RS61586B1 - Anti-tfr antitela i njihova upotreba u lečenju proliferativnih i zapaljenjskih poremećaja - Google Patents

Description

Opis

[0001] U nastavku su opisana antitela koja se specifično vezuju za TfR, receptor za transferin. Takva antitela posebno su korisna u lečenju proliferativnih i zapaljenjskih poremećaja, kao što su limfom ili leukemija. Ovo otkrivanje se posebno odnosi na specifična humanizovana anti-TfR antitela, sa jednakim ili poboljšanim svojstvima u odnosu na odgovarajuće roditeljsko mišje antitelo A24, ili njegovu himernu verziju sa humanim IgG1 konstantnim regionom.

Stanje tehnike

[0002] Receptor za transferin (CD71) (u nastavku označen "TfR") je homodimerni transmembranski glikoprotein sa disulfidnom vezom koji se sastoji od dva 760-aminokiselinska monomera od približno 90 kDa svaki. TfR ima ključnu ulogu u regulaciji apsorpcije železa i ćelijskog rasta (Gill et al., N Engl J Med., 332,1744-1748, 1995 - Hermine et al., N Engl J Med., 332, 1749-1751, 1995). Kada se diferitransferin vezuje za svoj receptor na površini ćelije, internalizuje se preko jama presvučenih klatrinom sa kiselim vezikulama gde se disocira kompleks železo-transferin. Nakon oslobađanja, receptor i apotransferin recikluju se nazad na površinu ćelije.

[0003] TfR se konstitutivno eksprimira u plazmatičnoj membrani ćelije tkiva koja se neprestano obnavljaju, kao što su prekursori krvnih ćelija u koštanoj srži, hepatociti u jetri, keratinociti u epidermisu i enterociti u kriptama crevnog epitela.

[0004] Nekoliko studija je pokazalo da se TfR eksprimira obilnije u malignim tkivima nego u njihovim zdravim pandanima (Gatter et al., J Clin Pathol., 36,539-545, 1983 - Faulk et al, Lancet., 2,390-392, 1980 - Shindelman et al., Int J Cancer, 27,329-334, 1981). Nekoliko autora prijavilo je terapeutske pristupe na osnovu ove ideje gde se koriste anti-TfR antitela ili sam transferin konjugovan sa lekovima za ubijanje malignih ćelija.

[0005] Takođe je predloženo da se koriste anti-TfR antitela radi blokiranja interakcije između transferina i TfR, i kao posledica sprečavanja apsorpcije železa, što dovodi do nedostatka železa i negativne regulacije ćelijskog rasta. Međutim, iako mnoge publikacije opisuju pripremanje anti-TfR antitela, postoji jako mali broj izveštaja anti-TfR monoklonalnih antitela (mAb) koja imaju antiproliferativnu aktivnost.

[0006] Trowbridge i Lopez (Proc. Natl Acad Sci USA, 79, 1175-1179, 1982) prijavili su svojstva monoklonalnog antitela, označenog sa 42/6 i klasifikovanog kao IgA (k), koje blokira vezivanje transferina za njegov receptor i može da inhibira in vitro rast humane T leukemijske ćelijske linije, blokiranjem ćelija u S fazi ćelijskog ciklusa.42/6 antitelo i hibridom koji ga proizvodi (ATCC HB-8094) opisani su u US Patent 4,434,156.

[0007] Lesley et al. (Mol Cell Biol.5, 1814-21, 1985) ispitivali su efekte anti-mišjih monoklonalnih antitela na receptor za transferin koja pripadaju ili IgG ili IgM klasi, na vezivanje transferina i na rast mišjih ćelija limfoma in vitro. Primetili su da IgM inhibiraju ćelijski rast ali ne i IgG, iako su oba mogla da indukuju nishodnu regulaciju i degradaciju TfR. Međutim, IgG umrežen sa anti-imunoglobulinskim antitelom mogao je da inhibira ćelijski rast. U naknadnom radu, isti tim (Lesley et al., Exp Cell Res., 182,215-33, 1989) ispitivao je efekte IgG i IgM monoklonalnih anti-TfR antitela i njihovih mono- i dvovalentnih fragmenata na rast mišjih ćelija limfoma i TfR ekspresiju. Objavili su da ovi efekti zavise od stepena umrežavanja receptora za transferin antitelom, što je posledica valence antitela. Monovalentni fragmenti antitela nisu imali značajne efekte; dvovalentni fragmenti antitela indukovali su nishodnu regulaciju ekspresije receptora na površini ćelija bez narušavanja njihove internalizacije i reciklovanje i bez narušavanja ćelijskog rasta; viševalentni IgM indukovali su nagomilavanje antitelo-kompleksiranog receptora na površini ćelije, blokirajući njegovu internalizaciju i dovodeći do snažne inhibicije ćelijskog rasta.

[0008] Iz gorepomenutog stanja tehnike proizilazi da anti-proliferativna svojstva anti-TfR antitela snažno variraju od jednog antitela do drugog i da se ne mogu predvideti na osnovu njihove sposobnosti da blokiraju ili ne transferin koji se vezuje za svoj receptor.

[0009] U prethodnoj publikaciji (Moura et al., J Exp Med, 194, 417-425, 2001), pronalazači su prijavili mišja monoklonalna IgG (IgG2kappa), označen A24, koja se vezuju za humani TfR.

[0010] WO2005/111082 opisuje A24 antitelo, mišje antitelo koje može da blokira T ćelijsku proliferaciju, a za koje se čini da je efikasnije od prethodno opisanog mAb 42/6 u inhibiranju proliferacije T ćelija. A24 sprečava Tf od vezivanja TfR na kompetitivan način. A24 takođe redukuje TfR ekspresiju i narušava TfR reciklovanje. A24 takođe može da blokira ex vivo proliferaciju malignih T ćelija i akutnih i hroničnih oblika ATL (Moura et al., Blood, 103,5, 1838-45,1 March 2004, Callens et al., 2010; J. Exp. Med. , Vol 207 No 4, pp731-750). Ovo antitelo takođe je opisano kao da može da spreči razvoj tumora limfoma plašt ćelija i in vitro i in vivo (Lepelletier et al. Cancer Res 2007; 67:1145-1154; Callens et al.2008, Leukemia, 22, 42-48).

[0011] WO2014/020140 dalje opisuje antagonist TfR kao što su anti-TfR antitela za upotrebu u lečenju β talasemije.

[0012] Za davanje čoveku, danas je obavezno da se humanizuju antitela mišjeg porekla, da bi se sprečile reakcije imunogenosti. Međutim, izvođenjem prvog procesa humanizacije A24 antitela, pronalazači su otkrili gubitak vezivanja i apoptotička svojstva među svim humanizovanim varijantama. Prema tome, pronalazači morali su da konstruišu specifične varijante A24 u nekoliko faza humanizacije, koje kombinuju održavana funkcionalna svojstva A24 roditeljskog antitela sa predviđenim smanjenjem imunogenosti za ljude.

Suština

[0013] Ovaj pronalazak definisan je u patentnim zahtevima.

[0014] Ovo otkrivanje se, prema tome, odnosi na izolovano anti-TfR antitelo ili protein sa antigenvezujućim delom anti-TfR antitela, koje obuhvata ili,

(a) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata HCDR1 od SEQ ID NO:1, HCDR2 od SEQ ID NO:2, HCDR3 od SEQ ID NO:3 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata LCDR1 od SEQ ID NO:4, LCDR2 od SEQ ID NO:5 i LCDR3 od SEQ ID NO:6;

(b) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata HCDR1 od SEQ ID NO:1, HCDR2 od SEQ ID NO:2, HCDR3 od SEQ ID NO:3 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata LCDR1 od SEQ ID NO:4, LCDR2 od SEQ ID NO:8 i LCDR3 od SEQ ID NO:6;

(c) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:11 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata VL od SEQ ID NO:13;

(d) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:11 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata VL od SEQ ID NO:14;

(e) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:11 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata VL od SEQ ID NO:15;

(f) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:12 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata VL od SEQ ID NO:13;

(g) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:12 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata VL od SEQ ID NO:14;

(h) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:12 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata VL od SEQ ID NO:15;

pri čemu se pomenuto anti-TfR antitelo ili protein specifično vezuje za receptor za transferin od SEQ ID NO:16.

[0015] U specifičnom načinu ostvarivanja, pomenuto antitelo ili protein vezuje se za receptor za transferin sa KDod 10nM ili manje, poželjno sa KDod 1nM ili manje.

[0016] U nekom drugom specifičnom načinu ostvarivanja, pomenuto antitelo ili protein indukuje apoptozu HL-60 ćelijske linije do nivoa koji je jednak ili viši od nivoa indukcije izmerenog sa odgovarajućim himernim antitelom sa roditeljskim mišjim varijabilnim regionima koji imaju VH od SEQ ID NO:9 i VL od SEQ ID NO:10.

[0017] Poželjno, takvo anti-TfR antitelo prema ovom otkrivanju je humanizovano anti-TfR antitelo.

[0018] U nekom drugom specifičnom načinu ostvarivanja koji može da se kombinuje sa prethodnim načinima ostvarivanja, pomenuto anti-TfR antitelo obuhvata konstantni region humanog IgG4 izotipa, ili mutantni ili hemijski modifikovani konstantni region, pri čemu pomenuti mutantni ili hemijski modifikovani konstantni region ne dodeljuje ili dodeljuje smanjenu ADCC aktivnost pomenutom antitelu u poređenju sa odgovarajućim antitelom sa konstantnim regionom IgG1 izotipa divljeg tipa.

Alternativno, pomenuto anti-TfR antitelo ili protein može da obuhvata konstantni region humanog IgG1 izotipa, ili mutantni ili hemijski modifikovani konstantni region, pri čemu pomenuti mutantni ili hemijski modifikovani konstantni region dodeljuje povećanu ADCC aktivnost pomenutog antitela u poređenju sa odgovarajućim antitelom sa konstantnim regionom IgG1 izotipa divljeg tipa.

[0019] Primeri antitela prema ovom otkrivanju uključuju humanizovano anti-TfR antitelo mAb1 do mAb16 kao što je opisano u nastavku, posebno u Tabeli 1.

[0020] Ovde su takođe opisana izolovana anti-TfR antitela ili proteini kao što su prethodno definisani, za upotrebu kao lek, ili u dijagnostici, na primer, za upotrebu u lečenju nekog tumora. Pomenuti tumor je poželjno neki hematološki tumor, npr. neki limfom ili leukemija.

[0021] Alternativno, pomenuto izolovano anti-TfR antitelo ili protein može takođe da se koristi u lečenju HTLV-1 povezanih bolesti, da smanji virusno opterećenje kod zapaljenjskih poremećaja povezanih sa HTLV-1 infekcijom, uključujući HAM/TSP, polimiozitis i artritis.

[0022] Ovo otkrivanje dalje se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata anti-TfR antitelo ili protein kao što su prethodno definisani, u kombinaciji sa jednim ili više od farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa, razblaživača ili nosača. Farmaceutska kompozicija može dodatno da uključuje druge aktivne sastojke.

[0023] U specifičnom načinu ostvarivanja, pomenuta kompozicija je formulacija liofilizata, ili prethodno napunjen špric ili prethodno napunjena fiolica, koja obuhvata terapeutski prihvatljivu količinu anti-TfR antitela ili proteina kao što su prethodno definisani.

[0024] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira najmanje varijabilni(e) region(e) teškog i/ili lakog lanca antitela ili proteina kao što su prethodno definisani; klonirajući ili ekspresioni vektor koji obuhvata jednu ili više takvih nukleinskih kiselina, ili klonirajući ili ekspresioni vektor za rekombinantnu proizvodnju anti-TfR antitela kao što su prethodno definisani u ćeliji domaćina.

[0025] U specifičnom načinu ostvarivanja, klonirajući ili ekspresioni vektor obuhvata ili najmanje jednu od sledećih nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptide teškog i lakog lanca bilo kog od mAb1 do mAb16 kao što su definisani u Primerima u nastavku.

[0026] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na ćeliju domaćina koja obuhvata jedan ili više klonirajućih ili ekspresionih vektora kao što su prethodno definisani.

[0027] Ovo otkrivanje dalje se odnosi na postupak za proizvodnju anti-TfR antitela ili proteina kao što su prethodno definisani, koji obuhvata: (i) kultivisanje ćelije domaćina ovog otkrivanja za ekspresiju pomenutog antitela ili proteina od strane ćelije domaćina; opciono (ii) prečišćavanje pomenutog antitela ili proteina; i, (iii) ponovno dobijanje pomenutog antitela ili proteina.

Legende crteža

[0028]

Fig.1 je dijagram koji prikazuje nedostatak indukcije apoptoze prvih 6 humanizovanih varijanti INA01 (INA01 varijante 1-6) u poređenju sa himernim INA01 antitelom sa varijabilnim regionima roditeljskog A24 kao što je izmereno prema testu indukcije HL-60 apoptoze.

Fig.2 je dijagram koji prikazuje poboljšani efekat apoptoze druge runde humanizovanih varijanti (INA01 varijante 7-11), međutim i dalje ispod himernog INA01 antitela sa varijabilnim regionima roditeljskog A24, kao što je izmereno prema testu indukcije HL-60 apoptoze.

Fig.3 je dijagram koji prikazuje efektivnu indukciju apoptoze treće runde humanizovanih varijanti (INA01 varijante 12-17), superiornu nad himernim INA01 antitelom sa varijabilnim regionima roditeljskog A24, kao što je izmereno prema testu indukcije HL-60 apoptoze.

Fig.4 Prinos proizvodnje mAb1 do mAb16: Količina (mg) svakog proizvedenog antitela mAb1 do mAb16 prikazana je na osnovu 2 proizvodne šarže.

Fig.5 prikazuje poravnanje VL sekvenci prema ovom otkrivanju sa VL roditeljskog A24 (Fig.5a) i poravnanje VH sekvenci prema ovom otkrivanju sa VH roditeljskog A24 (Fig.5b).

Detaljni opis

Definicije

[0029] Kako bi se ovo otkrivanje jasnije razumelo, određeni pojmovi prvo su definisani. Dodatne definicije date su u detaljnom opisu.

[0030] Izraz "imunološki odgovor" odnosi se na delovanje, na primer, limfocita, antigen prezentujućih ćelija, fagocitnih ćelija, granulocita i rastvorljivih makromolekula proizvedenih od strane gornjih ćelija ili jetre (uključujući antitela, citokine i komplement) koje rezultuje selektivnim oštećenjem, uništavanjem ili uklanjanjem, iz ljudskog tela, patogena, ćelija ili tkiva inficiranih patogenima, kancerogenih ćelija ili, u slučaju autoimunosti ili patološkog zapaljenja, normalnih humanih ćelija ili tkiva.

[0031] "Put signalne transdukcije" ili "aktivnost signalizacije" odnosi se na biohemijsku uzročnoposledičnu vezu koju uopšteno inicira protein-protein interakcija kao što je vezivanje faktora rasta za receptor, što dovodi do prenosa signala iz jednog dela ćelije u drugi deo ćelije. Uopšteno, prenos uključuje specifičnu fosforilaciju jednog ili više ostataka tirozina, serina ili treonina na jedan ili više proteina u serijama reakcija koje izazivaju signalnu transdukciju. Pretposlednji procesi obično uključuju događaje u jezgru, što rezultuje promenom u ekspresiji gena.

[0032] Pojam CD71 ili receptor za transferin ili TfR odnosi se na humani TfR kao što je definisano u SEQ ID NO: 16, osim ako je drugačije opisano.

[0033] Pojam "antitelo" kao što je ovde navedeno uključuje cela antitela i bilo koje antigen-vezujuće fragmente (tj., "antigen-vezujući deo") ili njihove pojedinačne lance.

[0034] "Antitelo" koje se javlja u prirodi je glikoprotein koji obuhvata najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sastoji se od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sastoji se od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sastoji se od jednog domena, CL. VH i VL regioni mogu dalje biti podeljeni u regione hipervarijabilnosti, nazvani regioni koji određuju komplementarnost (CDR), prošarani regionima koji su očuvaniji, nazvani okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL sastoji se od tri CDR i četiri FR raspoređenih od amino-kraja do karboksi-kraja u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji uzajamno reaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju vezivanje imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući razne ćelije imunološkog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplemenata.

[0035] Pojam "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "antigenski deo"), kao što se ovde koristi, odnosi se na punu dužinu ili jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen (npr., deo TfR). Pokazalo se da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvesti fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih pojmom "antigenvezujući deo" antitela uključuju Fab fragment, monovalentni fragment kojeg čine VL, VH, CLi CH1 domeni; F(ab)2fragment, dvovalentni fragment koji obuhvata dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; Fd fragment kojeg čine VHi CH1 domeni; Fv fragment kojeg čine VLi VHdomeni jednog kraka antitela; Unibody koje se sastoji od jednog kraka sa modifikovanim IgG teškim lancem, na primer IgG4, u zglobnom regionu, domenski fragment antitela (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), ili fragment nanotela kojeg čini VHdomen; i izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR), ili bilo koje fuzione proteine koji obuhvataju takav antigen-vezujući deo.

[0036] Osim toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana zasebnim genima, oni mogu biti spojeni, pomoću rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji im omogućava da se izrade kao jednolančani protein u kom se VL i VH regioni uparuju radi obrazovanja monovalentnih molekula (poznatih kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird et al., 1988 Science 242:423-426; i Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci.85:5879-5883). Takva jednolančana antitela takođe su namenjena da budu obuhvaćena pojmom "antigen-vezujući deo" antitela. Ovi fragmenti antitela dobijaju se pomoću konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima u tehnici, a fragmenti su pregledani za upotrebu na isti način kao intaktna antitela.

[0037] "Izolovano antitelo", kao što se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje je suštinski bez ostalih antitela koja imaju drugačije antigenske karakteristike (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TfR je suštinski bez antitela koja se specifično vezuju za drugačije antigene od TfR). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za TfR može, međutim, da ima unakrsnu reaktivnost prema drugim antigenima, kao što su TfR molekuli iz drugih vrsta. Štaviše, izolovano antitelo može biti suštinski bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemijskih jedinjenja. Izrazi "monoklonalno antitelo" ili "kompozicija monoklonalnog antitela" kao što se ovde koristi odnose se na pripremu molekula antitela jednog molekulskog sastava. Kompozicija monoklonalnog antitela pokazuje pojedinačnu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop.

[0038] Kao što se ovde koristi, "izotip" odnosi se na klasu antitela (npr., IgM, IgE, IgG kao što je IgG1 ili IgG4) koja je snabdevena genima konstantnog regiona teškog lanca.

[0039] Izraz " antitelo koje prepoznaje neki antigen" i " antitelo specifično za neki antigen" koriste se naizmenično ovde sa izrazom "antitelo koje se specifično vezuje za antigen".

[0040] Kao što se ovde koristi, antitelo ili protein koje se "specifično vezuje za neki antigen", na primer koje se "specifično vezuje za TfR" treba da se odnosi na neko antitelo ili protein koje se vezuje za pomenuti antigen (na primer humani TfR od SEQ ID NO:16) sa KDod 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje.

[0041] Pojam "KD", kao što se ovde koristi, treba da se odnosi na konstantu disocijacije, koja se dobija iz odnosa Kdprema Ka(tj. Kd/Ka) i izražen je kao molarna koncentracija (M). KDvrednosti za antitela mogu se odrediti pomoću postupaka dobro ustanovljenih u tehnici. Postupak za određivanje KDnekog antitela je pomoću rezonancije površinskog plazmona, ili pomoću biosenzornog sistema kao što je Biacore® sistem. Test za merenje KDanti-TfR antitela pomoću Biacore® sistema opisan je u Primerima dole.

[0042] Pojam "Kassoc" ili "Ka", kao što se ovde koristi, treba da se odnose na brzinu vezivanja određene antitelo-antigen interakcije, dok pojmovi "Kdis" ili "Kd," kao što se ovde koriste, treba da se odnose na brzinu disocijacije određene antitelo-antigen interakcije.

[0043] Kao što se ovde koristi, pojam "afinitet" odnosi se na jačinu interakcije između antitela i antigena na pojedinačnim antigenskim mestima. U okviru svakog antigenskog mesta, varijabilni region "kraka" antitela uzajamno reaguje putem slabih nekovalentnih sila sa antigenom na brojnim mestima; što je više interakcija, jači je afinitet.

[0044] Kao što se ovde koristi, pojam "avidnost" odnosi se na informativnu meru sveukupne stabilnosti ili jačine antitelo-antigen kompleksa. Kontrolisano je pomoću tri glavna faktora: afinitet antitela prema epitopu; valenca i antigena i antitela; i strukturni raspored delova koji uzajamno reaguju. Konačno, ovi faktori definišu specifičnost antitela, to jest, verovatnoću da će se određeno antitelo vezati za određeni epitop antigena. U specifičnom načinu ostvarivanja, pomenuto anti-TfR antitelo ovog otkrivanja je dvovalentno antitelo.

[0045] Kao što se ovde koristi, pojam "HL-60 ćelijska linija" odnosi se na promijelocitik dobijen od Collins et al. (PNAS 1978, 75:2458-1462) i takođe opisan u Gallagher et al (Blood, 1979, 54:713-733), na primer dostupan u ATCC® kolekciji pod kataloškim nazivom CCL-240™.

[0046] Kao što se ovde koristi, antitelo A24 odnosi se na antitelo kao što je opisano u WO2005/111082.

[0047] Kao što se ovde koristi, pojam "ADCC" ili aktivnost "ćelijska citotoksičnost posredovana antitelima" odnosi se na aktivnost ćelijske deplecije. ADCC aktivnost može se izmeriti komercijalno dostupnim ADCC testovima, na primer, ADCC Reporter biotest kao što je komercijalizovan od strane Promega pod Ref# G7015, i kao što je ukratko opisan u Primerima.

[0048] Kao što se ovde koristi, pojam "subjekat" uključuje bilo kog čoveka ili nehumanu životinju. Pojam "nehumana životinja" uključuje sve kičmenjake, npr., sisare i one koji nisu sisari, kao što su nehumani primati, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, vodozemci, reptili, itd.

[0049] Kao što se ovde koristi, pojam "optimizovan" znači da je nukleotidna sekvenca izmenjena da kodira aminokiselinu sekvencu pomoću kodona koji su poželjni u proizvodnji ćelije ili organizma, uopšteno eukariotska ćelija, na primer, jajna ćelija kineskog hrčka (CHO) ili humana ćelija. Optimizovana nukleotidna sekvenca konstruisana je da zadrži u potpunosti, ili koliko je to moguće, aminokiselinu sekvencu originalno kodiranu početnom nukleotidnom sekvencom. Aminokiselinske sekvence kodirane optimizovanim nukleotidnim sekvencama takođe se nazivaju optimizovane.

[0050] Kao što se ovde koristi, procenat identiteta između dve sekvence je funkcija broja identičnih položaja koje dele sekvence (tj., % identiteta = broj identičnih položaja/ukupan broj položaja x 100), uzimajući u obzir broj praznina, i dužinu svake praznine, koju je potrebno uvesti za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identiteta između dve sekvence može se postići pomoću matematičkog algoritma, kao što je opisano u nastavku.

[0051] Procenat identiteta između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti pomoću algoritma od E. Meyers i W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) koji je ugrađen u ALIGN program (verzija 2.0), pomoću tabele PAM120 težinskih ostataka, vrednost dužine praznine od 12 i vrednost praznine od 4. Alternativno, procenat identiteta između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti pomoću Needleman i Wunsch (J. Mol, Biol.48:444-453, 1970) algoritma koji je ugrađen u GAP program u GCG softverskom paketu (dostupan na http://www.gcg.com), korišćenjem ili Blossom 62 matrice ili PAM250 matrice, i težine praznine od 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i težine dužine od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.

[0052] Procenat identiteta između dve nukleotidne aminokiselinske sekvence može se takođe odrediti pomoću, na primer, algoritama kao što je BLASTN program za sekvence nukleinske kiseline koji koristi kao zadate dužinu reči (W) od 11, očekivanje (E) od 10, M=5, N=4, i poređenje oba lanca.

Rekombinantna antitela

[0053] Antitela ovog otkrivanja uključuju humanizovana rekombinantna antitela mAb1-mAb16, izolovana i strukturno okarakterisana njihovim aminokiselinskim sekvencama varijabilnih teških i lakih lanaca i humanim konstantnim regionom izotipa kao što je opisano u Tabeli 1 dole:

Tabela 1: Aminokiselinske sekvence varijabilnih teških i lakih lanaca od mAb1-mAb16

[0054] Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca i kodirajuća sekvenca nukleotida konstantnih regiona izotipa IgG4, IgG1 i njihovih mutantnih verzija IgG1 AA i IgG1 N297A korišćenih za generisanje mAb1 do mAb16 dobro su poznate u tehnici.

[0055] Laki i teški lanci pune dužine i odgovarajuće kodirajuće sekvence mAb1 prikazane su u Tabeli 2 dole.

Tabela 2: DNK kodirajuće sekvence teških i lakih lanaca pune dužine

1

[0056] Primeri aminokiselinskih sekvenci VH CDR1 (takođe se nazivaju HCDR1), VH CDR2 (takođe se nazivaju HCDR2), VH CDR3 (takođe se nazivaju HCDR1), VL CDR1 (takođe se nazivaju LCDR1), VL CDR2 (takođe se nazivaju LCDR2), VL CDR3 (takođe se nazivaju HCDR3) nekih antitela prema ovom otkrivanju prikazani su u Tabeli 3.

[0057] U Tabeli 3, CDR regioni nekih antitela ovog otkrivanja opisani su pomoću Chothia sistema (Chothia C, Lesk AM.1987, J Mol Biol 196, 901-917).

[0058] Radi lakšeg čitanja, CDR regioni u nastavku su nazvani HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 tim redosledom.

Tabela 3: CDR regioni iz mAb1 do mAb16 i referentno A24 antitelo prema Chothia definiciji

[0059] U jednom načinu ostvarivanja, izolovano rekombinantno antitelo ima: varijabilni region teškog lanca koji obuhvata HCDR1 od SEQ ID NO: 1; HCDR2 od SEQ ID NO: 2; HCDR3 od SEQ ID NO: 3; varijabilni region lakog lanca koji obuhvata LCDR1 od SEQ ID NO: 4; LCDR2 od SEQ ID NO: 5 ili 8; i LCDR3 od SEQ ID NO: 6; pri čemu se pomenuto antitelo specifično vezuje za receptor za transferin od SEQ ID NO:16.

[0060] U specifičnim načinima ostvarivanja, izolovano rekombinantno antitelo prema ovom pronalasku obuhvata ili:

(a) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata HCDR1 od SEQ ID NO:1, HCDR2 od SEQ ID NO:2, HCDR3 od SEQ ID NO:3 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata LCDR1 od SEQ ID NO:4, LCDR2 od SEQ ID NO:5 i LCDR3 od SEQ ID NO:6;

(b) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata HCDR1 od SEQ ID NO:1, HCDR2 od SEQ ID NO:2, HCDR3 od SEQ ID NO:3 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata LCDR1 od SEQ ID NO:4, LCDR2 od SEQ ID NO:8 i LCDR3 od SEQ ID NO:6;

(c) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:11 i polipeptid varijabilnog lakog lanca VL od SEQ ID NO:13;

(d) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:11 i polipeptid varijabilnog lakog lanca VL od SEQ ID NO:14;

(e) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:12 i polipeptid varijabilnog lakog lanca VL od SEQ ID NO:13;

(f) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:12 i polipeptid varijabilnog lakog lanca VL od SEQ ID NO:14;

pri čemu se pomenuto anti-TfR antitelo specifično vezuje za receptor za transferin od SEQ ID NO:16.

[0061] U specifičnom načinu ostvarivanja, pomenuto rekombinantno anti-TfR antitelo kao što je prethodno definisano ima jedno ili više od sledećih svojstava:

(i) Vezuju se za receptor za transferin sa KDod 10nM ili manje, poželjno sa KDod 1nM ili manje, mereno pomoću SPR, na primer kao što je opisano u Primerima dole;

(ii) vezuje se za receptor za transferin sa EC50 od 0.1 µg/ml ili manje, poželjno od 0.05 µg/ml ili manje, mereno u ELISA testu kao što je opisano u Primerima dole;

(iii) indukuje apoptozu HL-60 ćelijske linije do nivoa koji je jednak ili viši od nivoa indukcije izmerenog sa odgovarajućim referentnim himernim antitelom koje ima roditeljske mišje varijabilne regione sa VH od SEQ ID NO:9 i VL od SEQ ID NO:10, na primer mereno pomoću testa indukcije HL-60 apoptoze. Obično, količina 10 µg/ml rekombinantnog antitela ovog otkrivanja može da se testira za indukciju apoptoze HL-60 ćelijske linije u poređenju sa istom količinom referentnog himernog antitela sa roditeljskim mišjim varijabilnim regionima iz A24 koje obuhvata VH od SEQ ID NO:9 i VL od SEQ ID NO:10. Indukcija apoptoze u Testu indukcije HL-60 apoptoze ispitivanog antitela jednaka je onoj referentnog antitela ako procenat pozitivnih ćelija meren sa ispitivanim antitelom nije značajno niži od procenta pozitivnih ćelija izmerenog sa referentnim antitelom.

[0062] Kao što se ovde koristi, "odgovarajuće" referentno himerno antitelo odnosi se na referentno antitelo sa konstantnim regionom izotipa koji je 100% identičan konstantnom regionu izotipa antitela čije se određeno svojstvo ispituje, na primer indukcija apoptoze.

[0063] U određenim načinima ostvarivanja koji mogu da se kombinuju sa prethodnim načinima ostvarivanja, antitelo obezbeđeno ovde je neki fragment antitela gore definisanih antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali bez ograničenja, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, Unibody i scFv fragmente, dijatela, jedan domen ili nanotela i ostale fragmente.

[0064] Pojam "dijatela" odnosi se na male fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, koji fragmenti obuhvataju varijabilni domen teškog lanca (VH) vezan za varijabilni domen lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Pomoću linkera koji je prekratak da dozvoli uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni moraju da se upare sa komplementarnim domenima drugog lanca i obrazuju dva antigen-vezujuća mesta.

[0065] Antitela jednog-domena su fragmenti antitela koji obuhvataju ceo ili neki deo varijabilnog domena teškog lanca ili ceo ili neki deo varijabilnog domena lakog lanca nekog antitela. U određenim načinima ostvarivanja, antitelo jednog-domena je neko humano antitelo jednog-domena (Domantis, Inc., Waltham, MA; vidi, npr., U.S. Patent br.6,248,516 B1).

[0066] Fragmenti antitela mogu se izvesti različitim tehnikama, uključujući, ali bez ograničenja, proteolitičku digestiju intaktnog antitela kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina kao što su opisane ovde.

1

[0067] U određenim načinima ostvarivanja, antitelo ovog otkrivanja je humanizovano antitelo. Obično, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, dok ima najmanje isti afinitet (ili superiorni afinitet) roditeljskog nehumanog antitela. U poželjnim načinima ostvarivanja, antitela ovog otkrivanja su humanizovana antitela roditeljskog antitela A24.

[0068] Uopšteno, humanizovano antitelo obuhvata jedan ili više varijabilnih domena u kojima su CDR (ili njihovi delovi) izvedeni iz nehumanog antitela, npr. mišje A24 antitelo, a FR (ili njihovi delovi) su izvedeni iz sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono će, takođe, da obuhvata najmanje neki deo humanog konstantnog regiona. U nekim načinima ostvarivanja, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu supstituisani su odgovarajućim ostacima iz nehumanog antitela (npr., A24 antitelo iz kog su izvedeni CDR ostaci), npr., da bi se ponovo uspostavila ili poboljšala specifičnost ili afinitet antitela. U nekim specifičnim načinima ostvarivanja, neki CDR ostaci u humanizovanom antitelu takođe su supstituisani, npr., da bi se ponovo uspostavila ili poboljšala specifičnost ili afinitet antitela.

[0069] Humanizovana antitela i postupci njihove proizvodnje razmatrani su, npr., u Almagro i Fransson, Front. Biosci.13: 1619-1633 (2008), i dalje su opisani, npr., u Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); US Patent br.5,

821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Kashmiri et al, Methods 36:25-34 (2005) (koji opisuje kalemljenje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, Mol. Immunol.28:489-498 (1991) (koji opisuje "obnavljanje površine"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (koji opisuje "FR mešanje"); i Osbourn et al, Methods 36:61-68 (2005) i Klimka et al, Br. J. Cancer, 83 :252-260 (2000) (koji opisuje pristup "vođeni izbor" FR mešanju).

[0070] Poželjno rekombinantno antitelo prema ovom otkrivanju je humanizovan tiho antitelo, poželjno humanizovano tiho IgG1 ili IgG4 antitelo.

[0071] Kao što se ovde koristi, pojam "tiho" antitelo odnosi se na antitelo koje ne pokazuje ili pokazuje malu ADCC aktivnost izmerenu u testu ADCC aktivnosti.

[0072] U jednom načinu ostvarivanja, izraz "nema ili mala ADCC aktivnost" znači da tiho antitelo pokazuje ADCC aktivnost koja je najmanje ispod 10%, na primer ispod 50% ADCC aktivnosti koja je primećena sa odgovarajućim antitelom sa humanim IgG1 izotipom divljeg tipa.

[0073] Utišane efektorske funkcije mogu se dobiti mutacijom u Fc konstantnom delu antitela i opisane su u stanju tehnike: Strohl 2009 (AA & N297A); Baudino 2008, D265A (Baudino et al., J.Immunol.181 (2008): 6664-69, Strohl, CO Biotechnology 20 (2009): 685-91). Primeri tihih IgG1 antitela obuhvataju takozvani AA mutant koji obuhvata L234A i L235A mutaciju u IgG1 Fc aminokiselinskoj sekvenci. Drugo tiho IgG1 antitelo obuhvata N297A mutaciju, koja rezultuje aglikoziliranim ili neglikoziliranim antitelima.

[0074] Antitela sa mutantnim aminokiselinskim sekvencama mogu se dobiti mutagenezom (npr., mutageneza usmerena na određeno mesto ili PCR-posredovana mutageneza) molekula kodirajuće nukleinske kiseline, praćeno ispitivanjem kodiranog izmenjenog antitela na zadržanu funkciju (tj., funkcije izložene gore) pomoću funkcionalnih testova opisanih ovde.

Antitela sa konzervativnim modifikacijama

[0075] U određenim načinima ostvarivanja, antitelo (ili vezujući protein koji obuhvata njegov antigenvezujući deo) ovog otkrivanja ima varijabilni region teškog lanca koji obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence, pri čemu jedna ili više od ovih CDR sekvenci ima određene aminokiselinske sekvence bazirane na mAb1 do mAb16 antitelima opisanim ovde ili njihove konzervativne modifikacije, i gde antitelo ili protein zadržava željena funkcionalna svojstva anti-TfR antitela ovog otkrivanja.

[0076] Željena funkcionalna svojstva anti-TfR antitela uključuju bez ograničenja:

(i) vezivanje za receptor za transferin sa KDod 10nM ili manje, poželjno sa KDod 1nM ili manje, na primer mereno pomoću SPR testa, na primer pomoću Biacore®;

(ii) vezuje se za receptor za transferin sa EC50 od 0.1 µg/ml ili manje, poželjno od 0.05 µg/ml ili manje, mereno u ELISA testu kao što je opisano u Primerima dole;

(iii) indukuje apoptozu HL-60 ćelijske linije do nivoa koji je jednak ili viši od nivoa indukcije izmerenog sa odgovarajućim referentnim himernim antitelom koje ima roditeljske mišje varijabilne regione sa VH od SEQ ID NO:9 i VL od SEQ ID NO:10, na primer izmereno pomoću testa indukcije HL-60 apoptoze. Obično, količina 10µg/ml rekombinantnog antitela ovog otkrivanja može da se ispita za indukciju apoptoze HL-60 ćelijske linije u poređenju sa istom količinom referentnog himernog antitela sa roditeljskim mišjim varijabilnim regionima iz A24 koje obuhvata VH od SEQ ID NO:9 i VL od SEQ ID NO:10. Indukcija apoptoze u testu indukcije HL-60 apoptoze ispitivanog antitela jednaka je onoj referentnog antitela ako procenat pozitivnih ćelija izmeren sa ispitivanim antitelom nije značajno manji od procenta pozitivnih ćelija izmerenog sa referentnim antitelom.

[0077] Kao što se ovde koristi, izraz "konzervativne modifikacije sekvenci" treba da se odnose na supstitucije aminokiselina u kojima se aminokiselinski ostatak zamenjuje nekim aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance definisane su u tehnici. Ove porodice uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr., aspartinska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-razgranatim bočnim lancima (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Tako, jedan ili više aminokiselinskih ostataka unutar CDR regiona nekog antitela ovog otkrivanja mogu da se zamene drugim aminokiselinskim ostacima iz

1

iste porodice bočnih lanaca, a izmenjeno antitelo može da se ispita na zadržanu funkciju pomoću funkcionalnih testova opisanih ovde.

[0078] Modifikacije se mogu uvesti u antitelo ovog otkrivanja standardnim tehnikama poznatim u tehnici, kao što je mutageneza usmerena na određeno mesto i PCR-posredovana mutageneza.

Inženjering okvirnih regiona ili Fc inženjering

[0079] Konstruisana antitela ovog otkrivanja uključuju ona u kojima su modifikacije izvedene na ostacima okvirnog regiona unutar VH i/ili VL, npr. da bi se poboljšala svojstva antitela. Obično, takve modifikacije okvirnih regiona izvode se radi smanjenja imunogenosti antitela. Na primer, jedan pristup je da se "unazad mutira" jedan ili više ostataka okvirnog regiona u odgovarajuću sekvencu germinitivnu liniju. Određenije, antitelo koje je podvrgnuto somatskoj mutaciji može da sadrži ostatke okvirnog regiona koji se razlikuju od sekvence germinitivne linije od koje je antitelo dobijeno. Takvi ostaci mogu se identifikovati poređenjem sekvenci okvirnog regiona antitela sa sekvencama germinitivne linije od koje je antitelo dobijeno. Da bi se vratile sekvence okvirnog regiona u konfiguraciju njihove germinitivne linije, somatske mutacije mogu biti "unazad mutirane" u sekvencu germinitivne linije pomoću, na primer, mutageneze usmerene na određeno mesto ili PCR-posredovane mutageneze. Takva "unazad mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena ovim otkrivanjem.

[0080] Druga vrsta modifikacije okvirnog regiona uključuje mutiranje jednog ili više ostataka unutar okvirnog regiona, ili čak unutar jednog ili više CDR regiona, radi uklanjanja T ćelijskih-epitopa čime se smanjuje potencijalna imunogenost antitela.

[0081] Određenije, kompanija Antitope (Cambridge UK) razvila je niz zaštićenih tehnologija za procenu i uklanjanje imunogenosti, koje se zasnivaju na identifikovanju lokacije T ćelijskih epitopa u terapeutskim antitelima i proteinima. Ove tehnologije sumirane su dole:

□ iTope™ - in silico tehnologija za predviđanje vezivanja peptida za humane MHC alele klase II (Perry et al 2008 Drugs in R&D, 9(6):385-396).

□ TCED™ - baza podataka poznatih T ćelijskih epitopa identifikovanih u ispitivanjima pomoću EpiScreen™ testova mapiranja T ćelijskih epitopa naročito V regiona antitela (Bryson et al 2010 Biodrugs 24(1):1-8). Baza podataka se može pretražiti pomoću BLAST pretrage da bi se identifikovali uobičajeni motivi (Altschul et al 1997 Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402).

[0082] Dodatno ili alternativno modifikacijama izvedenim unutar okvirnih ili CDR regiona, antitela ovog otkrivanja mogu se konstruisati tako da uključuju modifikacije unutar Fc regiona, obično radi izmene jednog ili više funkcionalnih svojstava antitela, kao što su poluživot u serumu, fiksacija komplementa, Fc receptorsko vezivanje i/ili antigen-zavisna ćelijska citotoksičnost.

[0083] Osim toga, antitelo ovog otkrivanja može biti hemijski modifikovano (npr., jedan ili više hemijskih ostataka mogu biti vezani za antitelo) ili može biti modifikovano radi izmene njegove glikozilacije, opet

1

radi izmene jednog ili više funkcionalnih svojstava antitela. Svaki od ovih načina ostvarivanja detaljno je opisan u nastavku.

[0084] Kao što se ovde koristi, pojam "konstantni region izotipa" ili "Fc region" koriste se naizmenično radi definisanja C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina, uključujući Fc region prirodne sekvence i Fc regione varijanti. Fc region teškog lanca humanog IgG uopšteno je definisan kao onaj koji obuhvata aminokiselinski ostatak iz položaja C226 ili iz P230 na karboksilnom kraju IgG antitela.

Numeracija ostataka u Fc regionu je ona od EU indeksa od Kabata. C-terminalni lizin (ostatak K447) Fc regiona može se ukloniti, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela. Prema tome, kompozicija antitela ovog otkrivanja može da obuhvata populacije antitela sa uklonjenim svim K447 ostacima, populacije antitela gde nisu uklonjeni K447 ostaci, i populacije antitela koje imaju mešavinu antitela sa i bez K447 ostatka.

[0085] U jednom određenom načinu ostvarivanja, zglobni region od CH1 modifikovan je tako da je izmenjen broj ostataka cisteina u zglobnom regionu, npr., povećan ili smanjen. Ovaj pristup je opisan dodatno u U.S. Patent br.5,677,425 od Bodmer et al. Broj ostataka cisteina u zglobnom regionu od CH1 izmenjen je radi, na primer, olakšanja sklapanja lakih i teških lanaca ili radi povećanja ili smanjenja stabilnosti antitela.

[0086] U nekom drugom načinu ostvarivanja, Fc zglobni region nekog antitela je mutiran radi smanjenja biološkog poluživota antitela. Određenije, jedna ili više aminokiselinskih mutacija uvodi se u interfejs region CH2-CH3 domena Fc-zglobnog fragmenta tako da antitelo ima oštećeno vezivanje za Stafilokokni protein A (SpA) u odnosu na SpA vezivanje prirodnog Fc-zglobnog domena. Ovaj pristup detaljno je opisan u U.S. Patent br.6,165,745 od Ward et al.

[0087] U nekom drugom načinu ostvarivanja, antitelo je modifikovano radi produženja njegovog biološkog poluživota. Mogući su razni pristupi. Na primer, može se uvesti jedna ili više od sledećih mutacija: T252L, T254S, T256F, kao što je opisano u U.S. Patent br.6,277,375 prema Ward. Alternativno, da bi se produžio biološki poluživot, antitelo se može izmeniti unutar CH1 ili CL regiona da sadrži vezujući epitop salvage receptora uzet iz dve petlje CH2 domena Fc regiona iz IgG, kao što je opisano u U.S.

Patent br.5,869,046 i 6,121,022 od Presta et al.

[0088] U još nekim drugim načinima ostvarivanja, Fc region je izmenjen zamenom najmanje jednog aminokiselinskog ostatka nekim drugačijim aminokiselinskim ostatkom radi izmene efektorskih funkcija antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselina može se zameniti drugačijim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjen afinitet za efektorski ligand ali zadržava antigen-vezujuću sposobnost roditeljskog antitela. Efektorski ligand prema kom je afinitet izmenjen može biti, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup detaljnije je opisan u U.S. Patent br.5,624,821 i 5,648,260, oba od Winter et al.

[0089] U nekom drugom načinu ostvarivanja, jedna ili više aminokiselina odabranih od aminokiselinskih ostataka može biti zamenjena drugačijim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjeno

1

C1q vezivanje i/ili smanjenu ili ukinutu citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC). Ovaj pristup detaljnije je opisan u U.S. Patent br.6,194,551 od Idusogie et al.

[0090] U nekom drugom načinu ostvarivanja, jedan ili više aminokiselinskih ostataka izmenjeno je da bi se time izmenila sposobnost antitela da fiksira komplement. Ovaj pristup dodatno je opisan u PCT objavi WO 94/29351 od Bodmer et al.

[0091] U još jednom drugom načinu ostvarivanja, Fc region je modifikovan radi povećanja sposobnosti antitela da posreduje antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) i/ili radi povećanja afiniteta antitela za Fcγ receptor modifikovanjem jedne ili više aminokiselina. Ovaj pristup dodatno je opisan u PCT objavi WO 00/42072 od Presta. Štaviše, vezujuća mesta na humanom IgG1 za FcγRI, FcγRII, FcγRIII i FcRn mapirana su i varijante sa poboljšanim vezivanjem opisane su (vidi Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem 276:6591-6604).

[0092] U drugim načinima ostvarivanja, Fc region je modifikovan radi smanjenja sposobnosti antitela da posreduje antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) i/ili radi smanjenja afiniteta antitela za Fcγ receptor modifikovanjem jedne ili više aminokiselina. Takva antitela sa smanjenim efektorskim funkcijama, a posebno smanjenom ADCC uključuju tiha antitela.

[0093] U određenim načinima ostvarivanja, koristi se Fc domen IgG1 izotipa. U nekim specifičnim načinima ostvarivanja, mutantna varijanta IgG1 Fc fragmenta se koristi, npr. Fc tihog IgG1 koji smanjuje ili uklanja sposobnost fuzionog polipeptida da posreduje antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) i/ili da se veže za Fcγ receptor. Primer tihog mutanta IgG1 izotipa je IgG1 u kom je leucin zamenjen alaninom na aminokiselinskim položajima 234 i 235 kao što je opisano u J. Virol 2001 Dec;75(24):12161-8 od Hezareh et al.

[0094] U određenim načinima ostvarivanja, Fc domen je tihi Fc mutant koji sprečava glikozilaciju na položaju 297 Fc domena. Na primer, Fc domen sadrži supstituciju aminokiseline asparagina na položaju 297. Primer takve supstitucije aminokiseline je zamena N297 glicinom ili alaninom.

[0095] U još jednom drugom načinu ostvarivanja, glikozilacija antitela je modifikovana. Na primer, može se izraditi aglikozilirano antitelo (tj., antitelo bez glikozilacije). Glikozilacija može biti izmenjena radi, na primer, povećanja afiniteta antitela za antigen. Takve modifikacije ugljenih hidrata mogu se postići, na primer, izmenom jednog ili više mesta glikozilacije unutar sekvence antitela. Na primer, može se izvestiti jedna ili više supstitucija aminokiselina koje rezultuju uklanjanjem jednog ili više mesta glikozilacije okvirnog regiona varijabilnog regiona čime se uklanja glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može da poveća afinitet antitela za antigen. Takav pristup detaljnije je opisan u U.S. Patent br.5,714,350 i 6,350,861 od Co et al.

[0096] Dodatno ili alternativno, može se izraditi antitelo koje ima izmenjen tip glikozilacije, kao što je hipofukozilovano antitelo koje ima smanjene količine fukozilnih ostataka ili antitelo koje ima povećano umetanje GlcNac struktura. Ti izmenjeni obrasci glikozilacije pokazali su da povećavaju ADCC sposobnost antitela. Te modifikacije ugljenih hidrata mogu se postići, na primer, eksprimiranjem antitela u ćeliji

1

domaćina sa izmenjenim aparatom glikozilacije. Ćelije sa izmenjenim aparatom glikozilacije opisane su u tehnici i mogu se koristiti kao ćelije domaćina u kojima se eksprimiraju rekombinantna antitela ovog otkrivanja čime se proizvodi antitelo sa izmenjenom glikozilacijom. Na primer, EP 1176195 od Hang et al. opisuje ćelijsku liniju sa funkcionalno oštećenim FUT8 genom, koji kodira fukoziltransferazom, kao što su antitela eksprimirana u takvoj ćelijskoj liniji pokazuju hipofukozilaciju. Prema tome, u jednom načinu ostvarivanja, antitela ovog otkrivanja proizvedena su rekombinantnom ekspresijom u ćelijskoj liniji koja pokazuje obrazac hipofukozilacije, na primer, ćelijska linija sisara sa oskudnom ekspresijom FUT8 gena koji kodira fukoziltransferazu. PCT objava WO 03/035835 od Presta opisuje varijantu CHO ćelijske linije, Lecl3 ćelije, sa smanjenom sposobnošću da vežu fukozu za Asn(297)-vezane ugljene hidrate, pri čemu takođe rezultuje hipofukozilacijom antitela eksprimiranih u toj ćeliji domaćina (vidi takođe Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem.277:26733-26740). PCT objava WO 99/54342 od Umana et al. opisuje ćelijske linije konstruisane da eksprimiraju glikoziltransferaze koje modifikuju glikoproteine (npr., beta(1,4)-N acetilglukozaminiltransferaza III (GnTIII)) tako da antitela eksprimirana u konstruisanim ćelijskim linijama pokazuju povećano umetanje GlcNac struktura što rezultuje povećanom ADCC aktivnošću antitela (vidi takođe Umana et al., 1999 Nat. Biotech.17:176-180).

[0097] Druga modifikacija antitela ovde koja je predviđena ovim otkrivanjem je pegilacija ili hesilacija ili srodne tehnologije. Antitelo može biti pegilovano radi, na primer, produženja biološkog (npr., serum) poluživota antitela. Da bi se pegilovalo antitelo, antitelo ili njegov fragment obično reaguje sa polietilen glikolom (PEG), kao što je reaktivan estar ili aldehidni derivati PEG-a, pod uslovima u kojima jedna ili više PEG grupa postaje vezana za antitelo ili fragment antitela. Pegilacija se može izvesti reakcijom acilovanja ili reakcijom alkilacije sa reaktivnim PEG molekulom (ili analognim reaktivnim polimerom rastvorljivim u vodi). Kao što se ovde koristi, pojam "polietilen glikol" treba da obuhvata bilo koji od oblika PEG-a koji se koristi za dobijanje drugih proteina, kao što su mono (C1-C10) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol ili polietilen glikol-maleimid. U određenim načinima ostvarivanja, antitelo koje se pegiluje je aglikozilirano antitelo. Postupci za pegilaciju proteina poznati su u tehnici i mogu se primeniti na antitela ovog otkrivanja. Vidi na primer, EP 0154316 od Nishimura et al. i EP 0401384 od Ishikawa et al.

[0098] Druga modifikacija antitela koja je predviđena ovim otkrivanjem je konjugat ili fuzija proteina najmanje antigen-vezujućeg regiona antitela ovog otkrivanja sa serumskim proteinom, kao što je humani serumski albumin ili neki njegov fragment radi produženja poluživota dobijenog molekula. Takav pristup je, na primer, opisan u Ballance et al. EP 0322094.

[0099] Druga mogućnost je fuzija najmanje antigen-vezujućeg regiona antitela ovog otkrivanja na proteine koji se mogu vezati za serumske proteine, kao što je humani serumski albumin radi produženja poluživota dobijenog molekula. Takav pristup je, na primer, opisan u Nygren et al., EP 0486525.

[0100] U jednom određenom načinu ostvarivanja, efektorska funkcija ili funkcija aktivacije komplementa antitela prema ovom otkrivanju je smanjena ili uklonjena u odnosu na antitelo divljeg tipa istog izotipa. U jednom aspektu, efektorska funkcija je smanjena ili uklonjena postupkom odabranim od smanjena

1

glikozilacije antitela, modifikacije izotipa antitela u izotip koji prirodno ima smanjenu ili uklonjenu efektorsku funkciju i modifikacije Fc regiona. U određenom povezanom načinu ostvarivanja, pomenuti izotip sa smanjenom ili uklonjenom efektorskom funkcijom je IgG4 izotip.

Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju antitela ovog otkrivanja

[0101] Ovde su takođe opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju anti-TfR antitela ili povezane proteine ovog otkrivanja. Primeri nukleotidnih sekvenci varijabilnog lakog lanca su oni koji kodiraju aminokiselinske sekvence varijabilnog lakog lanca bilo kog od mAb1 do mAb16, pri čemu se potonje sekvence jednostavno dobijaju iz Tabele 1 i Tabele 2, i pomoću genetskog koda i, opciono, uzimajući u obzir pristrasnost prema kodonu zavisno od vrsta ćelija domaćina.

[0102] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na molekule nukleinske kiseline koji izvode iz kasnije sekvence koja je optimizovana za ekspresiju proteina u ćelijama sisara, na primer, CHO ćelijske linije.

[0103] Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili mogu biti nukleinske kiseline u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "učunjena suštinski čistom" kada je prečišćena od drugih ćelijskih komponenata ili drugih kontaminenata, npr., drugih ćelijskih nukleinskih kiselina ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući alkalni/SDS tretman, CsCI vezivanje, kolonsku hromatografiju, elektroforezu u agaroznom gelu i druge dobro poznate u ovoj tehnici. Vidi, F. Ausubel, et al., ed.1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing i Wiley Interscience, New York. Nukleinska kiselina ovog otkrivanja može biti, na primer, DNK ili RNK i može ili ne mora da sadrži intronske sekvence. U nekom načinu ostvarivanja, nukleinska kiselina može biti prisutna u vektoru kao što je vektor otkrivanja faga, ili u vektoru rekombinantnog plazmida.

[0104] Nukleinske kiseline ovog otkrivanja mogu se dobiti pomoću standardnih tehnika molekularne biologije. Kada se DNK fragmenti kodiraju, na primer, VH i VL segmenti se dobijaju, ovi DNK fragmenti mogu dalje da se manipulišu standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer da bi se preveli geni varijabilnog regiona u gene lanca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenta ili u scFv gen. U ovim manipulacijama, VL- ili VH-kodirajući DNK fragment (na primer VL i VH kao što su definisani u Tabeli 1) je radno vezan za drugi DNK molekul, ili za neki fragment koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Pojam "operativno vezan", kao što se koristi u ovom kontekstu, treba da znači da su dva DNK fragmenta spojena na funkcionalni način, na primer, tako da aminokiselinske sekvence kodirane od strane dva DNK fragmenta ostaju u-okviru, ili tako da se protein eksprimira pod kontrolom željenog promotera.

[0105] Izolovana DNK koja kodira VH region može se prevesti gen teškog lanca pune dužine radnim vezivanjem VH-kodirajuće DNk za drugi DNK molekul koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence humanih gena konstantnih regiona teškog lanca poznati su u tehnici (vidi

2

npr., Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S.

Department of Health and Human Services, NIH objava br.91-3242) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnim PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD konstantni region. U nekim načinima ostvarivanja, konstantni region teškog lanca odabran je među IgG1 izotipovima, na primer humani IgG1 izotip. U drugim načinima ostvarivanja, konstantni region teškog lanca odabran je među IgG4 izotipovima, na primer humani IgG4 izotip. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, VH-kodirajuća DNK može biti radno vezana za drugi DNK molekul koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.

[0106] Izolovana DNK koja kodira VL region može se prevesti u gen lakog lanca pune dužine (kao i u gen Fab lakog lanca) radnim vezivanjem VL-kodirajuće DNK za drugi DNK molekul koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence humanih gena konstantnog regiona lakog lanca poznate su u tehnici (vidi npr., Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH objava br.91-3242) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantni region.

[0107] Radi izrade scFv gena, VH- i VL-kodirajući DNK fragmenti su radno vezani za drugi fragment koji kodira fleksibilni linker, npr., koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4 -Ser)3, tako da VH i VL sekvence mogu da se eksprimiraju kao susedni jednolančani protein, sa VL i VH regionima spojenim fleksibilnim linkerom (vidi npr., Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554).

Generisanje transfektoma koji proizvode monoklonalna antitela

[0108] Antitela ovog otkrivanja mogu se proizvesti u transfektomu ćelije domaćina, na primer, kombinacijom tehnika rekombinantne DNK i postupaka transfekcije gena kao što su dobro poznati u tehnici (npr., Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

[0109] Na primer, da bi se eksprimirala antitela, ili fragmenti antitela, DNK koje kodiraju delimične ili lake i teške lance pune dužine mogu se dobiti standardnim tehnikama molekularne biologije ili biohemije (npr., DNK hemijska sinteza, PCR amplifikacija ili cDNK kloniranje pomoću hibridoma koji eksprimira antitelo od interesa) i DNK mogu se umetnuti u ekspresione vektore tako da su geni radno vezan za kontrolne sekvence transkripcije i translacije. U ovom kontekstu, pojam "radno vezan" treba da znači da gen antitela vezan u vektor tako da kontrolne sekvence transkripcije i translacije unutar vektora služe njihovoj namenjenoj funkciji regulisanja transkripcije i translacije gena antitela. Ekspresioni vektor i kontrolne sekvence ekspresije biraju se da budu kompatibilni sa korišćenim ćelijama domaćina za ekspresiju. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu se umetnuti u zasebni vektor ili, uobičenije, oba gena umeću se u isti ekspresioni vektor. Geni antitela se umeću u ekspresioni vektor standardnim postupcima (npr., ligacija komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu gena antitela i vektora, ili ligacija otvorenog kraja ako nisu prisutna restrikciona mesta). Varijabilni regioni lakog i teškog lanca antitela opisani ovde mogu da se koriste za izradu gena antitela pune dužine bilo kog izotipa antitela njihovim umetanjem u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teškog lanca i lakog lanca željenog izotipa tako da je VH segment radno vezan za CH segment(e) unutar vektora, a VL segment je radno vezan za CL segment unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava izlučivanje lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može da se klonira u vektor tako da je signalni peptid vezan u okviru na amino kraju gena lanaca antitela. Signalni peptid može biti signalni peptid imunoglobulina ili heterologni signalni peptid (tj., signalni peptid iz nekog proteina koji nije imunoglobulin).

[0110] Pored gena lanaca antitela, rekombinantni ekspresioni vektori opisani ovde nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanaca antitela u ćeliji domaćina. Pojam "regulatorna sekvenca" treba da uključuje promotere, pojačivače i ostale kontrolne elemente ekspresije (npr., signali poliadenilacije) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanaca antitela. Takve regulatorne sekvence opisane su, na primer, u Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Stručnjaci u ovoj tehnici znaće da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci, može da zavisi od takvih faktora kao što su izbor ćelije domaćina koja će se transformisati, nivo ekspresije željenog proteina, itd. Regulatorne sekvence za ekspresiju u ćelijima domaćina sisara uključuju virusne elemente koji usmeravaju visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promoteri i/ili pojačivači dobijeni od citomegalovirusa (CMV), Simijan Virusa 40 (SV40), adenovirusa (npr., glavni kasni promoter adenovirusa (AdMLP)), i polioma. Alternativno, nevirusne regulatorne sekvence mogu se koristiti, kao što su promoter ubikvitina ili promoter P-globina. Dalje, regulatorni elementi koji se sastoje od sekvenci iz različitih izvora, kao što je SRa promoter sistem, koji sadrži sekvence iz SV40 ranog promotera i ponavljanje dužeg kraja virusa leukemije humanih T ćelija tipa 1 (Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol.8:466-472).

[0111] Pored gena lanaca antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori ovog otkrivanja mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr., počeci replikacije) i selektivni marker-geni. Selektivni marker-gen olakšava selekciju ćelija domaćina u koje će se uvesti vektor (vidi, npr., U.S. Patent br.4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, svi od Axel et al.). Na primer, obično, selektivni marker-gen dodeljuje otpornost na lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, na ćeliji domaćina u koju se vektor uvodi. Selektivni markergeni uključuju gen dihidrofolatreduktaze (DHFR) (za upotrebu u dhfr- ćelijama domaćina sa selekcijom/amplifikacijom metotreksata) i neo gen (za G418 selekciju).

[0112] Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodira teške i lake lance transfektuje se u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Razni oblici pojma "transfekcija" treba da obuhvate širok spektar tehnika koje se obično koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr., elektroporacija, taloženje kalcijumfosfata, transfekcija pomoću DEAE-dekstrana i slično. Teorijski je moguće da se antitela ovog otkrivanja eksprimiraju ili u prokariotskim ili u eukariotskim ćelijama domaćina. Ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, na primer ćelije domaćina sisara, kvasac ili filamentozne gljive, razmatrana je jer je verovatnije da će se kod tih eukariotskih ćelija, a određenije ćelije sisara, sklopiti i izlučivati ispravno uvijeno i imunološki aktivno antitelo u odnosu na prokariotske ćelije.

[0113] U jednom određenom načinu ostvarivanja, klonirajući ili ekspresioni vektor prema ovom otkrivanju obuhvata jednu od kodirajućih sekvenci teških i lakih lanaca bilo kog od mAb1 do mAb16 radno vezanih za odgovarajuće promoter sekvence.

[0114] Ćelije domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela ovog otkrivanja uključuju jajne ćelije kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr- CHO ćelije, koje opisuju Urlaub i Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 korišćene sa DHFR selektivnim markerom, npr., kao što je opisano u R.J. Kaufman i P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol.159:601-621), CHOK1 dhfr+ ćelijske linije, NSO ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije, na primer GS CHO ćelijske linije zajedno sa GS Xceed™ ekspresionim sistemom gena (Lonza).

[0115] Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvedu u ćelije domaćina sisara, antitela se proizvode kultivisanjem ćelija domaćina tokom nekog vremenskog perioda dovoljnog za ekspresiju antitela u ćelijama domaćina i, opciono, izlučuje se antitelo u podlogu za kulturu u kojoj se ćelije domaćina uzgajaju. Antitela se mogu izolovati i prečistiti, na primer, iz podloge za kulturu posle njihovog izlučivanja pomoću standardnih postupaka za prečišćavanje proteina (vidi na primer Abhinav et al.2007, Journal of Chromatography 848: 28-37).

[0116] U jednom određenom načinu ostvarivanja, ćelija domaćina ovog otkrivanja je ćelija domaćina transfektovana sa ekspresionim vektorom koji ima kodirajuće sekvence pogodne za ekspresiju mAb1-mAb16 tim redosledom, radno vezane za odgovarajuće promoter sekvence.

[0117] Potom se potonje ćelije domaćina mogu dalje kultivisati pod pogodnim uslovima za ekspresiju i proizvodnju nekog antitela ovog otkrivanja odabranog iz grupe koju čine mAb1-mAb16 tim redosledom.

Imunokonjugati

[0118] U drugom aspektu, ovo otkrivanje sadrži anti-TfR antitelo kao što je opisano ovde, ili njegov fragment, konjugovan sa nekim terapeutskim ostatkom, kao što je citotoksin, lek (npr., imunosupresant) ili radiotoksin. Takvi konjugati ovde se nazivaju "imunokonjugati". Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina nazivaju se ovde "imunotoksini." Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za (npr., ubija) ćelije. Primeri uključuju takson, citohalasin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, t. kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1 -dehidrotestosteron,

2

glukokortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihove analoge ili homologe. Terapeutski agensi takođe uključuju, na primer, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), ablacioni agense (npr., mehloretamin, tioepa hloraksnbucil, meifalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatin, antracikline (npr., daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr., daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin i antramicin (AMC)), i anti-mitotičke agense (npr., vinkristin i vinblastin).

[0119] Citotoksini mogu biti konjugovani za antitela ovog otkrivanja pomoću tehnologija sa linkerima koje su dostupne u tehnici. Primeri vrsta linkera koji se koriste za konjugaciju citotoksina za antitelo uključuju, ali bez ograničenja, hidrazone, tioetre, estre, disulfide i linkere koji sadrže peptide. Linker može biti odabran koji je, na primer, podložan cepanju pri niskoj pH unutar lizozomalnog odeljka ili podložan cepanju proteazama, kao što su proteaze prevashodno eksprimirane u tumorskom tkivu kao što su katepsini (npr., katepsini B, C, D).

[0120] Za dalji opis vrsta citotoksina, linkera i postupaka za konjugaciju terapeutskih agenasa za antitela, vidi takođe Panowksi S et al.2014 Jan 1; 6(1): 34-45 radi pregleda konjugata antitela i leka.

[0121] Antitela ovog otkrivanja takođe mogu da se konjuguju za radioaktivni izotop radi obrazovanja citotoksičnih radiofarmaceutika, takođe se nazivaju radioimunokonjugati. Primeri radioaktivnih izotopa koji se mogu konjugovati za antitela za upotrebu u dijagnostici ili terapiji uključuju, ali bez ograničenja, jod<131>, indijum<111>, itrijum<90>i lutecijum<177>. Postupci za pripremanje radioimunkonjugata ustanovljeni su u tehnici.

Bispecifični ili multispecifični molekuli

[0122] U drugom aspektu, dalje su ovde opisani bispecifični il multispecifični molekuli koji obuhvataju anti-TfR antitelo ovog otkrivanja. Antitelo može se dobiti ili vezati za drugi funkcionalni molekul, npr., drugi peptid ili protein (npr., drugo antitelo ili ligand za receptor) da bi se obrazovao bispecifični molekul koji se vezuje za najmanje dva različita vezujuća mesta ili ciljne molekule. Antitelo se može u suštini dobiti ili vezati za više od jednog drugog funkcionalnog molekula da bi se obrazovali multispecifični molekuli koji se vezuju za više od dva različita vezujuća mesta i/ili ciljne molekule; takvi multispecifični molekuli takođe treba da su obuhvaćeni pojmom "bispecifični molekul" kao što se ovde koristi. Da bi se obrazovao bispecifični molekul, antitelo ovog otkrivanja može biti funkcionalno vezano (npr., hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim vezivanjem ili drugačije) za jedan ili više drugih vezujućih molekula, kao što je drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili vezujući mimetik, tako da se dobije bispecifični molekul.

[0123] Prema tome, ovo otkrivanje uključuje bispecifične molekule koji obuhvataju najmanje jednu prvu specifičnost vezivanja za TfR, na primer, jedan antigen-vezujući deo bilo kog od mAb1-mAb16 i drugu specifičnost vezivanja za drugi ciljni epitop. Na primer, drugi ciljni epitop je drugi epitop TfR koji se razlikuje od prvog ciljnog epitopa.

[0124] Dodatno, za način ostvarivanja u kom je bispecifični molekul multispecifičan, molekul može dalje da uključuje treću specifičnost vezivanja, pored prvog i drugog ciljnog epitopa.

[0125] U jednom načinu ostvarivanja, bispecifični molekuli kao što je opisan ovde obuhvata kao specifičnost vezivanja najmanje jedno antitelo, ili neki fragment antitela, uključujući, npr., Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Unibody ili jednolančani Fv. Antitelo može takođe biti dimer lakog lanca ili teškog lanca, ili bilo koji njegov minimalni fragment kao što je Fv ili jednolančani konstrukt kao što je opisano u Ladner et al. U.S. Patent br.4,946,778.

[0126] Ostala antitela koja se mogu koristiti u bispecifičnim molekulima opisanim ovde su mišja, himerna i humanizovana monoklonalna antitela.

[0127] Bispecifični molekuli ovog otkrivanja mogu se pripremiti konjugacijom specifičnosti vezivanja konstituenta, pomoću postupaka poznatih u tehnici. Na primer, svaka specifičnost vezivanja bispecifičnog molekula može se generisati odvojeno i zatim konjugovati jedan za drugi. Kada su specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, razni agensi za kuplovanje ili umrežavanje mogu da se koriste za kovalentnu konjugaciju. Primeri agenasa za umrežavanje uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzojevu kiselinu) (DTNB), ofenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) ciklohaksan-I-karboksilat (sulfo-SMCC) (vidi npr., Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Ostali postupci uključuju one opisane u Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No.78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), i Glennie et al., 1987 J. Immunol.139: 2367-2375).

[0128] Alternativno, obe specifičnosti vezivanja mogu biti kodirane u istom vektoru i eksprimirane i sklopljene u istoj ćeliji domaćina. Ovaj postupak je posebno koristan gde bispecifični molekul predstavlja mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2ili ligand x Fab fuzioni protein. Bispecifični molekul ovog otkrivanja može biti jednolančani molekul koji obuhvata jedno jednolančano antitelo i determinantu vezivanja, ili jednolančani bispecifični molekul koji obuhvata dve determinante vezivanja.

[0129] Vezivanje bispecifičnih molekula za njihove specifične mete može se potvrditi, na primer, enzimski povezanim imunosorbentnim testom (ELISA), radioimunotestom (REA), FACS analizom, biotestom (npr., inhibicija rasta i apoptoza), ili Western Blot testom. Svaki od ovih testova uopšteno detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo od posebnog interesa korišćenjem obeleženog reagensa (npr., antitelo) specifičnog za kompleks od interesa.

[0130] Antitela ovog otkrivanja mogu takođe da se koriste za pripremanje veštačkog T ćelijskog receptora (takođe poznat kao himerni T ćelijski receptori, ili himerni antigenski receptori (CAR)). Na primer, varijabilni regioni antitela mogu da se koriste za obrazovanje scFv koji je povezan preko spejsera sa transmembranskim domenom i endodomenom signalizacije od TCR (na primer CD3 zeta) i može biti

2

proizveden na površini T ćelija. Takvi CAR mogu se koristiti u terapiji adoptivnog transfera, na primer za lečenje proliferativnih poremećaja.

Farmaceutske kompozicije

[0131] U drugom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje kompoziciju, npr., farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jednu ili kombinaciju antitela opisanih ovde, na primer, jedno antitelo odabrano iz grupe koju čine mAb1-mAb16, formulisana zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve kompozicije mogu da uključuju jedno ili neku kombinaciju (npr., dva ili više različitih) antitela, ili imunokonjugate ili bispecifične molekule kao što su opisani ovde.

[0132] Farmaceutske kompozicije opisane ovde takođe se mogu dati u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovane sa ostalim agensima. Na primer, kombinovana terapija može da uključuje anti-TfR antitelo ovog otkrivanja, na primer jedno antitelo odabrano iz grupe koju čine mAb1-mAb16, kombinovano sa najmanje jednim antivirusnim, antizapaljenjskim ili drugim antiproliferativnim agensom. Primeri terapeutskih agenasa koji mogu da se koriste u kombinnovanoj terapiji kao što je detaljnije opisano dole u odeljku o upotrebama antitela ovog otkrivanja.

[0133] Kao što se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljivi nosač" uključuje neki i sve rastvarače, disperzione medijume, omotače, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije i slično koji su fiziološki kompatibilni. Nosač treba da bude pogodan za intravenozno, intramuskularno, subkutano, parenteralno, spinalno ili epidermalno davanje (npr., injekcijom ili infuzijom). U jednom načinu ostvarivanja, nosač treba da bude pogodan za subkutano davanje. Zavisno od puta davanja, aktivno jedinjenje, tj., antitelo, imunokonjugat ili bispecifični molekul, može da bude obložen u materijal da bi se zaštitilo jedinjenje od dejstva kiselina i ostalih prirodnih uslova koji mogu da inaktiviraju to jedinjenje.

[0134] Sterilni fosfat-puferisani slani rastvor je jedan primer farmaceutski prihvatljivog nosača. Drugi pogodni nosači dobro su poznati stručnjacima u tehnici. (Vidi, npr., Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed.1995)) Formulacije mogu dalje da uključuju jedan ili više ekscipijenasa, konzervanasa, poboljšivača rastvorljivosti, puferujućih agenasa, albumin za sprečavanje gubitka proteina na površinama fiolica, itd.

[0135] Oblik farmaceutskih kompozicija, put davanja, doziranje i režim prirodno zavise od stanje koje se leči, ozbiljnosti oboljenja, starosti, mase i pola pacijenta, itd.

[0136] Farmaceutske kompozicije ovog otkrivanja mogu se formulisati za topikalno, oralno, parenteralno, intranazalno, intravenozno, intramuskularno, subkutano ili intraokularno davanje i slično.

[0137] Poželjno, farmaceutske kompozicije sadrže nosače koji su farmaceutski prihvatljivi za formulaciju koja može da se ubrizga. One posebno mogu biti izotonični, sterilni, slani rastvori (mononatrijum ili dinatrijum fosfat, natrijum, kalijum, kalcijum ili magnezijum hlorid i slično mešavine tih soli), ili suve,

2

naročito liofilizovane kompozicije koje po davanju, zavisno od slučaja, sterilisane vode ili fiziološkog rastvora, dozvoljavaju konstituisanje injektibilnih rastvora.

[0138] Doze korišćenje za davanje mogu se prilagoditi u funkciji različitih parametara, a određenije u funkciji korišćenog režima davanja, relevantne patologije ili, alternativno, željenog trajanja lečenja.

[0139] Za pripremu farmaceutskih kompozicija, efektivna količina antitela može se rastvoriti ili dispergovati u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili vodenoj sredini.

[0140] Farmaceutski oblici pogodni za injektibilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije; formulacije uključujući susamovo ulje, ulje od kikirikija ili vodeni propilen glikol; i sterilne praškove ili liofilizate za privremenu pripremu sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i mora biti fluid do one mere da postoji jednostavna upotreba šprica. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti sačuvan od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, kao što su bakterije i gljive.

[0141] Rastvori aktivnih jedinjenja kao slobodne bazne ili farmakološki prihvatljive soli mogu se pripremiti u vodi pogodno umešane sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza. Takođe se mogu pripremiti disperzije u glicerolu, tečnim polietilen glikolima, i njihovim mešavinama i u uljima. Pod uobičajenim uslovima čuvanja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans koji sprečava razvoj mikroorganizama.

[0142] Antitelo ovog otkrivanja može se formulisati u kompoziciji u neutralnom obliku ili obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju adicione soli sa kiselinom (obrazovane sa slobodnim amino grupama proteina) i koje se obrazuju sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organske kiseline kao što su sirćetna, oksalna, vinska, mandelinska i slično. Soli obrazovane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu se takođe dobiti od neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili feri hidroksidi, i organskih baza kao što su izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slično.

[0143] Nosač može biti rastvarač ili disperziono sredstvo koje sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično), njihove pogodne mešavine i biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost može se održati, na primer, upotrebom nekog omotača, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Prevencija dejstva mikroorganizama može se postići pomoću raznih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, sorbinska kiselina, timerosal, i slično. U mnongim slučajevima, biće poželjno da se uključe izotonični agensi, na primer, šećeri ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injektibilnih kompozicija može se postići upotrebom agenasa za odlaganje apsorpcije, na primer, aluminijum monostearata i želatina, u kompozicijama.

[0144] Sterilni injektibilni rastvori pripremljeni su inkorporiranjem aktivnih jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa raznim drugim sastojcima nabrojanim gore, po potrebi, praćeno sterilizacijom filtriranjem. Uopšteno, disperzije se pripremaju inkorporiranjem raznih sterilisanih aktivnih

2

sastojaka u sterilni nosač koji sadrži bazno disperziono sredstvo i potrebnih ostalih sastojaka od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektibilnih rastvora, željeni postupci za pripremu su tehnike sušenja u vakuumu i sušenja smrzavanjem koje daju prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilisanog-filtriranog rastvora.

[0145] Priprema više, ili visoko koncentrovanih rastvora za direktnu injekciju takođe je predviđena, gde je predviđena upotreba DMSO kao rastvarača što rezultuje ekstremno brzom penetracijom, dostavom visokih koncentracija aktivnih agenasa u mala područja tumora.

[0146] Nakon formulisanja, rastvori će se dati na način kompatibilan doznoj formulaciji i u količini koja je terapeutski efektivna. Formulacije se lako daju u raznim doznim oblicima, kao što je tip injektibilnih rastvora opisanih gore, ali mogu se takođe koristiti kapsule koje oslobađaju lek i slično.

[0147] Za parenteralno davanje u vodenom rastvoru, na primer, rastvor treba biti pogodno puferisan po potrebi i tečni razblaživač prvo učiniti izotoničnim dovoljno slanim rastvorom ili glukozom. Ovi posebno vodeni rastvori naročito su pogodni za intravenozno, intramuskularno, subkutano i intraperitonealno davanje. U vezi s tim, sterilni vodeni medijumi koji se mogu koristiti biće poznati stručnjacima u tehnici u rasvetljavanju ovog otkrivanja. Na primer, jedna doza može se rastvoriti u 1 ml izotoničnog NaCl rastvora i ili se dodaje u 1000 ml fluida hipodermoklize ili ubrizgava u predviđeno mesto infuzije, (vidi na primer, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. izdanje, strane 1035-1038 i 1570-1580). Neke varijacije u doziranju nužno će se javiti zavisno od stanja subjekta koji se leči. Osoba odgovorna za davanje će, u bilo kom slučaju, odrediti odgovarajuću dozu za individualnog subjekta.

[0148] Antitela ovog otkrivanja mogu se formulisati u okviru terapeutske mešavine da obuhvata oko 0.0001 do 1.0 miligrama, ili oko 0.001 do 0.1 miligrama, ili oko 0.1 do 1.0 ili čak 1.0 do oko 10 miligrama po dozi. Višestruke doze mogu se takođe davati.

[0149] Pored jedinjenja formulisanih za parenteralno davanje, kao što su intravenozna ili intramuskularna injekcija, drugi farmaceutski prihvatljivi oblici uključuju, npr. tablete ili druge čvrste supstance za oralno davanje; kapsule sa oslobađanjem tokom vremena; i bilo koji drugi trenutno korišćen oblik.

[0150] U određenim načinima ostvarivanja, upotreba lipozoma i/ili nanočestica je predviđena za uvođenje antitela u ćelije domaćina. Obrazovanje i upotreba lipozoma i/ili nanočestica poznati su stručnjacima u tehnici.

[0151] Nanokapsule mogu uopšteno da obuhvate jedinjenja na stabilan i izvodljiv način. Da bi se izbegli neželjeni efekti zbog intracelularnog polimernog preopterećenja, takve ultrafine čestice (veličine oko 0.1 µm) uopšteno su izvedene pomoću polimera koji se mogu razgraditi in vivo. Biorazgradive nanočestice polialkil-cijanoakrilata koje ispunjavaju ove uslove predviđene su za upotrebu u ovom otkrivanju, a takve čestice se mogu jednostavno izraditi.

[0152] Lipozomi se obrazuju od fosfolipida koji se disperguju u vodenoj sredini i spontano obrazuju multilamelarne koncentrične dvoslojne vezikule (takođe se nazivaju multilamelarne vezikule (MLV)).

2

MLV uopšteno imaju prečnike od 25 nm do 4 µm. Sonikacija MLV rezultuje obrazovanjem malih unilamelarnih vezikula (SUV) sa prečnicima u opsegu od 200 do 500 Å, koje sadrže vodeni rastvor u jezgru. Fizičke karakteristike lipozoma zavise od pH, jonske jačine i prisustva dvovalentnih katjona.

Upotrebe i postupci antitela ili proteina ovog otkrivanja

[0153] Antitela ili proteini ovog otkrivanja imaju in vitro i in vivo dijagnostičke i terapeutske upotrebe. Na primer, ovi molekuli mogu da se daju ćelijama u kulturi, npr. in vitro ili in vivo, ili subjektu, npr., in vivo, radi lečenja, prevencije ili dijagnoze raznih poremećaja.

[0154] Antitela ovog otkrivanja ne samo da mogu da inhibiraju ćelijsku proliferaciju, već i indukuju apoptozu visoko proliferirajućih ćelija, kao što su T ćelije.

[0155] Ovde je predviđeno da se koristi anti-TfR antitelo ili protein ovog otkrivanja kao lek, posebno za upotrebu u lečenju, prevenciji ili dijagnozi ćelijskih proliferativnih poremećaja, kao što su tumori koji eksprimiraju visok nivo TfR, određenije, hematološke tumore, kao što su limfom, a posebno, ATL, MCL, Hodžkinova bolest, limfom velikih B ćelija, periferni T ćelijski limfom, akutna leukemija (mijeloid i limfoid) kao i čvrsti tumori, kao što su renalni karcinom, kancer pluća (malih ćelija), itd.

[0156] Dalje su opisana antitela ovog otkrivanja za upotrebu u lečenju, prevenciji ili dijagnozi HTLV-1 povezanih poremećaja, posebno za smanjenje virusnog opterećenja u zapaljenjskim poremećajima povezanim sa HTLV-1 infekcijom, uključujući HAM/TSP, polimiozitis i artritis.

[0157] Ovo otkrivanje takođe se odnosi na postupke za smanjenje ili supresiju apsorpcije transferina u humanim krvnim ćelijama davanjem kompozicije koja obuhvata terapeutski efikasnu dozu antitela ovog otkrivanja.

[0158] Antitela ili proteini za upotrebu kao što su opisani gore mogu se davati kao sam aktivni sastojak ili u vezi sa, npr. kao adjuvans ili u kombinaciji sa, drugim lekovima npr. antivirusnim, antizapaljenjskim agensima ili citotoksičnim, antiproliferativnim hemoterapeutskim ili antitumorskim agensima, npr. za lečenje ili prevenciju prethodno pomenutih bolesti.

[0159] Na primer, antitela za upotrebu kao što je opisano gore mogu da se koriste u kombinaciji sa AZT, IFN-alfa, anti-CD20 mAb, anti-CD25 mAb, hemoterapeutskim agensima.

[0160] Pogodni antineoplastični agensi mogu da uključuju, bez ograničenja, alkilirajuće agense (kao što su ciklofosfamid, mehloretamin, hlorambucil, melfalan, nitrozoureje, temozolomid), antracikine (kao što su daunorubicin, doksorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoksantron, valrubicin), taksane (kao što su Paklitaksel, Docetaksel), epotilone, , inhibitore topoizomeraze I (kao što je irinotekan ili topotekan), inhibitore topoizomeraze II (kao što su etopozid, tenipozid ili taflupozid), analoge nukleotida i analoge prekursora (kao što su azacitidin, azatioprin, kapecitabin, citarabin, flurouracil, gemcitabin, hidroksureja, merkaptopurin, metotreksat ili tioguanin), peptidne antibiotike (kao što su karboplatin, cisplatin i oksaliplatin), retinoide (kao što su tretinoin, alitretinoin, beksaroten), vinka alkaloide i derivate (kao što

2

su vinblastin, vinkristin, vindezin, vinorelbin), ciljane terapije kao što su inhibitori kinaza (kao što su ibrutinib, idelalisib, erlotinib, gefitinib, imatinib, vemurafenib, vismodegib), inhibitore proteazoma (kao što su bortezomib, karfilzomib), inhibitore histon deacetilaze (kao što su vorinostat ili romidepsin).

[0161] U skladu sa gore navedenim, ovo otkrivanje obezbeđuje u još daljem aspektu:

Postupak kao što je prethodno definisan koji obuhvata ko-davanje, npr. istovremeno ili redom, terapeutski efektivne količine anti-TfR antitela ili proteina ovog otkrivanja, i najmanje jednu drugu lekovitu supstancu, pri čemu je pomenuta druga lekovita supstanca antivirusni ili antiproliferativni agens, npr. kao što je naznačeno gore.

[0162] U jednom načinu ostvarivanja, antitela ili proteini ovog otkrivanja mogu da se koriste za detektovanje nivoa TfR, ili nivoa ćelija koje sadrže TfR. Ovo se može postići, na primer, dovođenjem u kontakt uzorka (kao što je in vitro uzorak) i kontrolnog uzorka sa anti-TfR antitelom pod uslovima koji omogućavaju obrazovanje kompleksa između antitela i TfR. Bilo koji kompleksi obrazovani između antitela i TfR detektuju se i porede u uzorku i kontroli. Na primer, standardni postupci detekcije, dobro poznati u tehnici, kao što su testovi ELISA i protočne citometrije, mogu se izvoditi korišćenjem kompozicija ovog otkrivanja.

[0163] Prema tome, u jednom aspektu, ovo otkrivanje dalje obezbeđuje postupke za detektovanje prisustva TfR (npr., humani TfR antigen) u uzorku, ili merenje količine TfR, koji obuhvataju dovođenje u kontakt uzorka, i kontrolnog uzorka, sa nekim antitelom ili proteinom ovog otkrivanja, ili njegovim antigen-vezujućim regionom, koje se specifično vezuje za TfR, pod uslovima koji omogućavaju obrazovanje kompleksa između antitela ili nekog njegovog dela i TfR. Obrazovanje kompleksa zatim se detektuje, pri čemu razlika u obrazovanju kompleksa uzorka u odnosu na kontrolni uzorak je pokazatelj prisustva TfR u uzorku.

[0164] Takođe, unutar obima ovog otkrivanja su kompleti koje čine kompozicije (npr., antitela, proteini, humanizovana antitela, konjugovana antitela i multispecifični molekuli) opisane ovde i uputstva za upotrebu. Komplet može dalje da sadrži najmanje jedan dodatni reagens, ili jedan ili više dodatnih antitela ili proteina (npr., antitelo koje ima komplementarnu aktivnost da se vezuje za epitop na ciljnom antigenu koja se razlikuje od prvog antitela). Kompleti obično uključuje oznaku koja ukazuje na namenjenu upotrebu sadržaja kompleta. Pojam oznaka uključuje bilo koji pisani ili zabeleženi materijal isporučen na ili sa kompletom, ili koji drugačije prati komplet. Komplet može dalje da obuhvata alate za dijagnozu da li pacijent pripada grupi koja će reagovati na lečenje anti-TfR antitelom, kao što je prethodno definisano.

PRIMERI

Postupci

1. Ispitivanje afiniteta pomoću ELISA

[0165] Za određivanje specifičnosti antitela, ELISA test može se primeniti pomoću sledećih protokola. Rekombinantni humani TfR (kao što su nabavljeni od R&D Systems, Kataloški broj 2474-TR) direktno su obloženi na ploču sa 96 bunarčića, ostavljeni tokom noći i isprani dvaput pre inkubacije sa nekoliko razblaženja (10) antitela (mišje i humanizovano mAb) (razblaženje može da započne sa koncentracijom od 50 µg/ml kroz 0,001 ug/ml) i inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon dva ispiranja, sekundarno antitelo kozji-anti humani IgG inkubiran je inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku, isprano dvaput i inkubirano sa TMB rastvorom tokom 10 minuta pre očitavanja apsorbance na 450 nm.

2. Određivanje afiniteta pomoću rezonancije površinskog plazmona (Biacore sistem)

[0166] Za određivanje KDvrednosti, tehnologija rezonancije površinskog plazmona može se primeniti pomoću Biacore™ tehnologije kao što je opisano u nastavku: Histidin-obeleženi humani TfR (kao što je nabavljen od R&D Systems, Kataloški broj 2474-TR) je vezan nakon pasaže na kovalentno imobilisan čip Penta-His mAb CM5 senzora. Deset različitih koncentracija antitela (1 do 500 nM) injektirano je po anti-His/TfR-His površini tokom 4 minuta i usledili su kompleksi disocijacije tokom 5 minuta. Oba profila vezivanja i disocijacije analizirana su nelinearnim kvadratnim algoritmom implementiranim u BIAevalution softver pomoću jednoeksponencijalnih funkcija vremena.

3. ADCC test

[0167] Antitelo-zavisna ćelijski-posredovana citotoksičnost je poželjan mehanizam za ubijanje ciljnih ćelija kancera pomoću antitelo-baziranih lekova. Antitelo se vezuje za ciljne antigene na površinu ćelije. Kada se Fc efektorski deo meta-vezanih antitela takođe vezuje za FcγRIIIa receptore na površini ćelije efektorskih ćelija (prirodne ćelije ubice pretežno), višestruko umnožavanje dva tipa ćelija se javlja, što dovodi do aktivacije ADCC puta. Ubijanje ciljnih ćelija je krajnja tačka ove aktivacija puta i koristi se u klasičnim ADCC biotestovima, koji koriste periferne krvne mononuklearne ćelije donora (PBMC) ili subpopulaciju prirodnih ćelija ubica (NK) kao efektorske ćelije. Kompletan komplet za ADCC Reporter Biotest (Promega, G7015) sadrži sve komponente i reagense potrebne za izvođenje anti-CD20-zasnovanog ADCC Reporter Biotesta. ADCC Reporter Biotest koristi alternativno očitavanje na ranijoj tački u aktivaciji ADCC puta: aktivacija transkripcije gena kroz NFAT (nuklearni faktor aktiviranih T-ćelija) put u efektorskoj ćeliji. Pored toga, ADCC Reporter Biotest koristi konstruisane Jurkat ćelije koje stabilno eksprimiraju FcγRIIIa receptor i NFAT element odgovora koji pokreće ekspresiju luciferaze svica kao efektorske ćelije. Biološka aktivnost antitela u ADCC je kvantifikovana preko luciferaze proizvedene kao rezultat aktivacije NFAT puta; aktivnost luciferaze u efektorskoj ćeliji je kvantifikovana očitavanjem luminescencije. Kao pozitivna kontrola za poređenje sa humanizovanim mAb, komplet obezbeđuje anti-CD20 antitelo.

1

4. Test indukcije apoptoze HL-60 i PHA aktiviranih T ćelija

[0168] Za test apoptoze, ćelije su inkubirane u ploči sa 24 bunarčića u koncentraciji od 100.10<3>ćelija po bunarčiću u 400 µl. Nakon toga, ćelije su inkubirane 3 i 4 dana sa nekoliko razblaženja na mišje ili humanizovano antitelo (od 200 µg/ml do 3 µg/ml). Nakon vremena inkubacije, ćelije su centrifugirane i obeležene u prisustvu Annexin V i Tropo 3 za 15 minuta pre analize protočnom citometrijoma.

5. Test produktivnosti (400ml)

[0169] Za test produktivnosti, VH geni su sintetizovani i klonirani u ekspresioni vektor pXCIgG (ΔK) za teški lanac. Laki lanci su prethodno sub-klonirani u pXCKappa vektor.16 antitela je prolazno eksprimirano u CHOK1SV GS-KO ćelije u zapremini od 400 ml (promućkati bocu). Proizvedena antitela su prečišćena pomoću afinitetne hromatografije sa proteinom A. Koncentracije antitela određene su pomoću predviđenog koeficijenta odumiranja (1.49) za sve varijante antitela. Integritet varijanata određen je pomoću SDS-PAGE i u redukujućim i ne-redukujućim uslovima.

Primeri mAb1 do mAb16

[0170] Primeri mAb1 do mAb16 kao što su opisani u Tabeli 1 mogu se proizvesti pomoću konvencionalne rekombinantne proizvodnje antitela i postupaka prečišćavanja.

[0171] Na primer, kodirajuće sekvence klonirane su u proizvodnom vektoru za rekombinantnu ekspresiju u proizvodnoj ćelijskoj liniji sisara.

[0172] Sledeće Tabele 4 i 5 obezbeđuju detaljne aminokiselinske i nukleotidne sekvence ovog otkrivanja, a posebno za proizvodnju nukleinskih kiselina, ekspresionih vektora i antitela ovog otkrivanja.

Tabela 4: Kratak opis korisnih aminokiselinskih i nukleotidnih sekvenci

2

Tabela 5: Kratak opis korisnih aminokiselinskih i nukleotidnih sekvenci

Rezultati

Konstruisanje funkcionalnih humanizovanih antitela A24

Humanizacija

[0173] Procedura humanizacije izvedena je kao što je naznačeno dole:

1. Domeni i regioni roditeljskih antitela su identifikovani.

2. Sekvence roditeljskih antitela poravnate su da bi se podesile referentne sekvence.

3. 3D strukturni model roditeljskog proteina je konstruisan.

4. Na osnovu prikupljenih podataka, početna procena mogućnosti da se zameni svaki položaj izvedena je i položaji su kategorizovani.

5. Strukturni modeli humanizovanih varijanti konstruisani su po potrebi i upoređeni sa roditeljskim modelom radi strukturne analize mogućih supstitucija.

6. CDR-kalemljenje izvedeno je analiziranjem položaja koji se razlikuju između roditeljskih i akceptorskih sekvenci. Položaji koji daju doprinos su uopšteno zadržani i samo supstituisani ako su takve supstitucije relativno favorizovane na osnovu njihovog potencijalnog uticaja na afinitet i kompatibilnost sa akceptorskim okvirnim regionom.

7. Krajnji skup kombinacija varijanti humanizovanih lakih i teških lanaca je konstruisan.

Anotacija sekvenci

[0174] Sačuvana baza podataka domena (CDD) (Marchler-Bauer et al.2011) korišćena je za određivanje sadržaja domena svakog aminokiselinskog lanca i približnih granica svakog domena. Granice varijabilnih domena precizno su određene zajedno sa granicama regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) prema nekoliko obično korišćenih definicija (Kabat i Wu 1991, Chothia i Lesk 1987 ažurirano u Al-Lazikani et al.1997, Honegger i Plücktuhn 2001). Ažurirana Chothia CDR definicija (Al-Lazikani et al. 1997) korišćena je i poziciono numerisanje u kom slučaju je korišćeno Chothia 1987 numerisanje.

Poravnanja sekvenci

[0175] Višestruka poravnanja roditeljske sekvence sa mišjim sekvencama i humanim sekvencama germinitivne linije generisana su pomoću MAFFT (Katoh et al.2002) i unosi u svako poravnanje određeni su prema identitetu sekvence (SeqID) sa roditeljskom sekvencom. Referentni skupovi redukovani su do jedinstvenog skupa sekvenci grupisanjem sa 100% SeqID i isključivanjem suvišnih unosa.

Identifikacija ostataka na kritičnim položajima

[0176] Fv antitela ima brojne kritične položaje koji čine VH/VL međulančani interfejs ili su odgovorni za odvojeni skup kanonskih struktura koji je definisan za pet od CDR (Chothia i Lesk 1987, Martin i Thornton 1996, Al Laziniki et al.1997); ovi položaji treba da se detaljno razmatraju pre predlaganja supstitucija za njih. Na osnovu poravnanja sekvenci roditeljskog antitela sa humanim germinitivnim linijama, identifikovani su najbliži podudarni unosi. Identifikacija optimalne humane germinitivne linije kao akceptora zasnovana je na uređenim kriterijumima navedenim dole:

1. Identitet sekvenci u okvirnim regionima

2. Identični ili kompatibilni ostaci međulančanog interfejsa

3. Petlje za podršku sa kanonskim konformacijama roditeljskih CDR

4. Kombinacija teških i lakih germinitivnih linija nalaze se u eksprimiranim antitelima

Konstrukcija 3D modela

[0177] Strukturni modeli Fv-regiona za roditeljsko mišje antitelo i njegove varijante, generisani su pomoću Lonza-ove platforme za modelovanje. Kandidatni fragmenti strukturnih šablona za okvirne regione (FR) i regione koji određuju komplementarnost (CDR) kao i puni Fv su postignuti, rangirani i odabrani iz interne baze podataka antitela na osnovu njihovih identiteta sekvenci sa metom, kao i kvalitativne kristalografske mere strukture šablona, kao što je rezolucija (u Angstremima (Å)).

[0178] Da bi se strukturno poravnali CDR sa FR šablonima, pet ostataka na bilo kojoj strani CDR uključeni su u CDR šablon. Poravnanje fragmenata generisano je na osnovu preklapajućih segmenata i strukturno poravnanje sekvenci je generisano. Fragmenti šablona zajedno sa poravnanjem obrađeni su pomoću MODELLER (Sali et al.1993).

[0179] Ovaj protokol stvara konformaciona ograničenja dobijena od skupa poravnatih strukturnih šablona. Grupa struktura koje zadovoljavaju ograničenja nastala je pomoću gradijenta konjugata i procedura optimizovanja simuliranog kaljenja. Jedna ili više struktura modela je odabrano iz ove grupe na osnovu rezultata energije, dobijenog iz rezultata strukture proteina i zadovoljenja konformacionih ograničenja. Modeli su ispitani i bočni lanci položaja, koji se razlikuju između mete i šablona, su optimizovani pomoću algoritma za optimizaciju bočnih lanaca i energija je svedena na minimum.

[0180] Za procenu konformacione varijabilnosti CDR korišćena je grupa alata za vizuelizaciju i računanje, kao i pakovanje domena i regiona u jezgro ili lokalno i analiza površine za selekciju jednog ili više željenih modela.

Poređenje modelovanih struktura

[0181] Strukturni modeli za roditeljske i humanizovane Fv-regione modelovani su pojedinačno, kao što je prethodno opisano, kako bi se osiguralo da modeli varijanti nisu konstruisani sa bilo kakvom inherentnom pristrasnošću prema strukturi roditeljskog modela. Međutim, visok identitet sekvenci humanizovanih varijanti sa roditeljskom sekvencom često rezultuje identičnim strukturnim šablonima koji su izabrani za mnoge modele.

[0182] Da bi se ocenio uticaj različitih supstitucija na afinitet i stabilnost, brojni strukturni kriterijumi se koriste. Dostupnost rastvarača, lokalno pakovanje atoma i lokacija supstitucije u odnosu na predviđeni interfejs vezivanja antigena ili interfejs Fv dimera su ključni kriterijumi. Opažanja nepovoljnog stanja solvatacije, loših kontakata među atomima ili loše smeštanje neodgovarajućeg ostatka na ključni položaj dovodi do odbacivanja moguće supstitucije. Drugi kriterijumi, kao što su elektrostatički efekti, obrasci vodoničnih veza ili mogući obrasci vodoničnih veza takođe se koriste za procenu pogodnosti supstitucije. Neki položaji više su pogodni od ostalih za prihvatanje supstitucija jer skup kritičnih položaja ima ulogu u podržavanju kanonske klase CDR, pakovanje pojedinačnih domenskih jezgara ili međudomenskim interfejsima.

Procenjivanje mogućih supstitucija

[0183] Svi položaji koji se razlikuju između roditeljskih i akceptorskih okvirnih regiona ili blizu predviđenih epitopa ocenjeni su na osnovu njihovog mogućeg uticaja na afinitet i stabilnost vezivanja.

[0184] Postoji mnogo faktora koji doprinose ovoj kategorizaciji, koji potiču od interesa i za afinitet i za stabilnost. Faktori koji doprinose klasifikaciji su:

• Položaji odgovorni za vezivanje antigena

• Kritični položaji

∘ Sačuvani ostaci unutar VH/VL interfejsa

∘ Položaji koji određuju CDR kanonsku klasu

• Rastojanje od CDR

• Očuvanje ili promena na položaju u referentnom poravnanju

• Dostupnost rastvarača

• Lokalno pakovanje atoma

• Lokalna sekundarna struktura

• Elektrostatički efekti

• Obrasci vodoničnih veza

• Mogućnost vodoničnih veza

• Post-translacione modifikacije

∘ N-glikozilacija

∘ Deamidacija

[0185] Kritični položaji inicijalno su definisani kao oni u Chothia CDR, određeni da su na kritičnim položajima u VH/VL interfejsu; na položajima koji pomažu određivanje CDR konformacije ili koji su visoko očuvani u referentnom poravnanju. Mnogi položaji su očuvani i prihvatiće samo mali skup, ili samo jedan, tip aminokiseline.

Optimalna selekcija akceptorskih okvirnih regiona

[0186] Generisana su poravnanja sekvenci koja porede roditeljske varijabilne domene sa humanom germinitivnom linijom. S obzirom na ukupni identitet sekvenci, podudaranje položaja interfejsa i slično klasifikovani CDR kanonski položaji, laki lanac je i dalje imao nekoliko jednakih pogodnih akceptorskih okvirnih regiona; obično je jedan bio malo pogodniji za jedan region a manje za drugi. Prema tome, dva akceptorska okvirna regiona lakog lanca bila su VK6-A26 i VK3-L6.

[0187] Teški lanac najbolje odgovara humanoj germinitivnoj liniji VH7-7-4.1. VH7 porodica germinitivne linije sadrži samo jedan član, koji se može inkorporirati u VH1 porodicu (Knappik et al.2000). Budući da je verovatno da se VH7 germinitivna linija nalazi ređe nego VH1 germinitivna linija, smatralo se poželjnim da se koristi potonja kao akceptorski okvirni region. Međutim, kada su analizirani položaji sa mogućim mutacijama unazad, postalo je jasno da VH7 germinitivna linija već sadrži odgovarajuće ostatke. Stoga, dve IGHV germinitivne linije korišćene su kao akceptorski okvirni regioni; VH7-7-4.1 i VH1-1-03.

[0188] Geni J-segmenta upoređeni su sa A24 roditeljskim sekvencama preko FR4 i J-segmenata. JK4 i JH4 identifikovani su kao najbolji pandan za laki i teški lanac tim redosledom, i zato su odabrani kao akceptorski okvirni regioni J-segmenta.

Humanizacija

[0189] Generisan je spisak svih položaja sa ostacima koji se razlikuju između roditeljskih i akceptorskog okvirnog regiona. Svi položaji su analizirani i razmatrani za izolovanje kao i u kontekstu ostalih mogućih supstitucija. Svaki položaj je rangiran i dat je predlog koje ostatke treba zameniti i oceniti u humanizovanim varijantama. Tri humanizovana lanca su predložena za laki lanac; jedan koji koristi akceptorski VK3-L6 i dva sa akceptorskim VK6-A26 gde je jedan imao dodatne položaje koji doprinose zadržane od roditeljske sekvence (mutacije unazad). Dva humanizovana lanca predložena su za teški lanac; pri čemu jedan koristi svaki odabrani akceptor. VH7-7-4.1 kalem je više konzervativan; vidi Tabelu 6.

Tabela 6 Humanizovani lanci

4

Prva generacija od 6 humanizovanih antitela nije mogla da očuva A24 funkcionalna svojstva

[0190] Na osnovu postupaka opisanih u prethodnom odeljku, prvo su konstruisane 3 humanizovane varijante lakog lanca od A24, (u nastavku se nazivaju VL1, VL2 i VL3) i 2 humanizovane varijante teškog lanca od A24 (u nastavku se nazivaju VH1 i VH2). VH0 i VL0 nazivaju se odgovarajući VH i VL od A24.

[0191] Generisano je sledećih 6 humanizovanih antitela sa sledećom kombinacijom humanizovanih VH i VL i humanim IgG1 izotipom:

INA01 Varijanta1 humanizovano antitelo: VH1/VL1

INA01 Varijanta 2 humanizovano antitelo: VH2/VL1

INA01 Varijanta 3 humanizovano antitelo: VH1/VL2

INA01 Varijanta 4 humanizovano antitelo: VH2/VL2

INA01 Varijanta 5 humanizovano antitelo: VH1/VL3

INA01 Varijanta 6 humanizovano antitelo: VH2/VL3

[0192] Ispitano je ovih 6 humanizovanih antitela na indukciju apoptoze HL-60 ćelija prema testu kao što je prethodno opisan i upoređeno je to svojstvo indukovanja apoptoze sa himernim oblikom referentnog mišjeg antitela A24 (VH0/VL0) sa istim humanim IgG1 izotipom. Rezultati su prikazani na Fig.1.

[0193] Kao što je prikazano na Fig.1, iznenađujuće je otkriveno da su sva ispitana humanizovana antitela izgubila svoja svojstva vezivanja. Ovo je naročito iznenađenje s obzirom da su neke od varijanti imale svih 6 CDR zajedničko sa njihovim roditeljskim mišjim A24 antitelom.

Generacija od 5 novih humanizovanih antitela

[0194] Zatim je konstruisan novi teški lanac (VH3) i generisano je sledeće humanizovano antitelo:

INA01 Varijanta 7 humanizovano antitelo: VH0/VL1

INA01 Varijanta 8 humanizovano antitelo: VH3/VL1

INA01 Varijanta 9 humanizovano antitelo: VH3/VL2

INA01 Varijanta 10 humanizovano antitelo: VH3/VL3

INA01 Varijanta 11 humanizovano antitelo: VH3A/L0

[0195] Ponovo, ispitana su ova humanizovana antitela na njihov kapacitet da indukuju apoptozu na osnovu testa indukcije HL-60 apoptoze kao što je opisan gore u poređenju sa himernim INA01 koje odgovara antitelu sa varijabilnim regionima roditeljskog mišjeg A24 i humanim IgG1 izotipom. Rezultati su prikazani na Fig.2.

[0196] Kao što je prikazano na Fig.2, humanizovana antitela i u ovom slučaju su izgubila najmanje delimično svoja svojstva da indukuju apoptozu.

Generacija od 6 novih humanizovanih antitela

[0197] Na osnovu rezultata dobijenih sa prethodna 3 nova antitela, ponovo su konstruisana 3 nova laka lanca i 2 nova teška lanca.

[0198] Određenije, korišćena je in silico analiza za predviđanje promena aminokiseline (bilo u okvirnim ili CDR regionima) koje indukuju imunogenost uz održavanje i dalje povoljnih svojstava roditeljskog antitela A24.

[0199] U ovoj analizi, iTope™ je korišćen za analizu A24 izvedenih sekvenci za slobodno vezivo visokog afiniteta za humanu MHC klasu II. Smatra se da su slobodni MHC klasa II vezujući peptidi visokog afiniteta u vezi sa prisustvom T ćelijskih epitopa (Hill et al 2003 Arthritis Res Ther. (2003) 1:R40-R48) iako veziva srednjeg i malog afiniteta mogu takođe da pokrenu T ćelijske odgovore. Tako, iTope™ se koristi da obezbedi korisni inicijalni skrining "male rezolucije" za lokaciju mogućih T ćelijskih epitopa. Pored toga, sekvence su analizirane pomoću TCED™ BLAST pretrage da bi se locirali bilo koji T ćelijski epitopi prethodno identifikovani EpiScreen™ analizom drugih sekvenci proteina.

[0200] Kao što je prikazano u Tabeli 7; in silico analizom iTope™ otkrilo se da supstitucije aminokiselina L53R i/ili S55T u LCDR2 mogu da smanje imunogenost.

Tabela 7

[0201] Zato je odlučeno da se ispitaju 3 nova laka lanca, jedan (VL4) koji uključuje 2 supstitucije aminokiselina u LCDR2 u poređenju sa LCDR2 iz A24, jedan (VL5) koji uključuje samo jednu supstituciju aminokiselina u LCDR2, i jedan (VL6) koji ima identični LCDR2 u poređenju sa A24.

[0202] Sledećih 6 novih humanizovanih antitela generisani su sa konstantnim regionom IgG1 izotipa.

INA01 varijanta 12 VH4/VL4

INA01 varijanta 13 VH5/VL4

INA01 varijanta 14 VH4/VL5

INA01 varijanta 15 VH5/VL5

INA01 varijanta 16 VH4/VL6

INA01 varijanta 17 VH5/VL6

[0203] Fig.5a prikazuje poravnanje VL4, VL5, VL6 sa VL A24 antitela.

[0204] Fig.5b prikazuje poravnanje VH4 i VH5 sa VH A24 antitela.

[0205] Ispitana su ova humanizovana antitela na njihov kapacitet da indukuju apoptozu na osnovu 72h testa apoptoze HL-60 kao što je prethodno opisano i u poređenju sa himernim INA01 koje odgovara antitelu sa varijabilnim regionima roditeljskog mišjeg A24 i humanim IgG1 izotipom. Rezultati su prikazani na Fig.3.

[0206] Kao što je prikazano na Fig.3, svih 6 novih ispitanih humanizovanih antitela imali su slična ili čak superiorna svojstva u poređenju sa himernim INA01 koje odgovara antitelu sa varijabilnim regionima roditeljskog mišjeg A24 i humanim IgG1 izotipom.

[0207] Posebno, varijanta 12 i varijanta 13 antitela sa 2 supstitucije aminokiselina u LCDR2 iznenađujuće su pokazale superiorna svojstva indukcije u poređenju sa roditeljskim himernim INA01 antitelom.

Konverzija u IgG

[0208] Radi eksprimiranja IgG pune dužine, fragmenti varijabilnih domena teških (VH) i lakih lanaca (VL) četiri vodeća kandidata, varijante 12, 14, 15 i 17, su sub-klonirani od Fab ekspresionih vektora u odgovarajuće ekspresione vektore za humani IgG4, humani IgG1 divljeg tipa, humani IgG1L234AL235A i humani IgG1N297A, pri čemu se pomenuti humani IgG1 L234AL235A ovde naziva "AA", što je rezultovalo ekspresionim vektorima za proizvodnju 16 antitela prema ovom otkrivanju, mAb1-mAb16 kao što je opisano u Tabeli 8 dole:

Tabela 8: Opis varijabilnih regiona i IgG Fc regiona mAb1-mAb16

4

Prolazna ekspresija i prečišćavanje humanog IgG

[0209] Ćelije su transfektovane sa DNK ekspresionog vektora koja kodira teški i laki lanac IgG mAb1 do mAb16.

[0210] Rezultati su prikazani na Fig.4. Rezultati su otkrili da su antitela proizvedena sa IgG4 izotipom proizvedena u boljem prinosu u poređenju sa drugim izotipom, IgG1 i mutantnim tihim IgG1.

Podaci profilisanja povezani sa mAb1

[0211]

Tabela 9: Podaci profilisanja mAb1

[0212] Značajno, antitela ovog otkrivanja imaju KDafinitet i EC50ispod 10nM, i čak ispod 1nM i imaju bolju indukciju apoptoze izmerenu u testu HL-60 apoptoze u odnosu na A24, pri čemu su zbog toga naročito povoljna za upotrebu kao lek.

[0213] Štaviše, ona imaju povoljna svojstva pogodnosti za razvoj, naročito za proizvodnju u eukariotskim ćelijskim linijama i davanje ljudima zbog predviđene smanjene imunogenosti.

[0214] Kodirajuće sekvence koje kodiraju varijabilne regione mogu se lako preneti u pogodnim ekspresionim vektorima i ćelijskim linijama za generisanje tihih IgG1 antitela, na primer koja obuhvataju IgG1 Fc varijantu koja sadrži L234A L235A mutaciju, ili IgG1 Fc varijantu koja sadrži N297A mutaciju.

[0215] Alternativno, kodirajuće sekvence koje kodiraju varijabilne regione mogu se takođe preneti u ekspresione vektore i ćelijske linije za generisanje antitela sa visokom ADCC aktivnošću, na primer koje obuhvataju IgG1 Fc divljeg tipa, i/ili sa umetanjem GlcNAc ili niskom fukozilacijom glikana na N297 aminokiselinskom položaju.

4

4

4

4

4

1

�

4

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Izolovano humanizovano antitelo na receptor za transferin (anti-TfR) ili protein sa antigen-vezujućim delom humanizovanog anti-TfR antitela, koje obuhvata ili,

(a) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata HCDR1 od SEQ ID NO:1, HCDR2 od SEQ ID NO:2, HCDR3 od SEQ ID NO:3 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata LCDR1 od SEQ ID NO:4, LCDR2 od SEQ ID NO:5 i LCDR3 od SEQ ID NO:6;

(b) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata HCDR1 od SEQ ID NO:1, HCDR2 od SEQ ID NO:2, HCDR3 od SEQ ID NO:3 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata LCDR1 od SEQ ID NO:4, LCDR2 od SEQ ID NO:8 i LCDR3 od SEQ ID NO:6;

(c) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:11 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata VL od SEQ ID NO:13;

(d) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:11 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata VL od SEQ ID NO:14;

(e) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:12 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata VL od SEQ ID NO:13; ili,

(f) polipeptid varijabilnog teškog lanca koji obuhvata VH od SEQ ID NO:12 i polipeptid varijabilnog lakog lanca koji obuhvata VL od SEQ ID NO:14;

pri čemu se pomenuto anti-TfR antitelo ili protein specifično vezuje za receptor za transferin (TfR) od SEQ ID NO:16.

2. Izolovano humanizovano anti-TfR antitelo ili protein prema zahtevu 1, pri čemu se pomenuto antitelo ili protein vezuje za receptor za transferin sa KDod 10nM ili manje, poželjno sa KDod 1nM ili manje.

3. Izolovano humanizovano anti-TfR antitelo ili protein prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu pomenuto antitelo ili protein indukuje apoptozu HL-60 ćelijske linije do nivoa koji je jednak ili viši od nivoa indukcije odgovarajućeg referentnog himernog antitela koji ima VH od SEQ ID NO:9 i VL od SEQ ID NO:10.

4. Izolovano humanizovano anti-TfR antitelo ili protein prema zahtevu 1, 2 ili 3, koje obuhvata konstantni region humanog IgG4 izotipa, ili mutantni ili hemijski modifikovani konstantni region, pri čemu pomenuti mutantni ili hemijski modifikovani konstantni region ne dodeljuje ili dodeljuje smanjenu ADCC aktivnost pomenutom antitelu u poređenju sa odgovarajućim antitelom sa konstantnim regionom IgG1 izotipa divljeg tipa.

5. Izolovano humanizovano anti-TfR antitelo ili protein prema zahtevu 1, 2 ili 3, koje obuhvata konstantni region humanog IgG1 izotipa, ili mutantni ili hemijski modifikovani konstantni region, pri čemu pomenuti mutantni ili hemijski modifikovani konstantni region dodeljuje povećanu ADCC aktivnost pomenutom antitelu u poređenju sa odgovarajućim antitelom sa konstantnim regionom IgG1 izotipa divljeg tipa.

6. Izolovano humanizovano anti-TfR antitelo ili protein prema bilo kom od zahteva 1-5, koje je mAb1 koje obuhvata teški lanac od SEQ ID NO:18 i laki lanac od SEQ ID NO:17.

7. Izolovano humanizovano anti-TfR antitelo ili protein prema bilo kom od zahteva 1-6, za upotrebu (i) kao lek ili (ii) u dijagnostici.

8. Izolovano humanizovano anti-TfR antitelo ili protein prema bilo kom od zahteva 1-6, za upotrebu u lečenju nekog tumora, na primer nekog hematološkog tumora, a određenije limfoma ili leukemije.

9. Izolovano humanizovano anti-TfR antitelo ili protein prema bilo kom od zahteva 1-6, za upotrebu u lečenju nekog čvrstog tumora ili bolesti kalem protiv domaćina.

10. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata humanizovano anti-TfR antitelo ili protein prema bilo kom od zahteva 1-9, u kombinaciji sa jednim ili više od farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa, razblaživača ili nosača, pri čemu, opciono, obuhvata druge aktivne sastojke.

11. Formulacija liofilizata, prethodno napunjen špric ili fiolica, koja obuhvata humanizovano anti-TfR antitelo ili protein prema bilo kom od zahteva 1-6.

12. Humanizovano anti-TfR antitelo prema bilo kom od zahteva 1-6, konjugovano sa nekim terapeutskim ostatkom, na primer, nekim citotoksinom, nekim lekom ili nekim radiotoksinom.

13. Klonirajući ili ekspresioni vektor za rekombinantnu proizvodnju humanizovanog anti-TfR antitela prema bilo kom od zahteva 1-6 u ćeliji domaćina, koji obuhvata najmanje jednu nukleinsku kiselinu koja kodira pomenuto anti-TfR antitelo.

14. Klonirajući ili ekspresioni vektor prema zahtevu 13, koji obuhvata najmanje jednu od nukleinskih kiselina koje kodiraju mAb1 kao što je definisano u zahtevu 6.

15. Ćelija domaćina koja obuhvata klonirajući ili ekspresioni vektor prema zahtevu 13 ili 14.

1

16. Postupak za proizvodnju humanizovanog anti-TfR antitela ili proteina prema bilo kom od zahteva 1-6, koji obuhvata: (i) kultivisanje ćelije domaćina prema zahtevu 15 za ekspresiju pomenutog antitela ili proteina od strane ćelije domaćina; opciono (ii) prečišćavanje pomenutog antitela ili proteina; i (iii) ponovno dobijanje pomenutog antitela ili proteina.

2