CN109475617B - 抗lag-3抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了结合淋巴细胞活化基因‑3(LAG‑3)的抗体。还提供了刺激免疫应答、抑制肿瘤细胞生长和治疗自身免疫疾病、炎症或病毒疾病的方法。

Description

抗LAG-3抗体及其应用
技术领域
本发明一般涉及分子生物学和蛋白质生物化学领域。更具体而言，本发明涉及结合淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)的抗体及其使用方法。
背景技术
淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)(也被称为CD223)是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，其与CD4密切相关，并且对T细胞的功能产生多方面的影响。LAG-3在活化的T细胞、耗竭的T细胞、肿瘤浸润性T细胞和调节性T细胞(Treg)上表达。在与主要组织相容性复合物2(MHCII类)结合后，LAG-3/MHC II类相互作用导致T细胞增殖、活化以及体内平衡的负调节。
与细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)以及程序性细胞死亡-1(PD-1)类似，LAG-3代表癌症中的重要免疫检查点。LAG-3不仅在活化/耗竭的效应T细胞上表达，还在调节性T细胞上表达。LAG3拮抗作用不仅可以促进效应T细胞的活化，而且可以阻断调节性T细胞的抑制功能。因此，LAG-3代表针对癌症免疫治疗的、有前景的靶标，并且临床前证据表明抗LAG-3抗体可以促进抗肿瘤应答。
鉴于上述情况，需要开发以刺激抑制各种癌症和肿瘤细胞生长的免疫应答的方式调节LAG-3活性、以及可用于治疗自身免疫、炎症或病毒性疾病的新药。
发明概要
本发明提供了能够结合人淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)蛋白的抗体及其片段，及其在治疗、诊断和分析情形中的用途。如在实验实施例中所证明的，本发明公开的一些抗LAG-3抗体具有已知的抗LAG-3抗体未显示出的活性。例如，除了与MHC II类分子的结合之外，本发明公开的抗体可以抑制LAG-3蛋白与半乳糖凝集素-3(LGALS3)、C型凝集素结构域家族4成员G(LSECtin)蛋白的结合。相比之下，已知的抗LAG-3抗体仅显示对与MHC II类分子结合的抑制作用。在一些实施方案中，本发明的抗体及其片段能够逆转调节性T细胞(Treg)对效应T细胞(Teff)的抑制作用。
在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的抗体或者其片段，所述的抗体或者其片段对人类淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)蛋白具有特异性，所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区含有重链互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述的轻链可变区含有轻链互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3；其中
所述的CDRH1包含序列如SEQ ID NO:240所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:240衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRH2包含序列如SEQ ID NO:241所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:241衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRH3包含序列如SEQ ID NO:242所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:242衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRL1包含序列如SEQ ID NO:243所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:243衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRL2包含序列如SEQ ID NO:244所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:244衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRL3包含序列如SEQ ID NO:245所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:245衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，依据Kabat编号，所述的氨基酸取代发生于SEQ ID NO:240的氨基酸残基Y27、T28、T30、G35或者其组合。在一些实施方案中，所述的氨基酸取代选自：
Y27：F；
T28：M或者L；
T30：E、D、或者G；或者
G35：W或者S。在一些实施方案中，所述的CDRH1包含一条选自由SEQ ID NO:240和SEQ ID NO:339～346组成的群组中的氨基酸序列。
在一些实施方案中，依据Kabat编号，所述氨基酸取代发生于SEQ ID NO:241的氨基酸残基D50、Y52、Y56、N58或者其组合。在一些实施方案中，所述的氨基酸取代选自：
D50：E；
Y52：F；
Y56：I、V、L或者H；或者
N58：V或者T。在一些实施方案中，所述的氨基酸取代包含N58V。在一些实施方案中，所述的CDRH2包含一条选自由SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:347～353组成的群组中的氨基酸序列。
在一些实施方案中，依据Kabat编号，所述氨基酸取代发生于SEQ ID NO:242的氨基酸残基N96、G99、Y102或者其组合。在一些实施方案中，所述的氨基酸取代选自：
N96：D或者G；
G99：K、R或者Q；或者
Y102：H。在一些实施方案中，所述的氨基酸取代包含G99K或者Y102H。在一些实施方案中，所述的CDRH3包含一条选自由SEQ ID NO:242和SEQ ID NO:354～361组成的群组中的氨基酸序列。
在一些实施方案中，依据Kabat编号，所述氨基酸取代发生于SEQ ID NO:243的氨基酸残基N28。在一些实施方案中，所述的氨基酸取代包含N28Q。
在一些实施方案中，所述的CDRL2包含一条如SEQ ID NO:376所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，依据Kabat编号，所述氨基酸取代发生于SEQ ID NO:244的氨基酸残基Q50、V51、S52、L54、S56或者其组合。在一些实施方案中，所述的氨基酸取代选自：
Q50：H；
V51：K；
S52：D；
L54：R：或者
S56：R、V、L或者T。在一些实施方案中，所述的CDRL2包含一条选自由SEQ ID NO:244和SEQ ID NO:362～369组成的群组中的氨基酸序列。
在一些实施方案中，依据Kabat编号，所述氨基酸取代发生于SEQ ID NO:245的氨基酸残基A89、N91、L94或其组合。在一些实施方案中，所述的氨基酸取代选自：
A89：G；
N91：Y；或者
L94：M或者E。在一些实施方案中，所述的氨基酸取代包含N91Y。在一些实施方案中，所述的CDRL3包含一条选自由SEQ ID NO:245和SEQ ID NO:370～375组成的群组中的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述的分离的抗体或者其片段包含重链可变区，所述的重链可变区包含一条选自由SEQ ID NO:238、246-259、261、263、265、267、269、271、273、75、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335和337组成的群组中的氨基酸序列，或者包含一条多肽，所述的多肽与一条选自由SEQ ID NO:238、246-259、261、263、265、267、269、271、273、75、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335和337组成的群组中的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述的分离的抗体或者其片段包含轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条选自由SEQ ID NO:239、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336和338组成的群组中的氨基酸序列，或者包含一条多肽，所述的多肽与一条选自由SEQ ID NO:239、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336和338组成的群组中的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
可以将回复突变整合到人源化抗体或片段中。在一些实施方案中，依据Kabat编号，所述的重链可变区包含一个或多个选自由：
(a)第71位的丙氨酸(A)、
(b)第69位的亮氨酸(L)、
(c)第66位的赖氨酸(K)、
(d)第67位的丙氨酸(A)、
(e)第48位的异亮氨酸(I)、
(f)第37位的异亮氨酸(I)、
(g)第38位的赖氨酸(K)、
(h)第91位的苯丙氨酸(F)以及
(i)第1位的谷氨酸(E)及其组合组成的群组中的氨基酸残基。
在另一个实施方案中，提供一种分离的抗体或者其片段，所述的抗体或者其片段对人类淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)蛋白具有特异性，所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区含有重链互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述的轻链可变区含有轻链互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3；其中
所述的CDRH1包含序列如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:1或2衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRH2包含序列如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:3或4衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRH3包含一条选自由序列如SEQ ID NO:5～45所示的氨基酸序列组成的群组中的氨基酸序列，或者衍生自SEQ ID NO:5～45中的任一个氨基酸序列并具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRL1包含一条选自由序列如SEQ ID NO:46～80所示的氨基酸序列组成的群组中的氨基酸序列，或者衍生自SEQ ID NO:46～80中的任一条氨基酸序列并具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRL2包含一条选自由序列如SEQ ID NO:81～103所示的氨基酸序列组成的群组中的氨基酸序列，或者衍生自SEQ ID NO:81～103中的任一条氨基酸序列并具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRL3包含一条选自由序列如SEQ ID NO:104～139所示的氨基酸序列组成的群组中的氨基酸序列，或者衍生自SEQ ID NO:104～139中的任一条氨基酸序列并具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述的分离的抗体或者其片段包含重链可变区，所述的重链可变区包含一条选自由SEQ ID NO:140～188组成的群组中的氨基酸序列，或者包含一条多肽，所述的多肽与一条选自由SEQ ID NO:140～188组成的群组中的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，所述的分离的抗体或者其片段包含轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条选自由SEQ ID NO:189～237组成的群组中的氨基酸序列，或者包含一条多肽，所述的多肽与一条选自由SEQ ID NO:189～237组成的群组中的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
还提供了双特异性的抗体，所述的双特异性包括针对免疫检查点蛋白或肿瘤抗原的第二特异性。在一些实施方案中，所述的双特异性包括针对选自由PD-L1、PD-1、CTLA-4、CD28、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM、BTLA、KIR、CD47、CD73、EGFR、Her2、CD33、CD133、CEA以及VEGF组成的群组中的蛋白靶点的第二特异性。
还提供了治疗方法，包括对自身免疫疾病或炎性疾病、癌症以及感染的治疗。
附图简要说明
图1.D1-D2结构域对于LAG-3的功能很重要。野生型(WT)LAG3胞外结构域(ECD)融合蛋白(LAG-3-ECD-huFc)片段可以结合Daudi细胞，而截掉D1-D2的LAG-3-ECD-huFc片段不能结合Daudi细胞。
图2.人抗LAG3抗体与衍生自各种物种的LAG3蛋白的结合。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评价抗LAG-3抗体与人、大鼠和小鼠LAG3的结合特性。
图3.人抗LAG3抗体与活化的人原代CD4+T细胞上的细胞表面LAG-3抗原的结合。评估抗LAG-3抗体与不同浓度(10μg/ml、3.333μg/ml、1.111μg/ml、0.370μg/ml、0.123μg/ml、0.041μg/ml、0.014μg/ml和0.005μg/ml)的活化的人原代CD4+T细胞上的细胞表面LAG-3抗原的结合。
图4.抗LAG-3抗体抑制可溶性LAG-3(sLAG)与MHC II类受体的结合。在使用生物素标记的LAG-3-ECD-huFcLAG-3-Fc融合蛋白和表达MHC II类受体的Raji细胞的体外结合试验中，评价抗LAG-3抗体阻断sLAG-3与MHC II类受体结合的能力。
图5.通过抗LAG-3抗体刺激外周血单个核细胞(PBMC)中的IL-2产生。将起始浓度为20μg/ml，以1:3系列稀释度稀释至共6个剂量的不同浓度的LAG-3抗体施用于葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的PBMC中。三天后，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评定培养上清液中的IL-2浓度。
图6.使用抗LAG-3抗体逆转调节性T细胞(Treg)对效应T细胞(Teff)的抑制功能。为了评价抗LAG-3抗体逆转Treg对Teffs的抑制作用的能力，使用实施例1中的抗体进行体外Treg抑制试验。
图7.抗LAG3抗体和PD-1抗体组合治疗的协同作用。在SEB刺激的PBMCs试验中，结合PD-1抗体评定抗LAG3抗体。
图8.在PD-L1抗体存在下，抗LAG-3抗体增强人类T细胞应答。在人混合淋巴细胞反应(MLR)试验中，结合PD-L1抗体评定抗LAG3抗体。
图9.ELISA结果显示抗体与LAG3(D1-D4 huFc)的完整胞外结构域而非D1-D2缺失LAG3(△D1-D2 huFc)结合的EC50，证明122H、147H和170H是用于人类LAG3的D1和D2结构域的有效的和选择性的结合剂。
图10.抗体122H、147H和170H剂量依赖性地抑制LAG3与其受体MHC II类分子的结合。
图11.小鼠单克隆抗体122H、147H和170H剂量依赖性地促进Jurkat T细胞产生IL2。
图12.人源化单克隆抗体147H-13剂量依赖性地促进Jurkat T细胞产生IL2。
图13.抗LAG3抗体与Jurkat-LAG3细胞和活化的CD4T细胞的结合曲线。
图14.亲和力成熟的抗LAG3抗体在刺激Jurkat T细胞IL2释放上的影响。
图15.抗LAG3抗体对阻断半乳糖凝集素-3或LSECtin与LAG3结合的作用。
图16.抗PD-L1抗体与抗LAG3抗体组合产生的IL-2显著多于单独的抗PD-L1抗体或者抗LAG3抗体。
图17.抗PD-L1抗体和147H-13的组合显示出对MC38肿瘤生长的强烈抑制。
详细描述
本发明涉及分离的抗体，特别是人和人源化抗体，其结合人LAG-3并且具有期望的功能特性。在一些实施方案中，所述的LAG-3抗体能够结合LAG-3并抑制其与其他分子的结合。在一些实施方案中，所述的其他分子包括但不限于半乳糖凝集素-3(LGALS3)、C型凝集素结构域家族4成员G(LSECtin)蛋白和MHC II类分子。
在某些实施方案中，本发明的所述的抗体包含本发明公开的某些CDR区。本发明提供了分离的抗体、制备此类抗体的方法，包含此类抗体的免疫偶联物和双特异性分子，以及含有本发明的所述抗体、所述免疫偶联物或所述双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及使用所述抗体的方法，例如检测LAG-3蛋白，以及单独或者与其他治疗剂组合使用本发明的所述抗LAG-3抗体刺激免疫应答的方法。因此，本发明还提供了使用本发明的所述抗LAG-3抗体来例如抑制肿瘤生长或治疗病毒感染的方法。
为了更容易理解本发明内容，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述另外的定义。
术语“LAG-3”或“LAG3”是指淋巴细胞活化基因-3。所述的LAG3蛋白属于免疫球蛋白(Ig)超家族，包含503个氨基酸的I型跨膜蛋白，具有4个细胞外Ig样结构域，被命名为D1至D4。如本发明所述，术语“LAG-3”包括变体、亚型、同系物、直系同源物和旁系同源物。例如，在某些情况下，对人LAG-3蛋白特异的抗体可与来自人以外的物种的LAG-3蛋白交叉反应。在其他实施方案中，对人LAG-3蛋白特异的所述抗体可以对人LAG-3蛋白完全特异，并且不显示出物种或其他类型的交叉反应性，或可以与来自某些其他物种但不是所有其他物种的LAG-3交叉反应(例如，与猴LAG-3交叉反应，但不与小鼠LAG-3交叉反应)。术语“人LAG-3”是指人序列LAG-3，例如具有GenBank登录号NP_002277的人LAG-3的完整氨基酸序列。术语“小鼠LAG-3”是指小鼠序列LAG-3，例如具有GenBank登录号NP 032505的小鼠LAG-3的完整氨基酸序列。LAG-3在本领域中也称为例如CD223。人LAG-3序列可以与GenBank登录号NP002277的人LAG-3不同，例如在非保守区域中的保守突变或突变、并且具有与人LAG-3基本相同的生物学功能。例如，人LAG-3的一种生物学功能是在LAG-3的细胞外结构域中具有特异性结合本发明的抗体的表位，或者人LAG-3的一种生物学功能是与MHC II类分子结合。
特别的人LAG-3序列通常与GenBank登录号NP_002277的人LAG-3的氨基酸序列具有至少90％的同一性，并且包含当与其他物种(例如鼠)的LAG-3氨基酸序列比较时能够将氨基酸序列鉴定为人的氨基酸残基。在某些情况下，人LAG-3与GenBank登录号NP_002277的LAG-3的氨基酸序列的同一性可以是至少95％，或甚至至少96％、97％、98％或99％的同一性。在某些实施方案中，人LAG-3序列将显示出与GenBank登录号NP_002277的LAG-3序列不超过10个氨基酸的差异。在某些实施方案中，人LAG-3可展示出与GenBank登录号NP_002277的LAG-3序列不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2或1个氨基酸的差异。如本发明所述可以测定同一性的百分比。
术语“免疫应答”是指，例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏(包括抗体、细胞因子和补体)产生的可溶性大分子的作用，该作用导致针对入侵病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞，或在自身免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织的选择性损伤、破坏或从人体中消除。
“抗原特异性T细胞应答”是指由T细胞特异的抗原刺激T细胞产生的T细胞应答。基于抗原特异性刺激的T细胞应答的非限制性实例包括增殖和细胞因子产生(例如IL-2产生)。
本发明中提及的术语“抗体”包括全抗体或者任何抗原结合片段(即：抗原结合部分)或者其单链。全抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本发明中缩写为VH)和重链恒定区组成。所述的重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本发明中缩写为VL)和轻链恒定区组成。所述的轻链恒定区由一个结构域CL组成。所述的VH和VL区可以进一步细分成被命名为互补决定区(CDR)的高变区，其间穿插着更保守的区域，被称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。所述重链和轻链的所述可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。所述抗体的所述恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
如本发明所用，抗体的术语“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”或“片段”)是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段(例如LAG-3蛋白)。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。包含在抗体的术语“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，由通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段组成的二价片段；(iii)Fab'片段，其基本上是具有部分铰链区的Fab[参见FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul编，第3版，1993)]；(iv)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(vi)由VH区组成的dAb片段[Ward等，(1989)Nature 341：544-546]；(vii)分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体，含有单个可变区和两个恒定区的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们能够使用重组方法通过合成的接头连接制成单一的蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子[被称为单链Fv(scFv)；参见例如：Bird等(1988)Science 242：423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883]。这种单链抗体也包括在抗体的术语“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与全抗体相同的方式筛选片段的效用。
本发明中所用的“分离的抗体”旨在表示基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合LAG-3蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除LAG-3蛋白以外的抗原)。然而，特异性结合人LAG-3蛋白的分离的抗体可能与其他抗原如来自其他物种的LAG-3蛋白具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
本发明所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子的制备。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
人源化抗体是来自非人物种的抗体，其蛋白质序列已经被修饰以增加其与人类天然产生的抗体变体的相似性。“人源化”的过程通常应用于被研制用于施于人单克隆抗体。
本发明所用的术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果所述的抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点突变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本发明所用，术语“人抗体”不旨在包括来源于另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体。
术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。
术语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性的抗体”在本发明中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一种试剂或抗体的偶联物。术语“人源化抗体”意指来源于另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。
术语“嵌合抗体”意指其中可变区序列源自一个物种并且恒定区序列源自另一物种的抗体，例如其中可变区序列源自小鼠抗体，而恒定区序列源自人抗体的抗体。
如本发明所用，“特异性结合人LAG-3”或“对人LAG-3具有特异性”的抗体旨在表示与人LAG-3蛋白(以及可能来自一个或多个非人类物种的LAG-3蛋白)结合，但基本上不与非LAG-3蛋白结合的抗体。优选地，所述的抗体以“高亲和力”结合人LAG-3蛋白，即KD为1×10- 7M或更低、更优选为5×10-8M或更低、更优选为3×10-8M或更低、更优选为1×10-8M或更低、更优选为25×10-9M或更低，进一步更优选为1×10-9M或更低。
如本发明所用，术语“基本上不结合”蛋白质或细胞是指不结合或者不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即以1×10-6M或更高、更优选1×10-5M或更高、更优选1×10-4M或更高、更优选1×10-3M或更高、进一步更优选1×10-2M或更高的KD结合蛋白质或细胞。本发明所用的术语“Kassoc”或者“Ka”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的结合率，而本发明所用的术语“Kdis”或“Kd”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本发明所用，术语“KD”旨在表示由Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得并表示为摩尔浓度(M)的解离常数。可以使用本领域中建立完善的方法测定抗体的KD值。测定抗体的KD的优选方法为通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如
Figure GDA0003470474660000131
系统。
针对IgG抗体的术语“高亲和力”是指具有1×10-7M或更低、更优选5×10-8M或更低、进一步更优选1×10-8M或更低、进一步更优选5×10-9M或更低以及进一步更优选1×10- 9M或更低的KD值的抗体。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和力”结合可以不同。例如，针对IgM同种型的“高亲和力”结合是指具有10-6M或更低、更优选10-7M或更低、进一步更优选10-8M或更低的KD的抗体。
术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬行动物，但优选哺乳动物，例如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛和马。
在以下小节中进一步详细描述了本发明的各个方面。
抗LAG-3抗体和片段
本发明提供了对人淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)蛋白具有特异性的抗体和片段。展示了对LAG-3具有高亲和力的人抗体、小鼠抗体和人源化抗体，以及与结合相关的其他所需活性。本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。
一组示例性的抗LAG-3抗体和片段来源于小鼠抗体147H(参见表5)。示例性的人源化嵌合抗体以及一些具有回复突变的人源化抗体片段显示在表6中。此外，基于亲和力成熟，制备了具有改进特性的另外的抗体和片段(表7、8)。在一些实施方案中，提供了分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段对人类淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)蛋白具有特异性，并且包含序列如SEQ ID NO:240所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO:241所示的VH CDR2、序列如SEQ ID NO:242所示的VH CDR3、序列如SEQ ID NO:243所示的VL CDR1、序列如SEQID NO:244所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO:245所示的VL CDR3。
在一个实施方案中，所示的抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区含有重链互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述的轻链可变区含有轻链互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3；其中
所述的CDRH1包含序列如SEQ ID NO:240所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:240衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRH2包含序列如SEQ ID NO:241所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:241衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRH3包含序列如SEQ ID NO:242所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:242衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRL1包含序列如SEQ ID NO:243所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:243衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRL2包含序列如SEQ ID NO:244所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:244衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；
所述的CDRL3包含序列如SEQ ID NO:245所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:245衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列。
可以进行取代的氨基酸残基的非限制性实例显示在表8中。例如，在CDRH2中，这样的残基包括D50、Y52、Y56和N58。在一个优选的实施方案中，CDRH2包括N58V取代，可选地具有其他取代(例如SEQ ID NO:347)。在另一个实施方案中，CDRH3的取代发生在N96、G99或Y102。在一个优选的实施方案中，CDRH3包括取代G99K、Y102或组合(例如SEQ ID NO:354)。在另一个实施方案中，CDRL3取代发生在A89、N91或L94。在一个优选的实施方案中，CHRL3包含取代N91Y(例如SEQ ID NO:374)。在一个实施方案中，所示的抗体或片段包括N58V、G99K、Y102和N91Y的全部，可选地具有其他取代。
在一些实施方案中，所述的抗体或片段包含重链可变区，所述的重链可变区包含一条选自由SEQ ID NO:238、246～259、261、263、265、267、269、271、273、75、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335和337组成的群组中的氨基酸序列，或者包含一条多肽，所述的多肽与一条选自由SEQ ID NO:238、246～259、261、263、265、267、269、271、273、75、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335和337组成的群组中的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述的抗体或片段包含包含轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条选自由SEQ ID NO:239、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336和338组成的群组中的氨基酸序列，或者包含一条多肽，所述的多肽与一条选自由SEQ ID NO:239、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336和338组成的群组中的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段还包含重链恒定区、轻链恒定区、Fc区或者其组合。在一些实施方案中，所示的轻链恒定区为κ链或λ链恒定区。
不受限制地，所述的抗体或者其片段为嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。在一个方面，抗体或者其片段是人源化抗体。
对于人源化抗体或片段，可以整合入某些回复突变。在一些实施方案中，依据Kabat编号，所述的重链可变区包含一个或者多个选自由：
(a)第71位的丙氨酸(A)、
(b)第69位的亮氨酸(L)、
(c)第66位的赖氨酸(K)、
(d)第67位的丙氨酸(A)、
(e)第48位的异亮氨酸(I)、
(f)第37位的异亮氨酸(I)、
(g)第38位的赖氨酸(K)、
(h)第91位的苯丙氨酸(F)以及
(i)第1位的谷氨酸(E)及其组合组成的群组中的氨基酸残基。
在一些实施方案中，所述的重链可变区包含第71位的丙氨酸(A)。
在一些实施方案中，所述的重链可变区包含第69位的亮氨酸(L)。
在一些实施方案中，所述的重链可变区包含第66位的赖氨酸(K)
在一些实施方案中，所述的重链可变区包含第67位的丙氨酸(A)。
在一些实施方案中，所述的重链可变区包含第48位的异亮氨酸(I)。
在一些实施方案中，所述的重链可变区包含第37位的异亮氨酸(I)。
在一些实施方案中，所述的重链可变区包含第38位的赖氨酸(K)。
在一些实施方案中，所述的重链可变区包含第91位的苯丙氨酸(F)。
在一些实施方案中，所述的重链可变区包含第1位的谷氨酸(E)。
在一些实施方案中，所述的重链可变区包含一个或者多个选自由：
(a)第71位的丙氨酸(A)、
(b)第69位的亮氨酸(L)、
(c)第66位的赖氨酸(K)、
(d)第67位的丙氨酸(A)、
(e)第48位的异亮氨酸(I)、
(f)第37位的异亮氨酸(I)以及
(g)第38位的赖氨酸(K)及其组合组成的群组中的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述的重链可变区包含所有上述列举的残基。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:238所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:238具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:239所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:239具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条选自由SEQ ID NO:246-259组成的群组中的氨基酸序列，或者包含一条多肽，所述的多肽与一条选自由SEQ ID NO:246-259组成的群组中的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区一条序列如SEQ ID NO:239所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:246所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:246具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:247所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:247具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:248所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:248具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:249所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:249具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:250所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:250具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:251所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:251具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:252所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:252具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:253所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:253具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:254所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:254具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:255所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:255具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:256所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:256具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:257所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:257具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:258所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:258具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条重链可变区，所述的重链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:259所示的氨基酸序列，或者一条与SEQ ID NO:259具有至少90％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述的抗体或者其片段包含一条轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条序列如SEQ ID NO:260所示的氨基酸序列，或者一条与SEQID NO:260具有至少90％序列同一性的多肽。
在任一个这些示例性重链可变区或轻链可变区中，可以对所述的CDR进行如表8中所示的修饰，或者使用表8中所示的示例性修饰的CDR进行替换。
在不同的实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区包含与本发明所述的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中所述抗体保留本发明的抗LAG-3抗体所需的功能特性。例如，抗体特异性结合人LAG-3；阻断LAG-3与主要组织相容性复合物(MHC)II类分子、半乳糖凝集素-3和LSECtin结合；刺激免疫反应；并逆转调节性T细胞对效应细胞的抑制作用。
另外，或可替代地，所述抗体可具有一种或多种以上讨论的下列功能特性，例如与人LAG-3高亲和力结合、与猴LAG-3结合、缺乏与小鼠LAG-3结合、抑制LAG-3与MHC II类分子结合的能力和/或刺激抗原特异性T细胞应答的能力。
在不同的实施方案中，所述的抗体可以为例如人抗体、人源化抗体或者嵌合抗体。在其他实施例中，所述的VH和/或VL的氨基酸序列可以与上述序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。可通过VH和/或VL的氨基酸序列核酸的突变(例如，定点或PCR介导的诱变)获得具有与上述序列的VH和VL区具有高同源性(即80％或更高)的VH和VL区的抗体，再使用本发明所述的功能试验来测试改变编码的抗体保留的功能(即上述功能)。
如本发明所用，两个氨基酸序列之间的所述百分比同源性等同于两个序列之间的百分比同一性。两个序列之间的所述百分比同一性是由序列共有的相同位点的数目的函数(即，％同源性＝相同位点的数量/位点的总数量×100)，考虑到空位的数量，和需要引入每个空位的长度，以优化两个序列的比对。如下面的非限制性实施例中所述，可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定。
可以使用已被合并到ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.4:11-7,1988)、使用PAM120加权残基表(空位长度罚分为12、空位罚分为4)确定两个氨基酸序列之间的所述百分比同一性。另外，可以使用已被合并入GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48:444-53,1970)、使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6，来确定两个氨基酸序列之间的所述百分比同一性。
另外，或可替代地，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索以例如鉴定相关序列。可以使用Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-10,1990)的XBLAST程序(版本2.0)进行这样的搜索。可以使用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50、字长＝3以获得与本发明内容的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以如Altschul等人(Nucl.Acid Res.25(17)：3389-402,1997)所述利用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数是有帮助的。
在一些实施方案中，所述的序列同一性至少为95％、96％、97％、98％、99％或者99.5％。在一些实施方案中，所述的序列同一性包括10个残基中1、2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸的取代、缺失或添加。在一些实施方案中，这样的取代是保守取代。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一氨基酸残基取代。在另一个实施方案中，一个氨基酸链可以用侧链家族成员的顺序和/或组成不同的、结构相似的链替换。
在下表中提供了保守氨基酸取代的非限制性实例，其中0或更高的相似性得分表示两个氨基酸之间的保守取代。
氨基酸相似性矩阵
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W
W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10
F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9
L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5
M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6
K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5
H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2
E -5 0 -1 0 0 0 3 4
D -5 1 -1 0 0 0 4
T -2 0 0 1 1 3
A -2 1 1 1 2
S 0 1 1 1
P -3 -1 6
G -3 5
C 12
保守氨基酸取代
原氨基酸 取代氨基酸
丙氨酸 D-Ala,Gly,Aib,β-Ala,L-Cys,D-Cys
精氨酸 D-Arg,Lys,D-Lys,Orn D-Orn
天冬酰胺 D-Asn,Asp,D-Asp,Glu,D-Glu Gln,D-Gln
天冬氨酸 D-Asp,D-Asn,Asn,Glu,D-Glu,Gln,D-Gln
半胱氨酸 D-Cys,S-Me-Cys,Met,D-Met,Thr,D-Thr,L-Ser,D-Ser
谷氨酰胺 D-Gln,Asn,D-Asn,Glu,D-Glu,Asp,D-Asp
谷氨酸 D-Glu,D-Asp,Asp,Asn,D-Asn,Gln,D-Gln
甘氨酸 Ala,D-Ala,Pro,D-Pro,Aib,β-Ala
异亮氨酸 D-Ile,Val,D-Val,Leu,D-Leu,Met,D-Met
亮氨酸 Val,D-Val,Met,D-Met,D-Ile,D-Leu,Ile
赖氨酸 D-Lys,Arg,D-Arg,Orn,D-Orn
甲硫氨酸 D-Met,S-Me-Cys,Ile,D-Ile,Leu,D-Leu,Val,D-Val
苯丙氨酸 D-Phe,Tyr,D-Tyr,His,D-His,Trp,D-Trp
脯氨酸 D-Pro
丝氨酸 D-Ser,Thr,D-Thr,allo-Thr,L-Cys,D-Cys
苏氨酸 D-Thr,Ser,D-Ser,allo-Thr,Met,D-Met,Val,D-Val
酪氨酸 D-Tyr,Phe,D-Phe,His,D-His,Trp,D-Trp
缬氨酸 D-Val,Leu,D-Leu,Ile,D-Ile,Met,D-Met
本发明还制备了人抗体。如表2所示，所述人抗体或片段可包含重链CDR。重链可变区的实例显示于表1中。所述的人抗体或片段可包含如表4中所示的轻链CDR。重链可变区的实例如表3所示。
因此，在一个实施方案中提供了一种分离的抗体或者其片段，其中，所述的抗体或者其片段对人类淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)蛋白具有特异性，所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区含有重链互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述的轻链可变区含有轻链互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3；其中所述的CDRH1包含序列如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:1或2衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；所述的CDRH2包含序列如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列，或者由SEQ ID NO:3或4衍生的在其中具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；所述的CDRH3包含一条选自由序列如SEQ ID NO:5～45所示的氨基酸序列组成的群组中的氨基酸序列，或者衍生自SEQ ID NO:5～45中的任一个氨基酸序列并具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；所述的CDRL1包含一条选自由序列如SEQ ID NO:46～80所示的氨基酸序列组成的群组中的氨基酸序列，或者衍生自SEQ ID NO:46～80中的任一条氨基酸序列并具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；所述的CDRL2包含一条选自由序列如SEQ IDNO:81～103所示的氨基酸序列组成的群组中的氨基酸序列，或者衍生自SEQ ID NO:81～103中的任一条氨基酸序列并具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列；所述的CDRL3包含一条选自由序列如SEQ ID NO:104～139所示的氨基酸序列组成的群组中的氨基酸序列，或者衍生自SEQ ID NO:104～139中的任一条氨基酸序列并具有一个或者两个氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述的抗体或片段包含与表2所示的组合之一相同的三个重链CDR。例如，如第一行所示，所述重链可以包含序列如SEQ ID NO:1所示的CDRH1、序列如SEQ ID NO:3所示的CDRH2和序列如SEQ ID NO:5所示的CDRH3。在一些实施方案中，所述的抗体或片段包含与表4所示的组合之一相同的三个轻链CDR。例如，如第一行所示，所述的轻链可以包含序列如SEQ ID NO:46所示的CDRL1、序列如SEQ ID NO:81所示的CDRL2和序列如SEQ ID NO:104所示的CDRL3。
在一些实施方案中，所述的分离的抗体或片段包含重链可变区，所述的重链可变区包含一条选自由SEQ ID NO:140～188组成的群组中的氨基酸序列，或者包含一条多肽，所述的多肽与一条选自由SEQ ID NO:140～188组成的群组中的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，所述的分离的抗体或片段包含轻链可变区，所述的轻链可变区包含一条选自由SEQ ID NO:189～237组成的群组中的氨基酸序列，或者包含一条多肽，所述的多肽与一条选自由SEQ ID NO:189～237组成的群组中的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，所述的序列同一性为至少95％、96％、97％、98％、99％或者99.5％。在一些实施方案中，所述的序列同一性包括10个残基中1、2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸的取代、缺失或添加。在一些实施方案中，这样的取代是保守取代。
本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，抗体特异性结合人LAG-3并且可以结合来自某些其他物种的LAG-3，例如猴LAG-3，如食蟹猴、恒河猴，但可能基本上不与来自某些其他物种LAG-3结合，例如小鼠LAG-3。优选地，本发明的抗体以高亲和力结合人LAG-3。
可以通过，例如所述抗体在抗原特异性T细胞应答中刺激白细胞介素-2(IL-2)或干扰素γ(IFN-γ)产生的能力，来指示所述抗体刺激免疫应答如抗原特异性T细胞应答的能力。在某些实施方案中，本发明的抗体结合人LAG-3并表现出刺激抗原特异性T细胞应答的能力。在其他实施例中，本发明的抗体结合人LAG-3，但不表现出刺激抗原特异性T细胞应答的能力。其他评定所述抗体刺激免疫应答能力的方法，包括所述抗体抑制在例如体内肿瘤移植模型中肿瘤生长的能力，或抗体刺激自身免疫应答的能力，如在自身免疫模型中促进自身免疫性疾病发展的能力，例如在NOD小鼠模型中促进糖尿病发展的能力。
可以使用本领域中建立完善的一种或多种技术来评估本发明的抗体与LAG-3的结合。例如，在一个优选的实施方案中，可以通过流式细胞术测定来测试抗体，其中所述抗体与表达人LAG-3的细胞系反应，所述细胞系为例如已经被转染以在其细胞表面表达LAG-3的CHO细胞，所述LAG-3如人LAG-3、或猴LAG-3(如恒河猴或食蟹猴)、或小鼠LAG-3。用于流式细胞术测定的其他合适的细胞包括表达天然LAG-3的抗CD3-刺激的CD4+活化的T细胞。另外，或可选地，可以在BIAcore结合测定中测试所述抗体的结合，包括结合动力学(例如KD值)。其他合适的结合测定包括ELISA测定，例如使用重组LAG-3蛋白。优选地，本发明的抗体以5×10-8M或更低、2×10-8M或更低、5×10-9M或更低、4×10-9M或更低、3×10-9M或更低、2×10- 9M或更低、125×10-9M或更低、5×10-10M或更低或者1×10-10M或更低的KD结合LAG-3蛋白。
本发明优选的抗体是如实施例2～8所描述的以分离和结构表征的人单克隆抗体S27、S31、T99和S119。S27、S31、T99和S119的VH氨基酸序列分别如SEQ ID NO:149、SEQ NO:150、SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:162所示。S27、S31、T99和S119的VL氨基酸序列分别如SEQID NO:198、SEQ NO:199、SEQ ID NO:207和SEQ ID NO:211所示。
鉴于这些抗体中的每一种都可以结合人LAG-3，所述的VH和VL序列可以“混合并匹配”以产生本发明的其他抗LAG-3结合分子。优选地，当VH和VL链混合并匹配时，源自特定VH/VL配对的VH序列被结构上相似的VH序列替换。同样，优选地，源自特定VH/VL配对的VL序列被结构上相似的VL序列替换。
因此，在一个方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含：
(a)包含选自由SEQ ID NO:140～SEQ ID NO:188组成的群组中的氨基酸序列的重链可变区，和
(b)包含选自SEQ ID NO:189～SEQ ID NO:237组成的群组中的氨基酸序列的轻链可变区；
其中所述的抗体特异性结合人LAG-3。
优选的可变重链和可变轻链的组合包括：
(a)包含序列如SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列的重链可变区和包含序列如SEQID NO:198所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含序列如SEQ ID NO:150所示的氨基酸序列的重链可变区和包含序列如SEQID NO:199所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含序列如SEQ ID NO:158所示的氨基酸序列的重链可变区和包含序列如SEQID NO:207所示的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含序列如SEQ ID NO:162所示的氨基酸序列的重链可变区和包含序列如SEQID NO:211所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在本领域中众所周知的是，独立于CDR1和/或CDR2结构域的CDR3结构域可以单独确定抗体对同源抗原的结合特异性，并且基于共同的CDR3序列预测可产生具有相同结合特异性的多重抗体。参见，例如Klimka et al.,Brit.J.of Can.83(2):252-60,2000；Beiboeret al.,J.Mol.Biol.296:833-49,2000；Rader et al.,PNAS 95:8910-15,1998；Barbas etal.,JACS 116:2161-2,29914；Barbas et al.,PNAS 92:2529-33,1995；Ditzel et al.,J.Immunol.157:739-49,1996；Berezov et al.,BIAJournal 8(1):Scientific Review,2001；Igarashi et al.,J.Biochem 117:452-7,1995；Bourgeois et al.,J.Virol.72:807-10,1998；Levi et al.,PNAS 90:4374-8,1993；Polymenis and Stoller,J.Immunol.152:5218-329,1994；以及Xu和Davis,Immunity 13:37-45,2000。也可参见美国专利No.6,951,646、No.6,914,128、No.6,090,382、No.6,818,216、No.6,156,313、No.6,827,925、No.5,833,943、No.5,762,905以及No.5,760,185。这些参考文献中的每一篇都通过引用整体并入本发明。
因此，本发明提供了包含源自人或非人动物的抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体能够特异性结合人LAG-3。在某些方面，本发明内容提供了包含源自非人抗体(例如小鼠或大鼠抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体能够特异性结合LAG-3。在一些实施方案中，本发明抗体包含一个或多个源自非人抗体的重链和/或轻链CDR3结构域，所述的非人抗体(a)能够竞争结合；(b)保留功能特征；(c)结合相同的表位；和/或(d)具有与相应的亲本非人抗体相似的结合亲和力。在其它方面，本发明提供了包含源自人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，例如获自非人动物的人抗体，其中所述人抗体能够特异性结合人LAG-3。在其它方面，本发明提供了包含源自第一人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，例如获自非人动物的人抗体，其中所述的第一种人抗体能够特异性结合人LAG-3，并且使用源自所述的第一种人抗体的CDR3结构域替代缺乏针对LAG-3的结合特异性的人抗体中的CDR3结构域，以产生能够特异性结合人类LAG-3的第二人类抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体包含一个或多个源自第一人抗体的重链和/或轻链CDR3结构域，所述的第一人抗体(a)能够竞争结合；(b)保留功能特征；(c)结合相同的表位；和/或(d)具有与相应的亲本第一人抗体相似的结合亲和力。
工程化的和修饰的抗体
如本发明所用，术语“人源化的”、“人源化”等指的是将本发明公开的鼠单克隆抗体的CDR移植到人FR和恒定区。这些术语还包括下面讨论的、通过例如Kashmiri等人(Methods,36(1):25-34,2005)和Hou等人(J.Biochem.144(1):115-20,2008)公开的方法分别对鼠CDR和人FR可能进行的进一步修饰以改善各种抗体特性。
如本发明所用，术语“FR”或者“框架序列”指的是FR1～4中的任一个。本发明内容所涵盖的人源化抗体和抗原结合片段包括其中的FR1～4中的一个或多个基本上或完全为人源的分子，即其中存在单独的基本上或完全人源的FR1～4的任何可能组合。例如，这包括其中的FR1和FR2、FR1和FR3、FR1、FR2和FR3等基本上或完全为人源的分子。基本上为人源的框架是与已知的人种系框架序列具有至少80％序列同一性的框架。优选地，所述的基本上为人源的框架与本发明公开的框架序列或者已知的人种系框架序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
全人源框架是与已知的人种系框架序列相同的框架。人FR种系序列可以从国际ImMunoGeneTics(IMGT)数据库和Marie-Paule Lefranc和Gerard Lefranc于2001年发表于学术出版社(Academic Press)的The Immunoglobulin FactsBook获得，其内容通过引用整体并入本发明。
本发明涵盖的CDR不仅包括本发明具体公开的那些，还包括与本发明公开的CDR序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％序列同一性的CDR序列。可替代地，本发明涵盖的CDR不仅包括本发明特别公开的，还包括与本发明公开的CDR序列相比在相应位置具有1、2、3、4或5个氨基酸变化的CDR序列。这种序列相同或氨基酸修饰的CDR优选与完整抗体识别的抗原结合。
除了本发明公开的那些根据本发明内容显示出类似功能特性的人源化抗体之外，还可以使用几种不同的方法产生人源化抗体Almagro等人(Front.Biosci.,Humanizationof antibodies Jan 1(13):1619-33,2008)。在一个方法中，将亲本抗体化合物CDR移植到与亲本抗体化合物框架具有高序列同一性的人框架中。新框架与所述的亲本抗体化合物中的相应框架的序列的所述序列同一性通常为至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在具有少于100个氨基酸残基的框架的情况下，可以改变1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。与亲本抗体相比，这种移植可能导致结合亲和力的降低。如果是这种情况，则可以根据Queen等人(PNAS 88：2869,1991)公开的具体标准，在某些位置将框架回复突变到亲代框架。描述基于同源性和回复突变、可用于产生人源化变体的方法的其他参考文献包括如Olimpieri等(Bioinformatics Feb 1；31(3)：434-5,2015)以及美国专利No.4,816,397、No.5,225,539和No.5,693,761；以及Winter及其同事的方法(Jones et al.,Nature 321:522-5,1996；Riechmann et al.,Nature 332:323-7,1988；和Verhoeyen et al.,Science239:1534-6,1988)。
可以通过例如标准ELISA测试本发明的抗体与人LAG-3的结合。可以通过蛋白免疫印迹进一步测试抗LAG-3人IgG抗体与LAG-3抗原的反应性。本发明的抗体的所述结合特异性还可以通过监测所述抗体与表达LAG-3蛋白的细胞的结合来确定，例如流式细胞术。这些方法在本领域中是已知的。参见例如上文引用的Harlow和Lane(1988)。
双功能分子
本发明的抗体可以与治疗剂偶联以形成免疫偶联物，例如抗体-药物偶联物(ADC)。合适的治疗剂包括抗代谢物、烷化剂、DNA小沟结合剂、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、热休克蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素以及抗有丝分裂剂。在所述ADC中，所述抗体和所述治疗剂优选通过可裂解的接头例如肽基、二硫化物或腙接头偶联。更优选地，所述接头是肽基接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。所述ADC的扫描按照美国专利No.7,087,600、No.6,989,452和No.7,129,261；PCT公开WO 02/096910、WO 07/038658、WO 07/051081、WO 07/059404、WO 08/083312和WO 08/103693；美国专利公开20060024317、20060004081和20060247295准备，其公开内容在此引入作为参考。
在另一个方面，本发明内容的特征在于包含抗LAG-3抗体的双特异性分子，所述的抗LAG-3抗体与至少一种其他功能分子[例如另一种肽或蛋白质(如，另一种抗体或受体的配体)]连接以产生结合至少两个不同的结合位点或靶分子的双特异性分子。因此，如本发明所用，“双特异性分子”包括具有三个或更多个特异性的分子。在一个优选的实施方案中，所述的双特异性分子包含针对LAG-3的第一结合特异性和用于触发分子的第二结合特异性，该触发分子招募可杀死表达LAG-3的靶细胞的细胞毒性效应细胞。合适的触发分子的例子是CD64、CD89、CD16和CD3。参见，例如Kufer et al.,Trends in Biotech.22(5):238-44,2004。
在一个实施方案中，双特异性分子除具有抗Fc结合特异性和抗LAG-3结合特异性之外，还具有第三特异性。所述的第三特异性可以是针对抗增强因子(EF)，例如，与参与细胞毒活性的表面蛋白结合从而增加针对靶细胞的免疫应答的分子。例如，所述的抗增强因子可以结合细胞毒性T细胞(例如通过CD2、CD3、CDS、CD28、CD4、CD40或ICAM-1)、其他免疫调节分子(例如通过PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM、BTLA、KIR、CD47或CD73)或其他免疫细胞，导致针对靶细胞的免疫应答增加。
作为免疫受体调节剂，可以将对LAG-3特异的抗体或抗原结合片段与对肿瘤抗原特异的第二抗原结合片段组合以产生双特异性抗体。“肿瘤抗原”是在肿瘤细胞中产生的抗原物质，即它在宿主中引发免疫应答。肿瘤抗原可用于鉴定肿瘤细胞，并且是用于癌症治疗的潜在候选物。体内的正常蛋白质不具有抗原性。然而，某些蛋白质在肿瘤发生过程中产生或过表达，因此对身体而言为“外来的”。这可能包括与免疫系统隔离良好的正常蛋白质、通常以极少量产生的蛋白质、通常仅在某些发育阶段产生的蛋白质，或由于突变而结构被修饰的蛋白质。
以通过筛选容易地鉴定本领域已知的很多肿瘤抗原和新的肿瘤抗原。肿瘤抗原的非限制性实例包括EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CD73、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和肌腱蛋白。
在一些方面，与相应的非肿瘤细胞相比，单价单元对在肿瘤细胞上过表达的蛋白质具有特异性。这里使用的“相应的非肿瘤细胞”是指与肿瘤细胞起源具有相同细胞类型的非肿瘤细胞。应注意，这些蛋白质不一定与肿瘤抗原不同。非限制性实例包括在大多数结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃肠道癌中过表达的癌胚抗原(CEA)；常在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和宫颈癌中过表达的调节蛋白受体(heregulin receptors)(HER-2、neu或c-erbB-2)；在包括乳腺癌、头颈癌、非小细胞肺癌和前列腺癌的一系列实体瘤中高表达的表皮生长因子受体(EGFR)；去唾液酸糖蛋白受体；转铁蛋白受体；在肝细胞上表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂酶复合物受体；在胰腺导管腺癌细胞中过表达的成纤维细胞生长因子受体(FGFR)；用于抗血管生成基因治疗的血管内皮生长因子受体(VEGFR)；在90％的非黏液性卵巢癌中选择性过表达的叶酸受体；细胞表面糖萼；碳水化合物受体以及可用于将基因递送至呼吸上皮细胞，并且对于治疗肺病如囊性纤维化具有吸引力的聚合免疫球蛋白受体。双特异性在这方面的非限制性实例包括LAG-3/EGFR、LAG-3/Her2、LAG-3/CD33、LAG-3/CD133、LAG-3/CEA和LAG-3/VEGF。
还提供了不同形式的双特异性抗体。在一些实施方案中，每一个抗LAG-3片段和每一个第二片段各自独立地选自Fab片段、单链可变片段(scFv)或单域抗体。在一些实施方案中，所述的双特异性抗体还包含Fc片段。
还提供了不仅包括抗体或抗原结合片段的双功能分子。作为肿瘤抗原靶向分子，例如本发明所述的那些，LAG-3特异的抗体或抗原结合片段可以可选地通过肽接头与免疫细胞因子或配体组合。连接的免疫细胞因子或配体包括但不限于IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、GM-CSF、TNF-α、CD40L、OX40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、LIGHT和GITRL。这种双功能分子可以将免疫检查点阻断效应与肿瘤部位局部免疫调节相结合。
双特异性分子可以具有许多不同的形式和大小。在粒径谱的一端，除了它具有两个具有不同特异性的结合臂，而不是具有相同特异性的两个结合臂以外，双特异性分子保留了传统的抗体形式。另一个极端是由通过肽链连接的两个单链抗体片段(scFv)组成的双特异性分子，即所谓的Bs(scFv)2构建体。中等大小的双特异性分子包括通过肽基接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因工程、体细胞杂交或化学方法制备。参见，例如Kufer等，同上；Cao and Suresh,Bioconjugate Chem.9(6):635-44,1988；and van Spriel et al.,Immunol.Today 21(8):391-7,2000和其中引用的参考文献。
药物组合物
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的抗体与早期药学上可接受的制剂。所述的药物组合物可选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本发明的所述药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗在联合疗法中施用，使得抗LAG-3抗体增强其针对疫苗的免疫应答。
所述的药物组合物可包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散剂或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。Gennaro,ed.,Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy,20th Ed(Lippincott Williams&Wilkins 2003)中教导了合适赋形剂的选择和使用，其公开内容通过引用并入本发明。优选地，药物组合物适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输液)。根据给药途径，活性化合物可以涂覆在材料中，以保护其免受酸和其它可能使其失活的天然条件的作用。本发明所用的短语“肠胃外给药”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输液。可替代地，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径给药，例如局部、表皮或粘膜给药途径，如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部给药。
本发明的所述药物化合物可以是药学上可接受的盐的形式。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予任何不期望的毒理学作用的盐。这些盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸的那些，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，以及衍生自无毒有机酸，例如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂肪族磺酸和芳香族磺酸等。碱加成盐包括衍生自碱土金属的那些，例如钠、钾、镁、钙等，以及衍生自无毒有机胺，例如N，N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
药物组合物可以是无菌水溶液或分散液的形式，还可以配制成微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定的给药方式而变化，并且通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，在百分之百中，该量为约0.01％至约99％活性成分、优选约0.1％至约70％、最优选为约1％至约30％的活性成分，与药学上可接受的载体组合。
调整剂量方案以提供最佳的所需应答(如治疗应答)。例如，可以施用单次推注、可以随时间施用几个分开的剂量或者可以按照治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于给药和剂量均匀是特别有利的。如本发明所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单元含有预定量的活性化合物，经计算其可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。可替代地，在需要较少的给药次数的情况下，抗体可以作为缓释制剂施用。
对于抗体的施用，剂量为宿主体重的约0.0001～100mg/kg、更通常为0.01～5mg/kg。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1～10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每月施用一次、每3个月施用一次或每3至6个月施用一次。本发明针对抗LAG-3抗体的优选剂量方案包括使用以下剂量方案之一，通过静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重施用抗体：(i)每四周一次，给药六次后每三个月一次；(ii)每三个星期给药一次；(iii)3mg/kg体重给药一次，然后每三周1mg/kg体重给药。在一些方法中，调节剂量以达到血浆抗体浓度约为1-1000μg/mL，并且在一些方法中约为25-300μg/mL。
本发明的抗LAG-3抗体的“治疗有效剂量”优选导致疾病症状的严重性降低、疾病无症状期的频率和持续时间增加或预防由疾病折磨导致的损伤或者残疾。例如，对于携带肿瘤的受试者的治疗，相比于未治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选抑制肿瘤生长至少约20％、更优选至少约40％、进一步更优选至少约60％、进一步更优选至少约80％。治疗有效量的治疗化合物可以降低肿瘤大小，或以其他方式改善受试者的症状，所述受试者通常是人或可以是另一种哺乳动物。
所述的药物组合物可以是控释制剂，包括埋植剂、透皮贴剂和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见，如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978.。
治疗组合物可以通过医疗装置给药，例如(1)无针皮下注射装置(如美国专利No.5,399,163、No.5,383,851、No.5,312,335、No.5,064,413、No.4,941,880、No.4,790,824和No.4,596,556)；(2)微输液泵(美国专利No.4,487,603)；(3)透皮装置(美国专利No.4,486,194)；(4)输液装置(美国专利No.4,447,233和4,447,224)；(5)渗透装置(美国专利No.4,439,196和No.4,475,196)；其公开内容在此引入作为参考。
在某些实施方案中，本发明的人单克隆抗体可以配制成确保体内适当的分布的制剂。例如，为了确保本发明的治疗化合物穿过血脑屏障，可以将它们配制在可以另外包含靶向部分以增强对特定细胞或器官的选择性转运的脂质体中。参见，如美国专利No.4,522,811、No.5,374,548、No.5416016和No.5,399,331；V.V.Ranade,J.Clin.Pharmacol.29:685,1989；Umezawa et al.,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038；Bloeman et al.(1995)FEBSLett.357:140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180；Briscoe etal.(1995)Am.J.Physiol.1233:134；Schreier et al.(1994)J.Biol.Chern.269:9090；Keinanen and Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；以及Killion and Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
用途和方法
本发明的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内用途，包括，例如检测LAG-3或通过阻断LAG-3增强免疫应答。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是人抗体。例如，这些分子可以被施用于培养基中的、体外的或者离体的细胞，或者施用于人类受试者(如体内)以在各种情况下增强免疫力。因此，在一个方面，本发明提供了改变受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用本发明的所述抗体或其抗原结合部分，从而改变受试者中的免疫应答。优选地，应答被增强、刺激或上调。
优选的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。该方法特别适用于治疗患有可通过增强免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)治疗的病症的人类患者。在一个具体实施例中，所述方法特别适用于体内治疗癌症。为了实现免疫的抗原特异性增强，所述抗LAG-3抗体可以与目标抗原一起施用，或者抗原可能已经存在于待治疗的受试者(如患有肿瘤或携带病毒的受试者)中。当LAG-3的抗体与另一种药剂一起给药时，可以按顺序或同时施用两者。
本发明还提供了用于检测样本中人LAG-3抗原的存在或检测人LAG-3抗原的量的方法，包括在允许抗体或其部分与人LAG-3之间形成复合物的条件下，使样本和对照样本与特异性结合人LAG-3的人单克隆抗体或抗原结合部分接触。然后检测所述复合物的形成，其中所述样本与所述对照样本相比，复合物形成的差异表明样本中存在人LAG-3抗原。此外，本发明的所述抗LAG-3抗体可用于通过免疫亲和纯化来纯化人LAG-3。
鉴于本发明的抗LAG-3抗体抑制LAG-3与MHC II类分子的结合并刺激抗原特异性T细胞应答的能力，本发明还提供了使用本发明的抗体刺激、增强或上调抗原特异性T细胞应答的体外方法和体内方法。例如，本发明提供了刺激抗原特异性T细胞应答的方法，包括使所述T细胞与本发明的所述抗体接触从而刺激抗原特异性T细胞应答。抗原特异性T细胞应答的任何合适的指标可用于检测抗原特异性T细胞应答。此类合适指标的非限制性实例包括在抗体存在下T细胞的增殖上升，和/或在抗体存在下细胞因子的生成增加。在优选的实施方案中，刺激抗原特异性T细胞产生白细胞介素-2。
本发明还提供了刺激受试者中的免疫应答(如抗原特异性T细胞应答)的方法，其包括向受试者施用本发明的抗体以刺激受试者的免疫应答(如抗原特异性的T细胞反应)。在一个优选的实施方案中，所述受试者是携带肿瘤的受试者，并且刺激针对肿瘤的免疫应答。在另一个优选的实施方案中，受试者是携带病毒的受试者，并且刺激针对病毒的免疫应答。
在另一个方面，本发明提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者施用本发明的抗体，从而抑制受试者中肿瘤的生长。在另一方面，本发明内容提供了治疗受试者中的病毒感染的方法，其包括向受试者施用本发明内容的抗体，从而在受试者中治疗病毒感染。
下面进一步详细讨论本发明的这些和其他方法。
癌症
通过抗体阻断LAG-3可以增强对患者中癌细胞的免疫应答。在一个方面，本发明涉及使用抗LAG-3抗体在受试者体内治疗，从而抑制癌性肿瘤的生长。可以单独使用抗LAG-3抗体来抑制癌性肿瘤的生长。可替代地，抗LAG-3抗体可以与其他免疫原性试剂、标准癌症治疗或其他抗体联合使用，如下所述。
因此，在一个实施方案中，本发明提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的抗LAG-3抗体或其抗原结合部分。优选地，所述抗体是人抗LAG-3抗体(例如本发明所述的任何人抗人LAG-3抗体)。另外，或可替代地，所述抗体可以是嵌合或人源化抗LAG-3抗体。
可以使用本发明的抗体抑制其生长的优选癌症包括通常对免疫疗法有应答的癌症。治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑素瘤(如转移性恶性黑素瘤)、肾癌(如透明细胞癌)、前列腺癌(如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(如非小细胞肺癌)。另外，本发明包括其生长可以使用本发明内容的抗体来抑制的难治性或复发性恶性肿瘤。可以使用本发明的方法治疗的其他癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓性白血病、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症(包括由石棉诱导的癌症)，以及所述癌症的组合。本发明还可用于治疗转移性癌症，尤其是表达PD-L1的转移性癌症[Iwai et al.(2005)Int.Immunol.17:133-144]。
可选地，LAG-3的抗体可以与免疫原性药剂组合，例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(He et al(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，例如多肽gp100、MAGE抗原、Trp-2、MARTI和/或酪氨酸酶，或被转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下面进一步讨论)。
已经显示人类中的一些肿瘤具有免疫原性，例如黑素瘤。通过利用LAG-3阻断提高T细胞活化的阈值，可以激活宿主中的肿瘤反应。
当与疫苗接种方案组合时，LAG-3阻断可能更有效。已经设计了许多用于针对肿瘤的疫苗接种的实验策略(参见Rosenberg,S.,2000,Development of Cancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62；Logothetis,C.,2000,ASCO Educational BookSpring:300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring:414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring:730-738；也参见Restifo,N.and Sznol,M.,Cancer Vaccines,Ch.61,pp.3023-3043in DeVita et al.(eds.),1997,Cancer:Principles and Practice of Oncology,Fifth Edition)。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。当所述肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时，这些细胞疫苗已被证明是最有效的。GM-CSF已被显示为是用于肿瘤疫苗接种的抗原呈递的有效激活剂(Dranoff et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90:3539-43)。
对各种肿瘤中的基因表达和大规模基因表达模式的研究，导致形成了所谓的肿瘤特异性抗原的定义(Rosenberg，SA(1999)Immunity 10：281-7)。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和肿瘤产生的细胞中表达的分化抗原，例如黑素细胞抗原gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原已被显示可以为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。可将LAG-3阻断与肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合结合使用，以产生对这些蛋白的免疫应答。这些蛋白质通常被免疫系统视为自身抗原，因此对它们具有耐受性。肿瘤抗原可包括合成染色体端粒所必需的蛋白质端粒酶，其在超过85％的人类癌症和仅有限数量的体细胞组织中表达(Kim et al.(1994)Science 266:2011-2013)。(可以通过各种方式保护这些体细胞组织免受免疫攻击)。由于细胞突变使蛋白质序列改变、两个不相关的序列(即费城染色体中的bcr-abl)之间产生融合蛋白，或者来自B细胞肿瘤的个体基因型，肿瘤抗原也可以是在癌细胞中表达的“新抗原”。
其他肿瘤疫苗可包括来自涉及人类癌症的病毒的蛋白质，例如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可以与LAG-3阻断结合使用的另一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织本身分离的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白质片段，并且这些HSP在被递送至抗原呈递细胞时非常有效地引发肿瘤免疫(Suot&Srivastava(1995)Science269:1585-1588；Tamura et al.(1997)Science 278:117-120)。
树突细胞(DC)是有效的抗原呈递细胞，其用于引发抗原特异性应答。DC可以离体产生，并装载各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle et al.(1998)NatureMedicine 4:328-332)。也可以通过遗传手段转导DC以表达这些肿瘤抗原。为了免疫目的，DC也与肿瘤细胞直接融合(Kugler et al.(2000)Nature Medicine 6:332-336)。作为疫苗接种的方法，DC免疫可以与LAG-3阻断有效组合，以激活更有效的抗肿瘤应答。
LAG-3阻断也可以与标准癌症治疗组合。LAG-3阻断可以与化学疗法方案有效结合。在这些例子中，可以减少施用的化疗试剂的剂量(Mokyr et al.(1998)CancerResearch 58:5301-5304)。这种组合的一个实例是抗LAG-3抗体与达卡巴嗪组合用于治疗黑素瘤。这种组合的另一个实例是抗LAG-3抗体与白细胞介素-2(IL-2)组合用于治疗黑素瘤。联合使用LAG-3阻断和化学疗法的科学原理是：作为大多数化学疗法化合物的细胞毒素作用的结果，细胞死亡应该导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平的增加。可能通过细胞死亡从而与LAG-3阻断协同作用的其他联合疗法为放射、手术和激素剥夺。这些方案中的每一种都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与LAG-3阻断剂组合。血管生成抑制导致肿瘤细胞死亡，其可以将肿瘤抗原供给宿主抗原呈递途径。
LAG-3阻断抗体还可以与将表达Fca或Fey受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(参见，如美国专利No.5,922,845和No.5,837,243)。双特异性抗体可以用于靶向两种单独的抗原。例如，已经使用抗-Fc受体/抗肿瘤抗原(如Her-2/neu)双特异性抗体将巨噬细胞靶向肿瘤部位。该靶向可以更有效地激活肿瘤特异性应答。通过使用LAG-3阻断来增强这些应答的T细胞防御。可替代地，可以通过使用结合肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标志物的双特异性抗体将抗原直接递送至DC。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。可以通过使由肿瘤表达并且免疫抑制的蛋白质失活来克服许多这些机制。这些蛋白质其中包括TGF-β[Kehrl etal.(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050]、IL-10[Howard&O'Garra(1992)Immunology Today 13：198-200]和Fas配体[Hahne et al.(1996)Science 4:1363-1365]。针对这些实体中的每一种的抗体可以与抗LAG-3组合使用，以抵消免疫抑制剂的作用并且有助于宿主的肿瘤免疫应答。
激活宿主免疫应答性的其他抗体可以与抗LAG-3组合使用。这些包括激活DC功能和抗原呈递的树突细胞表面上的分子。抗CD40抗体能够有效地替代T细胞辅助活性(Ridgeet al.(1998)Nature 393:474-478)并且可以与LAG-3抗体一起使用(Ito et al.(2000)Immunobiology201(5)527-40)。激活针对T细胞共刺激分子的抗体，例如CTLA-4(如美国专利No.5,811,097)、OX-40[Weinberg et al.(2000)Immunol.164:2160-2169]、4-1BB[Melero et al.(1997)Nature Medicine 3:682-685]和ICOS[Hutloff et al.(1999)Nature 397:262-266]也可以使T细胞的活化水平增加。
骨髓移植目前用于治疗多种造血来源的肿瘤。虽然移植物抗宿主病是这种治疗的后果，但可以从移植物抗肿瘤应答中获得治疗益处。LAG-3阻断可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。
还有几种实验性治疗方案，涉及抗原特异性T细胞的离体活化和扩增以及这些细胞过继转移到受体中以刺激针对肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg&Riddell(1999)Science 285:546-51)。这些方法也可用于激活对传染因子如CMV的T细胞应答。在抗LAG-3抗体存在下的离体活化可以增加过继转移的T细胞的频率和活性。
在本发明中还提供了细胞疗法，更具体地，嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法。可以使用与本发明的抗LAG-3抗体(或者可替代地，工程化以表达本发明的抗LAG-3抗体)接触合适的T细胞。在这种接触或工程化后，可以将所述的T细胞引入需要治疗的癌症患者。所述癌症患者可能患有本发明公开的任何类型的癌症。所述T细胞可以是但不限于，例如，肿瘤浸润性T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。
在一些实施方案中，所述的T细胞是从所述癌症患者自身中分离的。在一些实施方案中，所述的T细胞由供体或细胞库提供。当所述的T细胞是从癌症患者分离时，可以使不期望的免疫反应最小化。
传染性疾病
本发明的其他方法用于治疗已经暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本发明的另一方面提供了治疗受试者的传染性疾病的方法，其包括向所述受试者施用抗LAG-3抗体或其抗原结合部分，以治疗受试者的传染性疾病。优选地，抗体是人抗人LAG-3抗体(例如本发明所述的任何人抗LAG-3抗体)。另外或可替代地，抗体可以是嵌合或人源化抗体。
类似于如上所述其对肿瘤的应用，抗体介导的LAG-3阻断可以单独使用，或作为佐剂与疫苗组合使用，以刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。利用该治疗方法特别有用的病原体的实例包括目前没有针对其的有效疫苗的病原体，或常规疫苗对其不完全有效的病原体。这些包括但不限于HIV、肝炎(A、B和C)、流行性感冒、疱疹、贾第虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。LAG-3阻断针对通过介质，例如，在感染过程中呈现改变的抗原的HIV建立的感染特别有用。在施用抗人LAG-3抗体时，这些新型表位被认为是外源，因此激发了不会通过LAG-3被负信号抑制的强烈T细胞应答。
引起可通过本发明的方法治疗的感染的致病病毒的一些实例包括HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-11和CMV，EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTL-V病毒、登革热病毒、乳头状瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒。
可通过本发明的方法治疗的引起感染的致病细菌的一些实例包括衣原体、立克次体细菌、分枝杆菌、葡萄状球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉、沙门氏菌、杆菌、霍乱、破伤风、肉毒杆菌、炭疽、鼠疫、钩状螺旋体病和莱姆病细菌。
可通过本发明的方法治疗的引起感染的致病真菌的一些实例包括白色念珠菌、克鲁斯念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌等，新型隐球菌、曲霉属(烟曲霉、黑曲霉等)、毛霉属(毛霉菌、犁头霉、根霉)、申克氏胞子丝菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌和荚膜组织胞浆菌。
可通过本发明内容的方法治疗的引起感染的致病性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴、结肠小袋纤毛虫、福氏纳格里阿米巴原虫、棘阿米巴虫、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫、卡氏肺孢子虫、间日疟原虫、微小(田鼠)巴贝虫、布氏锥虫、克氏锥虫、杜氏利什曼虫、刚地弓形虫、巴西日圆线虫。
在所有上述方法中，LAG-3阻断可以与提供了增强的肿瘤抗原呈递的其他形式的免疫疗法(参见，如Bolliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak(1994)Structure 2:1121-1123)，例如细胞因子治疗(如干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体疗法组合。
自身免疫反应
抗LAG-3抗体可以激发和扩增自身免疫应答。实际上，使用肿瘤细胞和肽疫苗诱导抗肿瘤应答揭示了许多抗肿瘤应答涉及抗自身反应性[van Elsas et al.(2001)J.112Exp.Med.194:481-489；Overwijk,et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:2982-2987；Hurwitz,(2000)supra；Rosenberg&White(1996)J.Immunother EmphasisTumor Immunol.19(1):81-4]。因此，可以考虑将抗LAG-3阻断与各种自身蛋白结合使用，以便设计疫苗接种方案以有效地产生针对这些自身蛋白的免疫应答用于疾病治疗。例如，阿尔茨海默病涉及大脑淀粉样沉积物中Aβ肽的不适当积累；针对淀粉样蛋白的抗体应答能够清除这些淀粉样沉积物[Schenk et al.,(1999)Nature 400:173-177]。
其他自身蛋白质也可以用作靶标，例如用于治疗过敏和哮喘的IgE、以及用于类风湿性关节炎的TNFα。最后，可以通过使用抗LAG-3抗体诱导针对各种激素的抗体应答。中和针对生殖激素的抗体应答可用于避孕。中和对特定肿瘤生长所需的激素和其他可溶性因子的抗体应答也可以被认为是可能的疫苗接种目标。
如上所述的使用抗LAG-3抗体的类似方法可用于诱导治疗性自身免疫应答，以治疗具有不适当积累其他自身抗原(例如淀粉样沉积物，包括阿尔茨海默氏症中的Aβ，细胞因子如TNFα和IgE)的患者。
疫苗
抗LAG-3抗体可通过共同施用抗LAG-3抗体与目标抗原(例如疫苗)来刺激抗原特异性免疫应答。因此，在另一方面，本发明提供了一种增强对受试者中抗原的免疫应答的方法，包括向受试者施用：(i)所述抗原；(ii)抗LAG-3抗体或其抗原结合部分以增强对受试者中抗原的免疫应答。优选地，抗体是人抗人LAG-3抗体(例如本发明所述的任何人抗LAG-3抗体)。另外或可替代地，抗体可以是嵌合或人源化抗体。所述抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。此类抗原的非限制性实例包括在以上部分中讨论的那些，例如以上讨论的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)、或来自上述病毒、细菌或其他病原体的抗原。
在体内和体外施用本发明的抗体组合物(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子以及免疫偶联物)的合适途径是本领域熟知的，并且可由本领域普通技术人员选择。例如，所述抗体组合物可以通过注射(如静脉内或皮下)给药。所用分子的合适剂量将依赖于受试者的年龄和体重以及所述抗体组合物的浓度和/或制剂。
如前所述，本发明的人抗LAG-3抗体可与一种或多种治疗剂，例如细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂共同施用。抗体可以与药剂(作为免疫复合物)连接，或者可以与所述药剂分开施用。在后一种情况下(分开施用)，抗体可以在药剂之前、之后或与药剂同时施用，或者可以与其他已知疗法例如抗癌治疗、如放射共同施用。此类治疗剂包括：其中，抗肿瘤剂，例如阿霉素、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪和环磷酰胺羟基脲，它们本身仅在对患者有毒或亚有毒水平下有效。以每四周一次、100mg/mL的剂量静脉内施用顺铂，并且以每21天一次、60-75mg/mL的剂量静脉内施用阿霉素。本发明中人抗LAG-3抗体或其抗原结合片段与化学治疗剂的共同施用，提供了两种通过不同的机制对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用的抗癌剂。这种共同给药可以解决由于药物抗性的发展或肿瘤细胞的抗原性变化而导致肿瘤细胞与抗体不反应的问题。
包含本发明的抗体组合物(如人抗体、双特异性或多特异性分子或免疫偶联物)和使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。所述试剂盒可以进一步含有至少一种另外的试剂，或本发明的一种或多种另外的人抗体(如不同于第一人抗体的，具有与LAG-3抗原中的表位结合的互补活性的人抗体)。试剂盒通常包括指示所述试剂盒内容物的预期用途的标签。术语“标签”包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的任何文字或记录材料，或者试剂盒附带的其他材料。
神经系统疾病
本发明的其他方法用于治疗患有影响运动的神经系统进行性疾病的患者。在一个实施方案中，所述影响运动的神经系统进行性疾病是帕金森氏病。因此，本发明的另一方面提供了治疗受试者的帕金森病的方法，其包括向所述受试者施用抗LAG-3抗体或其抗原结合部分以治疗受试者的帕金森病。优选地，抗体是人抗人LAG-3抗体(例如本发明所述的任何人抗LAG-3抗体)。另外或可替代地，抗体可以是嵌合或人源化抗体。
除免疫系统器官如胸腺和脾脏外，LAG3也在脑中富集[C.J.Workman(2002)Eur.J.Immunol.32,2255–2263]。免疫印迹分析表明LAG3主要在神经元中表达。根据艾伦大脑图谱(Allen Brain Atlas)，LAG3定位于整个中枢神经系统(CNS)的神经元，包括DA神经元。X.Mao等[Science.2016Sep30；353(6307)]报道LAG3通过其D1结构域(29-167AA)优先以高亲和力结合α-突触核蛋白(α-syn)错误折叠的预制纤维(PFF)。此外，D2(168-252AA)、D3(265-343AA)或细胞内结构域(ICD，472-525AA)的缺失大大减弱了LAG3与α-syn PFF的结合。X.Mao等人已经证明α-syn PFF与LAG3的结合引发了a-syn PFF的内吞作用、传递和毒性。新出现的证据表明帕金森病(PD)的发病机制可能是由于错误折叠的α-syn PFF的细胞间传递。帕金森病(PD)是第二种最常见的神经退行性疾病，其导致运动缓慢、震颤、僵硬，并且在PD的后期阶段导致认知障碍。病理学上，PD的特征在于路易体和神经突中α-突触核蛋白的积累。整个神经系统中存在神经元退化，伴随着黑质致密部中的多巴胺神经元变性，其导致PD的主要症状。抗LAG3抗体特异性结合D1或D2结构域可降低α-syn PFF毒性和细胞间传递，表明其具有PD治疗的潜力。如实施例1中所示，我们的抗体可以特异性结合LAG3蛋白的D1或D2结构域。因此，抗体可用于PD治疗。
联合疗法
在另一方面，本发明提供联合疗法的方法，其中抗LAG-3抗体与一种或多种有效刺激免疫应答的另外的抗体共同施用，从而进一步增强、刺激或上调受试者中的免疫应答。例如，本发明提供了用于刺激受试者中的免疫应答的方法，包括向受试者施用抗LAG-3抗体和一种或多种另外的免疫刺激性抗体，例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗-CTLA-4抗体，以刺激受试者中的免疫应答，例如抑制肿瘤生长或刺激抗病毒应答。在一个实施方案中，向受试者施用抗LAG-3抗体和抗PD-1抗体。在另一个实施方案中，向受试者施用抗LAG-3抗体和抗PD-L1抗体。在另一个实施方案中，向受试者施用抗LAG-3抗体和抗CTLA-4抗体。在一个实施方案中，所述的抗LAG-3抗体是人抗体，例如本发明的抗体。可替代地，所述的抗LAG-3抗体可以是例如嵌合或人源化抗体(如由小鼠抗LAG-3mAb制备)。在另一个实施方案中，所述至少一种另外的免疫刺激性抗体(如抗PD-1、抗PD-L1和/或抗CTLA-4抗体)是人抗体。可替代地，所述的至少一种另外的免疫刺激性抗体可以是例如嵌合或人源化抗体(如由小鼠抗PD-1、抗PD-L1和/或抗CTLA-4抗体制备)。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗过度增殖性疾病(如癌症)的方法，其包括向受试者施用LAG-3抗体和CTLA-4抗体。在进一步的实施方案中，以亚治疗剂量施用所述的抗LAG-3抗体，以亚治疗剂量施用所述的抗CTLA-4抗体，或两者均以亚治疗剂量施用。在另一个实施方案中，本发明提供了用于改变与使用免疫刺激剂治疗过度增生性疾病有关的不良事件的方法，包括向受试者施用抗LAG-3抗体以及亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。在某些实施方案中，所述的受试者是人。在某些实施方案中，所述的抗CTLA-4抗体是人序列单克隆抗体10D1(描述于PCT公开WO 01114424中)，并且抗LAG-3抗体是人序列单克隆抗体，如本发明所述S27、S31、T99或S119。本发明的方法包括的其他抗CTLA-4抗体包括例如公开于：WO98/42752、WO00/37504、美国专利No.6,207,156、Hurwitz et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17):10067-10071、Camacho et al.(2004)J.Clin.Oncology22(145):Abstract No.2505(antibody CP-675206)以及Mokyr et al.(1998)CancerRes.58:5301-5304中的那些。在某些实施方案中，所述的抗CTLA-4抗体与人CTLA-4以5×10-8M或更低、1×10-8M或更低、5×10-9M或更低、1×10-8M与1×10-10M之间或者更低的KD结合。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗过度增殖性疾病(如癌症)的方法，其包括向受试者施用LAG-3抗体和PD-1抗体。在进一步的实施例中，以亚治疗剂量施用所述的抗LAG-3抗体，以亚治疗剂量施用所述的抗PD-1抗体，或两者均以亚治疗剂量施用。在另一个实施方案中，本发明提供了用于改变与使用免疫刺激剂治疗过度增生性疾病有关的不良事件的方法，所述方法包括向受试者施用抗LAG-3抗体以及亚治疗剂量的抗PD-1抗体。在某些实施方案中，所述的受试者是人。在某些实施方案中，所述的抗PD-1抗体是人序列单克隆抗体，并且所述的抗LAG-3抗体是人序列单克隆抗体，例如本发明所述的S27、S31、T99或S119。人序列抗PD-1抗体的实例包括17D8、2D3、4H1、5C4和4A11，其描述于PCT公开WO 061121168中。在某些实施方案中，所述的抗PD-1抗体与人PD-1以5×10-8M或更低、1×10-8M或更低、5×10-9M或更低、1×10-8M与1×10-10M之间或者更低的KD结合。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗过度增殖性疾病(如癌症)的方法，其包括向受试者施用LAG-3抗体和PD-L1抗体。在进一步的实施例中，以亚治疗剂量施用所述的抗LAG-3抗体，以亚治疗剂量施用所述的抗PD-L1抗体，或两者均以亚治疗剂量施用。在另一个实施方案中，本发明提供了用于改变与使用免疫刺激剂治疗过度增生性疾病有关的不良事件的方法，所述方法包括向受试者施用抗LAG-3抗体以及亚治疗剂量的抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，所述的受试者是人。在某些实施方案中，所述的抗PD-L1抗体是人序列单克隆抗体，并且所述的抗LAG-3抗体是人序列单克隆抗体，例如本发明所述的S27、S31、T99或S119。人序列抗PD-L1抗体的实例包括3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7以及13G4，其描述于PCT公开WO07/005874中。在某些实施方案中，所述的抗PD-1抗体与人PD-1以5×10-8M或更低、1×10-8M或更低、5×10-9M或更低、1×10-8M与1×10-10M之间或者更低的KD结合。
通过抗体阻断LAG-3和一种或多种第二靶抗原如CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1可以增强对患者中癌细胞的免疫应答。使用本发明的抗体可以抑制其生长的癌症包括通常对免疫疗法有应答的癌症。用本发明的联合疗法治疗的癌症的代表性实例包括在上文使用抗LAG-3抗体的单一疗法的讨论中具体列出的那些癌症。
在某些实施方案中，本发明讨论的治疗性抗体的组合可以作为在药学上可接受的载体中的单一组合物同时施用，或者与在药学上可接受的载体中的每种抗体作为单独的组合物同时施用。在另一个实施方案中，可以依次施用所述治疗性抗体的组合。例如，可以依次施用抗CTLA-4抗体和抗LAG-3抗体，如首先施用抗CTLA-4抗体，然后施用抗LAG-3抗体；或者首先施用抗-LAG-3抗体，然后施用抗CTLA-4抗体。另外或可替代地，可以依次施用抗PD-1抗体和抗LAG-3抗体，例如首先施用抗PD-1抗体，然后施用抗LAG-3抗体；或者首先施用抗体抗LAG-3，然后施用抗PD-1抗体。另外或可替代地，可以依次施用抗PD-L1抗体和抗LAG-3抗体，例如首先施用抗PD-L1抗体，然后施用抗LAG-3抗体；或者首先施用抗LAG-3抗体，然后施用抗PD-L1抗体。
此外，如果依次施用一剂以上的联合疗法，则在每个施用的时间点可以反转所述依次施用的顺序或保持相同的顺序，依次施用可以与同时施用组合，或者任何其组合。例如，第一次施用中可以同时施用抗CTLA-4抗体和抗LAG-3抗体；第二次施用可以依次先施用抗CTLA-4和接着施用抗-LAG-3；第三次施用可以依次先施用抗LAG-3和接着施用抗CTLA-4等。另外或可替代地，第一次施用中可以同时施用抗PD-1抗体和抗LAG-3抗体；第二次施用可以依次先施用抗PD-1和接着抗LAG-3；第三次施用可以依次先施用抗LAG-3和接着施用抗PD-1等。另外或可替代地，第一次施用中可以同时施用抗PD-L1抗体和抗LAG-3抗体，第二次施用可以依次先施用抗PD-L1和接着施用抗LAG-3，第三次施用可以依次先施用抗LAG和接着施用抗PD-L1等。另一种代表性给药方案可以包括依次先施用抗LAG-3和接着施用抗CTLA-4(和/或抗PD-1和/或抗PD-L1)的第一次施用，并且随后的施用可以是同时的。
可选地，抗LAG-3和一种或多种另外的抗体(如抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体)的组合可以进一步与免疫原性试剂，例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞(He et al.(2004)J.Immunol.173:4919-28)组合。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，例如gp100的肽、MAGE抗原、Trp-2、MARTI和/或酪氨酸酶，或转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。组合的LAG-3和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断可以进一步与疫苗接种方案组合，例如以上详细讨论的涉及用抗LAG抗体的单一疗法的任何疫苗接种方案。
LAG-3和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1的联合阻断也可以进一步与标准癌症治疗组合。例如，LAG-3和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1的联合阻断可以与化学治疗方案有效组合。在这些情况下，可以减少与本发明的组合一起施用的其他化学治疗剂的剂量(Mokyr etal.(1998)Cancer Research 58:5301-5304)。这种组合的一个实例是抗LAG-3和抗-CTLA-4抗体和/或抗-PD-1抗体和/或抗-PD-L1抗体的联合进一步与达卡巴嗪组合用于治疗黑素瘤。另一个实例是抗LAG-3和抗-CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体的联合进一步与白细胞介素-2(IL-2)组合用于治疗黑色素瘤。将LAG-3和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断与化学疗法联合使用的科学原理是细胞死亡导致抗原呈递途径中肿瘤抗原的水平增加，其中细胞死亡是大多数化学治疗化合物细胞毒作用的结果。可通过细胞死亡从而与LAG-3和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1的联合阻断协同作用的其他联合疗法包括放射、手术或激素剥夺。这些方案中的每一种都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂还可以与联合的LAG-3和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，肿瘤细胞死亡是进入宿主抗原呈递途径的肿瘤抗原的来源。
LAG-3和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断抗体的联合也可以与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体联合使用(参见，如美国专利5,922,845号和5,837,243号)。双特异性抗体可用于靶向两种单独的抗原。通过使用组合的LAG-3和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1阻断可以增强这些应答的T细胞防御。在另一个实例中，抗LAG-3和抗-CTLA-4和/或抗-PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体的联合可以与抗肿瘤抗体例如
Figure GDA0003470474660000501
(利妥昔单抗)、
Figure GDA0003470474660000502
(曲妥珠单抗)、
Figure GDA0003470474660000503
(托西莫单抗)、
Figure GDA0003470474660000504
(替伊莫单抗)、
Figure GDA0003470474660000505
(阿仑单抗)、
Figure GDA0003470474660000506
(依帕珠单抗)、
Figure GDA0003470474660000507
(贝伐单抗)和
Figure GDA0003470474660000508
(厄洛替尼)等组合使用。举例来说且不希望受理论束缚，使用抗癌抗体或与毒素偶联的抗癌抗体治疗可导致癌细胞死亡(如肿瘤细胞)，其将增强由CTLA-4、PD-1、PD-L1或LAG-3介导的免疫应答。在一个示例性实施例中，过度增殖性疾病(如癌症肿瘤)的治疗可包括抗癌抗体与抗LAG-3和抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体(同时或依次或其任何组合)组合，这样可增强宿主的抗肿瘤免疫应答。
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。可以通过将肿瘤表达的免疫抑制蛋白质失活来克服许多这些机制。这些尤其包括TGF-β(Kehrl et al.(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard&O'Garra(1992)Immunology Today 13:198-200)以及Fas配体(Hahneet al.(1996)Science 27 4:1363-1365)。在另一个实例中，针对每一个这些实体的抗体可以进一步与抗LAG-3和抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体组合联合，以抵消免疫抑制剂的影响，并有利于宿主的抗肿瘤免疫应答。
可以用于激活宿主免疫应答的其他抗体可以进一步与抗LAG-3和抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体组合联合使用。这些包括激活DC功能和抗原呈递的树突细胞表面上的分子。抗CD40抗体(Ridge等，同上)可以与抗LAG-3和抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1组合使用(Ito等人，同上)。T细胞共刺激分子的其他活化抗体(Weinberg等，同上；Melero等，同上；Hutloff等，同上)也可提供T细胞活化水平的增加。
如上所述，骨髓移植目前用于治疗多种造血来源的肿瘤。LAG-3和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1的联合阻断可用于增加供体移植的肿瘤特异性T细胞的有效性。
几种实验性治疗方案涉及抗原特异性T细胞的离体活化和扩增，以及将这些细胞过继转移到受体中以使抗原特异性T细胞对抗肿瘤(Greenberg&Riddell，同上)。这些方法也可用于激活T细胞对感染因子如CMV的应答。在抗LAG-3和抗-CTLA-4和/或抗-PD-1和/或抗-PD-L1抗体存在下，可以预期离体活化能够增加过继转移的T细胞的频率和活性。
在某些实施方案中，本发明提供了用免疫刺激剂改变与过度增殖性疾病(如癌症)的治疗相关的不良事件的方法，包括向受试者施用抗LAG-3抗体和亚治疗剂量的抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体。例如，本发明的方法提供了通过向患者施用不可吸收的类固醇来降低免疫刺激性治疗性抗体诱发的结肠炎或腹泻的发生率的方法。因为任何将要接受免疫刺激性治疗抗体的患者都有罹患由这种抗体诱导的结肠炎或腹泻的风险，所以整个患者群体适合于根据本发明的方法进行治疗。尽管类固醇已被施用以治疗炎性肠病(IBD)和预防IBD的恶化，但它们尚未用于未被诊断为患IBD患者中的IBD的预防(降低发生率)。与类固醇、甚至是不可吸收的类固醇相关的显著副作用，都阻碍了预防性使用。
在进一步的实施方案中，LAG-3和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1(即免疫刺激性治疗抗体抗LAG-3和抗CTLA-4和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体)联合阻断可以进一步与任何不可吸收的类固醇的使用相结合。如本发明所用，“不可吸收的类固醇”是糖皮质激素，其表现出广泛的首过代谢，使得在肝脏代谢后类固醇的生物利用度低，即小于约20％。在本发明的一个实施方案中，所述的不可吸收的类固醇是布地奈德。布地奈德是局部作用的糖皮质激素，其在口服给药后主要通过肝脏广泛代谢。
Figure GDA0003470474660000521
(Astra-Zeneca，阿斯利康)是一种pH值和时间依赖性的布地奈德口服制剂，旨在用于优化向回肠和整个结肠的药物输送。
Figure GDA0003470474660000522
在美国被批准用于治疗涉及回肠和/或升结肠的轻度至中度克罗恩病。用于治疗克罗恩病的
Figure GDA0003470474660000523
的常用口服剂量为6～9mg/天。
Figure GDA0003470474660000524
在肠内释放，然后被吸收并保留在肠粘膜中。一旦通过肠粘膜靶组织，
Figure GDA0003470474660000525
就被肝脏中的细胞色素P450系统广泛代谢为具有可忽略的糖皮质激素活性的代谢产物。因此，其生物利用度低(约10％)。布地奈德的低生物利用度导致其相比于其他具有较不广泛的首过代谢的糖皮质激素具有较高的治疗比率。与全身作用的皮质类固醇相比，布地奈德产生较少的副作用，包括较少的下丘脑-垂体抑制。然而，
Figure GDA0003470474660000526
的长期给药可导致全身性糖皮质激素效应，例如肾上腺功能亢进和肾上腺抑制。参见PDR 58th ed.2004；608-610。
在更进一步的实施方案中，与不可吸收的类固醇组合的LAG-3和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1(即免疫刺激性治疗抗体抗LAG-3和抗CTLA-4和/或抗-PD-1和/或抗PD-L1抗体)组合阻断可以进一步与水杨酸盐组合。水杨酸盐包括5-ASA试剂如，例如：柳氮磺胺吡啶(
Figure GDA0003470474660000531
Pharmacia&UpJohn)；奥沙拉嗪(
Figure GDA0003470474660000532
Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(
Figure GDA0003470474660000533
Salix Pharmaceuticals，Inc.)；以及美沙拉嗪(
Figure GDA0003470474660000534
Procter&Gamble Pharmaceuticals；
Figure GDA0003470474660000535
Shire US；
Figure GDA0003470474660000536
AxcanScandipharm，Inc.；
Figure GDA0003470474660000537
Solvay)。
根据本发明的方法，为了降低由免疫刺激性抗体诱导的结肠炎的发生率，与抗LAG-3和抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体以及不可吸收的类固醇组合施用的水杨酸盐可以包括与不可吸收的类固醇重叠或顺序给药水杨酸盐。因此，例如，根据本发明的用于降低由免疫刺激性抗体诱导的结肠炎发病率的方法包括同时、顺序或任何其组合施用水杨酸盐和不可吸收的类固醇(例如在不可吸收的类固醇后6小时施用水杨酸盐)。此外，根据本发明，水杨酸盐和不可吸收的类固醇可以通过相同的途径(例如两者都是口服给药)或通过不同途径给药(例如口服给药水杨酸盐、直肠给药不可吸收的类固醇)，其可以不同于施用抗LAG-3和抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1抗体的途径。
诊断方法
在某些肿瘤样本中观察到LAG-3的过表达，并且具有LAG-3过表达细胞的患者可能对用本发明的抗LAG-3抗体的治疗有反应。因此，本发明的抗体也可用于诊断和预后目的。
优选包括细胞的样品可以获自患者，所述患者可以是癌症患者或期望诊断的患者。所述细胞是肿瘤组织或肿瘤块、血液样本、尿液样本或来自患者的任何样本的细胞。在可选地预处理样品后，可以在允许抗体与可能存在于样本中的LAG-3蛋白相互作用的条件下将样本与本发明的抗体一起孵育。可以使用诸如ELISA的方法，利用抗LAG-3抗体检测所述样本中LAG-3蛋白的存在。
在所述样本中存在的所述LAG-3蛋白(可选地具有量或浓度)可作为患者适合用抗体治疗的指示、或作为患者对癌症治疗有(或没有)应答的指示用于癌症的诊断。对于预后方法，在开始癌症治疗以后，可以在某些阶段进行一次、两次或更多次的检测，以指示治疗的进展。
通过以下不应被解释为进一步限制的实施例进一步说明本发明。本申请中引用的所有附图和所有参考文献、GenBank序列、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本发明。特别地，PCT公开WO 09/045957、WO 09/073533、WO 09/073546和WO 09/054863的公开内容明确地通过引用并入本发明。
实施例
以下实施例用于说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，因此可以认为其是构成其实践的优选模式。然而根据本发明内容，本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍然可以获得相同或相似的结果。更具体地，化学和生理学相关的某些试剂显然可以替代本发明所述的试剂，同时可以获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有这些类似的替代和修改应认为是在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
实施例1筛选抗LAG-3的完整人单克隆抗体
通过筛选完整的人Fab噬菌体展示文库产生抗LAG3人单克隆抗体(α-LAG-3mAb)。野生型LAG-3-ECD-huFc片段可以与Daudi细胞结合，而截掉D1-D2的LAG-3-ECD-huFc片段不能结合Daudi细胞(图1)。因此，D1-D2结构域对LAG-3功能至关重要。
用于噬菌体展示文库淘选的抗原。LAG-3是属于免疫球蛋白(Ig)超家族的一种单通道I型膜蛋白，其含有4个胞外Ig样结构域(ECD)：结构域(D)1、D2、D3和D4。重组人LAG-3-ECD-人IgG1(LAG-3-huFc)融合蛋白或人的截去D1-D2的LAG-3-ECD-人IgG1(ΔD1D2-LAG-3-huFc)融合蛋白在293T细胞系统表达。
噬菌体文库。哺乳动物中的Ig基因区段按照可变(V)组、多样(D)组、连接(J)组和恒定(C)组外显子排列。使用噬菌体载体构建人Fab噬菌体文库，所述噬菌体载体由1)所有人可变κ(VK)库；2)分别具有来自健康人受试者的遗传随机化CDR3区的VH3-23和VH1-69种系基因的VH组成。
抗原筛选和产生。为了选择D1-D2结构域特异性噬菌体结合物，对噬菌体文库进行基于抗原的淘选。
I)抗LAG-3的噬菌体文库溶液的淘选
用含有N-末端带有FLAG标签、D1-D2缺失的LAG-3(ΔD1D2-LAG-3)序列的质粒转染293F细胞。在转染后3天，将ΔD1D2-LAG-3 293F细胞用于噬菌体文库筛选。对噬菌体文库进行连续阴性筛选：链霉亲和素微珠、△D1D2-LAG-3转染的293F细胞和生物素标记的人IgG1Fc蛋白。然后将得到的文库与生物素化的LAG-3-huFc LAG-3一起震动孵育2小时，然后与100μL酪蛋白封闭的链霉亲和素标记的磁珠一起孵育15分钟。使用PBS洗涤5-20次除去未结合的噬菌体。然后用新制备的100mM三乙胺(TEA)洗脱结合的噬菌体，并加入Tris-HCl缓冲液中和。将得到的噬菌体标记为输出-1噬菌体文库。对输出-1噬菌体文库进行与上述相同的筛选，以产生输出-2和随后的输出-3噬菌体文库。总共进行三轮噬菌体文库筛选。
II)抗LAG-3的噬菌体文库免疫管淘选
噬菌体文库用于进行连续阴性筛选：酪蛋白包被的免疫管、D1D2-LAG-3转染的293F细胞和人IgG1Fc蛋白。然后将得到的文库在LAG3-huFc包被的免疫管中震动孵育2小时。使用PBST洗涤5-20次除去未结合的噬菌体。与基于细胞的淘选相似，总共进行了三轮噬菌体文库筛选。
将输出-3噬菌体文库稀释并铺板，在37℃下生长8小时，并在22℃下通过抗κ抗体包被的过滤器捕获过夜。将生物素化的LAG-3-huFc(50nM)和中性抗生物素蛋白-AP偶联物应用于过滤器以检测抗原结合的抗LAG3噬菌体。挑取阳性噬菌体噬菌斑并洗脱到100μL噬菌体洗脱缓冲液中。然后使用约10-15μL洗脱的噬菌体感染1mL XL1-Blue感受态细胞，制备用于噬菌体单点ELISA(SPE)的高滴度(HT)噬菌体(ELISA固定的底物，包被了50nM每种测试的蛋白质)。每个筛选到的噬菌体取1×1010噬斑形成单位(pfus)用于SPE确认。然后从滤膜中挑选阳性克隆，测试LAG-3抗原与LAG-3-huFc和ΔD1D2-LAG-3-huFc的结合。通过PCR从抗原阳性噬菌体中扩增D1-D2特异性结合物并测序。分析Ig轻链V基因(VL)和VH序列以鉴定独特序列并确定序列多样性。
将所有筛选到的VL和VH基因序列克隆到表达载体pFUSE2ss-CLIg-hk(轻链，InvivoGen Cat No.pfuse2ss-hclk)和pFUSEss-CHIg-hG1(重链，InvivoGen CatNo.pfusess-hchg1)中。所述抗体在HEK293细胞中表达，并使用蛋白A PLUS-琼脂糖纯化。所述抗体的序列及其CDR区在下表中提供。
表1抗体重链可变区
Figure GDA0003470474660000561
Figure GDA0003470474660000571
Figure GDA0003470474660000581
Figure GDA0003470474660000591
表2重链CDR
Figure GDA0003470474660000592
Figure GDA0003470474660000601
表3轻链可变区
Figure GDA0003470474660000602
Figure GDA0003470474660000611
Figure GDA0003470474660000621
Figure GDA0003470474660000631
表4轻链可变区
Figure GDA0003470474660000632
Figure GDA0003470474660000641
实施例2人抗LAG3抗体与来自不同物种的LAG3蛋白的结合
为了评价抗LAG-3抗体结合人、大鼠和小鼠LAG3的能力，通过ELISA评价实施例1中鉴定的抗体的结合特性。将人、大鼠和小鼠LAG3 ECD-Fc蛋白以1μg/ml、每孔100μl包被在ELISA板上。使用ELISA稀释缓冲液连续稀释来自实施例1的抗体。为了评定结合，将不同浓度(10μg/ml、3.333μg/ml、1.111μg/ml、0.370μg/ml、0.123μg/ml、0.041μg/ml、0.014μg/ml、0.005μg/ml、0.0015μg/ml和0.0005μg/ml)的LAG-3抗体加入到LAG3抗原包被的平板中，室温放置1.5小时。洗涤得到的平板，然后用抗人IgG(Fab)-HRP抗体标记。S31只能与人LAG3结合。S27和T99可以较低效力结合人LAG3和大鼠/小鼠LAG3。S119抗体可以高效力结合人、大鼠和小鼠LAG3(图2)。
实施例3人抗-LAG3抗体与活化的人原代CD4+T细胞上的细胞表面LAG-3抗原的结合
LAG-3在活化或耗尽的T细胞上表达。使用CD4磁珠分离CD4+T细胞。用
Figure GDA0003470474660000651
Human T-Activator CD3/CD28刺激纯化的人CD4+T细胞72小时。用FACS缓冲液连续稀释来自实施例1的抗体。为了评定结合，在鼠抗人LAG3 PE(eBioscience，克隆：3DS223H)抗体的存在下，将各种浓度(10μg/ml、3.333μg/ml、1.111μg/ml、0.370μg/ml、0.123μg/ml、0.041μg/ml、0.014μg/ml和0.005μg/ml)的LAG-3抗体添加到活化的人CD4 T细胞中，冰上孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤标记的细胞，随后用APC偶联的抗人IgG抗体在冰上标记30分钟。用FACS缓冲液洗涤所得细胞一次。在BD FACSCalibur TM中通过流式细胞术评估标记的细胞的荧光强度。如图3所示，S27、S31、T99和S119抗体可以剂量依赖性地结合在活化的人CD4+T细胞上表达的LAG3。
实施例4抗LAG-3抗体抑制可溶性LAG-3(sLAG)与MHC II类受体的结合
为了评价抗LAG-3抗体阻断sLAG-3与MHC II类受体结合的能力，使用生物素标记的LAG-3-ECD-huFc融合蛋白和表达MHC II类受体的Raji细胞设计体外结合试验。将来自实施例1的抗体用FACS缓冲液从20μg/mL起连续稀释，并在室温下与6μg/mL生物素-LAG-3-ECD-huFcc预孵育30分钟。然后将抗体混合物加入到FcR封闭的Raji细胞中，并在冰上孵育30分钟。然后用FACS缓冲液洗涤细胞，随后用链霉亲和素PE在冰上染色30分钟，随后用FACS缓冲液洗涤一次。在BD FACSCalibur TM中通过流式细胞术评估标记的细胞的荧光强度。如图4所示，S27、S31、S119和T99抗体可剂量依赖性地抑制LAG3与其受体MHC II类分子的结合。
实施例5通过抗LAG-3抗体刺激外周血单核细胞(PBMC)中IL-2的产生
葡萄球菌肠毒素B(SEB)是一种超级抗原，其同时结合MHC II类抗原和T细胞受体(TCR)，通过这种方式将两者结合在一起以诱导T细胞增殖和细胞因子产生。在从20μg/ml开始以1:3系列稀释度稀释共6个剂量的不同浓度的、来自实施例1的抗体存在下，用SEB刺激2×105个PBMC。三天后，通过ELISA评估培养上清液中的IL-2浓度。如图5所示，类似于PD-1抗体，相比于仅用SEB刺激，抗LAG3抗体(S24、S27、S31、S87、S119、T99和S20)可剂量依赖性地增强IL-2产生。
实施例6使用抗LAG-3抗体逆转调节性T细胞(Treg)对效应T细胞(Teff)的抑制
LAG-3在Treg(CD4+CD25hi)上高度表达，并介导它们的抑制功能(Journal ofImmunology 184:6545-51,2010)。为了评价抗LAG-3抗体逆转Treg对效应T细胞(CD4+CD25-CD127hi)的抑制作用的能力，将实施例1的抗体用于体外抑制测定。首先，使用BD FACSAriaII系统对Treg(CD4+CD25hiCD127low)和Teff(CD4+CD25-CD127hi)进行FACS分选。然后用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记Teff，并在结合于平板的抗CD3抗体和丝裂霉素C处理的抗原呈递细胞存在下以1:1的比例与Treg共培养。接着将抗LAG-3抗体加入到细胞培养物中，5天后测试Teff细胞增殖。结果如图6所示，表明当Treg与效应T细胞共培养时，效应T细胞的增殖和细胞因子的产生受到抑制。S119和T99可以逆转Treg对Teff的抑制。
实施例7抗LAG3和PD-1抗体组合治疗的协同作用
葡萄球菌肠毒素B(SEB)是一种刺激人体免疫应答的超抗原。PD-1阻断抗体可以增强SEB刺激的IL-2产生。如实施例5中所示，抗LAG3抗体还可以增强SEB介导的IL-2产生。为了探索抗LAG3抗体与PD-1抗体组合的作用，我们研究了抗LAG3抗体在次优的PD-1刺激存在下对SEB刺激的影响。在0.1μg/ml PD-1抗体存在下，将连续稀释的抗LAG3抗体加入SEB培养物中。72小时后评估IL-2产生。结果如图7表明，在存在最适度的PD-1处理的情况下，抗LAG-3抗体可以剂量依赖性方式增强SEB刺激的T细胞应答，说明抗LAG3和抗PD-1组合治疗具有协同效应。
实施例8抗LAG-3抗体在PD-L1抗体存在下增强人T细胞应答
为了评价抗LAG-3抗体与PD-L1抗体组合的效果，在混合淋巴细胞反应设置中评定人T细胞的应答。在GM-CSF和IL-4存在下，CD14+单核细胞分化为人DC，维持7天。然后将从另一个供体分离的CD4+T细胞与DC共培养，并连续稀释抗LAG-3抗体和PD-L1阻断抗体。混合培养2天后，测定培养上清液的IL-2产生。结果如图8所示，表明抗LAG-3抗体与PD-L1抗体一起可以显著促进IL-2产生。
实施例9LAG-3抗体BIACORE分析
通过Biacore T200使用捕获方法检查S20、S24、S27、S31、S87、S119、S120、S128、S136、S161和T99抗体与重组his-标签人LAG3-ECD蛋白的结合。使用抗人Fc抗体捕获抗LAG3抗体。将抗人Fc抗体包被在芯片上。将连续浓度的his标签人LAG3-ECD蛋白(0-4nM)以30μl/min的流速注射到捕获抗体上。解离阶段为900s或550s。结果如下表所示。抗LAG3抗体的Biacore结果显示，这些抗LAG3抗体是人LAG3的高亲和力结合物。
K<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(M)
S20 1.65E+05 7.33E-06 4.43E-11
S24 1.79E+06 1.20E-02 6.73E-09
S27 7.04E+06 1.10E-04 1.56E-11
S31 2.08E+06 6.25E-05 3.00E-11
S87 9.28E+05 2.33E-06 2.51E-12
S119 2.17E+07 1.49E-04 6.87E-12
S120 1.40E+06 2.64E-03 1.88E-09
S128 1.00E+06 8.17E-04 8.15E-10
S136 7.98E+05 8.27E-05 1.04E-10
S161 6.20E+05 5.53E-04 8.92E-10
T99 7.62E+06 1.70E-04 2.24E-11
实施例10制备针对人LAG3的小鼠单克隆抗体
该实施例显示如何使用杂交瘤技术产生抗人-LAG3小鼠单克隆抗体。
抗原：使用重组人LAG-3融合蛋白作为免疫原来产生抗人LAG-3抗体。将包含与小鼠免疫球蛋白Fc结构域(D1-D4 mFc)融合的人LAG-3的整个细胞外区域(结构域1-4)的融合蛋白用作免疫原。对于ELISA结合试验，融合蛋白包含与人免疫球蛋白Fc结构域(D1-D4huFc或△D1-D2 huFc)融合的人LAG-3的整个胞外区域(结构域1-4)或D1-D2结构域缺失的胞外区域。使用标准重组DNA技术制备LAG-3融合蛋白。
免疫接种
使用标准重组DNA技术制备LAG-3融合蛋白。腹膜内(IP)和/或皮下(SC)免疫小鼠。首先用50mg免疫原SC免疫小鼠，然后每2周用25μg免疫原进行IP免疫。通过眶后出血监测免疫应答。通过ELISA和基于细胞的受体阻断试验(如下所述)筛选血浆。将具有足够滴度的抗LAG-3D1-D2结构域免疫球蛋白和功能性LAG3阻断剂的小鼠用于融合。在处死和去除脾脏之前，用25μg抗原腹膜内加强免疫小鼠，然后用μg抗原加强免疫。脾脏用于融合。通过基于细胞的受体阻断试验，测试杂交瘤上清液中抗LAG-3D1-D2结构域结合及其阻断LAG3与其受体结合的功能。
选择产生抗LAG3阻断抗体的小鼠
为了选择产生抗LAG3阻断抗体的小鼠，通过ELISA测试来自免疫小鼠的血清与D1-D2结构域的结合。简而言之，评估血清与D1-D4 huFc的结合，并将其与△D1-D2 huFc的结合作为反向筛选。简而言之，将D1-D4 huFc或△D1-D2 huFc以0.5μg/ml包被过夜，然后用PBS中的5％BSA封闭。将连续稀释的血清与包被的抗原在室温下孵育1小时。将得到的平板用PBS/T洗涤，并与山羊抗小鼠IgG-HRP在室温下孵育1小时。所述的平板使用TMB底物显色，并用分光光度计在OD 450-630nm处分析。同时，如实施例4所述，评价血清阻断LAG3与Raji细胞上表达的MHCII分子结合的功能。选择具有对LAG3 D1-D2结构域具有特异性并且具有阻断LAG3与Raji细胞结合的功能的高滴度的小鼠进行融合和进一步筛选。
选择杂交瘤克隆122H、147H和170H用于进一步分析和测序。
实施例11抗LAG3小鼠单克隆抗体的结合特性
该实施例测试了抗LAG3小鼠抗体与LAG3蛋白的结合特性。
D1-D2特异性结合物：
为了评估结合特异性，对纯化的122H、147H和170H小鼠单克隆抗体进行D1-D4huFc和△D1-D2 huFc抗原的ELISA结合试验。简言之，将D1-D4huFc或△D1-D2 huFc以0.5μg/ml包被过夜，然后用PBS中的5％BSA封闭。将连续稀释的抗体(起始浓度为1μg/ml，以1:3连续稀释至共10个剂量)与包被的抗原在室温下孵育1小时。将得到的平板用PBS/T洗涤，并与山羊抗小鼠IgG-HRP在室温下孵育1小时。所述的平板用TMB底物显色，并用分光光度计在OD 450-630nm处分析。
图9对ELISA的结果进行了总结，其显示与LAG3(D1-D4 huFc)的全部胞外结构域的强结合，而非D1-D2缺失的LAG3(△D1-D2 huFc)，证实122H、147H和170H是人LAG3的D1、D2结构域的有效和选择性结合物。
实施例12抗LAG3小鼠单克隆抗体的功能特性
阻断LAG3与其受体的结合
为了评价抗LAG-3抗体阻断sLAG-3与MHC II类受体结合的能力，使用生物素标记的LAG-3-ECD-huFc融合蛋白和表达MHC II类受体的Raji细胞设计体外结合试验。将122H、147H和170H小鼠单克隆抗体从20μg/mL用FACS缓冲液连续稀释(1:5，共6剂)，并与6μg/mL生物素-LAG-3-ECD-huFc在室温下预孵育30小时。然后将抗体混合物加入到FcR封闭的Raji细胞中，并在冰上孵育30分钟。然后用FACS缓冲液洗涤细胞，随后用链霉亲和素PE在冰上染色30分钟，随后用FACS缓冲液洗涤一次。在BD FACSCaliburTM中通过流式细胞术评估标记的细胞的荧光强度。如图10所示，122H、147H和170H抗体可剂量依赖性地抑制LAG3与其受体MHCII类分子的结合。
通过抗LAG3抗体刺激人T细胞应答
为了测试抗LAG3抗体刺激T细胞应答的能力，使用Jurkat T细胞刺激试验。Jurkat是可在TCR刺激后产生IL2的人T细胞白血病细胞系。在该试验中，使用慢病毒用人LAG3基因转染的Jurkat细胞作为应答细胞。表达MHCII的Raji细胞用作抗原呈递细胞(APC)。葡萄球菌肠毒素(SE)是可以交联MHCII分子和T细胞受体β(TCRVβ)并刺激T细胞反应的超抗原。在该试验中使用SE作为刺激物。在该系统中，异位表达的huLAG3可以抑制Jurkat细胞产生SE刺激的IL-2，而抗LAG3抗体可以逆转IL-2的产生。简而言之，在SE刺激的情况下，将APC(2.5×104)与表达LAG3的Jurkat T细胞(1×105)共培养。在培养开始时加入抗LAG3抗体(从20ug/ml开始，1:5连续稀释至6个剂量)。48小时后，通过ELISA评估培养物上清液中IL2的产生。如图11所示，122H、147H和170H小鼠单克隆抗体可以剂量依赖性地促进Jurkat T细胞产生IL2，表明它们可以通过抑制T细胞的LAG3信号来刺激TCR刺激。
实施例13 147H小鼠mAb人源化设计
mAb 147H可变区基因用于制备人源化mAb。在该过程的第一步中，将mAb 147H的VH和VK的氨基酸序列与可用的人Ig基因序列数据库进行比较，以找到总体最优匹配的人种系Ig基因序列。对于轻链，最接近的人源匹配是A19/JK4基因，而对于重链，最接近的人源匹配是VH1-f/JH6基因。然后设计人源化可变结构域序列，其中147H轻链的CDR1(SEQ ID NO：243)、CDR2(SEQ ID NO：244)和CDR3(SEQ ID NO：245)被移植到A19/JK4基因的框架序列上，并且147H VH的CDR1(SEQ ID NO：240)、CDR2(SEQ ID NO：241)和CDR3(SEQ ID NO：242)序列被移植到VH1-f/JH6基因的框架序列上。然后产生3D模型，以确定是否存在将小鼠氨基酸替换为人氨基酸会影响结合和/或CDR构象的任何框架位点。在重链中，鉴定人框架中的R71、M69、R66、V67、M48、V37、R38、Y91和Q1(Kabat编号)并对小鼠序列中对应上述位点的氨基酸进行回复突变，即：R71A、M69L、R66K、V67A、M48I、V37I、R38K、Y91F和Q1E。
表5小鼠抗体序列
Figure GDA0003470474660000701
Figure GDA0003470474660000711
列出人源化抗体的氨基酸序列：147H-1、147H-2、147H-3、147H-4、147H-5、147H-6、147H-7、147H-8、147H-9、147H-10、147H-11、147H-12、147H-13和147H-14，各自具有不同的重链但都具有共同的轻链。
表6人源化抗体以及回复突变
Figure GDA0003470474660000712
Figure GDA0003470474660000721
合成产生人源化VH和VK基因，然后分别克隆到含有人γ1和人κ恒定结构域的载体中。人VH和人VK的配对产生了40种人源化抗体。
实施例14抗LAG3 147H人源化单克隆抗体的结合特性
通过
Figure GDA0003470474660000722
RED96系统对人源化抗体的亲和力排序
为了探索人源化抗体的结合动力学，该实施例通过使用Octet Red 96进行亲和力排序。如下表所示，147H-6、147H-7、147H-13和147H-14显示出更好的亲和力。
Figure GDA0003470474660000723
Figure GDA0003470474660000731
通过
Figure GDA0003470474660000732
RED96系统测定人源化抗体的完全动力学亲和力
为了探索人源化抗体的结合动力学，该实施例进一步通过使用Octet Red96运用各种剂量的抗原(50nM、25nM、12.5nM、6.15nM以及3.125nM)进行完全动力学亲和力测试。结合亲和力由
Figure GDA0003470474660000733
RED96系统中的软件计算。如表中所示，147H-6、147H-7、147H-13和147H-14显示出与147H嵌合抗体相当的亲和力。
抗体 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
147H嵌合 2.71E-08 8.01E+04 2.17E-03
147H-6 2.48E-08 1.05E+05 2.59E-03
147H-7 2.65E-08 1.18E+05 3.12E-03
147H-13 1.82E-08 1.04E+05 1.90E-03
147H-14 2.07E-08 9.87E+04 2.04E-03
实施例15抗LAG3小鼠单克隆抗体的功能特性
通过抗LAG3抗体刺激人T细胞应答
为了测试抗LAG3抗体刺激T细胞应答的能力，如实施例12中所述使用Jurkat T细胞刺激试验。在培养开始时，加入抗LAG3抗体(从30μg/ml开始，以1:3连续稀释至6个剂量)。48小时后，通过ELISA评估培养物上清液中IL2的产生。如图12所示，147H-13人源化单克隆抗体可以剂量依赖性地促进Jurkat T细胞产生IL2，表明它们可以通过抑制针对T细胞的LAG3信号来刺激TCR刺激。
实施例16抗LAG3 147H人源化单克隆抗体的亲和力成熟
为了提高抗原的结合亲和力，该实施例使用噬菌体展示技术进行147H-13的亲和力成熟。策略1：靶向147H-13的CDRH3和CDRL3以进行基于密码子的诱变。CDRH3和CDRL3分别在H95-H102和L89-L97(Kabat编号)处随机化。策略2：使用CDR巡查方法靶向每个CDR进行基于单个密码子的诱变。然后将CDRH1、CDRH2、CDRL1组合至文库1。将CDRH3、CDRL2、CDRL3组合至文库2。
在两种策略中，文库经过三轮或四轮基于亲和力的溶液相噬菌体展示选择，每轮的抗原浓度降低。第一轮使用相对高的抗原浓度(10nM)。随后三轮中的抗原浓度每次减少10倍或随后两轮中减少100倍以选择高亲和力变体。通过ELISA筛选测试来自最后一轮的个体变体与抗原的阳性结合。通过Octet Red 96(Fortebio，USA)确定各个变体的解离速率的排序。将具有改善的亲和力的突变组合以产生新的LAG3抗体。通过Biacore进一步证实亲和力，其表明CDR H2的N58V显著增加Koff，而CDR L3的N91Y改善了Kon。
表7抗体亲和力成熟
Figure GDA0003470474660000741
Figure GDA0003470474660000751
Figure GDA0003470474660000761
Figure GDA0003470474660000771
Figure GDA0003470474660000781
Figure GDA0003470474660000791
Figure GDA0003470474660000801
Figure GDA0003470474660000811
Figure GDA0003470474660000821
表8突变和突变CDR区的总结
Figure GDA0003470474660000822
Figure GDA0003470474660000831
实施例17亲和力成熟的抗LAG3 147H人源化单克隆抗体的结合特性
如实施例9中所述，通过Biacore T200检查亲和力成熟的抗体与重组his-标签人LAG3-ECD蛋白的结合动力学。结果显示在下表中。Biacore结果显示，这些抗LAG3抗体具有比亲本147H-13更好的亲和力。
KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
147H-13 1.4E-08 2.2E+06 3.0E-02
147H 3421 8.1E-09 1.4E+06 1.2E-02
147H 3508 1.4E-09 2.9E+06 4.2E-03
147H 3549 9.2E-10 7.4E+06 6.8E-03
147H 3550 9.8E-10 8.7E+06 8.5E-03
147H 3663 6.8E-09 7.9E+05 5.4E-03
147H 3669 8.8E-09 7.2E+05 6.3E-03
147H 3790 5.9E-09 7.7E+05 4.5E-03
147H 3791 1.2E-09 2.1E+06 2.5E-03
147H 3792 5.9E-10 4.9E+06 2.9E-03
147H 3793 1.3E-09 1.8E+06 2.3E-03
147H 3794 7.2E-10 3.7E+06 2.7E-03
147H 3807 5.1E-10 4.0E+06 2.0E-03
147H B3808 7.5E-10 4.3E+06 3.2E-03
147H 3809 4.7E-10 4.3E+06 2.0E-03
147H 3810 4.1E-10 4.7E+06 1.9E-03
147H 3811 5.9E-10 4.9E+06 2.9E-03
为了证实亲和力成熟的抗LAG-3抗体与人LAG3结合的能力，使用在实施例2中描述的ELISA评估具有最高亲和力的2种抗体(B3807和B3810)以及亲本抗体147H-13。B50807、B3810和亲本抗体的EC50如下表所示。3807和B3810均显示出优于亲本抗体147H-13的结合能力。
名称 EC50(nM)
147H-13 6.5
147H 3807 0.41
147H 3810 0.49
为了进一步证实亲和力成熟的抗LAG-3抗体可以结合细胞衍生的人LAG3，使用表达hLAG3的诱导型Jurkat细胞和活化的PBMC测试B3807和B3810的结合能力。简而言之，将Jurkat细胞重悬于FACS缓冲液中。将抗LAG3抗体和同种型对照在FACS缓冲液中连续稀释4倍，剂量范围为20nM～30pM。将连续稀释的抗体加入细胞悬浮液中，并在冰上孵育30分钟。然后除去未结合的抗体，用偶联有Alexa Fluor 633(Thermo，A21091)的抗人IgG对细胞进行染色。使用FACSCelesta流式细胞仪进行荧光测量，并用Flowjo分析以确定平均荧光强度(MFI)。为了测试抗LAG3抗体结合天然人LAG3的能力，用浓度均为1μg/ml的抗CD3(BD，555336)和抗CD28(BD，555725)刺激来自健康供体的PBMC。刺激3天后，收获细胞并与抗LAG3抗体在冰上孵育30分钟。使用抗人CD4和抗人IgG对细胞进行染色。在FACSCelesta流式细胞术对抗体与CD4+细胞的结合进行分析。细胞计数分析的结果总结在下表中，其显示抗体与细胞衍生的人LAG3结合的EC50。图13是显示抗LAG3抗体的结合曲线的图。测试抗体的EC50如下所示。
Figure GDA0003470474660000841
实施例18LAG3与MHC II类的结合阻断
为了测定抗LAG3单克隆抗体阻断人LAG3和MHCII之间相互作用的能力，使用均相TR-FRET技术，按照试剂盒生产厂家提供的方案进行LAG3和MHC II结合试验(Cisbio，64ICP03PEG)。将抗人LAG3抗体进行3倍稀释，范围为100nM至5pM(共10个点)。在PerkinElmer Envision读板仪上获得荧光数据，并拟合四参数剂量-响应曲线以获得每种抗体的IC 50。测试抗体的IC 50显示在下表中。
Figure GDA0003470474660000842
Figure GDA0003470474660000851
实施例19通过抗LAG3抗体刺激人T细胞应答
如实施例13中所述，使用表达hLAG3的Jurkat细胞测试抗LAG3抗体刺激T细胞应答的能力。类似地，在96孔板的每个孔中，在0.1ng/ml SE存在下，将Jurkat细胞(1×105)与Raji细胞(1×104)一起孵育。将抗LAG3抗体稀释3倍并以100nM至5pm的终浓度加入细胞中。48小时后，使用均相TR-FRET测定法测量来自培养基的IL2(PerkinElmer，TRF1221M)。图14显示了抗LAG3抗体刺激IL2释放的曲线。亲和力成熟的克隆在刺激T细胞应答中表现出更好的效力。
实施例20抗LAG3抗体对阻断半乳糖凝集素-3或LSECtin与LAG3结合的作用
据报道，LAG3具有其他配体，包括半乳糖凝集素-3(Cancer Immunol Res.2015；3:412–423.)和LSECtin(J Biol Chem.2004；279:18748–18758)。与这两种潜在的替代配体的相互作用可被用于拓宽LAG3对T细胞功能的影响，特别是涉及LAG3对肿瘤微环境中CD8+T细胞的内在作用。在4℃下，将重组半乳糖凝集素-3或LSECtin过夜包被在96孔上。将系列稀释的抗LAG3抗体(起始于10μg/ml，以1:3稀释)和生物素标记的LAG3-Fc蛋白与半乳糖凝集素-3或LSECtin包被的孔在室温下孵育2小时。用洗涤缓冲液充分洗涤后，加入链霉亲和素标记的HRP。如图15所示，147H、S27和S119抗体剂量依赖性地抑制半乳糖凝集素-3或LSECtin与LAG3蛋白的结合。
实施例21抗人LAG3和抗人PD-L1抗体组合治疗的协同作用
使用Jurkat T细胞刺激试验评价抗LAG-3抗体与PD-L1抗体组合的效果。Jurkat细胞过表达人LAG3和人PD-1。用人PD-L1转染内源表达MHCII的Raji细胞。在该测定中用SE作刺激物。简而言之，在SE刺激的存在下，将表达PD-L1的Raji(1×104)与表达Jurkat T细胞(1×105)的LAG3-PD-1共培养。将与抗PD-L1抗体联用或不含抗PD-L1抗体的抗LAG3抗体连续稀释并在培养开始时加入。48小时后，使用TR-FRET测定(PerkinElmer，TRF1221M)收集培养物上清液用于IL2释放。如图16所示，与其相应的单抗相比，与抗PD-L1抗体联用的抗LAG3抗体可以显著产生更多的IL-2。
使用表达人PD-1胞外结构域和人LAG3的双重人源化小鼠。将小鼠结肠腺癌细胞(MC38)工程化以表达人PD-L1。双重人源化小鼠(hLAG3/hPD-1)在第0天皮下植入5×105MC38-hPD-L1细胞。在第10天，选择平均肿瘤体积为137mm3的小鼠并随机分成4个治疗组(N＝7/组)。从第10天开始，小鼠腹腔内每隔一天注射一次，共8个剂量的同型对照(5mg/kg)、抗PD-L1抗体(5mg/kg)、抗LAG3抗体147H-13(5mg/kg)和抗PD-L1抗体(5mg/kg)以及抗-LAG3抗体(5mg/kg)。本实施例中使用的抗PD-L1抗体以高亲和力结合人PD-L1并阻断与PD-1的相互作用。在实验期间(29天)，通过卡尺每周两次监测肿瘤体积。5mg/kg剂量的PD-L1抗体和147H-13均未显示肿瘤抑制。相比之下，PD-L1抗体和147H-13的组合显示出对MC38肿瘤生长的强烈抑制，在研究结束时TGI为74.2％(图17)。因此，在建立的MC38结肠腺癌模型中，抗PD-L1和抗LAG3抗体的联合治疗比相应的单一疗法更有效。
***
本发明不限于所描述的具体实施方案的范围，所述具体实施方案旨在作为对本发明各个方面的单个说明，并且功能上等同的任何组合物或方法都在本发明的范围内。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明的方法和组合物进行各种修改和变化。因此，本公开旨在覆盖本公开的修改和变化，只要它们落入所附权利要求及其等同物的范围内。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请被具体并单独地指出通过引用并入本发明相同。
SEQUENCE LISTING
<110> 天境生物
<120> 抗LAG-3抗体及其应用
<130> P181115006WP
<150> PCT/CN2017/074365
<151> 2017-02-22
<150> PCT/CN2017/088570
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<223> Synthetic
<400> 359
Pro Gly Leu Pro Arg Asp Tyr
1 5
<210> 360
<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> Synthetic
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Pro Gly Leu Pro Gln Asp Tyr
1 5
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<211> 7
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<220>
<223> Synthetic
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Pro Asp Leu Pro Lys Asp Tyr
1 5
<210> 362
<211> 7
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Gln Val Ser Asn Leu Ala Arg
1 5
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<400> 363
Gln Lys Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
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<220>
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Gln Val Ser Asn Leu Ala Val
1 5
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1 5
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1 5
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1 5
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<211> 16
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<220>
<223> Synthetic
<400> 376
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Gln Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15

Claims (26)

1.一种分离的抗体或者其片段，其特征在于，所述的抗体或者其片段对人类淋巴细胞活化基因-3（LAG-3）蛋白具有特异性，所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区含有重链互补决定区 CDRH1、CDRH2 和 CDRH3，所述的轻链可变区含有轻链互补决定区CDRL1、CDRL2 和CDRL3；其中
所述的CDRH1为如SEQ ID NO: 240 所示的氨基酸序列；
所述的CDRH2为如SEQ ID NO: 241 所示的氨基酸序列；
所述的CDRH3为如SEQ ID NO: 242 所示的氨基酸序列；
所述的CDRL1为如SEQ ID NO: 243 所示的氨基酸序列；
所述的CDRL2为如SEQ ID NO: 244 所示的氨基酸序列；
和
所述的CDRL3为如SEQ ID NO: 245 所示的氨基酸序列。
2.如权利要求 1 所述的分离的抗体或者其片段，其特征在于，所述重链可变区包含序列如SEQ ID NO: 238 所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含序列如 SEQ ID NO: 239所示的氨基酸序列。
3.如权利要求 1 所述的分离的抗体或者其片段，其特征在于，所述重链可变区包含一条选自由SEQ ID NO: 251、252、258 和 259 组成的群组中的氨基酸序列，所述轻链可变区包含序列如 SEQ ID NO: 260 所示的氨基酸序列。
4.一种分离的抗体或者其片段，其特征在于，所述的抗体或者其片段对人类淋巴细胞活化基因-3（LAG-3）蛋白具有特异性，所述抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区含有重链互补决定区 CDRH1、CDRH2 和 CDRH3，所述的轻链可变区含有轻链互补决定区CDRL1、CDRL2 和CDRL3；其中
所述的CDRH1为如SEQ ID NO: 240 所示的氨基酸序列；
所述的CDRH2为如SEQ ID NO: 347 所示的氨基酸序列；
所述的CDRH3为如SEQ ID NO: 354 所示的氨基酸序列；
所述的CDRL1为如SEQ ID NO: 330 的氨基酸残基 24~39所示的氨基酸序列；
所述的CDRL2为如SEQ ID NO: 244 所示的氨基酸序列；
和
所述的CDRL3为如SEQ ID NO: 374 所示的氨基酸序列。
5.如权利要求 4 所述的分离的抗体或者其片段，其特征在于，所述重链可变区包含序列如SEQ ID NO: 329 所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含序列如SEQ ID NO: 330 所示的氨基酸序列。
6.如权利要求 1~5 任一项所述的分离的抗体或者其片段，其特征在于，所述的分离的抗体或者其片段进一步包含重链恒定区或轻链恒定区。
7.如权利要求 1~5 任一项所述的分离的抗体或者其片段，其特征在于，所述的分离的抗体或者其片段为双特异性的。
8.如权利要求 7 所述的分离的抗体或者其片段，其特征在于，所述的双特异性包括针对免疫检查点蛋白或肿瘤抗原的第二特异性。
9.如权利要求 7 所述的分离的抗体或者其片段，其特征在于， 所述的双特异性包括针对选自由 PD-L1、PD-1、CTLA-4、CD28、CD122、4-1BB、TIM3、OX-40、OX40L、CD40、CD40L、LIGHT、ICOS、ICOSL、GITR、GITRL、TIGIT、CD27、VISTA、B7H3、B7H4、HEVM、BTLA、KIR、CD47、CD73、EGFR、Her2、CD33、CD133、CEA 以及 VEGF 组成的群组中的蛋白靶点的第二特异性。
10.如权利要求 7 所述的分离的抗体或者其片段，其特征在于，所述的双特异性包括针对 PD-L1 的第二特异性。
11.一种包含如权利要求 1~10 任一项所述的抗体或其片段，以及药学上可接受的载体的组合物。
12.一种包含编码如权利要求 1~10 任一项所述的抗体或其片段的一种或多种多核苷酸的分离的细胞。
13.如权利要求 1~10 任一项所述的分离的抗体或者其片段在制备用于在有需要的患者中治疗自身免疫疾病或炎性疾病的药物中的应用。
14.如权利要求 13 所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病或炎性疾病选自由帕金森病、关节炎、多发性硬化症、牛皮癣、炎症性肠病、狼疮、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、爱迪生氏病、乳糜泻、皮肌炎、重症肌无力、恶性贫血、干燥综合征、I 型糖尿病、血管炎、葡萄膜炎、动脉粥样硬化和强直性脊柱炎组成的群组。
15.如权利要求 13 所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病或炎性疾病为克罗恩氏病。
16.如权利要求 13 所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病或炎性疾病为类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮或多发性硬化症。
17.如权利要求 13 所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病或炎性疾病为幼年型类风湿关节炎。
18.如权利要求 13 所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病或炎性疾病为幼年特发性关节炎。
19.如权利要求 1~10 任一项所述的分离的抗体或者其片段在制备用于在有需要的患者中治疗癌症的药物中的应用。
20.如权利要求 19 所述的应用，其特征在于，所述癌症选自由白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌、胆囊癌、胆管癌、食管癌、肾细胞癌、甲状腺癌、睾丸癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、脑垂体癌、血管癌、脑癌、眼癌、口咽癌、下咽癌、宫颈癌、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、胃泌素瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、骨髓增生异常综合征和肉瘤组成的群组。
21.如权利要求 19 所述的应用，其特征在于，所述癌症为结肠直肠癌、非小细胞肺癌、头颈鳞状细胞癌、皮肤癌、软组织癌、神经癌、脑膜癌、子宫癌或成胶质细胞瘤。
22.如权利要求 19 所述的应用，其特征在于，所述癌症为肺腺癌或肺鳞状细胞癌。
23.如权利要求 20 所述的应用，其特征在于，所述白血病为全身性肥大细胞增生症、急性淋巴细胞性白血病（ALL）、T 细胞 ALL、急性髓性白血病（AML）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、多发性骨髓瘤（MM）、慢性髓细胞白血病（CML）、骨髓增生性肿瘤或单核细胞白血病。
24.如权利要求 20 所述的应用，其特征在于，所述白血病为骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征或浆细胞白血病。
25.如权利要求 20 所述的应用，其特征在于，所述淋巴瘤为组织细胞淋巴瘤、 T 细胞淋巴瘤或 B 细胞淋巴瘤。
26.如权利要求 20 所述的应用，其特征在于，所述肉瘤为骨肉瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、肺泡样软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤或软骨肉瘤。
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