔｉｃ ｃｈａｎｎｅｌにｔａｒｇｅｔ ＲＵを１０，０００ＲＵに固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅ）した。キャプチャ（Ｃａｐｔｕｒｅ）の間、ラニングバッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）としてはＰＢＳを使用した。Ｆｌｏｗ ｒａｔｅは３０μＬ／ｍｉｎを維持した。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの間、ｆｌｏｗ ｒａｔｅは４０μＬ／ｍｉｎ、ラニングバッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）としてはＰＢＳを使用した。ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／ｄｉｓｓｓｏｃｉａｔｉｏｎはそれぞれ５分、２０分であった。分析は、ｂａｓｅｌｉｎｅ １、ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ＥＤＣ＋ＮＨＳ）、ヒトＩＧＦ１Ｒ ｌｏａｄｉｎｇ、ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ（１Ｍ Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ｂａｓｅｌｉｎｅ ２、ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの順に行われた。Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎは二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）モデルを使用し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．０、Ｓ／Ｎ：０４Ｙ１５Ｘ１１－０１４９）を使用して分析した。
分析結果、１５６４ ＩｇＧ抗体のＫＤは２．５３０５×１０－９ｎＭと、Ｆ０６ ＩｇＧ抗体は４．７８０２×１０－７ｎＭと確認されて、全てヒトＩＧＦ１Ｒに対して高い結合力を示すのを確認した。分析の結果は図３ｂである。特に、１５６４クローンをＩｇＧ形態に製作した時、ヒトＩＧＦ１Ｒに２．５３０５×１０－９ｎＭの解離定数を示すのを確認して、１５６４はその形態によって結合力に大きな変化がないのを確認した。
実施例１２．抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のヒトＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株および脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）に対する結合力分析
１２－１：ＭＣＦ－７に対するＦＡＣＳ分析
実施例９－１で製造した９９６、１２２６、および１５６４クローンのミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）形態が、細胞表面の内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）のＩＧＦ１Ｒに結合するか確認するために、ヒトＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株および脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）に対する結合力分析をＦＡＣＳで行った。Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔとＩＧＦ１Ｒが過発現すると知られたＭＣＦ－７、乳癌細胞株との結合程度をＦＡＣＳで確認した。
具体的に、サンプル当り０．４３×１０６のＭＣＦ－７細胞株に、前記３種のミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）をそれぞれ２０ｕｇ／ｍｌに希釈後、処理して４℃で１時間反応させた。ＰＢＳバッファーを用いて２回洗浄後、抗－ヒト（ｈｕｍａｎ）ＦＩＴＣを１：５００で希釈して処理、４℃で１時間反応させた。再びＰＢＳバッファーを用いて２回洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を用いて抗－ＩＧＦ１Ｒミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）が結合された程度を測定した。対照群として二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）のみ処理したＭＣＦ－７細胞を使用した。前記実験結果を図４ａに示した。
実施例７および実施例９－２で製作されたＡ０２、Ａ０６、Ａ０７、Ｂ０１、Ｂ０２、Ｂ０９、Ｂ１０、Ｃ０４、Ｄ０３、Ｅ０６、Ｆ０６、Ｈ０４（Ｇｌｙ）、Ｈ０４（Ｖａｌ）、ＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２、ＶＨ３５を前記と同様な方法でＭＣＦ－７に対する結合力を分析した。１５６４クローンを実施例１４－２方法で製作してｐａｒｅｎｔａｌクローンとして比較し、二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）のみ処理したＭＣＦ－７細胞を対照群として使用した。分析結果は図４ｃに示した。
前記実験結果によって、当該サンプルのＭＦＩ（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で示し、テストした３種のミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）内のｓｃＦｖおよび二重特異抗体形態のａｆｆｉｎｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔおよびｐａｒｅｎｔａｌクローン（１５６４クローン）が細胞表面に発現される内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するのを確認した。当該結果は、前記例で確保されたクローンが体内に実際に存在する形態のＩＧＦ１Ｒに結合して意図した目的で使用できるのを示す結果である。
１２－２：ＪＩＭＴ－１およびＢＴ４７４に対するＦＡＣＳ分析
実施例１２－１で使用したＭＣＦ－７細胞株の代わりに、ＪＩＭＴ－１およびＢＴ４７４乳癌細胞株を使用したことを除いては実質的に同様な方法で実施例１４－１で製造した９９６、１２２６、および１５６４クローンのミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）形態が、細胞表面の内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）のＩＧＦ１Ｒに結合するか確認した。前記実験結果を図４ａに示した。
前記実験結果によって、当該サンプルのＭＦＩ（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）で示し、テストした３種のミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）内のｓｃＦｖがＩＧＦ１Ｒ発現多様な細胞株表面の内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するのを確認した。
１２－３：マウス脳内皮細胞に対するＦＡＣＳ分析
実施例９－２方法で製作した１５６４クローンの二重特異抗体形態と実施例１４－３方法で製作した１５６４クローンのＩｇＧ形態がマウスの脳内皮細胞であるｂＥＮＤ．３に結合するかを分析した。この時、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）抗体のみ処理グループおよび治療抗体単独ＩｇＧ（ＣＨ１１Ｆ１１）処理グループを陰性対照群として使用した。ＦＡＣＳ分析法は実施例１２－１および１２－２と同一に行った。分析結果は図４ｂに示した。
試験したテストクローン全てが陰性対照群を除いてｂＥＮＤ．３に対して結合力を示した。当該結果を通じて多様な形態の１５６４クローンが脳内皮細胞表面に発現するＩＧＦ１Ｒに特異的に結合するのを確認した。
実施例１３．抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ分析
１３－１：ＭＣＦ－７ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ－１５６４、９９６、１２２６、ＭＫＪＰ２（ミニボディ）
実施例９－１で製造した９９６、１２２６、１５６４およびＭＫＪＰ２クローンのミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）形態が、ＩＧＦ１Ｒを発現する細胞株で細胞内部に内在化（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）され、細胞内に導入された抗体は分解されずＲＭＴ Ｐａｔｈｗａｙを経るかを確認しようとした。抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がＢＢＢ通過能を向上させるシャトルとして使用されるためには当該抗体がＢＢＢを構成する脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）されることが先行されなければならない。
ＩＧＦ１Ｒを発現するＭＣＦ－７細胞株を用いて発明による抗体が細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）されるかを分析した。具体的に、８ウェルスライドチャンバー（８－ｗｅｌｌ ｓｌｉｄｅ ｃｈａｍｂｅｒ）内に３０，０００個のＭＣＦ－７細胞株をプレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）した後、１日間培養した。実施例９－１で製造した９９６、１２２６、１５６４およびＭＫＪＰ２クローンのミニボディ抗体をそれぞれ５μｇ／ｍｌずつ４℃で各ウェルに２時間処理して冷たいＤＭＥＭ培養液で３回洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８－コンジュゲートされた（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗－ヒトＦｃ抗体をまた４℃で１時間処理した。
抗体複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）の内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）をテストするために、当該プレートをＣＯ２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）に移して３７℃で３０分間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。１００％メタノールを入れてｃｕｌｔｕｒｅを固定すると同時に反応を終了した。固定後にはＰＢＳで３回洗浄した。蛍光顕微鏡上で抗体の内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）程度をｇｒｅｅｎ ｆｉｌｔｅｒ領域（Ａｌｅｘａ４８８）でイメージングした。イメージング時に、ＤＡＰＩを用いて細胞内核を染色して各細胞の位置を確認した。前記実験結果を図５ａに示した。
前記実験結果から、ＭＣＦ－７細胞株を用いた実験でもテストした４種抗体全ては内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）がよく起こるのを確認することができ、特にＭＫＪＰ２と１５６４の内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）が他のクローンに比べて多く起こることが分かった。
１３－２：ＭＣＦ－７ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ－Ｃ０４、Ｆ０６、ＶＨ５、ＶＨ１６、ＶＨ３５、ＶＨ９、ＶＨ２、ＶＨ７、ＶＨ３２
ＩＧＦ１Ｒに対する結合力を変化させた１５６４ ｖａｒｉａｎｔの細胞表面ＩＧＦ１Ｒ結合を分析するためにＩＧＦ１Ｒを発現するＭＣＦ－７細胞株を用いてＦＡＣＳ分析を行った。ｓｃＦｖ形態の二重抗体として製作されたＩＧＦ１Ｒ抗体を１０ｕｇ／ｍＬ濃度に２×１０Ｅ５のＭＣＦ７細胞に３０分間処理した。１％ＢＳＡが添加されたＰＢＳバッファーで洗浄した後、ヒト抗体を検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）するＦＩＴＣが結合された二次抗体を１時間処理した。ＰＢＳバッファーで洗浄した後、ＦＡＣＳ分析を通じて結合力が変化多様なｖａｒｉａｎｔの細胞外結合および内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を確認した。
下記表２２の結果のように１５６４ ＩＧＦ１Ｒ抗体が含まれている二重抗体は冷蔵条件より３７℃条件で内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）が増加してｉｎｔｅｎｓｉｔｙが増加するのを確認し、細胞結合程度が高かったＦ０６クローンも内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）が増加するのを確認した。このような結果は、１５６４ ｖａｒｉａｎｔが細胞によく結合して結合依存的に細胞内に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）されるのを示唆するのである。
Figure 2023113599000026
１３－３：ヒト脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）に対する内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）分析
実施例９－２および９－４で製作した１５６４クローンの二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）および一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態がヒト由来脳内皮細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ（ＨＭＢＥＣ））に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）されるか分析した。治療抗体ＩｇＧ（１１Ｆ１１）を陰性対照群として使用した。
ＨＭＢＥＣ（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃：ＡＣＢＲＩ３７６）を１２ウェルプレートに９０％ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙにプレーティングした後、テスト抗体を投与した。その翌日、４％パラホルムアルデヒドで固定後、ＰＢＳリンス後に３％ＢＳＡとＴｒｉｔｏｎＸが含まれている溶液（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５０分間使用してブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）および透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）した。ＰＢＳでリンス後、ヒトＦｃに対する抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ抗体）を２時間３０分間投与し、ＰＢＳリンス後、当該１次（ｐｒｉｍａｒｙ）抗体に対する２次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）抗体を１時間投与した。ＰＢＳリンス後、核染色のために１：１０００で希釈された濃度でＨｏｅｃｈｓｔを１０分間染色（ｓｔａｉｎｉｎｇ）した。結果物はＬＳＭ ７８０ ＮＬＯ ＥＣ Ｐｌａｎ－Ｎｅｏｆｌｕａｒ １００Ｘ／１．３ Ｏｉｌ条件で共焦点顕微鏡で分析した。前記実験結果を図５ｂに示した。
１５６４クローンの二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）および一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態は、陰性対照群である治療抗体（１１Ｆ１１）に比べて増加された内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示した。この結果は、前記に記述された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体が治療抗体と連結された多様な形態の二重特異抗体であって、ＢＢＢを構成する脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）内に当該治療抗体を効果的に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）させることができるのを、したがって窮極的に当該治療抗体のＢＢＢ通過能を増大させるのを示唆する。
１３－４：ヒト脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）内で細胞内運命（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｅ）の分析
万一、当該抗体が内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）された後、細胞内のリソソーム関連マーカと同じ場所に存在（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ）すれば、当該抗体は脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）内で分解されるためＢＢＢを通過できない。これとは反対に、エキソサイトーシス（ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ）と関連する初期エンドソーム（ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ）あるいはＢＢＢ通過に関連したと知られたマーカと共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ）すれば、当該抗体は脳内皮細胞（ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）に内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）された後、脳側に抜け出る受容体媒介トランスサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）によってＢＢＢを通過すると予想される。
実施例１３－２でテストされた抗体のうちの１５６４二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態を同一な方式でＨＭＢＥＣに処理した後、細胞内で当該抗体がいずれの細胞成分（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）と共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ）するか分析した。但し、ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）および透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）後、投与抗体を検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）するＧｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ抗体と共に、下記の抗体をそれぞれ同時に投与した。
＊Ａｎｔｉ－Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ：リソソームマーカ
＊Ａｎｔｉ－Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１：カベオリン媒介トランスサイトーシス（ｃａｖｅｏｌｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ）マーカ（ＢＢＢ通過の主要メカニズムと考えられる）
＊Ａｎｔｉ－ＥＥＡ１：初期エンドソーム（ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ）マーカ
残り方法は実施例１３－２と同一であって、前記のマーカに対する二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）抗体をそれぞれ処理した。
分析結果は図５ｃに示した。１５６４クローンは二重特異抗体形態で全てカテプシンＤ（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ）と共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ）せず、その代わりにｃａｖｅｏｌｉｎ－１およびＥＥＡ１と細胞膜および細胞内部で共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ）した。この結果は、１５６４クローンが内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）された後、細胞内の分解メカニズムを経ずにＲＭＴを通じてＢＢＢを通過することができるのを示す。
実施例１４．抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のＩＧＦ１Ｒ信号伝達に及ぼす影響分析
１４－１：ＭＣＦ－７細胞株のＩＧＦ１Ｒによるｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ
本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がＩＧＦ１Ｒ（ＩＧＦ１受容体）とそのリガンドであるＩＧＦ１間の結合を妨害するかどうかを、ＩＧＦ１による細胞増殖効能を用いて確認した。
実施例９－１で製造した９９６、１２２６、１５６４およびＭＫＪＰ２クローンのミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）抗体をそれぞれ４００ｎＭから５倍ずつ希釈して希釈サンプルを製作後、２０ｎｇ／ｍｌ濃度の２５μｌ ＩＧＦ１に各２５μｌずつ処理した。ＩＧＦ１Ｒを発現するＭＣＦ－７細胞株を培養し、実験当日培地を除去して継代し、ＩＧＦ１とテスト抗体が分注されている９６ウェルプレートの各ウェル当り２０，０００個ずつ（５０μｌに該当）処理した。
３日間適切な温度および湿度で培養して細胞生長程度を測定するためにＣＣＫ－８試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）を１０μｌずつ処理しＣＯ２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で４－５時間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。その後、取り出してｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒの４５０ｎｍ波長で吸光度を測定した。前記実験結果を図６ａに示した。
前記実験結果から、本発明による抗体は、ＩＧＦ１のＩＧＦ１Ｒに対するシグナリング（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によるＭＣＦ－７の細胞増殖を阻害しないと確認された。対照群として使用したＩｍｃｌｏｎｅ社の抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体はＩＧＦ１によるＭＣＦ－７の細胞増殖を処理濃度に比例して阻害した。したがって、本発明の抗体はＢＢＢを構成する内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）に発現するＩＧＦ１Ｒに結合してＢＢＢ通過能を有するが、同時に体内ＩＧＦ１によるｓｉｇｎａｌｉｎｇを阻害しない抗体であるので、本発明による抗体はＢＢＢシャトルとして使用できるのを確認した。
１４－２：ＭＣＦ－７細胞株のＩＧＦ１Ｒによるｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔの阻害分析
本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体が、ＩＧＦ１Ｒ発現細胞と結合するＩＧＦ１がｓｉｇｎａｌｉｎｇを細胞内に伝達する時、そのｓｉｇｎａｌｉｎｇのｒｅｃｅｐｔｏｒおよびｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔに関与するかどうかを確認するために実験した。即ち、ＩＧＦ１Ｒを発現するＭＣＦ－７細胞株に抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体を投与し、これによる細胞内の全体ＩＧＦ１Ｒ、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１Ｒのｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｆａｃｔｏｒである全体Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ量を分析した。
ＭＣＦ－７細胞（ｃｅｌｌ）を培養して、抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体を処理２０時間前にその培養液を血清（ｓｅｒｕｍ）が含まれていない培養液に変更した。実施例９－１で製造した９９６、１２２６、１５６４およびＭＫＪＰ２クローンのミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）抗体をそれぞれ１００ｎＭを前記ＭＣＦ－７細胞株に処理後、１時間後に２００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１を処理した。２０分後、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）とホスファターゼ阻害剤カクテル（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）が添加されたＭ－ＰＥＲで細胞を溶解した。ＢＣＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用してタンパク質濃度を測定した後、１２．５μｇのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌにローディングして電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）させた後、ＰＶＤＦメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）にｔｒａｎｓｆｅｒした。ブロッキングは５％のＢＳＡが含まれているＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）と共に１時間ｇｅｎｔｌｅ ｓｈａｋｉｎｇで常温で行って、その後にＩＧＦ１ＲあるいはＡｋｔに対する１次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を４℃で軽く揺すりながら一晩処理した。βアクチン抗体（ｂｅｔａ ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）はローディングコントロール（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用された。洗浄した後にｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙを１時間常温でゆっくり揺すりながら処理した後に洗浄し、ＥＣＬ溶液（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加し、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ Ｌａｓ ４０００を用いてシグナルを確認した。前記実験結果を図６ｂに示した。
前記実験結果から、本発明による抗体は細胞内の全体ＩＧＦ１Ｒ、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１Ｒのｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｆａｃｔｏｒである全体Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ量に影響を与えないことを確認した。
１４－３：マウス脳内皮細胞のＩＧＦ１Ｒによるｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔの阻害分析
本発明による抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体が、マウス由来脳内皮（ｂｒａｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）細胞にＩＧＦ１がｓｉｇｎａｌｉｎｇを細胞内に伝達する時、そのｓｉｇｎａｌｉｎｇのｒｅｃｅｐｔｏｒおよびｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔに関与するかどうかを確認するために実験した。即ち、ＩＧＦ１Ｒを発現することが確認されたｂＥＮＤ３細胞株に実施例９－２の方法で製作された１１Ｆ１１－１５６４、３Ａ９－１５６４（ＣＨ１１Ｆ１１とｃｈ３Ａ９、抗α－ｓｙｎ単独抗体として大韓民国公開特許２０１８－００８１４６５に記載されたもの）および実施例９－３の方法で製作された１５６４クローンのＩｇＧ形態を投与し、これによる細胞内の全体ＩＧＦ１Ｒ、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１Ｒのｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｆａｃｔｏｒである全体Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ量を分析した。
ｂＥＮＤ３ ｃｅｌｌを培養して、抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体を処理２０時間前にその培養液を血清（ｓｅｒｕｍ）が含まれていない培養液に変更した。実施例９－２の１５６４およびＭＫＪＰ２クローンの二重特異抗体をそれぞれ１００ｎＭを前記ｂＥＮＤ細胞株に処理後、１時間後に２００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１を処理した。２０分後、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）とホスファターゼ阻害剤カクテル（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）が添加されたＭ－ＰＥＲで細胞を溶解した。ＢＣＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用してタンパク質濃度を測定した後、１２．５μｇのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌにローディングして電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）させた後、ＰＶＤＦメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）にｔｒａｎｓｆｅｒした。ブロッキングは５％のＢＳＡが含まれているＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）と共に１時間ｇｅｎｔｌｅ ｓｈａｋｉｎｇで常温で行って、その後にＩＧＦ１ＲあるいはＡｋｔに対する１次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を４℃で軽く揺すりながら一晩処理した。βアクチン抗体（ｂｅｔａ ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）はローディングコントロール（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用された。洗浄した後に二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を１時間常温でゆっくり揺すりながら処理した後に洗浄し、ＥＣＬ溶液（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を添加し、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ Ｌａｓ ４０００を用いてシグナルを確認した。前記実験結果を図６ｃに示した。
前記実験結果から、本発明による抗体は細胞内の全体ＩＧＦ１Ｒ、リン酸化されたＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１Ｒのｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｆａｃｔｏｒである全体Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ量に影響を与えないことを確認した。
実施例１５．抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎ ｖｉｖｏＢＢＢ通過能分析（ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
１５－１．ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）の脳血管（ｂｒａｉｎ ｖｅｓｓｅｌ）との共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）
本発明の抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体がｉｎ ｖｉｖｏで脳血管系（ｂｒａｉｎ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）に沿って分布するかどうかを確認するために次のような実験を行った。
具体的に、６－８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｍｏｕｓｅ）の雄の尾静脈にＰＢＳバッファーあるいは１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧコントロールおよび実施例９－１で製造した９９６、１２２６および１５６４クローンのミニボディ抗体をそれぞれ単回投与した。４時間後、マウス脳（ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ）を十分な量の０．９％ＮａＣｌ溶液および４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で心臓内灌流（ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｌｌｙ ｐｅｒｆｕｓｅ）させた。固定された脳（ｂｒａｉｎ）は摘出して２０μｍにｓｅｃｔｉｏｎ後、脳血管とＩＧＦ１Ｒテストの共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を確認するために血管マーカである抗－マウスＣＤ３１および抗－ヒトＦｃ抗体でｃｏ－ｓｔａｉｎｉｎｇした。ＣＤ３１はＡｌｅｘａ４８８がコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）された二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）であって、ヒトＦｃはＡｌｅｘａ ５９４がコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）された二次抗体（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いて、蛍光顕微鏡下でイメージングした。前記実験結果は図７ａに示した。
前記実験結果から、本発明によるリガンド結合非阻害クローン（ｎｏｎ－ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は優れたＢＢＢ通過能を有するのを確認し、抗体が脳血管と共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）する程度を免疫染色で分析する方法（Ｎｅｕｒｏｎ（２０１６）Ｙｕ－Ｚｕｃｈｅｒｏ ｅｔ ａｌ．）によって、脳組織を血管マーカ（抗－ＣＤ３１、緑色）とヒト抗体（抗－ヒトＦｃ、赤色）で染色した結果、本願の一例によるリガンド結合非阻害クローンはＩｇＧ対照群に比べて高い共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）程度を示した。
１５－２．二重特異抗体のｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢ通過能分析
本願抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢ通過能を正常ラット（ｎｏｒｍａｌ ｒａｔ）で確認しようとした。ＳＤラットに１０ｍｇ／ｋｇあるいは３０ｍｇ／ｋｇのパーキンソン病治療単独抗体（１１Ｆ１１）あるいは１５６４クローンが二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態に結合された二重特異抗体（１１Ｆ１１－１５６４）を尾静脈に単回投与後、２４時間目にそのＣＳＦおよび脳（ｂｒａｉｎ）での抗体量を質量分析で分析した。質量分析方法は具体的質量分析方法は、Ｓｖ－ＡＲＢＥＣを透過性膜（ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の上に単一層でプレーティングし、当該ＢＢＢシステムの抵抗値（ＴＥＥＲ）およびスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）通過程度を基にして当該システムのｉｎｔｅｇｒｉｔｙを予め評価した。この時、ｓｖ－ＡＲＢＥＣは当該システムのｉｎｔｅｇｒｉｔｙを助けると確認されたラット星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）培養培地（ＲＡＳ－ＣＭ）を処理した。テスト抗体である１５６４、４８Ｇ５、５４Ｈ４、６０Ｈ６、Ｂ１１の二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）二重特異抗体をメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）の上に処理した後、９０分後にボトムチャンバー（ｂｏｔｔｏｍ ｃｈａｍｂｅｒ）での抗体量を質量分析で分析した。質量分析のために、各抗体ＦｃおよびｓｃＦｖでのシグネチャーペプチド（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）が分析された後に使用された。この時、パーキンソン病治療抗体単独（１１Ｆ１１）および当該抗体にハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）のバイオシミラーのｓｃＦｖ形態を結合させた二重特異抗体を陰性対照群として使用した。当該システムにはＢＢＢを通過しないと知られたＡ２０．１抗体（ｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｕｎｃｉｌ製作）を通過させて当該システムの検量限界線を決めた。質量分析から導出された結果値を先行文献で知られた公式に代入してＰａｐｐ値を決定し、この値はｉｎ ｖｉｔｒｏでのＢＢＢ通過能程度を示す。
分析の結果、１５６４クローンが結合された二重特異抗体は抗ＩＧＦ１Ｒ抗体が結合していない治療抗体に比べて高いＣＳＦ、脳（ｂｒａｉｎ）通過能を示し、当該効能を１０、３０ｍｇ／ｋｇ ｄｏｓｅ全てで確認された。二重特異抗体は、３０ｍｇ／ｋｇ ｄｏｓｅで単独抗体に比べて最大約４．５倍以上の脳（ｂｒａｉｎ）への通過能を示した。
１５６４クローンを実施例９－２および９－４によって二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）および一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態に製作した後、前記と同一な方式で３０ｍｇ／ｋｇあるいは６０ｍｇ／ｋｇで投与後、２４時間目にＣＳＦと脳（ｂｒａｉｎ）での抗体量を分析した。１５６４クローンが結合された２つ形態の二重特異抗体は、単独抗体に比べて高いＣＳＦ、脳（ｂｒａｉｎ）通過能を示した。特に、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態は一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態に比べて高いＢＢＢ通過能を示し、これは最大約５倍の脳（ｂｒａｉｎ）通過能増大であった。
図７ｂおよび図７ｃの結果は、１５６４クローンが多様な形態に治療抗体に結合された時にも当該治療抗体の体内ＢＢＢ通過能を向上させるのを示す。
実施例２によって製作された１５６４クローンのａｆｆｉｎｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔはｐａｒｅｎｔａｌクローンに比べて血清中ＰＫ（ｓｅｒｕｍ ＰＫ）の増大が予想された。したがって、血清（ｓｅｒｕｍ）内に長期間残存して継続的にＢＢＢ流入量を維持することによってそのＢＢＢ通過能が向上することが期待された。実施例９－２によって二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態あるいは９－４によって一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態に製作されたａｆｆｉｎｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔをＳＤラットに３０ｍｇ／ｋｇで尾静脈投与した後、０、２４、４８時間目に血液を眼球静脈叢から採取した。テスト抗体は治療抗体のｂａｃｋｂｏｎｅがキメラあるいはヒト化された抗体であるかによって２つ実験に分けられ、実験に使用された当該ｖａｒｉａｎｔの二重特異抗体は下記表の通りである。
Figure 2023113599000027
血液内抗体量は、ＥＬＩＳＡで分析した。９６ウェルプレートにヤギ抗－ヒトＦｃ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆｃ）抗体をコーティングした後、適当量希釈された試料を処理後、抗－ヒトＦａｂ ＨＲＰコンジュゲートされた（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｆａｂ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗体で検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）した。分析結果は図７ｄおよび図７ｅに示した。
その結果、１次試験群では１５６４の一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）、Ｆ０６の一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）、Ｃ０４の一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）がｐａｒｅｎｔａｌ １５６４クローンの二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）に比べて長くなった血清中ＰＫ（ｓｅｒｕｍ ＰＫ）を示した。２次試験群ではＶＨ３５二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）群を除いてＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２の二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）形態がｐａｒｅｎｔａｌ １５６４二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）に比べて増大された血清中ＰＫ（ｓｅｒｕｍ ＰＫ）を示した。
当該グループのＢＢＢ通過能を分析するために、４８時間目に当該ラットからＣＳＦを抽出して同一なＥＬＩＳＡで分析した。分析結果は図７ｆに示した。
１次試験群では増大された血清中ＰＫ（ｓｅｒｕｍ ＰＫ）を示した１５６４一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）、Ｆ０６一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）、Ｃ０４一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態がｐａｒｅｎｔａｌ １５６４二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）に比べて増大されたＣＳＦ抗体量を示した。２次試験群でもまた増大された血清中ＰＫ（ｓｅｒｕｍ ＰＫ）を示したＶＨ２、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ９、ＶＨ１６、ＶＨ３２の二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）がｐａｒｅｎｔａｌ １５６４二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）に比べて増大されたＣＳＦ抗体量を示した。ＶＨ３５はｐａｒｅｎｔａｌ １５６４二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）に比べて短くなった血清中ＰＫ（ｓｅｒｕｍ ＰＫ）およびＣＳＦ抗体量を示した。
図７ｄ、図７ｅおよび図７ｆの結果は、血清（ｓｅｒｕｍ）におけるＰＫが持続的な抗体のＢＢＢ流入によって抗体のＢＢＢ通過能にあって重要な要素であり、ＢＢＢシャトルを有して血清中ＰＫ（ｓｅｒｕｍ ＰＫ）が増大された二重特異抗体のＢＢＢ通過能が増加するのを示す。特に、ＣＳＦ抗体量が最も高いＦ０６一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態の場合、ｐａｒｅｎｔａｌ １５６４二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）に比べて約５倍程度高いＣＳＦ通過能を示した。１５６４二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）抗体がＣＳＦで単独抗体に比べて約３倍増加されたＣＳＦ通過能を示したことがあるので、Ｆ０６一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）形態は単独抗体に比べて最大約１５倍増加されたＢＢＢ通過能を示すことが予想される。
実施例１６．抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープマッピング
１６－１．抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体とｂｏｉｌｅｄ、ｎａｔｉｖｅ ＩＧＦ１Ｒタンパク質のＥＬＩＳＡ
本発明による二重抗体が含む抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体クローンが線形あるいは立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）を認識するか確認しようとした。１５６４、４８Ｇ５、５４Ｈ４、６０Ｈ６、Ｂ１１の二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）二重特異抗体とｎａｔｉｖｅヒトＩＧＦ１Ｒ ＥＣＤタンパク質あるいは当該タンパク質に熱を加えたタンパク質（ｂｏｉｌｅｄ ＩＧＦ１Ｒ）に対するＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡ方法は実施例１１に示された方法と同一であった。分析結果は下記表に示した。
Figure 2023113599000028
 ＊Ｎ／Ａ：Ｎｏｔ ａｖａｉｌａｂｌｅ
前記クローンはｎａｔｉｖｅヒトＩＧＦ１Ｒ ＥＣＤに実施例１５での結果と類似の結合力を示した反面、熱を加えて３次構造を破壊したｂｏｉｌｅｄヒトＩＧＦ１Ｒ ＥＣＤには全て結合しなかった。これは本願の抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体が線形でない立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合するのを意味する。
１６－２．抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体のエピトープマッピング
１５６４クローンの立体構造エピトープ（Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）を分析するために、次のようにアラニンスキャニング（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）を行った。ＩＧＦ１Ｒ発現度が低いことが確認された卵巣ガン細胞株であるＯＶＣＡＲ３細胞にＮ－末端にはｅＧＦＰ ｔａｇが融合されＣ－末端キナーゼドメイン（ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ）は除去されたＩＧＦ１Ｒライブラリーを発現させた。ＩＧＦ１Ｒライブラリーは、ＩＧＦ１Ｒ表面の残基がアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）で置換された突然変異を含む。準備されたライブラリーをＯＶＣＡＲ３細胞にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。ＩＧＦ１Ｒの発現が確認された細胞に対して１５６４抗体を処理し、その後、ＤｙＬｉｇｈｔ６５０が標識された二次抗体を処理して蛍光標識した。標識された細胞をＩＧＦ１Ｒ発現有無とＩＧＦ１Ｒの発現と１５６４結合有無によって分類した後、これらに対してイルミナＨｉＳｅｑ技法でＲＮＡディープシークエンシング（ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行って当該細胞群での各アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）突然変異の頻度を分析した。当該頻度数はｗｉｌｄｅ ｔｙｐｅ ＩＧＦ１Ｒを発現した細胞に対する結果で正規化した後、相対頻度を計算して１５６４が標識された細胞群からその数字が減少した突然変異を選別した。
このような観察に基づいて、１５６４のエピトープはＦＮ２ドメインに位置することが分かり、これに属する残基はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８であることが分かった。当該結果および１５６４クローンが認識するシークエンスは図９に示した。この残基は先行文献によればＩＧＦ１の結合に関与しないので、当該結果は実施例１６－１で１５６４が示す性質を忠実に説明している。
実施例１７．単独抗体および二重抗体の抗原結合力比較
１７－１：α－ｓｙｎ抗原に対する単独抗体および二重抗体の結合力
ＩＧＦ１Ｒ抗体がｓｃＦｖ形態でＩｇＧ形態のα－ｓｙｎ抗体と連結させた時、α－ｓｙｎ抗体の結合力に対する影響を分析した。
１ｕｇ／ｍｌ濃度で９６ウェルプレートに１８時間α－ｓｙｎ凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）をコーティング（ｃｏａｔｉｎｇ）し、洗浄後、各抗体は４００ｎＭで５倍ずつ希釈して結合させた。結合された抗体は、抗－ヒトＦｃ－ＨＲＰを結合させた後、ＴＭＢ溶液を添加して発色させて抗体の結合程度を確認した。
図１０ａの結果のように、α－ｓｙｎ凝集体に対する結合力は単独抗体や二重抗体において同一なのを確認した。
１７－２：ＩＧＦ１Ｒ抗原に対する単独抗体および二重抗体の結合力
ＩＧＦ１Ｒ抗原に対するα－ｓｙｎ単独抗体と二重抗体の結合程度を比較するために以前と同様な方法で実験を行った。
図１０ｂの結果のように、ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖ抗体を有している二重抗体は濃度依存的によく結合したが、ＩＧＦ１Ｒ抗体部位がない単独抗体は結合しないのを確認した。
１７－３：α－ｓｙｎヒト化抗体らの結合力分析
実施例１７－１と同様な方法で実験を行ってキメラ二重抗体とヒト化二重抗体間の結合力差を分析した。
図１０ｃの結果のように、ヒト化二重抗体（Ｈｕ１１Ｆ１１ ｖｅｒ２、３、または４と１５６４の組み合わせ）はキメラ二重抗体と類似の水準でα－ｓｙｎ凝集体との結合力を保有しており、ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖが一つである一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）二重抗体もキメラ抗体と類似の結合力を示すのを確認した。
実施例１７－２と同様な方法で実験を行ってキメラ二重抗体とヒト化二重抗体間のＩＧＦ１Ｒ結合力を分析した結果、図１０ｄのように、全ての二重抗体（Ｈｕ１１Ｆ１１ ｖｅｒ２、３、または４と１５６４の組み合わせ）が同一な結合力を示し、ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖがない単独抗体は結合しないのを確認した。
このような結果は、人体内で免疫原として作用できるマウス抗体部位を交替するためにヒト化した時、α－ｓｙｎ凝集体およびＩＧＦ１Ｒに対する結合力に変化がなかったのを示唆するものであって、同一な活性を保有しているのを意味するものである。
１７－４：単独抗体と二重抗体の食細胞作用比較
食細胞作用は、大食細胞の多様な受容体が関与して細胞外不必要な物質を除去する作用を意味する。多様なタンパク質凝集体は免疫反応や炎症反応を誘導して人体に悪影響を与えるようになり、特にα－ｓｙｎ凝集体の除去のために抗体を投与した時、抗体のＦｃ部位と細胞表面のＦｃｒＲとの相互作用を通じて促進されると知られている。このような理由で、単独抗体とＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖが連結された二重抗体の食細胞作用に対する活性を比較した。
単独抗体と二重抗体の食細胞作用を比較するために、マウスに由来したＢＶ－２小膠細胞を用いた。ＢＶ－２細胞はＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで準備してＵ底９６ウェルプレート（Ｕ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に１００ｕＬずつ分注した。１０ｕｇ／ｍｌのα－ｓｙｎ凝集体と２５ｕｇ／ｍｌ抗体はＲＰＭＩ１６４０培地で希釈して混合した後、常温で２０分間放置した。α－ｓｙｎ凝集体と抗体混合物をＢＶ－２細胞に処理した後、１５分間放置した。１２００ｒｐｍで遠心分離して上清液のα－ｓｙｎ凝集体を除去し、細胞表面に結合された凝集体または抗体を除去するためにＰＢＳ、ｐＨ２．５バッファーで３回洗浄した。細胞は４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）でに固定させた後、ＰＢＳバッファーで洗浄した。細胞内に貪食（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）された凝集体と抗体を確認するために、０．５％トリトンＸ－１００（ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を添加して細胞膜を緩くし、ＰＢＳバッファーで洗浄後、ｐａｎ－α－ｓｙｎ抗体を１時間処理した。結合されたｐａｎ－α－ｓｙｎ抗体はａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ－ａｌｅｘａ－４８８抗体を１時間処理した後、ＦＡＣＳ分析を通じて大食作用によって細胞内に入った凝集体を確認した。
図１０ｅの結果のように、正常ヒトＩｇＧ（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）は大食作用に影響を与えず、α－ｓｙｎ抗体を処理した時にα－ｓｙｎ凝集体の大食作用が増加するのを確認することができた。単独抗体と二重抗体を比較した時、類似の水準に大食作用が起こるのを確認して、ＩｇＧ Ｃ－末端部位に結合されたｓｃＦｖ形態のＩＧＦ１Ｒ抗体がα－ｓｙｎ抗体の作用に影響を与えないのを確認した。
実施例１８．二重特異抗体の効能評価
実施例１０によってキメラ１１Ｆ１１抗体と１５６４クローンｓｃＦｖの二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）二重特異抗体を製作し、ヒトアルファ－シヌクレインを過発現する形質転換マウス（ｍＴｈｙ－１ ｈｕｍａｎ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ＵＣ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）で二重特異抗体とアルファ－シヌクレイン抗体のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で効果を比較、分析した。２．５ｍｇ／ｋｇの単独抗体またはヒトＩｇＧまたは同一モル数の二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）二重特異抗体を３ヶ月間毎週腹腔投与した。グループ当り５匹のマウスを用い、非形質転換マウス（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）を対照群として使用した。その次に、灌流を次のように行った。
最後の投与が完了した後、脳内の病理分析のために、人道的規定によって当該動物は抱水クロラール（ｃｈｌｏｒａｌ ｈｙｄｒａｔｅ）で麻酔がかかった後、０．９％の生理食塩水で心臓灌流された。その次に、灌流された脳の半分（ｓａｇｇｉｔａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ）はリン酸緩衝液のうちの４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４、４℃に分析時点まで保管し、他の半分は直ちに冷凍状態で保管した（－７０℃）。
病理学的分析は、次のように行われた。パラホルムアルデヒドに固定された脳半分は、ビブラトーム（Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ）を用いてフリーフローティング（ｆｒｅｅ－ｆｌｏａｔｉｎｇ）方式で４０μｍ厚さの連続切片に切り出した。各投与群の脳内アルファ－シヌクレインの発現程度を確認するために、皮質（ｃｏｒｔｅｘ）、海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）、線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）を含む切片をアルファ－シヌクレイン抗体（凝集体のマーカであるｐ１２９ α－ｓｙｎ抗体、ａｂｃａｍ、ａｂ５９２６４または総アルファ－シヌクレイン抗体、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２６４２）と４℃で一晩培養した。または、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）の活性程度を分析するために、前記切片をＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＢ５８０４、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）あるいは脳炎症（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）程度を確認するために、ＩＬ－１βに対する抗体（ａｂ９７２２、ａｂｃａｍ）をそれぞれ処理した。または、海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）の神経細胞死滅程度を分析するために、ＮｅｕＮ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、＃ＭＡＢ３７７）に対する抗体を処理した。１次抗体との培養後に、ビオチンが結合されたヤギ抗－ウサギＩｇＧ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ）（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびアビジンＤ－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ａｖｉｄｉｎ Ｄ－ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（１：２００、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を処理し、ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）で検出した。免疫染色された各切片は、明視野顕微鏡で観察して光学密度を測定した。結果は、図１１ａ～図１１ｅに開示されている。
１８－１．キメラ抗体と二重特異抗体のアルファ－シヌクレイン減少能分析
図１１ａは、キメラ１１Ｆ１１抗体および当該キメラ抗体と１５６４クローンの二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）二重特異抗体がヒトα－Ｓｙｎを過発現するマウス動物モデル（ＴＧ）でアルファ－シヌクレイン凝集体を除去することができるかを、マウスに抗体投与後、ｐ－１２９ α－Ｓｙｎ抗体を用いてマウス脳組織の中の皮質（ｃｏｒｔｅｘ）、海馬（ｈｉｐｐｏｍｃａｐｕｓ）を染色して測定した結果である。ｐ－１２９ α－ｓｙｎは１２９番目残基がリン酸化された形態の凝集体のマーカであって、染色された組織で濃い茶色点あるいは凝集体形態に示される。
図１１ａによれば、ＩｇＧ処理群はｎｏｎ－ｔｇ対照群に比べて高いｐ－１２９の染色程度を示した（＃：ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１）。これとは反対に、単独抗体あるいは二重特異抗体を処理したグループでは、ｐ－１２９ α－ｓｙｎあるいは凝集体の染色程度が顕著に減少した。特に、海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）では二重特異抗体処理群の減少程度がキメラ１１Ｆ１１抗体に比べて優れていた（＊：ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。図１１ｂは図１１ａと同一な実験であるが、マーカとして、総アルファ－シヌクレイン抗体で染色した結果である。総アルファ－シヌクレイン検出は、本願による抗体がアルファ－シヌクレイン自体の除去能（ｃｌｅａｒｉｎｇ）および抗体の細胞間伝達（ｃｅｌｌ ｔｏ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）抑制能があるのを示すことである。また、他の側面から、単量体の凝集体への形成の抑制、または単量体を全て除去することができると解釈できる。ＴＧマウス（ｍｏｕｓｅ）で増加したヒトアルファ－シヌクレインは単独抗体および二重特異抗体投与によってＩｇＧ投与群に比べて減少し、特に、海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）では二重特異抗体の単独抗体に比べて効能がさらに優れた。
当該結果は、キメラ１１Ｆ１１抗体および二重特異抗体が２．５ｍｇ／ｋｇの低い容量でもパーキンソン疾患動物モデルで効果的にアルファ－シヌクレインおよびその凝集体レベルを減少させるのを示す。特に、二重特異抗体が単独抗体に比べて効能が優れており、これは二重特異抗体が向上したＢＢＢ通過能を基にして単独抗体に比べて脳にさらに多く到達して疾患を効果的に治療することができるのを示唆する。
１８－２．キメラ抗体と二重特異抗体のアストログリオーシス（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）および炎症性サイトカイン（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）レベル減少能分析
グリオーシス（ｇｌｉｏｓｉｓ）は、ＢＢＢの損傷、ＴＧＦ－ベータまたはインターロイキンのような物質によって触発される、中枢神経系に損傷がある場合、これに対する反応として膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）で起こる非特異的反応である。代表的なものとして、アストログリオーシス（Ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）を含み、ＧＦＡＰタンパク質がマーカーとして使用される。よって、キメラ１１Ｆ１１抗体およびキメラ抗体と１５６４クローンの二重特異抗体をマウスに投与してアストログリオーシス（Ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）減少およびこれを触発する炎症性サイトカイン放出減少に及ぼす影響を分析した。分析結果は、図２１ｃおよび２１ｄに開示されている。
図１１ｃは本発明の一例で製造されたキメラ１１Ｆ１１抗体あるいは当該抗体と１５６４クローンの二重特異抗体がｉｎ ｖｉｖｏでアストログリオーシス（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）を減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカとしてＧＦＡＰ（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果である。単独抗体および二重特異抗体はＩｇＧ対照群に比べてアストログリオーシス（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）を抑制し、特に、線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）では二重特異抗体の効能が単独抗体に比べて優れるのを確認することができた。
図１１ｄは、本発明の一例で製造されたキメラ１１Ｆ１１抗体あるいは当該抗体と１５６４クローンの二重特異抗体がｉｎ ｖｉｖｏで炎症性サイトカインを減少させることができるかを、マウスに抗体投与後、マーカとしてＩＬ－１ベータ抗体を用いてマウスの脳組織を染色して測定した結果である。ＩＬ－１ベータは炎症を誘発して多様な神経細胞の死滅および炎症反応を誘導するようになる。本願による抗体を投与したマウスの海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）でＩｇＧ対照群に比べて単独抗体および二重特異抗体投与群でＩＬ－１ベータが減少し、特に、二重特異抗体の減少能が単独抗体に比べて有意に優れた（＃＃：Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．００５；＊：ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。
前記図面に示されているように、本願による抗体は対照群と比較して、アストログリオーシス（Ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）を減少させ、これを触発する炎症性サイトカインＩＬ－１ベータの放出を減少させることが明らかになった。
１８－３．キメラ抗体と二重特異抗体の神経退化（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の減少能分析
アルファシヌクレインの神経毒性および炎症反応によって脳細胞の死滅が発生するのを先行文献で確認されてきた。本願の単独抗体および二重特異抗体がアルファ－シヌクレインによるｉｎ ｖｉｖｏでの脳細胞死滅を抑制できるか分析した。
皮質（ｃｏｒｔｅｘ）および海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）でニューロンのマーカであるＮｅｕＮで染色した結果、単独抗体および二重特異抗体全てＩｇＧ対照群に比べて脳細胞死滅程度が減少することが明らかになった。特に、皮質（ｃｏｒｔｅｘ）では二重特異抗体の脳細胞死滅抑制能が単独抗体に比べて優れたことが確認された。当該結果は、図１１ｅに示した。
実施例１９．Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを通じた半減期増大およびこれによるＢＢＢ通過能向上
ＦｃＲｎは、血管内で抗体が循環する時、溶解されないように細胞内に抗体を引き込んで循環させることによって半減期を増加させる細胞膜の重要な受容体である。ＢＢＢ通過能はトランスサイトーシス抗体の活性も重要であるが、血管内での濃度に依存してＢＢＢを通過するということはよく知られた事実である。このような理由で、二重抗体の半減期を増加させるためにＦｃ部位の４２８番目アミノ酸をメチオニン（Ｍｅｔ）をロイシン（Ｌｅｕ）に変化させてＦｃＲｎとの結合力を増大させた二重抗体を製作した。ヒトＦｃＲｎを発現するｔｇマウスに１０ｍｇ／ｋｇ濃度でＷＴ二重抗体とＭ４２８Ｌ二重抗体を投与して比較した結果、図１１のように、約５０％程度の半減期増大効果を確認した。半減期増加を再確認するために、サルにＷＴ二重抗体（ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）－１５６４）、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）Ｍ４２８Ｌ二重抗体（ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）（Ｍ４２８Ｌ）－１５６４二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ））、一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）Ｍ４２８Ｌ二重抗体（（ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）（Ｍ４２８Ｌ）－１５６４一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ））を投与してＰＫ ｐｒｏｆｉｌｅを分析した。図１２ａに示したように、ＷＴ二重抗体の場合、１６８時間以後から急激に血液内濃度が低まる反面、ＦｃＲｎとの結合力が高いＭ４２８Ｌ二重抗体はＷＴに比べて向上した血液内濃度を維持した。半減期は、ＷＴ二重抗体に比べてＭ４２８Ｌ二重抗体で１．５日程度増加する結果を確認した。特に、ｃｌｅａｒａｎｃｅ側面からは、一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）Ｍ４２８Ｌ二重抗体が最も優れており、ＷＴ二重抗体が最も速いｃｌｅａｒａｎｃｅを示した（図１２ｂ）。
半減期増加効果によるＢＢＢ通過向上を検証するために、抗体投与２４時間後にＣＳＦを抽出して、ＣＳＦ内の抗体量を分析した。１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１Ｒを１８時間冷蔵状態でコーティング（ｃｏａｔｉｎｇ）した後、ＣＳＦを添加してＩＧＦ１Ｒと結合した抗体を検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）した。図１２ｃで確認されるように、血液内抗体量が多かったＭ４２８Ｌ二重抗体のＢＢＢ通過量が多いのを確認し、一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）Ｍ４２８Ｌ二重抗体は優れたＢＢＢ通過能と結合されて二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）Ｍ４２８Ｌ二重抗体より向上した通過能を示した。
実施例２０．脱アミド化されたＡｆｆｉｎｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔ基盤二重特異抗体の効能評価
実施例１０によってヒト化１１Ｆ１１抗体であるｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）と１５６４クローンのａｆｆｉｎｉｔｙ ｖａｒｉａｎｔであるＦ０６ ｓｃＦｖの一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）二重特異抗体、特に脱アミド化のためにＣＤＲ内一部ｒｅｓｉｄｕｅを変形したｍｕｔａｎｔを用いた二重抗体（ｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）－Ｆ０６（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）を含む）を製作して、ヒトアルファ－シヌクレインを過発現する形質転換マウス（ｍＴｈｙ－１ ｈｕｍａｎ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ、ＵＣ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）で前記製作された二重特異抗体とアルファ－シヌクレイン単独抗体のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）効能を比較、分析した。
具体的に、４ヶ月齢の形質転換マウスにＩｇＧおよびｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）は２０ｍｇ／ｋｇ、二重特異抗体は同一モル数に該当する２３．４ｍｇ／ｋｇを８日間、０、７２、１４４、１９２時間目に腹腔投与した。最後の投与後、２４時間後、当該動物は抱水クロラール（ｃｈｌｏｒａｌ ｈｙｄｒａｔｅ）で麻酔がかかった後、０．９％の生理食塩水で心臓灌流された。脳は分離されて分析時まで－７０℃でｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎされた。脳組織を破砕し遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）してｄｅｂｒｉを除去した後、上澄み液を得て、α－ｓｙｎに対するＥＬＩＳＡで当該脳ライセート（ｂｒａｉｎ ｌｙｓａｔｅ）内のα－ｓｙｎ量を定量した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ＫＨＢ００６１）。その結果は図１３の通りである。
図１３に示されているように、本発明の一例で製造されたヒト化１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）抗体および脱アミド化されたＦ０６ ｖａｒｉａｎｔ基盤二重特異抗体は、ＩｇＧ対照群に比べて脳内のα－ｓｙｎを減少させるのを示した。特に、二重特異抗体はα－ｓｙｎ単独抗体に比べて優れた脳内α－ｓｙｎ減少能を示した。
実施例２１．（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体を含む二重抗体のＩＧＦ１Ｒ－特異的抗原結合力分析（ＥＬＩＳＡ）
本実施例では、実施例８によって脱アミド化された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体を含む二重抗体が正常的な抗原結合力を有するかどうかを確認すると同時に、多様な抗－ＩＧＦ１Ｒクローンおよび二重抗体フォーマット内での脱アミド化ＩＧＦ１Ｒ抗体の抗原結合力を多角的に分析しようとした。このために、抗－ＩＧＦ１ＲクローンであるＦ０６、ＶＨ５およびＶＨ１６を基盤にして、脱アミド化されていない抗体（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）、（ｄｅ）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体および（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体をそれぞれ含む一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）二重抗体または二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）二重抗体を製造し、ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡを通じて組換えＩＧＦ１Ｒに対する結合力および濃度依存的結合の有無を定量的に分析および比較した。抗－アルファ－シヌクレイン抗体としてはｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）クローンを使用した。
抗体結合対象抗原であるヒト組換えＩＧＦ１Ｒは細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）（ＥＣＤ）であって、Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した（１０１６４－Ｈ０８Ｈ）。９６－ウェルＥＬＩＳＡプレートに（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅｓ、ＮＵＮＣ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）ヒトＩＧＦ１ＲをＰＢＳバッファーに１ｕｇ／ｍｌで希釈してウェル当り１００ｕｌずつ入れた後、４℃で１６時間反応してコーティング後、上澄み液を除去した。１％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が含まれているＰＢＳバッファーをウェル当り２００ｕｌ入れて３７℃で２時間反応させて非特異的結合を遮断させた。
先に製造した二重抗体およびそれぞれの対照群抗体（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅおよび（ｄｅ）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体）を最高濃度４００ｎＭを基準にして５倍ずつ希釈して８ポイントを作った後、各ウェルに１００μｌずつ処理後、３７℃で２時間反応させてコーティングされた抗原に抗体を結合させた。反応終了後、Ｔｗｅｅｎ２０が０．０５％含まれているＰＢＳバッファー３００ｕｌを用いて４回洗浄し、二重抗体に存在するヒトＦｃを認知する抗－ヒトＦｃ－ＨＲＰをブロッキングバッファーに１：２０００で希釈して各ウェルに１００ｕｌずつ処理して３７℃で１時間反応させた。再びＰＢＳ－Ｔ（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％）３００ｕｌを用いて４回洗浄した後、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｔ０４４０）を使用して発色させた。酵素反応を０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸によって中止させ、マイクロプレートリーダー機（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を記録および分析した。前記実験結果を図１４ａ～図１４ｃおよび表２５に示した。図１４ａはＦ０６一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）抗体、Ｆ０６（Ｓｔｏｐ）一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）抗体、およびＦ０６（ｄｅ２）（Ｓｔｏｐ）抗体に関する実験結果であり、図１４ｂはＶＨ５抗体、ＶＨ５（ｄｅ）（Ｓｔｏｐ）抗体およびＶＨ５（ｄｅ２）（Ｓｔｏｐ）抗体に関する実験結果であり、図１４ｃはＶＨ１６抗体、ＶＨ１６（ｄｅ）（Ｓｔｏｐ）抗体およびＶＨ１６（ｄｅ２）（Ｓｔｏｐ）抗体に関する実験結果である。
図１４ａ、１４ｂ、および１４ｃによれば、抗－ＩＧＦ１Ｒクローンの種類および一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）／二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）フォーマットに関係なく、（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体は脱アミド化されていないｗｉｌｄ ｔｙｐｅ水準の抗原結合力を維持した。また、（ｄｅ）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体と比較しても優れた抗原結合力を示した。下記表２５で、Ｆ０６、ＶＨ５およびＶＨ１６を基盤にして脱アミド化されていない抗体（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）、（ｄｅ）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体および（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体に関する実験結果を示す。
Figure 2023113599000029
表２５は、（ｄｅ）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体と（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体のｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ結果を数値化して比較したものである。表２５によれば、抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体クローンの種類や一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）／二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）フォーマットに関係なく、（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体は（ｄｅ）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体に比べて顕著に優れた抗原結合力を有することが確認された。
実施例２２．（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体を含む二重抗体の細胞表面ＩＧＦ１Ｒ－特異的抗原結合力分析（ＦＡＣＳ）
実施例２１で試験した（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化二重抗体、そして対照群としてこれらのｗｉｌｄ ｔｙｐｅ抗体および（ｄｅ）（ＳｔｏＰ）脱アミド化二重抗体を用いて細胞表面ＩＧＦ１Ｒ－特異的抗原結合力をＦＡＣＳ分析した。分析にはＩＧＦ１Ｒを過発現するＭＣＦ７細胞を使用した。
具体的に、前記二重抗体をそれぞれ１０ｕｇ／ｍｌで希釈後、サンプル当り０．５×１０６のＭＣＦ－７細胞株に処理して４℃で２時間反応させた。ＰＢＳバッファーを用いて２回洗浄後、抗－ヒト（ｈｕｍａｎ）ＦＩＴＣを１：１０００で希釈して処理し、４℃で１時間反応させた。再びＰＢＳバッファーを用いて２回洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を用いて抗－ＩＧＦ１Ｒ ＢｓＡｂが結合された程度を測定した。対照群としては二次抗体のみ処理したＭＣＦ－７細胞を使用し、前記実験結果を図１５ａ～１５ｃに示した。
実験結果、実施例２１で確認された結果と同様に、抗－ＩＧＦ１Ｒクローンの種類および一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）／二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）フォーマットに関係なく（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体は脱アミド化されていないｗｉｌｄ ｔｙｐｅ抗体と同等な水準の抗原結合力を維持し、（ｄｅ）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体と比較して優れた抗原結合力を示した。
実施例２３．（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体基盤二重抗体のｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢ通過能分析
実施例８によって脱アミド化された抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体を含む二重抗体のｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢ通過能をＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）ラットで確認しようとした。実験群および投与容量は下記表に整理されている。
Figure 2023113599000030
上記表２６に記載されたようなα－ｓｙｎ単独抗体またはα－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒ二重抗体をラットの尾静脈に単回投与後、２４時間目にその血清（ｓｅｒｕｍ）および脳脊髄液（ＣＳＦ）での抗体量を質量分析で分析した。具体的質量分析方法は実施例１５と実質的に同一に行い、分析結果は図１６に示されている。
図１６で血清内濃度は投与２４時間後の血液内抗体濃度を意味するものであって、（ｄｅ）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体と（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体で類似に観察された。反面、抗体のｂｒａｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙを代弁する脳脊髄液内濃度の場合、（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化抗体で最も高く示された。これは、本発明の二重抗体が脱アミド化抗－ＩＧＦ１Ｒ抗体によって優れたＢＢＢ通過能を示すという事実を示すことである。
本発明の二重抗体の効能をより長期間観察するために、表２６に示す抗アルファ－シヌクレイン単独抗体であるｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ．２）と（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化二重抗体であるｈｕ１１Ｆ１１（ｖｅｒ２）－Ｆ０６一価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）をラットの尾静脈に単回投与した後、１６８時間までの血清、脳脊髄液および脳での抗体量を質量分析で分析した。質量分析方法は、前記実施例１５の方法と実質的に同一に行った。分析結果は図１７に示されている。
図１７によれば、抗体の血清内濃度は単独抗体と（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化二重抗体で類似に観察されたが、抗体のｂｒａｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙを代弁する脳脊髄液内濃度の場合、単独抗体に比べて（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化二重抗体で曲線下面積（ＡＵＣ）が約５．８倍増加し、２４時間目の脳脊髄液内濃度は（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化二重抗体で約１０倍以上であることが確認された。また、脳内濃度も単独抗体に比べて（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化二重抗体で曲線下面積（ＡＵＣ）が約７．９倍増加した。これから、本発明の二重抗体は（ｄｅ２）（ＳｔｏＰ）脱アミド化ＩＧＲ１Ｒ抗体を含むことによって優れたＢＢＢ通過能を示すことができるのを確認することができた。

Claims (15)

  1. 抗α－ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片；および抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片を含む、抗α－ｓｙｎ／抗ＩＧＦ１Ｒの二重特異抗体であって、
    前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
    前記重鎖可変領域は、配列番号１または配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号２～７および配列番号１１～１８のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、配列番号８～９および配列番号１９のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含み、
    前記軽鎖可変領域は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号２１～２３のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および配列番号２４～２８および配列番号２９～３１のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含むものである、二重特異抗体。
  2. 前記抗α－ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、ヒト、サル、ラット、およびマウスアルファ－シヌクレインタンパク質のＣ－末端領域に特異的に結合するものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
  3. 前記抗α－ｓｙｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７３のアミノ酸配列で、Ｎ－末端から１１０番残基～１２０番残基を含む連続する少なくとも１１個のアミノ酸を含むペプチド、または１１１番残基～１２２番残基を含む連続する少なくとも１２個アミノ酸を含むペプチドに特異的に結合するものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
  4. 前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むタンパク質でＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８、Ｇｌｕ７７９、Ｌ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９、Ｌ８１３、Ｖ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０およびＣ４８８からなる群より選択された少なくとも一つ以上のアミノ酸を特異的に認識して結合するものである、請求項１に記載の二重特異抗体
  5. 前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むタンパク質で結合部位１～結合部位３からなる群より選択された少なくとも一つ以上の結合部位に結合するものであり、前記結合部位１はＹ７７５、Ｐ７７６、Ｆ７７８、Ｒ６５０、Ｓ７９１、Ｌ７９８およびＧｌｕ７７９からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位２はＬ６４１、Ｈ８０８、Ｅ８０９およびＬ８１３からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含み、結合部位３はＶ３９７、Ｄ４３５、Ｗ４３４、Ｙ４６０およびＣ４８８からなる群より選択された一つ以上のアミノ酸を含むものである、請求項４に記載の二重特異抗体。
  6. 前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
    前記重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号３および配列番号５～７のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、および配列番号８～９のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含み、
    前記軽鎖可変領域は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号２２および２３のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および配列番号２６～２８のアミノ酸配列のうちから選択された一つを含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含むものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
  7. 前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ１、配列番号３３または配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ２、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ３、および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨ－ＦＲ４を含み、軽鎖可変領域は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ１、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ２、配列番号３９または配列番号４０のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ３、および配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸配列を含むＬ－ＦＲ４を含むものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
  8. 前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の重鎖可変領域は配列番号４３～配列番号８７のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号８８～配列番号１３２のアミノ酸配列からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
  9. 前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
  10. 前記抗α－ｓｙｎ抗体は完全な抗体であり、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体は抗体のＦｖ－断片である、請求項１に記載の二重特異抗体。
  11. 前記抗α－ｓｙｎ抗体の完全な抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４形態である、請求項１０に記載の二重特異抗体。
  12. 前記抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の一分子が抗α－ｓｙｎ抗体の一つの重鎖ＣＨ３に結合したｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ二重特異抗体である、請求項１０に記載の二重特異抗体。
  13. 前記二重特異抗体に含まれている抗α－ｓｙｎ抗体の重鎖可変領域は、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１３６または１３７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（Ｈ－ＣＤＲ２）、および配列番号１３８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含み、
    軽鎖可変領域は、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１４０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ－ＣＤＲ２）、および配列番号１４１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含むものである、請求項１に記載の二重特異抗体。
  14. 請求項１～１３のうちのいずれか一項による二重特異抗体を含む、アルファ－シヌクレイン病（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ）の予防または治療用薬学組成物。
  15. 前記アルファ－シヌクレイン病（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ）は、パーキンソン疾患（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）、パーキンソン疾患性認知症（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｍｅｎｔｉａ、ＰＤＤ）、レビー小体認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ、ＤＬＢ）、アルツハイマーレビー小体疾患（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＬＢＶ））、複合性アルツハイマーおよびパーキンソン病（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、または多系統萎縮症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｔｒｏｐｈｙ、ＭＳＡ）を含むものである、請求項１４に記載の組成物。
JP2023065309A 2019-06-14 2023-04-13 α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途 Pending JP2023113599A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2019-0071057 2019-06-14
KR20190071057 2019-06-14
PCT/KR2020/007704 WO2020251316A1 (ko) 2019-06-14 2020-06-15 α-SYN/IGF1R에 대한 이중 특이 항체 및 그 용도
JP2021573848A JP7348676B2 (ja) 2019-06-14 2020-06-15 α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021573848A Division JP7348676B2 (ja) 2019-06-14 2020-06-15 α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023113599A true JP2023113599A (ja) 2023-08-16

Family

ID=73781866

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021573848A Active JP7348676B2 (ja) 2019-06-14 2020-06-15 α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途
JP2023065309A Pending JP2023113599A (ja) 2019-06-14 2023-04-13 α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途
JP2023141925A Pending JP2023179442A (ja) 2019-06-14 2023-09-01 α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021573848A Active JP7348676B2 (ja) 2019-06-14 2020-06-15 α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023141925A Pending JP2023179442A (ja) 2019-06-14 2023-09-01 α－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途

Country Status (15)

Country Link
US (2) US20220348665A1 (ja)
EP (2) EP4268842A3 (ja)
JP (3) JP7348676B2 (ja)
KR (2) KR20220044397A (ja)
CN (2) CN117024589A (ja)
AU (2) AU2020291487A1 (ja)
BR (1) BR112021025086A2 (ja)
CA (1) CA3143242A1 (ja)
CL (1) CL2021003335A1 (ja)
CO (1) CO2021017688A2 (ja)
EA (1) EA202193058A1 (ja)
IL (2) IL302490A (ja)
MX (2) MX2021015081A (ja)
PE (2) PE20220516A1 (ja)
WO (1) WO2020251316A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112019016374A2 (pt) 2017-02-17 2020-04-07 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos para alfa-sinucleína e usos dos mesmos
CA3219659A1 (en) * 2021-05-12 2022-11-17 Abl Bio Incorporated Antibodies for treating alpha-synucleinopathies

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
EP3002299A1 (en) * 2008-06-03 2016-04-06 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
HUE037811T2 (hu) 2011-10-28 2018-09-28 Prothena Biosciences Ltd Alfa-szinukleint felismerõ humanizált antitestek
US9534044B2 (en) 2013-02-28 2017-01-03 United Arab Emirates University Alpha-synuclein antibodies and uses thereof
WO2015031673A2 (en) * 2013-08-28 2015-03-05 Bioasis Technologies Inc. Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof
EP3071974A2 (en) 2013-11-19 2016-09-28 Prothena Biosciences Limited Monitoring immunotherapy of lewy body disease from constipation symptoms
MX2016011560A (es) 2014-03-06 2017-04-13 Nat Res Council Canada Anticuerpos especificos para el receptor del factor de crecimiento similar a insulina 1 y usos de los mismos.
UA120047C2 (uk) 2014-03-06 2019-09-25 Нешнл Рісеч Каунсіл Оф Канада Антигензв'язуючий фрагмент антитіла, який специфічно зв'язується з рецептором інсуліноподібного фактора росту 1 (igf1r)
CA2942154C (en) 2014-03-06 2023-06-27 National Research Council Of Canada Insulin-like growth factor 1 receptor -specific antibodies and uses thereof
EP3207057A2 (en) 2014-10-16 2017-08-23 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
WO2017127499A1 (en) * 2016-01-22 2017-07-27 Janssen Biotech, Inc. Anti-ror1 antibodies, ror1 x cd3 bispecific antibodies, and methods of using the same
BR112019013953A2 (pt) 2017-01-06 2020-02-11 Abl Bio Inc. Anticorpo anti-a-syn e uso do mesmo
CN109475617B (zh) * 2017-02-22 2022-05-17 天境生物科技(杭州)有限公司 抗lag-3抗体及其应用
WO2018213316A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Alector Llc Anti-siglec-5 antibodies and methods of use thereof
BR112020001970A2 (pt) * 2017-08-02 2020-08-04 Stressmarq Biosciences Inc. anticorpo que se liga à alfa-sinucleína ativa
CA3082559A1 (en) * 2017-11-17 2019-05-23 Abl Bio Inc. Antibodies to a-synuclein and uses thereof
JP7212391B2 (ja) * 2017-12-14 2023-01-25 エービーエル バイオ インコーポレイテッド ａ－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途

Also Published As

Publication number Publication date
IL302490A (en) 2023-06-01
EA202193058A1 (ru) 2022-03-05
PE20231029A1 (es) 2023-07-10
MX2023006669A (es) 2023-06-21
MX2021015081A (es) 2022-01-18
CA3143242A1 (en) 2020-12-17
KR20220044397A (ko) 2022-04-07
JP7348676B2 (ja) 2023-09-21
WO2020251316A1 (ko) 2020-12-17
EP3985022A4 (en) 2023-08-02
EP4268842A2 (en) 2023-11-01
US20230357412A1 (en) 2023-11-09
AU2020291487A1 (en) 2022-01-20
CO2021017688A2 (es) 2022-01-17
CN113966346A (zh) 2022-01-21
CL2021003335A1 (es) 2022-07-15
PE20220516A1 (es) 2022-04-07
EP4268842A3 (en) 2024-05-22
JP2023179442A (ja) 2023-12-19
IL288692A (en) 2022-02-01
JP2022537279A (ja) 2022-08-25
AU2023202595A1 (en) 2023-06-29
EP3985022A1 (en) 2022-04-20
CN117024589A (zh) 2023-11-10
KR20210087093A (ko) 2021-07-09
KR102444797B1 (ko) 2022-09-20
US20220348665A1 (en) 2022-11-03
BR112021025086A2 (pt) 2022-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018370279B2 (en) Antibodies to a-synuclein and uses thereof
JP7212391B2 (ja) ａ－ｓｙｎ／ＩＧＦ１Ｒに対する二重特異抗体およびその用途
US20230357412A1 (en) Bispecific antibody against alpha-syn/igf1r and use thereof
US20220185875A1 (en) Bispecific antibody specifically bound to vegf and ang2
TWI821699B (zh) 抗b7h4抗體及其雙抗和應用
WO2021170082A1 (zh) 抗cd47/抗pd-l1抗体及其应用
US20220380446A1 (en) Antibodies for treating alpha-synucleinopathies
EA045348B1 (ru) БИСПЕЦИФИЧНОЕ АНТИТЕЛО К α-SYN/IGF1R И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
CN116438198A (zh) 能够结合ror2的抗体以及结合ror2和cd3的双特异性抗体

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230612

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230612