TW202342089A

TW202342089A - 長效顆粒球巨噬細胞群落刺激因子

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Publication number: TW202342089A
Application number: TW112113134A
Authority: TW
Inventors: 麥可費德豪斯; 繆小牛; 王超; 羅禕; 鄒岳峰
Original assignee: 美商伴侶療法股份有限公司
Priority date: 2022-04-08
Filing date: 2023-04-07
Publication date: 2023-11-01
Also published as: WO2023196747A1

Abstract

本揭示案大體上係關於與具有改善之藥物動力學的長效及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)相關之組合物及方法。

Description

長效顆粒球巨噬細胞群落刺激因子

本揭示案尤其係關於具有改善之藥物動力學的與長效及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)相關之組合物及方法。

群落刺激因子CSF係指一個由四種糖蛋白組成之家族，其控制及協調廣泛分佈之骨髓細胞沈積物之細胞產生。此等包括：顆粒球-巨噬細胞CSF (GM-CSF)、顆粒球群落CSF (G-CSF)、巨噬細胞群落CSF (M-CSF)及多潛能群落刺激因子(IL-3)。此等淋巴激素可誘導在骨髓中發現之前驅細胞分化成特定類型之成熟血細胞。由前驅細胞產生之特定類型之成熟血細胞視存在之CSF類型而定。參見Metcalf D. Cancer Immunol Res. 2013, 1(6): 351-356。

GM-CSF係一种血液生長因子，調控造血細胞之產生、遷移、增殖、分化及功能。響應於發炎刺激，GM-CSF由各種細胞類型釋放，該等細胞類型包括T淋巴球、巨噬細胞、纖維母細胞及內皮細胞。接著GM-CSF活化且增強嗜中性球、嗜酸性球及巨噬細胞之產生及存活。天然GM-CSF通常在作用部位附近產生，在該部位其調節造血前驅細胞之活體外增殖、分化及存活，但僅以皮莫耳濃度(10 ^-10至10 ^-12M)存在於循環血液中。參見Alexander WS. Int Rev Immunol. 1998, 16:651-682；Gasson JC. Blood. 1991, 77:1131-1145；Shannon MF等人 Crit Rev Immunol. 1997, 17:301-323；Barreda DR等人 Dev Comp Immunol. 2004, 28:509-554及Metcalf D. Immunol Cell Biology. 1987, 65:35-43。

人類GM-CSF (hGM-CSF)經合成為具有17個胺基酸信號肽之144個胺基酸殘基前驅蛋白。此前驅蛋白經加工，可產生127個胺基酸之成熟蛋白，預測分子量為14.4 kDa。其具有兩個二硫鍵，由於糖基化及唾液酸化而作為15-30 kDa之寬帶遷移。N連接之聚醣位於Asn ²⁷及Asn ³⁷，且O連接之糖基化的多個潛在位點存在於Ser5、Ser7、Ser9及Ser10，但此等位點之聚醣結構範圍尚未明確確定。已觀測到GM-CSF之糖基化模式會影響其活性、受體結合、免疫原性及半衰期。參見Lee F.等人 Proc Natl Acad Sci USA Biochem. 1985. 82: 360-4364；Miyatake S.等人 EMBO J. 1985. 4: 2561-2568. Cebon J等人 J Biol. Chem. 1991. 265, 4483-4491；Zhang Q等人 Proc. Natl. Acad. Sci. 2014, 2885-2890。

重組人類顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(rhu GM-CSF)已經FDA批准與化學療法組合用於治療嗜中性球減少症、惡血質及如白血病之惡性腫瘤。在臨床上，GM-CSF用於在化學療法之後治療嗜中性球減少症及再生不良性貧血，此大大降低與骨髓移植相關之感染的風險。其在骨髓性白血病治療及作為疫苗佐劑方面之效用也已得到充分證實。參見Dorr RT. Clin Therapeutics. 1993. 15(1):19-29；Armitage JO. Blood 1998, 92:4491-4508；Kovacic JC等人 J Mol Cell Cardiol. 2007, 42:19-33；Jacobs PP等人 Microbial Cell Factories 2010, 9:93。

儘管存在五類異種蛋白產生平台，包括細菌、酵母、植物、昆蟲細胞及哺乳動物細胞，但目前市售生物醫藥中超過50%在哺乳動物細胞株中產生。此部分係由於其餘四類無法用人類樣寡醣修飾糖蛋白。此很重要，因為蛋白質結合之聚醣會影響循環半衰期、組織分佈、生物活性及免疫原性。

GM-CSF表現系統影響GM-CSF之藥物動力學特性、生物活性及臨床毒性。在臨床上，已在中國倉鼠卵巢細胞(CHO-GM，瑞拉司亭(regramostim))、大腸桿菌(大腸桿菌-GM，莫拉司亭(molgramostim))或酵母(酵母-GM，沙格司亭(sargramostim))中產生GM-CSF。參見Dorr RT. Clin Therapeutics. 1993. 15(1):19-29；Walsh G. Nat Biotechnol. 2006, 24:769-776；Jacobs PP等人 Nat Protoc. 2009, 4:58-70；Jacobs PP等人 Microbial Cell Factories 2010, 9:93；Walsh G. Nat Biotechnol. 2018, 36(12): 1136-1145。在GM-CSF之製造過程中，存在四種主要GM-CSF同功型/物種：「超糖基化」(約50 kDa)、N-及N- + O-糖基化(約20 kDa)、O-糖基化(約16 kDa)及非糖基化(約15 kDa)物種。糖基化GM-CSF經由使用酵母(沙格司亭)或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(瑞拉司亭)技術之重組技術獲得，此等技術產生復雜糖型混合物。人類細胞來源之GM-CSF同樣亦經異質糖基化，但是，當其在大腸桿菌中製得時，GM-CSF仍然為非糖基化的。聚醣異質性反映CHO細胞轉譯後糖基化缺乏特異性。參見Dorr RT. Clinical Therapeutics/第15卷, NO. 1, 1993；Zhang Q等人 PNAS. 2014. 111(8): 2885-2890。

當聚醣添加至天冬醯胺(Asn)或精胺酸(Arg)側鏈之氮時發生N-糖基化，而當聚醣添加至絲胺酸(Ser)或蘇胺酸(Thr)或酪胺酸(Tyr)胺基酸之羥基氧側鏈時發生O-糖基化。天冬醯胺殘基通常需要Asn-Xxx-Ser/Thr/Cys之共有序列進行N-糖基化，其中Xxx可為除脯胺酸以外之任何胺基酸。沙格司亭之rhu GM-CSF蛋白質序列含有兩個共有序列，Asn-Leu-Ser (NLS)及Asn-Glu-Thr (NET)，其中該蛋白質可能糖基化。在沙格司亭之製造過程中，兩個N-糖基化位點Asn ²⁷及Asn ³⁷在醱酵槽中存在之一些GM-CSF物種中經糖基化。Thr ³⁹(或Ser ³⁹或Cys ³⁹)殘基係使Asn ²⁷或Asn ³⁷能夠進行糖基化之重要錨點。在天冬醯胺殘基37處附接有N-寡醣之物種稱為「超糖基化」物種(30-100 kDa)，因為此等糖型含有多達數百個甘露糖殘基。高甘露糖基化僅發生在N37。

沙格司亭(LEUKINE)之最終產品由N-糖基化及O-糖基化糖型以及非糖基化形式組成。因此，沙格司亭在其糖型概況中具有異質性，此在其整個許可歷史中一直非常一致。沙格司亭中近一半之GM-CSF蛋白為非糖基化的，且略少於三分之一為完全N-糖基化的。大多數(若非全部) N-糖基化物種亦為O-糖基化的。高度支化之N連接之寡醣結構覆蓋分子之顯著部分，包括H1及H5 α-螺旋，而不阻礙受體結合位點以及H6 α-螺旋及C末端隨機捲曲中之一些。儘管重組GM-CSF之碳水化合物組分因細胞來源而不同，但受體結合或活體外及活體內生物活性不需要糖基化。酵母rhu GM-CSF及非糖基化之大腸桿菌來源之rhu GM-CSF具有藉由受體親和力及細胞增殖特定活性量測之可比活性。參見Urdal及Park, 1988；Metcalf D. Cancer 1990: 65:2185-2195。

人類中之內源性蛋白質在活體內以不同速率降解，此可能因其功能而有很大差異。例如，血紅素持續存在於紅細胞之整個生命週期，且組蛋白之半衰期以年為單位，而其他蛋白質如鳥胺酸去羧酶(11分鐘半衰期)之降解速度非常快。參見Thomas E Creighton (1993). 「Chapter 10 - Degradation」. Proteins: Structures and Molecular Properties (第2版). W H Freeman and Company. 第463-473頁. ISBN 0-7167-2317-4。在真核生物中，細胞內空間中之大多數短壽命蛋白質皆藉由泛素-蛋白酶體路徑(UPP)降解。參見Kybuczkova L等人 J Cell Mol Med. 2014. 18: 947-961。UPP在蛋白質加工及降解之細胞穩態中起核心作用，該等蛋白質包括調控細胞週期進程、細胞凋亡及DNA修復之蛋白質。參見Heinemeyer W等人 J Biol Chem. 1997. 272: 25200-25209。溶酶體亦移除細胞質中及細胞外不需要之蛋白質。來自細胞外部之物質經由胞吞作用被吸收，而來自細胞內部之物質經由自噬作用被消化。參見Settembre C等人 Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2013.14 (5): 283-96。已證明GM-CSF具有可自50分鐘延長至85分鐘之半衰期。參見Cebon等人 Blood. 1988. 72: 1340-1347；Stagg等人 2004。天然存在及重組GM-CSF之活體內生物活性在很大程度上視其生體可用率而定。參見Dorr RT. Clinical Therapeutics/vol. 15, NO. 1, 1993。

已報導糖基化穩定多種蛋白質。已發現一些帶電荷之末端聚醣(例如，唾液酸)在調控糖蛋白之循環半衰期中起關鍵作用。亦有一些報導說明糖基化對於維持蛋白質之構形穩定性以防止pH變性至關重要，例如在G-CSF (GRANOCYTE)中。參見Nissen C. Eur J Cancer. 1994；30A (增刊3):S12-14；Ono M. Eur J Cancer. 1994；30A(增刊3):S7-11。例如經由青黴素G醯化酶之糖基化，亦可將增加之pH穩定性人工工程改造至蛋白質中。與非糖基化蛋白質相比，該蛋白質糖基化型式之半衰期在pH 3時增加13倍，且在pH 10時增加7倍。參見Masarova J, Biotechnol Appl Biochem. 2001；34(Pt 2):127-133。亦表明，糖基化程度及聚醣尺寸均可增加蛋白質之失活半衰期，但在增加聚醣尺寸時會帶來顯著更大之動力學穩定性。參見Solá RJ, Al-Azzam W, Griebenow K. Biotechnol Bioeng. 2006；94(6):1072-1079；Sola RJ, Cell Mol Life Sci. 2007；64(16):2133-2152；Sola RJ等人 J Pharm Sci. 2009. 98(4): 1223-1245。

治療性蛋白質(生物治療性或生物性)在人類中之生體可用率亦可能受到藥物投與途徑之影響。參見Dorr RT, Clinical Therapeutics/第15卷, NO. 1, 1993。緊接在靜脈內(IV)投藥後幾乎所有治療性蛋白質均可用，但接著隨著時間推移可能藉由血漿中存在之蛋白酶降解。在一些情況下，皮下(SC)投藥藉由較長時間維持高血漿濃度而延長對具有短消除半衰期之蛋白質的暴露，且與靜脈內投藥相比可更好地耐受。因此，SC投藥後生物治療劑之吸收可能受其在細胞外基質(ECM)中之命運的影響，包括不完全生體可用率之可能性。參見Hale G,等人 Blood. 2004.104(4):948-955。將沙格司亭中存在之不同同功型轉運至體循環中可能有利於不同途徑，因為其分子大小不同。

GM-CSF表現系統可影響藥物動力學參數，其中糖基化程度影響GM-CSF半衰期、分佈及消除。已使用大鼠模型報導GM-CSF糖基化程度與其分佈、清除及活性之間的關係。發現相對於較小、較少糖基化之分子，在最大、最完全糖基化形式之蛋白質中活體外量測之GM-CSF比活性顯著降低。藉由添加N連接之碳水化合物，單次靜脈內推注後大鼠血流中GM-CSF之有效半衰期顯示顯著增加。大鼠中GM-CSF之清除遵循雙相動力學，且碳水化合物修飾延長第一階段或c階段。參見Donohue RE等人, Cold Spring Harbor Labs. 1986. 51: 685-692及Dorr RT Clinical Therapeutics. 1993. 15(1): 19-29。影響藥物動力學參數之另一種方法係將標靶蛋白(如GM-CSF)與白蛋白結合。此可利用白蛋白之長半衰期及靶向能力來增強標靶蛋白之生物穩定性。參見Chuang Y-M等人 Cell Mol Immunol. 2020。

抗血清白蛋白域抗體亦已顯示可延長短效藥物之半衰期。參見Holt LJ等人. Protein Eng Des Sel. 2008. 21(5):283-8。然而，習知抗體之大尺寸會阻礙標靶蛋白或藥物在活體內向細胞之遞送。奈米抗體(15 kDa)及基於奈米抗體之人類重鏈抗體(75 kDa)可克服此等限制。駱駝科天然產生僅由重鏈組成之抗體，其中標靶識別模組由單個可變域(VHH或Nb)構成。奈米抗體之優點包括其尺寸小、溶解度高、高穩定性及活體內組織滲透性好。參見Bannas P等人 Front Immunol. 2017。可藉由將一或多種抗腫瘤奈米抗體與白蛋白特異性奈米抗體融合來延長例如抗腫瘤奈米抗體之分子的活體內半衰期。參見Roovers RC等人 Int J Cancer. 2011. 129(8):2013-24；Zhu Y等人 Sci Rep (2017) 7(1):2602；Bannas P等人 Front Immunol. 2017。按理說，增加基於GM-CSF之療法之半衰期及循環時間可減少劑量且簡化對患者投與之治療方案。此可能對患者護理品質、患者依從性及降低醫療成本產生積極影響。

仍然需要具有改善之藥物動力學、延長之半衰期及增加之循環時間的GM-CSF分子。

因此，本揭示案係關於GM-CSF之長效形式，其尤其提供相對於野生型GM-CSF或沙格司亭改善之藥物動力學及藥效學。

在態樣中，提供一種融合或嵌合蛋白，該蛋白包含重組人類GM-CSF蛋白、連接子及人類化單域抗體。

在態樣中，本發明組合物之重組人類GM-CSF蛋白包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少約97%一致性且視情況在位置N37或與其對應之位置處具有取代或缺失的胺基酸序列，例如在位置N37或與其對應之位置處的胺基酸可經取代為極性且電荷中性之親水性胺基酸，諸如麩醯胺酸(Q)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、脯胺酸(P)及半胱胺酸(C)。

在態樣中，本發明組合物之人類化單域抗體包含具有三個CDR之重鏈，例如如根據IMGT命名法或Kabat命名法定義。

IMGT命名法： CDR-H1：GETLDYYA (SEQ ID NO: 12) CDR-H2：IASSGGST (SEQ ID NO: 13) CDR-H3：AAAVLECRTVVRGYDY (SEQ ID NO: 14) Kabat CDR定義： CDR-H1：ETLDYYAIG (SEQ ID NO: 15) CDR-H2：IASSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 16) CDR-H3：AVLECRTVVRGYDY (SEQ ID NO: 17)。

在態樣中，本發明組合物之人類化單域抗體包含具有SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14之三個CDR，或具有一或多個取代或缺失(例如1個或2個或3個或4個)之變異體的重鏈。在態樣中，本發明組合物之人類化單域抗體包含具有SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 17之三個CDR，或具有一或多個取代或缺失(例如1個或2個或3個或4個)之變異體的重鏈。在態樣中，本發明組合物之人類化單域抗體包含與SEQ ID NO: 3具有至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約98%、或至少約99%一致性且在非人類美洲駝抗體構架內具有取代或缺失以實現非人類抗體之人類化的胺基酸序列。CDR根據IMGT命名法定義。CDR亦可藉由Kabat命名法來定義。

IMGT命名法： CDR-H1: GETLDYYA (SEQ ID NO: 12) CDR-H2: IASSGGST (SEQ ID NO: 13) CDR-H3: AAAVLECRTVVRGYDY (SEQ ID NO: 14) Kabat CDR定義： CDR-H1: ETLDYYAIG (SEQ ID NO: 15) CDR-H2: IASSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 16 ) CDR-H3: AVLECRTVVRGYDY(SEQ ID NO: 17) 在態樣中，融合或嵌合蛋白，包含重組人類GM-CSF蛋白之該蛋白與人類化單域抗體經由連接子融合。

在實施例中，本發明組合物包含複數種分子形式，例如非糖基化、O-糖基化、N-糖基化及/或N+O糖基化形式。在實施例中，本發明之融合或嵌合蛋白基本上不含超糖基化、例如超甘露糖基化形式。

在實施例中，亦提供編碼本發明之融合或嵌合蛋白之核酸分子(例如密碼子最佳化序列)。在實施例中，亦提供表現編碼本發明之融合或嵌合蛋白之核酸分子的人類宿主細胞，視情況中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在實施例中，亦提供一種醫藥組合物，其包含本發明之融合或嵌合蛋白及醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。

在態樣中，提供一種治療正在進行或已經進行癌症療法、或正在進行或已經進行骨髓移植、或已經急性暴露於骨髓抑制劑量之輻射(例如急性輻射病或急性輻射症候群(ARS))及/或具有輻射復合傷(RCI)之患者或個體的方法；該方法包括向該患者投與治療有效量之本文所述之醫藥組合物。

在態樣中，提供一種治療神經退化性疾病之方法，該神經退化性疾病為例如不限於阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、進行性核上性麻痺症(PSP)、多系統萎縮症(MSA)、路易體失智症、帕金森氏症失智症癲癇、中風、杭丁頓氏舞蹈症、大腦缺氧、多發性硬化症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)及周圍神經病變，且有需要之個體已用本文描述之融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物進行治療。

在態樣中，提供一種治療真菌感染之方法，該真菌感染為例如不限於侵襲性真菌感染，視情況選自念珠菌病及/或白黴菌病感染，且有需要之個體已用本文描述之融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物進行治療。

在態樣中，提供一種治療自體免疫疾病之方法，該自體免疫疾病視情況選自克羅恩氏症(Crohn’s disease)及/或潰瘍性結腸炎(UC)、大腸急躁症(IBD)及/或其他炎性疾病，有需要之患者或個體已用本文描述之融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物進行治療。

在實施例中，本發明之融合或嵌合蛋白在功能上類似於沙格司亭。在實施例中，與重組人類GM-CSF相比，融合或嵌合蛋白具有增強之藥物動力學。在實施例中，與重組人類GM-CSF相比，融合或嵌合蛋白具有增強之半衰期。在實施例中，與重組人類GM-CSF相比，融合或嵌合蛋白具有增強之藥效學。

相關申請案之交叉引用

本申請案主張於2022年4月8日申請之美國臨時專利申請案第63/329,039號的優先權，出於所有目的，其全部內容以引用之方式併入本文中。以電子方式提交之文本文檔的說明

以電子方式提交之文本文檔的內容以引用之方式整體併入本文中：序列表之電腦可讀格式複本(檔名：PNR-009TW 127114-5009-TW Sequence Listing.xml；記錄日期：2023年3月23日；文檔大小：20,480位元組)。

本揭示案部分地基於一種融合或嵌合蛋白，其包含重組人類GM-CSF蛋白、連接子及人類化單域抗體，其中該組合物產生具有增強之半衰期、藥物動力學及藥效學之功能性GM-CSF。 GM-CSF之組合物

在一態樣中，提供經工程改造之融合或嵌合蛋白。

在實施例中，在本揭示案之實踐中使用之經工程改造之GM-CSF包括任何醫藥學上安全及有效之GM-CSF，或其具有GM-CSF生物活性之任何衍生物，視情況具有本發明之取代及/或缺失。

在一個實施例中，用於實施主題方法之經工程改造之GM-CSF源自重組人類GM-CSF (rhu GM-CSF)，諸如沙格司亭(LEUKINE)。沙格司亭係一種生物合成的酵母來源之重組人類GM-CSF，屬於單一127個胺基酸之糖蛋白，其與內源性人類GM-CSF之不同之處在於在位置23處具有白胺酸而非精胺酸。其他天然及合成之GM-CSF及其具有天然人類GM-CSF生物活性之衍生物在本揭示案之實踐中可能同樣有用。

在實施例中，本發明重組人類GM-CSF分子經糖基化。在實施例中，本發明重組人類GM-CSF分子包含一或多個影響GM-CSF糖基化之取代及/或缺失。

不希望受理論束縛，生物合成GM-CSF之糖基化程度似乎影響半衰期、分佈及消除。(Lieschke及Burgess, N. Engl. J. Med. 327:28-35, 1992；Dorr, R. T., Clin. Ther. 15:19-29, 1993；Horgaard等人, Eur. J. Hematol. 50:32-36, 1993)。

在一態樣中，提供一種重組人類GM-CSF蛋白，其包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%一致性或100%一致性的胺基酸序列。在一態樣中，提供一種重組人類GM-CSF蛋白，其包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%一致性或100%一致性且在位置N37或與其對應之位置處具有取代或缺失的胺基酸序列。

在實施例中，重組人類GM-CSF之在位置N37或與其對應之位置處的胺基酸為極性且電荷中性之親水性胺基酸。在實施例中，極性且電荷中性之親水性胺基酸係選自麩醯胺酸(Q)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、脯胺酸(P)及半胱胺酸(C)。在實施例中，極性且電荷中性之親水性胺基酸為麩醯胺酸(Q)。在實施例中，極性且電荷中性之親水性胺基酸係選自麩醯胺酸(Q)、絲胺酸(S)及蘇胺酸(T)。

在實施例中，提供一種重組人類GM-CSF蛋白，其包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%一致性或100%一致性且具有N37 缺失、N37Q、N37S、N37T、N37P及N37C中之一或多者的胺基酸序列。

在實施例中，重組人類GM-CSF具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之胺基酸序列,或與其約90%、或約93%、或約95%、或約97%、或約98%一致性之變異體，視情況具有本發明之取代及/或缺失。

在實施例中，GM-CSF為莫拉司亭、沙格司亭及瑞拉司亭中之一者，視情況具有本發明取代及/或缺失。

不希望受理論束縛，hGM-CSF之核心由四個成角度排列之螺旋組成。rhGM-CSF之晶體結構及誘變分析(Rozwarski D A等人, Proteins 26:304-13, 1996)表明，除蛋白質核心中之非極性側鏈外，10個掩埋之氫鍵殘基涉及與主鏈原子之分子內氫鍵鍵結，該等主鏈原子比與其他側鏈原子進行氫鍵鍵結之殘基更保守；在不對稱單元中之兩個分子中之等效位置觀測到24個溶劑化位點，且其中最強者位於二級結構元件之間的裂縫中。疏水性側鏈之兩個表面簇位於預期受體結合區域附近。螺旋A/螺旋C面上殘基之誘變證實某些Glu、Gly及Gln殘基之重要性。因此，此等殘基不會在用於本揭示案之hGM-CSF之功能性取代變異體中被取代，且此等螺旋將保留在用於本揭示案之hGM-CSF之功能性片段或缺失變異體中。

此外，在實施例中，關於結構資訊，普通技術人員可參考UniProtKB條目P04141以告知變異體之身份。

hGM-CSF之N端螺旋控制與其受體之高親和力結合(Shanafelt A B等人, EMBO J 10:4105-12, 1991)。GM-CSF生物學效應之轉導需要與至少兩種細胞表面受體組分(其中之一與細胞介素IL-5共享)相互作用。上述研究藉由在一系列人類-小鼠雜交GM-CSF細胞介素上定位獨特受體結合域，確定GM-CSF中之受體結合決定子。GM-CSF與其高親和力受體複合物之共享次單元之相互作用受肽鏈之一小部分控制。N末端α-螺旋中存在少數關鍵殘基足以賦予相互作用特異性。

因此，在實施例中，此資訊可告知技術人員關於胺基酸序列中可接受之變化。

在實施例中，胺基酸突變為胺基酸取代，且可包括保守及/或非保守取代。

「保守取代」可例如基於所涉及之胺基酸殘基之極性、電荷、大小、溶解度、疏水性、親水性及/或兩親性之相似性來進行。20種天然存在之胺基酸可分為以下六個標準胺基酸組：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr；Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

如本文所用，「保守取代」定義為胺基酸經列在上面所示之六個標準胺基酸組之相同組中之另一個胺基酸替換。例如，Glu替換Asp在如此修飾之多肽中保留一個負電荷。此外，甘胺酸及脯胺酸可根據其破壞α-螺旋之能力相互取代。

如本文所用，「非保守取代」定義為胺基酸經列在上面所示之(1)至(6)六個標準胺基酸組之不同組中之另一個胺基酸替換。

在各種實施例中，取代亦可包括非經典胺基酸(例如硒代半胱胺酸、吡咯離胺酸、 N-甲醯甲硫胺酸、β-丙胺酸、GABA及δ-胺基乙醯丙酸、4-胺基苯甲酸(PABA)、常見胺基酸之D-異構體、2,4-二胺基丁酸、α-胺基異丁酸、4-胺基丁酸、Abu、2-胺基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-胺基己酸、Aib、2-胺基異丁酸、3-胺基丙酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、羥脯胺酸、肌胺酸、瓜胺酸、高瓜胺酸、氧化半胱胺酸、三級丁基甘胺酸、三級丁基丙胺酸、苯基甘胺酸、環己基丙胺酸、β-丙胺酸、氟胺基酸、設計胺基酸如β甲基胺基酸、C α-甲基胺基酸、N α-甲基胺基酸及一般胺基酸類似物)。

胺基酸序列之修飾可使用所屬領域任何已知技術，例如定點誘變或基於PCR之誘變來實現。此類技術在例如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 1989及Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989中有所描述。糖型

在實施例中，本發明之融合或嵌合蛋白含有包含複數種分子形式之GM-CSF分子。在實施例中，該等分子形式係選自非糖基化、O-糖基化、N-糖基化及N+O糖基化形式。

在實施例中，融合或嵌合蛋白基本上不含超糖基化、例如超甘露糖基化形式。在實施例中，重組人類GM-CSF在純化後具有約或少於約10%超甘露糖基化形式，或在純化後具有約或少於約5%超甘露糖基化形式，或在純化後具有約或少於約3%超甘露糖基化形式，或在純化後具有約或少於約2%超甘露糖基化形式，或在純化後具有約或少於約1%超甘露糖基化形式。

在實施例中，當以相同方式表現及純化時，融合或嵌合蛋白具有比野生型人類GM-CSF及/或沙格司亭少之超甘露糖基化形式。在實施例中，當以相同方式表現及純化時，重組人類GM-CSF具有比野生型人類GM-CSF及/或沙格司亭少約100%、或約90%、或約80%、或約70%、或約60%、或約50%、或約40%、或約30%、或約20%、或約10%之超甘露糖基化形式。在實施例中，超甘露糖基化形式之量可如所屬領域已知進行偵測，例如但不限於層析方法(例如尺寸解析度(例如經由分子量及/或在管柱中之滯留時間及/或螢光標記(例如使用2-胺基苯甲酸(2-AA)、2-胺基苯甲醯胺(2-AB)及2-胺基吡啶(2-AP)、陰離子交換層析及其類似物)、質譜法、SDS-PAGE/染色(例如基於過碘酸-席夫(PAS)反應之凝膠染色程序)、基於親和力之方法(諸如使用醣結合蛋白(例如凝集素))、基於酶之方法、基於抗體之方法、釋放分析(例如酶促裂解或聚醣之化學移除或化學衍生化)、毛細管電泳及東方墨點法。

在實施例中，本發明之融合或嵌合蛋白適用於比用於沙格司亭之純化更簡單之純化。

在實施例中，當藉由反相高效液相層析法(RP-HPLC)定量時，本發明之融合或嵌合GM-CSF蛋白解析為三個峰。在實施例中，本發明組合物例如經由HPLC解析為三種形式(無糖基化形式、O連接之糖型及O+N連接之糖型)且缺乏超糖基化形式。

在實施例中，本發明之融合或嵌合GM-CSF蛋白不用超糖基化物種即可純化，無需一或多種有機溶劑(例如但不限於乙腈、三氟乙酸(TFA)、吡啶、乙酸及/或N-丙醇)及/或用於純化及/或移除超糖基化峰(無糖基化形式、O連接之糖型及O+N連接之糖型)的反相C4 HPLC管柱。

在實施例中，本發明重組人類GM-CSF包含多於一種物種(例如糖型)。

在實施例中，在哺乳動物細胞、例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生之融合或嵌合蛋白為單體的，具有兼具糖基化及無糖基化同功型之異質糖型。人類化單域抗體(VHH)

在態樣中，本發明組合物之人類化單域抗體包含與SEQ ID NO: 3具有至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約98%、或至少約99%一致性且在非人類美洲駝抗體構架內具有取代或缺失以實現非人類抗體之人類化的胺基酸序列。CDR根據IMGT命名法定義。CDR亦可藉由Kabat命名法來定義。

在態樣中，本發明組合物之人類化單域抗體包含與SEQ ID NO. 3具有至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%一致性之胺基酸序列及/或包含三個選自以下之CDR：(i) SEQ ID NO: 12-14或其變異體或(ii) SEQ ID NO: 15-17或其變異體。

在實施例中，本發明組合物之人類化單域抗體(VHH)結合人類、小鼠及恆河猴血清白蛋白。在實施例中，本發明組合物之人類化單域抗體(VHH)結合人類血清白蛋白及/或對其具有特異性(HSA)。在實施例中，本揭示案之組合物結合HAS，其中HSA存在於人類血漿中。

在實施例中，本發明組合物實質上不與HSA競爭結合新生兒Fc受體(FcRn)。

在實施例中，本發明組合物結合蛋白A。

在實施例中，當本發明之融合或嵌合蛋白可溶時，蛋白結合活性可根據解離常數(KD)呈現。視情況，當融合或嵌合蛋白為膜抗原時，抗原結合活性可根據表觀解離常數(表觀KD)呈現。

在實施例中，解離常數、KD及表觀解離常數(表觀KD)可藉由所屬領域技術人員已知之方法，例如使用Biacore (GE healthcare)、Scatchard圖示或FACS確定。

在實施例中，本揭示案提供具有至少約50 nM、或至少約45 nM、或至少約40 nM、或至少約35 nM、或至少約30 nM、或至少約25 nM、或至少約20 nM、或至少約15 nM、或至少約10 nM、或至少約5 nM之KD的組合物。在實施例中，本揭示案提供具有至少約100 pM、或至少約90 pM、或至少約80 pM、或至少約70 pM、或至少約60 pM、或至少約50 pM、或至少約40 pM、或至少約30 pM、或至少約20 pM或至少約10 pM之表觀KD的組合物。

在實施例中，可在不同條件下測定組合物之結合活性。在較佳實施例中，量測條件恆定。連接子

在態樣中，融合或嵌合蛋白，包含重組人類GM-CSF蛋白之該蛋白經由連接子與人類化單域抗體連接及/或融合。

在實施例中，本發明組合物之連接子為可撓性連接子。在實施例中，本發明組合物之可撓性連接子實質上包含甘胺酸及絲胺酸殘基。在實施例中，本發明組合物之可撓性連接子包含至少約20、或至少約30、或至少約40、或至少約50、或至少約60個胺基酸殘基。

在一個實施例中，本發明組合物之可撓性連接子包含(Gly ₄Ser) _n，其中n為約1至約12。

在一個實施例中，本發明組合物之可撓性連接子包含(Gly ₄Ala) _n，其中n為約1至約12。

在一個實施例中，本發明組合物之可撓性連接子為鉸鏈-CH2-CH3 Fc域。在一個實施例中，本發明組合物之鉸鏈-CH2-CH3 Fc域源自人類IgG。在實施例中，本發明組合物之鉸鏈-CH2-CH3 Fc域源自人類IgG1、IgG2或IgG4。

在實施例中，本發明組合物之連接子包含選自SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。在實施例中，本發明組合物之連接子包含與SEQ ID NO: 6具有至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%一致性之胺基酸序列。在實施例中，本發明組合物之連接子包含具有或SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5或其變異體(例如，具有約5個、或約4個、或約3個、或約2個、或約1個取代或缺失)之胺基酸序列。

在態樣中，本發明組合物之VHH域位於融合或嵌合蛋白之N端。

在態樣中，本發明組合物之重組GM-CSF位於融合或嵌合蛋白之N端。

在實施例中，與在C端包含重組GM-CSF之組合物相比，包含融合或嵌合蛋白之N端的本發明組合物之重組GM-CSF產量增加。含有融合或嵌合蛋白之重組GM-CSF之功能特性

在實施例中，視情況具有本發明取代及/或缺失的本發明之融合或嵌合蛋白在功能上類似於野生型人類GM-CSF及/或沙格司亭(例如一或多個功能參數之差異不超過所分析功能參數之約50%、或不超過約40%、或不超過約30%、或不超過約20%、或不超過約10%、或不超過約5%、或不超過約5倍、或不超過約4倍、或不超過約3倍、或不超過約2倍)。在實施例中，GM-CSF之功能參數可藉由所屬領域已知之分析法偵測，該等分析法例如但不限於使用細胞如TF-1細胞株、初級骨髓細胞之增殖分析法、生化分析法如ILITE (EAGLE) GM-CSF (在GM-CSF啟動子控制下之螢光素酶)、細胞存活分析法(例如骨髓細胞存活分析法)、細胞分化分析法及共培養實驗。

在實施例中，視情況具有本發明之取代及/或缺失的本發明之融合或嵌合蛋白結合及/或活化顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子受體(GM-CSF-R-α或CSF2R)。在實施例中，視情況具有本發明之取代及/或缺失的本發明之重組人類GM-CSF分子以與野生型人類GM-CSF及/或沙格司亭相當之親和力、功效及/或生物活性結合及/或活化顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子受體(GM-CSF-R-α或CSF2R) (例如，一或多個功能參數之差異不超過約50%、或不超過約40%、或不超過約30%、或不超過約20%、或不超過約10%、或不超過約5%、或不超過約5倍、或不超過約4倍、或不超過約3倍、或不超過約2倍)。GM-CSF結合及活化之分析法係所屬領域已知的。此類分析法之非限制性實例包括例如放射性配位體分析法或非放射性配位體分析法(例如免疫沈澱(IP)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、西方墨點法、螢光偏振(FP)、螢光共振能量轉移(FRET )、表面電漿子共振(SPR)及放射免疫分析(RIA)。結合動力學亦可藉由所屬領域已知之標準分析法，例如藉由Biacore分析來評估。亦可使用全細胞配位體結合分析法及使用可溶性GM-CSF受體α (sGMRa)之無細胞分析系統。可使用之一些其他類型之分析法包括受體結合或飽和結合，或使用放射性碘化之GM-CSF之競爭性結合分析法，以及細胞增殖分析法。

在實施例中，可使用一或多種基於細胞之活性生物分析法，例如使用GM-CSF依賴性人類細胞株增殖分析法，例如使用TF-1、M-07e、HU-3、M-MOK、MB-02、GM/SO、F-36P、GF-D8、ELF-153、AML-193、MUTZ-3、OCI-AML5、OCI-AML6、OCI-AML1、SKNO-1、UCSD-AML1及UT-7來分析本發明之融合或嵌合蛋白。

在實施例中，本發明之融合或嵌合蛋白之效力使用採用TF-1細胞之生物分析法量測，TF-1細胞係一種響應GM-CSF而增殖之人類紅血球白血病細胞株。該測定之細節是所屬領域已知之。例如，參考標準、對照及測試樣品在分析介質中一式三份連續稀釋，且添加至三個獨立之96孔盤中。接著添加懸浮液中之TF-1細胞，且將混合物在37℃下培育約69.5-72小時。在添加螢光染料(例如ALAMARBLUE)後，將盤在37℃下培育約6.6-8小時。接著在螢光微定量盤式讀取儀中量測TF-1細胞增殖。

在實施例中，本發明之融合或嵌合蛋白具有與缺乏突變之重組人類GM-CSF大致相同之特定活性(例如，如使用採用TF-1細胞之生物分析法所分析)。

在實施例中，在哺乳動物細胞、諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生之本發明之融合或嵌合蛋白之功能與在酵母細胞中產生之重組人類GM-CSF相當(例如一或多個功能參數之差異不超過約90%、或不超過約80%、或不超過約70%、或不超過約60%、或不超過約50%、或不超過約40%、或不超過約30%、或不超過約20%、或不超過約10%、或不超過約5%、或不超過約10倍、或不超過約9倍、或不超過約8倍、或不超過約7倍、或不超過約6倍、或不超過約5倍、或不超過約4倍、或不超過約3倍、或不超過約2倍)。

在實施例中，與沙格司亭或WT GM-CSF相比，本發明之融合或嵌合蛋白具有改善之藥物動力學及藥效學。在實施例中，與沙格司亭或WT GM-CSF相比，本發明之融合或嵌合蛋白具有延長之半衰期(例如一或多個功能參數之差異不超過約50%、或不超過約40%、或不超過約30%、或不超過約20%、或不超過約10%、或不超過約5%、或不超過約5倍、或不超過約4倍、或不超過約3倍、或不超過約2倍)。

在實施例中，發生結合及/或活化之GM-CSF-R-α在細胞表面表現。在實施例中，細胞為造血前驅細胞。在實施例中，造血前驅細胞為免疫細胞。在實施例中，造血前驅細胞經輻照。

在實施例中，視情況具有本發明取代及/或缺失的本發明之融合或嵌合蛋白的免疫原性，與野生型人類GM-CSF及/或沙格司亭相當(例如一或多個功能參數之差異不超過約50%、或不超過約40%、或不超過約30%、或不超過約20%、或不超過約10%、或不超過約5%、或不超過約5倍、或不超過約4倍、或不超過約3倍、或不超過約2倍)。在實施例中，使用所屬領域已知之方法分析免疫原性。非限制性實例包括偵測一或多種抗GM-CSF結合抗體，如藉由例如篩選分析法(諸如直接或間接或橋接ELISA、電化學發光、基於珠粒之化學發光分析法、放射免疫沈澱分析法、表面電漿子共振及生物層干涉術)，以及基於細胞之螢光素酶報導基因中和抗體分析法評估。

在態樣中，融合或嵌合蛋白顯著增加嗜中性球、單核球、嗜酸性球、總WBC及血小板之水準、細胞計數及/或量。在實施例中，融合或嵌合蛋白顯著增加血小板之水準、細胞計數及/或量。

在實施例中，細胞重組融合或嵌合蛋白為可溶的。核酸及宿主細胞

在實施例中，提供一種核酸分子，其編碼本文所述之融合或嵌合蛋白。在實施例中，核酸分子具有密碼子最佳化序列。

在實施例中，宿主細胞為酵母、哺乳動物、細菌、昆蟲、藻類或植物細胞。

在實施例中，酵母細胞為非甲基營養型酵母細胞。在實施例中，宿主細胞為釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)細胞。

在實施例中，提供表現本文所述之核酸分子的人類宿主細胞。

在實施例中，提供一種表現本文所述之核酸分子的非人類宿主細胞。

在實施例中，提供一種表現本文所述之核酸分子的CHO細胞。醫藥組合物及調配物

在實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之融合或嵌合蛋白及醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。

本文所述之任何醫藥組合物可作為包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑之組合物的組分投與至個體。此類組合物可視情況包含合適量之醫藥學上可接受之賦形劑以提供適合投藥之形式。

在各種實施例中，醫藥賦形劑可為液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之彼等油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。醫藥賦形劑可為例如鹽水、阿拉伯樹膠、明膠、澱粉糊、滑石粉、角蛋白、膠態二氧化矽、尿素及其類似物。此外，可使用助劑、穩定劑、增稠劑、潤滑劑及著色劑。在一個實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑在投與至個體時為無菌的。當靜脈內投與本文所述之任何藥劑時，水為有用之賦形劑。鹽水溶液及葡萄糖及甘油水溶液亦可用作液體賦形劑，特別是可注射溶液。合適醫藥賦形劑亦包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其類似物。若需要，本文所述之任何試劑亦可包含少量潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑。合適醫藥賦形劑之其他實例描述於 Remington’s Pharmaceutical Sciences1447-1676 (Alfonso R. Gennaro編輯, 第19版 1995)，以引用之方式併入本文中。

本揭示案包括各種製劑之所述醫藥組合物(及/或額外治療劑)。本文所述之任何本發明之醫藥組合物(及/或額外治療劑)可採用溶液、懸浮液、乳液、滴劑、錠劑、丸劑、小丸劑、膠囊、含有液體之膠囊、明膠膠囊、粉劑、持續釋放調配物、栓劑、乳液、氣霧劑、噴霧劑、懸浮液、凍乾粉、冷凍懸浮液、乾燥粉之形式或任何其他適合使用之形式。在一個實施例中，組合物呈膠囊形式。在另一個實施例中，組合物呈錠劑形式。在又一個實施例中，醫藥組合物調配成軟明膠膠囊之形式。在另一實施例中，醫藥組合物調配成明膠膠囊之形式。在又一個實施例中，醫藥組合物調配成液體。

必要時，本發明之醫藥組合物(及/或額外治療劑)亦可包括增溶劑。此外，可用所屬領域已知之合適媒劑或遞送裝置來遞送藥劑。本文概述之組合療法可在單一遞送媒劑或遞送裝置中共同遞送。

包含本發明之醫藥組合物(及/或額外治療劑)之調配物宜以單位劑型呈現且可藉由藥學領域熟知之任何方法製備。此類方法通常包括使治療劑與構成一或多種輔助成分之載劑結合之步驟。通常，藉由將治療劑與液體載劑、細粉狀固體載劑或兩者均勻且密切地結合，且接著必要時，將產物成型為所需調配物之劑型(例如，濕或乾法造粒、粉末摻合物等，接著使用所屬領域已知之習知方法壓片)來製備調配物。

在各種實施例中，本文所述之任何醫藥組合物(及/或額外治療劑)根據常規程序調配為適合本文所述之投與模式之組合物。

投藥途徑包括例如：口服、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外、舌下、鼻內、腦內、陰道內、透皮、直腸、吸入或局部投藥。投藥可為局部的或全身的。在實施例中，投藥口服進行。在另一個實施例中，投藥係藉由非經腸注射。投藥模式可由行醫者自行決定，且部分視醫療疾患之部位而定。在大多數情況下，投藥導致本文所述之任何藥劑釋放至血流中。

在特定實施例中，融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物(及/或額外治療劑)藉由靜脈內途徑投與。

在一個實施例中，本文所述之醫藥組合物(及/或額外治療劑)根據常規程序調配為適於口服投藥之組合物。用於口服遞送之組合物可呈例如錠劑、口含錠、水性或油性懸浮液、顆粒劑、粉劑、乳液、膠囊、糖漿或酏劑之形式。口服投藥之組合物可包含一或多種試劑，例如甜味劑，諸如糖、阿斯巴甜或糖精；調味劑，諸如薄荷、冬青油或櫻桃；著色劑；及防腐劑，以提供醫藥學上適口之製劑。此外，在錠劑或丸劑形式之情況下，可對組合物進行包衣以延遲在胃腸道中之崩解及吸收，從而在延長之時間段內提供持續作用。包圍驅動本文所述之任何醫藥組合物(及/或額外治療劑)之滲透活性劑的選擇性滲透膜亦適用於口服投與之組合物。在後面此等平台中，來自膠囊周圍環境之流體由驅動化合物吸收，驅動化合物膨脹以穿過孔置換藥劑或藥劑組合物。此等遞送平台可提供基本上零級之遞送概況，而非立即釋放調配物之尖峰概況。諸如單硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯之時間延遲材料亦可為有用的。口服組合物可包括標準賦形劑，諸如甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素及碳酸鎂。在一個實施例中，賦形劑為醫藥級的。除活性化合物外，懸浮液亦可含有助懸劑，諸如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇及山梨糖醇酐酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂、黃芪膠等及其混合物。

適用於非經腸投藥(例如靜脈內、肌肉內、腹膜內、皮下及關節內註射及輸注)之劑型包括例如溶液、懸浮液、分散液、乳液及其類似劑型。其亦可呈無菌固體組合物(例如凍乾組合物)之形式製造，其可在即將使用時溶解或懸浮在無菌可注射介質中。其可含有例如所屬領域已知之懸浮劑或分散劑。適用於非經腸投藥之調配組分包括無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如EDTA；緩衝劑，諸如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及調節張力之試劑，諸如氯化鈉或葡萄糖。

對於靜脈內投藥，合適載體包括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。載劑在製造及儲存條件下應穩定，且應防微生物。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇)及其合適混合物之溶劑或分散介質。

本文所述之任何本發明之醫藥組合物(及/或額外治療劑)可藉由控制釋放或持續釋放方式或藉由所屬領域普通技術人員熟知之遞送裝置投與。實例包括但不限於美國專利第3,845,770號；第3,916,899號；第3,536,809號；第3,598,123號；第4,008,719號；第5,674,533號；第5,059,595號；第5,591,767號；第5,120,548號；第5,073,543號；第5,639,476號；第5,354,556號；及第5,733,556號，各者均以引用之方式整體併入本文中。此類劑型可用於使用例如羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、其他聚合物基質、凝膠、滲透膜、滲透系統、多層包衣、微粒、脂質體、微球或其組合提供不同比例之所需釋放概況來提供一或多種活性成分之控制釋放或持續釋放。可容易地選擇所屬領域技術人員已知之合適控制釋放或持續釋放調配物，包括本文所述之彼等調配物，與本文所述之藥劑之活性成分一起使用。因此，本揭示案提供適合於口服投與之單一單位劑型，諸如但不限於適於控制釋放或持續釋放之錠劑、膠囊、軟膠囊及囊片。

活性成分之控制或持續釋放可藉由各種條件來刺激，包括但不限於pH值之變化、溫度之變化、適當波長之光的刺激、酶之濃度或可用性、水之濃度或可用性或其他生理條件或化合物。

在另一個實施例中，控制釋放系統可置放在待治療之目標區域附近，因此僅需要全身劑量之一部分(參見例如Goodson, Medical Applications of Controlled Release, 上述, 第2卷, 第115-138頁(1984))。可使用在Langer, 1990, Science249:1527-1533之評論中論述之其他控制釋放系統。

醫藥調配物較佳為無菌的。滅菌可例如藉由無菌過濾膜過濾來完成。當組合物凍乾時，可在凍乾及復原之前或之後進行過濾滅菌。醫藥學上可接受之鹽及賦形劑

本文所述之組合物可具有足夠鹼性之官能基，其可與無機或有機酸反應，或具有羧基，其可與無機或有機鹼反應，形成醫藥學上可接受之鹽。如所屬領域所熟知，醫藥學上可接受之酸加成鹽由醫藥學上可接受之酸形成。此類鹽包括在例如 Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977)及 The Handbook of Pharmaceutical Salts ； Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl及C. G. Wermuth (編輯), Verlag, Zurich (Switzerland) 2002中列出，其以引用之方式整體併入本文中。

作為非限制性實例，醫藥學上可接受之鹽包括硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡萄醣醛酸鹽、蔗糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、樟腦磺酸鹽、雙羥萘酸鹽、苯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙烯酸鹽、氯苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、鄰乙醯氧基苯甲酸鹽、萘-2-苯甲酸鹽、異丁酸鹽、苯基丁酸鹽、α-羥基丁酸鹽、丁炔-1,4-二甲酸鹽、己炔-1,4-二甲酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、肉桂酸鹽、乙醇酸鹽、庚酸鹽、馬尿酸鹽、蘋果酸鹽、羥基順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、菸鹼酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、對苯二甲酸鹽、丙炔酸鹽、丙酸鹽、苯丙酸鹽、癸二酸鹽、辛二酸鹽、對溴苯磺酸鹽、氯苯磺酸鹽、乙基磺酸鹽、2-羥乙基磺酸鹽、甲基磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、萘-1,5-磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽及酒石酸鹽。

術語「醫藥學上可接受之鹽」亦指具有酸性官能基，諸如羧酸官能基之本揭示案之組合物與鹼之鹽。合適鹼包括但不限於鹼金屬如鈉、鉀及鋰之氫氧化物；鹼土金屬如鈣及鎂之氫氧化物；其他金屬之氫氧化物，諸如鋁及鋅；氨及有機胺，諸如未取代或羥基取代之單烷基、二烷基或三烷基胺、二環己胺；三丁胺；吡啶；N-甲基胺、N-乙基胺；二乙胺；三乙胺；單-、雙-或三-(2-OH-低碳烷基胺)，諸如單-、雙-或三-(2-羥乙基)胺、2-羥基-三級丁胺或三-(羥甲基)甲胺、N,N-二低碳烷基-N-(羥基-低碳烷基)-胺，諸如N,N-二甲基-N-(2-羥乙基)胺或三-(2-羥乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；及胺基酸，諸如精胺酸、離胺酸及其類似物。

在實施例中，本文所述之組合物呈醫藥學上可接受之鹽之形式。使用方法

在一態樣中，提供一種治療正在進行或已經進行癌症療法、或正在進行或已經進行骨髓移植、及/或已經急性暴露於骨髓抑制劑量之輻射(例如急性輻射症候群之造血症候群(H-ARS))，伴有或不伴有其他損傷，諸如燒傷、創傷、感染、出血或鈍器外傷(例如輻射復合傷(RCI))之患者或個體的方法；該方法包括向該患者投與治療有效量之本發明之融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物。在實施例中，患者藉由調節造血前驅細胞之無性擴增、存活、分化及活化狀態來治療。在實施例中，患者藉由調節骨髓單核細胞譜系、藉由促進巨核細胞及紅血球前驅細胞之增殖來治療。在實施例中，患者藉由調節造血前驅細胞、藉由刺激嗜中性球、巨噬細胞及/或樹突狀細胞之存活、增殖及活化來治療。在實施例中，患者在骨髓移植後藉由調節造血前驅細胞、藉由刺激嗜中性球、巨噬細胞及/或樹突狀細胞之存活、增殖及活化來治療。

在一態樣中，提供一種治療方法，其包括向患者投與治療有效量之本發明之融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物或使細胞與有效量之本文所述之醫藥組合物接觸且投與治療有效量之該等細胞，其中該治療：加速誘導化學療法後嗜中性球恢復及/或降低感染發生率；將造血前驅細胞動員至周邊血液中以供藉由白細胞去除術來收集及以供移植；加速自體或同種異體骨髓或周邊血液前驅細胞移植後之骨髓重建；治療自體或同種異體骨髓移植後延遲之嗜中性球恢復或移植失敗；及/或治療急性輻射症候群之造血系統症候群(H-ARS)；及/或治療輻射復合傷(RCI)。

在一態樣中，提供一種用於治療病毒感染之方法，其包括：向有需要之患者投與有效量之包含本發明之融合或嵌合蛋白之組合物或包含其之醫藥組合物。

在實施例中，病毒感染為視情況選自A型、B型、C型及D型流行性感冒病毒感染之流行性感冒感染。

在實施例中，病毒感染為病毒出血熱，該病毒性出血熱由視情況選自以下之一組病毒引起：沙粒病毒(Arenavirus)、黃病毒(Flavivirus)、絲狀病毒(Filovirus)、漢坦病毒(Hantavirus)、奈洛病毒(Nairovirus)、菲努病毒(Phenuvirus)。

在實施例中，肺部感染為由鼠疫耶氏桿菌( Yersinia pestis)感染引起之肺鼠疫。

在實施例中，病毒感染為冠狀病毒感染。在實施例中，冠狀病毒為β冠狀病毒，該β冠狀病毒視情況選自嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)、SARS-CoV、中東呼吸道症候群-冠狀病毒(MERS-CoV)、HCoV-HKU1及HCoV-OC43。在實施例中，冠狀病毒α冠狀病毒，該α冠狀病毒為視情況選自HCoV-NL63及HCoV-229E。

冠狀病毒為冠狀病毒科( Coronaviridae)之一員，包括最近才被發現會侵入人類之β冠狀病毒及α冠狀病毒呼吸道病原體。冠狀病毒科包括β冠狀病毒，諸如嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)、SARS-CoV、中東呼吸道症候群-冠狀病毒(MERS-CoV)、HCoV-HKU1及HCoV-OC43。α冠狀病毒包括例如HCoV-NL63及HCoV-229E。

冠狀病毒經由「棘狀」表面糖蛋白侵入細胞，該糖蛋白負責血管收縮素轉化酶2 (ACE2)之病毒識別，ACE2係哺乳動物宿主上促進病毒進入宿主細胞中之一種跨膜受體。Zhou等人, A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 2020.。新型冠狀病毒感染2019 (COVID-19)由SARS-CoV-2引起。

SARS-CoV-2係一種被認為起源於蝙蝠之新型病毒。COVID-19導致嚴重呼吸窘迫，且此RNA病毒株係最近爆發之原因，已宣布其對公共衛生及全球緊急情況構成重大威脅。對SARS-CoV-2完整基因體之系統發育分析表明，該病毒與一組SARS樣冠狀病毒(β冠狀病毒屬(genus Betacoronavirus)、沙貝病毒亞屬(subgenus Sarbecovirus))之相關性最為密切(核苷酸相似性為89.1%)。Wu等人, A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature, 2020年2月3日。

SARS-CoV-2係一種有包膜之單股RNA病毒，其編碼「棘狀」蛋白，亦稱為S蛋白，該蛋白係一種介導與細胞表面受體結合之表面糖蛋白；完整膜蛋白；包膜蛋白及核衣殼蛋白。S蛋白包含S1次單元及S2次單元，係一種三聚體I類融合蛋白，呈融合前構形存在，經歷結構重排以使病毒膜與宿主細胞膜融合。參見例如Li, F. Structure, Function, and Evolution of Coronavirus Spike Proteins . Annu. Rev. Virol.3: 237 -261 (2016 )，其以引用之方式整體併入本文中。已發現呈融合前構形之SARS-CoV-2棘狀蛋白之結構。參見Daniel等人, Cryo-EM structure of the SARS-CoV-2 spike in the prefusion conformation. Science, 2020年2月19日，其以引用之方式整體併入本文中。

對SARS-CoV-2完整基因體(GenBank寄存編號: MN908947)之系統發育分析表明，該病毒與一組SARS樣冠狀病毒(β冠狀病毒屬、沙貝病毒亞屬)之相關性最為密切(核苷酸相似性為89.1%)。Wu等人, A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature, 2020年2月3日，其以引用之方式整體併入本文中。

SARS-CoV-2具有棘狀表面糖蛋白、膜糖蛋白M、包膜蛋白E及核衣殼磷蛋白N。SARS-CoV-2冠狀病毒之完整基因體(29903個核苷酸，單股RNA)在NCBI資料庫中描述為GenBank參考序列: MN908947。冠狀病毒蛋白可選自：冠狀病毒棘狀蛋白(GenBank參考序列: QHD43416)、冠狀病毒膜糖蛋白M (GenBank參考序列: QHD43419)、冠狀病毒包膜蛋白E (GenBank參考序列: QHD43418)及冠狀病毒核衣殼磷蛋白E (GenBank參考序列: QHD43423)。

在實施例中，該方法預防或減輕患者中急性呼吸窘迫症候群(ARDS)之發展。

在實施例中，冠狀病毒為SARS-CoV-2。在實施例中，患者罹患COVID-19。在實施例中，患者罹患以下中之一或多者：發熱、咳嗽、呼吸短促、腹瀉、上呼吸道症狀、下呼吸道症狀、肺炎及急性呼吸道症候群。

在實施例中，患者缺氧。在實施例中，患者罹患呼吸窘迫。在實施例中，該方法改善患者中之氧合作用。在實施例中，該方法預防或減輕患者中自呼吸窘迫至細胞介素不平衡之轉變。在實施例中，該方法逆轉或預防細胞介素風暴。在實施例中，該方法逆轉或預防肺中或全身細胞介素風暴。在實施例中，細胞介素風暴係選自以下中之一或多者：全身性發炎反應症候群、細胞介素釋放症候群、巨噬細胞活化症候群及吞噬血球性淋巴組織細胞增生症。在實施例中，該方法逆轉或預防一或多種發炎性細胞介素之過度產生。在實施例中，發炎性細胞介素為以下中之一或多者：IL-6、IL-1、IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)、IL-2ra、IL-10、IL-18、TNFα、干擾素-γ、CXCL10及CCL7。

在實施例中，該方法引起患者中之病毒或細菌負荷量相對於治療前降低。

在實施例中，病毒感染係選自β冠狀病毒感染，該β冠狀病毒感染視情況選自嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)、嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(SARS-CoV-1)、中東呼吸道症候群-冠狀病毒(MERS-CoV)、HCoV-HKU1及HCoV-OC43感染。在實施例中，病毒感染係選自α冠狀病毒感染，該α冠狀病毒感染視情況選自HCoV-NL63及HCoV-229E感染。

在實施例中，β冠狀病毒感染為嚴重急性呼吸道症候群(SARS)。

在實施例中，β冠狀病毒感染為冠狀病毒疾病2019 (COVID-19)或與其相關。

在實施例中，病毒感染為視情況選自A型、B型、C型及D型流行性感冒病毒感染之流行性感冒感染。在實施例中，流行性感冒感染為大流行2009 A型流行性感冒(H1N1)或A型家禽流行性感冒(H5N1)。

在實施例中，病毒感染為病毒出血熱，該病毒性出血熱由視情況選自以下之一組病毒引起：沙粒病毒、黃病毒、絲狀病毒、漢坦病毒、奈洛病毒、菲努病毒。

在實施例中，肺部感染為由鼠疫耶氏桿菌感染引起之肺鼠疫。

在一態樣中，提供一種用於治療由暴露於化學戰劑引起之症狀的方法，其包括：向有需要之患者投與有效量之包含本發明之融合或嵌合蛋白之組合物或包含其之醫藥組合物。

在實施例中，化學戰劑為硫芥子氣(SM/HD)及/或氯氣。

在實施例中，患者中之暴露症狀的特徵為骨髓抑制。

在實施例中，所提供之方法引起症狀，包括由暴露於硫芥子氣(SM/HD)及/或氯氣引起之骨髓抑制的減輕及/或改善。

在一態樣中，提供一種治療及/或改善患者或個體中由神經退化性疾病引起之症狀的方法；該方法包括向該患者投與治療有效量之本發明之融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物。

在實施例中，神經退化性疾病係選自阿茲海默氏症、帕金森氏症、進行性核上性麻痺症(PSP)、多系統萎縮症(MSA)、路易體失智症、帕金森氏症失智症癲癇、中風、杭丁頓氏舞蹈症、大腦缺氧、多發性硬化症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)及周圍神經病變。

在實施例中，患者之神經退化性疾病之特徵在於氧化壓力、神經突完整性損失、細胞凋亡、神經元損失或/及發炎反應。在實施例中，神經退化性疾病與認知障礙相關。

在一態樣中，提供一種治療方法，其包括向神經退化性疾病患者投與治療有效量之本發明之融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物或使細胞與有效量之本文所述之醫藥組合物接觸且投與治療有效量之細胞，其中該治療：引發疾病緩解反應；暫時或永久減緩認知衰退；引起症狀改善；及/或減慢疾病發作及/或發展。

在一態樣中，所提供之本發明之融合或嵌合蛋白為促進重組GM-CSF穿過內皮毛細血管(血腦障壁，BBB)之遞送增強以用於中樞神經系統(CNS)療法的組合物。

在一態樣中，提供一種治療及/或改善患者或個體中由自體免疫疾病引起之症狀的方法；該方法包括向該患者投與治療有效量之本發明之融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物。

在一個實施例中，自體免疫疾病視情況選自克羅恩氏症及/或潰瘍性結腸炎(UC)及/或大腸急躁症(IBD)。

在一態樣中，提供一種治療方法，其包括向自體免疫疾病患者投與治療有效量之本發明之融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物或使細胞與有效量之本文所述之醫藥組合物接觸且投與治療有效量之該等細胞，其中該療法可恢復效應功能與調控性免疫功能之平衡。

在一態樣中，提供一種治療及/或改善症狀患者或個體中由凋亡蛋白酶募集域家族成員9 (CARD9)缺乏引起之症狀的方法。

在一態樣中，提供一種治療正在進行或已經進行真菌感染療法之患者或個體的方法；該方法包括向該患者投與治療有效量之本發明之融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物。

在實施例中，本發明組合物用作抗真菌療法之輔助療法。在實施例中，本發明組合物降低及/或減少各種組織中之真菌負荷量。

在一態樣中，提供一種治療正在進行或已經進行急性輻射症候群之造血症候群(H-ARS)之療法的患者或個體的方法。

在一態樣中，提供一種治療正在進行或已經進行輻射復合傷(RCI)之療法之患者或個體的方法。

在一態樣中，提供一種治療正在進行或已經進行神經切斷之療法之患者或個體的方法。

在一態樣中，提供一種治療正在進行或已經進行創傷性腦損傷之療法之患者或個體的方法。

在一態樣中，提供一種治療正在進行或已經進行敗血症之療法之患者或個體的方法。在實施例中，本發明組合物平衡及/或調控發炎及急性期反應，且降低發病率及死亡率。

在一態樣中，提供一種治療正在進行或已經進行多器官功能障礙症候群(MODS)治療之患者或個體的方法。

在一態樣中，提供一種治療正在進行或已經進行周邊動脈疾病/周圍動脈疾病治療之患者或個體的方法。

在一態樣中，提供一種治療正在進行或已經進行慢性傷口癒合治療之患者或個體的方法。

在一個實施例中，慢性傷口視情況選自麻風、腿部潰瘍及/或各種其他原因之無痛性傷口。

在實施例中，本發明組合物用作傷口癒合療法之輔助療法，包括但不限於高壓氧療法、超音波及電磁療法及/或負壓傷口療法。在實施例中，本發明組合物作用於各種表皮細胞且增強傷口癒合。在實施例中，本發明組合物促進組織重塑及再生。組合療法及其他治療藥物

在各種實施例中，本揭示案之醫藥組合物聯合額外藥劑共同投與。共同投與可為同時的或依次的。

在一個實施例中，本揭示案之額外治療劑及融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物同時投與至個體。如本文所用，術語「同時」係指額外治療劑及融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物以不超過約60分鐘，諸如不超過約30分鐘、不超過約20分鐘、不超過約10分鐘、不超過約5分鐘或不超過約1分鐘之時間間隔投與。額外治療劑及融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物之投與可藉由同時投與單一調配物(例如，包含額外治療劑及融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物之調配物)或分開之調配物(例如，包括額外治療劑之第一種調配物及包括融合或嵌合蛋白之第二種調配物)來進行。

共同投藥不需要治療劑同時投與，若其投與時間使得額外治療劑及融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物之藥理學活性在時間上重疊，則發揮組合治療作用。例如，額外治療劑及靶向部分、融合或嵌合蛋白、或其醫藥組合物、組合物可依次投與。如本文所用之術語「依次」意謂以超過約60分鐘之時間間隔投與額外治療劑及融合或嵌合蛋白。例如，額外治療劑及融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物之依次投藥之間的時間間隔可超過約60分鐘、超過約2小時、超過約5小時、超過約10分鐘小時、超過約1天、超過約2天、超過約3天、超過約1週，間隔超過約2週，或間隔超過約1個月。最佳投與時間將視新陳代謝、排泄之速率及/或投與之額外治療劑及融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物之藥效學活性而定。可首先投與額外治療劑或融合或嵌合蛋白組合物或其醫藥組合物。

共同投藥亦不需要藉由相同投藥路徑將治療劑投與至個體。相反，各治療劑可藉由任何合適路徑投與，例如非經腸或不非經腸。

在實施例中，本文所述之融合或嵌合蛋白或其醫藥組合物在與另一種治療劑共同投與時協同作用。在此類實施例中，靶向部分、本發明之組合物及額外治療劑可以低於當在單一療法之情況下使用藥劑時所採用之劑量的劑量投與。

在實施例中，額外治療劑為抗病毒藥物。

在實施例中，額外治療劑係選自包括抗病毒藥之藥物，諸如瑞德西韋(remdesivir)、法匹拉韋(favipiravir)、奧司他韋(oseltamivir)、巴洛沙韋(baloxavir)、加利地韋(galidesivir)、安普那韋(amprenavir)、替拉那韋(tipranavir)、沙奎那韋(saquinavir)、奈非那韋(nelfinavir)、茚地那韋(indinavir)、地瑞那韋(darunavir)、阿扎那韋(atazanavir)、依美汀(emetine)、洛匹那韋(lopinavir)及/或利托那韋(ritonavir)、阿比朵爾(arbidol)及洛匹那韋/利托那韋、及/或利巴韋林(ribavirin)、地瑞那韋及考比司他(cobicistat)、及/或IFN-β-1b、β-D-N4-羥基胞苷(NHC)，諸如EIDD-1931或EIDD-2801或EIDD-2801；免疫調節劑，諸如糖皮質激素、IFN-a 2a、IFN-a 2b、IFN-b、聚乙二醇化IFN-g、巴瑞克替尼(baricitinib)、西羅莫司(sirolimus)、克拉扎珠單抗(clazakizumab)、卡那單抗(canakinumab)、XPro1595、塔西單抗(tocilizumab)、沙利魯單抗(sarilumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、阿達木單抗(adalimumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、伊維菌素(ivermectin)、阿那白滯素(anakinra)、普澤力(prezcobix)、喜炎平(xiyanping)、芬戈莫德(fingolimod)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、樂利單抗(leronlimab)、沙利度胺(thalidomide)、MK-2206、尼古拉胺(nicolasamide)、硝唑胺(nitazoxamide)、氯喹(chloroquine)或羥氯喹；抗生素，諸如卡利黴素(carrimycin)、布拉菌素(brilacidin)、阿奇黴素(azithromycin)、纈胺黴素(valinomycin)、血管收縮素抑制劑/拮抗劑，如rhACE2/GSK2586881/APN01、氯沙坦(losartan)、依普沙坦(eprosartan)、替米沙坦(telmisartan)、纈沙坦(valsartan)；絲胺酸蛋白酶抑制劑，包括卡莫司他甲磺酸鹽(camostat mesylate)、萘莫司他(nafamostat)；其他藥物，諸如溴己新(bromhexine)、抑肽酶(aprotinin)、氯丙嗪(chlorpromazine)、唑他汀(zotatifin)、甲胺喋呤(methotrexate)、來那度胺(lenalidomide)、抗VEGF-A及靜脈內免疫球蛋白(IVIG)。例如，在實施例中，此等額外治療劑中之任一種均可用於SARS-CoV-2感染之情況。

在實施例中，額外治療劑係選自法匹拉韋、拉尼米韋辛酸鹽(laninamivir octanoate)、帕拉米韋(peramivir)、扎那米韋(zanamivir)、磷酸奧司他韋、巴洛沙韋酯(baloxavir marboxil)、烏非諾韋(umifenovir)、鹽酸金剛烷胺(urumin amantadine hydrochloride)、鹽酸金剛乙胺(rimantadine hydrochloride)、阿達普明(adapromine)、LASAG/BAY81-87981、塞來昔布(celecoxib)、依那西普(etanercept)、二甲雙胍(metformin)、吉西他濱(gemcitabine)、達匹韋林(dapivirine)、曲美替尼(trametinib)、賴諾普利(lisinopril)、萘普生(naproxen)、萘啶酸(nalidixic acid)、多佐胺(dorzolamide)、魯索利替尼(ruxolitinib)、米多君(midodrine)、地爾硫卓(diltiazem)；他汀類藥物，包括阿托伐他汀(atorvastatin)、硝唑尼特(nitazoxanide)；PPAR拮抗劑，包括吉非貝齊(gemfibrozil)。例如，在實施例中，此等額外治療劑中之任一種均可用於流行性感冒感染或其他病毒感染，諸如引起病毒性出血熱之彼等病毒感染。

在實施例中，額外治療劑為治療神經退行性疾病之藥物。

在實施例中，額外治療劑係選自左旋多巴(Levodopa)；膽鹼酯酶抑制劑，包括多奈哌齊(donepezil，ARICEPT)、卡巴拉汀(rivastigmine，EXELON)、加蘭他敏(Galantamine，RAZADYNE)；非典型抗精神病藥/第二代抗精神病藥，包括血清素-多巴胺拮抗劑(SDA)、多作用靶向受體之抗精神病藥(MARTA)及D ₂部分促效劑(例如ABILIFY/阿立哌唑(Aripiprazol))；NMDA受體拮抗劑美金剛(memantine)、利魯唑(riluzole，RILUTEK)、NSAID (非類固醇消炎劑)、咖啡因A2A受體拮抗劑及CERE-120 (腺相關病毒血清型2-神經秩蛋白)及深部腦刺激。例如，在實施例中，此等治療劑中之任一種均可用於神經退行性疾病之情況。

在實施例中，額外治療劑為抗真菌藥物。

在實施例中，額外治療劑係選自制黴菌素(nystatin)；兩性黴素B (amphotericin B)；特比萘芬(terbinafine)；醫療設備(armamentarium)；嘧啶類似物，諸如氟胞嘧啶(flucytosine)；三唑類，諸如氟康唑(fluconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、普拉米康唑(pramiconazole)、雷夫康唑(ravuconazole)、伏立康唑(voriconazole)及泊沙康唑(posaconazole)；咪唑類，諸如克黴唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、酮康唑(ketoconazole)及咪康唑(miconazole)；棘白菌素(echinocandin)，諸如卡泊芬淨(caspofungin)、米卡芬淨(micafungin)及阿尼芬淨(anidulafungin)。例如，在實施例中，此等治療劑中之任一種均可用於真菌感染之情況。

在實施例中，額外治療劑為治療自體免疫疾病之藥物。

在實施例中，額外治療劑係選自皮質類固醇，諸如普賴蘇(prednisone)及布地奈德(budesonide，Entocort EC)；口服5-胺基水楊酸鹽，諸如柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，AZULFIDINE)；消炎藥/發炎抑制劑/免疫抑制劑，諸如硫唑嘌呤(azathioprine，AZASAN、IMURAN)、巰基嘌呤(mercaptopurine，PURINETHOL、PURIXAN)、甲胺喋呤(TREXALL)及皮質類固醇及胺基水楊酸鹽，如美沙拉嗪(mesalamine，ASACOL HD、DELZICOL)、巴柳氮(balsalazide，COLAZAL)、託法替尼(tofacitinib，XELJANZ) 、環孢菌素(cyclosporine，GENGRAF、NEORAL、SANDIMMUNE)及奧沙拉嗪(olsalazine，DIPENTUM)；生物製劑，諸如那他珠單抗(natalizumab，TYSABRI)、維多珠單抗(vedolizumab，ENTYVIO)、英夫利昔單抗(infliximab，REMICADE)、阿達木單抗(HUMIRA)、聚乙二醇賽妥珠單抗(certolizumab pegol，CIMZIA)、優特克單抗(ustekinumab，STELARA)及戈利木單抗(golimumab，SIMPONI)；抗生素，諸如環丙沙星(ciprofloxacin，CIPRO)及甲硝唑(metronidazole，FLAGYL)；止瀉藥，諸如洛哌丁胺(loperamide，IMODIUM AD)；止痛藥；維生素及補充劑，包括鐵補充劑。例如，在實施例中，此等治療劑中之任一種均可用於自體免疫疾病之情況。

在實施例中，額外治療劑為加速或幫助傷口癒合或其他皮膚病之藥物。

在實施例中，額外治療劑係選自高壓氧療法、超音波及電磁療法及/或負壓傷口療法；皮質類固醇，諸如氫化可體松(hydrocortisone)、去炎松(triamcinolone，ACETONIDE、TRIANEX)、氯倍他索(clobetasol，TEMOVATE)；維生素D類似物，諸如鈣泊三烯及骨化三醇(VECTICAL)；類視色素，諸如他扎羅汀(tazarotene，TAZORAC、AVAGE)及阿維A酸(acitretin，SORIATANE)；鈣調神經磷酸酶抑制劑，諸如他克莫司(tacrolimus，PROTOPIC)及吡美莫司(pimecrolimus，ELIDEL)；水楊酸；煤焦油；戈克曼療法(goeckerman therapy)；蒽林(anthralin)；光療法，諸如自然光、UVB寬帶、UVB窄帶、補骨脂素加紫外線A (PUVA)及準分子雷射療法；免疫抑制劑，如類固醇、甲胺喋呤(TREXALL)、阿達木單抗(HUMIRA)、英夫利昔單抗(REMICADE)、環孢菌素；生物製劑依那西普(ENBREL)、英夫利昔單抗(REMICADE)、阿達木單抗(HUMIRA)、優特克單抗(STELARA)、蘇金單抗(secukinumab，COSENTYX)及依克珠單抗(ixekizumab，TALTZ)；硫鳥嘌呤(thioguanine，TABLOID)及羥基脲(DROXIA、HYDREA)、蘆薈提取霜、魚油補充劑、俄勒岡葡萄(Oregon grape)及精油。

在實施例中，額外治療劑為心血管疾病或周圍動脈疾病藥物。

在實施例中，額外治療劑係選自抗凝劑，諸如阿哌沙班(apixaban，ELIQUIS)、華法林(warfarin，COUMADIN)；抗血小板及雙重抗血小板療法(DAPT)，諸如阿司匹林(asprin)及P2Y12抑制劑，諸如氯吡格雷(clopidogrel，PLAVIX)、普拉格雷(Prasugrel，EFFIENT)、替格瑞洛(Ticagrelor，BRILINTA)、雙嘧達莫(Dipyridamole，PERSANTINE)；血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑，諸如苯那普利(benazepril，LOTENSIN)；血管收縮素II受體阻斷劑(或抑制劑)，諸如阿齊沙坦(Azilsartan，EBARBI)。

血管收縮素受體腦啡肽酶抑制劑(ARNI)，諸如沙庫巴曲(sacubitril)/纈沙坦(ENTRESTO)；β阻斷劑(β-腎上腺素激導性阻斷劑)，諸如醋丁洛爾(acebutolol，SECTRAL)；結合α及β-阻斷劑，諸如卡維地洛(carvedilol，COREG、COREG CR)；鈣通道阻斷劑，諸如胺氯地平(amlodipine，NORVASC)；降膽固醇藥物，諸如他汀類(立普妥(atorvastation)/LIPITOR)、菸鹼酸(nicotinic acid/niacin)；膽固醇吸收抑制劑(依澤替米貝(ezetimibe)/ZETIA)、組合他汀及膽固醇吸收抑制劑(依澤替米貝/辛伐他汀(Simvastatin) (Vytorin)；洋地黃(digitali) (地高辛(digoxin)/LANOXIN)；利尿劑，諸如乙醯唑胺(DIAMOX)；血管擴張劑，諸如硝酸異山梨酯(ISORDIL)及硝酸甘油(NITRO BID、NITRO STAT)。

在實施例中，額外治療劑為治療敗血症或敗血病之藥物。

在實施例中，額外治療劑係選自抗生素，諸如頭孢曲松(ceftriaxone，ROCEPHIN)、頭孢噻肟(cefotaxime，CLAFORAN)、胺芐西林(ampicillin)及舒巴坦(sulbactam，UNASYN)、頭孢他啶(ceftazidime，FORTAZ)及克林黴素(clindamycin，CLEOCIN)。

在實施例中，額外治療劑為治療腫瘤適應症之藥物。

在實施例中，額外治療劑係選自細胞毒性劑，包括毒素，諸如蓖麻毒素；化學治療劑，諸如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)；放射性同位素(例如碘-131、鐳-223)；靶向療法，諸如HERCEPTIN；及免疫腫瘤劑，諸如伊匹單抗(ipilimumab，YERVOY)及納武單抗(nivolumab，OPDIVO)。

在實施例中，額外療法為增加血小板細胞數或計數及/或治療免疫性血小板減少症(ITP)之藥物。

在實施例中，額外治療劑係選自類固醇，諸如普賴蘇、免疫球蛋白療法、羅米司亭(romiplostim，NPLATE)、艾曲比帕(eltrombipag，PROMACTA)及利妥昔單抗(rituximab，RITUXAN、TRUXIMA)。製備方法

在態樣中，提供一種製備融合或嵌合蛋白之方法，其包括：(a)獲得經編碼重組人類GM-CSF之核酸轉染的細胞或其提取物、連接子及人類化單域抗體，該重組人類GM-CSF包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少約97%一致性，且視情況在位置N37或與其對應之位置處具有取代或缺失的胺基酸序列；(b)使用一或多個HPLC管柱自轉染細胞中純化融合或嵌合蛋白；及(c)收集經純化之融合或嵌合蛋白，該經純化之嵌合蛋白基本上不含超甘露糖基化GM-CSF形式。

在實施例中，細胞為原核或真核宿主細胞，例如酵母、哺乳動物、細菌、昆蟲、藻類或植物細胞。

合適原核宿主細胞包括細菌細胞(例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌( Bacillus subtilis)、分枝桿菌屬( Mycobacterium spp.)、結核分枝桿菌( M. tuberculosis)或其他合適細菌細胞)及古細菌細胞(例如詹氏甲烷球菌( Methanococcus jannaschii)及海沼甲烷球菌( Methanococcus maripaludis))。

在實施例中，本揭示案之宿主細胞為真核宿主細胞。合適真核宿主細胞包括但不限於：真菌細胞、藻類細胞、昆蟲細胞、動物細胞(例如哺乳動物細胞、禽類細胞及魚類細胞)及植物細胞。

合適哺乳動物宿主細胞包括但不限於：中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK) 293細胞。

合適真菌宿主細胞包括但不限於：子囊菌門( Ascomycota)、擔子菌門( Basidiomycota)、半知菌門( Deuteromycota)、接合菌門( Zygomycota)、不完全真菌( Fungi imperfecti)。

合適酵母宿主細胞包括但不限於：念珠菌屬( Candida)、漢遜酵母屬( Hansenula)、酵母屬( Saccharomyces)、裂殖酵母屬( Schizosaccharomyces)、克魯維酵母屬( Kluyveromyces)及耶氏酵母屬( Yarrowia)。在實施例中，酵母細胞為多形漢遜酵母( Hansenula polymorpha)、釀酒酵母、卡爾斯伯格酵母( Saccaromyces carlsbergensis)、糖化酵母( Saccharomyces diastaticus)、諾爾本酵母( Saccharomyces norbensis)、克魯維酵母( Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母( Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母( Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌( Candida albicans)或解脂耶氏酵母( Yarrowia lipolytica)。

合適絲狀真菌宿主細胞包括例如真菌亞門( Eumycotina)及卵菌門( Oomycota)之任何絲狀形式。在一些實施例中，絲狀真菌宿主細胞可為以下物種之細胞：綿黴屬( Achlya)、枝頂孢黴屬( Acremonium)、麯黴屬( Aspergillus)、短梗黴屬( Aureobasidium)、烟管黴屬( Bjerkandera)、擬蠟菌屬( Ceriporiopsis)、頭孢菌屬( Cephalosporium)、金孢子菌屬( Chrysosporium)、旋孢腔菌屬( Cochliobolus)、棒囊殼屬( Corynascus)、栗疫屬( Cryphonectria)、隱球菌屬( Cryptococcus)、鬼傘屬( Coprinus)、革蓋菌屬( Coriolus)、色二孢屬( Diplodia)、伊多菌屬( Endothis)、鐮刀菌屬( Fusarium)、赤黴屬( Gibberella)、黏帚黴屬( Gliocladium)、腐質黴屬( Humicola)、肉座菌屬( Hypocrea)、毀絲黴屬( Myceliophthora) (例如，嗜熱毀絲黴( Myceliophthora thermophila))、毛黴屬( Mucor)、鏈孢黴屬( Neurospora)、青黴屬( Penicillium)、足孢屬( Podospora)、白腐菌屬( Phlebia)、梨囊鞭菌屬( Piromyces)、梨孢菌屬( Pyricularia)、根毛黴屬( Rhizomucor)、根黴屬( Rhizopus)、裂褶菌屬( Schizophyllum)、柱黴屬( Scytalidium)、孢子絲菌屬( Sporotrichum)、籃狀菌屬( Talaromyces)、熱子囊菌屬( Thermoascus)、梭孢殼屬( Thielavia)、栓菌屬( Tramates)、彎頸黴屬( Tolypocladium)、木黴屬( Trichoderma)、輪枝孢屬( Verticillium)、草菇屬( Volvariella)或有性型(teleomorph)或無性型(anamorph)及其同義詞或分類學等同物。在一個實施例中，絲狀真菌係選自構巢麯黴( A. nidulans)、米麯黴( A. nidulans)、醬油麯黴( A. sojae)及黑麯黴( A. niger)組之麯黴。在一個實施例中，絲狀真菌為黑麯黴( Aspergillus niger)。

在態樣中，提供一種製備包含融合或嵌合蛋白之組合物之方法，其包括：(a)獲得經編碼重組人類GM-CSF之核酸轉染的細胞或其提取物、連接子及VHH人類化奈米抗體，該重組人類GM-CSF包含與SEQ ID NO: 2具有至少約97%一致性，且視情況在位置N37或與其對應之位置處具有取代或缺失的胺基酸序列；(b)使用一或多個HPLC管柱自轉染細胞中純化融合或嵌合蛋白；及(c)收集經純化之融合或嵌合蛋白，該經純化之嵌合蛋白基本上不含超甘露糖基化GM-CSF形式。

在實施例中，細胞為酵母細胞，例如不限於釀酒酵母。

在實施例中，細胞為哺乳動物細胞，例如不限於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。

在實施例中，與使用非哺乳動物細胞之產生相比，在哺乳動物細胞中產生融合蛋白或嵌合蛋白增加本發明組合物之表現水準。

在實施例中，該方法進一步包括調配經純化之融合或嵌合蛋白用於注射，例如皮下或靜脈內註射。序列

SEQ ID NO: 1為野生型GM-CSF。一些實施例之取代或缺失之位點用下劃線及粗體表示： APARSPSPSTQPWEHVNAIQEA R RLLNLSRDTAAEM NET VEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE。

SEQ ID NO: 2為沙格司亭。一些實施例之取代或缺失之位點用下劃線及粗體表示： APARSPSPSTQPWEHVNAIQEA LRLLNLSRDTAAEM NET VEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE。

SEQ ID NO: 3為人類VH3-23序列。 MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK。

SEQ ID NO: 4為G4S連接子序列。 GGGG SGGGG SGGGG SGGGG S

SEQ ID NO: 5為G4A連接子序列。 GGGG AGGGG AGGGG AGGGG A

SEQ ID NO: 6為來自人類IgG1序列之鉸鏈序列之變異體： EPKSSDKTHTSPPSPAPE。

SEQ ID NO: 7為VHH-GMCSF構築體序列，其中抗HSA VHH位於N端，GM-CSF位於C端，且G4S作為連接子。 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGETLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCIASSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAAVLECRTVVRGYDYWGQGTQVTVSSGGGG SGGGG SGGGG SGGGG SAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEA L RLLNLSRDTAAEM Q ETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE。

SEQ ID NO: 8為VHH-GMCSF構築體序列，其中抗HSA VHH位於N端，GM-CSF位於C端，且鉸鏈作為連接子。 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGETLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCIASSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAAVLECRTVVRGYDYWGQGTQVTVSSEPKSSDKTHTSPPSPAPEAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEA L RLLNLSRDTAAEM Q ETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE。

SEQ ID NO: 9為VHH-GMCSF構築體序列，其中GM-CSF位於N端，抗HSA VHH位於C端，且鉸鏈作為連接子。 APARSPSPSTQPWEHVNAIQEA L RLLNLSRDTAAEM Q ETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQEEPKSSDKTHTSPPSPAPEEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGETLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCIASSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAAVLECRTVVRGYDYWGQGTQVTVSS。

SEQ ID NO: 10為VHH-GMCSF構築體序列，其中GM-CSF位於N端，抗HSA VHH位於C端，且G4S作為連接子。 APARSPSPSTQPWEHVNAIQEA L RLLNLSRDTAAEM Q ETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQEGGGG SGGGG SGGGG SGGGG SEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGETLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCIASSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAAVLECRTVVRGYDYWGQGTQVTVSS。

SEQ ID NO: 11為VHH-GMCSF構築體序列，其中抗HSA VHH位於N端，GM-CSF位於C端，且G4A作為連接子。 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGETLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCIASSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAAVLECRTVVRGYDYWGQGTQVTVSSGGGG AGGGG AGGGG AGGGG AAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEA L RLLNLSRDTAAEM Q ETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE。

SEQ ID NO: 12-14為CDR：CDR-H1: GETLDYYA (SEQ ID NO: 12)、CDR-H2: IASSGGST (SEQ ID NO: 13)及CDR-H3: AAAVLECRTVVRGYDY (SEQ ID NO: 14)。

SEQ ID NO: 15-17為CDR:CDR-H1: ETLDYYAIG (SEQ ID NO: 15)、CDR-H2: IASSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 16 )、CDR-H3: AVLECRTVVRGYDY(SEQ ID NO: 17)。定義

以下定義與本文揭示之發明結合使用。除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之技術人員通常所理解相同之含義。

當與有效治療冠狀病毒感染之藥劑結合使用時，「有效量」為有效治療或減輕冠狀病毒感染之量。

如本文所用，「一(a/an)」或「該」可表示一或多個。此外，當與參考數字指示結合使用時，術語「約」意謂參考數字指示加上或減去該參考數字指示之最多10%。例如，語言「約50」涵蓋45至55之範圍。

如本文所指，除非另有說明，所有組成百分比均按總組合物之重量計。如本文所用，詞語「包括」及其變異體意欲為非限制性的，使得對清單中之項目的敘述不排除亦可用於此技術之材料、組合物、裝置及方法的其他類似項目。類似地，術語「可」及「可能」及其變異體意欲為非限制性的，使得對實施例可或可能包含某些要素或特徵之敘述不排除不含彼等要素或特徵之本技術之其他實施例。

儘管開放式術語「包含」作為諸如包括、含有或具有之術語的同義詞在本文中用於描述及主張本發明，但本發明或其實施例可替代地使用替代術語來描述，諸如「由……組成」或「基本上由……組成」。

本發明藉由以下非限制性實例進一步說明。實例實例 1 ： VHH 分子之發現及人類化

將兩隻美洲駝用人類血清白蛋白(HSA)進行免疫接種以產生抗體。自細胞中分離出總RNA，接著進行cDNA合成。使用此cDNA，藉由PCR擴增駱駝科動物僅重鏈抗體(VHH)編碼序列之重鏈可變域。重鏈IgG (hcIgG)之結構展示於圖 1A中。

隨後，使用螢光活化細胞分選(FAC)與結合表現結合人類血清白蛋白(HSA)之VHH之酵母的螢光標記之HAS來分離結合HSA之個別VHH。圖 1B中展示用於篩選抗原結合支架文庫之酵母表面展示系統。此等VHH亦不在會阻斷FcRn結合之抗原決定基處結合白蛋白，此對於白蛋白之再循環及藥物動力學(pK)特性很重要。亦展示殖株不與膜製劑特異性結合。最後，在pH 5.5及7.4之間量測時，VHH殖株之結合特性未發生改變。在鑑定出結合HSA之VHH殖株後，藉由將CDR移植至具有適當回復突變及維持VHH穩定性所需之美洲駝特定序列之適當人類VHH中，將VHH人類化。

經鑑定及人類化之三種抗HAS VHH殖株用於實驗融合蛋白中，以證明VHH有助於血清半衰期之增加。製備蛋白質融合分子以研究三種VHH之潛在半衰期延長能力。用三種VHH中之各者構築Fab分子融合蛋白。在鼠類模型中證明由VHH促進之Fab片段之半衰期延長，展示出Fab之半衰期增加17倍。VHH59-1亦使其他抗HSA-VHH分子之半衰期增加超過一倍( 圖 1C)。實例 2 ： GMCSF-VHH 之鑑定與構築

最初製造且表徵四種變異體。VHH及GMCSF之取向圍繞兩個連接子序列變化：VHH-連接子-GMCSF或GMCSF-連接子-VHH。使用(GGGGS)x4或(GGGGA)x4連接子。第二個序列為人類IgG1之經修飾之鉸鏈序列，因為VHH直接連接至美洲駝IgG之鉸鏈區，亦即VHH及美洲駝天然抗體之恆定區之間的連接。選擇白蛋白前導序列而不是天然GMCSF前導序列，因為資料表明，當使用SignalP軟體分析評估時，前導序列之裂解為異質的，而白蛋白前導序列為均質裂解的。4種構築體經選殖且在CHO細胞中瞬時表現。分泌前導序列對於所有4種構築體而言均相同。序列示於圖 2中。實例 3 ： VHH-GA-GMCSF* 分子 之表徵

製造抗HSA-VHH59-1之多種變異體，以便吾人可根據經驗確定哪個變異體具有最佳的可開發性特徵，包括表現效價、藉由尺寸排阻層析法確定之聚集傾向、在融合或嵌合蛋白情況下VHH結合HSA之能力、融合之GMCSF之生物活性及GMCSF與其同源受體之結合特性。用於進行融合之*GM-CSF序列與之前用於表現CHO來源之GM-CSF變異體之GMCSF變異體序列相同。

表 1展示4種構築體在瞬時CHO中之表現效價水準。GM-CSF在N端之表現水準遠高於C端。由於VHH及Pro A樹脂之間的結合相對較弱，觀測到30%之產率損失。然而，與其他構築體相比，此GMCSF-鉸鏈-VHH似乎亦含有更多聚集體。表 1 ：

使用基於ForteBio之分析法評估融合或嵌合蛋白之VHH部分與人類血清白蛋白(HSA)結合之能力。有趣地，所有4種VHH-GMCSF融合或嵌合蛋白僅當其固定在感測器上且白蛋白處於溶液中時才能夠結合HSA，而當白蛋白在感測器上移動時則不能。

在生物活性分析法中在存在( 圖 3A)及不存在白蛋白( 圖 3B)之情況下使用TF-1細胞評估GM-CSF與同源受體融合或嵌合之能力。TF-1細胞響應融合或嵌合GM-CSF之暴露而增殖。將四種嵌合或融合蛋白與含有CHO來源之GMCSF*變異體(VHH-GMCSF)以及LEUKINE及市售GM-CSF之構築體進行比較。資料表明，VHH-G4Sx4-GM-CSF及GM-CSF-G4Sx4-VHH在基於TF-1細胞之分析法中具有生物活性，亦即當將GM-CSF融合或嵌合蛋白添加至培養基中時，細胞增殖。然而，注意到GMCSF-G4Sx4-VHH EC50 ( 表 2)比其他取向略低或活性小。含有CHO來源之GM-CSF*之融合或嵌合蛋白顯示出與LEUKINE相似之活性。因此，結果表明，在存在及缺乏白蛋白下融合或嵌合蛋白內GM-CSF相對於VHH之方向均對其在基於細胞之分析法中之生物活性有影響，在白蛋白存在下GM-CSF活性之抑制更大。不希望受理論束縛，與單獨GM-CSF或當GMCSF與VHH連接子之C端融合時相比，白蛋白在與VHH結合時可能導致GM-CSF (在N端)與其受體相互作用之能力發生改變，且因此無法誘導TF1細胞增殖( 圖 3A-B)。表 2：

	EC50
Leukine	0.003041
CHO-GMCSF*	0.00299
VHH-G4A-GMCSF*	0.009436
緩衝劑	0

實例 4 ：融合蛋白聚醣概況之質譜評估

質譜分析用於驗證N端裂解異質性以及分子之糖基化。質譜法鑑定出(G4Sx4)連接子添加木糖，已知木糖對人類具有免疫原性。參見 Arch Biochem Biophys. 426:266-278。質譜分析亦表明，GM-CSF、Ser7、Ser10及N27中之已知糖基化位點在所有VHH-G4Sx4-GM-CSF變異體中亦均糖基化，且類似於融合蛋白中使用之CHO產生之GMCSF*。分析六種不同的穩定株系，且結果列於下表。使用高解析度液相層析-質譜法(LC-MS) (Vanquish UPLC Q Exactive，Thermo)來確定完整分子量及聚醣概況( 圖 4A)。該圖展示藉由質譜法進行之聚醣分析，特別是製成VHH-G4A GMCSF*之6種穩定CHO殖株之聚醣佔有率。將100 μg樣品用去離子水稀釋至2 mg/mL，接著注入LC-MS。藉由BioPharmaFinder軟體對資料進行分析及解褶積，以獲得完整蛋白質分子量。藉由精確質量轉移及手動計算確定糖基化物種。基於所有已識別離子之強度，N/O糖基化佔有率係基於其電離效率相當之假設來估計( 表 3)。表 3 ：

分析之蛋白質樣品之樣品ID	O-糖基化佔有率(%)	N-糖基化佔有率(%)	評論
2E7	＞95%	52.2%	測得之分子量與理論值一致，說明表現正確。
6E7	＞90%	46.4%
6G7	＞90%	27.6%
9F6	＞80%	14.9%
10A8	＞80%	13.6%
10B7	＞80%	12.3%

在基於TF-1細胞之分析法中分析自此6種殖株產生之構築體。資料表明，儘管N27處之N連接之佔有在大約12%與大約53%之間變化，但活性未發生改變。因此，分子之活性未改變且似乎不受存在或缺乏聚醣之影響( 圖 4B及表 4)。表 4 ：實例 5 ： VHH-GMCSF 構築體之活體外結合表徵

為評估與白蛋白之結合，將VHH選殖至人類IgG1 Fc及鉸鏈上，以便於純化及分析。VHH-Fc構築體之結合親和力藉由BLI使用Octet 384 (Pall Life Sciences)確定。將VH-Fc構築體裝載至AHC感測器上，接著暴露於溶液中之單體標靶人類、小鼠或恆河猴白蛋白以確定締合及接著在緩衝溶液中之解離( 表 5 及圖 5A-C)。表 5 ：

	響應	KD (M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
人類白蛋白	0.1779	1.59E-07	8.22E+04	1.30E-02
小鼠白蛋白	0.5073	1.04E-08	3.73E+05	3.86E-03
恆河猴白蛋白	0.3404	6.62E-08	2.80E+05	1.85E-02

為確定解離常數，結合反應及解離在所述pH下進行。資料採集在30℃下進行。

該等圖在Y軸上顯示響應單位(晶片感測器上標靶與VHH-Fc之結合)，且在X軸上顯示時間( 圖 6A-D)。使用ForteBio資料分析軟體分析資料(時間及響應單位)。資料適合1:1結合模型以計算締合(Kon)及解離速率(Koff)，且使用比率kd/ka計算KD。表 6顯示各標靶及各pH之量測及計算參數。表 6 ：

	響應	KD (M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
pH 5.5	0.2589	1.23E-08	2.41E+05	2.95E-03
pH 6.0	0.2054	3.81E-09	3.42E+05	1.30E-03
pH 6.5	0.1571	8.20E-09	2.07E+05	1.70E-03
pH 7.0	0.1262	6.63E-09	1.78E+05	1.18E-03

實例 6 ： VHH-GA-GMCSF* 之活體內表徵

在猴研究中實驗測試VHH-GA-GMCSF*及兩種對照分子，亦即CHO產生之GMCSF*及Leukine (每個測試分子一隻猴)。在靜脈內注射20 ug VHH-GA-GM-CSF*或10 ug Leukine或CHO產生之GM-CSF*後，在一段時間內量測三種分子中各者之pK以及對循環造血細胞之生物學效應。由於VHH-GA-GM-CSF*之分子量大約為GM-CSF*之分子量的兩倍，因此以更高之濃度給藥，且因此藉由將量加倍，可投與等莫耳量之分子。在註射後12分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時及72小時抽血。資料( 圖 7A-C)顯示VHH-GA-GMCSF*構築體中之VHH促進pK自0.79小時顯著增加至＞10小時。Leukine及CHO產生之GMCSF*顯示相似之半衰期(t _1/2)，表明GMCSF之CHO產生與半衰期延長無關。給單隻恆河猴靜脈內註射10 ug/Kg所列形式之GMCSF。在註射後12分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時及72小時抽血。分析血液之細胞含量，且藉由構築體特異性專有ELISA測定構築體在血液中之濃度。VHH-GA-GMCSF*顯示t _1/2比Leukine或VHH-GA-GMCSF構築體中使用之GMCSF之CHO產生形式高約17倍。

使用帶有細胞特異性標記物之FACS分析，在自注射之猴子抽血後，對細胞計數及細胞類型進行完整造血評估( 圖 8A-E)。測定嗜中性球、單核球、嗜酸性球、總WBC及血小板之數量( 圖 8A-E)。CHO產生之GM-CSF*及LEUKINE均顯示注射後24小時嗜中性球、單核球及WBC之細胞計數急劇增加，至第4天返回基線。然而，融合或嵌合VHH-GA-GMCSF*之嗜中性球、單核球及WBC細胞計數在第2天達到峰值，且在第8-12天之間返回基線。注射融合或嵌合蛋白後嗜中性球及單核球及WBC之持續時間更長表明pk增強，如圖 7A-C中示出，此引起循環中血細胞增加之生物讀數持續時間更長。在註射融合或嵌合蛋白後觀測到嗜酸性球增加之類似延遲動力學。在註射嵌合或融合蛋白後，嗜中性球、單核球、嗜酸性球及WBC之數量亦有所增加。令人意外地，資料顯示與CHO產生之GM-CSF*及LEUKINE相比，注射融合或嵌合VHH-GA-GMCSF*後血小板數量顯著增加。 等同物

僅使用常規實驗，所屬領域技術人員將認識到或能夠確定本文具體描述之特定實施例之許多等同物。此類等同物旨在涵蓋在所附申請專利範圍之範疇內。 以引用之方式併入

本文所提及之所有專利及公開案均以引用之方式整體併入本文中。

如本文所用，所有標題僅用於組織而不意欲以任何方式限制本揭示案。任何個別部分之內容可同樣適用於所有部分。

無

圖 1A示出重鏈IgG (hcIgG)之結構示意圖。圖 1B顯示用於篩選抗原結合支架文庫之酵母表面展示系統。VHH經由其C端與Aga2p之N端融合。可藉由使用結合Myc標籤之螢光標記抗體偵測表面表現。圖 1C示出顯示鼠類模型中由VHH促進之Fab片段之半衰期延長的圖。圖中之各條線示出各種構築體。Bi-340-352係作為Fab片段之融合搭配物的抗白蛋白VHH半衰期延長分子。Bi-340-356係不相關之與相同Fab片段之VHH融合體，未顯示半衰期延長。圖 2示出在具有或不具有分泌前導序列之情況下在CHO細胞中選殖及瞬時表現之四種構築體。所有4種構築體之分泌前導序列均為相同的。該4種構築體包括：VHH-G4Sx4連接子-GMCSF、VHH-鉸鏈連接子-GMCSF、GMCSF-鉸鏈連接子-VHH及GM-CSF-G4Sx4連接子-VHH。該圖亦示出具有或不具有分泌前導序列之VHH-G4Ax4連接子-GM-CSF。圖 3A-B顯示針對各種融合或嵌合蛋白、CHO產生之GM-CSF (ATUM CHO N37Q)及LEUKINE/QCRS-GMCSF (顯示為個別圖形線)，使用及不使用人類血清白蛋白(HSA)之TF-1分析之結果的圖。BDS LEUKINE/QCRS GMCSF係指野生型GM-CSF，SEQ ID NO: 2，序列內無T39A或N37Q胺基酸取代。CHO N37Q為VHH構築體中所用之CHO產生之GMCSF變異體。H-G-GS-H為GMCSF-G4Sx4-VHH且H-H-GS-G為VHH G4Sx4-GMCSF分子。在向該細胞分析添加40 ug/ml (血液中之生理濃度) HSA或不添加HAS下重複基於TF1細胞之分析。圖 4A示出用於驗證VHH-G4Sx4-GMCSF變異體(VHH-G4Sx4-GMCSF*)之N端裂解異質性以及糖基化的示例光譜圖。高解析度液相層析-質譜法(LC-MS) (Vanquish UPLC Q Exactive，Thermo)用於確定完整分子量及聚醣概況。該圖展示藉由質譜法進行之聚醣分析，特別是製成VHH-G4A GMCSF*之6種穩定CHO殖株之聚醣佔有率。將100 μg樣品用去離子水稀釋至2 mg/mL，接著注入LC-MS。藉由BioPharmaFinder軟體對資料進行分析及解褶積，以獲得完整蛋白質分子量。質譜分析亦顯示GMCSF中已知之糖基化位點：Ser7 Ser10且N27在所有VHH-G4Sx4-GMCSF變異體中亦糖基化，且類似於融合蛋白中使用之CHO產生之GMCSF*。圖 4B顯示描繪TF-1分析結果之圖。在基於TF-1細胞之分析中分析自六個穩定之CHO殖株產生之VHH-G4A GMCSF*。圖 5A-C顯示說明VHH與包括人類、鼠類及恆河猴之三種白蛋白物種結合之表面電漿子共振(SPR)評估的圖。為評估結合，將VHH選殖至人類IgG1 Fc及鉸鏈上，以便於純化及分析。VHH-Fc構築體之結合親和力藉由BLI使用Octet 384 (Pall Life Sciences)確定。將VHH-Fc構築體裝載至AHC感測器上，接著暴露於溶液中之單體標靶人類、小鼠或恆河猴白蛋白，以確定締合及解離。在pH評估之情況下，結合反應及解離緩衝液處於所描述之pH值。資料採集在30℃下進行。圖 6A-D顯示說明在30℃下在各種pH下VHH與人類白蛋白結合之表面電漿子共振(SPR)評估的圖。圖在Y軸上顯示響應單位(晶片感測器上靶標與VHH-Fc之結合)且在X軸上顯示時間。資料(時間及響應單位)使用ForteBio資料分析軟體進行分析。圖 7A-C顯示說明融合或嵌合蛋白VHH-GA-GMCSF*與CHO產生之GM-CSF及LEUKINE相比在靜脈內註射10 ug/Kg之GMCSF之所列形式之後的半衰期(t _1/2)或藥物動力學的圖。給單個恆河猴靜脈內註射10 ug/Kg GMCSF之所列形式。在註射後12分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時及72小時抽血，且分析細胞含量，且藉由構築體特異性ELISA確定血液中之構築體濃度。VHH-GA-GMCSF*顯示t _1/2比Leukine或VHH-GA-GMCSF構築體中使用之GMCSF之CHO產生形式大約17倍。CHO對照為在CHO細胞中製得之VHH構築體中使用的GMCSF變異體(GMCSF R23L及N37Q)以維持相似糖基化模式。酵母對照為LEUKINE。圖 8A-E顯示與CHO及LEUKINE (酵母生長之GM-CSF)相比，靜脈內(IV)注射融合或嵌合蛋白構築體後確定之嗜中性球、單核球、嗜酸性球、總WBC及血小板之數量的圖。CHO對照為在CHO細胞中製得之VHH構築體中使用的GMCSF變異體(GMCSF R23L及N37Q)以維持相似糖基化模式。

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Claims

一種包含融合或嵌合蛋白之組合物，該融合或嵌合蛋白包含重組人類顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白、連接子及人類化單域抗體。
如請求項1之組合物，其中該重組人類GM-CSF蛋白包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少約97%一致性之胺基酸序列。
如請求項2之組合物，其中該重組人類GM-CSF蛋白包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少約97%一致性且在位置N37或與其對應之位置處具有取代或缺失的胺基酸序列。
如請求項3之組合物，其中在位置N37或與其對應之位置處的胺基酸為極性且電荷中性之親水性胺基酸。
如請求項4之組合物，其中該極性且電荷中性之親水性胺基酸係選自麩醯胺酸(Q)、絲胺酸(S)及蘇胺酸(T)。
如請求項5之組合物，其中該極性且電荷中性之親水性胺基酸係選自麩醯胺酸(Q)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、脯胺酸(P)及半胱胺酸(C)。
如請求項6之組合物，其中該極性且電荷中性之親水性胺基酸為麩醯胺酸(Q)。
如請求項1之組合物，其中該人類化單域抗體為重鏈抗體之可變片段(VHH)。
如請求項8之組合物，其中該VHH對人類血清白蛋白具有特異性。
如請求項8或9之組合物，其中該VHH包含與SEQ ID NO: 3具有至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%一致性之胺基酸序列及/或包含三個選自以下之CDR：(i) SEQ ID NO: 12-14或其變異體或(ii) SEQ ID NO: 15-17或其變異體。
如請求項8至10中任一項之組合物，其中該VHH相對於非人類化VHH進一步包含構架區內之取代或缺失。
如請求項1至11中任一項之組合物，其中該重組人類GM-CSF經由連接子連接至該單域抗體。
如請求項12之組合物，其中該連接子為可撓性連接子。
如請求項13之組合物，其中該可撓性連接子實質上包含甘胺酸及絲胺酸殘基。
如請求項13或14之組合物，其中該可撓性連接子包含至少約20個、或至少約30個、或至少約40個、或至少約50個、或至少約60個胺基酸殘基。
如請求項13至15中任一項之組合物，其中該可撓性連接子包含(Gly ₄Ser) _n，其中n為約1至約12。
如請求項12之組合物，其中該連接子為鉸鏈-CH2-CH3 Fc域。
如請求項17之組合物，其中該鉸鏈-CH2-CH3 Fc域源自人類IgG。
如請求項18之組合物，其中該鉸鏈-CH2-CH3 Fc域源自人類IgG1、IgG2或IgG4。
如請求項12之組合物，其中該連接子包含選自SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 6具有至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%一致性之胺基酸序列或具有約5個、或約4個、或約3個、或約2個、或約1個取代或缺失之SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。
如請求項20之組合物，其中該連接子包含與SEQ ID NO: 6具有至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%一致性之胺基酸序列。
如請求項1至21中任一項之組合物，其中該VHH域位於該融合或嵌合蛋白之N端。
如請求項1至21中任一項之組合物，其中該GM-CSF位於該融合或嵌合蛋白之N端。
如請求項1至23中任一項之組合物，其中該融合或嵌合蛋白包含選自SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID. NO: 11之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11具有至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%一致性之胺基酸序列。
如請求項1至24中任一項之組合物，其中該組合物結合及/或活化顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子受體(GM-CSF-R-α或CSF2R)。
如請求項25之組合物，其中該GM-CSF-R-α在細胞表面上表現。
如請求項26之組合物，其中該細胞為造血前驅細胞。
如請求項27之組合物，其中該造血前驅細胞為免疫細胞。
如請求項27之組合物，其中該造血前驅細胞經輻照。
如請求項1至29中任一項之組合物，其中該組合物結合人類、小鼠及恆河猴血清白蛋白。
如請求項30之組合物，其中該組合物結合人類血清白蛋白(HSA)。
如請求項31之組合物，其中該HSA存在於人類血漿中。
如請求項32之組合物，其中該組合物實質上不與HSA競爭結合新生兒Fc受體(FcRn)。
如前述請求項中任一項之組合物，其中該融合或嵌合蛋白為可溶的。
如前述請求項中任一項之組合物，其中融合或嵌合蛋白展示出與沙格司亭(sargramostim)實質上類似之功能。
如前述請求項中任一項之組合物，其中該重組人類GM-CSF包含複數種分子形式。
如請求項36之組合物，其中該等分子形式係選自非糖基化、O-糖基化、N-糖基化及N+O糖基化形式。
如前述請求項中任一項之組合物，其中該重組人類GM-CSF實質上不含超甘露糖基化形式。
一種核酸分子，其編碼如前述請求項中任一項之融合或嵌合蛋白或其片段。
如請求項39之核酸，其中該核酸分子具有密碼子最佳化序列或其組分。
一種人類宿主細胞，其表現如請求項39或40之核酸分子。
如請求項41之宿主細胞，其中該宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
一種非人類宿主細胞，其表現如請求項39或40之核酸分子。
如請求項43之非人類宿主細胞，其中該宿主細胞為酵母細胞。
如請求項44之非人類宿主細胞，其中該酵母細胞為非甲基營養型酵母細胞。
如請求項45之非人類宿主細胞，其中該宿主細胞為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至38中任一項之組合物及醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。
一種治療正在進行或已經進行癌症療法、或正在進行或已經進行骨髓移植、或已經急性暴露於骨髓抑制劑量之輻射(例如H-ARS)、及/或具有輻射復合傷(RCI)之患者或個體的方法；該方法包括向該患者投與治療有效量之如請求項47之醫藥組合物。
如請求項48之方法，其中該患者藉由調節造血前驅細胞之無性擴增、存活、分化及活化狀態來治療。
如請求項48之方法，其中該患者藉由調節骨髓單核細胞譜系、藉由促進巨核細胞及紅血球前驅細胞之增殖來治療。
如請求項48之方法，其中該患者藉由調節造血前驅細胞、藉由刺激嗜中性球、巨噬細胞及/或樹突狀細胞之存活、增殖及活化來治療。
如請求項48之方法，其中該患者在骨髓移植後藉由調節造血前驅細胞、藉由刺激嗜中性球、巨噬細胞及/或樹突狀細胞之存活、增殖及活化來治療。
一種治療方法，其包括向患者投與治療有效量之如請求項47之醫藥組合物或使細胞與有效量之如請求項47之醫藥組合物接觸且投與治療有效量之該等細胞，其中該治療：加速誘導化學療法後嗜中性球恢復及/或降低感染發生率；將造血前驅細胞動員至周邊血液中以供藉由白細胞去除術來收集及以供移植；加速自體或同種異體骨髓或周邊血液前驅細胞移植後之骨髓重建；治療自體或同種異體骨髓移植後延遲之嗜中性球恢復或移植失敗；及/或治療造血系統急性輻射症候群(H-ARS)之造血症候群；治療輻射復合傷(RCI)；治療神經退化性疾病；治療神經切斷；治療創傷性腦損傷；治療肺部感染；治療自體免疫疾病，視情況克羅恩氏病(Crohn’s)或IBD；治療敗血症/敗血病；治療侵襲性真菌感染；治療多器官功能障礙症候群(MODS)；治療周邊動脈疾病/周圍動脈疾病/心血管疾病；治療腫瘤適應症；促進傷口癒合及/或治療皮膚病。
一種用於治療冠狀病毒感染之方法，其包括：向有需要之患者投與有效量之如請求項47之醫藥組合物。
如請求項54之方法，其中該冠狀病毒為β冠狀病毒，該β冠狀病毒視情況選自嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)、SARS-CoV、中東呼吸道症候群-冠狀病毒(MERS-CoV)、HCoV-HKU1及HCoV-OC43。
如請求項55之方法，其中該冠狀病毒為α冠狀病毒，該α冠狀病毒視情況選自HCoV-NL63及HCoV-229E。
如請求項56之方法，其中該冠狀病毒為SARS-CoV-2。
如請求項56之方法，其中該患者罹患COVID-19。
一種用於治療視情況選自A型、B型、C型及D型之流行性感冒病毒之感染的方法，其包括：向有需要之患者投與有效量之如請求項47之醫藥組合物。
一種治療病毒性出血熱之方法，該病毒性出血熱由視情況選自以下之一組病毒引起：沙粒病毒(Arenavirus)、黃病毒(Flavivirus)、絲狀病毒(Filovirus)、漢坦病毒(Hantavirus)、奈洛病毒(Nairovirus)、菲努病毒(Phenuviruses)，該方法包括：向有需要之患者投與有效量之如請求項47之醫藥組合物。
一種治療肺部感染之方法，其中該肺部感染為由鼠疫耶氏桿菌(Yersinia pestis)感染引起之肺鼠疫，該方法包括：向有需要之患者投與有效量之如請求項47之醫藥組合物。
如請求項54至61中任一項之方法，其中該患者罹患以下中之一或多者：發熱、咳嗽、呼吸短促、腹瀉、上呼吸道症狀、下呼吸道症狀、肺炎及急性呼吸道症候群。
如請求項54至62中任一項之方法，其中該患者缺氧。
如請求項54至63中任一項之方法，其中該患者罹患呼吸窘迫。
如請求項54至64中任一項之方法，其中該方法預防或減輕該患者中急性呼吸窘迫症候群(ARDS)之發展。
如請求項54至65中任一項之方法，其中該方法改善該患者中之氧合作用。
如請求項54至66中任一項之方法，其中該方法預防或減輕該患者中自呼吸窘迫至細胞介素不平衡之轉變。
如請求項54至67中任一項之方法，其中該方法逆轉或預防細胞介素風暴。
如請求項68之方法，其中該方法逆轉或預防肺中或全身細胞介素風暴。
如請求項68或69之方法，其中該細胞介素風暴係選自以下中之一或多者：全身性發炎反應症候群、細胞介素釋放症候群、巨噬細胞活化症候群及吞噬血球性淋巴組織細胞增生症。
如請求項70之方法，其中該方法逆轉或預防一或多種發炎性細胞介素之過度產生。
如請求項71之方法，其中該發炎性細胞介素為以下中之一或多者：IL-6、IL-1、IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)、IL-2ra、IL-10、IL-18、TNFα、干擾素-γ、CXCL10及CCL7。
如請求項54至72中任一項之方法，其中該方法引起該患者中之病毒或細菌負荷量相對於治療前降低。
一種治療及/或改善由暴露於化學戰劑引起之症狀的方法，其包括：向有需要之患者投與有效量之如請求項47之醫藥組合物。
如請求項74之方法，其中該化學戰劑為硫芥子氣(SM/HD)及/或氯氣。
如請求項74或75之方法，其中該患者中之暴露症狀的特徵為骨髓抑制。
如請求項74至76中任一項之方法，其中該組合物引起包括骨髓抑制之化學暴露症狀的改善。
一種治療及/或改善由神經退化性疾病引起之症狀的方法，其包括：向有需要之患者投與有效量之如請求項47之醫藥組合物。
如請求項78之方法，其中該神經退化性疾病係選自阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、進行性核上性麻痺症(PSP)、多系統萎縮症(MSA)、路易體失智症(Lewy body dementia)、帕金森氏症失智症癲癇、中風、杭丁頓氏舞蹈症(Huntington's Chorea)、大腦缺氧、多發性硬化症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)及周圍神經病變。
如請求項78或79之方法，其中該神經退化性疾病之特徵在於氧化壓力、神經突完整性損失、細胞凋亡、神經元損失或/及發炎反應。
如請求項78至80中任一項之方法，其中該神經退化性疾病與認知障礙相關。
如請求項78至81中任一項之方法，其中該組合物引發疾病緩解反應。
如請求項78至82中任一項之方法，其中該組合物引發暫時或永久減緩認知衰退。
如請求項78至83中任一項之方法，其中該組合物引起神經退化性疾病症狀之改善。
如請求項78至84中任一項之方法，其中該組合物減慢該神經退化性疾病之發作及/或發展。
一種治療自體免疫疾病之方法，其包括：向有需要之患者投與有效量之如請求項47之醫藥組合物，其中該自體免疫疾病視情況選自克羅恩氏症及/或潰瘍性結腸炎(UC)及/或大腸急躁症(IBD)。
如請求項86之方法，其中該組合物恢復效應功能與調控性免疫功能之平衡。
一種治療及/或改善由凋亡蛋白酶募集域家族成員9 (CARD9)缺乏引起之症狀的方法，其包括：向有需要之患者投與有效量之如請求項47之醫藥組合物。
如請求項88之方法，其中該方法治療侵襲性真菌感染。
如請求項89之方法，其中該侵襲性真菌感染係選自念珠菌病、白黴菌病、侵襲性麴菌病、芽生菌病、念珠菌病、球黴菌病、糞黴菌、孢耳黴菌、隱球菌腦膜炎、組織漿菌症。
如請求項90之方法，其中該念珠菌病為食道念珠菌病、口咽念珠菌病、侵襲性念珠菌病及/或念珠菌血症。
如請求項90之方法，其中該白黴菌病為皮膚白黴菌病。
如請求項88至92中任一項之方法，其中該組合物用作抗真菌療法之輔助療法。
如請求項88至93中任一項之方法，其中該組合物有助於降低及/或減少各種組織中之真菌負荷量。
一種治療及/或促進傷口癒合及/或皮膚病之方法，其包括：向有需要之患者投與有效量之如請求項47之醫藥組合物。
如請求項95之方法，其中該慢性傷口視情況選自麻風、腿部潰瘍及/或各種其他原因之無痛性傷口。
如請求項96之方法，其中該方法促進組織重塑及再生。
一種治療癌症之方法，其包括：向有需要之患者投與有效量之如請求項47之醫藥組合物。
如請求項98之方法，其中該組合物引起對針對腫瘤細胞之免疫反應之免疫調節或活化。
如請求項98或99之方法，其中該組合物增強或恢復一或多種選自由以下組成之群的細胞之活性或活化：T細胞、T輔助細胞、細胞毒性T細胞、樹突狀細胞、NK細胞、巨噬細胞、抗腫瘤巨噬細胞及B細胞。
如請求項98至100之方法，其中該組合物治療、改善及/或預防癌症生長、存活、轉移、上皮-間質轉變、免疫逃逸或復發。
一種治療敗血症或敗血病之方法，其包括向有需要之患者投與有效量之如請求項47之醫藥組合物。
如請求項98至101之方法，其中該組合物平衡及/或調控發炎及急性期反應，且降低發病率及死亡率。
一種治療免疫血小板減少症(ITP)或低血小板計數之方法，其包括向有需要之患者投與有效量之如請求項47之醫藥組合物。
如請求項103之方法，其中該組合物加強或增強血小板細胞計數及/或逆轉血小板減少症。
如請求項1至38中任一項之組合物，其中該組合物促進重組GM-CSF穿過內皮毛細血管(血腦障壁，BBB)之遞送以用於中樞神經系統(CNS)療法。
如請求項1至38中任一項之組合物，其中該融合或嵌合蛋白藉由轉染哺乳動物細胞、視情況CHO細胞來產生，其中該融合或嵌合蛋白與沙格司亭相比顯示出延長之半衰期。
如請求項1至38中任一項之組合物，其中該融合或嵌合蛋白與沙格司亭相比展示出增強之藥物動力學。
如請求項1至38中任一項之組合物，其中該融合或嵌合蛋白展示出與沙格司亭實質上類似之功能。
如請求項1至38中任一項之組合物，其中該融合或嵌合蛋白顯著增加嗜中性球、單核球、嗜酸性球、總WBC及血小板之水準、細胞計數及/或量。
如請求項1至38中任一項之組合物，其中該融合或嵌合蛋白顯著增加血小板之水準、細胞計數及/或量。
如請求項1至38中任一項之組合物，其中該融合或嵌合蛋白藉由轉染哺乳動物細胞、視情況CHO細胞來產生，其中該嵌合蛋白與沙格司亭相比顯示出改善之藥效學。
如請求項1至38中任一項之組合物，其中該融合或嵌合蛋白藉由轉染哺乳動物細胞、視情況CHO細胞來產生，其中該融合或嵌合蛋白與沙格司亭相比顯示出類似之功能以及改善之藥物動力學及藥效學。