CN1105779C - 一种从生物原料中制备因子ix的方法 - Google Patents

一种从生物原料中制备因子ix的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1105779C
CN1105779C CN96193308A CN96193308A CN1105779C CN 1105779 C CN1105779 C CN 1105779C CN 96193308 A CN96193308 A CN 96193308A CN 96193308 A CN96193308 A CN 96193308A CN 1105779 C CN1105779 C CN 1105779C
Authority
CN
China
Prior art keywords
factors
factor
chromatography
inactivation
blood plasma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN96193308A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1181782A (zh
Inventor
D·乔思克
L·霍菲尔
F·莫尔费尔德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Octapharma AG
Original Assignee
Octapharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Octapharma AG filed Critical Octapharma AG
Publication of CN1181782A publication Critical patent/CN1181782A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1105779C publication Critical patent/CN1105779C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Abstract

本发明提供了一种通过层析从生物原料中制备因子IX的方法，其特征在于在亲和层析分离之前先用终浓度为1.5-2.3mol/l的硫酸铵处理所述原料。本发明的方法克服了现有技术在制备因子IX时，制剂中蛋白酶成分被浓缩、凝血的危险性增加等缺陷。

Description

一种从生物原料中制备因子IX的方法
技术领域
本发明涉及一种通过层析从生物原料中制备因子IX的方法，以及可从根据本发明的方法得到的因子IX。
背景技术
例如，从血浆中制备因子IX时，低温沉淀物是首先被分离的。冷冻的柠檬酸盐血浆被解冻，其中主要的因子VIII和纤维蛋白原可通过离心被分离出来。这样得到的冷冻处理后(cryopoor)的血浆包含了一些依赖于维生素K的凝固因子，它们的活性在0.01IU/mg蛋白的数量级。
就已知的现有技术来说，维生素K依赖性因子可通过阳离子交换剂吸附而被结合，如DEAE-Sephadex，且对白蛋白的回收无不利影响。然而，由于DEAE-Sephadex的流动特性差，在批量操作时这一步必需是固相提取。经DEAE-Sephadex洗脱后的级分即作为纯化因子IX的初始材料。然而，血浆中的蛋白酶在级分中也被浓缩，它们对蛋白质的水解作用可导致因子IX这一目材料的损失，并增加了制剂中凝血的危险性。
发明内容
本发明的目的是提供一种方法，使该过程既减少了上述的危险性，又不增加蛋白酶抑制剂。令人惊异的是，通过使用权利要求特征的方法，实现了这一目标。这包括用蛋白质沉淀剂处理含因子IX的生物原料。其指的候选生物材料是血浆或经冷冻沉淀除去了因子VIII和纤维蛋白原的血浆(即冷冻处理后的血浆)。
具体地，蛋白质沉淀剂的浓度为1.5～2.3mol/l，优选浓度可为1.75～1.9mol/l。该值与含因子IX的生物材料中存在的蛋白质沉淀剂浓度有关。
蛋白质沉淀剂，可特别考虑硫酸铵。
据发明所述的方法，蛋白水解活性至少被降低了一个数量级。另外，象因子VII和因子II等干扰组分也可通过实际层析纯化因子IX前的蛋白质沉淀步骤而除去。蛋白质C和S也被剔除。至于因子VII，几乎可全部除去。因子II相当完全地被去除(70到90％)，蛋白质C和S被除去约50％。
在用蛋白质沉淀剂处理过的级分上清中，因子IX的活性一般在20到30IU/ml，相当于比活1到5IU/mg。
按照本发明的沉淀步骤，优选使用硫酸铵，沉淀步骤之后即是对因子IX浓集的级分进行层析分离。这利用了高盐浓度下蛋白质有不同程度疏水性相互作用的特点。根据本发明，因子IX优选在相对高盐浓度存在下被结合，该高盐浓度来源于蛋白质沉淀，被加到了可用于疏水相互作用层析的层析材料中。该步同时降低了由蛋白质沉淀处理所导致的高盐浓度。尤其是，当层析材料已被结合在亲水通性臂(触角)基质材料上时，即可使用该层析材料。接着与这些间隔壁共价结合的是相应的配基，特别是疏水配基，例如丙基，丁基，和苯基基团。
将蛋白质沉淀处理后的级分上清液上适当的层析材料。并任意洗涤。结合在层析柱上的因子IX以及因子X可用较低浓度的含蛋白质沉淀剂的缓冲液洗脱，其中，洗脱液离子强度的减少视所用的溶液浓度而定。含有因子IX的级分从含有疏水互作层析材料上被洗脱和收集，并被用于以后适当方法的脱盐步骤。比如，脱盐步骤可用超滤和/或透滤。
进一步地将因子IX分离，如从所伴随因子X中，可以本发明的优选实施方案进行，即用肝素修饰基质的亲和层析进行分离。当包含了上述因子的溶液离子强度相对较低时，这些因子被吸附到层析材料上。如果有干扰因子X存在，因子X可用浓度为150-300mmol/l的氯化钠溶液洗脱。在这种条件下，因子IX仍将结合在肝素处理的亲和层析基质上。将水溶液中的离子强度提高到约二倍，因子IX便开始从亲和基质上被分离。
病毒的灭活可以用化学和/或物理方法。物理方法的灭活基本上包括了每个级分经60到65℃下5至30小时的热处理。这样的热处理尤其可在肝素亲和层析之后进行。化学方法的病毒灭活包括的方法如一种用非离子表面活性剂及二烷基或三烷基磷酸酯对含因子IX的级分的处理，尤其是，吐温和三正丁基磷酸酯(TNBP)的结合使用。病毒灭活的方法在EP0131740或Horowitz等人发表在血液，79(1992)826上的文章已有描述。
病毒灭活方法可以联合使用，如WO94/17834中所描述的方法。优选的方法是，疏水性层析之后进行超滤或透滤，之后再进行化学灭活。
按照本发明的应用办法，从血浆中获取高纯度的因子IX的产率可增加到为血浆的20到30％。
附图示本发明的方法，连续的纯化步骤以流程图形式表示。流程图中的箭头指的是被分离的物品和残留下的，即存在于上清液和洗脱液中的物质。
具体实施方式
下面的实施例将用于阐明本发明。
冷冻的含柠檬酸盐的血浆被解冻至0到3℃，搅拌。离心分离因子VIII和纤维蛋白原。所获的冷冻处理后血浆级分含有维生素K依赖性凝固因子。其比活约0.01IU/mg。之后的收集步骤包括了固相提取或用DEAE-Sephadex离子交换层析。从而分离了IgG和白蛋白。维生素K依赖性凝固因子所表现的活性为10-50IU/ml，以因子IX为参照，这一结果相当于浓缩了3500倍。
在实际的纯化之后进行捕获。向从捕获步骤得到的级分中加入硫酸铵，并使最后浓度达到约为1.9mol/l，这时，蛋白质C和S被除去约50％，因子II被除去70-90％，因子VII几乎全部被除去。经硫酸铵沉淀处理后的上清液被用于疏水互作层析，这种层析的基质是经过了适当修饰后的具“触角”的凝胶。使用的硫酸铵浓度约为1.75mol/l。所用的缓冲液也含有磷酸根离子。疏水互作层析使残留的因子VII和因子IX吸附在材料上，因子X被吸附70到80％。因子IX/因子X混合物的洗脱用硫酸铵溶液进行，其中，硫酸铵溶液的浓度为1.2-1.4mol/l。洗脱液中不含因子VII，也基本上无蛋白水解活性。在因子IX和因子X混合物中，因子IX的比活为5-15IU/mg蛋白。
存在于洗脱液中的硫酸铵可通过超滤和透滤除去。用去污剂灭活病毒可用约1％吐温80/0.3％TNBP进行。
分离了去污剂后，所获的分离液被用于肝素亲合层析。在低渗透势下，因子X和IX被吸附到肝素凝胶上。用0.25mol/l Nacl缓冲液可将因子X洗脱。将Nacl的浓度增加至0.45mol/l时，因子IX也被洗脱。洗脱物中存在的因子IX约为30～50IU/ml，其比活大于100。
所获含因子IX的提取物被脱盐和冷冻干燥。

Claims (11)

1.一种通过层析从生物原料中制备因子IX的方法，其特征在于在亲和层析分离之前先用终浓度为1.5-2.3mol/l的硫酸铵处理所述原料。
2.权利要求1的方法，其中的生物材料是血浆或者是经冷冻沉淀分离并除去了因子VIII及纤维蛋白原的血浆。
3.权利要求1或2的方法，其中在蛋白质沉淀之后，除去硫酸铵并通过将因子IX吸附到能用于疏水相互作用层析的层析材料上而浓缩因子IX。
4.权利要求3的方法，其中所述含有被吸附的因子IX的层析材料被其离子强度可导致因子IX从所述疏水相互作用层析的材料中分离出来的水溶液处理。
5.权利要求4的方法，其中所说的来自疏水相互作用层析材料分离后得到的含因子IX的级分进入减少含因子IX的溶液的盐浓度的步骤。
6.权利要求5的方法，其中减少含因子IX的溶液的盐浓度的步骤是超滤/透滤。
7.权利要求5的方法，其后用肝素修饰的底物材料进行亲合层析。
8.权利要求1或2的方法，还包括病毒灭活步骤，其中的病毒灭活可用化学和/或物理学方式进行。
9.权利要求8的方法，其中所说的病毒物理灭活包括60-65℃下热处理5-30小时
10.权利要求8的方法，其中所述的病毒灭活步骤在肝素亲和层析之后进行。
11.权利要求8的方法，其中所说的病毒化学灭活包括了用非离子去污剂/二烷基化磷酸酯或三烷基化磷酸酯对含因子IX的样品进行处理。
CN96193308A 1995-02-25 1996-02-14 一种从生物原料中制备因子ix的方法 Expired - Fee Related CN1105779C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19506633A DE19506633A1 (de) 1995-02-25 1995-02-25 Verfahren zur Herstellung von Faktor IX aus biologischen Quellen
DE19506633.2 1995-02-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1181782A CN1181782A (zh) 1998-05-13
CN1105779C true CN1105779C (zh) 2003-04-16

Family

ID=7755037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN96193308A Expired - Fee Related CN1105779C (zh) 1995-02-25 1996-02-14 一种从生物原料中制备因子ix的方法

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5919909A (zh)
EP (1) EP0811058B1 (zh)
JP (1) JPH11500910A (zh)
KR (1) KR100436857B1 (zh)
CN (1) CN1105779C (zh)
AT (1) ATE194167T1 (zh)
AU (1) AU697217B2 (zh)
CA (1) CA2213577C (zh)
DE (2) DE19506633A1 (zh)
DK (1) DK0811058T3 (zh)
EA (1) EA000222B1 (zh)
ES (1) ES2147365T3 (zh)
FI (1) FI119377B (zh)
GR (1) GR3034035T3 (zh)
IL (1) IL117157A (zh)
MY (1) MY119366A (zh)
PT (1) PT811058E (zh)
UA (1) UA46005C2 (zh)
WO (1) WO1996027003A1 (zh)
ZA (1) ZA961450B (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19506633A1 (de) * 1995-02-25 1996-08-29 Octapharma Ag Verfahren zur Herstellung von Faktor IX aus biologischen Quellen
AT405608B (de) * 1997-04-08 1999-10-25 Immuno Ag Verfahren zur inaktivierung von pathogenen, insbesondere von viren, in einem biologischen material
WO2005033140A1 (ja) * 2003-09-30 2005-04-14 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute 高純度血液凝固ｉｘ因子調製物およびその精製方法
KR100567448B1 (ko) * 2003-11-05 2006-04-04 주식회사 인투젠 형질전환 동물의 유즙 전처리방법 및 이를 통한 인체단백질의 정제방법
AU2005228945B2 (en) 2004-03-19 2010-09-30 Baxter Healthcare S.A. Factor IXa for the treatment of bleeding disorders
US10434492B2 (en) * 2007-01-26 2019-10-08 Sigma-Aldrich Co. Llc Compositions and methods for solid phase extraction of lipids
US10928366B2 (en) * 2007-01-26 2021-02-23 Sigma-Aldrich Co. Llc Compositions and methods for combining protein precipitation and solid phase extraction
RU2731720C2 (ru) * 2010-03-30 2020-09-08 Октафарма Аг Способ очистки витамин к-зависимых белков, таких как коагуляционный фактор vii
CN104560925B (zh) * 2014-12-30 2017-11-03 山东泰邦生物制品有限公司 一种从人凝血因子ⅸ层析废液中激活制备人凝血酶的方法
CN107540743A (zh) * 2017-10-11 2018-01-05 南岳生物制药有限公司 一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法
CN111378029B (zh) * 2018-12-29 2023-05-05 四川远大蜀阳药业有限责任公司 一种人凝血因子ix的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0131740A2 (en) * 1983-07-14 1985-01-23 New York Blood Center, Inc. Undenatured virus-free biologically active protein derivatives
WO1992015324A1 (en) * 1991-03-01 1992-09-17 Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. Preparation of factor ix

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3473407D1 (en) * 1983-05-02 1988-09-22 Immuno Ag Method of inactivating pathogens
DE3877529T2 (de) * 1987-10-23 1996-11-07 Centre Regional De Transfusion Herstellung von hoch-gereingtem menschlichen Faktor IX sowie anderem Plasmaproteinkonzentrat und dessen therapeutische Verwendung.
AT402261B (de) * 1991-01-25 1997-03-25 Immuno Ag Komplex enthaltend den gerinnungsfaktor ix
CA2155337A1 (en) 1993-02-09 1994-08-18 Monika Stadler Method for inactivating viruses devoid of lipid envelopes
DE19506633A1 (de) * 1995-02-25 1996-08-29 Octapharma Ag Verfahren zur Herstellung von Faktor IX aus biologischen Quellen

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0131740A2 (en) * 1983-07-14 1985-01-23 New York Blood Center, Inc. Undenatured virus-free biologically active protein derivatives
WO1992015324A1 (en) * 1991-03-01 1992-09-17 Rhone-Poulenc Rorer International (Holdings) Inc. Preparation of factor ix

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
生物化学教程 1992-01-01 沈仁权，顾其敏，高等教育出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
UA46005C2 (uk) 2002-05-15
CN1181782A (zh) 1998-05-13
EP0811058A1 (en) 1997-12-10
AU697217B2 (en) 1998-10-01
AU4876196A (en) 1996-09-18
EP0811058B1 (en) 2000-06-28
DE69609054T2 (de) 2001-03-08
DK0811058T3 (da) 2000-10-16
WO1996027003A1 (en) 1996-09-06
CA2213577A1 (en) 1996-09-06
GR3034035T3 (en) 2000-11-30
KR100436857B1 (ko) 2004-09-21
IL117157A (en) 1999-12-22
FI973469A (fi) 1997-08-22
CA2213577C (en) 2005-01-04
JPH11500910A (ja) 1999-01-26
PT811058E (pt) 2000-10-31
ES2147365T3 (es) 2000-09-01
IL117157A0 (en) 1996-06-18
EA199700196A1 (ru) 1998-02-26
ATE194167T1 (de) 2000-07-15
KR19980702453A (ko) 1998-07-15
DE19506633A1 (de) 1996-08-29
ZA961450B (en) 1996-08-27
US5919909A (en) 1999-07-06
DE69609054D1 (de) 2000-08-03
FI973469A0 (fi) 1997-08-22
FI119377B (fi) 2008-10-31
MY119366A (en) 2005-05-31
EA000222B1 (ru) 1998-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3094167B2 (ja) 免疫血清グロブリンの精製方法
US4272523A (en) Fractionating citrate-stabilized plasma
CA2192683C (en) Filtration
CN1105779C (zh) 一种从生物原料中制备因子ix的方法
JP3771935B2 (ja) 水溶性血漿タンパク質の純化方法
CA2024667C (en) Process for preparing a concentrate of blood coagulation factor viii-von willebrand factor complex from total plasma
CZ287186B6 (en) Process for preparing concentrate free of aggregation of immunoglobulins G
JPS61275210A (ja) ウイルス及び発熱原不活性化剤を用いる固相に吸着させた生物医学的生成物及び製薬生成物の処理法
RU2008134479A (ru) Очистка и применение фактора, способствующего заживлению ран
US5252217A (en) Blood coagulation factor XI concentrate having high specific activity, suitable for therapeutic use, and process for preparing same
EP0860444A1 (en) Method for removing viruses from a protein solution
US4814277A (en) Method of inactivating reproductive filterable pathogens
CN1214042C (zh) 静脉内免疫血清球蛋白及其产物的生产方法
UA44261C2 (uk) Спосіб одержання вітамін к-залежних протеїнів за допомогою методів мембранної хроматографії
EP0650364B1 (en) Purification of factor ix
JP2001519790A (ja) 生物学的材料中の病原体とりわけ特定のウイルスの不活化法
RU2082412C1 (ru) Способ выделения с4 компонента комплемента человека
RU2353386C1 (ru) Способ получения концентрата ix фактора свертывания крови человека
RU2086650C1 (ru) Способ получения комплекса ингибиторов лейкоцитарных протеиназ
RU2026553C1 (ru) Способ выделения c3 - компонента комплемента человека
JPH07268003A (ja) アンチトロンビン−ｉｉｉの精製方法
LV10194B (en) Blood coagulation factor xi concentrate having high specific activity, suitable for therapeutic use, and process for preparing same

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1025023

Country of ref document: HK

C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20030416

Termination date: 20140214