NO874231L - Rensing av rekombinant tumornekrosefaktor. - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte til rensing av rekombinant tumornekrosefaktor fra kulturer av mikroorganismer transformert med vektorer som koder for produksjonen av tumornekrosefaktor. En sekvens av berøringstrinn inn-går i fremgangsmåten, slik at utløps-strømmen fra det første berøringstrinn kan bringes i kontakt direkte med det berøringsmateriale som benyttes i det andre trinn, og på samme måte, utløps-strømmen fra det andre beraringstrinn kan bringes i kontakt direkte med det berøringsmateriale som benyttes i det tredje berøringstrinn. I en foretrukket utførelsesform kan tumornekrosefaktor-holdig fermenteringsvæske i betydelig grad renses ved en enkelt passasje gjennom et flerkomponent-kromatografisystem, dvs. at de farste, andre og tredje berøringsmaterialer er hver pakket i en kolonnekonfigurasjon, idet TNF-holdig væske føres direkte gjennom kolonne-sekvensen. Behovet for mellomliggende isolering, konsentrering, rekondi-sjonering og lignende av de tumornekrosefaktor-holdige fraksjoner unngås derfor ved utførelse av oppfinnelsen.

Description

Oppfinnelsen angår isolering og rensing av tumornekrosefaktor (TNF) produsert ved genetisk modifiserte mikroorganismer.

Etter hvert som rekombinant-DNA-teknologi har utviklet seg

i de senere år, er den styrte produksjon ved mikroorganismer av en rekke nyttige polypeptider blitt mulig. Mange eukaryot-iske polypeptider som f.eks. menneskelig veksthormon, leuko-cytt-interferoner, menneskelig insulin og menneskelig pro-insulin er allerede blitt produsert ved mikroorganismer. Den fortsatte anvendelse av teknikker som allerede foreligger ventes å tillate fremstilling ved mikroorganismer i fremtiden av en rekke andre nyttige polypeptidprodukter. Et slikt nyttig polypeptidprodukt er human-tumornekrosefaktor.

Tumornekrosefaktor (TNF) er en antitumor-substans som finnes

i sera hos dyr som er blitt behandlet med mikrobielle produkter i to ordnede trinn (events). Det første trinn er et primingstrinn som bevirker aktivering og formering av makrofager og er forbundet med utvidelse av retikuloendotheliale elementer i leveren og milten. For dette primingstrinn er mycobakterier, såsom Bacillus Calmette Guerin (BCG), corynebakterier, såsom Corynebacterium parvum og zymosan (gjærcellevegger) virksomme. Det andre trinn er et frembringelsestrinn som er nødvendig

for forekomsten av TNF i blodet. Dette krever etterfølgende behandling av primede dyr med lipopolysakkarid (LPS - en viktig bestanddel av celleveggen hos gramnegative bakterier, også kjent som endotoksin eller bakterielt pyrogen). Ved bruk av disse prinsipper kan man oppnå sera med lignende antitumoregenskaper og cytotoksiske egenskaper fra mus, rotter og kaniner.

Den cellulære opprinnelse av TNF er makrofager (monocytter), således blir TNF også betegnet som et monokin. TNF bevirker blødende nekrose og iblant fullstendig regresjon av visse tumorer transplantert i mus, og viser cytotoksisk aktivitet overfor visse tumorcellelinjer, men ikke overfor normale celler.

Rekombinant-DNA-teknikker ved hvilke DNA som koder for pep-tider med TNF-aktivitet innføres i en celle for å uttrykke TNF eller TNF-analoger, anses å representere det beste håp

for rimelig produksjon av store mengder TNF. Ved transforma-sjon av egnede vertsorganismer med DNA som koder for TNF-aminosyresekvensen, kan genetisk modifiserte mikroorganismer anvendes til å produsere TNF i betydelige mengder. En hindring for anvendelse av rekombinant-DNA-teknologi for kommersiell fremstilling av TNF, er behovet for hurtig og effektivt å kunne utvinne TNF i biologisk aktiv form fra genetisk modifiserte mikroorganismer som produserer det ønskede TNF.

En hensikt med den foreliggende oppfinnelse er derfor å skaffe en fremgangsmåte for effektiv utvinning av biologisk aktivt TNF produsert ved genetisk modifiserte mikroorganismer.

Denne og andre hensikter ved den foreliggende oppfinnelse

vil fremgå ved gjennomgåelse av beskrivelsen og de tilhørende krav.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det utviklet

en fremgangsmåte til isolering og rensing av tumornekrosefaktor fremstilt ved genetisk konstruerte mikroorganismer. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er særlig nyttig for utvinning av TNF produsert ved rekombinante gjærstammer. Den fremgangsmåte som er utviklet omfatter bruken av tre separate, men koordinerte berøringstrinn som utføres i en spesiell rekke-følge, slik at utløpsstrømmen fra det første berøringstrinn kan anvendes direkte som matningsmateriale til det andre berør-ingstrinn, og utløpsstrømmen fra det andre berøringstrinn kan anvendes direkte som matningsmateriale for det tredje berør-ingstrinn.

Ved utførelse av den foreliggende oppfinnelse blir fremstilling av meget rent rekombinant TNF gjort mulig uten behovet for konsentrering og re-formulering av prøven under sekvensen av berøringstrinn. Som et resultat av den forenklede rense-prosess ifølge oppfinnelsen oppnås en rekke fordeler, f.eks. blir håndteringstapene for det ønskede rekombinante produkt bragt på et minimum, en mindre mengde reagenser er nødvendig for rensing av prøver, et redusert volum avfallsstrømmer genereres og nedbrytningen av prøven under rensingen bringes på et minimum på grunn av den reduserte mengde prøve-manipulering som er nødvendig for TNF-rensing.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der utviklet

en fremgangsmåte til isolering og rensing av tumornekrosefaktor (TNF) produsert ved genetisk modifiserte mikroorganismer, hvilken fremgangsmåte omfatter:

(a) å føre den oppbrutte, klarede fermenteringsvæske inneholdende TNF til et porøst glassmateriale med høyt overflateareal, (b) å vaske det porøse glassmateriale som har høyt overflateareal og er lastet i henhold til trinn (a) med en egnet buffer , (c) å eluere en første TNF-holdig fraksjon fra det porøse glassmateriale med høyt overflateareal vasket i henhold til trinn (b) med en oppløsning som omfatter 0,01-10 V/V % av et egnet elueringsmiddel, (d) å bringe den første TNF-holdige fraksjon som fås fra trinn (c) i berøring med en anionvekslerharpiks, (e) å eluere en andre TNF-holdig fraksjon fra den nevnte anionvekslerharpiks med en oppløsning omfattende salt i en buffer, idet saltkonsentrasjonen og pH-verdien av den nevnte oppløsning er tilstrekkelig til å bevirke eluering av den andre TNF-holdige fraksjon fra den nevnte anionvekslerharpiks, men utilstrekkelig til å hindre binding av TNF i den andre TNF-holdige fraksjon til det farge-affinitetsmateriale som anvendes i trinn (f), (f) å bringe den andre TNF-holdige fraksjon fra den nevnte anionvekslerharpiks i berøring med et immobilisert-farge affi-nitet smateriale, (g) å vaske det TNF-holdige immobilisert-farge affinitetsmateriale fremstilt i henhold til trinn (f) med en egnet buffer

inntil stort sett ikke noe materiale med en UV-absorbans på

ca. 280 nm elueres, og

(h) å eluere renset TNF fra det vaskede TNF-holdige immobilisert-f arge affinitetsmateriale med et elueringsmiddel som omfatter en tilstrekkelig konsentrasjon av salt i en buffer med en pH-verdi i området fra 6,5 inntil 10 for å bevirke desorpsjon av TNF fra det nevnte farge-affinitetsmateriale uten å bevirke nedbrytning av TNF..

Alle de ovenfor beskrevne manipulasjoner utføres typisk ved

ca. 4°C for å bringe på et minimum forekomsten av proteolytisk nedbrytning og for å bringe på et minimum termisk inaktivering av TNF. Det er funnet at de ovenfor beskrevne manipulasjoner kan utføres ved en rekke forskjellige temperaturer i området fra ca. 4 inntil 25°C.

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir hvert av de faste berøringsmaterialer som anvendes, dvs. det porøse glassmateriale med høyt overflateareal, anionvekslerharpiksen og det immobilisert-farge affinitetsmateriale inneholdt i en pakket kolonne-konfigurasjon. En slik konfigurasjon tillater de TNF-holdige oppløsninger og de ytterligere behandlingsoppløsninger som de faste berøringsmaterialer underkastes ganske enkelt å passere gjennom en pakket kolonne med det riktige, faste berøringsmateriale. Videre tillater driften ifølge oppfinnelsen i denne pakkede kolonneform den direkte passasje av utløpsstrømmen fra kolonnen pakket med porøst glassmateriale med høyt overflateareal til den med anionvekslerharpiks pakkede kolonne, samt den direkte passasje av ut-løpsstrømmen fra den med anionvekslerharpiks pakkede kolonne til den med immobilisert-farge affinitetsmateriale-pakkede kolonne. Således skaffer kolonnekonfigurasjonen en ualminnelig effektiv metode til utførelse av den foreliggende oppfinnelse.

Uttrykket "tumornekrosefaktor" slik det anvendes i den foreliggende beskrivelse, er ment å omfatte alle proteiner, både naturlig forekommende og syntetiske, som er i besittelse av de antitumoregenskaper som observeres for molekyler av natur lig forekommende tumornekrosef aktor o( (TNF (X, generelt betegnet ganske enkelt som "TNF" i den foreliggende beskrivelse), således anses det at TNF fra en rekke naturlige kilder samt analoger og derivater derav, ligger innenfor oppfinnelsens omfang.

Den foreliggende oppfinnelse angår isoleringen og rensingen -av tumornekrosefaktor (TNF) fremstilt ved en genetisk modifi-sert mikroorganisme. En hvilken som helst mikroorganisme som kan produsere heterologe proteinprodukter er nyttig for ut-førelse av den foreliggende oppfinnelse. For tiden foretrekkes gjærstammer på grunn av deres viste evne til å uttrykke heterologe proteiner på høye nivåer og i biologisk aktiv form. Særlig foretrukket er stammer av Pichia pastoris og Saccharomyces cerevisiae på grunn av deres etablerte evne til å produsere høye nivåer av biologisk aktive rekombinante proteiner.

Produksjonen av TNF til svært høye nivåer i Pichia pastoris

er beskrevet av Sreekrishna, Fuke og Potenz i norsk søknad nr. 87 3927 som oppgis som referanse for nærmere detaljer med hensyn til rekombinant produksjon av TNF.

Det første trinn i renseprosessen ifølge oppfinnelsen er å føre oppbrutt, klaret fermenteringsvæske til et porøst glassmateriale med høyt overflateareal. Som angitt ovenfor vil i en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen dette porøse glassmateriale med høyt overflateareal anvendes i en kolonne-konfigurasjon. For letthets skyld skal det porøse glassmateriale med høyt overflateareal som inneholdes i en kolonne, iblant betegnes som den "første kolonne", da dette er det materiale som benyttes i det første berøringstrinn i den inte-grerte multiple berøringsmetode for rensingen av TNF.

Det fyllkroppsmateriale (packing) som anvendes i denne første kolonne består av porøse granuler av høysilikaglass som er gjennomtrengt av innbyrdes forbundne porer av ensartet og nøye regulert størrelse. Porestørrelser i området 300-3000 Ångstrøm (uttrykt som midlere porediameter) er egnet til bruk i ut- førelse av oppfinnelsen, idet porestørrelser i området 500-1000 Ångstrøm foretrekkes. Foruten ensartet porestørrelse har fyllkroppsmaterialet som anvendes i den første kolonne den samme porestørrelse nær sin overflate som i sitt indre. Således er maskestørrelsen av fyllkroppsmaterialet som anvendes forholdsvis uvesentlig og kan variere mellom vide grenser. Fagfolk vil innse at større partikler vil typisk tillate hur-tigere strømning av materialet gjennom kolonnen, mens mindre partikler typisk tillater mer effektiv kolonnepakking (dvs. mindre tomrom). Overflatearealet av det første berøringsmate-riale kan variere mellom vide grenser og vil variere som en funksjon av den midlere porediameter av de partikler som anvendes. Typisk vil de materialer som anvendes i dette første berøringstrinn ha et overflateareal i området fra ca. 10 inntil 100 m 2/g, idet overflatearealer i området fra ca. 20 inn-

2

til 50 m /g foretrekkes.

Før den første kolonne lastes med den TNF-holdige væske, blir kolonnen typisk ekvilibrert ved anvendelse av teknikker som er kjent for fagfolk. En hvilken som helst buffer som kan opprettholde en pH-verdi i området 6,5-7,5 eller deromkring,

er egnet til utførelse av slik ekvilibrering. Buffere med en konsentrasjon i området fra ca. 0,002 inntil 0,1 M er egnede. Høyere bufferkonsentrasjoner bør unngås, da de er tilbøyelige til å undertrykke eluering av forurensende proteiner. I praksis foretrekkes det å anvende fosfatbuffere,

idet en eksemplarisk buffer omfatter 0,01 M kaliumfosfat med en pH-verdi på ca. 7,5.

Mengden av TNF-holdig fermenteringsvæske som bringes i berør-ing med det porøse glassmateriale med høyt overflateareal kan variere innen vide grenser. Det riktige lastenivå vil variere som en funksjon av TNF-konsentrasjonen i væsken, sub-stratet som de TNF-produserende mikroorganismer ble dyrket på, konsentrasjonen av andre proteiner og oppløselige ikke-proteinholdige komponenter, beskaffenheten av det spesielle porøse glassmateriale med høyt overflateareal som benyttes og lignende. Idet det innses at lastenivåene kan variere innen vide grenser som et resultat av de ovenfor angitte faktorer, er de verdier som er vist i tabell I for hver av berørings-trinnene ifølge oppfinnelsen bare angitt for å gi retnings-linjer for fagfolk.

De anbefalte lastenivåer angitt i tabell I kan oppnås ved justering av enten mengden væske som bringes i berøring med et gitt berøringsmateriale ved en gitt tid eller"justering av mengden av berøringsmaterialet som benyttes for et gitt volum (og konsentrasjon) av væske. Da hver av berøringsmate-rialene som anvendes i de forskjellige trinn i TNF-renseprosessen generelt har forskjellige lastekapasiteter, er det iblant nødvendig å variere mengden berøringsmateriale som anvendes i hvert trinn i rensesekvensen.

Den TNF-holdige fermenteringsvæske som føres til det porøse glassmateriale med høyt overflateareal kan brytes opp og klares ved anvendelse av teknikker som er kjent av fagfolk, som f.eks. trykkoppbrytning, kraftig omrøring i nærvær av glassperler, enzymatisk digestion av cellevegger, f.eks. med Zymolyase, kjemisk oppbrytning, f.eks. med metylenklorid og lignende. Fortrinnsvis vil oppbrytning av cellene utføres ved en pH-verdi som er tilstrekkelig høy til å skaffe en etter-oppbrytnings pH-verdi i området 6-8 for å skaffe et medium i hvilket det ønskede TNF forblir i en stabil form.

Straks oppbrytningen er utført blir celleavfallet fjernet fra væsken som inneholder de oppbrutte celler ved anvendelse av teknikker som er kjent for fagfolk. Teknikker som kan anvendes til fremstilling av klaret, cellefri fermenteringsvæske omfatter f.eks. sentrifugering, mikrofiltrering og lignende.

Straks den oppbrutte, klarede fermenteringsvæske er blitt ført til det porøse glassmateriale med høyt overflateareal, blir glassmaterialet deretter vasket med minst tre volumer (volumer vaskeoppløshing pr. volum glassmateriale) av en egnet buffer for å fjerne de komponenter i væsken som ikke fester seg til det porøse glassmateriale med høyt overflateareal,

som anvendes i det første berøringstrinn. Inntil ti eller flere volumer buffer kan anvendes for slik vasking. Den øvre grense med hensyn til den riktige mengde vasking er mer en funksjon av hva som er bekvemt og praktiske hensyn såsom kost-naden av ytterligere buffer, den ytterligere tid som er nød-vendig for videre vasking, den økede mengde utløpsstrøm som skal avhendes, og lignende. Fagfolk kan lett bestemme beskaffenheten av egnede buffere som anvendes for et slikt formål. Typisk er der blitt anvendt en buffer som omfatter 0,01 M kaliumfosfat ved en pH-verdi på ca. 7,5 for dette vasketrinn, skjønt en hvilken som helst buffer som kan opprettholde en pH-verdi i området 6,5-7,5 eller deromkring, er egnet for vasketrinnet. Buffere med en konsentrasjon i området fra 0,002 inntil 0,1 M er egnet for formålet.

Straks det porøse glassmateriale med høyt overflateareal er blitt tilstrekkelig vasket, blir en TNF-holdig fraksjon eluert derfra med en oppløsning som omfatter 0,01-10 V/V % av et egnet elueringsmiddel som kan bevirke desorpsjon av TNF fra det porøse glassmateriale med høyt overflateareal, men som ikke i nevneverdig grad virker forstyrrende inn på bindingen av TNF til den anionvekslerharpiks som anvendes, i det andre berøringstrinn. Slike elueringsmidler er typisk forbindelser som meddeler en basisk pH-verdi til elueringsoppløsningen og/eller inneholder minst én hydroksylgruppe. Eksempler på elueringsmidler omfatter:

(a) forbindelser med formelen:

hvor n=0, 1 eller 2, hver R er hver for seg H eller metyl og X er hydroksyl eller R, med det forbehold at minst én X er hydroksyl,

(b) forbindelser med formelen:

hvor x=l, 2 eller 3, og hver R' er hver for seg en C^-Cg-alkyl- eller -cykloalkylradikal og den nevnte R' valgfritt inneholder én eller flere hydroksylsubstituenter, og (c) kombinasjoner av forbindelser som kan skaffe en buffret oppløsning med en pH-verdi i området 8-11, som f.eks. karbonater, fosfater, borater og lignende.

Eksempler på forbindelser som tilfredsstiller de ovenfor angitte formler omfatter etenglykol, glycerol, propenglykol, etylamin, propylamin, butylamin, trietylamin, etanolamin, trietanolamin og lignende, samt blandinger av to eller flere derav.

Ved utførelse i den foretrukne kolonnekonfigurasjonsmode blir utløpsstrømmen fra den første kolonne inneholdende porøst glass-fyllkroppsmateriale med høyt overflateareal, overvåket for nærværet av protein ved egnede metoder. Egnede metoder for et slikt formål kan lett bestemmes av fagfolk. For eksempel er overvåking av den ultrafiolette (UV) absorpsjon ved 280 nm bekvem. Straks slik overvåking viser at protein er i ferd med å elueres fra den første kolonne, blir utløpsstrømmen fra den første kolonne matet direkte inn i en andre kolonne som omfatter en anionvekslerharpiks. Slik innføring av utløps-strømmen fra den første kolonne fortsettes inntil overvåking av utløpsstrømmen fra den første kolonne viser at ikke noe mer protein elueres fra den første kolonne.

I henhold til denne foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen, blir den proteinholdige fraksjon fra den første kolonne ført direkte inn i den andre kolonne, hvilket bringer på et minimum mengden av prøvehåndtering som de TNF-holdige prøver underkastes og man unngår nødvendigheten av å utføre en eventuell modifikasjon av prøven før ytterligere rensing kan utføres.

De anionvekslerharpikser som er påtenkt for bruk i utførelse av oppfinnelsen er sterke anionvekslere som f.eks. kvaternære ammonium-anionvekslerharpikser. Slike harpikser kan fremstilles på en rekke forskjellige bærere, f.eks. silika, cellulose, polystyren og lignende.

Som fagfolk vil innse, blir anionvekslerharpiksen typisk ekvilibrert med egnet buffer før lasting med TNF-holdig fluid.

Det er funnet at buffer omfattende 0,02 M Tris-HCl, pH 8,3,

er passende og effektiv, skjønt en hvilken som helst buffer som kan opprettholde en pH-verdi i området fra ca. 7,8 inntil 10 er egnet. Buffere som anvendes har typisk en konsentrasjon i området 0,002-0,1 M.

Etter at den TNF-holdige utløpsstrøm fra det porøse glassmateriale med høy overflate er blitt bragt i berøring med anionvekslerharpiksen, men før eluering av TNF fra anionvekslerharpiksen, blir den TNF-lastede harpiks vasket med ytterligere volumer av den samme buffer som ble brukt til å ekvilibrere harpiksen før den ble lastet med TNF-holdig fluid. Omtrent 1-2 volumer eller mer av buffer (volumer av vaskebuffer pr. volum anionvekslerharpiks) anvendes. Den minste mengde som er nødvendig er den mengde som vil returnere pH-verdien av utløpsstrømmen fra anionvekslerharpiksen til tilnærmet lik pH-verdien av harpiksen før den TNF-holdige opp-løsning ble lastet på denne. Den øvre grense med hensyn til mengden buffer som anvendes for dette vaske-ekvilibrerings-trinn bestemmes stort sett av hva som er bekvemt. I en for tiden foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir anionvekslerharpiksen ekvilibrert til en pH-verdi på ca. 8,3 før den TNF-holdige fraksjon elueres derfra ved passasje deri-gjennom av ytterligere mengder 0,02 M Tris-HCl buffer, pH

8,3, skjønt en hvilken som helst buffer som kan opprettholde en pH-verdi i området 7,8-10 er egnet. Buffere som anvendes har typisk en konsentrasjon i området 0,002 til 0,1 M.

Ved utførelse i den foretrukne kolonnekonfigurasjon blir den andre kolonne som inneholder anionvekslerharpiksen lastet med TNF-holdig utløpsstrøm fra den første kolonne (som inneholder porøs glasspakking med høyt overflateareal) og deretter vasket. En TNF-holdig fraksjon blir deretter eluert fra den andre kolonne med en oppløsning omfattende minst ca. 0,2 M konsentrasjon av et oppløselig metallsalt i en egnet buffer. Egnede oppløselige salter omfatter salter av anionene: halogenider, fosfater, sulfater, acetater, nitrater og lignende. Natriumklorid foretrekkes for tiden fordi det er billig og lett tilgjengelig. Egnede buffere er de som kan opprettholde pH-verdien av elueringsoppløsningen i området fra ca. 7,8 inntil 10. Saltkonsentrasjoner i området fra ca. 0,1 inntil 0,5 M er egnet, idet de høyere konsentrasjoner generelt bevirker at TNF elueres lettere fra den andre kolonne. Generelt er det nødvendig med høyere saltkonsentrasjoner for eluering av TNF ved høyere pH-verdier, mens lavere saltkonsentrasjoner er passende for TNF-eluering ved lavere pH-verdier. I praksis foretrekkes det å anvende en oppløsning omfattende natriumklorid i 0,01 M Tris-HCl buffer, pH 8,3. Denne eluering kan utføres på en rekke forskjellige måter, som f.eks. ved anvendelse av en lineær gradient av lavt (f.eks. 0,1 M) til høyt (f.eks. 0,3 M) natriumkloridinnhold i elueringsmiddelet eller en trinnvis gradient fra intet natriumklorid til et høyt (f.eks. 0,2 M) natriumkloridinnhold i elueringsmiddelet.

Ved utførelse i den foretrukne kolonnekonfigurasjon kan utløps-strømmen fra den andre kolonne passende overvåkes for eluer-ingen av proteinholdig fluid ved passende metoder, som f.eks. overvåking av UV-absorbansen ved ca. 280 nm. Straks protein holdig fluid begynner å elueres fra den andre kolonne, kan denne utløpsstrøm føres direkte inn i en tredje kolonne omfattende en immobilisert-farge affinitetskromatografikolonne.

Ved direkte innføring av den proteinholdige utløpsstrøm fra den andre kolonne inn i den tredje kolonne, unngås nødvendig-heten av å utføre en eventuell modifikasjon av prøven såsom konsentrasjon, re-formulering etc.

Utrykket "immobilisert-farge affinitetskromatografikolonne", slik det anvendes i den foreliggende beskrivelse, betegner en variant av affinitetskromatografi hvor syntetiske triazin-farger benyttes istedenfor de naturlige substrater, kofaktorer eller effektorer som vanligvis anvendes som immobiliserte ligander. Fagfolk vil være oppmerksomme på at det finnes en rekke farge-ligander som er egnet til utførelse av den foreliggende oppfinnelse. Eksempler på ligander omfatter de røde, oransje, grønne og blå farger, hvis ligand-molekyldeler er vist nedenunder: Disse ligand-molekyldeler kan immobiliseres på en rekke forskjellige bærere, f.eks. silika, glass, cellulose, Sepharose, Sephadex og lignende. Farge-liganden Blå A er funnet å gi utmerkede resultater og er derfor den for tiden foretrukne ligand (på en fast bærer) som berøringsmateriale for det tredje berøringstrinn som anvendes i TNF-rensemetoden ifølge oppfinnelsen.

Fagfolk vil innse at det immobilisert-farge affinitetsmateriale som anvendes i utførelsen av oppfinnelsen generelt ekvilibreres med en egnet buffer før lasting av utløpsstrømmen fra anionevekslerharpiksen derpå. I praksis er det funnet'at ekvilibrering av immobilisert-farge affinitetsmaterialet med en buffer omfattende 0,02 M Tris-HCl, pH 8,3, er nyttig for dette formål, skjønt en hvilken som helst buffer som kan opprettholde en pH-verdi i området fra ca. 6,0 inntil 8,5 er egnet. Buffere som anvendes har typisk en konsentrasjon i området fra 0,002 til 0,1 M.

Ved utførelse i den foretrukne kolonnekonfigurasjonsmode blir stort sett alt det proteinholdige materiale som elueres fra den andre kolonne (inneholdende anionvekslerharpikspakking) lastet på den tredje kolonne, som er pakket med immobilisert-farge affinitetsmateriale. Den tredje kolonne blir deretter vasket med tilstrekkelige mengder av en egnet buffer inntil stort sett ikke noe materiale med en UV-absorbans i området ca. 280 nm elueres. Et buffersystem som er funnet nyttig for dette formål omfatter 0,02 M Tris-HCl, pH 8,3, skjønt fagfolk vil innse at andre buffer-systemer er egnet til vasking av den tredje kolonne før eluering av TNF derfra, som f.eks. buffere som kan opprettholde en pH-verdi i området fra ca. 6,0 inntil 8,5. Buffere som anvendes har typisk en konsentrasjon i området fra ca. 0,002 inntil 0,1 M.

Straks alt det 280 nm absorberende materiale er blitt vasket fra den lastede tredje kolonne, blir TNF-holdig fluid eluert fra kolonnen med et elueringsmiddel omfattende en egnet buffer som eventuelt har en høy saltkonsentrasjon. Eksempler på salter omfatter oppløselige salter av anionene: halogenider, fosfater, sulfater, acetater, nitrater, tiocyanater og lignende. Fagfolk kan lett bestemme egnede saltkonsentrasjoner som kan anvendes for slik eluering, avhengig av slike faktorer som størrelsen av kolonnen som anvendes, mengden av TNF adsorbert på kolonnen og lignende. Saltkonsentrasjoner i området fra ca. 0,3 inntil 1 M og høyere er egnet til eluering av TNF. Saltene som anvendes oppløses i en egnet buffer, slik at den resulterende oppløsning bevirker desorpsjon av TNF fra den tredje kolonne uten å bevirke nedbrytning av TNF. Således er buffere i pH-området 6,5-10 egnede. Ved den aller høyeste pH-verdi er lite, om overhodet noe, tilsatt salt nødvendig for å bevirke eluering av TNF. Eventuelt kan tilsatte reagenser som fremmer desorpsjon av TNF fra den tredje kolonne også innlemmes i elueringsoppløsningen, som f.eks. ikke-ion-iske vaskemidler. I praksis er det funnet at en eluerings-blanding omfattende ca. 1,0 M natriumklorid i en 0,02 M Tris-HCl buffer ved pH 8,3 er egnet.

Utløpsstrømmen fra den tredje kolonne overvåkes ved passende måter for identifisering av de proteinholdige fraksjoner som deretter kan slås sammen og underkastes ytterligere behandling for å fjerne uønskede salter derfra og ytterligere konsentrere den TNF-holdige fraksjon. Slike velkjente teknikker som dia-lyse, vakuumdialyse, ultrafiltrering, lyofilisering og lignende kan anvendes.

For en ytterligere forståelse av den foreliggende oppfinnelse og dens fordeler henvises det til de følgende ikke-begrensende eksempler.

EKSEMPEL I

Fremstilling av TNF- holdig væske

En stamme av Pichia pastoris inneholdende en integrert, på metanol reagerende TNF-kodende ekspresjonskassett og betegnet som GTS115/pTNF6-5 (tilgjengelig fra the Northern Regional Research Center ved De forente staters landbruksdepartement, Peoria, Illinois, med aksesjonsnummer NRRL Y-18116) ble dyrket på 20% w/v glycerol til et dyrkningsutbytte ved likevektstil-stand på 108 g/l tørrcellevekt. Etter en 30 min. hungers-periode ble 20 ml metanol satt til kulturen på 2000 ml. En øyeblikkelig reduksjon i både D.O. og pH ble observert. Ialt ble 275 ml (217 g) metanol satt til kulturen over en periode på 189 timer. Nitten metanoltilsetninger var nødvendige over dette tidsrom. Nesten all metanolen ble oksidert.

Produksjonen av TNF i GTSll5/pTNF6-5-celler ble hurtig indu-sert ved ombytting til metanol og syntes å nå metningsverdier på mer enn 100 x 10^ innen 48 timer. TNF-nivået fortsatte å være stabilt inntil slutten av forsøket som ble utført i ca. 189 timer.

EKSEMPEL II

Pichia-væske ved ca. 100 g/l ble fremstilt som beskrevet i eksempel I og frosset ved -20°C inntil bruk. Ca. 100 ml av opptint celle-væske ble justert på pH 8 med 0,1 N NaOH, oppbrutt ved agitasjon med glassperler i et blandeapparat med en vannkappe i 3-5 min. og klaret ved sentrifugering ved 30.000

x G i 15 min. Den ovenpåflytende væske ble direkte ført til i en kolonne inneholdende 60 ml glass med regulert porestørrelse (CPG; overflateareal =36,4 m 2/g, midlere porestørrelse = 654 Ångstrøm, porevolum = 0,91 ml/g). Hoveddelen av Pichia-proteinene lot seg eluere med ca. fem kolonnevolumer av 0,01 M kaliumfosfat (pH 7,5). TNF ble deretter eluert med 5% vandig trietanolamin. Idet proteinet på sin høyeste verdi kom ut av CPG-kolonnen, ble CPG-kolonnens utløp koblet til innløpet av en Accell QA anionvekslerkolonne inneholdende 60 ml harpiks (37-55 mikrometer partikler av ikke-sammenpressbart silika, 500 Ångstrøm porestørrelse med kvaternær metylamin ioneveksler bundet dertil). Deretter ble CPG-kolonnen koblet fra og TNF eluert fra ionevekslerkolonnen med en tilstrekkelig mengde 0,2 M NaCl i 0,02 M Tris-HCl (pH 8,3) til å eluere den TNF-holdige protein på sitt toppunkt.

Idet proteinet på sitt toppunkt kom ut fra anionvekslerkolonnen, ble utløpet av anionvekslerkolonnen koblet til inn-løpet av kolonnen med farge Blå A inneholdende 20 ml fyllkropp-materiale (Blå farge koblet til en tverrbundet 5% agarose-bærermatriks med en eterbinding til fargens triazinring), fulgt av vasking med ca. 4 kolonnevolumer av en buffer omfattende 0,02 M Tris-HCl (pH 8,3), dvs. inntil alt 280 nm-materialet var eluert, og til slutt eluering av det rensede TNF med en oppløsning omfattende 1,0 M NaCl i 0,02 M Tris-HCl (pH 8,3 ) .

Den spesifikke aktivitet (U/mg) av et representativt renset TNF oppnådd fra P. pastoris ble bestemt til 2,6 x 10 7 for

en frossen prøve og 3,0 x 10<7>for en frysetørket prøve.

Utbyttet av TNF var 78% basert på antall enheter TNF som opp-rinnelig ble lastet på den første kolonne. Renheten av TNF

som ble oppnådd som et resultat av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble bestemt til 98% ved Coomassie Brilliant Blue R-farget SDS-PAGE gel. Alle rensetrinnene ble fullført innen 24 timer.

Eksemplene er gitt bare for å belyse utførelsen av oppfinnelsen og skal ikke anses å begrense oppfinnelsens omfang på noen som helst måte. Rimelige variasjoner og modifikasjoner som ikke avviker fra oppfinnelsens ånd anses å ligge innenfor oppfinnelsen omfang.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte til rensing av rekombinant tumornekrosefaktor, TNF, fra klaret, oppbrutt fermenteringsvæske inneholdende denne, karakterisert ved at (a) den nevnte væske føres til et porøst glassmateriale som har et høyt overflateareal; (b) det nevnte glassmateriale med høyt overflateareal som er blitt lastet med den nevnte væske vaskes med en buffer; (c) en første TNF-holdig fraksjon elueres fra det nevnte porøse glassmateriale som har et høyt overflateareal med en oppløsning omfattende 0,01-10 V/V % av et elueringsmiddel som bevirker desorpsjon av TNF fra det nevnte porøse glassmateriale med høy overflate, men ikke i vesentlig grad virker inn på bindingen av TNF til den anionvekslerharpiks som anvendes i trinn (d); (d) den nevnte første TNF-holdige fraksjon som fås fra trinn (c) bringes i berøring med en anionvekslerharpiks; (e) en andre TNF-holdig fraksjon fra den nevnte anionvekslerharpiks elueres med en oppløsning omfattende salt i en buffer, idet saltkonsentrasjonen og pH-verdien av den nevnte oppløsning er tilstrekkelig til å bevirke eluering av TNF fra den nevnte anionvekslerharpiks, men utilstrekkelig til å hindre binding av TNF til det immobilisert-farge affinitetsmateriale som anvendes i trinn (f); (f) den nevnte andre TNF-holdige fraksjon fra den nevnte anionvekslerharpiks bringes i berøring med et immobilisert-farge affinitetsmateriale; (g) det nevnte immobilisert-farge affinitetsmateriale vaskes med en buffer inntil stort sett ikke noe materiale med en UV-absorbans på tilnærmet lik 280 nm elueres, og deretter (h) renset TNF elueres fra det nevnte immobilisert-farge affinitetsmateriale med et elueringsmiddel som omfatter en tilstrekkelig konsentrasjon av salt i en buffer med en pH-verdi i området 6,5-10 til å bevirke desorpsjon av TNF fra det nevnte immobilisert-farge affinitetsmateriale uten å bevirke nedbrytning av TNF.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den nevnte fermenteringsvæske er en gjær-fermenteringsvæske, særlig hvor den nevnte gjær-fermenteringsvæske er en væske inneholdende celler av arten Pichia pastoris, særlig hvor den nevnte art av Pichia pastoris er Pichia pastoris GTSll5/pTNF6-5 NRRL Y-18116.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at det nevnte porøse glassmateriale med høyt overflateareal, den nevnte anionvekslerharpiks og det nevnte immobilisert-farge affinitetsmateriale inneholdes i henholdsvis en første, andre og tredje kolonne.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, ytterligere omfattende ekvilibrering av den nevnte første kolonne med en buffer før trinn (a), særlig ytterligere omfattende ekvilibrering av den nevnte andre kolonne før trinn (d) med en buffer som opprettholder pH-verdien i området 7,8-10, særlig hvor en buffer omfattende 0,02 M Tris-HCl, pH 8,3, anvendes til den nevnte ekvilibrering, særlig ytterligere omfattende ekvilibrering av den nevnte andre kolonne til en pH-verdi i området 7,8-10 før trinn (e) hvor den nevnte TNF-holdige fraksjon elueres fra den nevnte andre kolonne ved passasje gjennom denne av ytterligere buffer med en pH-verdi i området 7,8-10, særlig ytterligere omfattende ekvilibrering av den nevnte tredje kolonne før trinn (f) med en buffer som har en pH-verdi i området 7,8-10, særlig hvor en buffer omfattende 0,02 M Tris-HCl, pH 8,3, anvendes til den nevnte ekvilibrering, særlig hvor den TNF-holdige fraksjon fra den nevnte første kolonne mates direkte inn i den andre kolonne når overvåking av utløps-strømmen fra den første kolonne avslører næværet av protein deri, og hvor den TNF-holdige fraksjon fra den nevnte andre kolonne mates direkte inn i den tredje kolonne når overvåking av utløpsstrømmen fra den andre kolonne avslører nærværet av protein deri.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den nevnte buffer som anvendes i trinn (b) til vasking av det porøse glassmateriale med høyt overflateareal omfatter en hvilken som helst buffer som opprettholder en pH-verdi i området 6,5-7,5, særlig hvor den nevnte buffer omfatter 0,01 M kaliumfosfat, pH 7,5.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den nevnte buffer for det nevnte trinn (g) vasking av immobilisert-farge affinitetsmateriale omfatter en buffer som har en pH-verdi i området 7,8-10, særlig hvor den nevnte buffer omfatter 0,02 M Tris-HCl, pH 8,3.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den nevnte klarede, oppbrutte fermenteringsvæske fremstilles ved: (i) oppbrytning av cellene i fermenteringsvæsken som er blitt justert på en pH-verdi som er tilstrekkelig høy til å gi en etter-oppbrytnings pH-verdi i området 6-8; og (ii) klaring av de oppbrutte celler; særlig hvor det nevnte porøse glassmateriale med høyt overflateareal består av perler i form av porøse granuler av høy-silikaglass som er gjennomtrengt av innbyrdes forbundne porer av ensartet størrelse i området 3000-30.000 nm, særlig hvor den nevnte anionvekslerharpiks er en sterk anionvekslerharpiks av den kvaternære ammonium type, særlig hvor det nevnte immobilisert-farge affinitetsmateriale omfatter en farge på en bærer, hvor fargen velges fra rød farge, oransje farge, grønn farge og blå farge.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det nevnte elueringsmiddel som anvendes i trinn (c) er minst ett valgt fra gruppene(i) forbindelser med formelen:

hvor n=0, 1 eller 2; hver R er for seg H eller metyl og X er hydroksyl eller R, med det forbehold at i det minste én X er hydroksyl;(ii) forbindelser med formelen:

hvor x=l, 2 eller 3, og hver R' er valgt for seg fra et ^-Cg-alkyl- eller -cykloalkylradikal, idet hver R <1> valgfritt inneholder én eller flere hydroksylgrupper; og (iii) kombinasjoner av forbindelser som kan skaffe en buffret oppløsning med en pH-verdi i området 8-11; særlig hvor det nevnte elueringsmiddel er minst ett valgt fra etenglykol, glycerol, propenglykol, etylamin, propylamin, butylamin, trietylamin, etanolamin og trietanolamin.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den nevnte oppløsning omfattende salt i en buffer som anvendes i trinn (e) omfatter minst tilnærmet lik 0,2 M konsentrasjon av et oppløselig metallsalt valgt fra halogenider, fosfater, sulfater, acetater og nitrater, i en buffer som har en pH-verdi i området 7,8-10, særlig hvor det nevnte elueringsmiddel som anvendes i trinn (h) omfater en konsentrasjon på minst 0,3 M av et salt valgt fra oppløselige salter av anionene: halogenider, fosfater, sulfater, acetater, nitrater og tiocyanater.

10. Fremgangsmåte til rensing av rekombinant tumornekrosefaktor, TNF, fra oppbrutt, klaret fermenteringsvæske, karakterisert ved at (a) den oppbrutte klarede fermenteringsvæske føres til en første kolonne inneholdende porøse glassperler med høyt overflateareal som fyllkroppsmateriale; (b) den første kolonne lastet som angitt i trinn (a) vaskes med minst tre kolonnevolumer av en buffer omfatter 0,01 M kaliumfosfat ved en pH-verdi på tilnærmet lik 7,5; (c) en første TNF-holdig fraksjon elueres fra den nevnte første kolonne med en oppløsning omfattende 0,01-10 V/V % trietanolamin; (d) den TNF-holdige fraksjon føres fra den nevnte første kolonne inn i en andre kolonne som omfatter en anionvekslerharpiks når overvåking av den andre utløpsstrøm fra den første kolonne viser at den nevnte utløpsstrøm inneholder protein; (e) den nevnte andre kolonne ekvilibreres til pH 8,3 ved at der gjennom kolonnen føres minst ett kolonnevolum med pH 8,3, 0,02 M Tris-HCl buffer; (f) en andre TNF-holdig fraksjon elueres fra den nevnte andre kolonne med en oppløsning omfattende 0,1-0,3 M NaCl i 0,01 M Tris-HCl, pH 8,3, buffer; (g) den TNF-holdige fraksjon fra den nevnte andre kolonne føres inn i en tredje kolonne omfattende en immobilisert-farge affinitetskromatografikolonne når overvåking av utløps-strømmen fra den andre kolonne viser at den nevnte utløps-strøm inneholder protein; (h) den nevnte tredje kolonne vaskes med en buffer inntil stort sett ikke noe materiale med en UV-absorbans på tilnærmet lik 280 nm elueres, og (i) det rensede TNF elueres med et elueringsmiddel omfattende 1,0 M NaCl i en 0,02 M Tris-HCl buffer, pH 8,3.