KR102236259B1 - 항-lag-3 항체 및 그것의 사용 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3)에 결합하는 항체를 제공한다. 또한 면역 반응을 자극하고, 종양 세포의 성장을 억제하고, 자가면역, 염증, 또는 바이러스 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

항-LAG-3 항체 및 그것의 사용{ANTI-LAG-3 ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 명세서는 일반적으로는 분자 생물학 및 단백질 생화학의 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 명세서는 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3)에 결합하는 항체 및 그 사용 방법에 관한 것이다.
림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3) (CD223으로도 알려져 있음)은 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리의 구성원이고, CD4에 밀접하게 관련되어 있으며, T 세포 기능에 다양한 영향을 준다. LAG-3는 활성화된 T 세포, 기능 소실된 T 세포, 종양 침윤성 T 세포, 및 조절 T 세포 (Tregs)에서 발현된다. 주요 조직 적합성 복합체 2 (MHC 분류 II)와 결합시, LAG-3/MHC 분류 II 상호작용은 T 세포 증식, 활성화, 및 항상성의 음성 조절을 유도한다.
LAG-3은 세포독성 T 림프구 항원-4 (CTLA-4), 예정된 세포 사멸 리간드-1 (PD-L1), 및 예정된 세포 사멸-1 (PD-1)과 유사한, 암에서의 중요한 면역 체크포인트를 나타낸다. LAG-3은 활성화된/기능 소실된 효과기 T 세포, 뿐만 아니라 조절 T 세포에서도 발현된다. LAG3 길항작용은 효과기 T 세포와 활성화를 촉진할 뿐만 아니라, 조절 T 세포의 억제 기능을 차단할 수 있다. 그러므로, LAG-3은 암 면역요법에 대한 유망한 표적을 나타내고 전임상적 증거는 항-LAG-3 항체가 항-종양 반응을 촉진할 수 있다는 것을 시사한다.
상기를 고려하여, 다양한 암 및 종양 세포의 성장을 억제하는 면역 반응을 자극하는 방식으로 LAG-3의 활성을 조절할 뿐만 아니라, 자가면역, 염증, 또는 바이러스 질환의 치료에 유용한 새로운 작용제를 개발할 필요가 있다.
본 명세서는 인간 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3) 단백질에 결합할 수 있는 항체 및 이것의 단편, 뿐만 아니라 치료적, 진단적 및 분석적 설정에서의 그것들의 사용을 제공한다. 실험예에서 입증된 바와 같이, 본원에서 개시된 항-LAG-3 항체 중 일부는 공지된 항-LAG-3 항체로는 보여지지 않는 활성을 나타냈다. 예로서, 본원에서 개시된 항체는 MHC 분류 II 분자로의 결합에 더하여, 갈렉틴-3 (LGALS3) 및 C형 렉틴 도메인 패밀리 4 구성원 G (LSECtin) 단백질로의 LAG-3 단백질의 결합을 억제할 수도 있다. 그에 반해, 공지된 항-LAG-3 항체는 단지 MHC 분류 II 분자로의 결합에 대한 억제 효과만을 나타냈다. 일부 구체예에서, 본 명세서의 항체 및 이것의 단편은 효과기 T 세포 (Teffs)에 대한 조절 T 세포 (Tregs)의 억제 효과를 반전시킬 수 있다.
한 구체예에서, 본 명세서는 인간 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3) 단백질에 대하여 특이성을 갖고, 중쇄 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이것의 단편을 제공하며, 여기서 CDRH1은 서열 번호:240의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:240으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH2는 서열 번호:241의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:241로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH3은 서열 번호:242의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:242로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL1은 서열 번호:243의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:243으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL2는 서열 번호:244의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:244로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL3은 서열 번호:245의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:245로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 서열 번호:240의 아미노산 치환은, 카바트 넘버링에 따라, 아미노산 잔기 Y27, T28, T30, G35, 또는 이것들의 조합에서 이루어진다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 Y27: F; T28: M, 또는 L; T30: E, D, 또는 G; 또는 G35: W, 또는 S로부터 선택된다. 일부 구체예에서, CDRH1은 서열 번호:240 및 339-346으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 서열 번호:241의 아미노산 치환은, 카바트 넘버링에 따라, 아미노산 잔기 D50, Y52, Y56, N58, 또는 이것들의 조합에서 이루어진다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 D50: E; Y52: F; Y56: I, V, L, 또는 H; 또는 N58: V, 또는 T로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 N58V를 포함한다. 일부 구체예에서, CDRH2는 서열 번호:241 및 347-353으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 서열 번호:242의 아미노산 치환은, 카바트 넘버링에 따라, 아미노산 잔기 N96, G99, Y102, 또는 이것들의 조합에서 이루어진다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 N96: D, 또는 G; G99: K, R, 또는 Q; 또는 Y102: H로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 G99K 또는 Y102H를 포함한다. 일부 구체예에서, CDRH3은 서열 번호:242 및 354-361로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 서열 번호:243의 아미노산 치환은, 카바트 넘버링에 따라, 아미노산 잔기 N28에서 이루어진다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 N28Q를 포함한다. 일부 구체예에서, CDRL2는 서열 번호:376의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 서열 번호:244의 아미노산 치환은, 카바트 넘버링에 따라, 아미노산 잔기 Q50, V51, S52, L54, S56, 또는 이것들의 조합에서 이루어진다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 Q50: H; V51: K; S52: D; L54: R; 또는 S56: R, V, L, 또는 T로부터 선택된다. 일부 구체예에서, CDRL2는 서열 번호:244 및 362-369로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 서열 번호:245의 아미노산 치환은, 카바트 넘버링에 따라, 아미노산 잔기 A89, N91, L94, 또는 이것들의 조합에서 이루어진다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 A89: G; N91: Y; 또는 L94: M, 또는 E로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 N91Y를 포함한다. 일부 구체예에서, CDRL3은 서열 번호:245 및 370-375로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 서열 번호:238, 246-259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 및 337로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호:238, 246-259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 및 337로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 서열 번호:239, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 및 338로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호:239, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 및 338로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
역돌연변이는 인간화 항체 또는 단편에 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은, 카바트 넘버링에 따라, (a) 위치 71에서 Ala (A), (b) 위치 69에서 Leu (L), (c) 위치 66에서 Lys (K), (d) 위치 67에서 Ala (A), (e) 위치 48에서 Ile (I), (f) 위치 37에서 Ile (I), (g) 위치 38에서 Lys (K), (h) 위치 91에서 Phe (F), 및 (i) 위치 1에서 Glu (E), 및 이것들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 인간 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3) 단백질에 대하여 특이성을 갖고, 중쇄 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 이것의 단편이 제공되며, 여기서 CDRH1은 서열 번호:1 또는 2의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:1 또는 2로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH2는 서열 번호:3 또는 4의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:3 또는 4로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH3은 서열 번호:5-45로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:5-45 중 어느 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL1은 서열 번호:46-80으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:46-80 중 어느 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL2는 서열 번호:81-103으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:81-103 중 어느 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL3은 서열 번호:104-139로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:104-139 중 어느 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 서열 번호:140-188로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 번호:140-188로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 서열 번호:189-237로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 번호:189-237로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
면역 체크포인트 단백질 또는 종양 항원에 대하여 제2 특이성을 더 포함하는 이중특이적 항체가 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 이중특이성은 PD-L1, PD-1, CTLA-4, CD28, CD122, 4-1BB, TIM3, OX-40, OX40L, CD40, CD40L, LIGHT, ICOS, ICOSL, GITR, GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM, BTLA, KIR, CD47, CD73, EGFR, Her2, CD33, CD133, CEA 및 VEGF로 구성된 군으로부터 선택된 단백질 표적에 대한 제2 특이성을 포함한다.
자가면역 또는 염증 질환, 암, 및 감염의 치료를 포함한 치료 방법이 또한 제공된다.
도 1. D1-D2 도메인은 LAG-3 기능에 중요하다. 야생형 (WT) LAG3 세포 외 도메인 (ECD) 융합 단백질 (LAG-3-ECD-huFc) 단편은 Daudi 세포에 결합할 수 있는 한편 D1-D2 절단된 LAG-3-ECD-huFc 단편은 Daudi 세포에 결합할 수 없다.
도 2. 다양한 종으로부터 유래된 LAG3 단백질로의 인간 항-LAG3 항체의 결합. 항-LAG-3 항체는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 통해 인간, 래트, 및 마우스 LAG3으로의 결합 성질에 대하여 평가되었다.
도 3. 활성화된 인간 1차 CD4+ T 세포 상의 세포 표면 LAG-3 항원으로의 인간 항-LAG3 항체의 결합. 항-LAG-3 항체는 다양한 농도 (10 μg/ml, 3.333 μg/ml, 1.111 μg/ml, 0.370 μg/ml, 0.123 μg/ml, 0.041 μg/ml, 0.014 μg/ml 및 0.005 μg/ml)에서 활성화된 인간 1차 CD4+ T 세포 상의 세포 표면 LAG-3 항원으로의 결합에 대하여 평가되었다.
도 4. 항-LAG-3 항체에 의한 MHC 분류 II 수용체로의 가용성 LAG-3 (sLAG) 결합의 억제. 항-LAG-3 항체는 비오틴-라벨링된 LAG-3-ECD-huFcLAG-3-Fc 융합 단백질 및 MHC 분류 II 수용체를 발현하는 Raji 세포를 사용한 시험관 내 결합 검정에서 MHC 분류 II 수용체로의 sLAG-3의 결합을 차단하는 능력에 대하여 평가되었다.
도 5. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 항-LAG-3 항체에 의한 IL-2 생산의 자극. 항-LAG-3 항체는 6회 용량에 대하여 20μg/ml에서 시작하여 1:3 단계 희석된 다양한 농도로 포도상구균 장독소 B (Staphylococcal Enterotoxin B; SEB) 자극된 PBMC로 투여되었다. 3일 후, 배양 상층액 중의 IL-2 농도는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 평가되었다.
도 6. 항-LAG-3 항체를 사용하여 효과기 T 세포 (Teffs)에 대한 조절 T 세포 (Tregs)의 억제 기능의 반전. 항-LAG-3 항체가 Teffs에 대한 Tregs의 억제 효과를 반전시키는 능력을 평가하기 위해서, 실시예 1의 항체가 시험관 내 Tregs 억제 검정에서 사용되었다.
도 7. 항-LAG3 및 PD-1 항체 조합 처리의 시너지 효과. 항-LAG3 항체는 SEB-자극된 PBMC 검정에서 PD-1 항체와 조합하여 테스트되었다.
도 8. 항-LAG-3 항체는 PD-L1 항체의 존재 하에서 인간 T 세포 반응을 향상시킨다. 항-LAG3 항체는 인간 혼합된 림프구 반응 (MLR) 검정에서 PD-L1 항체와 조합하여 평가되었다.
도 9. ELISA 결과는 D1-D2 결실된 LAG3 (ΔD1-D2 huFc)에 결합하지 않지만, LAG3의 전제 세포 외 도메인 (D1-D4 huFc)으로의 결합에 대한 항체의 EC50을 나타내며, 122H, 147H 및 170H가 인간 LAG3이 D1 및 D2 도메인에 대한 강력하고 선택적인 바인더임을 입증한다.
도 10. 122H, 147H 및 170H 항체는 수용체 MHC 분류 II 분자로의 LAG3의 결합을 용량 의존적으로 억제하였다.
도 11. 122H, 147H 및 170H 마우스 단클론성 항체는 Jurkat T 세포에 의한 IL2 생산을 용량 의존적으로 촉진하였다.
도 12. 인간화 단클론성 항체 147H-13은 Jurkat T 세포에 의한 IL2 생산을 용량 의존적으로 촉진하였다.
도 13. Jurkat-LAG3 세포 및 활성화된 CD4 T 세포 상에서 항-LAG3 항체의 결합 곡선.
도 14. Jurkat T 세포에 의한 IL2 방출의 자극에 대한 친화도 성숙화된 항-LAG3 항체의 효과.
도 15. LAG3으로의 갈렉틴-3 또는 LSECtin의 결합의 차단에 대한 항-LAG3 항체의 효과.
도 16. 항 PD-L1 항체와 조합된 항 LAG3 항체는 각각의 단독에서보다 훨씬 더 많은 IL-2를 생산하였다.
도 17. 항-PD-L1 항체 및 147H-13의 조합은 MC38 종양 성장의 강력한 억제를 입증하였다.
본 명세서는 인간 LAG-3에 결합하고 바람직한 기능적 성질을 가진 단리된 항체, 특히 인간 및 인간화 항체에 관한 것이다. 일부 구체예에서, LAG-3 항체는 LAG-3에 결합하여 다른 분자로의 결합을 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, 다른 분자는, 제한되는 것이 아니라, 갈렉틴-3 (LGALS3), C형 렉틴 도메인 패밀리 4 구성원 G (LSECtin) 단백질, 및 MHC 분류 II 분자를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 명세서의 항체는 본원에서 개시된 바와 같이 특정 CDR 영역을 포함한다. 본 명세서는 단리된 항체, 이러한 항체의 제조 방법, 이러한 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트 및 이중특이적 분자 및 본 명세서의 항체, 면역컨쥬게이트 또는 이중특이적 분자를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 명세서는 또한, 예컨대 LAG-3 단백질을 검출하기 위한 항체의 사용 방법, 뿐만 아니라, 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여, 면역 반응을 자극하기 위한 본 명세서의 항-LAG-3 항체의 사용 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 명세서는 또한, 예를 들어, 종양 성장을 억제하거나 바이러스 감염을 치료하기 위한 본 명세서의 항-LAG-3 항체의 사용 방법을 제공한다.
본 명세서가 더 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 용어들이 먼저 정의된다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
용어 "LAG-3" 또는 "LAG3"는 림프구 활성화 유전자-3을 지칭한다. 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리에 속하는 LAG3 단백질은 D1 내지 D4로 지정된 네 개의 세포 외 Ig-유사 도메인을 가진 503-아미노산 I형 막관통 단백질을 포함한다. 본원에서 기술된 바와 같이, 용어 "LAG-3"은 변종, 아이소폼, 상동체, 오쏠로그(ortholog), 및 파라로그(paralog)를 포함한다. 예를 들어, 인간 LAG-3 단백질에 특이적인 항체는, 어떤 경우에는, 인간 이외의 종의 LAG-3 단백질과 교차-반응할 수 있다. 다른 구체예에서, 인간 LAG-3 단백질에 특이적인 항체는 인간 LAG-3 단백질에 전적으로 특이적일 수도 있고 종 또는 다른 유형의 교차-반응성을 나타내지 않을 수도 있거나, 또는 다른 어떤 종의 LAG-3과 교차-반응하지만 다른 모든 종의 LAG-3과 교차-반응하는 것은 아닐 수도 있다 (예로서, 원숭이 LAG-3과 교차-반응하지만, 마우스 LAG-3과 교차-반응하지 않는다). 용어 "인간 LAG-3"은 인간 서열 LAG-3, 예컨대 GenBank Accession No. NP 002277을 가진 인간 LAG-3의 완전한 아미노산 서열을 지칭한다. 용어 "마우스 LAG-3"은 마우스 서열 LAG-3, 예컨대 GenBank Accession No. NP 032505를 가진 마우스 LAG-3의 완전한 아미노산 서열을 지칭한다. LAG-3은 또한, 예를 들어, CD223으로 업계에 공지되어 있다. 인간 LAG-3 서열은, 예로서, 보존된 돌연변이 또는 비-보존된 영역의 돌연변이를 가짐으로써 GenBank Accession No. NP 002277의 인간 LAG-3과 다를 수도 있고 LAG-3은 GenBank Accession No. NP 002277의 인간 LAG-3과 실질적으로 같은 생물학적 기능을 갖는다. 예를 들어, 인간 LAG-3의 생물학적 기능은 본 명세서의 항체에 의해 특이적으로 결합된 LAG-3의 세포 외 도메인에서 에피토프를 갖는 것이거나 또는 인간 LAG-3의 생물학적 기능은 MHC 분류 II 분자에 결합하는 것이다.
특정 인간 LAG-3 서열은 일반적으로 GenBank Accession No. NP 002277의 인간 LAG-3에 대하여 아미노산 서열이 적어도 90% 동일할 것이고 다른 종 (예로서, 쥐)의 LAG-3 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 서열을 인간인 것으로 확인하는 아미노산 잔기를 함유한다. 어떤 경우에는, 인간 LAG-3은 GenBank Accession No. NP 002277의 LAG-3과 아미노산 서열이 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 특정 구체예에서, 인간 LAG-3 서열은 GenBank Accession No. NP 002277의 LAG-3 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 구체예에서, 인간 LAG-3은 GenBank Accession No. NP 002277의 LAG-3 서열과 5개 이하, 또는 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다. 퍼센트 동일성은 본원에서 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
용어 "면역 반응"은 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는, 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우에는, 정상 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적 손상, 이것들의 파괴, 또는 이것들의 인간 신체로부터의 제거를 유발하는, 예를 들어, 림프구, 항원 제공 세포, 포식 세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자 (항체, 사이토카인, 및 보체 포함)의 작용을 지칭한다.
"항원-특이적 T 세포 반응"은 T 세포가 특이적인 항원으로 T 세포의 자극으로부터 발생하는, T 세포에 의한 반응을 지칭한다. 항원-특이적 자극시 T 세포에 의한 반응의 비-제한적 예는 증식 및 사이토카인 생산 (예로서, IL-2 생산)을 포함한다.
용어 "항체"는 본 발명에서 지칭된 바와 같이 전체 항체 및 이것의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 사슬을 포함한다. 전체 항체는 이황화 결합에 의해 서로 연결된 적어도 두 개의 중쇄 (H) 및 두 개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 축약됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2, 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 축약됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 불리는, 더 많이 보존되는 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 불리는 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서부터 카르복시 말단 방향으로 다음 순서로 배열된다: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 숙주 조직 또는 인자로의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있으며, 면역계의 다양한 세포 (예로서, 효과기 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 구성요소 (C1q)를 포함한다.
용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단히 "항체 일부" 또는 "단편")은, 본원에서 사용된 바와 같이, 항원 (예로서, LAG-3 단백질)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수도 있다. 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 결합된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) 본질적으로 힌지 영역의 일부를 가진 Fab인 Fab' 단편 (FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. I993 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (v) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된Fv 단편, (vi) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (viii) 나노바디, 단일 가변 도메인 및 두 개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 게다가, Fv 단편의 두 개의 도메인, VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 그것들은 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬 (단일 사슬 Fv (scFv)로 알려져 있음; 예로서, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (I988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883 참조)로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포함되도록 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지되어 있는 통상적인 기술을 사용하여 얻어지고, 단편은 온전한 항체와 같은 방식으로 유용성에 대하여 스크리닝된다.
"단리된 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 상이한 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하도록 의도된다 (예로서, LAG-3 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 LAG-3 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 하지만, 인간 LAG-3 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종의 LAG-3 단백질에 대하여 교차 반응성을 가질 수도 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학불질이 실질적으로 없을 수 있다.
용어 "단클론성 항체" 또는 "단클론성 항체 조성물"은 본원에서 사용된 바와 같이 단일 분자 조성물의 항체 분자의 조제물을 지칭한다. 단클론성 항체 조성물은 특정 에피토프에 대하여 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
인간화 항체는 단백질 서열이 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변종에 대한 유사성을 증가시키도록 변형된 비-인간 종의 항체이다. "인간화"의 공정은 보통 인간으로의 투여를 위해 개발된 단클론성 항체에 적용된다.
용어 "인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 생식세포 계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진 항체를 포함하도록 의도된다. 게다가, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 생식세포 계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 명세서의 인간 항체는 인간 생식세포 계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기 (예로서, 시험관 내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 시험관 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 하지만, 용어 "인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 또 다른 포유류 종, 예컨대 마우스의 생식세포 계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 항체를 포함하려는 것은 아니다.
용어 "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화된 항체 분류 (예로서, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
구절 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 교체 가능하게 사용된다.
용어 "인간 항체 유도체"는 인간 항체의 임의의 변형된 형태, 예로서, 항체 및 또 다른 작용제 또는 항체의 컨쥬게이트를 지칭한다. 용어 "인간화 항체"는 또 다른 포유류 종, 예컨대 마우스의 생식세포 계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 항체를 지칭하도록 의도된다. 추가적인 프레임워크 영역 변형은 인간 프레임워크 서열 내에서 이루어질 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열은 한 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열은 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하도록 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는" 또는 "인간 LAG-3에 대한 특이성을 가진" 항체는 인간 LAG-3 단백질 (및 아마도 하나 이상의 비-인간 종의 LAG-3 단백질)에 결합하지만 비-LAG-3 단백질에는 실질적으로 결합하지 않는 항체를 지칭하도록 의도된다. 바람직하게는, 항체는 "높은 친화도", 즉 1 Х 10-7 M 이하, 더 바람직하게는 5 Х 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 3 Х 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 1 Х 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 25 Х 10-9 M 이하 또는 더 바람직하게는 1 Х 10-9 M 이하의 KD로 인간 LAG-3 단백질에 결합한다.
용어 단백질 또는 세포에 "실질적으로 결합하지 않는다"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 높은 친화도로 결합하지 않는 것, 즉, 1 Х 10-6 M 이상, 더 바람직하게는 1 Х 10-5 M 이상, 더 바람직하게는 1 Х 10-4 M 이상, 더 바람직하게는 1 Х 10-3 M 이상, 더 바람직하게는 1 Х 10-2 M 이상의 KD로 단백질 또는 세포에 결합하는 것을 의미한다. 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 특정 항체-항원 상호작용의 회합 속도를 지칭하도록 의도되는 반면, 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하도록 의도된다. 용어 "KD"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 해리 상수를 지칭하도록 의도되며, 이것은 Ka에 대한 Kd의 비율 (즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고 몰 농도 (M)로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 업계에서 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는데 바람직한 방법은 표면 플라스몬 공명의 사용, 바람직하게는 Biacore® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것이다.
용어 IgG 항체에 대한 "높은 친화도"는 표적 항원에 대하여 1 x 10-7 M 이하, 더 바람직하게는 5 x 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 5 x 10-9 M 이하, 및 더 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하의 KD를 가진 항체를 지칭한다. 하지만, "높은 친화도" 결합은 다른 항체 아이소타입에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, IgM 아이소타입에 대한 "높은 친화도" 결합은 10-6 M 이하, 더 바람직하게는 10-7 M 이하, 더 바람직하게는 10-8 M 이하의 KD를 가진 항체를 지칭한다.
용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예로서, 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류, 및 파충류를 포함하지만, 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소 및 말이 바람직하다.
본 명세서의 다양한 양태는 다음 세부항목에서 더 상세히 기술된다.
항-LAG-3 항체 및 단편
본 명세서는 인간 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3) 단백질에 대한 특이성을 가진 항체 및 단편을 제공한다. LAG-3에 대하여 높은 친화도를 가질 뿐만 아니라 결합에 관련된 다른 원하는 활성을 가진 인간 항체 뿐만 아니라 마우스 및 인간화 항체가 입증된다. 본 명세서의 항체는 항체의 특정한 기능적 특성 또는 성질을 특징으로 한다.
항-LAG-3 항체 및 단편의 예시적 군은 마우스 항체 147H로부터 유래되었다 (표 5 참조). 역돌연변이된 많은 인간화 항체 단편과 함께 예시적 인간화 키메라 항체는 표 6에서 나타난다. 또한, 친화도 성숙화에 기초하여, 개선된 성질을 가진 추가적인 항체 및 단편이 제조되었다 (표 7 및 8). 일부 구체예에서, 인간 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3) 단백질에 대하여 특이성을 갖고 서열 번호:240의 VH CDR1, 서열 번호:241의 VH CDR2, 서열 번호:242의 VH CDR3, 서열 번호:243의 VL CDR1, 서열 번호:244의 VL CDR2, 및 서열 번호:245의 VL CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 이것의 단편이 제공된다.
한 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 CDRH1은 서열 번호:240의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:240으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH2는 서열 번호:241의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:241로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH3은 서열 번호:242의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:242로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL1은 서열 번호:243의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:243으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL2는 서열 번호:244의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:244로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL3은 서열 번호:245의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:245로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
치환이 이루어질 수 있는 아미노산 잔기의 비-제한적 예는 표 8에서 나타난다. 예를 들어, CDRH2에서, 이러한 잔기는 D50, Y52, Y56 및 N58을 포함한다. 바람직한 구체예에서, CDRH2는 선택적으로 다른 치환과 함께 N58V 치환을 포함한다 (예로서, 서열 번호: 347). 또 다른 예에서, CDRH3 치환은 N96, G99 또는 Y102에서 일어난다. 바람직한 구체예에서, CDRH3은 치환 G99K, Y102, 또는 조합을 포함한다 (예로서, 서열 번호: 354). 또 다른 예에서, CDRL3 치환은 A89, N91, 또는 L94에서 일어난다. 바람직한 구체예에서, CHRL3은 치환 N91Y를 포함한다 (예로서, 서열 번호: 374). 한 구체예에서, 항체 또는 단편은 선택적으로 다른 치환과 함께 N58V, G99K, Y102, 및 N91Y 모두를 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 서열 번호:238, 246-259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 및 337로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호:238, 246-259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 및 337로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 서열 번호:239, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 및 338로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호:239, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 및 338로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 중쇄 불변 영역, 경쇄 불변 영역, Fc 영역, 또는 이것들의 조합을 더 포함한다. 일부 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 사슬 불변 영역이다.
제한되는 것이 아니라, 항체 또는 이것의 단편은 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 완전한 인간 항체이다. 한 양태에서, 항체 또는 이것의 단편은 인간화 항체이다.
인간화 항체 또는 단편에 대하여, 특정 역돌연변이가 포함될 수 있다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은, 카바트 넘버링에 따라, 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다:
(a) 위치 71에서 Ala (A),
(b) 위치 69에서 Leu (L),
(c) 위치 66에서 Lys (K),
(d) 위치 67에서 Ala (A),
(e) 위치 48에서 Ile (I),
(f) 위치 37에서 Ile (I),
(g) 위치 38에서 Lys (K),
(h) 위치 91에서 Phe (F), 및
(i) 위치 1에서 Glu (E), 및 이것들의 조합.
일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 위치 71에서 Ala (A)를 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 위치 69에서 Leu (L)을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 위치 66에서 Lys (K)를 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 위치 67에서 Ala (A)를 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 위치 48에서 Ile (I)를 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 위치 37에서 Ile (I)를 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 위치 38에서 Lys (K)를 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 위치 91에서 Phe (F)를 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 위치 1에서 Glu (E)를 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은, 카바트 넘버링에 따라, 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다:
(a) 위치 71에서 Ala (A),
(b) 위치 69에서 Leu (L),
(c) 위치 66에서 Lys (K),
(d) 위치 67에서 Ala (A),
(e) 위치 48에서 Ile (I),
(f) 위치 37에서 Ile (I), 및
(g) 위치 38에서 Lys (K), 및 이것들의 조합. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 상기 나열된 잔기 모두를 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:238의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:238에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:239의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:239에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:246-259로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호:246-259로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:239의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:246의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:246에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:247의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:247에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:248의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:248에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:249의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:249에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:250의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:250에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:251의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:251에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:252의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:252에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:253의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:253에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:254의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:254에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:255의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:255에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:256의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:256에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:257의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:257에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:258의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:258에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:259의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:259에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 이것의 단편은 서열 번호:260의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:260에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
이들 예시의 중쇄 가변 또는 경쇄 가변 영역 중 어느 것에서도, CDR은 표 8에서 예시된 바와 같이 변형될 수 있거나 또는 표 8에서 나타난 바와 같이 예시의 변형된 CDR로 대체될 수 있다.
다양한 구체예에서, 본 명세서의 항체는 본원에서 기술된 바람직한 항체의 아미노산 서열에 대하여 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 항체는 본 명세서의 항-LAG-3 항체의 원하는 기능적 성질을 보유한다. 예를 들어, 항체는 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하고; 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분류 II 분자, 갈렉틴-3 및 LSECtin으로의 LAG-3 결합을 차단하고; 면역 반응을 자극하고; 효과기 세포에 대한 조절 T 세포의 억제 효과를 반전시킨다.
추가적으로, 또는 대안으로, 항체는 상기 논의된 다음의 기능적 성질, 예컨대 인간 LAG-3으로의 높은 친화도 결합, 원숭이 LAG-3으로의 결합, 마우스 LAG-3으로의 결합의 결핍, MHC 분류 II 분자로의 LAG-3의 결합을 억제하는 능력 및/또는 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력 중 하나 이상을 가질 수 있다.
다양한 구체예에서, 항체는, 예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 다른 구체예에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 상기 제시된 서열에 대하여 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성일 수 있다. 상기 제시된 서열의 VH 및 VL 영역에 대하여 높은 (즉, 80% 이상) 상동성을 갖는 VH 및 VL 영역을 가진 항체를 VH 및/또는 VL 아미노산 서열의 핵산의 돌연변이 유발 (예로서, 부위-특이적 또는 PCR-매개된 돌연변이 유발)에 의해 얻은 후 이어서, 본원에서 기술된 기능적 검정을 사용하여 암호화된 변화된 항체를 보유된 기능 (즉, 상기 제시된 기능)에 대하여 테스트하였다.
본원에서 사용된 바와 같이, 두 개의 아미노산 서열 간의 퍼센트 상동성은 두 개의 서열 간의 퍼센트 동일성과 동등하다. 두 개의 서열 간의 퍼센트 동일성은 갭(gap)의 수, 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이며 (즉, %상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 총 # x 100), 두 개의 서열의 최적의 정렬이 도입될 필요가 있다. 두 개의 서열 간의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있으며, 하기 비-제한적 예에서 기술된 바와 같다.
두 개의 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하는 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘 (Comput. Appl. Biosci. 4:11-7, 1988) (이것은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 포함된다)을 사용하여 결정될 수 있다. 이에 더하여, 두 개의 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 중량을 사용한 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-53, 1970) 알고리즘 (이것은 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 포함된다)을 사용하여 결정될 수 있다.
추가적으로, 또는 대안으로, 본 명세서의 단백질 서열은 공용 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위해, 예로서 관련된 서열을 확인하기 위해 "질의 서열(query sequence)"로서 더 사용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)의 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 명세서의 항체 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 =3으로 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭(gapped) 정렬을 얻기 위해서, Gapped BLAST가 Altschul et al. (Nucl. Acid Res. 25(17):3389-402, 1997)에서 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예로서, XBLAST 및 NBLAST)의 기본 파라미터가 유용하다.
일부 구체예에서, 서열 동일성은 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%이다. 일부 구체예에서, 서열 동일성은 10개의 잔기 중 하나, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개, 여덟 개, 아홉 개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 치환은 보존적 치환이다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 업계에 정의되어 있으며, 염기성 측쇄 (예로서, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예로서, 아스파르트산, 글루탐산), 비대전 극성 측쇄 (예로서, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예로서, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예로서, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄 (예로서, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 면역글로불린 폴리펩타이드에서 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 같은 측쇄 패밀리의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 또 다른 구체예에서, 아미노산의 스트링(string)은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 다른 구조적으로 유사한 스트링으로 대체될 수 있다.
보존적 아미노산 치환의 비-제한적 예는 하기 표에서 제공되며, 0 이상의 유사성 점수는 두 개의 아미노산 간의 보존적 치환을 나타낸다.
Figure 112019050671519-pat00001
Figure 112019050671519-pat00002
인간 항체가 또한 본원에서 제조되었다. 인간 항체 또는 단편은 표 2에서 나타난 바와 같이 중쇄 CDR을 포함할 수도 있다. 중쇄 가변 영역의 예는 표 1에서 나타난다. 인간 항체 또는 단편은 표 4에서 나타난 바와 같이 경쇄 CDR을 포함할 수도 있다. 중쇄 가변 영역의 예는 표 3에서 나타난다.
따라서, 한 구체예에서는, 인간 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3) 단백질에 대하여 특이성을 갖고, 중쇄 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 이것의 단편이 제공되며, 여기서 CDRH1은 서열 번호:1 또는 2의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:1 또는 2로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH2는 서열 번호:3 또는 4의 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:3 또는 4로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRH3은 서열 번호:5-45로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:5-45 중 어느 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL1은 서열 번호:46-80으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:46-80 중 어느 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL2는 서열 번호:81-103으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:81-103 중 어느 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하고; CDRL3은 서열 번호:104-139로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환을 가진 서열 번호:104-139 중 어느 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 표 2에서 나타난 조합 중 하나와 같은 세 개의 중쇄 CDR을 포함한다. 예로서, 중쇄는 첫 번째 열에서 나타난 바와 같이 서열 번호: 1의 CDRH1, 서열 번호:3의 CDRH2 및 서열 번호:5의 CDRH3을 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 표 4에서 나타난 조합 중 하나와 같은 세 개의 경쇄 CDR을 포함한다. 예로서, 경쇄는 첫 번째 열에서 나타난 바와 같이 서열 번호: 46의 CDRL1, 서열 번호:81의 CDRL2 및 서열 번호:104의 CDRL3을 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 서열 번호:140-188로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 번호:140-188로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 서열 번호:189-237로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 번호:189-237로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 서열 동일성은 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%이다. 일부 구체예에서, 서열 동일성은 열 개의 잔기 중 하나, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개, 여덟 개, 아홉 개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 치환은 보존적 치환이다.
본 명세서의 항체는 항체의 특정한 기능적 특성 또는 성질을 특징으로 한다. 예를 들어, 항체는 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하고 어떤 다른 종, 예로서, 원숭이 LAG-3, 예로서, 게먹이 원숭이(cynomolgus monkey), 붉은 털 원숭이(rhesus monkey)의 LAG-3에 결합할 수도 있지만, 어떤 다른 종의 LAG-3, 예로서, 마우스 LAG-3에 실질적으로 결합하지 않을 수도 있다. 바람직하게는, 본 명세서의 항체는 높은 친화도로 인간 LAG-3에 결합한다.
항체가 면역 반응, 예컨대 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력은, 예를 들어, 항원-특이적 T 세포 반응에서 항체가 인터류킨-2 (IL-2) 또는 인터페론 감마 (IFN-γ) 생산을 자극하는 능력으로 표시될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 명세서의 항체는 인간 LAG-3에 결합하여 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력을 나타낸다. 다른 구체예에서, 본 명세서의 항체는 인간 LAG-3에 결합하지만 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 능력을 나타내지 않는다. 항체가 면역 반응을 자극하는 능력을 평가하기 위한 다른 수단은 예컨대 생체 내 종양 이식 모델에서 항체가종양 성장을 억제하는 능력 또는 항체가 자가면역 반응을 자극하는 능력, 예컨대 자가면역 모델에서 자가면역 질환의 발달을 촉진하는 능력, 예컨대 NOD 마우스 모델에서 당뇨병의 발달을 촉진하는 능력을 포함한다.
LAG-3으로의 본 명세서의 항체의 결합은 업계에서 잘 확립된 하나 이상의 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서, 항체는 인간 LAG-3을 발현하는 세포주, 예컨대 LAG-3, 예로서, 세포 표면 상에서 인간 LAG-3, 또는 원숭이 LAG-3, 예로서, 붉은 털 또는 게먹이 원숭이 또는 마우스 LAG-3을 발현하도록 트랜스펙션된 CHO 세포와 항체가 반응하는 유동 세포분석 검정에 의해 테스트될 수 있다. 유동 세포분석 검정에서 사용에 적합한 다른 세포는 항-CD3-자극된 CD4+ 활성화된 T 세포를 포함하며, 이것은 천연 LAG-3을 발현한다. 추가적으로, 또는 대안으로, 결합 역학 (예로서, KD 값)을 포함한 항체의 결합은 BIAcore 결합 다른 적합한 결합 검정은, 예를 들어, 재조합 LAG-3 단백질을 사용하는 ELISA 검정을 포함한다. 바람직하게는, 본 명세서의 항체는 5 x 10-8 M 이하의 KD로 LAG-3 단백질에 결합하거나, 2 x 10-8 M 이하의 KD로 LAG-3 단백질에 결합하거나, 5 x 10-9 M 이하의 KD로 LAG-3 단백질에 결합하거나, 4 x 10-9 M 이하의 KD로 LAG-3 단백질에 결합하거나, 3 x 10-9 M 이하의 KD로 LAG-3 단백질에 결합하거나, 2 x 10-9 M 이하의 KD로 LAG-3 단백질에 결합하거나, 125 x 10-9 M 이하의 KD로 LAG-3 단백질에 결합하거나, 5 x 10-10 M 이하의 KD로 LAG-3 단백질에 결합하거나, 또는 1 x 10-10 M 이하의 KD로 LAG-3 단백질에 결합한다.
본 명세서의 바람직한 항체는 [실시예 2-8]에서 기술된 바와 같이 단리되고 구조적으로 특성화된 인간 단클론성 항체 S27, S31, T99, 및 S119이다. S27, S31, T99 및 S119의 VH 아미노산 서열은 각각 서열 번호:149, 서열 번호:150, 서열 번호:158, 및 서열 번호:162에서 나타난다. S27, S31, T99, 및 S119의 VL 아미노산 서열은 각각 서열 번호:198, 서열 번호:199, 서열 번호:207, 및 서열 번호:211에서 나타난다.
이들 항체 각각이 인간 LAG-3에 결합할 수 있다는 점을 고려하면, VH 및 VL 서열은 "혼합되고 매칭되어" 본 명에서의 다른 항-LAG-3 결합 분자를 생성할 수 있다. 바람직하게는, VH 및 VL 사슬이 혼합되어 매칭될 때, 특정 VH/VL 쌍의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체된다. 유사하게, 바람직하게는 특정 VH/VL 쌍의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체된다.
따라서, 한 양태에서, 본 명세서는 다음을 포함하는 단리된 단클론성 항체, 또는 이것의 항원 결합 부분을 제공한다:
(a) 서열 번호: 140-서열 번호:188로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
(b) 서열 번호:189-서열 번호:237로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
여기서 항체는 인간 LAG-3에 특이적으로 결합한다.
바람직한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열 번호:149의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:198의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호:150의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:199의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호:158의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:207의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(d) 서열 번호:162의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:211의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
CDR1 및/또는 CDR2 도메인(들)과는 독립적으로, CDR3 도메인은 단독으로 동족 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정할 수 있고 예상대로 공통의 CDR3 서열을 기초로 같은 결합 특이성을 가진 다수의 항체가 생성될 수 있다는 것은 업계에 널리 공지되어 있다. 예로서, Klimka et al., Brit. J. of Can. 83(2):252-60, 2000; Beiboer et al., J. Mol . Biol. 296:833-49, 2000; Rader et al., PNAS 95:8910-15, 1998; Barbas et al., JACS 116:2161-2, 29914; Barbas et al., PNAS 92:2529-33, 1995; Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-49, 1996; Berezov et al., BIAJournal 8(1): Scientific Review, 2001; Igarashi et al., J. Biochem 117:452-7, 1995; Bourgeois et al., J. Virol. 72:807-10, 1998; Levi et al., PNAS 90:4374-8, 1993; Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-329, 1994; 및 Xu and Davis, Immunity 13:37-45, 2000 참조. 또한 미국 특허 번호 6,951,646; 6,914,128; 6,090,382; 6,818,216; 6,156,313; 6,827,925; 5,833,943; 5,762,905 및 5,760,185 참조. (이들 참고문헌 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다).
따라서, 본 명세서는 인간 또는 비-인간 동물로부터 유래된 항체의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단클론성 항체를 제공하며, 단클론성 항체는 인간 LAG-3에 특이적으로 결합할 수 있다. 어떤 양태 내에서, 본 명세서는 비-인간 항체, 예컨대 마우스 또는 래트 항체의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단클론성 항체를 제공하며, 단클론성 항체는 LAG-3에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예 내에서, 비-인간 항체의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 이러한 본 발명의 항체는 (a) 상응하는 모체 비-인간 항체와 결합에 대하여 경쟁할 수 있고; (b) 기능적 특성을 보유하고; (c) 같은 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 유사한 결합 친화도를 가진다. 다른 양태 내에서, 본 명세서는 인간 항체, 예로서, 비-인간 동물로부터 얻어진 인간 항체의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단클론성 항체를 제공하며, 인간 항체는 인간 LAG-3에 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 양태 내에서, 본 명세서는 제1 인간 항체, 예를 들어, 비-인간 동물로부터 얻은 인간 항체의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단클론성 항체를 제공하며, 제1 인간 항체는 인간 LAG-3에 특이적으로 결합할 수 있고 제1 인간 항체의 CDR3 도메인은 LAG-3에 대한 결합 특이성이 결핍된 인간 항체의 CDR3 도메인을 대체하여 인간 LAG-3에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 인간 항체를 생성한다. 일부 구체예 내에서, 제1 인간 항체의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 이러한 본 발명의 항체는 (a) 상응하는 모체 제1 인간 항체와 결합에 대하여 경쟁할 수 있고; (b) 기능적 특성을 보유하고; (c) 같은 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 유사한 결합 친화도를 가진다.
조작되고 변형된 항체
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화된", "인간화", 등은 인간 FR 및 불변 영역으로의 본원에서 개시된 쥐 단클론성 항체 CDR의 이식을 지칭한다. 하기 논의된 바와 같이, 다양한 항체 성질을 개선하기 위해, 예를 들어, 각각 Kashmiri et al. (Methods, 36(1):25-34, 2005) 및 Hou et al. (J. Biochem. 144(1):115-20, 2008)에서 개시된 방법에 의한 쥐 CDR, 및 인간 FR로의 가능한 추가의 변형이 또한 이들 용어에 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "FR" 또는 "프레임워크 서열"은 FR 1 내지 4 중 어느 하나를 지칭한다. 본 명세서에 포함되는 인간화 항체 및 항원 결합 단편은 FR 1 내지 4 중 어느 하나 이상이 실질적 또는 완전한 인간인, 즉, 실질적 또는 완전한 인간 FR 1 내지 4 개개의 가능한 조합 중 어느 것이라도 존재하는 분자를 포함한다. 예를 들어, 이것은 FR1 및 FR2, FR1 및 FR3, FR1, FR2, 및 FR3, 등이 실질적 또는 완전한 인간인 분자를 포함한다. 실질적 인간 프레임워크는 공지된 인간 생식세포 계열 프레임워크 서열에 대하여 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것들이다. 바람직하게는, 실질적으로 인간 프레임워크는 본원에서 개시된 프레임워크 서열, 또는 공지된 인간 생식세포 계열 프레임워크 서열에 대하여 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진다.
완전한 인간 프레임워크는 공지된 인간 생식세포 계열 프레임워크 서열과 동일한 것들이다. 인간 FR 생식세포 계열 서열은 국제 ImMunoGeneTics (IMGT) 데이터베이스 및 Marie-Paule Lefranc 및 Gerard Lefranc의 The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press, 2001로부터 얻을 수 있다 (이것들의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다).
본 명세서에 포함되는 CDR은 본원에서 구체적으로 개시된 것들 뿐만 아니라, 본원에서 개시된 CDR 서열에 대하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 CDR 서열을 포함한다. 대안으로, 본 명세서에 포함되는 CDR은 본원에서 구체적으로 개시된 것들 뿐만 아니라, 본원에서 개시된 CDR 서열과 비교하여 상응하는 위치에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변화를 가진 CDR 서열을 포함한다. 이러한 서열이 동일하거나, 또는 아미노산이 변형된 CDR은 바람직하게는 온전한 항체에 의해 인식되는 항원에 결합한다.
본원에서 개시된 것들 외에도 본 명세서에 따라 유사한 기능적 성질을 나타내는 인간화 항체는 여러 상이한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. Almagro et al. (Front. Biosci., Humanization of antibodies Jan 1(13):1619-33, 2008). 한 접근법에서, 모체 항체 화합물 CDR은 모체 항체 화합물 프레임워크와 높은 서열 동일성을 가진 인간 프레임워크로 이식된다. 새로운 프레임워크의 서열 동일성은 모체 항체 화합물의 상응하는 프레임워크의 서열과 일반적으로 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일할 것이다. 100개 미만의 아미노산 잔기를 가진 프레임워크의 경우에, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다. 이 이식은 모체 항체와 비교하여 결합 친화도의 감소를 유발할 수도 있다. 이 경우에, 프레임워크는 Queen et al. (PNAS 88:2869, 1991)에 의해 개시된 구체적인 기준에 따라 특정 위치에서 모체 프레임워크로 역돌연변이될 수 있다. 상동성 및 역돌연변이를 기초로 인간화 변종을 생성하는데 유용한 방법을 기술한 추가적인 참고문헌은 Olimpieri et al. (Bioinformatics Feb 1;31(3):434-5, 2015) 및 미국 특허 번호 4,816,397, 5,225,539, 및 5,693,761; 및 Winter와 동료들의 방법 (Jones et al., Nature 321:522-5, 1996; Riechmann et al., Nature 332:323-7, 1988; 및 Verhoeyen et al., Science 239:1534-6, 1988)에 기술된 것을 포함한다.
본 명세서의 항체는, 예를 들어, 표준 ELISA에 의해 인간 LAG-3로의 결합에 대하여 테스트될 수 있다. 항-LAG-3 인간 IgG 항체는 웨스턴 블롯팅에 의해 LAG-3 항원과의 반응성에 대하여 더 테스트될 수 있다. 본 명세서의 항체의 결합 특이성은 또한 LAG-3 단백질을 발현하는 세포로의 항체의 결합을 모니터링함으로써, 예로서, 유동 세포분석법에 의해 결정될 수 있다. 이들 방법은 업계에 공지되어 있다. 예로서, 상기 인용된 Harlow and Lane (1988) 참조.
이기능적 분자
본 명세서의 항체는 치료제에 컨쥬게이션되어 면역컨쥬게이트, 예컨대 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)를 형성할 수 있다. 적합한 치료제는 항대사성물질, 알킬화제, DNA 마이너 그루브(minor groove) 바인더, DNA 삽입제, DNA 가교제, 히스톤 데아세틸라제 억제자, 핵 배출(nuclear export) 억제자, 프로테아솜 억제자, 토포아이소머라제 I 또는 II 억제자, 열 충격 단백질 억제자, 타이로신 키나제 억제자, 항생제, 및 세포분열억제제를 포함한다. ADC에서, 항체 및 치료제는 바람직하게는 분열 가능한 링커, 예컨대 펩티딜, 이황화, 또는 하이드라존 링커를 통해 컨쥬게이션된다. 더 바람직하게는, 링커는 펩티딜 링커, 예컨대 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, 또는 Glu이다. ADC는 미국 특허 번호 7,087,600; 6,989,452; and 7,129,261; PCT 공보 WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; 및 WO 08/103693; 미국 특허 공보 20060024317;20060004081; 및 20060247295에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다 (이것들의 개시물은 본원에 참고로 포함된다).
또 다른 양태에서, 본 명세서는 적어도 두 개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성하기 위해 적어도 하나의 다른 기능적 분자, 예로서, 또 다른 펩타이드 또는 단백질 (예로서, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 결합된 항-LAG-3 항체를 포함하는 이중특이적 분자를 특징으로 한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "이중특이적 분자"는 셋 이상의 특이성을 가진 분자를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이중특이적 분자는 LAG-3에 대한 제1 결합 특이성 및 LAG-3을 발현하는 표적 세포를 사멸시킬 수 있는 세포독성 효과기 세포를 모집하는 촉발 분자에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다. 적합한 촉발 분자의 예는 CD64, CD89, CD16, 및 CD3이다. 예로서, Kufer et al., Trends in Biotech. 22(5):238-44, 2004 참조.
한 구체예에서, 이중특이적 분자는 항-Fc 결합 특이성 및 항-LAG-3 결합 특이성에 더하여 제3 특이성을 갖는다. 제3 특이성은 항-향상 인자 (EF), 예로서, 세포독성 활성에 수반된 표면 단백질에 결합하며 이로써 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자에 대한 것일 수 있다. 예를 들어, 항-향상 인자는 세포독성 T 세포 (예로서 CD2, CD3, CDS, CD28, CD4, CD40, 또는 ICAM-1을 통해), 다른 면역 조절 분자 (예로서 via PD-1, PD-L1, CTLA-4, CD122, 4-1BB, TIM3, OX-40, OX40L, CD40L, LIGHT, ICOS, ICOSL, GITR, GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM, BTLA, KIR, CD47 또는 CD73) 또는 다른 면역 세포에 결합하여, 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
면역 수용체 조절자로서, LAG-3에 특이적인 항체 또는 항원-결합 단편은 종양 항원에 특이적인 제2 항원-결합 단편과 조합되어 이중특이적 항체를 생성할 수 있다. "종양 항원"은 종양 세포에서 생산된 항원성 물질이며, 즉, 그것은 숙주에서 면역 반응을 촉발시킨다. 종양 항원은 종양 세포를 확인하는데 유용하고 암 치료에 사용을 위한 잠재적 후보물질이다. 신체 내 정상 단백질은 항원성이 아니다. 하지만, 특정 단백질은 종양 형성 중에 생산되거나 과발현되며 따라서 신체에 대하여 "외래의" 것으로 보인다. 이것은 면역계로부터 격리된 정상 단백질, 보통 극소량으로 생산되는 단백질, 보통 발달의 특정 단계에서만 생산되는 단백질, 또는 돌연변이로 인해 구조가 변형된 단백질을 포함한다.
종양 항원의 풍부함은 업계에 공지되어 있고 새로운 종양 항원은 스크리닝에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 종양 항원의 비-제한적 예는 EGFR, Her2, EpCAM, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, CD73, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, CIX, PSMA, 폴레이트-결합 단백질, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR, 인테그린, aVb3, a5b1, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP 및 테나신을 포함한다.
일부 양태에서, 1가 유닛은 상응하는 비-종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 과발현되는 단백질에 대하여 특이성을 갖는다. "상응하는 비-종양 세포"는 본원에서 사용된 바와 같이 종양 세포의 기원과 같은 세포 유형인 비-종양 세포를 지칭한다. 이러한 단백질은 종양 항원과 반드시 상이할 필요는 없다. 비-제한적 예는 대부분의 결장, 직장, 유방, 폐, 췌장 및 위장관 암종에서 과발현되는 암 배아 항원 (CEA); 유방, 난소, 결장, 폐, 전립선 및 자궁경부암에서 종종 과발현되는 헤레굴린 수용체 (HER-2, neu 또는 c-erbB-2); 유방, 두경부, 비-소세포 폐 및 전립선의 종양을 포함하는 다양한 고체 종양에서 고도로 발현되는 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 아시알로당단백질 수용체; 트랜스페린 수용체; 간 세포에서 발현되는 세르핀 효소 복합체 수용체; 췌장관 선암종 세포에서 과발현되는 섬유아세포 성장 인자 수용체 (FGFR); 항-혈관 형성 유전자 요법에 대한 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR); 비뮤신 난소 암종 중 90%에서 선택적으로 과발현되는 폴레이트 수용체; 세포 표면 글리코칼릭스; 탄수화물 수용체; 및 호흡 상피 세포로의 유전자 전달에 유용하고 낭포성 섬유증(Cystic Fibrosis)과 같은 폐 질환의 치료에 매력적인 폴리머 면역글로불린 수용체를 포함한다. 이 점에 있어서 이중특이성의 비-제한적 예는 LAG-3/EGFR, LAG-3/Her2, LAG-3/CD33, LAG-3/CD133, LAG-3/CEA 및 LAG-3/VEGF를 포함한다.
상이한 포맷의 이중특이적 항체가 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 항-LAG-3 단편 및 제2 단편 각각은 Fab 단편, 단일-사슬 가변 단편 (scFv), 또는 단일-도메인 항체로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 Fc 단편을 더 포함한다.
단지 항체 또는 항원 결합 단편만을 포함하는 것이 아닌 이기능적 분자가 또한 제공된다. 종양 항원 표적화 분자로서, 본원에서 기술된 것들과 같이 LAG-3에 특이적인 항체 또는 항원-결합 단편은 선택적으로 펩타이드 링커를 통해 면역 사이토카인 또는 리간드와 조합될 수 있다. 결합된 면역 사이토카인 또는 리간드는 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, GM-CSF, TNF-a, CD40L, OX40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, LIGHT 및 GITRL을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 이기능적 분자는 면역 체크포인트 차단 효과를 종양 부위 국소 면역 조절과 조합할 수 있다.
이중특이적 분자는 많은 상이한 포맷 및 크기로 되어있을 수 있다. 크기 스펙트럼의 한 단부에서, 이중특이적 분자는, 동일한 특이성의 두 개의 결합 아암을 갖는 대신에, 각각 상이한 특이성을 가진 두 개의 결합 아암을 갖는다는 점을 제외하면, 전통적인 항체 포맷을 보유한다. 다른 쪽 극단에서는 펩타이드 사슬에 의해 결합된 두 개의 단일-사슬 항체 단편 (scFv)으로 구성된, 소위 Bs(scFv)2 구조의 이중특이적 분자가 존재한다. 중간 크기 이중특이적 분자는 펩티딜 링커에 의해 결합된 두 개의 상이한 F(ab) 단편을 포함한다. 이들 및 그 밖의 포맷의 이중특이적 분자는 유전적 조작, 체세포 혼성체화, 또는 화학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 예로서, Kufer et al., supra; Cao and Suresh, Bioconjugate Chem. 9(6):635-44, 1988; 및 van Spriel et al., Immunol. Today 21(8):391-7, 2000; 및 그 안에서 인용된 참고문헌 참조.
약학적 조성물
또 다른 양태에서, 본 명세서는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제제화된 본 명세서의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 그것은 선택적으로 하나 이상의 추가적인 약학적 활성 성분, 예컨대 또 다른 항체 또는 약물을 함유할 수도 있다. 본 명세서의 약학적 조성물은 또한, 예를 들어, 또 다른 면역자극제, 항암제, 항바이러스제, 또는 백신과 조합 요법으로 투여될 수 있으며, 이로써 항-LAG-3 항체가 백신에 대한 면역 반응을 향상시킨다.
약학적 조성물은 임의의 수의 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 담체, 표면 활성제, 점증제 또는 에멀젼화제, 고체 바인더, 분산 또는 현탁 보조제, 가용화제, 착색제, 착향제, 코팅제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장화제, 및 이것들의 조합을 포함한다. 적합한 부형제의 선택 및 사용은 Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)에서 교시되어 있다 (이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다). 바람직하게는, 약학적 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 상피 투여 (예로서, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 산의 작용 및 그것을 비활성화시킬 수도 있는 그 밖의 천연 조건으로부터 그것을 보호하기 위한 재료로 코팅될 수 있다. 구절 "비경구 투여"는 본원에서 사용된 바와 같이, 보통은 주사에 의한, 장 및 국부적 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 제한되는 것이 아니라, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관경, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안으로, 본 명세서의 항체는 비-비경구 경로를 통해, 예컨대 국부적, 상피 또는 점막 투여 경로, 예로서, 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
본 명세서의 약학적 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 되어있을 수 있다. "약학적으로 허용 가능한 염"은 모체 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하지만 어떠한 원치않는 독성학적 효과도 제공하지 않는 염을 지칭한다. 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등, 뿐만 아니라 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 다이카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록실 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰산 등으로부터 유래된 것들을 포함한다. 염기 추가 염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것들을 포함한다.
약학적 조성물은 멸균 수성 용액 또는 분산제의 형태로 되어있을 수 있다. 그것들은 또한 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 그 밖의 순차적 구조로 제제화될 수 있다.
담체 재료와 조합되어 단일 투약 형태를 생산할 수 있는 활성 성분의 양은 치료 중인 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 다를 것이고 일반적으로는 치료적 효과를 생산하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로는, 100 퍼센트 중에서, 이 양은 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 약 0.01% 내지 약 99 퍼센트 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 더 바람직하게는 약 1% 내지 약 30% 활성 성분의 범위에 있을 것이다.
투약 양생법은 최적의 원하는 반응 (예로서, 치료적 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스(bolus)가 투여될 수 있거나, 여러 분할된 용량이 시간이 흐름에 따라 투여될 수 있거나 또는 용량은 치료적 상황의 긴급 사태로 나타난 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제제화하는 것이 투여의 용이함 및 투약량의 균일성을 위해 특히 유리하다. 투약 단위 형태는 본원에서 사용된 바와 같이 일원화된 투약으로서 처리되는 대상체에게 적합한 물리적으로 별개의 유닛을 지칭한다; 각각의 유닛은 필요한 약학적 담체와 관련된 원하는 치료적 효과를 생산하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유한다. 대안으로, 항체는 지효성 제제로서 투여될 수 있으며, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다.
항체의 투여를 위해, 투약량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100mg/kg, 및 더 일반적으로는 0.01 내지 5 mg/kg의 범위에 있다. 예를 들어 투약량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg의 범위 내에 있을 수 있다. 예시적 처리 양생법은 주 1회, 2주 1회, 3주 1회, 4주 1회, 월 1회, 3월 1회 또는 3 내지 6월 1회 투여를 수반한다. 본 명세서의 항-LAG-3항체에 대하여 바람직한 투약 양생법은 정맥내 투여를 통한 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함하며, 항체는 다음 투약 스케쥴 중 하나를 사용하여 제공된다: (i) 6회 투약에 대하여 4주마다, 이후 3월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3 mg/kg 체중으로 1회, 이후 3주마다 1 mg/kg 체중. 몇몇 방법에서, 투약량은 약 1-1000 μg/mL의 혈장 항체 농도 및 몇몇 방법에서는 약 25-300 μg/mL를 달성하도록 조정된다.
본 명세서의 항-LAG-3 항체의 "치료적 유효 투약량"은 바람직하게는 질환 증상의 심각도의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 드묾 및 기간의 증가, 또는 질병의 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 유발한다. 예를 들어, 종양을 가지고 있는 대상체의 치료를 위해, "치료적 유효 투약량"은 바람직하게는 미처리 대상체에 비해 적어도 약 20%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 및 더 바람직하게는 적어도 약 80%만큼 종양 성장을 억제한다. 치료적 화합물의 치료적 유효량은 종양 크기를 감소시키거나, 그렇지 않으면 전형적으로 인간이거나 또는 또 다른 포유동물일 수 있는 대상체의 증상을 개선할 수 있다.
약학적 조성물은 이식물, 경피 패치, 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어된 방출 제제일 수 있다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스터, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 예로서, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 참조.
치료적 조성물은 의료 디바이스, 예컨대 (1) 무바늘 피하 주사 디바이스 (예로서, 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335;5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 및 4,596,556); (2) 마이크로-주입 펌프 (미국 특허 번호 4,487,603); (3) 경피 디바이스 (미국 특허 번호 4,486,194); (4) 주입 장치 (미국 특허 번호 4,447,233 및 4,447,224); 및 (5) 삼투 디바이스 (미국 특허 번호 4,439,196 및 4,475,196)를 통해 투여될 수 있다 (이것의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다).
특정 구체예에서, 본 명세서의 인간 단클론성 항체는 생체 내에서 적절한 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 치료적 화합물이 혈관-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 통과한다는 것을 보장하기 위해서, 그것들은 리포솜에서 제제화될 수 있으며, 이것은 특이적 세포 또는 기관으로의 선택적 수송을 향상시키기 위한 추가적으로 표적화 모이어티를 포함할 수도 있다. 예로서, 미국 특허 번호 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; 및 5,399,331; V.V. Ranade, J. Clin. Pharmacol. 29:685, 1989; Umezawa et al., (1988) Biochem . Biophys . Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBSLett . 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob . Agents Chemother . 39:180; Briscoe etal . (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994) J. Biol . Chern . 269:9090;Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett . 346:123; 및 Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273 참조.
사용 및 방법
본 명세서의 항체, 항체 조성물 및 방법은, 예를 들어, LAG-3의 검출 또는 LAG-3의 차단에 의한 면역 반응의 향상을 수반한 많은 시험관 내 및 생체 내 유용성을 갖고 있다. 바람직한 구체예에서, 본 명세서의 항체는 인간 항체이다. 예를 들어, 이들 분자는 시험관 내 또는 생체 외부에서 배양 중인 세포에, 또는, 예로서, 생체 내에서 인간 대상체에게 투여되어 다양한 상황에서 면역력을 향상시킬 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본 명세서는 대상체의 면역 반응을 변형시키는 방법을 제공하며 대상체의 면역 반응이 변형되도록 본 명세서의 항체, 또는 이것의 항원-결합 부분을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 반응이 향상되거나, 자극되거나 또는 상향조절된다.
바람직한 대상체는 면역 반응의 향상이 필요한 인간 환자를 포함한다. 방법은 면역 반응 (예로서, T-세포 매개된 면역 반응)을 증가시킴으로써 치료될 수 있는 장애를 가진 인간 환자를 치료하는데 특히 적합하다. 특정 구체예에서, 방법은 생체 내에서 암의 치료에 특히 적합하다. 면역력의 항원-특이적 향상을 달성하기 위해서, 항-LAG-3 항체는 관심있는 항원과 함께 투여될 수 있거나 또는 항원은 처리되는 대상체 (예로서, 종양 함유 또는 바이러스-함유 대상체)에 이미 존재할 수도 있다. LAG-3에 대한 항체가 또 다른 작용제와 함께 투여될 때, 둘은 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 명세서는 샘플에서 인간LAG-3 항원의 존재를 검출하거나, 또는 인간 LAG-3 항원의 양을 측정하는 방법을 더 제공하며, 항체 또는 이것의 일부와 인간 LAG-3 간의 복합체 형성을 허용하는 조건 하에서 샘플, 및 대조군 샘플을 인간 LAG-3에 특이적으로 결합하는 인간 단클론성 항체, 또는 이것의 항원 결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함한다. 그 다음에 복합체의 형성이 검출되며, 대조군 샘플과 비교하여 샘플 간의 복합체 형성의 차이는 샘플 내 인간 LAG-3 항원의 존재를 나타낸다. 더욱이, 본 명세서의 항-LAG-3 항체는 면역친화도 정제를 통해 인간 LAG-3를 정제하는데 사용될 수 있다.
본 명세서의 항-LAG-3 항체가 MHC 분류 II 분자로의 LAG-3의 결합을 억제하고 항원-특이적 T 세포 반응을 자극할 수 있는 능력을 고려하여, 본 명세서는 또한 시험관 내에서 및 생체 내에서 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하거나, 향상시키거나 또는 상향조절하기 위해 본 명세서의 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서는 항원-특이적 T 세포 반응을 자극하는 방법을 제공하며 항원-특이적 T 세포 반응이 자극되도록 상기 T 세포를 본 명세서의 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 항원-특이적 T 세포 반응의 임의의 적합한 지표가 항원-특이적 T 세포 반응을 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 적합한 지표의 비-제한적 예는 항체의 존재 하에서 증가된 T 세포 증식을 포함하고 및/또는 항체의 존재 하에서 사이토카인 생산을 증가시킨다. 바람직한 구체예에서, 항원 특이적 T 세포에 의한 인터류킨-2 생산이 자극된다.
본 명세서는 또한 대상체의 면역 반응 (예로서, 항원-특이적 T 세포 반응)을 자극하는 방법을 제공하며 대상체의 면역 반응 (예로서, 항원-특이적 T 세포 반응)이 자극되도록 대상체에게 본 명세서의 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 대상체는 종양-함유 대상체이고 종양에 대한 면역 반응이 자극된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 대상체는 바이러스-함유 대상체이고 바이러스에 대한 면역 반응이 자극된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서는 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하며 대상체에서 종양의 성장이 억제되도록 본 명세서의 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 명세서는 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공하며 대상체에서 바이러스 감염이 치료되도록 본 명세서의 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서의 이들 및 다른 방법은 하기 더 상세히 논의된다.
암
항체에 의한 LAG-3의 차단은 환자에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 한 양태에서, 본 명세서는 암성 종양의 성장이 억제되도록 생체 내에서 항-LAG-3 항체를 사용한 대상체의 치료에 관한 것이다. 항-LAG-3 항체는 단독으로 암성 종양의 성장을 억제하는데 사용될 수 있다. 대안으로, 항-LAG-3 항체는 하기 기술된 바와 같이 다른 면역원성 작용제, 표준 암 치료, 또는 그 밖의 항체와 함께 사용될 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 본 명세서는 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공하며, 항-LAG-3 항체, 또는 이것의 항원-결합 부분의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 인간 항-LAG-3 항체 (예컨대 본원에서 기술된 인간 항-인간 LAG-3 항체 중 어느 것)이다. 추가적으로 또는 대안으로, 항체는 키메라 또는 인간화 항-LAG-3 항체일 수 있다.
본 명세서의 항체를 사용하여 성장이 억제될 수도 있는 바람직한 암은 전형적으로 면역요법에 반응성인 암을 포함한다. 치료를 위해 바람직한 암의 비-제한적 예는 흑색종 (예로서, 전이성 악성 흑색종), 신장암 (예로서 투명 세포 암종), 전립선암 (예로서, 호르몬 난치성 전립선 선암종), 유방암, 결장암 및 폐암 (예로서, 비-소세포 폐암)을 포함한다. 추가적으로, 본 명세서는 본 명세서의 항체를 사용하여 억제될 수 있는 난치성 또는 재발성 악성 종양을 포함한다. 본 명세서의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 암의 예는 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위암, 고환암, 나팔관 암종, 자궁 내막 암종, 자궁 경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨 질환(Hodgkin's Disease), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 예컨대 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 소아 고체 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 수뇨관암, 신우 암종, 중추신경계 (CNS) 신생물 형성, 원발성 CNS 림프종, 종양 형성, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체선종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 유표피암, 편평세포암, T-세포 림프종, 환경적으로 유도된 암, 예컨대 석면에 의해 유도된 것들, 및 상기 암들의 조합을 포함한다. 본 명세서는 또한 전이성 암, 특히 PD-L1을 발현하는 전이성 암의 치료에 유용하다 (Iwai et al. (2005) Int . Immunol . 17:133-144).
선택적으로, LAG-3에 대한 항체는 면역원성 작용제, 예컨대 암성 세포, 정제된 종양 항원 (재조합 단백질, 펩타이드, 및 탄수화물 분자 포함), 세포, 및 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 유전자로 트랜스펙션된 세포와 조합될 수 있다 (He et al (2004) J. Immunol . 173:4919-28). 사용될 수 있는 종양 백신의 비-제한적 예는 흑색종 항원의 펩타이드, 예컨대 gp100, MAGE 항원, Trp-2, MARTI 및/또는 타이로시나제의 펩타이드, 또는 사이토카인 GM-CSF를 발현하도록 트랜스펙션된 종양 세포 (하기 더 논의됨)를 포함한다.
인간에서, 몇몇 종양, 예컨대 흑색종은 면역원성인 것으로 나타났다. LAG-3 차단에 의한 T 세포 활성화의 역가를 높입으로써, 숙주의 종양 반응이 활성화될 수 있다.
LAG-3 차단은 백신 접종 프로토콜과 조합될 때 더 효율적일 가능성이 크다. 종양에 대한 백신 접종을 위한 많은 실험 계획이 고안되었다 (Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring:300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000,ASCO Educational Book Spring: 730-738 참조; 또한 Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition 참조). 이들 계획 중 하나에서, 백신은 자가조직 또는 동종이계 종양 세포를 사용하여 제조된다. 이들 세포 백신은 종양 세포가 GM-CSF를 발현하도록 형질도입될 때 가장 효과적인 것으로 나타났다. GM-CSF는 종양 백신 접종을 위한 항원 제공의 강력한 활성화제인 것으로 나타났다 (Dranoff et al. (1993) Proc . Natl . Acad . Sci U.S.A . 90: 3539-43).
다양한 종양에서 유전자 발현 및 대규모 유전자 발현 패턴의 연구는 소위 종양 특이적 항원의 정의로 이어졌다 (Rosenberg, SA (1999) Immunity 10: 281-7). 많은 경우에, 이들 종양 특이적 항원은 종양 및 종양이 발생한 세포에서 발현되는 분화 항원, 예를 들어 멜라닌 세포 항원 gp100, MAGE 항원, 및 Trp-2이다. 더 중요하게는, 이들 항원들 중 다수는 숙주에서 발견된 종양 특이적 T 세포의 표적인 것으로 나타날 수 있다. LAG-3 차단은 이들 단백질에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 종양에서 발현된 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 수거와 함께 사용될 수 있다. 이들 단백질은 일반적으로 면역계에 의해 자가 항원으로 간주되며 그러므로 그것들에 대하여 내성이다. 종양 항원은 염색체의 텔로미어의 합성에 필요하고 85%를 초과하는 인간 암에서 및 제한된 수의 체조직에서만 발현되는 단백질 텔로머라제를 포함할 수 있다 (Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013). (이들 체조직은 다양한 수단에 의해 면역 공격으로부터 보호될 수도 있다). 종양 항원은 또한 두 개의 무관한 서열 (즉, Philadelphia 염색체의 bcr-abl), 또는 B 세포 종양의 이디오타입(idiotype) 사이에서 단백질 서열을 변화시키거나 융합 단백질을 생성하는 체세포 돌연변이 때문에 암 세포에서 발현되는 "신항원(neo-antigen)"일 수 있다.
그 밖의 종양 백신은 인간 암에 관련된 바이러스, 예컨대 인간 파필로마 바이러스 (Human Papilloma Virus; HPV), 간염 바이러스 (HBV 및 HCV) 및 카포시 헤르페스 육종 바이러스 (Kaposi's Herpes Sarcoma Virus; KHSV)의 단백질을 포함할 수 있다. LAG-3 차단과 함께 사용될 수 있는 또 다른 형태의 종양 특이적 항원은 종양 조직 자체로부터 단리된 정제된 열 충격 단백질 (HSP)이다. 이들 열 충격 단백질은 종양 세포의 단백질의 단편을 함유하고 이들 HSP는 종양 면역력을 유도하기 위해 항원 제공 세포로 전달시 고도로 효율적이다 (Suot & Srivastava (1995) Science269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Science 278:117-120).
수지상세포 (DC)는 항원-특이적 반응을 프라이밍(prime)하는데 사용될 수 있는 강력한 항원 제공 세포이다. DC는 생체 외부에서 생산되고 다양한 단백질 및 펩타이드 항원 뿐만 아니라 종양 세포 추출물을 풍부하게 함유할 수 있다 (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). DC는 또한 이들 종양 항원을 발현하기 위해 유전적 수단에 의해 형질도입될 수 있다. DC는 또한 면역화의 목적을 위해 종양 세포에 직접적으로 융합되었다 (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6: 332-336). 백신 접종의 방법으로서, DC 면역화는 더 강력한 항-종양 반응을 활성화시키기 위해 LAG-3 차단과 효과적으로 조합될 수 있다.
LAG-3 차단은 또한 표준 암 치료와 조합될 수 있다. LAG-3 차단은 화학치료적 양생법과 효과적으로 조합될 수 있다. 이들 경우에는, 투여되는 화학치료제의 용량을 감소시키는 것이 바람직할 수도 있다 (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). 이러한 조합의 예는 흑색종의 치료를 위해 데카르바진과 조합된 항-LAG-3 항체이다. 이러한 조합의 또 다른 예는 흑색종의 치료를 위해 인터류킨-2 (IL-2)와 조합된 항-LAG-3항체이다. LAG-3 차단 및 화학요법의 조합된 사용의 과학적인 근거는 대부분의 화학치료적 화합물의 세포독성 작용의 결과인 세포 사멸이 항원 제공 경로에서 종양 항원의 수준의 증가를 초래해야 한다는 것이다. 세포 사멸을 통해 LAG-3 차단과의 시너지 효과를 유발할 수 있는 그 밖의 조합 요법은 방사선, 수술, 및 호르몬 박탈이다. 이들 프로토콜 각각은 숙주에서 종양 항원의 공급원을 생성한다. 혈관 형성 억제자는 또한 LAG-3 차단과 조합될 수 있다. 혈관 형성의 억제는 종양 항원을 숙주 항원 제공 경로로 공급할 수 있는 종양 세포 사멸을 유도한다.
LAG-3 차단 항체는 또한 Fca 또는 Fey 수용체-발현 효과기 세포를 종양 세포로 표적화하는 이중특이적 항체와 조합하여 사용될 수 있다 (예로서, 미국 특허 번호 5,922,845 및 5,837,243 참조). 이중특이적 항체는 두 개의 별도의 항원을 표적화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-Fc 수용체/항-종양 항원 (예로서, Her-2/neu) 이중특이적 항체는 대식세포를 종양의 부위로 표적화하는데 사용되었다. 이 표적화는 더 효과적으로 종양 특이적 반응을 활성화시킬 수도 있다. 이들 반응의 T 세포 아암은 LAG-3 차단의 사용에 의해 증가될 것이다. 대안으로, 항원은 종양 항원 및 수지상세포 특이적 세포 표면 마커에 결합하는 이중특이적 항체의 사용에 의해 DC에 직접 전달될 수 있다.
종양은 다양한 메커니즘에 의해 숙주 면역 감시를 회피한다. 이들 메커니즘 중 다수는 종양에 의해 발현되고 면역억제성인 단백질의 비활성화에 의해 극복될 수 있다. 이것들은 다른 것들 중에서도 TGF-β (Kehrl etal . (1986) J. Exp . Med . 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), 및 Fas 리간드 (Hahne et al. (1996) Science 4: 1363-1365)를 포함한다. 이들 실체물 각각에 대한 항체는 면역억제제의 효과를 상쇄하고 숙주에 의한 종양 면역 반응을 촉진하도록 항-LAG-3와 조합하여 사용될 수 있다.
숙주 면역 반응성을 활성화시키는 그 밖의 항체는 항-LAG-3 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 이것들은 DC 기능 및 항원 제공을 활성화시키는 수지상세포의 표면 상의 분자를 포함한다. 항-CD40 항체는 T 세포 헬퍼(helper) 활성을 효과적으로 대체할 수 있고 (Ridge et al. (1998) Nature 393: 474-478) LAG-3 항체와 함께 사용될 수 있다 (Ito et al. (2000) Immunobiology201 (5) 527-40). T 세포 동시자극 분자, 예컨대 CTLA-4 (예로서, 미국 특허 번호 5,811,097), OX-40 (Weinberg et al. (2000) Immunol . 164:2160-2169), 4-1BB (Melero et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997), 및 ICOS (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 262-266)에 대한 항체의 활성화는 또한 T 세포 활성화의 수준의 증가를 제공할 수도 있다.
골수 이식은 현재 조혈성 기원의 다양한 종양을 치료하는데 사용되고 있다. 이식편대숙주병이 이 치료의 결과인 한편, 이식편 대 종양 반응으로부터 치료적 이점을 얻을 수도 있다. LAG-3 차단은 공여체 이식된 종양 특이적 T 세포의 효과를 증가시키는데 사용될 수 있다.
또한 종양에 대한 항원-특이적 T 세포를 자극하기 위해 항원 특이적 T 세포의 생체 외부 활성화 및 확장 및 이들 세포의 수령체로의 입양 전달(adoptive transfer)을 수반하는 여러 실험적 처리 프로토콜이 존재한다 (Greenberg &Riddell (1999) Science 285: 546-51). 이들 방법은 또한 감염원, 예컨대 CMV에 대한 T 세포 반응을 활성화시키는데 사용될 수 있다. 항-LAG-3 항체의 존재 하에 세포 외부 활성화는 입양 전달된 T 세포의 빈도 및 활성을 증가시킬 수 있다.
세포 요법, 및 더 구체적으로는 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포 요법이 또한 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서의 항-LAG-3 항체와 접촉된 (또는 대안으로 본 명세서의 항-LAG-3 항체를 발현하도록 조작된) 적합한 T 세포가 사용될 수 있다. 이러한 접촉 또는 조작시, T 세포는 치료가 필요한 암 환자로 도입될 수 있다. 암 환자는 본원에서 개시된 바와 같이 어떤 유형의 암에 걸릴 수도 있다. T 세포는, 제한되는 것이 아니라, 예로서, 종양-침윤성 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이것들의 조합일 수 있다.
일부 구체예에서, T 세포는 암 환자 자신으로부터 단리되었다. 일부 구체예에서, T 세포는 공여체에 의해 또는 세포 은행으로부터 제공되었다. T 세포가 암 환자로부터 단리될 때, 원치않는 면역 반응은 최소화될 수 있다.
감염성 질환
특정 독소 또는 병원체에 노출된 환자를 치료하기 위해 본 명세서의 다른 방법이 사용된다. 따라서, 본 명세서의 또 다른 양태는 대상체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 대상체가 감염성 질환에 대하여 치료되도록 항-LAG-3 항체, 또는 이것의 항원-결합 부분을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 인간 항-인간 LAG-3 항체 (예컨대 본원에서 기술된 인간 항-LAG-3 항체 중 어느 것)이다. 추가적으로 또는 대안으로, 항체는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다.
상기 논의된 종양에 대한 적용과 유사하게, 항체 매개된 LAG-3 차단은 병원체, 독소, 및 자가항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 단독으로, 또는 보조제로서 백신과 조합하여 사용될 수 있다. 이 치료적 접근이 특히 유용할 수 있는 병원체의 예는 현재 효과적인 백신이 없는 병원체, 또는 통상적인 백신이 충분히 효과적이지 않은 병원체를 포함한다. 이것들은 HIV, 간염 (A, B, & C), 인플루엔자, 헤르페스(herpes), 지아르디아(Giardia), 말라리아(Malaria), 리슈마니아(Leishmania), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. LAG-3 차단은 감염 과정에 걸쳐 변화된 항원을 제공하는 HIV와 같은 감염원에 의해 확립된 감염에 대하여 특히 유용하다. 이들 새로운 에피토프는 항-인간 LAG-3 투여시 외래의 것으로 인식되며, 따라서 LAG-3을 통한 음의 신호에 의해 약화되지 않는 강력한 T 세포 반응을 유발한다.
본 명세서의 방법으로 치료 가능한 감염을 유발하는 병원성 바이러스의 몇몇 예는 HIV, 간염 (A, B, 또는 C), 헤르페스 바이러스 (예로서, VZV, HSV-1,HAV-6, HSV-11, 및 CMV, 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus)), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파르보바이러스, 우두 바이러스, HTL-V 바이러스, 뎅구 바이러스(dengue virus), 유두종 바이러스, 연속종 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스성 뇌염 바이러스(arboviral encephalitis virus)를 포함한다.
본 명세서의 방법으로 치료 가능한 감염을 유발하는 병원성 박테리아의 몇몇 예는 클라미디아(chlamydia), 리케챠 박테리아(rickettsial bacteria), 마이코박테리아, 포도상구균(staphylococci), 연쇄상구균(streptococci), 폐렴쌍구균(pneumonococci), 수막염균(meningococci) 및 임균(gonococci), 클레브시엘라(klebsiella), 프로테우스(proteus), 세라티아(serratia), 슈도모나스(pseudomonas), 레지오넬라(legionella), 디프테리아(diphtheria), 살모넬라(salmonella), 바실루스(bacilli), 콜레라(cholera), 파상풍(tetanus), 보툴리즘(botulism), 탄저병(anthrax), 역병(plague), 렙토스피라증(leptospirosis), 및 라임병 박테리아를 포함한다.
본 명세서의 방법으로 치료 가능한 감염을 유발하는 병원성 균류의 몇몇 예는 칸디다 알비칸스(Candida albicans) (크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis), 등), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스페르질루스(Aspergillus) (푸미가투스(fumigatus), 니게르(niger), 등), 뮤코랄레스 속(Genus Mucorales) (털곰팡이(mucor), 압시디아(absidia), 거미줄 곰팡이(rhizopus)), 스포로트릭스 센키(Sporothrix schenkii), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum)을 포함한다.
본 명세서의 방법으로 치료 가능한 감염을 유발하는 병원성 기생충의 몇몇 예는 이질 아메바(Entamoeba histolytica), 대장 발란티듐(Balantidium coli), 파울러 자유 아메바(Naegleriafowleri), 가시아메바 종(Acanthamoeba sp .), 람블 편모충(giardia lambia), 크립토스포리듐 종(Cryptosporidium sp .), 주폐포자충(Pneumocystis carinii), 삼일열 말라리아(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 도노반 리슈만 편모충(leishmania donovani), 톡소 포자충(Toxoplasma gondii), 쥐모양 선충(Nippostrongylus brasiliensis)을 포함한다.
상기 모든 방법들에서, LAG-3 차단은 사이토카인 처리 (예로서, 인터페론, GM-CSF, G-CSF, IL-2), 또는 종양 항원의 향상된 제시를 제공하는 이중특이적 항체 요법과 같은 다른 형태의 면역요법과 조합될 수 있다 (예로서, Bolliger (1993) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123 참조).
자가면역 반응
항-LAG-3 항체는 자가면역 반응을 유발하고 증폭시킬 수 있다. 실제로, 종양 세포 및 펩타이드 백신을 사용한 항-종양 반응의 유도는 많은 항-종양 반응이 항-자가 반응성을 수반한다는 것을 나타낸다 (van Elsas et al. (2001) J.112 Exp . Med. 194:481-489; Overwijk, et al. (1999) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 96: 2982-2987; Hurwitz, (2000) supra; Rosenberg & White (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol .19 (1): 81-4). 그러므로, 질환 치료를 위해 이들 자가 단백질에 대한 면역 반응을 효율적으로 생성하기 위한 백신 접종 프로토콜을 고안하기 위해 다양한 자가 단백질과 함께 항-LAG-3 차단의 사용을 고려하는 것이 가능하다. 예를 들어, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease)은 뇌 내 아밀로이드 침전물에서 Aβ 펩타이드의 부적절한 축적을 수반한다; 아밀로이드에 대한 항체 반응은 이들 아밀로이드 침전물을 제거할 수 있다 (Schenk et al., (1999) Nature 400: 173-177).
다른 자가 단백질은 또한 표적, 예컨대 알레르기(allergy) 및 천식(asthma)의 치료를 위한 IgE, 및 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis)에 대해서는 TNFα로 사용될 수 있다. 결국, 다양한 호르몬에 대한 항체 반응은 항-LAG-3 항체의 사용에 의해 유도될 수도 있다. 생식 호르몬에 대한 중화 항체 반응은 피임에 사용될 수 있다. 호르몬 및 특정 종양의 성장에 필요한 다른 가용성 인자에 대한 중화 항체 반응은 또한 가능한 백신 접종 표적으로 간주될 수 있다.
항-LAG-3 항체의 사용에 대하여 상기 기술된 바와 유사한 방법은 다른 자가 항원, 예컨대 알츠하이머 병의 Aβ를 포함한 아밀로이드 침전물, 사이토카인, 예컨대 TNFα, 및 IgE가 부적절하게 축적된 환자를 치료하기 위해 치료적 자가면역 반응의 유도에 사용될 수 있다.
백신
항-LAG-3 항체는 관심있는 항원 (예로서, 백신)과 항-LAG-3 항체의 동시-투여에 의해 항원-특이적 면역 반응을 자극하는데 사용될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서 본 명세서는 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공하며, 대상체에서 항원에 대한 면역 반응이 향상되도록 (i) 항원; 및 (ii) 항-LAG-3 항체, 또는 이것의 항원-결합 부분을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 인간 항-인간 LAG-3 항체 (예컨대 본원에서 기술된 인간 항-LAG-3 항체 중 어느 것)이다. 추가적으로 또는 대안으로, 항체는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다. 항원은, 예를 들어, 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원 또는 병원체의 항원일 수 있다. 이러한 항원의 비-제한적 예는 상기 섹션에서 논의된 것들, 예컨대 상기 논의된 종양 항원 (또는 종양 백신), 또는 바이러스, 박테리아 또는 상기 기술된 그 밖의 병원체의 항원을 포함한다.
생체 내 및 시험관 내에서 본 명세서의 항체 조성물 (예로서, 인간 단클론성 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역컨쥬게이트)을 투여하는 적합한 경로는 업계에 공지되어 있고 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 주사에 의해 (예로서, 정맥내 또는 피하) 투여될 수 있다. 사용된 분자의 적합한 투약량은 대상체의 나이 및 체중과 항체 조성물의 농도 및/또는 제제에 따라 다를 것이다.
앞서 기술된 바와 같이, 본 명세서의 인간 항-LAG-3 항체는 하나 이상의 다른 치료제, 예로서, 세포독성제, 방사선독성제 또는 면역억제제와 동시-투여될 수 있다. 항체는 작용제와 결합될 수 있거나 (면역-복합체로서) 또는 작용제와 별도로 투여될 수 있다. 후자 (별도의 투여)의 경우에, 항체는 작용제 이전에, 이후에 또는 동시에 투여될 수 있거나 다른 공지된 요법, 예로서, 항암 요법, 예로서, 방사선과 동시-투여될 수 있다. 이러한 치료제는, 다른 것들 중에서도, 항신생물제 such as 독소루비신 (adriamycin), 씨스플라틴 블레오마이신 설페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 다카르바진 및 사이클로포스파미드 하이드록시유레아를 포함하며 이것들은 그 자체로는 환자에게 독성 또는 부독성인 수준에서만 효과적이다. 씨스플라틴은 4주 1회 100 mg/mL 용량으로 정맥내로 투여되고 아드리아마이신은 21일마다 1회 60-75 mg/mL 용량으로 정맥내로 투여된다. 화학치료제와 본 명세서의 인간 항-LAG-3 항체, 또는 이것의 항원 결합 단편의 동시-투여는 인간 종양 세포에 대한 세포독성 효과를 산출하는 상이한 메커니즘을 통해 작동하는 두 개의 항암제를 제공한다. 이러한 동시-투여는 약물에 대한 저항성의 발달 또는 항체와 반응하지 않게 하는 종양 세포의 항원성의 변화로 인한 문제를 해결할 수 있다.
또한 본 명세서의 항체 조성물 (예로서, 인간 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자, 또는 면역컨쥬게이트) 및 사용 설명서를 포함한 키트가 본 명세서의 범위 내에 포함된다. 키트는 적어도 하나의 추가적인 시약, 또는 본 명세서의 하나 이상의 추가적인 인간 항체 (예로서, 제1 인간 항체와 별개의 LAG-3 항원에서 에피토프에 결합하는 상보적 활성을 가진 항체)를 더 함유할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트의 내용물의 사용 목적을 표시한 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트에 또는 키트와 함께 공급되거나, 또는 그렇지 않으면 키트를 동반하는 임의의 서면, 또는 기록된 자료를 포함한다.
신경계 장애
본 명세서의 다른 방법은 움직임에 영향을 주는 신경계의 진행성 장애에 걸린 환자를 치료하는데 사용된다. 한 구체예에서, 움직임에 영향을 주는 신경계의 진행성 장애는 파킨슨 병(Parkinson's disease)이다. 따라서, 본 명세서의 또 다른 양태는 대상체에서 파킨슨 병을 치료하는 방법을 제공하며 대상체가 파킨슨 병에 대하여 치료되도록 항-LAG-3 항체, 또는 이것의 항원-결합 부분을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 인간 항-인간 LAG-3 항체 (예컨대 본원에서 기술된 인간 항-LAG-3 항체 중 어느 것)이다. 추가적으로 또는 대안으로, 항체는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다.
면역계 장기, 예로서 흉선 및 비장 외에도, LAG3은 또한 뇌에서도 풍부하다 (C. J. Workman (2002) ，Eur. J. Immunol. 32, 2255-2263). 면역블롯 분석은 LAG3이 대부분 뉴런에서 발현된다는 것을 나타낸다. Allen Brain Atlas에 따르면, LAG3은 중추신경계 (CNS) 전반에 걸쳐, DA 뉴런을 포함한, 뉴런에 국소화된다. X. Mao et al. (Science. 2016 Sep 30;353(6307))은 LAG3이 주로 D1 도메인 (29-167AA)을 통해 높은 친화도로 α-시누클레인 (α-syn) 미스폴딩된(misfolded) 미리 형성된 피브릴 (PFF)에 우선적으로 결합한다는 것을 보고하였다. 이에 더하여, D2 (168-252AA), D3 (265-343AA), 또는 세포 내 도메인 (ICD, 472-525AA)의 결실은 α-syn PFF로의 LAG3의 결합을 실질적으로 약화시키고, X. Mao et al.은 LAG3으로의 α-syn PFF 결합이 a-syn PFF 세포 내 섭취, 전달, 및 독성을 일으킨다는 것을 나타냈다. 신생 증거는 파킨슨 병 (PD)의 발병이 미스폴딩된 α-syn PFF의 세포-대-세포 전달 때문일 수도 있다는 것을 나타낸다. 파킨슨 병 (PD)은 두 번째로 많은 신경퇴행성 장애이고 움직임의 둔화, 떨림, 경직, 및 PD 말기에는, 인지 장애를 유발한다. 병리학적으로, PD은 루이체(Lewy body) 및 신경 돌기에서 a-시누클레인의 축적을 특징으로 한다. 신경계 전반에 걸쳐 뉴런이 퇴행되며, 흑질 치밀부(substantia nigra pars compacta)에서 도파민 뉴런의 퇴행은 PD의 주요 증상을 유발한다. D1 또는 D2 도메인에 특이적으로 결합하는 항-LAG3 항체는 a-syn PFF 독성 및 세포-대-세포 전달을 감소시킬 수 있으며, PD 요법에 대한 가능성을 시사한다. 실시예 1에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 항체는 LAG3 단백질의 D1 또는 D2 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다. 그러므로, 항체는 PD 요법에 사용될 수 있다.
조합 요법
또 다른 양태에서, 본 명세서는 항-LAG-3 항체가 면역 반응을 자극하는데 효과적인 하나 이상의 추가적인 항체와 동시-투여되며 그렇게 함으로써 대상체에서 면역 반응을 더 향상시키거나, 자극하거나 또는 상향조절하는 조합 요법의 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서는 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공하며, 예를 들어, 종양 성장을 억제하거나 항-바이러스 반응을 자극하기 위해 대상체에서 면역 반응이 자극되도록 대상체에게 항-LAG-3 항체 및 하나 이상의 추가적인 면역자극 항체, 예컨대 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-CTLA-4 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대상체는 항-LAG-3 항체 및 항-PD-1 항체가 투여된다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 항-LAG-3 항체 및 항-PD-L1 항체가 투여된다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 항-LAG-3 항체 및 항-CTLA-4 항체가 투여된다. 한 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 인간 항체, 예컨대 본 명세서의 항체이다. 대안으로, 항-LAG-3 항체는, 예를 들어, 키메라 또는 인간화 항체 (예로서, 마우스 항-LAG-3 mAb로부터 제조된)일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 적어도 하나의 추가적인 면역자극 항체 (예로서, 항-PD-1, 항-PD-L1 및/또는 항-CTLA-4 항체)는 인간 항체이다. 대안으로, 적어도 하나의 추가적인 면역자극 항체는, 예를 들어, 키메라 또는 인간화 항체 (예로서, 마우스 항-PD-1, 항-PD-L1 및/또는 항-CTLA-4 항체로부터 제조된)일 수 있다.
한 구체예에서, 본 명세서는 과증식성 질환 (예로서, 암)을 치료하는 방법을 제공하며, LAG-3 항체 및 CTLA-4 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 항-CTLA-4 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 또는 둘 다 치료 용량 미만으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서는 면역자극제로의 과증식성 질환의 치료에 관한 부작용을 변화시키는 방법을 제공하며, 항-LAG-3 항체 및 치료 용량 미만의 항-CTLA-4 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간이다. 특정 구체예에서, 항-CTLA-4 항체는 인간 서열 단클론성 항체 10D1 (PCT 공보 WO 01114424에서 기술됨)이고 항-LAG-3 항체는 본원에서 기술된 바와 같이 인간 서열 단클론성 항체, 예컨대 S27, S31, T99, 또는 S119이다. 본 명세서의 방법에 포함되는 다른 항-CTLA-4 항체는, 예를 들어, WO98/42752; WO 00/37504; 미국 특허 번호 6,207,156; Hurwitz et al. (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin . Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (항체 CP-675206); 및 Mokyr et al. (1998) Cancer Res.58:5301-5304에 개시된 것들을 포함한다. 특정 구체예에서, 항-CTLA-4 항체는 5 x 10-8 M 이하의 KD로 인간 CTLA-4에 결합하거나, 1 x 10-8 M 이하의 KD로 인간 CTLA-4에 결합하거나, 5 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 CTLA-4에 결합하거나, 또는 1 x 10-8 M 내지 1 x 10-10 M 이하의 KD로 인간 CTLA-4에 결합한다.
한 구체예에서, 본 명세서는 과증식성 질환 (예로서, 암)을 치료하는 방법을 제공하며, LAG-3 항체 및 PD-1 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 항-PD-1 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 또는 둘 다 치료 용량 미만으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서는 면역자극제로의 과증식성 질환의 치료와 관련된 부작용을 변화시키는 방법을 제공하며, 항-LAG-3 항체 및 치료 용량 미만의 항-PD-1 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간이다. 특정 구체예에서, 항-PD-1 항체는 인간 서열 단클론성 항체이고 항-LAG-3 항체는 본원에서 기술된 바와 같이 인간 서열 단클론성 항체, 예컨대 S27, S31, T99, 또는 S119이다. 인간 서열 항 PD-1 항체의 예는 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 및 4A11을 포함하며, PCT 공보 WO 061121168에 기술되어 있다. 특정 구체예에서, 항-PD-1 항체는 5 x 10-8 M 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 1 x 10-8 M 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 5 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 또는 1 X 10-8 M 내지 1 X 10-10 M 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합한다.
한 구체예에서, 본 명세서는 과증식성 질환 (예로서, 암)을 치료하는 방법을 제공하며, LAG-3 항체 및 PD-L1 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가의 구체예에서, 항-LAG-3 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 항-PD-L1 항체는 치료 용량 미만으로 투여되거나, 또는 둘 다 치료 용량 미만으로 투여된다.. 또 다른 구체예에서, 본 명세서는 면역자극제로의 과증식성 질환의 치료와 관련된 부작용을 변화시키는 방법을 제공하며, 항-LAG-3 항체 및 치료 용량 미만의 항-PD-L1 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간이다. 특정 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 인간 서열 단클론성 항체이고 항-LAG-3 항체는 본원에서 기술된 바와 같이 인간 서열 단클론성 항체, 예컨대 S27, S31, T99, 또는 S119이다. 인간 서열 항-PD-L1 항체의 예는 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 및 13G4를 포함하며, 이것은 PCT 공보 WO 07/005874에 기술되어 있다. 특정 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 5 x 10-8 M 이하의 KD로 인간 PD-L1에 결합하거나, 1 x 10-8 M 이하의 KD로 인간 PD-L1에 결합하거나, 5 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 PD-L1에 결합하거나, 또는 1 x 10-8 M 내지 1 x 10-10 M 이하의 KD로 인간 PD-L1에 결합한다.
항체에 의한 LAG-3 및 하나 이상의 제2 표적 항원, 예컨대 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1의 차단은 환자에서 암성 세포에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 본 명세서의 항체를 사용하여 성장이 억제될 수 있는 암은 면역요법에 전형적으로 반응성인 암을 포함한다. 본 명세서의 조합 요법으로 치료를 위한 암의 대표적인 예는 상기 항-LAG-3 항체로의 단일요법의 논의에서 구체적으로 나열된 상기 암들을 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에서 논의 된 치료적 항체의 조합은 약학적으로 허용 가능한 담체 중의 단일 조성물로서 동시에, 또는 약학적으로 허용 가능한 담체 중의 각 항체와 별도의 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 치료적 항체의 조합은 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-CTLA-4항체 및 항-LAG-3 항체는 순차적으로 투여될 수 있으며, 예컨대 항-CTLA-4 항체가 먼저 투여되고 항-LAG-3 항체가 두 번째로 투여되거나, 또는 항-LAG-3 항체가 먼저 투여되고 항-CTLA-4 항체가 두 번째로 투여된다. 추가적으로 또는 대안으로, 항-PD-1 항체 및 항-LAG-3 항체는 순차적으로 투여될 수 있으며, 예컨대 항-PD-1 항체가 먼저 투여되고 항-LAG-3 항체가 두 번째로 투여되거나, 또는 항-LAG-3 항체가 먼저 투여되고 항-PD-1 항체가 두 번째로 투여된다. 추가적으로 또는 대안으로, 항-PD-L1 항체 및 항-LAG-3 항체는 순차적으로 투여될 수 있으며, 예컨대 항-PD-L1 항체가 먼저 투여되고 항-LAG-3 항체가 두 번째로 투여되거나, 또는 항-LAG-3 항체가 먼저 투여되고 항-PD-Ll 항체가 두 번째로 투여된다.
게다가, 조합 요법의 1회 초과의 용량이 순차적으로 투여되면, 순차적 투여 순서는 각각의 투여 시점에서 뒤바뀌거나 같은 순서를 유지될 수 있고, 순차적 투여는 동시 투여, 또는 이것들의 임의의 조합과 조합될 수 있다. 예를 들어, 항-CTLA-4 항체 및 항-LAG-3항체의 조합의 첫 번째 투여는 동시에 이루어질 수 있고, 두 번째 투여는 첫 번째 항-CTLA-4 및 두 번째 항-LAG-3으로 순차적으로 이루어질 수 있으며, 세 번째 투여는 첫 번째 항-LAG-3 및 두 번째 항-CTLA-4, 등으로 순차적으로 이루어질 수 있다. 추가적으로 또는 대안으로, 항-PD-1 항체 및 항-LAG-3 항체의 조합의 첫 번째 투여는 동시에 이루어질 수 있고, 두 번째 투여는 첫 번째 항-PD-1 및 두 번째 항-LAG-3으로 순차적으로 이루어질 수 있으며, 세 번째 투여는 첫 번째 항-LAG-3 및 두 번째 항-PD-1, 등으로 순차적으로 이루어질 수 있다. 추가적으로 또는 대안으로, 항-PD-L1 항체 및 항-LAG-3 항체의 조합의 첫 번째 투여는 동시에 이루어질 수 있고, 두 번째 투여는 첫 번째 항-PD-L1 및 두 번째 항-LAG-3으로 순차적으로 이루어질 수 있으며, 세 번째 투여는 첫 번째 항-LAG-3 및 두 번째 항-PD-L1, 등으로 순차적으로 이루어질 수 있다. 또 다른 대표적인 투약 계획은 첫 번째 항-LAG-3 및 두 번째 항-CTLA-4 (및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1)로 순차적인 첫 번째 투여를 수반할 수 있고, 후속 투여는 동시에 이루어질 수도 있다.
선택적으로, 항-LAG-3 및 하나 이상의 추가적인 항체 (예로서, 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체)의 조합은 면역원성 작용제, 예컨대 암성 세포, 정제된 종양 항원 (재조합 단백질, 펩타이드, 및 탄수화물 분자 포함), 세포, 및 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 유전자로 트랜스펙션된 세포와 더 조합될 수 있다 (He et al.(2004) J. Immunol . 173:4919-28). 사용될 수 있는 종양 백신의 비-제한적 예는 흑색종 항원의 펩타이드, 예컨대 gp100, MAGE 항원, Trp-2, MARTI 및/또는 타이로시나제의 펩타이드, 또는 사이토카인 GM-CSF를 발현하도록 트랜스펙션된 종양 세포를 포함한다. 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단은 백신 접종 프로토콜, 예컨대 항-LAG-3 항체로의 단일요법에 관하여 상기 상세히 논의된 백신 접종 프로토콜 중 어느 것과도 더 조합될 수 있다.
조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단은 또한 표준 암 치료와 더 조합될 수 있다. 예를 들어, 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단은 화학치료 요법과 효율적으로 조합될 수 있다. 이 경우에는, 본 명세서의 조합과 함께 투여되는 다른 화학치료제의 용량을 감소시키는 것이 가능하다 (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). 이러한 조합의 예는 흑색종의 치료를 위해 데카르바진과 추가로 조합되는, 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체의 조합이다. 또 다른 예는 흑색종의 치료를 위해 인터류킨-2 (IL-2)와 추가로 조합되는, 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체의 조합이다. 화학요법으로 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단의 조합된 사용에 대한 과학적인 근거는 대부분의 화학치료적 화합물의 세포독성 작용의 결과인 세포 사멸이 항원 제공 경로에서 종양 항원의 수준을 증가시킨다는 것이다. 세포 사멸을 통한 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단과 시너지 효과를 유발할 수 있는 다른 조합 요법은 방사선, 수술, 또는 호르몬 박탈을 포함한다. 이들 프로토콜 각각은 숙주에서 종양 항원의 공급원을 생성한다. 혈관 형성 억제자는 또한 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단과 조합될 수 있다. 혈관 형성의 억제는 종양 세포 사멸을 유도하며, 이것은 숙주 항원 제공 경로로 공급되는 종양 항원의 공급원일 수 있다.
LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단 항체의 조합은 또한 Fcα 또는 Fcγ 수용체-발현 효과기 세포를 종양 세포로 표적화하는 이중특이적 항체와 조합하여 사용될 수 있다 (예로서, 미국 특허 번호 5,922,845 및 5,837,243 참조). 이중특이적 항체는 두 개의 별도의 항원을 표적화하는데 사용될 수 있다. 이들 반응의 T 세포 아암은 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는 PD-L1 차단의 사용에 의해 증가될 것이다. 또 다른 예에서, 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체의 조합은 항-신생물 항체, 예컨대 Rituxan® (리툭시맙), Herceptin® (트라스투쥬맙), Bexxar® (토시투모맙), Zevalin® (이브리투모맙), Campath® (알렘투쥬맙), Lymphocide® (에프르투쥬맙), Avastin® (베바시쥬맙), 및 Tarceva® (에를로티닙), 등과 함께 사용될 수 있다. 예로서 및 어떠한 이론에도 결부되지 않으면서, 항-암 항체 또는 독소에 컨쥬게이션된 항-암 항체로의 처리는 암 세포 (예로서, 종양 세포) 사멸로 이어질 수 있으며 이는 CTLA-4, PD-1, PD-L1 또는 LAG-3에 의해 매개되는 면역 반응을 증가시킬 것이다. 예시적 구체예에서, 과증식성 질환 (예로서, 암 종양)의 치료는 동시에 또는 순차적으로 또는 이것들의 임의의 조합으로 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체와 조합된 항-암 항체를 포함할 수 있으며, 이것은 숙주에 의한 항-종양 면역 반응을 증가시킬 수 있다.
종양은 다양한 메커니즘에 의해 숙주 면역 감시를 회피한다. 이들 메커니즘 중 다수는 종양에 의해 발현되고 면역억제성인 단백질의 비활성화에 의해 극복될 수 있다. 이것들은 다른 것들 중에서도 TGF-β (Kehrl et al. (1986) J. Exp . Med . 163: 1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992) Immunology Today 13: 198-200), 및 Fas 리간드 (Hahne et al. (1996) Science 27 4: 1363-1365)를 포함한다. 또 다른 예에서, 이들 실체물 각각에 대한 항체는 면역억제제의 효과를 상쇄하고 숙주에 의한 항-종양 면역 반응을 촉진하도록 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체 조합과 추가로 조합될 수 있다.
숙주 면역 반응성을 활성화시키는데 사용될 수 있는 그 밖의 항체는 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1및/또는 항-PD-L1 항체 조합과 조합하여 더 사용될 수 있다. 이것들은 DC 기능 및 항원 제공을 활성화시키는 수지상세포의 표면 상의 분자를 포함한다. 항-CD40 항체 (Ridge et al., supra)는 항-LAG-3 및 항-CTLA-4및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 조합과 함께 사용될 수 있다 (Ito et al., supra). T 세포 동시 자극 분자에 대한 그 밖의 활성화 항체 (Weinberg et al., supra, Melero et al. supra, Hutloff et al., supra)가 또한 T 세포 활성화의 수준의 증가를 제공할 수도 있다.
상기 논의된 바와 같이, 골수 이식은 조혈성 기원의 다양한 종양을 치료하기 위해 동시에 사용된다. 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는PD-1 및/또는 PD-L1 차단은 공여체 이식된 종양 특이적 T 세포의 효과를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
여러 실험적 처리 프로토콜은 종양에 대한 항원-특이적 T 세포를 자극하기 위해 항원 특이적 T 세포의 생체 외부 활성화 및 확장 및 이들 세포의 수령체로의 입양 전달을 수반한다 (Greenberg & Riddell, supra). 이들 방법은 또한 감염원, 예컨대 CMV에 대한 T 세포 반응을 활성화시키는데 사용될 수 있다. 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1및/또는 항-PD-L1 항체의 존재 하에 세포 외부 활성화는 입양 전달된 T 세포의 빈도 및 활성을 증가시킬 것으로 예상된다.
특정 구체예에서, 본 명세서는 면역자극제로의 과증식성 질환 (예로서, 암)의 치료와 관련된 치료와 관련된 부작용을 변화시키는 방법을 제공하며, 항-LAG-3 항체 및 치료 용량 미만의 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1및/또는 항-PD-L1 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서의 방법은 비-흡수성 스테로이드를 환자에게 투여함으로써 면역자극 치료적 항체-유도된 대장염(colitis) 또는 설사(diarrhea)의 발병률을 감소시키는 방법을 제공한다. 면역자극 치료적 항체를 받을 임의의 환자는 이러한 항체에 의해 유도된 대장염 또는 설사에 걸릴 위험이 있기 때문에, 이 전체 환자 집단은 본 명세서의 방법에 따른 요법에 적합하다. 스테로이드는 염증성 장 질환 (IBD)을 치료하고 IBD의 약화를 예방하기 위해서 투여되었지만, 그것들이 IBD로 진단되지 않은 환자에서 IBD를 예방하는데 (IBD의 발병을 감소시키는데) 사용되지는 않았다. 스테로이드, 심지어는 비-흡수성 스테로이드와 관련된 큰 부작용은 예방적 사용을 방해하였다.
추가의 구체예에서, 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1 및/또는PD-L1 차단 (즉, 면역자극 치료적 항체 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체)은 어떠한 비-흡수성 스테로이드의 사용과도 추가로 조합될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비흡수성 스테로이드"는 광범위한 처음 통과 대사(first pass metabolism)를 나타내며, 이로써 간에서의 대사 후, 스테로이드의 생체 이용률이 낮은, 즉, 약 20% 미만인 글루코코르티코이드이다. 본 명세서의 한 구체예에서, 비-흡수성 스테로이드는 부데소니드이다. 부데소니드는 국소적으로 작용하는 글루코코르티코스테로이드이며, 이것은 경구 투여 후, 주로 간에서, 광범위하게 대사된다. ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca)은 회장(ileum)으로 및 결장 전반에 걸친 약물 전달을 최적화하기 위해 개발된 부데소니드의 pH- 및 시간-의존적 경구용 제제이다. ENTOCORT EC®은 미국에서 회장 및/또는 상행 결장과 관련된 경도 내지 중등도의 크론병(Crohn's disease)의 치료에 대하여 승인되어 있다. 크론병의 치료를 위한 ENTOCORT EC®의 일반적인 경구 투약량은 6 내지 9 mg/일이다. ENTOCORT EC®은 흡수되기 전에 장에서 방출되고 소화관 점막에서 유지된다. 소화관 점막 표적 조직을 통과하면, ENTOCORT EC®은 간에서 사이토크롬 P450 시스템에 의해 극미량의 글루코코르티코이드 활성을 가진 대사산물로 광범위하게 대사된다. 그러므로, 생체 이용률이 낮다 (약 10%). 부데소니드의 낮은 생체 이용률은 덜 광범위하게 처음 통과 대사되는 다른 글루코코르티코이드보다 개선된 치료 계수를 유도한다. 부데소니드는 전신적으로 작용하는 코르티코스테로이드보다, 적은 시상하부-뇌하수체 억제를 포함하는, 소수의 부작용을 유발한다. 하지만, ENTOCORT EC®의 만성 투여는 전신적 글루코코르티코이드 효과, 예컨대 부신 피질 기능 항진증(hypercorticism) 및 부신 억제를 유발할 수 있다. PDR 58th ed. 2004; 608-610 참조.
추가의 구체예에서, 조합된 LAG-3 및 CTLA-4 및/또는 PD-1및/또는 PD-L1 차단 (즉, 면역자극 치료적 항체 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체)은 비흡수성 스테로이드와 함께 살리실레이트와 더 조합될 수 있다. 살리실레이트는 5-ASA 작용제, 예를 들어, 설파살라진 (AZULFIDINE®, Pharmacia & UpJohn); 올살라진 (DIPENTUM®, Pharmacia & UpJohn); 발살라지드 (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); 및 메살라민 (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA® Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROW ASA®' Solvay)을 포함한다.
본 명세서의 방법에 따르면, 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체 및 비-흡수성 스테로이드와 조합하여 투여되는 살리실레이트는 면역자극 항체에 의해 유도되는 대장염의 발병률을 감소시킬 목적으로 살리실레이트 및 비-흡수성 스테로이드의 임의의 중복 또는 순차적 투여를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서에 따라 면역자극 항체에 의해 유도된 대장염의 발병률을 감소시키는 방법은 살리실레이트 및 비-흡수성 스테로이드를 동시에 또는 순차적으로, 또는 이것의 임의의 조합으로 투여하는 단계를 포함한다 (예로서, 살리실레이트는 비-흡수성 스테로이드 이후 6시간에 투여된다). 또한, 본 명세서에 따르면, 살리실레이트 및 비-흡수성 스테로이드는 같은 경로로 (예로서, 둘 다 경구로 투여된다) 또는 상이한 경로로 (예로서, 살리실레이트는 경구로 투여되고 비-흡수성 스테로이드는 직장으로 투여된다) 투여될 수 있으며, 이것은 항-LAG-3 및 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-1 및/또는 항-PD-L1 항체를 투여하는데 사용된 경로(들)과 상이할 수도 있다.
진단 방법
LAG-3의 과발현은 특정 종양 샘플에서 관찰되고, LAG-3-과발현 세포를 갖고 있는 환자는 본 명세서의 항-LAG-3 항체로의 처리에 반응성일 것이다. 따라서, 본 명세서의 항체는 진단적 및 예후적 목적을 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는 세포를 포함하는 샘플은 환자로부터 얻어질 수 있으며, 환자는 암 환자 또는 진단이 필요한 환자일 수 있다. 세포는 종양 조직 또는 종양 블록, 혈액 샘플, 소변 샘플 또는 환자의 임의의 샘플의 세포이다. 샘플의 선택적 전처리시, 샘플은 항체가 샘플에 잠재적으로 존재하는 LAG-3 단백질과 상호작용하는 것을 허용하는 조건 하에서 본 명세서의 항체와 함께 인큐베이션될 수 있다. 항-LAG-3 항체를 이용하는 ELISA와 같은 방법이 샘플에서 LAG-3 단백질의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다.
샘플에서 LAG-3 단백질의 존재 (선택적으로 양 또는 농도로)는 환자가 항체로의 처리에 적합하다는 지표로서, 또는 환자가 암 치료에 반응하였다는 (또는 반응하지 않았다는) 지표로서 암의 진단에 사용될 수 있다. 예후적 방법을 위해서, 검출은 치료의 진행을 나타내기 위해 암 치료의 시작시 특정 스테이지에서 1회, 2회 또는 그 이상 실행될 수 있다.
본 명세서는 다음 실시예에 의해 더 예시되며, 더 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 모든 도멘 및 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, GenBank 서열, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용물은 명확하게 본원에 참고로 포함된다. 특히, PCT 공보 WO 09/045957, WO 09/073533, WO 09/073546, 및 WO 09/054863의 개시내용은 명확하게 본원에 참고로 포함된다.
실시예
본 명세서의 바람직한 구체예를 입증하기 위해 다음 실시예가 포함된다. 다음의 실시예에서 기술된 기술은 본 명세서의 실시에서 발명자에 의해 잘 기능하는 것으로 발견된 기술을 나타내며, 따라서 그 실시에 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인정되어야 한다. 하지만, 당업자는, 본 명세서를 고려하여, 개시된 특이적인 구체예에서 많은 변화가 이루어지고 본 명세서의 개념, 사상 및 범위에서 벗어나지 않으면서 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인정해야 한다. 더 구체적으로는, 화학적으로 및 생리학적으로 관련이 있는 특정 작용제가 본원에서 기술된 작용제로 대체될 수도 있는 한편 같거나 유사한 결과가 달성될 수 있다는 것은 분명하다. 당업자에게 분명한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 한정된 바와 같이 본 명세서의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
실시예 1
LAG-3에 대한 전체 인간 단클론성 항체의 스크리닝
항-LAG3 인간 단클론성 항체 (α-LAG-3 mAb)를 전체 인간 Fab 파지-디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여 생성하였다. 야생형 LAG-3-ECD-huFc 단편은 Daudi 세포에 결합할 수 있는 한편 D1-D2 절단된 LAG-3-ECD-huFc 단편은 Daudi 세포에 결합할 수 없다 (도 1). 그 결과로서, D1-D2 도메인은 LAG-3 기능에 중요하다.
파지-디스플레이 라이브러리- 패닝(panning)을 위한 항원. LAG-3는 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리에 속하고 4개의 세포 외 Ig-유사 도메인 (ECD), 도메인 (D)1, D2, D3 및 D4를 함유하는 단일-통과(single-pass) I형 막 단백질이다. 재조합 인간 LAG-3-ECD-인간 IgG1 (LAG-3-huFc) 융합 단백질 또는 인간 D1-D2 절단된 LAG-3-ECD-인간 IgG1 (ΔD1D2-LAG-3-huFc) 융합 단백질을 293T 세포 시스템에서 발현시켰다.
파지 라이브러리. 포유동물의 Ig 유전자 세그먼트를 가변성 (V), 다양성 (D), 결합성 (J), 및 불변성 (C) 엑손의 군으로 배열한다. 인간 Fab 파지 라이브러리를 1) 모든 인간 가변 카파 (VK) 레퍼토리; 및 2) 유전적으로 무작위로 추출된, 건강한 인간 대상체의 CDR3 영역을 가진 VH3-23 및 VH1-69 생식세포 계열 유전자 각각의 VH로 구성된 파지 벡터를 사용하여 해석하였다.
항원 스크리닝 및 생성. D1-D2 도메인-특이적 파지 바인더를 선택하기 위해, 파지 라이브러리를 항원-기반 패닝하였다.
I) LAG-3에 대하여 패닝하는 파지 라이브러리 용액
293F 세포를 N-말단에서 FLAG-태그를 가진 D1-D2 결실된 LAG-3 (ΔD1D2-LAG-3) 서열을 함유하는 플라스미드로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 3일에, ΔD1D2-LAG-3 293F 세포를 파지 라이브러리 스크리닝에 사용하였다. 파지 라이브러리를 순차적 음성 스크리닝으로 수행하였다: 스트렙타비딘 비드, ΔD1D2-LAG-3 트랜스펙션된 293F 세포 및 비오틴-라벨링된-인간 IgG1Fc 단백질. 그 다음에 그 결과의 라이브러리를 모션(motion) 하에 비오티닐화된 LAG-3-huFc LAG-3과 함께 2 hr 동안 인큐베이션한 후 이어서, 카세인 차단된 스트렙타비딘-마그네틱 비드 100μL와 함게 15분 동안 인큐베이션하였다. 미결합 파지를 PBS로 5-20회 세척하여 제거하였다. 그 다음에 결합된 파지를 신선하게 제조된 100mM 트라이에틸아민 (TEA)으로 용출하였고 Tris-HCl 버퍼를 추가하여 중화시켰다. 그 결과의 파지를 Output-1 파지 라이브러리로 라벨링하였다. Output-1 파지 라이브러리를 상기 기술된 바와 같이 동일한 스크리닝을 거쳐 Output-2 및 그 이후 Output-3 파지 라이브러리를 생성하였다. 총 3 라운드의 파지 라이브러리 스크리닝을 수행하였다.
II) LAG-3에 대한 파지 라이브러리 면역튜브 패닝 .
파지 라이브러리를 사용하여 순차적 음성 스크리닝을 수행하였다: 카세인-코팅된 면역튜브, ΔD1D2-LAG-3 트랜스펙션된 293F 세포 및 인간 IgG1Fc 단백질. 그 다음에 그 결과의 라이브러리를 LAG3-huFc-코팅된 면역튜브에서 2 hr 동안 모션 하에 인큐베이션하였다. 미결합 파지를 PBST로 5-20회 세척하여 제거하였다. 세포-기반 패닝과 유사하게, 총 3 라운드의 파지 라이브러리 스크리닝을 수행하였다.
Output-3 파지 라이브러리를 희석하고 평판배양하여 37℃에서 8 hr 동안 성장시켰고 22℃에서 밤새도록 항-카파 항체-코팅된 필터로 캡쳐하였다. 비오티닐화된 LAG-3-huFc (50nM) 및 NeutrAvidin-AP 컨쥬게이트를 필터에 적용하여 항원 결합 항-LAG3 파지를 검출하였다. 양성 파지 플라크를 선택하고 100 μL 파지 용출 버퍼로 용출시켰다. 그 다음에 파지 단일 지점 ELISA (SPE)에 대한 고-역가 (HT) 파지 (테스트된 각각의 단백질 50 nM로 코팅된 ELISA 고정된 기질)를 제조하기 위해 용출된 파지 약 10-15 μL를 사용하여 XL1-Blue 컴피턴트(competent) 세포 1 mL를 감염시켰다. 각 파지의 1x1010개의 플라크 형성 유닛 (pfu)을 SPE 확인에 사용하였다. 필터 리프트(filter lift)로부터 선택된 양성 클론을 LAG-3-huFc 및 ΔD1D2-LAG-3-huFc로의 LAG-3 항원 결합에 대하여 테스트하였다. D1-D2 특이적 바인더를 PCR에 의해 항원 양성 파지로부터 증폭시키고 시퀀싱하였다. Ig 경쇄 V 유전자 (VL) 및 VH 서열을 분석하여 고유한 서열을 확인하고 서열 다양성을 결정하였다.
모든 히트(hit)의 VL 및 VH 유전자 서열을 발현 벡터 pFUSE2ss-CLIg-hk (경쇄, InvivoGen Cat No. pfuse2ss-hclk) 및 pFUSEss-CHIg-hG1 (중쇄, InvivoGen Cat No. pfusess-hchg1)으로 클로닝하였다. 항체를 HEK293 세포에서 발현시켰고 Protein A PLUS-Agarose를 사용하여 정제하였다. 항체 및 이것들의 CDR 영역의 서열은 하기 표에서 제공된다.
항체 중쇄 가변 영역
항체 번호 VH 서열 번호:
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IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGS
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IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASSY
HGGGYHRYWGQGTLVTVSS		 141
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IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHE
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IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTG
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IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAG
TGMDLVFNSWGQGTLVTVSS		 146
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IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGL
ARGDLNFGYWGQGTLVTVSS		 147
NLAG3-HDB169-S24 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREP
HFDYWGQGTLVTVSS		 148
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IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTAA
PGSYYLVFHYWGQGTLVTVSS		 149
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IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDA
GPVGYYGMDVWGQGTTVTVSS		 150
NLAG3-HDB169-S32 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGDG
LYGSGSFGYWGQGTPVTVSS		 151
NLAG3-HDB169-S61 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKDI
RWFYGMDVWGQGTTVTVSSw		 152
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IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHE
SGIAGGHFDYWGQGTLVTVSS		 153
NLAG3-HDB169-S86 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDA
GPVGYYGMDVWGQGTTVTVS		 154
NLAG3-HDB169-S87 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKDI
RWYYGMDVWGQGTTVTVSS		 155
NLAG3-HDB169-T94 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVFCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKGV
RGTYQIGYYGMDVWGQGTTVTVSS		 156
NLAG3-HDB169-T97 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQG
TAMALDYWGQGTLVTVSS		 157
NLAG3-HDB169-T99 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRDL
QDWNYGGAAYWGQGTLVTVSS		 158
NLAG3-HDB169-S103 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDD
YYYGQFDSWGQGTLVTVSS		 159
NLAG3-HDB169-S107 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREI
TGTSYTALDSWGQGTLVTVSS		 160
NLAG3-HDB169-S109 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGH
IDGQAAGDYWGQGTLVTVSS		 161
NLAG3-HDB169-S119 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAST
LRVPNPPYWGQGTLVTVSS		 162
NLAG3-HDB169-S120 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSG
DRYDFWSGYWGQGTLVTVSS		 163
NLAG3-HDB169-S127 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAST
LRVPNPPYWGQGTLVTVSS		 164
NLAG3-HDB169-S128 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDA
GPVGYYGMDVWGQGTMVTVSS		 165
NLAG3-HDB169-S136 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRGQ
DSTWYSSFDYWGQGTLVTVSS		 166
NLAG3-HDB169-S139 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAST
LRLPNPPYWGQGTLVTVSS		 167
NLAG3-HDB169-S150 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATTQ
TSFYSHGMDVWGQGTTVTVSS		 168
NLAG3-HDB169-S157 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRKT
PFWGALDSWGRGTLVTVSS		 169
NLAG3-HDB169-S164 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGF
TYGDFIFDYWGQGTLVTVSS		 170
NLAG3-HDB169-S177 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGG
IIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDV
RGVTYLGMDVWGQGTTVTVSS		 171
NLAG3-HDB323-S20 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRKT
PFWGTLDSWGRGTLVTVSS		 172
NLAG3-HDB323-S21 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRRT
PFWGALDSWGRGTLVTVSS		 173
NLAG3-HDB323-S32 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRKT
PFWGALDSWGRGTLVTVSS		 174
NLAG3-HDB323-S35 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRKGL
GSPTDYYYGMDVWGQGTTVTVSS		 175
NLAG3-HDB323-S52 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRKT
PFWGALDSWGRGTLVTVSS		 176
NLAG3-HDB323-S55 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRKT
PFWGTLDSWGRGSLVTVSS		 177
NLAG3-HDB323-T89 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRPEYD
TYYYGMDVWGQGTTVTVSS		 178
NLAG3-HDB323-T92 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGGS
YDYWGQGTLVTVSS		 179
NLAG3-HDB323-T94 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALNG
MDVWGQGTMVTVSS		 180
NLAG3-HDB323-S102 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRPLQG
IAAADSYYYYAMDVWGQGTTVTVSS		 181
NLAG3-HDB323-S103 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLHSY
LSEEFDPWGQGTLVTVSS		 182
NLAG3-HDB323-S107 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRKT
PFWGALDSWGRGTLVTVSS		 183
NLAG3-HDB323-S114 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLSAV
NTYIDDWGQGTLVTVSS		 184
NLAG3-HDB323-S135 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTKT
PFWGTLDYWGQGTLVTVSS		 185
NLAG3-HDB323-S143 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRRT
PFWGALDSWGRGTLVTVSS		 186
NLAG3-HDB323-S146 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSQS
PVWGYFDYWGQGMLVTVSS		 187
NLAG3-HDB323-S161 QLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIS
GSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGYY
DFWSGYSDYWGQGTLVTVSS		 188
Figure 112019050671519-pat00003
경쇄 가변 영역
항체 번호 VL 서열 번호:
NLAG3-HDB169-T03 DIQLTQSPSSLSAFVGDRVTITCQANQDIHHYLNWYQQKPGKAPKLLIYD
ASILQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQADSFPITFGQ
GTRLEIKR		 189
NLAG3-HDB169-T05 EIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSSNKNYLAWYQQKPGQPP
KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYST
PWTFGPGTKLEIKR		 190
NLAG3-HDB169-T06 DIQMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGHPP
KLLVYWASTRESGVPARFSASGSGTDFTLAISNLQAEDVAVYYCQQYYST
PWTFGQGTKVEIKR		 191
NLAG3-HDB169-T07 EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNLLHSDGYNYLNWYLQKPGQSPQ
LLIYLGSNRATGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
WTFGQGTKVEIKR		 192
NLAG3-HDB169-T08 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYTSNNKNYLAWYQQKPGQPP
KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAIYYCQQYYST
PWTFGQGTKLEIKR		 193
NLAG3-HDB169-T10 AIQLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPP
KLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDSATYYCQQSFTT
PWTFGQGTKVEIKR		 194
NLAG3-HDB169-T13 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDINRYLSWYQQKPGKAPKLLIYD
ASNLETGVPSRFSGSASGTDFTFAISSLQPEDIATYYCQQYDNLPPTFGQ
GTRLEIKR		 195
NLAG3-HDB169-T23 EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYA
ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQSYGSPVTFGQ
GTKLEIKR		 196
NLAG3-HDB169-S24 EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYD
ASNLETGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLRPEDFATYFCQQADSFPITFGQ
GTRLEIKR		 197
NLAG3-HDB169-S27 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISSHLNWYQQKPGKAPKVLIYA
ASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGNSFPFTFGP
GTKVEIKR		 198
NLAG3-HDB169-S31 AIRMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQGIAGWLAWYQQKPGKAPKLLIYA
ASSLQSGVPSRFSGSASGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQAKSFPLTFGG
GTKVEIKR		 199
NLAG3-HDB169-S32 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPP
KLLIYWASTRESGVPDRFSGTGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSYST
PWTFGQGTKLEIK 		200
NLAG3-HDB169-S61 DIVMTQSPSSVSAFVGDRVTITCRASQGVSSWLAWFQQKPGKAPKLLIYA
ASTLQSGVPSRFSGRGYGTEFTLTISSLQPEDLATYYCQQVKSFPLTFGG
GTKVDIKR		 201
NLAG3-HDB169-S64 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFYHSNNHNYLAWYQQKPGQPP
KLLIYWASTRQSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYNT
PWTFGQGTKVEIKR		 202
NLAG3-HDB169-S86 AIRMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQGIAGWLAWYQQKPGKAPKLLIYA
ASSLQSGVPSRFSGSASGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQAKSFPLTFGG
GTKVEIKR		 203
NLAG3-HDB169-S87 DIVMTQSPSSVSAFVGDRVTITCRASQGVSSWLAWFQQKPGKAPKLLIYA
ASTLQSGVPSRFSGRGYGTEFTLTISSLQPEDLATYYCQQVKSFPLTFGG
GTKVDIKR		 204
NLAG3-HDB169-T94 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSSLAWYQQKPGKAPNLLIYT
ASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQTKNFPLTFGQ
GTRLEIKR		 205
NLAG3-HDB169-T97 EIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQRPGQPP
KLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGADFSLTISSLQAEDVAVYYCQQYYST
PWTFGQGTKLEIKR		 206
NLAG3-HDB169-T99 VIWMTQSPSSLSASVGDSVTITCQASRDISNSLSWHQQKPGKAPKLLIYA
ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTKSFPLTFGG
GTKVEIKR		 207
NLAG3-HDB169-S103 EIVMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQSISRYLNWYQQKPGQAPKLLIYA
AFSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPRTFGQ
GTKLEIKR		 208
NLAG3-HDB169-S107 DVVMTQSPSTVSASVGDRITITCRASRSISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYA
ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPLTFGG
GTKVEIK		 209
NLAG3-HDB169-S109 DIQLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVFYRSNQKNYLAWYQQKPGQTP
RLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRA
PWTFGQGTKVEIKR		 210
NLAG3-HDB169-S119 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYG
ISSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANNFPLTFGG
GTKLEIKR		 211
NLAG3-HDB169-S120 EIVLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASRGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYA
ASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKSFPLTFGG
GTKVEIKR		 212
NLAG3-HDB169-S127 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYG
ISSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANNFPLTFGG
GTKLEIKR		 213
NLAG3-HDB169-S128 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYA
ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISRLQPEDFATYYCQQAKSFPLTFGG
GTKVEIKR		 214
NLAG3-HDB169-S136 AIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPNLLIYA
VSTLQSGVPSRFSGSGSGTVFTLTISSLQPEDFATYFCQQGNSFPLTFGG
GTKVEIKR		 215
NLAG3-HDB169-S139 DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQAISNLLAWYQQKPGKPPNLLIYD
ISTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFAIYYCQQSKNFPVTFGG
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GTKVEIKR		 237
Figure 112019050671519-pat00004
실시예 2
다양한 종으로부터 유래된 LAG3 단백질로의 인간 항- LAG3 항체의 결합.
항-LAG-3 항체가 인간, 래트, 및 마우스 LAG3에 결합하는 능력을 테스트하기 위해서, 실시예 1에서 확인된 항체를 ELISA를 통해 결합 성질에 대하여 평가하였다. 인간, 래트 및 마우스 LAG3 ECD-Fc 단백질을 100μl/웰로 1μg/ml에서 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 실시예 1의 항체를 ELISA 희석 버퍼로 단계 희석하였다. 결합을 평가하기 위해서, LAG-3 항체를 다양한 농도 (10 μg/ml, 3.333 μg/ml, 1.111 μg/ml, 0.370 μg/ml, 0.123 μg/ml, 0.041 μg/ml, 0.014 μg/ml, 0.005 μg/ml, 0.0015 μg/ml 및 0.0005 μg/ml)로 1.5 hr 동안 RT에서 LAG3 항원 코팅된 플레이트에 추가하였다. 그 결과의 플레이트를 세척한 다음 항-인간 IgG(Fab)-HRP 항체로 라벨링하였다. S31은 인간 LAG3에만 결합할 수 있다. S27 및 T99는 인간 LAG3 및 래트/마우스 LAG3에 낮은 힘으로 결합할 수 있다. S119 항체는 인간, 래트 및 마우스 LAG3에 높은 힘으로 결합할 수 있다 (도 2).
실시예 3
활성화된 인간 1차 CD4 + T 세포 상의 세포 표면 LAG-3 항원으로의 인간 항-LAG3 항체의 결합
LAG-3를 활성화된 또는 기능 소실된 T 세포에서 발현시켰다. CD4+ T 세포를 CD4 마그네틱 비드를 사용하여 분리하였다. 정제된 인간 CD4+ T 세포를 72 hr 동안 Dynabeads® 인간 T-활성화제 CD3/CD28로 자극하였다. 실시예 1의 항체를 FACS 버퍼로 단계 희석하였다. 결합을 평가하기 위해서, LAG-3 항체를 다양한 농도 (10 μg/ml, 3.333 μg/ml, 1.111 μg/ml, 0.370 μg/ml, 0.123 μg/ml, 0.041 μg/ml, 0.014 μg/ml 및 0.005 μg/ml)로 마우스 항-인간 LAG3 PE 항체 (eBioscience, 클론: 3DS223H)의 존재 하에 얼음 위에서 30분 동안 활성화된 인간 CD4 T 세포에 추가하였다. 라벨링된 세포를 FACS 버퍼로 세척하였고 그 이후 APC-컨쥬게이션된 항-인간 IgG 항체로 얼음 위에서 30분 동안 라벨링하였다. 그 결과의 세포를 FACS 버퍼로 1회 세척하였다. 라벨링된 세포를 BD FACSCalibur™ 중에서 유동 세포분석법으로 형광 강도에 대하여 평가하였다. 도 3에서 나타난 바와 같이, S27, S31, T99 및 S119 항체는 활성화된 인간 CD4+ T 세포 상에서 발현된 LAG3에 용량 의존적으로 결합할 수 있다.
실시예 4
MHC 분류 II 수용체에 결합하는 가용성 LAG-3 ( sLAG )의 항-LAG-3 항체 억제
항-LAG-3 항체가 MHC 분류 II 수용체로의 sLAG-3의 결합을 차단하는 능력을 평가하기 위해서, 시험관 내 결합 검정을 비오틴-라벨링된 LAG-3-ECD-huFc 융합 단백질 및 MHC 분류 II 수용체를 발현하는 Raji 세포를 사용하여 설계하였다. 실시예 1의 항체를 FACS 버퍼를 이용하여 20μg/mL로부터 단계 희석하였고 6 μg/mL 비오틴-LAG-3-ECD-huFcc로 실온에서 30분 동안 사전 인큐베이션하였다. 그 다음에 항체 혼합물을 FcR 차단된 Raji 세포에 추가하였고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 세포를 FACS 버퍼로 세척하였고 그 이후 스트렙타비딘 PE로 얼음 위에서 30분 동안 염색한 다음 FACS 버퍼로 1회 세척하였다. 라벨링된 세포를 BD FACSCalibur™ 중에서 유동 세포분석법으로 형광 강도에 대하여 평가하였다. 도 4에서 나타난 바와 같이, S27, S31, S119 및 T99 항체는 수용체 MHC 분류 II 분자로의 LAG3의 결합을 용량 의존적으로 억제할 수 있다.
실시예 5
말초 혈액 단핵 세포 ( PBMC )에서 항-LAG-3 항체에 의한 IL-2 생산의 자극
포도상구균 장독소 B (SEB)는 MHC 분류 II 항원 및 T 세포 수용체 (TCR)에 동시에 결합하여, T 세포 증식 및 사이토카인 생산을 유도하는 방식으로 그것들을 합치는 초항원이다. 2 Х 105 PBMC를 실시예 1의 항체의 존재 하에 SEB로 20μg/ml에서부터 시작하여 1:3 단계 희석으로 6회 용량에 걸쳐 다양한 농도에서 자극하였다. 3일 후, 배양 상층액 중 IL-2 농도를 ELISA로 평가하였다. 도 5에서 나타난 바와 같이, PD-1 항체와 유사하게, 항-LAG3 항체(S24, S27, S31, S87, S119, T99 및 S20)는 SEB 자극 단독과 비교하여 IL-2 생산을 용량 의존적으로 향상시킬 수 있다.
실시예 6
항-LAG-3 항체를 사용하여 효과기 T 세포 ( T effs )에 대한 조절 T 세포 ( T regs )의 억제의 반전
LAG-3은 Tregs (CD4+CD25hi)에서 고도로 발현되고 그것들의 억제 기능을 매개한다 (Journal of Immunology 184:6545-51, 2010). 효과기 T 세포 (CD4+CD25-CD127hi)에 대한 Tregs의 억제 효과를 반전시키는 항-LAG-3 항체의 능력을 평가하기 위해서, 실시예 1의 항체를 시험관 내 억제 검정에 사용하였다. 먼저, Tregs (CD4+CD25hiCD127low) 및 Teffs (CD4+CD25-CD127hi)를 BD FACSAria II 시스템을 사용하여 FACS-분류하였다. Teffs를 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스터 (CFSE)로 라벨링하였고 플레이트 결합된 항-CD3 항체 및 미토마이신 C-처리된 항원 제공 세포의 존재 하에 1:1 비율로 Tregs와 공동-배양하였다. 그 다음에 항-LAG-3 항체를 세포 배양물에 추가하였고 Teffs 세포 증식을 5일 후에 테스트하였다. 도 6의 결과는 Tregs를 효과기 T 세포와 공동-배양할 때, 효과기 T 세포 증식 및 사이토카인 생산을 억제하였다는 것을 나타낸다. S119 및 T99는 Tregs에 의한 Teffs의 억제를 반전시킬 수 있다.
실시예 7
항- LAG3 및 PD-1 항체 조합 처리의 시너지 효과
포도상구균 장독소 B (SEB)는 인간 면역 반응을 자극하는 초항원이다. PD-1 차단 항체는 SEB 자극된 IL-2 생산을 향상시킬 수 있다. 실시예 5에서 나타난 바와 같이, 항-LAG3 항체는 또한 SEB 매개된 IL-2 생산을 향상시킬 수 있다. PD-1 항체와 조합된 항-LAG3 항체의 효과를 연구하기 위해서, 발명자들은 부최적 PD-1 자극의 존재 하에 SEB 자극에 대한 항-LAG3 항체의 효과를 조사하였다. 0.1μg/ml PD-1 항체의 존재 하에서, 단계 희석된 항-LAG3 항체를 SEB 배양물에 추가하였다. IL-2 생산을 72 hr 후에 평가하였다. 도 7의 결과는 항-LAG-3 항체가 부최적 PD-1 처리의 존재 하에 용량-의존적 방식으로 SEB 자극된 T 세포 반응을 향상시킬 수 있다는 것을 나타내며, 항-LAG3 및 항-PD-1 조합 처리가 시너지 효과를 나타낸다는 것을 시사한다.
실시예 8
항-LAG-3 항체는 PD-L1 항체의 존재 하에 인간 T 세포 반응을 향상시킨다.
PD-L1 항체와 조합된 항-LAG-3 항체의 효과를 평가하기 위해서, 인간 T 세포의 반응을 혼합된 림프구 반응 설정에서 평가하였다. 인간 DC를 7일 동안 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 CD14+ 단핵구로부터 분화시켰다. 또 다른 공여체로부터 단리된 CD4+ T 세포를 DC 및 단계 희석된 항-LAG-3 항체 및 PD-L1 차단 항체와 공동-배양하였다. 혼합된 배양 후 2일에, 배양 상층액을 IL-2 생산에 대하여 검정하였다. 도 8의 결과는 항-LAG-3 항체가 PD-L1 항체와 함께 IL-2 생산을 크게 촉진할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 9
LAG-3 항체 BIACORE 분석
재조합 his-태그 인간 LAG3-ECD 단백질로의 S20, S24, S27, S31, S87, S119, S120, S128, S136, S161 및 T99 항체의 결합을 캡쳐 방법을 사용하여 Biacore T200에 의해 검사하였다. 항-LAG3 항체를 항-인간 Fc 항체를 사용하여 캡쳐하였다. 항-인간 Fc 항체를 칩 상에 코팅하였다. 일련의 농도의 his-태그 인간 LAG3-ECD 단백질 (0-4nM)을 캡쳐 항체에 30 ml/분의 유속으로 주사하였다. 해리 단계는 900s 또는 550s였다. 결과는 하기 표에서 나타난다. 항-LAG3 항체에 대한 Biacore 결과는 이들 항-LAG3 항체가 인간 LAG3에 대하여 높은 친화도 바인더인 것을 나타낸다.
Figure 112019050671519-pat00005
실시예 10
인간 LAG3에 대한 마우스 단클론성 항체의 생성
이 실시예는 항-인간-LAG3 마우스 단클론성 항체가 하이브리도마(hybridoma) 기술을 사용하여 어떻게 생성되는지를 나타낸다.
항원: 재조합 인간 LAG-3 융합 단백질을 면역원으로서 항-인간 LAG-3 항체를 발생시키는데 사용하였다. 마우스 면역글로불린 Fc 도메인 (D1-D4 mFc)에 융합된 인간 LAG-3의 전체 세포 외 영역 (도메인 1-4)을 포함하는 융합 단백질을 면역원으로 사용하였다. ELISA 결합 테스트를 위해서, 인간 면역글로불린 Fc 도메인에 융합된 인간 LAG-3의 전체 세포 외 영역 (도메인 1-4) 또는 D1-D2 도메인이 없는 세포 외 영역의 융합 단백질 (각각 D1-D4 huFc 또는 ΔD1-D2 huFc). LAG-3 융합 단백질을 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조하였다.
면역화:
표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 LAG-3 융합 단백질을 제조하였다. 마우스를 복강내로 (IP) 및/또는 피하로 (SC) 면역화하였다. 마우스를 먼저 50mg 면역원으로 SC 면역화한 다음 2주마다 25μg 면역원으로 IP 면역화하였다. 면역 반응을 후안와(retroorbital) 채혈로 모니터링하였다. 혈장을 ELISA에 의해 스크리닝하였고 세포-기반 수용체 차단 검정으로 스크리닝하였다 (하기 기술된 바와 같다). 항-LAG-3 D1-D2 도메인 면역글로불린 및 기능적 LAG3 차단물질의 충분한 역가를 가진 마우스를 융합에 사용하였다. 희생 및 비장 제거 전에, 마우스를 항원 25 μg으로 복강내로 부스팅(boost)한 후 이어서 μg의 항원으로 후속적으로 부스팅하였다. 비장을 융합에 사용하였다. 하이브리도마 상층액을 항-LAG-3 D1-D2 도메인 결합 및 그것의 수용체로의 LAG3의 결합을 차단하는 능력에 대하여 세포 기반 수용체 차단 검정으로 테스트하였다.
항- LAG3 차단 항체를 생산하는 마우스의 선택
항-LAG3 차단 항체를 생산하는 마우스를 선택하기 위해서, 면역화된 마우스의 혈청을 ELISA로 D1-D2 도메인으로의 결합에 대하여 테스트하였다. 간략히 말하면, 혈청을 D1-D4 huFc로의 결합에 대하여 평가하였고 ΔD1-D2 huFc로의 결합을 대응 스크리닝으로서 제공하였다. 요약하면, D1-D4 huFc 또는 ΔD1-D2 huFc를 0.5μg/ml로 밤새도록 코팅한 다음 PBS 중의 5% BSA로 블로킹하였다. 단계 희석된 혈청을 코팅된 항원으로 실온에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 그 결과의 플레이트를 PBS/T로 세척하였고 실온에서 1 h 동안 염소 항-마우스 IgG-HRP와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 TMB 기질로 현상하였고 OD 450-630nm에서 분광 광도계로 분석하였다. 동시에, 혈청을 실시예 4에서 기술된 바와 같이 Raji 세포에서 발현되는 MHCII 분자로의 LAG3의 결합을 차단하는 기능에 대하여 평가하였다. 융합 및 추가의 스크리닝을 위해 LAG3 D1-D2 도메인에 특이적인 높은 역가를 갖고 Raji 세포로의 LAG3의 결합을 차단하는 기능을 하는 마우스를 선택하였다.
추가의 분석 및 시퀀싱을 위해 하이브리도마 클론 122H, 147H 및 170H를 선택하였다.
실시예 11
항- LAG3 마우스 단클론성 항체의 결합 성질
이 실시예는 LAG3 단백질로의 항-LAG3 마우스 항체의 결합 성질을 테스트하였다.
D1-D2 특이적 바인더:
결합 특이성을 평가하기 위해, 정제된 122H, 147H 및 170H 마우스 단클론성 항체를 D1-D4 huFc 및 ΔD1-D2 huFc 항원에 대하여 ELISA 결합 테스트하였다. 간략히 말하면, D1-D4 huFc 또는 ΔD1-D2 huFc를 0.5μg/ml로 밤새도록 코팅한 다음 PBS 중의 5% BSA로 블로킹하였다. 단계 희석된 항체 (1μg/ml에서 시작하여 10회 용량에 걸쳐 1:3 단계 희석)를 코팅된 항원과 함께 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션하였다. 그 결과의 플레이트를 PBS/T로 세척하였고 염소 항-마우스 IgG-HRP와 함께 실온에서 1 h 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TMB 기질로 현상하였고 OD 450-630nm에서 분광 광도계로 분석하였다.
ELISA의 결과를 도 9에서 요약하였는데, 이것은 LAG3의 전체 세포 외 도메인 (D1-D4 huFc)으로의 강력한 결합을 나타내지만, D1-D2 결실된 LAG3 (ΔD1-D2 huFc)으로의 결합을 나타내지 않으며, 122H, 147H 및 170H는 인간 LAG3의 D1 및 D2 도메인에 대한 강력하고 선택적인 바인더임을 확인한다.
실시예 12
항- LAG3 마우스 단클론성 항체의 기능적 성질
LAG3의 , 그 수용체로의 결합의 차단
항-LAG-3 항체가 MHC 분류 II 수용체로의 sLAG-3의 결합을 차단하는 능력을 평가하기 위해서, 시험관 내 결합 검정을 비오틴-라벨링된 LAG-3-ECD-huFc 융합 단백질 및 MHC 분류 II 수용체를 발현하는 Raji 세포를 사용하여 설계하였다. 122H, 147H 및 170H 마우스 단클론성 항체를 FACS 버퍼로 20μg/mL에서부터 단계 희석하였고 (6회 용량에 걸쳐 1:5) 실온에서 30분 동안 6 μg/mL의 비오틴-LAG-3-ECD-huFc와 함께 사전 인큐베이션하였다. 그 다음에 항체 혼합물을 FcR 차단된 Raji 세포에 추가하였고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 세포를 FACS 버퍼로 세척하였고 그 이후 얼음 위에서 30분 동안 스트렙타비딘 PE로 염색하였고 그 이후 FACS 버퍼로 1회 세척하였다. 라벨링된 세포를 BD FACSCalibur™ 중에서 유동 세포분석법으로 형광 강도에 대하여 평가하였다. 도 10에서 나타난 바와 같이, 122H, 147H 및 170H 항체는 수용체 MHC 분류 II 분자로의 LAG3의 결합을 용량 의존적으로 억제할 수 있다.
항- LAG3 항체에 의한 인간 T 세포 반응의 자극
항-LAG3 항체가 T 세포 반응을 자극하는 능력을 테스트하기 위해서, Jurkat T 세포 자극 검정을 사용하였다. Jurkat은 TCR 자극시 IL2를 생산할 수 있는 인간 T 세포 백혈병 세포주이다. 이 검정에서, 렌티바이러스에 의해 인간 LAG3 유전자로 트랜스펙션된 Jurkat 세포를 응답 세포로 사용하였다. MHCII를 발현하는 Raji 세포를 항원 제공 세포 (APC)로 사용하였다. 포도상구균 장독소 (SE)는 초항원이며, 이것은 MHCII 분자 및 T 세포 수용체 베타 (TCRVβ)를 교차결합시키고 T 세포 반응을 자극할 수 있다. 이 검정에서 SE를 자극물질로 사용하였다. 이 시스템에서, 이소성으로 발현된 huLAG3은 Jurkat 세포에 의한 SE 자극된 IL-2 생산을 억제할 수 있는 한편, 항-LAG3 항체는 IL-2 생산을 반전시킬 수 있다. 요약하면, APC (2.5 Х 104)를 SE 자극의 존재 하에 LAG3 발현 Jurkat T 세포 (1 Х 105)와 공동-배양하였다. 항-LAG3 항체 (20ug/ml에서부터 시작하여 6회 용량에 걸쳐 1:5 단계 희석됨)를 배양 초기에 추가하였다. 48hr 후, 배양 상층액을 ELISA로 IL2 생산에 대하여 평가하였다. 도 11에서 나타난 바와 같이, 122H, 147H 및 170H 마우스 단클론성 항체는 Jurkat T 세포에 의한 IL2 생산을 용량 의존적으로 촉진할 수 있으며, 그것들이 T 세포에 대한 LAG3 신호를 억제함으로써 TCR 자극을 자극할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 13
147H 마우스 mAb 인간화 디자인
mAb 147H 가변 영역 유전자를 이용하여 인간화 mAb를 생성하였다. 이 공정의 첫 번째 단계에서, mAb 147H의 VH 및 VK의 아미노산 서열을 인간 Ig 유전자 서열의 이용 가능한 데이터베이스와 비교하여 전체적으로 가장 일치하는 인간 생식세포 계열 Ig 유전자 서열을 발견하였다. 경쇄에 대하여, 가장 밀접한 인간 매칭은 A19/JK4 유전자이고, 중쇄에 대하여 가장, 밀접한 인간 매칭은 VH1-f/JH6 유전자였다. 그 다음에 147H 경쇄의 CDR1 (서열 번호:243), 2 (서열 번호:244) 및 3 (서열 번호:245)이 A19/JK4 유전자의 프레임워크 서열로 이식되었고, 147H VH의 CDR1 (서열 번호:240), 2 (서열 번호:241), 및 3 (서열 번호:242) 서열이 VH1-f/JH6 유전자의 프레임워크 서열로 이식된 인간화 가변 도메인 서열을 설계하였다. 그 다음에 3D 모델을 생성하여 마우스 아미노산을 인간 아미노산으로 대체하는 것이 결합 및/또는 CDR 입체구조에 영향을 줄 수 있는 프레임워크 위치가 존재하는지를 결정하였다. 중쇄의 경우에, 인간 프레임워크의 R71, M69, R66, V67, M48, V37, R38, Y91 및 Q1 (카바트 넘버링)이 확인되었고 마우스 대응물 아미노산, 즉, R71A, M69L, R66K, V67A, M48I, V37I, R38K, Y91F 및 Q1E로 역돌연변이되었다.
Figure 112019050671519-pat00006
인간화 항체의 아미노산 서열을 나열한다: 147H-1, 147H-2, 147H-3, 147H-4, 147H-5, 147H-6, 147H-7, 147H-8, 147H-9, 147H-10, 147H-11, 147H-12, 147H-13, 및 147H-14, 각각은 상이한 중쇄를 갖지만 모두 공통 경쇄를 공유한다.
Figure 112019050671519-pat00007
인간화 VH 및 VK 유전자를 합성으로 생산한 다음 각각 인간 감마 1 및 인간 카파 불변 도메인을 함유한 벡터로 클로닝하였다. 인간 VH 및 인간 VK의 쌍 형성은 40개의 인간화 항체를 생성하였다.
실시예 14
항- LAG3 147H 인간화 단클론성 항체의 결합 성질
Octet® RED96 시스템에 의한 인간화 항체의 친화도 순위 결정
인간화 항체의 결합 역학을 연구하기 위해서, 이 실시예는 Octet Red 96에 의한 친화도 순위 결정을 수행하였다. 하기 표에서 나타난 바와 같이, 147H-6, 147H-7, 147H-13 및 147H-14는 더 양호한 친화도를 나타낸다.
Figure 112019050671519-pat00008
Octet® RED96 시스템에 의한 인간화 항체의 전체 동역학적 친화도
인간화 항체의 결합 동역학을 연구하기 위해서, 이 실시예는 Octet Red 96을 사용하여 다양한 용량의 항원 (50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.15 nM, 3.125 nM)을 달리함으로써 전체 동역학 친화도 테스트를 더 수행하였다. 결합 친화도를 Octet® RED96 시스템의 소프트웨어로 계산하였다. 표에서 나타난 바와 같이, 147H-6, 147H-7, 147H-13 및 147H-14는 147H 키메라 항체와 비슷한 친화도를 나타냈다.
Figure 112019050671519-pat00009
실시예 15
항- LAG3 마우스 단클론성 항체의 기능적 성질
항- LAG3 항체에 의한 인간 T 세포 반응의 자극
항-LAG3 항체가 T 세포 반응을 자극하는 능력을 테스트하기 위해서, Jurkat T 세포 자극 검정을 실시예 12에서 기술된 바와 같이 사용하였다. 항-LAG3 항체 (30μg/ml에서부터 시작하여 6회 용량에 걸쳐 1:3 단계 희석됨)를 배양 초기에 추가하였다. 48 hr 후 배양 상층액을 ELISA로 IL2 생산에 대하여 평가하였다. 도 12에서 나타난 바와 같이, 147H-13 인간화 단클론성 항체는 Jurkat T 세포에 의한 IL2 생산을 용량 의존적으로 촉진할 수 있으며, 그것들이 T 세포에 대한 LAG3 신호를 억제함으로써 TCR 자극을 자극할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 16
항- LAG3 147H 인간화 단클론성 항체의 친화도 성숙화
항원 결합 친화도를 개선하기 위해, 이 실시예는 파지 디스플레이 기술을 사용하여 147H4-13의 친화도 성숙화를 수행하였다. 계획 1: 147H-13의 CDRH3 및 CDRL3을 코돈-기반 돌연변이 유발에 대하여 표적화하였다. CDRH3 및 CDRL3을 각각 위치 H95-H102 및 L89-L97 (카바트 넘버링)에서 무작위로 추출하였다. 계획 2: 각각의 CDR을 CDR 워킹(walking) 접근법을 사용하여 단일 코돈 기반 돌연변이 유발에 대하여 표적화하였다. 그 다음에 CDRH1, CDRH2, CDRL1을 라이브러리 1에 조합하였다. CDRH3, CDRL2, CDRL3을 라이브러리 2에 조합하였다.
두 계획에서, 라이브러리는 3 또는 4 라운드의 친화도-기반 용액상 파지 디스플레이 선택을 거치며 각 라운드마다 항원의 농도가 감소한다. 상대적으로 높은 항원 농도 (10 nM)를 제1 라운드에 사용하였다. 높은 친화도 변종을 선택하기 위해 항원 농도를 후속 3 라운드마다 각각 10배 또는 후속 2 라운드마다 100배 감소시켰다. 최종 라운드의 개개의 변종을 ELISA 스크리닝으로 항원으로의 양성 결합에 대하여 테스트하였다. 개개의 변종의 오프율(off-rate) 순위를 Octet Red 96 (Fortebio, USA)으로 결정하였다. 개선된 친화도를 가진 돌연변이를 조합하여 새로운 LAG3 항체를 생성하였다. 친화도를 Biacore로 추가로 확인하였으며 이는 CDR H2의 N58V는 Koff를 크게 증가시키는 한편, CDR L3의 N91Y는 Kon을 개선하였다는 것을 시사하였다.
항체 친화도 성숙화
번호 서열 ( CDR 밑줄, 돌연변이 볼드체)
147H3421 VH: (서열 번호: 261)
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147H
3422		 VH: (서열 번호: 263)
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LLIYQVSNLA T GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYC G Q Y LELP
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Figure 112019050671519-pat00010
실시예 17
친화도 성숙화된 항- LAG3 147H 인간화 단클론성 항체의 결합 성질
재조합 his-태그 인간 LAG3-ECD 단백질에 대한 친화도 성숙화된 항체의 결합 역학을 실시예 9에서 언급된 바와 같이 Biacore T200로 검사하였다. 결과는 하기 표에서 나타난다. Biacore 결과는 이들 항-LAG3 항체가 모체 147H-13보다 더 양호한 친화도를 갖는다는 것을 나타냈다.
Figure 112019050671519-pat00011
인간 LAG3에 결합하는 친화도 성숙화된 항-LAG-3 항체의 능력을 확인하기 위해서, 모체 항체 147H-13과 함께 가장 높은 친화도를 가진 2개의 항체 (B3807 및 B3810)를 ELISA를 사용하여 평가하였으며, 이것은 실시예 2에서 기술되어 있다. 모체 항체와 함께 B3807, B3810의 EC50을 하기 표에서 나타냈다. 3807 및 B3810 둘 다는 모체 항체 147H-13보다 우수한 결합 능력을 나타냈다.
Figure 112019050671519-pat00012
친화도 성숙화된 항-LAG-3 항체가 세포-유래된 인간 LAG3에 결합할 수 있는지를 추가로 확인하기 위해서는，두 개의 유도성 hLAG3 발현된 Jurkat 세포 및 활성화된 PBMC를 사용하여 B3807 및 B3810의 결합 능력을 테스트하였다. 간략히 말하면, Jurkat 세포를 FACS 버퍼에 재현탁하였다. 항-LAG3 항체 및 아이소타입 대조군을 FACS 버퍼에서 4배 단계 희석하였으며 용량은 20nM 내지 30 pM의 범위에 있다. 단계 희석된 항체를 세포 현탁액에 추가하였고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음에 미결합 항체의 제거 후, 세포를 Alexa Fluor 633 (Thermo, A21091)과 컨쥬게이션된 항-인간 IgG로 염색하였다. 형광 발광 측정값을 FACSCelesta 유동 세포분석기에서 획득하였고 Flowjo에서 분석하여 평균 형광 강도 (MFI)를 결정하였다. 천연 인간 LAG3에 결합하는 항-LAG3 항체의 능력을 테스트하기 위해, 건강한 공여체의 PBMC를 항-CD3 (BD, 555336) 및 항-CD28 (BD, 555725)로 둘 다 1ug/ml의 농도로 자극하였다. 3일 자극 후, 세포를 수확하였고 얼음 위에서 30분 동안 항-LAG3 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 항-인간 CD4 및 항-인간 IgG로 염색하였다. CD4+ 세포에 결합하는 항체의 분석을 FACSCelesta 유동 세포분석기에서 수행하였다. 세포분석법의 결과는 하기 표에 요약되어 있으며 이것은 세포-유래된 인간 LAG3에 결합하는 항체의 EC50을 나타냈다. 도 13은 항-LAG3 항체의 결합 곡선을 나타내는 그래프이다. 테스트된 항체의 EC50은 하기 나타난다.
Figure 112019050671519-pat00013
실시예 18
MHC 분류 II에 결합하는 LAG3의 차단
항-LAG3 단클론성 항체가 인간 LAG3과 MHCII의 상호작용을 차단하는 능력을 측정하기 위해, 키트 제조사에서 제공된 프로토콜에 따라 균질한 TR-FRET 기술을 이용하여 LAG3 및 MHC II 결합 검정 (Cisbio, 64ICP03PEG)을 수행하였다. 항-인간 LAG3 항체를 100 nM 내지 5pM의 범위 (10개 지점) 내에서 3배 희석하였다. 형광 발광 데이터를 PerkinElmer Envision 플레이트 판독기에서 획득하였고 각각의 항체의 IC50을 얻기 위해서 4-파라미터 용량-반응 곡선을 설정하였다. 테스트된 IC50을 하기 표에서 나타냈다.
Figure 112019050671519-pat00014
실시예 19
항- LAG3 항체에 의한 인간 T 세포 반응의 자극
항-LAG3 항체가 T 세포 반응을 자극하는 능력을 테스트하기 위해서, 실시예 13에서 기술된 바와 같이 hLAG3-발현된 Jurkat 세포를 사용하였다. 유사하게, 96-웰 플레이트의 각 웰에서, Jurkat 세포 (1 Х 105)를 0.1ng/ml SE의 존재 하에 Raji 세포 (1 Х 104)와 함께 인큐베이션하였다. 항-LAG3 항체를 3배 희석하여 100nM 내지 5pm의 범위에 있는 최종 농도로 세포에 추가하였다. 48시간 후, 배양 배지의 IL2을 균질한 TR-FRET 검정을 사용하여 측정하였다 (PerkinElmer, TRF1221M). 도 14는 IL2 방출을 자극하는데 있어서 항-LAG3 항체의 곡선을 나타낸다. 친화도 성숙화된 클론은 T 세포 반응을 자극하는데 있어서 더 양호한 강도를 나타냈다.
실시예 20
LAG3으로 갈렉틴 -3 또는 LSECtin의 결합의 차단에 대한 항- LAG3 항체의 효과
LAG3가 갈렉틴-3 (Cancer Immunol Res. 2015;3:412-423.) 및 LSECtin (J Biol Chem. 2004;279:18748-18758)을 포함한 다른 리간드를 갖고 있다는 것이 보고되었다. 이들 두 개의 잠재적인 대안의 리간드와의 상호작용은, 특히 종양 미세환경에서 CD8+ T 세포 상에서의 LAG3에 대한 본질적인 역할에 관하여, T-세포 기능에 대한 LAG3의 영향을 넓히는 역할을 할 수도 있다. 재조합 갈렉틴-3 또는 LSECtin을 평판배양된 96 웰에 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 단계 희석된 항-LAG3 항체 (10μg/ml에서부터 시작하여 1:3 희석됨) 및 비오틴-라벨링된 LAG3-Fc 단백질을 실온에서 2시간 동안 갈렉틴-3 또는 LSECtin 코팅된 웰과 함께 인큐베이션하였다. 세척 버퍼로의 광범위한 세척 후, 스트렙타비딘-HRP를 추가하였다. 도 15에서 나타난 바와 같이, 147H, S27 및 S119 항체는 LAG3 단백질로의 갈렉틴-3 또는 LSECtin의 결합을 용량 의존적으로 억제하였다.
실시예 21
항-인간 LAG3 및 항-인간 PD-L1 항체의 조합 처리의 시너지 효과
PD-L1 항체와 조합된 항-LAG-3 항체의 효과를 평가하기 위해서, Jurkat T 세포 자극 검정을 사용하였다. Jurkat 세포를 인간 LAG3 및 인간 PD-1로 과발현시켰고, 내인성으로 MHCII를 발현하는 Raji 세포를 인간 PD-L1로 트랜스펙션하였다. 이 검정에서 SE를 자극물질로서 사용하였다. 간략히 말하면, PD-L1을 발현하는 Raji (1 Х 104)를 SE 자극의 존재 하에 LAG3-PD-1을 발현하는 Jurkat T 세포 (1 Х 105)와 공동-배양하였다. 항-PD-L1 항체가 있거나 없이 항-LAG3 항체를 단계 희석하였고 배양 초기에 추가하였다. 48 hr 후 배양 상층액을 TR-FRET 검정 (PerkinElmer, TRF1221M)을 사용하여 IL2 방출에 대하여 수거하였다. 도 16에서 나타난 바와 같이, 항 PD-L1 항체와 조합된 항 LAG3 항체는 상응하는 모노-항체보다 훨씬 더 많은 IL-2를 생산할 수 있다.
인간 PD-1 및 인간 LAG3의 세포 외 도메인을 발현하는 이중 인간화 마우스를 사용하였다. 마우스 결장 선암종 세포 (MC38)를 인간 PD-L1을 발현하도록 조작하였다. 이중 인간화 마우스 (hLAG3/hPD-1)를 제0 일에 5x105 MC38-hPD-L1 세포로 피하로 이식하였다. 제10 일에, 137 mm3의 평균 종양 부피를 가진 마우스를 선택하였고 4개의 처리 군 (N=7/군)으로 무작위로 추출하였다. 마우스에 제10 일에 시작하여, 8회 용량에 걸쳐 격일마다 아이소타입 대조군 (5mg/kg), 항-PD-L1 항체 (5mg/kg), 항-LAG3 항체 147H-13 (5mg/kg) 및 항-PD-L1 항체 (5mg/kg) + 항-LAG3 항체 (5mg/kg)를 복강내로 투여하였다. 이 실시예에 사용된 항-PD-L1 항체는 높은 친화도로 인간 PD-L1에 결합하고 PD-1과의 상호작용을 차단한다. 종양 부피를 캘리퍼스 측정으로 실험 기간 (29 일) 동안 주 당 2회 모니터링하였다. PD-L1 항체 및 147H-13은 5mg/kg에서 종양 억제를 나타내지 않았다. 그에 반해, PD-L1 항체 및 147H-13의 조합은 MC38 종양 성장의 강력한 억제를 입증하였으며, 연구 마지막에 TGI는 74.2%였다 (도 17). 따라서, 확립된 MC38 결장 선암종 모델에서, 항-PD-L1 및 항-LAG3 항체의 조합 처리는 상응하는 단일요법보다 훨씬 더 효율적이었다.
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본 명세서는 기술된 구체적인 구체예에 의해 범위가 제한되는 것이 아니며 이것은 본 명세서의 개개의 양태의 단일 예시로서 의도되고, 기능적으로 동등한 어떠한 조성물 또는 방법도 본 명세서의 범위 내에 있다. 본 명세서의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서의 방법 및 조성물에서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 따라서, 본 명세서는 본 명세서의 변형 및 변화를 커버하도록 의도되며 단 그것들은 첨부된 청구범위 및 그 등가물의 범위 내에 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 개개의 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함되는 것과 같은 정도로 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> I-MAB <120> ANTI-LAG-3 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> P184013503W <150> PCT/CN2017/074365 <151> 2017-02-22 <150> PCT/CN2017/088570 <151> 2017-06-16 <160> 376 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Ala Arg Gly Ser Ser Trp Phe Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Ala Ser Ser Tyr His Gly Gly Gly Tyr His Arg Tyr 1 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Claims (49)

  1. 인간 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3) 단백질에 대하여 특이성을 가지고, 중쇄 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 경쇄 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 이것의 단편으로서,
    (a)
    CDRH1은 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하고;
    CDRH2는 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하고;
    CDRH3은 서열 번호:5-33으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    CDRL1은 서열 번호:46-68로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    CDRL2는 서열 번호:81-93으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    CDRL3은 서열 번호:104-114 및 116-125로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 또는
    (b)
    CDRH1은 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하고;
    CDRH2는 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하고;
    CDRH3은 서열 번호:31 및 34-45로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    CDRL1은 서열 번호:64, 69-80 및 115로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    CDRL2는 서열 번호:85, 86, 93-97 및 99-103으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
    CDRL3은 서열 번호:122 및 126-139로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는,
    단리된 항체 또는 이것의 단편.
  2. 제1 항에 있어서, 서열 번호:140-188로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  3. 제1 항에 있어서, 서열 번호:189-237로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  4. 제1 항에 있어서, 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  5. 제1 항에 있어서, 이중특이적인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  6. 제5 항에 있어서, 이중특이성은 면역 체크포인트 단백질 또는 종양 항원에 대하여 제2 특이성을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  7. 제5 항에 있어서, 이중특이성은 PD-L1, PD-1, CTLA-4, CD28, CD122, 4-1BB, TIM3, OX-40, OX40L, CD40, CD40L, LIGHT, ICOS, ICOSL, GITR, GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM, BTLA, KIR, CD47, CD73, EGFR, Her2, CD33, CD133, CEA 및 VEGF로 구성된 군으로부터 선택된 단백질 표적에 대하여 제2 특이성을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  8. 제5 항에 있어서, 이중특이성은 PD-L1에 대한 제2 특이성을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이것의 단편.
  9. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고, 이들을 필요로 하는 환자에서 자가면역 또는 염증 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물.
  10. 제9 항에 있어서, 상기 자가면역 또는 염증 질환은 파킨슨 병, 관절염, 류머티스성 관절염, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 건선(psoriasis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 크론병(Crohn's disease), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 낭창(lupus), 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematous), 소아 류머티스성 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis), 그레이브 병(Grave's disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 애디슨 병(Addison's disease), 셀리악 병(celiac disease), 피부근염(dermatomyositis), 다발성 경화증, 중증 근무력증(myasthenia gravis), 악성 빈혈(pernicious anemia), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), I형 당뇨병, 맥관염(vasculitis), 포도막염(uveitis), 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis) 및 강직성 척추염(ankylosing spondylitis)으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1 항 내지 제8 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고, 이들을 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물.
  12. 제11 항에 있어서, 암은 백혈병, 림프종, 난소암, 유방암, 내막암, 결장암 (결장직장암), 직장암, 방광암, 요로상피암, 폐암 (비-소세포 폐암, 폐 선암종, 폐 편평세포 암종), 기관지 암, 골암, 전립선암, 췌장암, 위암, 간세포 암종, 담낭암, 담관암, 식도암, 신장세포 암종, 갑상선암, 두경부 편평세포 암종 (두경부암), 고환암, 내분비선암, 부신암, 뇌하수체암, 피부암, 연조직암, 혈관암, 뇌암, 신경 암, 안암, 뇌막암, 중인두암, 하인두암, 자궁경부암, 및 자궁암, 교모세포종(glioblastoma), 수모세포종(meduloblastoma), 성상세포종(astrocytoma), 신경교종(glioma), 수막종(meningioma), 가스트린종(gastrinoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 흑색종, 골수이형성증(myelodysplastic syndrome), 및 육종(sarcoma)으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제12 항에 있어서, 백혈병은 전신성 비만세포증(systemic mastocytosis), 급성 림프구성 (림프아구성) 백혈병 (ALL), T 세포 - ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 다발성 골수종 (MM), 만성 골수성 백혈병 (CML), 골수증식성 장애 / 신생물, 골수이형성증, 단핵구성 세포 백혈병, 및 원형질 세포 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    림프종은 조직구성 림프종 및 T 세포 림프종, B 세포 림프종, including 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종, 저도(low grade)/여포성 비-호지킨 림프종 (NHL), 세포 림프종 (FCC), 맨틀 세포 림프종 (mantle cell lymphoma; MCL), 확산성 대세포성 림프종 (diffuse large cell lymphoma; DLCL), 소 림프구성 (SL) NHL, 중등도(intermediate grade)/여포성 NHL, 중등도 확산성 NHL, 고도(high grade) 면역모세포성 NHL, 고도 림프아구성 NHL, 고도 비-분열 소세포성 NHL, 부피가 큰 질환성(bulky disease) NHL, 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia)으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    육종은 골육종(osteosarcoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 윤활막육종(synovial sarcoma), 포상연부육종(alveolar soft part sarcoma), 혈관육종(angiosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 섬유육종(fibrosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 및 연골육종(chondrosarcoma)으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
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