PT99560A - Processo para a preparacao de muteinas do factor de necrose tumoral humano e de composicoes farmaceuticas que as contem - Google Patents

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«PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MUTEÍNAS DO FAC-TOR DE NECROSE TIMORAL HUMANO E DB COMPOSI-gOES FARMACÊUTICAS QUE AS CONTÊM" O factor de necrose tumoral ou mais especificamente o factor alfa de necrose tumoral é uma citocina produzida principalmente por macrdfagos estimulados que exibe não sd uma notável citotoxicidade contra diversas células turno ra is £*Carswell et al., Procd. Nat. Acad. Sei.. U.S.A.. 72. (1975) 3666-3670,/ mas que desempenha também uma função múl tipla como mediador de inflamações e de respostas imunes £“para uma revisão veja-se Beutler e Cerami, Ann. Rev. Immunol.. £ (I989), 625-655} Bonavista e Granger (eds .), Tumor Necrosis Factor: Structure, Mechanism of Action. Role in Disease and Therapy, Basileia, Karger, 1990J7. A estrutura primaria do factor alfa de necrose tumoral humano (FQiNTh) foi deduzido da sequência nucleotídica de um ADNc que foi clonado e expressado em E. coli £"Pennica et al., Nature. 112 (198*+), 72^-729; Marmenout et al., Eurooe. J. Biochem.. 152 (1985), 515-522; Wang et al., Science. 228 (1985), 1^9-15*+; Shirai et al., Nature. 111 (1985)? 803-806.7. Descobriu-se uma notável homo-logia na sequência de aminoácidos (30 %) entre o íbçNTh e a lin fotoxina dos seres humanos, frequentemente designada por factor beta de necrose tumoral dos seres humanos (F p NTh), que é uma citocina produzida por um subconjunto de linfocitos £Gray et al., Nature. 112 (198^), 721-72^: Fiers et al., Cold

Spring Harbour Symp., £1, (I986), 537-595-7. 0 FotWTh com sequências de aminoácidos modificadas conhecido pela designação de FodNT-muteínas, também foi já descrito na especialidade /"veja-se por exemplo Yamagishi et al., Proteln.Engineering, i (1990), 713-719 ou Fiers in Tumor

Necrosis Factors:__Structure. Function and Mechanism of Action.

Aggarwal e Vilcek (eds.), Nova Iorque, Mareei Dekker, Inc., no prelo, ou Fiers et al., in Bo na vis ta e Granger, pp. 77-81 (s.a)J7. Por outro lado, os FQ^NT-muteínas foram também objecto de diver sos pedidos ,&e. . patente de invenção, por exemplo, os pedidos de patente de invenção internacional publicados com os NSs. ¥0 86/02381, ¥0 86/0^-606, ¥0 88/06625 e os pedidos de patente de invenção europeia publicados com os N^s 155 5^9: 158 286; 168,21**·; 251 037 e 3^0 333 e o pedido de patente de invenção alemã Νδ 38^353^.

As muteínas da linfotoxina foram também descritas em obras da especialidade, por exemplo, nos pedidos de patente de invenção europeia publicados com os N^s 250 000; 31^ 09*+ e 336 383.

Os efeitos biológicos do FNT são mediados através de receptores específicos, designadamente um receptor que possui um peso molecular aparente de 55 kD confirmado por electrofo-rese em gel de poliacrilamida/dodecilsulfato de sédio (SDS--PAGE) (R-FNT-p55) ® um receptor com um peso molecular aparen te de 75 kD confirmado por SDS-PAGE (R-FNT-p75)· As duas formas de receptores FNT foram clonadas, nomeadamente, no caso do R-FNT-p55 por Loetscher et al. £Cell. 61 (1990), 351-359 e no caso do R-FNT-p75 por Dembie et al. (Cytokine, 2 Μ

(1990), 53-58] (para ambos os receptores veja-se também o pedido de patente de invenção europeia NQ 90116707.2) e descobriu-se mais recentemente que ambos os receptores se ligam não só ao F NT mas também ao F NT com elevada afinidade [Schónfeld et al., J. Biol. Chem., 266 (1991), 3863-3869]. 0 objectivo da presente invenção i uma muteína ou um seu sal farmaceuticamente aceitável com base na sequência de aminoãcidos do factor de necrose Tumoral humano, sendo essa sequência modificada por supressão, inserção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos, de tal modo que a muteína apresenta uma diferença significativa entre a sua afinidade de ligação ao Receptor do Factor de Necrose Tumoral p75 humano e o Recep-tor do Factor de Necrose Tumoral p55 humano.

Um aspecto preferencial da presente invenção reside nu ma muteína tal como definida antes com base na sequência de aminoácidos do F NT conforme descrito por Pennica et al.

[s.a], de s ignadamente

1 10 VAL ARG SER SER SER ARG THR PRO SER ASP LYS PRO VAL ALA HIS 20 30

VAL VAL ALA ASN PRO GLN ALA GLU GLY GLN LEU GLN TRP LEU ASN 40

ARG ARG ALA ASN ALA LEU LEU ALA ASN GLY VAL GLU LEU ARG ASP 50 60

ASN GLN LEU VAL VAL PRO SER GLU GLY LEU TYR LEU ILE TYR SER 70

GLN VAL LEU PHE LYS GLY GLN GLY CYS PRO SER THR HIS VAL LEU 80 90

LEU THR HIS THR ILE SER ARG ILE ALA VAL SER TYR GLN THR LYS 100 k 4:

VAL ASN LEU LEU SER ALA ILE LYS SER PRO CYS GLN ARG GLU THR 110 120 PRO GLU GLY ALA GLU ALA LYS PRO TRP TYR GLU PRO ILE TYR LEU I30 GLY GLY VAL PHE GLN LEU GLU LYS GLY ASP ARG LEU SER ALA GLU mo 150 ILE ASN ARG PRO ASP TYR LEU ASP PHE ALA GLU SER GLY GLN VAL 157 TYR PHE GLY ILE ILE ALA LEU ou conforme descrito por Marmenout et al. (s.a.) ou ¥ang et sl. (s.a.) ou Shirai et al., ou mais especifieamente conforme codificado para a sequência nucleotídica da inserção do plas-rnídéo ’ PDS56/BBSII, SphlFfcs(_NT (ver as figuras 3a e 3b e o Exem pio I) codificadora para o Eb^NT maduro.

Um aspecto especifieamente preferencial da presente invenção reside numa muteína tal como definida antes em que a sequência de aminoácidos do Fb^NT é modificada por substituição de um ou mais aminoácidos, de preferência um ou dois, por outros aminoácidos, de preferência por aminoácidos que ocor rem naturalmente.

Os aspectos mais especifieamente preferenciais da pre sente invenção residem em muteínas tal como definidas antes em que a sequência de aminoácidos do K*jNT é substituída nas posições 29 e/ou 32 ou nas posições 31 e 32 ou na posição 31 ou nas posições 29 e 31, sendo preferíveis as substituições nas posições 29 e/ou 32 ou nas posições 31 e 32 ou na posição 31 (com referência a uma sequência de aminoácidos do Fb<NT contendo 157 aminoácidos) por outros aminoácidos, de preferên

cia por aminoácidos que ocorrem naturalmente. EÍ possível utilizar nessas posições qualquer aminoácido, de preferencia um" aminoácido que ocorra naturalmente, originando uma FNT-muteína que exibe uma diferença significativa entre a sua afinidade de ligaçao ao R-FNT-P75 humano e ao R-FNT-p55 humano, pelo que pa ra as substituições na posição 29 e preferível utilizar a seri na, a glicina ou a tirosina, sendo especialmente preferível a serina, por exemplo, no caso de uma muteína em posição única na posição 29 (Ser^-SviNT). Para as substituições na posição 31 é preferível utilizar o ácido glutamieo, por exemplo , glu^-F^NT , ou a asparagina. Para as substituições na posição 32 dá-se preferência k. tirosina, por exemplo, Tyr^-Rj(NT ou ao triptofano, por exemplo, TrpJ -F^NT, sendo este último espe cificamente preferido . As substituições especialmente preferidas no caso de uma muteína numa posição dupla, nas posições 29 e 32, são Ser2^-Trp^2-EtyNT e nas posições 31 e 32, são Asn^-Thr^-F<a(NT. Deve notar-se que as muteínas da presente in venção também podem ser preparadas por métodos conhecidos na es pecialidade da síntese química de peptidos e de proteínas, por exemplo, através da síntese em fase líquida ou em fase solida parcial ou total conforme descrito, por exemplo, por Gross e Meyerihofer em The Peptides. San Diego, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanóvich, Publs., Vols. 1-9, 1979-1987, ou por Fields e Nobel, Int. J. Peot. Prot. Res.. 35 (1990) 161-21½.

Os análogos obtidos por supressão, substituição e/ou adição de um ou vários aminoácidos nessas muteínas, tal como definidas no parágrafo anterior, não sendo por isso modificadas as posições 29 e/ou 32 ou a posição 31 ou as posições 31 3 32 na muteína, demonstrando ainda esses análogos uma diferença significativa entre a sua afinidade de lifeaçS©.ao R-FNT-p75 hu mano e ao R-FNT-P55 humano constituem também um objectivo da presente invenção. Os análogos de substituição obtidos por substituição de aminoácidos em proteínas cuja actividade não ê geralmente alterada, são conhecidos na especialidade e foram descritos, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill em The Proteins, ,!fova Iorque, Academic Press, 1979» (veja-se especial mente a Figura 6, página IV). As modificações que ocorrem mais frequentemente são: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, T&r/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, TYr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Ásp./Gly, e também essas mesmas mç> dificações por ordem inversa (as abreviaturas de três letras são utilizadas para os aminoácidos e constituem abreviaturas nor malizadas conhecidas na especialidade).

Os análogos de substituição, adição e/ou supressão podem ser produzidos por métodos conhecidos na especialidade e fo ram descritos, por exemplo, por Sambrook et al., Z"Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbourt Laboratory Press, USA, 1989-7» ou nos pa rágrafos seguintes. A eventualidade de tal análogo demonstrar possuir ainda uma diferença significativa entre a sua afinidade de ligação aos R-FNT-P75 e R-FNT-p55 pode ser determinada conforme descrito adiante e mais especificamente nos Exemplos lia) e b) ou no Exemplo VIII. Alem disso, os sais dessas mu-teínas e correspondentes análogos constituem também um objectivo

da presente invenção. Esses sais podem ser produzidos por mé todos conhecidos na especialidade.

ConstituU ainda,um objectivo da presente invenção pro porcionar uma muteína, tal como anteriormente descrito, para o tratamento de doenças, por exemplo, em casos de cancro. É bem sabido na especialidade que com base nas suas ac tividades biológicas (s.a.), o BsjJíT pode constituir um composto valioso para o tratamento de diversas doenças. Por exemplo, o Fo<NT, isolado ou em associação com o interferão pode constituir um agente anti-tumor eficaz, Z*Brouckaert et al., Int. J. Câncer, 38 (1986), 763-769 _7. Todavia, a sua toxicidade sisté mica constitui uma limitação fundamental no que diz respeito à sua utilização terapêutica mais alargada, Z*Taguchi T. e Sohmura Y.. Biotherapy. 31 (199D > 177“l86_/ A descoberta de dois receptores do FIT com caracterís ticas funcionais (putativamente) distintas deve permitir diferenciar num determinado estado de doença as respostas biológicas benéfica e indesejada ao FNT. Existem provas circunstanciais que suportam a exequibilidade desta abordagem. Demonstrou-se, por exemplo /"Brouckaert et al., Agents and Actions. 26 (1989), 196-197: Everaerdt, B. et al., Biochem. Biophys.

Bes. Comm«., 163 (1989;, 378-385.7 que o Fc^NT dos murinos murganhos (F<^NTm) é cerca de 50 vezes mais tóxico do que 0 B^WT dos seres humanos (E^NTh), embora ao serem testados em culturas celulares sejam ambos igualmente activos sobre linhas de ce lulas sensíveis.

Admite-se que a estratégia de separação entre as acti-vidades benéficar® indesejada do Fc&NT utilizando compostos \| que se ligam especificamente a um ou outro dos receptores de FNT, tais como as FNT-mutaínas da presente invenção, pode sez utilizada de uma forma geral noutros casos de doenças em que o FNT desempenha qualquer função.

As sequências de ADN que contêm uma sequência de ADN codificadora para as FNT-muteínas, conforme descrito antes, constituem também um objectivo da presente invenção. Essas sequências de ADN podem ser construídas a partir de sequências genémicas ou de ADNc codificadoras para o FNTh, tal como se encontra descrito na especialidade £s,ã.J utilizando métodos conhecidos de mutagénese in vitro (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989). Essa mutagénese pode ser efectuada aleatoriamente com o objectivo de originar um grande némero de mutantes que possam ser depois submetidos em ensaios para a de terminação das suas propriedades desejadas recorrendo a sistemas de ensaio adequados ou, para se proceder à mutação de posi ções definidas numa determinada sequência de ADN , recorrer--se-á à chamada mutagénese dirigida a um sítio /"ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, 15«51-15*113-7 ou à mutagénese utilizando a reacção da cadeia da polimerase //ver, por exemplo, White et al., Trends in Genetics. (1989), 185-189-7·

Um mutagene químico que é frequentemente utilizado pa-*>a a mutagénese aleatéria 4 o bissulfito de sédio, o qual converte um resíduo citosina num resíduo uracilo proporcionando consequentemente uma transição de "C" para ,rT'* (abreviaturas normalizadas para nucleétidos) ^Para a pratica do método veja -se, por exemplo, Shortle e Nathans, Procd_Nat._.Acad_,. S.ci 2 ¢: U.S,Α., 22 (I978), 2170-217^, ou Pine e Huang. Meth. Enzvm.. I5k, (I987), 7. Este mutagene actua unicamente sobr.e 0 ADN de cordão simples ao passo que a expressão da sequência mutada do ADN alvo se efectua com um vector plasmídeo de ôdrdaa duplo. Uma possibilidade de evitar a necessidade de re clonagem nos vectores de mutagenese e de expressão reside na utilização dos chamados "fasmidos". Estes são vectores que, para além de uma origem plasmídica de replicação, suportam tam bém uma origem de replicação derivada de um fago filamentoso.

Como exemplos desses plasmídeos refere-se os conhecidos fasmidos pMa e pMc descritos por Stanssen et al., Nucleic Acids Res. .17.. (1989), ^1+1-^51+. Utilizando este sistema de expressão é possível construir as chamadas estruturas de "lacuna-em--duplex" (ou de dúplice lacuna) /^ver também Kramer et al., Nucl. Acids. Res., 12 (198*+), 9^1-9^567^, em que apenas a se quência que codifica 0 FNT (s.a.) se encontra numa configuração de cordão simples e por isso acessível ao mutagene químico específico. As estruturas de "dúplice lacuna" utilizáveis em mutagenese aleatória podem ser construídas conforme descrito pg. ra a mutagenese específica do sítio, por Stanssen et al. 2s.a.7 com a excepção de o eordão(-) possuir o mesmo gene de resistência antibiótica activa do cordão(+). Utilizando diferentes sítios de restrição na sequência do ADN codificadora do Fc^NTh é possível variar a largura da lacuna. Gomo exemplos desses sítios de restrição refere-se os sítios Clal-Sall (*+70 nucleó-tidos) BstXl-BstXl (237 nucleótidos) ou os sítios Styl—Styl (68 nucleótidos). Essas estruturas de dúplice lacuna podem ser depois tratadas com concentrações ©íescentes (até ^ M) de bissul 10

fito, seguindo-se vários passos de diálise conforme descrito por Shortle e Nathans (s.a.). Depois é possível transformar uma célula hospedeira procariótica adequada com essas estrutu ras fasmldicas de acordo com métodos conhecidos na especialidade e descritos, por exemplo, por Sambrook et al. (s.a.).

No contexto da presente invenção, uma célula hospedeira proca-ridtica adequada significa uma célula hospedeira deficiente nu ma função de reparação específica, de tal modo que seja mantido um resíduo uracilo no ADN durante a replicação, sendo essa célula hospedeira susceptível de realizar a expressão do cor respondente FNT mutado. Essas estirpes hospedeiras especíi-cas são conhecidas na especialidade, por exemplo, no caso das estirpes coli refere-se à estirpe E^ coli BW 313, Z*Kunkel, T.A., Procd. Natl. Acad. Sei. USA. 82 (1985), kSS-k&J. Depois é possível proceder ao rastreio dos clones resultantes para determinação daqueles que realizam a expressão de uma FNT--muteína desejada, através de sistemas de ensaio adequados. Por exemplo, é possível inocular cada colónia numa placa de micro-titulação num meio adequado que contenha o antibiótico relevan te. As células podem ser submetidas a uma lise por adição de lisozima, seguindo-se ciclos sequenciais de congelamento/des-congelamento. Após precipitação e centrifugação dos ácidos nu-cleicos pode utilizar-se directamente o sobrenadante de cada co lónia em ensaios adequados conforme descrito, por exemplo, nos exemplos lia e Ilb ou no Exemplo VIII medindo a ligação aos R-FNT-p75 e R-FNT-P55 sobre a superfície das células vivas ou numa forma purifigada.

Se desejável é possível determinar os sítios espeçífi 11

cos de mutaçao, por exemplo, por análise dos fragmentos de reis trição [veja-se, por exemplo, Sambrook et al. (s.a)]. Atra ves da determinação da sequência do ADN desses fragmentos é possível determinar a posição exacta da mutação e, no caso de essa mutação originar uma substituição de aminoácidos, é possível deduzir os novos aminoácidos a partir da sequência de ADN determinada. A sequenciação do ADN pode ser efectuada em conformidade com métodos conhecidos na especialidade, por exem pio, utilizando a polimerase T7 sobre ADN-superespiralado com um estojo de sequenciação comercialmente disponível (Pharmacia, Uppsala, Suécia).

Conforme se referiu antes, outra possibilidade de proceder á mutação de uma determinada sequência de ADN é a "mu-tagénese dirigida a um sítio". Uma estratégia muito utilizada para esse tipo de mutagénese, conforme originalmente descrito por Hutchinson e Edgell [J. Virol., 8 (1971), 181] implica o recosimento de um oligonucleótido sintético que suporta a de sejada substituição nucleotídica para uma região alvo de uma sequência de ADN de cordão simples em que a mutação deve ser introduzida [para uma revisão, veja-se Smith, Annual. Rev. Genet., 19, (1985), 423 e para o conhecimento de métodos aperfeiçoados veja-se as referências 2-6 em Stanssen et al. (1989)].

Um desses métodos preferenciais é o descrito por Stanssen et al. (1989) utilizando "ADN de dúplice lacuna" con forme originalmente descrito por Kramer et al. (1984) [veja--se as referências anteriores e também Kramer e Fritz, Méthods in Enzymology, Academic Press, Inc., USA (1987), mas utilizando genes com resistência aos antibióticos em vez dos genes funcio 12Α nais M13 para a selecção do cordão que contém a mutação conjuntamente com a tecnologia fasmiídica descrita também por Stanssen et al. (1989) Z"s.a._7. Uma vantagem deste método re side também na capacidade de se executar ciclos sucessivos de mutagenese sem que haja necessidade de transferir o gene para o novo vector de mutagenese: a segunda mutagenese sequencial di fere apenas pela selecção de outro marcador antibiótico (Stanssen et al., (s.a.). Como controlo pode utilizar-se a re tromutagénese específica do sítio do mutante para o tipo selva gem. Por outro lado, a utilização de um oligonueledtido, crian do ou destruindo um sítio de restrição no gene do FNT , permite controlar 0 mutante, não sé pela hibridação para o oligonu-cleétido utilizado para a mutagenese dirigida ao sítio mas tam bém pela presença ou pela ausência do sítio de restrição. Para se criar uni conjunto de FNT-muteínas em que numa posição definida da sua sequência de aminoácidos se substitui 0 aminoácido de tipo primitivo por qualquer aminoácido que ocorra naturalmente, utiliza-se um conjunto de oligonucleotidos com todos os codoes possíveis na posição definida.

Conforme já se referiu antes, outra possibilidade para proceder ã mutação de uma determinada sequência de ADN reside na mutagenese utilizando a reacção da cadeia da polimerase (RCP). Os princípios deste método foram evidenciados, por exem pio, por White et al. (1989) ao passo que existem métodos aperfeiçoados descritos, por exemplo, por /"PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, Inc., 1990-7. A RCP é um método realizado in vitro para a produção de grandes quantidades de um fragmento específico de ABN com

, comprimento definido e com uma sequência definida, a partir de pequenas quantidades de . mna matriz de ADN . Em consequência, a RCP baseia-se na amplificação enzimética do fragmento de ADN flanqueado por dois iniciadores oligonucleotídicos que hibridam para cordões opostos da sequência alvo . Os iniciadores são orientados com as suas extremidades 3' voltadas uma para a outra. Os ciclos repetidos de desnaturação a quente da matriz, reeosimento dos iniciadores às suas sequências complementares e a extensão dos iniciadores recosidos com uma polimerase de ADN originam a amplificação do segmento defini do pelas extremidades 5' dos iniciadores da RCP . Uma vez que o produto de extensão de cada iniciador pode servir como matriz para o outro, cada ciclo duplica praticamente a quantidade do fragmento de ADN produzido no ciclo anterior. Uma vez que os iniciadores se encontram fisicamente incorporados no produto amplificado e as desadaptações entre a extremidade 5' do iniciador e da matriz não afectam significativamente a eficiência da amplificação, é possível alterar e sequência am plifiçada introduzindo consequentemente a mutação desejada no ADN amplificado. Utilizando a polimerase de ADN Taq ter-mostável, isolado a partir da bactéria termdfila Thermus aauaticus. é possível evitar a desnaturação da polimerase que necessitou da adição de enzima após cada passo de desnaturação a quente. Este desenvolvimento conduzido k automação da RCP através da utilização de uma diversidade de dispositivos simples que efectuam ciclos de temperatura. Além disso, a especi ficidade da reacção da amplificação aumenta devido ao facto de permitir a utilização de temperaturas mais elevadas para o re-

cosimento θ a extensão do iniciador. A especificidade acres cida aumenta o rendimento global dos produtos amplificados de vido ao facto de minimizar a competição para a enzima e para os iniciadores pelos fragmentos que não são alvo. 0 projecto e a síntese de oligonucledtidos podem ser efectuados por processos conhecidos na especialidade e descritos, por exemplo, por Sambrook et al. (I989) ou de acordo com métodos descritos nas referências anteriormente indicadas relativamente à mutagénese .dirigida a um sítio.

Uma vez criada uma sequência de ADN codificadora para uma FNT-muteína da presente invenção, é possível realizar a. expressão pela tecnologia fasmídica conforme descrito antes ou recorrendo a qualquer sistema adequado de expressão proca-riética ou eucaridtica bem conhecido na especialidade ZTveja--se, por exemplo, Sambrook et al., s.a._7. A expressão efectua-se preferencialmente em células procarioticas, por exemplo, em Ξ. coli. Bacillus subtilis e outros, sendo preferível utilizar E. coli. especificamente a estirpe E. coli R12, por exemplo, a M15 Z*descritas como DZ 291 por Villarejo et al. em J. Bacteriol.. 120 (197^·), l66-k7kj, HB 101 ZTATCC ΪΡ 33 69^-7? WK6 (Stranssens et al, (s.a.) ou 5. coli SG13009 Z* Gottesman et al., J. Bacteriol.. M U981), 265-27$ A expressão das muteínas da presente in venção também pode ser efectuada em células eucariéticas infe riores ou superiores, por exemplo, em células de leveduras (de tipo Saccharomyces. Pichia. etc.), fungos filamentosos (de tipo Aspereillus, etc.) ou linhas de células (do tipo das linhas de células dos ovários do hamster chinês, etc.), sendo

preferível realizar a expressão em células de leveduras v$-. ja-se Sreekrishna et al., Biochem.. 28 (1989), ^117-^-125-1 Hitreman et al., Nature, 291 (1981), 717-722; ver também o pedido de patente de invebção europeia NS 263 311,7. A expressão das FNT-muteínas da presente invenção pode ocorrer nesses sistemas por via intracelular ou, apds adequada adaptação do gene, por via extracelular ^veja-se Leemans et al., gene, 8$ (1989), 99-108,/.

Os vectores adequados para a expressão em L coli fo ram referidos, por exemplo, por Sambrook et al. Z*s.a._7 ou por Fiers et al. em Procd. 8th Int. Biotechnologv Svmposium /Tsoc. Franc. de Microbiol., Paris, (Durand et al., eds.), 1988, pp. 680-697_7/utilizando-se também vectores mais especí ficos da família pDS /*Bujard et al., Methods in Enzvmologv. eds» Wu e Grossmann. Academic Press. Inc. (I987), Vol. 165. ^16-^33; Stuber et al., Immunological Methods. eds, Lefkovits e Pernis, Academic Press, Inc., 1990, Vol. IV, 121-1^2_y tais como por exemplo p£S56/RBSII,Sphl-TNF Ser29 ou pDS56/RBSII, Sphl-TNFoiTrp32 (veja-se 0 Exemplo I) ou pBS56/RBSII, Sphl--TWFc*Glu31 ou pDS56/RBSII,Sphl-TNPc<Asn31Thr32 (veja-se Exemplo VII). As estirpes Ej. coli transformadas M15 (pREplf; pDS56/RBSII, Sphl-TNB*Glu3l) e K15 (pBEP^f; pI-S56/RBSII,Sphl-TNE^Asn3lTbr32) foram depositadas, ao abrigo do tratado de Budapest para efeitos de patentes na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (BSM) em Braunschweig, BRD a 18 de Setembro de 1991 sob os némeros de registo DSM 671½ e DSM 6715, respectivamente.

uma vez que com estes plasmídeos específicos pDS56/RBSII, devido aos seus elementos específicos promotor/operador reguláveis e devido aos seus sítios de ligação ribossômica, e possí^ vel conseguir um elevado nível de expressão, é possível manter os plasmídeos nas células de E. coli apenas quando a activi-dade do elemento promotor/operador é reprimida pela ligação de um repressor lac ao operador. A actividade de promotor pode ser restaurada com a densidade celular desejada por adição de IPTG, o qual desactiva o repressor e desimpede o promotor.

Uma vez que a maior parte das estirpes de E. coli nao proporcionam moléculas repressoras suficientes para reprimir completamente a função das sequências do promotor presentes nesses plasmídeos de elevado numero de cópias, essas estirpes E. coli, tais como E, coli M15 ou SG3009, têm que ser transformadas inicialmente com um plasmídeo, por exemplo pREP4, codificador para o repressor lac, antes de serem transformadas com os plasmídeos específicos pDS56/RBSII da presente invenção os quais podem ser depois mantidos de forma estável nas células de E. coli. Além de ser codificador para o repressor lac, o plasmídeo pREP4 contém também uma região do plasmídeo pACYC184 [Chang e Cohen, J. Bacteriol·., 134 (1978), 1141-1156], a qual contém toda a in formação necessária para a replicação e para a transmissão está vel ãs células da descendência [para informação adicional veja--se também "System for high levei production in E. coli and rapid purification of recombinante proteins: application to epitope mapping, preparation of antibodies and structure func-tion analisis" por Stúber et al. in Immunological Methods.

Lefkovits e Pernis (eds.), Nova Iorque, Academic Press, 1990,

. Vol. IV, pp 121-152. A transformação das células hospedeiras por vectores. conforme descrito antes pode ser efectuada recorrendo a qualquer procedimento convencional Z*veja-se por exemplo Sambrook et al. (s.a.) J. No caso de a célula hospedeira ser uma célu la procariòta ' tal como, por exemplo, uma célula de Eh coli as células competidoras que são capazes de incorporar ABN são preparadas a partir de células colhidas ap<5s a fase de crescimento exponencial e são tratadas depois com CaC^j de acordo com o método conhecido. A transformação também pode ser efec-tusda apés a formação de um protoplasto da célula hospedeira ou recorrendo a outros métodos conhecidos na especialidade e descritos, por exemplo, por Sambrook et al. (s.a.). Em conse quência, constitui também um objectivo da presente invenção proporcionar um vector, especialmente para a expressão numa cé lula hospedeira procariética ou eucariótica inferior, contendo uma sequência de ABN codificadora para uma FNT-muteína conforme descrito antes, e uma célula hospedeira, especialmente uma célula hospedeira procariotica, por exemplo, de coli, ou uma célula hospedeira eucariótica inferior transformada por esse mesmo vector.

Normalmente os organismos hospedeiros que contêm um vec tor de expressão desejado desenvolvem-se sob condições que são éptimas para o seu desenvolvimento. No caso de um hospedeiro procariético no final do desenvolvimento exponencial, quando decresce o aumento do ndmero de células por unidade de tempo, induz-se a expressão da desejada FNT-muteína, isto é, o ABN codificador para a desejada FNT-muteína é transcrito e o ARNm

transcrito é traduzido. A indução pode ser efectuada adicionando um indutor ou um desrepressor ao meio de crescimento ou alterando um parâmetro físico, por exemplo, provocando uma va riação de temperatura. Mos vectores de expressão utilizados nos aspectos preferenciais da presente invenção, a expressão é controlada pelo repressor lac. Adicionando isopropil--D--tiogalactopiranosido (IPTG), a expressão da sequencia de controlo é desreprimida sendo consequentemente induzida a sín tese da desejada FNT-muteína.

As FNT-muteínas da presente invenção produzidas pelas células hospedeiras transformadas, conforme especificado antes, podem ser recuperadas a partir do meio de cultura ou após a abertura das células e/ou a extracção por qualquer método adequado conhecido na química das proteínas e dos péptidos tal como, por exemplo, a precipitação com sulfato de aménio, a di-élise, a ultrafiltração, a filtração em gel ou a cromatografia de permuta ionica, a electroforese em gel, a focagem isoeléc-trica, a cromatografia por afinidade, a cromatografia de tipo imunoafinidade, a HPLC ou semelhantes. Os métodos especifica-mente preferenciais são a precipitação com sulfato de amónio e/ou polietilenimina, diálise, cromatografia por afinidade, por exemplo, sobre fenil-agarose, especificamente sobre fenil--sefarose, ou a cromatografia de permuta iónica, especificamen te sobre uma matriz de tipo MONO-Q e/ou MQNO-S (Pharmacia, Uppsala, Suécia) ou mais especificamente os métodos descritos por Tavernier et al. £11 (1990), *»93-501J e ainda de acordo com os métodos descritos no exemplo I ou no exemplo III. 1'

Em consequência, constitui também um'objectivo da pre sente invenção proporcionar um processo para a preparação de um composto, conforme especificado antes, consistindo esse pro cesso em cultivar células hospedeiras transformadas, conforme descrito antes, no meio adequado, isolar uma muteína a partir do sobrenadante da cultura ou a partir das próprias células hospedeiras e, se desejado, converter essa muteína num sal far ✓ maeeuticamente aceitável. Todos os compostos quando preparados de acordo com esse processo constituem também um objectivo da presente invenção.

As muteínas da presente invenção caracterizam-se por exibirem uma diferença significativa entre a sua afinidade de ligaÇio ao R-FNT-p75 humano e ao R-FNT-p55 humano. Essa pro priedade pode ser determinada através de um ensaio conhecido na especialidade, medindo as afinidades ie ligação. Por exem pio, é possível medir a ligação do préprio FNT e das muteínas da presente invenção utilizando células numa cultura celular que expresse os dois tipos de reeeptores do FNT em graus diferentes, tais como, por exemplo, as células Hep-2 que expressam exclusivamente o R-FNT-p55 humano e as células U937 ou HLóQ que adicionalmente expressam também o R-FNT-p75 humano. /7ver Broockhaus et al., Procd. Nat. Acad. Sei._TJ.S.A.., 8Z, (1990), 3127-3131; Hohmann et al., J. Biol. Chem., 26^,(1989) 1^927-1^93^5 Loetscher et al., (1990); Dembic et al., (19909J7. Como é evidente, as afinidades de ligação também podem ser determinadas directamente utilizando os R-FNT-p55 e R-FNT-p75 recombinantes ou nativos purificados, conforme esPecificamente descrito no exemplo Ilb, ou utilizando os correspondentes aná- 20

logos solúveis desses receptores. A expressão "diferença significativa entre a sua afinidade de ligação ao receptor do Factor de Necrose Tumoral p75 humano e ao receptor do Factor de Necrose Tumoral p55 humano" refere-se, no contexto da presente invenção, a uma dife rença nas afinidades de ligação aos dois tipos de receptores de FNT sendo essa diferença, no que diz respeito ao sistema de ensaio utilizado, suficientemente significativa de modo a permitir afirmar que uma muteína da presente invenção se liga preferencialmente a um dos dois receptores de FNT, quando fei ta a comparação com o FNT de tipo selvagem. Mais especifica mente esta expressão significa, no contexto do ensaio/sistema do Exemplo lia), que o valor Kp de uma FNT-muteína específica da presente invenção e pelo menos um factor com o valor 10 ou superior, sendo especialmente preferido pelo menos um factor n de valor 10' , mais elevado do que para o próprio E^NT determi nado utilizando as células U937, sendo o seu valor deter minado utilizando as células Hep-2 para a mesma FNT-muteína não superior por um factor de valor 2 comparativamente com 0 valor do próprio Fc\>NT/para verificação de dados específicos veja-se 0 Quadro 1 do Exemplo IIáX7. Contudo, deve notar-se que esses valores específicos tem apenas objectivos ilus trativos e de forma alguma d&vem ser considerados como limitativos.

As muteínas da presente invenção,caracterizam-se pela sua actividade anti-tumor confirmada por métodos conhecidos na especialidade e descritos, por exemplo, no Exemplo IV.

As muteínas da presente invenção podem exibir, mas não 21 Λ necessariamente, uma actividade citotóxica consideravelmente reduzida em ensaios de FUT normalizados os quais se baseiam em linhas de células de murinos, tais como as linhas de célu las L929 (ver 0 Quadro 1) ou as linhas de células L-M.

As FNT-muteínas da presente invenção podem ser utili zadas para o tratamento de doenças, por exemplo, nos casos de cancro.

Constitui um outro objectivo da presente invenção pro porcionar composições farmacêuticas e um processo para a sua preparação, contendo essas composições farmacêuticas um ou mais compostos da presente invenção, sá -'..desejado, em ,/ ' ... associação.com substâncias aditivas farmaceutieamente acti vas e/ou substâncias veiculares não tóxicas, inertes e tera-peuticamente compatíveis. Para satisfazer este objectivo, é possível processar um ou mais compostos da presente invenção, sempre que desejado ou necessário em associação com outras substâncias farmaceutieamente activas, por um processo conhecido, com os materiais veiculares sólidos ou líquidos normal-mente utilizados. A dosagem dessas preparações pode ser efec, tuada tendo em consideração critérios habituais por analogia com as preparações já utilizadas de estrutura e actividade se melhantes.

Os exemplos adiante descritos têm como objectivo ilus trar pormenores da presente invenção, sem contudo constituírem qualquer limitação.

Exem,- 2

Exemplos

Exemplo 1 ~ 9Q 39

Preparaçao de Ser -FQCNT e Trp -FQCNT

Construção de vim vector de mutagénese A partir do plasmídeo pDS56/RBSII, Sphl-FocNT de expressão do FNT humano (ver a Figura 3a: 0 plasmídeo de expre£ são contem o elemento promotor/operador regulador N250PSN250P29 (I K\\\X1). o sítio de ligação ribossómica de síntese RBSII (:7ΓΠ), genes (flMH^*) para a p~lactama-se (bla), cloranfenicol acetiltransferase (cat) e terminatos transcricionais (ΓΜΙΙΐΐΙΠΤΠ tQ do fago lambda (tQ) e TI do ope rão rrnB de E. coli (Tl) e a região de replicação do plasmídeo pBR322 (repl.). A região de codificação sob o controlo de N250PSN250P29 e RBSII está indicada por uma seta; para a sequência nucleotídica completa do plasmídeo veja-se a Figura 3b/ /1-3b/3, representada pelas abreviaturas normalizadas que iden tificam os nucleótidos), isolou-se um fragmento EcoRI-HindIII contendo o sítio de ligação ribossómico RBSII, a sequência codificadora do FC5(NT maduro e a sequência não traduzida em 3' de 130 pb. Este fragmento foi clonado nos fasmídeos pMac abertos com EcoRI-HindIII (Stanssen et al., s.a.), originando as estruturas pMa/RBSII, Sphl-FO(NT e pMc/RBSII, Sphl-FO^NT.

Isolamento do ADN de cordão simples (ADNcs).

Transformou-se o fasmido pMa/RBSII, Sphl-F^RT emE. coli WK6 (Stanssen et al., s.a.). Extraiu-se uma colónia e efectuou--se a sua cultura em 5 ml de meio LB (Sambrook et al., 1989) +

fcarbenicllina (fo^/ig/ml) a temperatura de 37°C, durante a noite. .Utilizou*se 1 ml desta cultura confluente para inocular 200 ml de LB + carbenicilina. Quando a observância (650 nm) atingiu o valor de 0,1 infectou-se a cultura com o fago auxiliar M13K07 /*Stanssen et al., (1989)^ para um valor m.o.i. de aproximadamente 20 e depois incubou-se ainda durante a noite à temperatura de 37°C. Seguidamente submeteu-ise as células à cen trifigação (10 minutos, 10000 rpm) e transferiu-se o sobrena- dante para outro tubo. Adicionou-se 50 ml de uma solução de PEG (20 % de polietilenoglicol 6000; NaCl 2,5 M) e manteve-se a mistura arrefecida com gelo durante 1 hora para precipitar os fagos. Após centrifugação (10 minutos, 8000 rpm) removeu- -se 0 sobrenadante e secou-se o tubo sobre toalhas de papel du rante 10 minutos. Com o granulado de fagos preparou-se nova- jauspensão. ifii 6 ml de tampão TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA, 0*1 mM, pH 8). Efectuou-se uma primeira extraeção com 6 ml de fenol saturado com TE seguindo-se uma centrifugação durante 3 minu tos. Apés a centrifugação (3 minutos) numa centrifugadora de

Eppendorf, transferiu-se a fase aquosa para um outro tubo e efectuou-se uma segunda extraeção com uma mistura de clorofor mio /álcool isoamílico (2^:1) pelo mesmo processo descrito.

Foi possível precipitar 0 ADN de cordão simples adicionando 1/10 de volume de NaC104 % e 1 volume de isopropanol (-20°C, 2 hòras). Este ADNcs foi granulado por centrifugação duran te 20 minutos numa centrifugadora de Eppendorf. Secou-se o granulado e dissolveu-se' em 500βιΐ de tampão TE utilizado co mo controlo, processou-se 5^1 desta mistura sobre gel de aga rose, contendo brometo de de etidio na concentração de 1^ig/ml.

Normalmente a relação entre o ADNcs (= cordão(+) do pMa/RBSIÇ Sphl-R^NT e o ADNcs do fago auxiliar estava:compreendida entre 2:1 e 20:1. A quantidade total de ADNcs foi avaliada em pelo menos 200 ng^)ul.

Construção de uma dúplice lacuna. A partir do fasmido pMc isolou-se o fragmento grande Ecorl-HindIII e utilizou-se para hibridação em cordão(+) do pMa/RBSII, Sphl-íbiNT. Numa experiência típica misturou-se 15^.1. de ADNcs (+ 3^ig), 15 Jbl de fragmento linear de cordão duplo (+ 1,5 J*g), 10 ml de tampão de hibridação ( KC1 1,5 M, Tris-HCl 100 mM, pH 7,5) e bOyH de água e incubou-se à tempe ratura de 100° C durante b minutos, a temperatura de 65°C duran te 8 minutos e à temperatura ambiente durante 15 minutos. Submeteu-se uma alíquota (10 ml) a electroforese sobre um gel de agarose, contendo brometo de etídio, para confirmar a forma ção do ADN de dúplice lacuna e, em caso afirmativo, para avaliar a sua quantidade (esta quantidade e normalmente de 50 ng/10 ml de mistura de hibridação).

Recosimento do oligonucledtido mutante e preenchimen to da dúplice lacuna.

Efectuou-se a síntese dos oligonucleotidos que continham o codão mutado destruindo ou criando um sítio de restri ção no gene FNT. Utilizou-se os oligonucleotidos 5'CCGGCGGTTGGA0CACTGGAGC3' e 5'CATTGGCCC4GCGGTTGAG3*; (as ba ses mutadas estão sublinhadas ) para criar, respectivamen te, as mutações Ser^ e Trp^, Apds a fosforilação enzimáti ca adicionou-se cerca de 8 pmoles a IfO ng de dúplice lacuna.

A seguir adicionou-se água ate um volume final de 10 ml. Aque ceu-se esta mistura ate b temperatura de 65°C durante 5 minutos e deixou-se arrefecer até a temperatura ambiente. Depois adicionou-se 18 ml de agua, 1+ yaj. de tampão 10 de carga (KCl 625 mM, Tris-HCl, 275 mM, MgCl2, 150 mM, DTT 20 mM, a pH 7,5), 2Jil de ATP 1 mk,' ^^1 dos quatro dNTP's 1 mM, Va de ligase e 1 ml de polimerase de. Klenow,.é .incubou-se a mistura à temperatura ambiente durante k5 minutos .

Transformação em EM coli WK6 mutS e EM coli WK6

Utilizou-se lOyul do ADN de dúplice lacuna preenchida para transformar (Sambrook et al., 1989) EM coli WKó mutS (Stanssen et al., s.a.). A partir dessa mistura (1,2 ml) utilizou-se 100^Ul que foram processados em placas de gelose contendo cloranfenicol na concentração de 25Jig/ml para verificação da eficiência da transformação. Utilizou-se a parte restante para inocular 20 ml de LB + cloranfenicol e desenvolvi mento durante a noite a temperatura de 25°C. Uma preparação em pequena escala de ADN plasmídico ^Birnboim, H.C. e Doly, J., Nucleic Acids Bes.. Z, (1979), 1513-7 desta cultura (sem ter ainda crescido até a confluência) originou uma popula ção fasmídica mista que foi possível transformar em Eh coli WKó. Repetiu-se o processamento de 100 JiL da mistura da trans formação em placas de gelose contendo cloranfenicol.

Rastreio por hibridação das colénias

Cerca de 100 colonias, resulttantes da transformação em EU. coli WK6, foram alinhadas sobre um filtro de nylon -(PALL, Glen Cove, Nova Iorque) e procedeu-se a sua incubação durante a noite à temperatura de 37°C. Transferiu-se o filtro (voltado para cima) para papéis Whatmann 3MM que foram embebidos em NaOH 0,5 M (3 minutos) Sfectuou-se a neutralização por transferência para folhas Wháfamann 3ΜΜ embebidas em tampão Tris-HCl 1M, a pH 7Λ (duas vezes durante 1 minuto ê 2xSSC (20XSSC = NaCl 3Mj Citrato de sódio 0,3M, pH 7) (5 minutos).

Após a secagem procedeu-se à cozedura do filtro à temperatura de 80°C entre folhas de papel 3MM. Depois humedeceu-se o fil tro previamente em 6xSSC (5 minutos) e hibridou-se previamen te a temperatura de 67°C durante 5 minutos em 10 x solução de Denhsrdt; (2 % (p/v) Ficoll PM de *+00 000 ), 2 % (ρ/v) de polivinilpirrolidona (PM de ^ 000), 2 % (p/v) de Albumina de Soro de Bovino), tampão de óxSSC e 0,2 % de SDS . Após a lavagem com tampão de 6xSSG colocou-se o filtro num prato de Petri contendo H· ml de óxSSC e 60 pmoles do oligonucleótido mutante marcado com ^P, durante 1 hora à temperatura ambien te, e lavou-se com 100 ml de 6xSSC. Cobriu-se o filtro com "Saranv/rap" e autorradiografou-se em películas pre-expostas (Fuji) a temperatura de -70°C durante 1 hora. Depois lavou-se o filtro novamente com tampão de óxSSC para valores crescentes da temperatura (variando entre 51°C e 75°C, conforme o comprimento da sonda e de acordo com a quantidade de resíduos G e C), seguindo-se de cada vez uma autorradiografia, conforme descrito antes. Por exemplo, a lavagem a temperatura de 61+° C permitiu nitidamente distinguir os mutantes Ser29 diferenciando-os das colónias de tipo selvagem, ao passo que os mutantes Trp32 foram detectados após duas lavagens sequenciais às temperaturas de ó2°C e Ó3°C, respectivamente.

Análise do fragmento de restrição

Uma vez que a mutação Ser29 criou um sítio de res-trição Ava2 e a Arg32 destruiu o sítio de restrição Ncil, foi possível utilizar as duas endonucleases correspondentes para análise do fragmento de restrição, com o objectivo de ve rificar mais uma vez a presença da mutação. Removeu-se as colá nias e permitiu-se o seu desenvolvimento atá a confluência em 5 ml de eloranfenicol. A partir dessas culturas procedeu-se a preparação do ADN plammídico, digeriu-se com endonucleases da restrição adequadas e submeteu-se e electroforese sobre ge-les de agarose, de acordo com procedimentos clássicos (Sambrook et al., 1989).

Subclonagem num vector de expressão bacteriana

Sfectuou-se a transferencia do gene FNT mutado para um vector de expressão exactamente pela forma oposta à da constru ção do vector do mutagánese. Digeriu-se o fasmídó·'- pMc/RBSII, Sphl-Fc(JíTSer29 ou pMc/RBSII,Sphl-I^NTTrp32 com EcoRl-HindIII e inseriu-se o fragmento pequeno no vector pDS56/RBSII, Sphi--F^NT aberto com EcoRi-HindIII gerando plasmídeos pDS56/RBSII, Sphl-Fc^NTSer29 e pDS56/RBSII, Sphl-S^NTTrp32 e transformou-se em células E. coli Ml5 contendo já o plasmídeo pREP*f (codifi cador do repressor lac; ver as Figuras 2a e 2b./l-2b/3 que repre senta uma sequência nucleotídica completa do plasmídeo de acor do com as abreviaturas normalizadas para os nucleátidos) por má todos normalizados (s.a.). Desenvolveram-se essas culturas de cálulas transformadas E. coli Ml5 ã temperatura de 37°C em meio LB (10 g de bactotriptona, 5 g de extracto de levedura, 5 g de NaCl por litro) contendo ampicilina na concentração de 8

100 mg/1 e esnamicina na concentração de 25 mg/1. Para uma densidade dptica a 600 nm correspondente a um valor compreendido entre 0,7 e 1>0 adicionou-se IPTG ate à concentração final de 2 mM. Decorridas mais 2,5 a 5 horas à temperatura de 37°C procedeu-se à colheita das células por centrifugação e purificou-se as FMT-muteínas de acordo com Tavernier et al. £J. Kol. Biol., 211, (1990)? ^93-501_J7. As estirpes de E. coli transformadas Ml5 (pREP^JPDS56/RBSII, Sphl-F^NTSer29) e Ml5 (pREP^f; pDS56/RBSII, Sphl-H^NTTrp32) Foram depositadas ao abrigo do Tratado de Budapeste relativo a patentes de invenção na Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM), em Braunschweig, Alemanha , a 19 de Novembro de 1990 sob os números de registo DSM 62^0 e DSK 62^-1, respectivamen-te.

Exemplo 2

Caracterização de Ser^-FotNT e Trp^^-Íb^NT a) Ligação diferencial e actividade biológica sobre células Hep-2 e U937

Cultura celular

Proporcionou-se o desenvolvimento de células Hep-2 £ ATCC nS CCL 23 J?, U937 /SmGne-GRE yspj & EAJI £ATCC n^ CCL 86_7 em meio RPMI 16^0 enriquecido com 10 % (v/v) de soro de vitela fstsl inactivado, L-glutamina (2 mM), piruvato de so dio (1 mM), 2-mercapto-etanol (5χ10~^Μ), 1 % de 100 x uma mistura de aminoacidos não essenciais <£*Gibro Laboratories, c Páisley, Reino UnidoJ e gentamicina (25 mg/ml). Procedeu-se à colheita das células não aderentes (U937 e RAJI) depois de se ter atingido unia densidade de 1 x 10^ células/ml. Para as experiências de ligação proporcionou-se o crescimento das células Hep-2 aderentes até a confluência, efectuou-se a tripsi nação, procedeu-se à colheita e à inoculação em pratos de ?e- £ tri grandes (150 cm2) com uma densidade de 2,5 x 10 células/ml. Os pratos foram depois colocados numa incubadora em atmosfera de CO2 durante a noite. Uma vez que as células Hep-2 não são fortemente aderentes foi possível colher as células pelo mesmo processo utilizado para as células não aderentes. Utilizou-se meio de Pulbecco enriquecido com 10 %de.soro,de vitela recém--nascida inactivado para 0 desenvolvimento das células L929.

Determinação das actividades específicas sobre as células L929, Hep-2 e U937

Determinou-se a quantidade de proteína utilizando reagente corante proteico da Biorad (Richmond, CA, E.U.A.), de acordo com as instruções do fabricante. Determinou-se a pureza das FNT-muteínas através do ensaio SDS-PAGE.

Dereminou-se a actividade citotéxica sobre as células L929 do murganho recorrendo a um ensaio normalizado para as células L929 (Ruff e Gifford in Lymphokines. ed. por Ξ. Pick, Orlando, USA, Academic Press, 1981, Foi. 2, 235-275). 0 ensaio de citotoxicidade sobre as células Hep-2 foi efectuado de forma idêntica ao do ensaio sobre as células L929 com a énica ex-cepção de se ter utilizado cicloheximida (50/hg/ml) em vez de

actinomicina D . 3nsaio de ligação do reeeptor

Iodação dos Fo£NT e Trp^2-FNT

Dissolveu-se 5 yz de iodogáneo (Pierce, USA) em 10y*l de cloroformio e secou-se sob uma corrente de azoto num peque no tubo de vidro. A este produto adicionou-se 10jsQ. de Na^2^! (Amersham, 100 miCi/ml em tampão borato 0,1 M, pH 8), e manteve-se em gelo durante 15 minutos. Com o auxílio de uma pipeta transferiu-se rapidamente este solução para um tubo de 2ppendo rf contendo 5 fiè de ft£NT ^enãica et al., s.aou 3,2/lug de Trp·3 -FNT em 10^0. de tampão fosfato a pH 8. De novo se manteve a mistura reaccional em gelo durante 15 minutos. Para se efectuar a separarão do Β^,ΝΤ iodado do Na^"2^I equilibrou-se primeiro uma coluna de filtração em gel PD-10 (Pharmacia) com tampão de fosfato 0,1 M + 0,25 % de gelatina e efectuou-se um ensaio preliminar com ljjig de Fc^NT ou TrpJ -FNT, consoante a espécie de FNT iodado. Depois carregou-se a mistura reaccio nal na coluna e procedeu-se s recolha de fracções com apro ximadamente 4-00 jpl a partir das quais se retirou alíquotas de 2 Jil para contagem num contador (LKB 1275 Kinigamma, Pharmacia LKB, Uppsala, Suécia). Obteve-se uma radioacti-vidade específica de 10-75 s 80 ^aCi/mg, respectivamente, pa_ ra ΒίχΝΤ e Trp32-FNT.

Determinação do valor Kp dos ShjNT e Trp·3 -FNT mares- dos por análise de Seatchard

Procedeu-se a uma diluição sequencial em diveissos pas % sos segundo um factor 2 no intervalo compreeendido entre 12,8 nM e 0,006 nM, dos JtyNT ou Trp^-FNT marcados, recorrendo a uma placa de microtitulação. Cada diluição foi preparada em triplicado. Mediu-se a ligação não específica através do mesmo procedimento, em que cada ponto continha um excesso 100 vezes superior de FNT não marcado (1,28 m a 0,6 nM). A cada cavidade adicionou-se a£roxlmadamente 2 x 10 células (U937), Hep-2 ou BAJI;. Efectuou-se a raaeção em 0,2 ml de meio de cultura tecidual contendo 0,1 % de NaN^ durante 2 s 3 horas à temperatura de í+°C. Depois procedeu-se a transferência de amostras das placas de microtitulação para pequenos tubos de pléstico (Micronic Systems) contendo já 300 <Jxl de ftalato oleoso (ftalato de dinonilo a 33 ftalato de dibutilo a 66 % (v/v)). Submeteu-se os tubos à centrifugação numa microcentri fugadora (Eppendorf) durante 10 minutos para precipitar as cé lulas, separando-as depois do sobrenadante utilizando o dleo ftalato como meio de separação. Apés a inversão dos tubos foi possível isolar facilmente o granulado celular (agora na parte superior) fundindo a parte superior dos tubos com um escalpelo quente. Mediu-se a quantidade de radioactividade ligada- às 'Cf lulas através de uma contagem num contador . A partir desses resultados determinou-se uma curva de Scatchard e poste-riormente calculou-se a constante de dissociação utilizan do 0 tipo »H0T" de ligação em equilíbrio no programa EBDA/LI GAND Z*Mc. Pherson et al., J. Pharmacol. Methods. 1^. (I9S5) 213-228J.

Determinação de Kn do FWT mutante £Ser29-lhfNT e 2

TrpJ -BtyNT J por análise de competição

Os resultados de Scatchard demonstraram que uma concen tração de 0,½ nM para o í^NT marcado radioactivamente era sufi cientemente elevada de modo a exibir um sinal nitidamente de- tectável, situgndo-se na parte linear das curvas de saturação.

Todavia, esta concentração foi também síificientemente baixa pa ra permitir a adição até $000 vezes em excesso de FNT mutante frio (2 AM), necessário para efectuar a experiência de competi ^ 12ς ção na qual o -'I-FNT de tipo selvagem constitui o ligando pri mário e o mutante frio constitui o competidor.

Preparou-se em placa de microtitulação um conjunto de 10 cavidades diluindo em série FNT mutante não marcado (2 mM a Ο,ΟΟ^^ίΜ) correspondendo os sucessivos passos de concentração ao factor 2. Nas duas cavidades restantes havia, respecti vamente, ausência completa de FNT não marcado (ligação total) e 5000 vezes em excesso de FNT não marcado de tipo selvagem (contraste). Adicionou-se a todas as cavidades 0,^ nM de BtyNT marcado radioactivamente (10-75 .^aCi^Ug). Após a adição de 2 x 10^ células 0 volume total foi de 0,2 ml/cavidade. 0 meio de incubação, as condições de reacção e de isolamento das célu las foram exactsmente os mesmos descritos antes para as experi ências das análises de Scatchard. Mediu-se cada ponto em triplicado e efectuou-se as experiências de dissociação duas vezes, estando a média dos dois valores indicada no Quadro 1. Recorrendo ao método "DRUG" do programa EBDA/LIGAND (s. a,) foi possível efectuar 0 traçado das curvas da competição e calcular os valores das muteínas. Para esses cálculos aa c % foram utilizados os seguintes resultados experimentais: 1. Marcação do FNTh o 1,2x10 dpm/5 jpig =3,7x10^ dpm/pmole =+10 çiCíjpg 5,3xl08 dpm/3,2 =1,9x10^ dpm/pmole =+75 primeira marcação (=lote 1): segunda marcação (=lõfee 2); 2,, Determinação do valor Κβ do FNT de tipo primitivo

Mediu-se o valor KD do 12^I-FNT (lote 1) em célu las Hep-2 e U937 pela análise de Scatchard.

Hep-2: = 9,17xlO“10 Π937: KD = 2,5xlO"10 3. Experiências de competição

Todas as experiências de deslocamento foram efectuadas utilizando ^2^I-FNT (lote 1) como ligando primário, com a ex-cepção da experiência B.3 (Quadro B, 3·)> em que se utilizou 125I-FNT (lote 2).

Em cada experiência mediu-se em triplicado a ligação para cada valor de concentração representando-se nos Quadros (A-D) seguintes apenas os valores médios.

Para cada experiência representada nestes Quadros calculou-se o valor utilizando o programa de Mc.Pherson et al. (1985)· A média das determinações relativas aos valores (duas experiências para Ser^-Fc^NT em células Hep-2 e em 3ͱ ¢: cálula3 Hep-2 θ dro 1. U937? duas experiências para Trp32-r^NT em células três em células U937) encontra-se representada no Qua

Quadro A

Competição com Ser29-i**NT Média dpm 1. 2120 1869 1779 1719 1708 1575 1*4-15 1320 1200 983 9*+9 632 533

Contraste 299 2 · 101*4· 635 603 5*4-1 572 em células 11937 concentração de mutante £molj7 0 1χ1θ“9 2xlQ“9 *4-xl0~9 8xlCf9 l,6xl0"8 3,2xl0"8 6,*fxlO“8 l,25xl0'7 2,5xl0”7 5xlQ'7 lxlO”6 2x10“ 0

ItxlO'9 8xl0“9 l,5x!0“8 -8 3x10 489 489 2. 413 380 319 263 238

Contraste 205 ~ 32

Competição com TrpJ 1. 2120 1917 1698 1655 1585 1488 1377 1333 1166 1026 953 777 628

Contraste 299 1047 653 629 636 6xl0"8 l,2xl0"7 2,5xlO“7 5xl0"7

IxlO"6 2x10 0

Quadro B fbíNT em células U937 0

IxlO"9 2xlQ"9 4x10""^ 8xl0“9 1£x1Q"8 -8 3x10 0 6xl0“8 l,25xl0"7 2,5xio"7 5xio“7 1x10"6 -6 2x10 D 0 4xl0"9 8xl0"9 ι,5χΐο"8 36

585 5k6 3xl0"8 6x10"8 508 k?9 15 2x1o"'7 2,5xl0“7 k22 5xio"7 357 1,1o"6 29k 2xl0“6 Contraste: 2lk 3. 83^0 0 (efectuado *+759 >fxl0"9 com 125i-Fm; ^1 8xl0"9 lote 2) 3620 1,5x10" 3275 3x1o"8 303^ 6xlO"8 2387 1,25x10 1981 2,5x10" 1^72 5xlO"7 1192 lxio"6 8l*+ 2xl0"6 Contraste; 307 Quadro _C Competição com Ser29· em células Hep-2 1. 938 0 799 IxlO"9 677 2xl0"9 56^ ^xlQ"9 510 _ -Q 8x10 "

Contraste Competição com

Contraste; 2. k5i l,6xl0“8 kk2 3 j2xl0*"8 kk6 6,^xlO"8 379 l,2xl0-7 37^ 2,5xl0“7 ^37 5xio“7 359 lxlO”6 383 2x1 θ'"8 353 *+57 0 273 , -Q *+xlQ ' 2*+0 8xlO“5 253 l,5xlO“8 235 3xl0‘8 207 óxlO”8 239 1,2χ1θ“7 215 2,5xl0“7 211 ^xl0“7 193 lxl0“6 238 2X10“6 215 Quadro D

Trp32-Fc*NT em células Hep-2 938 0 7*+2 -a 1x10 7 Ó08 2xlO"9 537 í+xlO’"^

Contraste: 2. Contraste: 5^7 8xlG~9 397 l,6xlO"8 39^ 3,2xl0“8 1+05 ο,ϊ+χίΟ*"8 395 1,25x10"' 388 2,5xl0“7 379 5xlO"7 353 -6 1x10 0 386 2xlG“6 353 ¥+5 0 298 too"9 222 8xlO~9 256 l,5xlO"8 202 3xlO"8 227 6xl0“8 210 l,2xl0"7 221 2,5xl0“7 197 5xio"7 231 lxl0“6 202 2x10 0 203

Qua-

Quadro 1

Hep-2 U937 L929 actividade actividad* Afinidade específica afinidade específica (V (U/mg) (¾) (U/mg) FôíNT 9,17xl0“10(ií<) 2,9x10^ 2,5xl0"10^ 2xl07 (100 %) (100 fo) (100 %) (100 %) Ser29-8*NT Ι,ΟόχΙΟ"9 9,3xl0‘6 5,07x1o"8 10 5 (86,5 %) (32 %) (0Λ9 fo) (0,5 '$) Trp29-F<*NT Ι,ΟόχΙΟ"9 if,5xio'7 3,53x1o'8 όΛχίο1* (36,5 >) (155 f) (0,71 S) (0,32 í)

Os valores assinalados por um asterisco (*)..'fo ram obtidos por análise de Scatehard. Todos os outros valores Kp foram determinados por análise de competição. Os valores relativos (em percentagem em relação ao Fo^NT) estão indicados entre parêntesis. E possível verificar que a constante de ligação (Κβ) de Ser 7-]j^NT e Trp^ -F<<NT determinada com células Hep-2 (as quais suportam apenas o R-FNT-P55) é praticamente idêntica à do R*NT. Verifica-se também que a actividade biológica (acti-vidade específica), nessas células é amplamente retida (nota--se que a precisão deste ensaio corresponde apenas a um factor 3). Surpreendentemente, a afinidade de ligação (medida no ensaio de competição) dos Ser29-B^NT e Trp^2-B^NT para as células U937> a qual suporta predominantemente - mas não exclusi

*fO

vamente - o receptor de alta afinidade R-FNT-p75> foi grande-mente perdida (aumento de valor de um faetor superior a 100). Deve notar-se também que a actividade biológica dos Ser^-EfcíNT e Trp^-PbtNT, determinada pelo ensaio normalizado com base nas células L929, foi grandemente perdida (diminuição de um faetor superior a 100). b) Ligação diferencial aos R-FNT-p75 humano e

In ui ——r—n—»»11·—mu—iiiiw 11· «1—·—ww>·mmmmemmieμηιμμμ»——w»——· R-FNT-P55 humano A competição do 12^I-R>aNT humano que se liga pelos Trp^-ifc<$T e Ser2^-F&tNT e F^NT humanos aos receptores de FNT purificados a partir das células HLÓO foi determinada confor me se descreve a seguir. Dissolveu-se alíquotas de 2jol dos R-FNT-p55 e R-FNT-p75 nativos purificados conforme descrito no pedido de patente de invenção europeia Rs 90116707.2, segundo valores de concentração aproximadamente correspondentes s 0,3 mg/ml em Hepes 20 mM, Tris 50 mM, NaCl 50 mM, SDTA, 1 mM, 0,1 % de octilglucosido, 0,1 mg/ml de BSA, pH 8,0, e com essa solução manchou-se em triplicado filtros de nitrocelulose pré-humedecidos. Os filtros foram bloqueados com tampão de bloqueio ( Tris 50 mM, NaCl 1^0 mM, EDTA 5 mH, 0,02 % de NaN., 1 % de leite em pó desnatado) durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS procedeu-se à incubação dos filtros com 12^I-Bb^NT na concentração de 10 ng/ml e para valores variáveis das concentrações dos TrpJ -Fo^NT ou Ser --F^NT ou F^NT, durante a noite e a temperatura de k°C. Proce deu-se à lavagem dos filtros com tampão de bloqueio (duas ve* zes durante 5 minutos) e com água (uma vez durante 5 minutos), secou-se ao ar e procedeu-se à contagem num contador de raios 'jj”. Os resultados encontram-se indicados nas Figuras la e 11¾ indicando a Figura 1 a ligação do Fe^WT (rectangulo aberto), Ser^-Fc*]SIT (círculos a cheio) e Trp^-Eb^NT (rectangulo a cheio) ao R-FNT-p75 humano no caso da Figura la e ao R-FHT-P55 humano no caso da Figura 1b .

Exemplo 3

Purificação de Trp^-íbcJNT

As células transformadas obtidas em conformidade com o exemplo 1 foram processadas do modo seguinte: a) Abertura com prensa French, adição de polietile noimina até a concentração final de 0,^ pH 7*6$ remoção do precipitado. b) Precipitação do sulfato de aménio a pH 7*2; frac-ção 30-70 %, c) Diélise contra sulfato de aménio a 25 % em Tris 10 mM, pH 6,8. d) Coluna fenil-sefarose CL-^B (35 x 250 mm).

Carregada em sulfato de aménio a 25 % - Tris 10 mM, pH 6,8.

Sluição: gradiente de sulfato de amonio a 25 -^/tampão Tris até 20 mM de etanolamina, pH 9 (duas veres 150 ml). e) Coluna Mono Q (HR 16/10).

Csrga em etanolamina 20 mM, pH 9. Sluição: 1gradien-

te (duas veres 300 ml) no mesmo tampão, variando desde 0 até 1 M em cloreto de sédio (Pharmacia, FPLC). As fracções acti7 vas sofreram diálise na presença de tampão fosfato 0,01 M, a pH 7. f) Coluna de hepsrina/sefarose CL-6B (30 x 80 mm) Carregada em tampão fosfato 0,01 M, a pH 7. Bluição com um gradiente no mesmo tampão variando desde 0 até 1 M em cloreto de sédio. g) As fracções activas foram concentradas em "amicon" (sistema de micro-ultrafiltraçio 8 MC; membrana 0 de 25 mm; "diaflo" 10 YMiO - 25 mm) e depois carregou-se separadamente numa coluna de filtração de gel (Ultrapac TSK G-2000 SWG; 21,5 x 600 mm) equilibrou-se em fosfato 0,01 M, a pH 7 e cloreto de sédio a 0,9 %. LPS (determinado pelo teste com estojo de Kabivitrum); A fracção mais activa continha Trp^1 2-Fc<NT com uma con centração de 5 mg/ml; teor em endotoxinas: 26 U.E./mg. A última fracção activa continha FNT com a concentração de 1,8 mg/ml e proteína com a concentração de k7 U.E./mg.

Exemplo *f 1

Efeito anti-tumor dos F^JíTh e IFH ^-h sobre tumo- res subcutâneos das células HT-29 em murganhos rapados 2

Injectou-se subcutaneamente em murganhos rapados 5χ10^ células HT-29 do adenocarcinoma do colon dos seres humanos /Tatcc HTB38 J, Cada grupo continha 5 murganhos. 0 tratamen- to consistiu em injecções perilesionais diárias durante 6 dias por semana, seguindo-se um dia sem tratamento . Os resultados encontram-se representados na Figura na qual "PBS" signifi-sa uma solução salina tamponada com fosfato tal como é conheci do na especialidade. :A.S®ta simples indica o início do tratamento com 5jag dé FotNTh ou com 0000 UI de Interferão humano (í'FN Jçvh) ou com ambos. A seta dupla indica o tempo necessário para dobrar essas doses e a seta cruzada indica o fim do tratamento.

2. Comparação do potencial snti-tumor dos FeiNTh e Trp32-íôtNT

Injectou-se subeutaneamente em murganhos rapados 0x10 células HT-29 do adenocarcinoma do cdlon dos seres humanos.

Cada grupo continha 5 murganhos. 0 tratamento teve início no 6s dia apás a inoculação e consistiu em injecções perilesionais diárias durante 6 dias por semana. Avaliou-se o volume do tumor cada 3 ou *+ dias medindo o diâmetro maior (a) e menor p k (b) e calculando o valor a x b x.O,^ de acordo com Attia s Weiss, tal como é conhecido na especialidade. Os resultados estão representados na Figura 5 na qual a seta indica o . início do tratamento e os triângulos abertos com vértice para baixo referem-se a UI de IFN^-h e 10 Jig %NTh, os triân- gulos a cheio com vértice para baixo referem-se a 10 UI de IFK^h e 10jig de Trp-^-FNT, os rectangulos a cheio referem--se a 10Jig de Fo^NTh, os triângulos abertos referem-se a so lução salina tamponada com fosfato e os círculos a cheio refe- rem-se a 10^ UI de IFN^"-h. Nos ensaios in vitro, não existe qualquer diferença na citotoxicidade para as células Hep ou HT-29 entre os FQ^NTh e Trp^-FO^NT.

Exemplo 5

Preparação de Ser^-Trp^-FQÍNT 9Q ^9

Preparou-se Ser -Trp -F^CNT conforme descrito no Exemplo 1 com as excepções seguintes: 1. O oligononucleótido utilizado continha a sequência seguinte (as bases mutadas estão sublinhadas): 5'GGGCATTGGCCCAGCGGTTGGACCACTGGAGC3' 2. Destruiu-se um sítio Nci 1 ao mesmo tempo que se criava um sítio Ava 2, permitindo verificar a presença da mutação por análise do fragmento de restrição. Não foi efec-tuada qualquer análise de hibridação. Efectuou-se o desenvolvimento de 6 clones resultantes da transformação WK6 e preparou- se o ADN e efectuou-se a análise conforme descrito no Exemplo 1. Verificou-se que 3 dos 6 clones sofreram a mutação .

Esta sequência de ADN foi subclonada no vector de expressão pDS56., gerando o plasmídeo pDS56/RBSII, Sphl--F(&NTSer29Trp32 e tranformou-se na estirpe E. coli M15. A expressão e a purificação foram efectuadas conforme descrito no Exemplo 1. ifl

Exemplo 6

Preparação de Gly^-FQÇlflT, Tyr29-^MT gjyg32-]^

Preparou-se os Gly^-S^NT, Tyr^-íòtNT e Tyr32-F*NT conforme descrito no Exemplo 1 com a excepção indicada a seguir. Foram utilizados oligonsacleótidos contendo um codão totalmente degenerado na posição 29 ou 32, originando uma inserção aleatória de todos os lo- aminoócidos em uma das duas posições. A sequência desses oligonucleótidos 4 a seguin te:

Posição 29: 5'CCACGCCATTCGCGAGGAGGGCATTGGCCCGGCGGTTXXXCCACTGGAGC3'

Posição 32 51CCACGCCATTC GC G AGGAGGGCATTGGCXXX GCGGTTCAGCC3' em que X - A, C, G ou T e as bases mutadas estão sublinhadas.

Em conjunto com a mutação introduziu-se também um sítio Nru-1 dnico. Assim, em vez de se transformar directamen te o agregado fasmido, isolado a partir da estirpe WIí6 mutS, digeriu-se primeiro este ADN com Nru-1, efectuou-se a slui-ção da banda linear a partir de gel de agarose, lágou-sé· e transformou-se na estirpe SURE (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Desta forma é possível seleccionar apenas os fasmidos que contêm as mutações. As 168 colónias obtidas foram inoculadas em placas de microtitulaçao, cresceram ate s confluência e submeteu-se os seus lisados a testes para verificação da activida.de biológica em relação a células Hep-2 conforme des- k6

crito no Exemplo 2a e para verificação de ligação diferencial conforme descrito no Exemplo 2b ou no Exemplo 8 . Tomando como base a actividade bioldgica e a ligação diferencial determinada de acordo com o Exemplo 2b ou com o Exemplo 8 , procedeu-se à selecção de coldnias e caracterizou-ss ainda por analise da sequência do ADN dos produtos de inserção correspondentes, conforme 4 conhecido na especialidade.

As sequências de ADN codificadoras para Gly^-Fo<,NT, Tyr^--Ft^NT e Tyr^-F^NT foram isoladas a partir das coldnias cor respondentes e clonadas em vectores de expressão bacteriana conforme descrito no Exemplo 1. As muteínas expressadas foram purificadas obtendo-se uma homogeneidade superior a 95 , através de um passo de cromatografia de permuta idnica em KONO-Q.

Exemplo 7

Preparação de Glu^-Fo^NT e Asn^-Thr^-FotNT Mutagénese do gene R^NT utilizando PCR

As reacções PCR foram efectuadas com o plasmídeo PDS56/RBSII, Sphl-Eb(NT £ Figura 3.7 que constitui a matriz de

Tm ADN utilizando um "Perkin-Slmer Cetus GeneAmp DNA Amplifi

TM cation Reagent Kit" com "AmpliTaq Recombinant Taq DNA Polymerase” (Perkin-Elmer Cetus, Vaterstetten, BRD) ZTver a Figura 8_7. Na reaeçao I foram utilizados os iniciadores 17/P (5'-GGCGTATCACGAG(K:CCTTTCG-3'; o iniciador 17/F 4 constituído pelos nucledtidos 39^9-3970 do plasmídeo pDS56/RBSII, Sphl- -F*NT) e 21 Aí5 (5-ATTGGCCCGCTÇGTTCAGCCACTGGAGCTGCCCCTC-3' ; o » precursor 21/K5 s constituído pelos nucleótidos que são complementares dos nucleótidos 219-18^· do plasmídeo PDS56/RBSII, Sphl-ífc<JíT, (as bases mutadas estão sublinhadas^ a reacção II continha os iniciadores 17/F e 21/M6 (5'-ATTGGGAGTGTTGTTCAGCCACTGGAGCTGCCCCTC-3'; o iniciador 21/MÓ e constituído pelos nucleótidos que são complementares dos nu cleótidos 219-18*+ do plasmídeo pDS56/RBSII, Sphl-E^HT, (as bases mutadas estão sublinhadas) e a reacção III continha os iniciadores 21/MR (5'-GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGG-3' ; 0 iniciador 21/MR e constituído pelos nucleótidos 220-2*+l do plasmídeo PDS56/RBSII, Sphl-Fo#T) e 17/0 (51-CATTACTGGATCTATCAACAGG-31; o iniciador 17/0 e constituído pelos nucleótidos que são complementares dos nucleótidos 7^8-727 do plasmídeo pDS56/RBSII, Sphl-FotNT). Em consequência, misturou-se 10Jil de ADR matriz (10 ng), $ jàl de cada um dos dois iniciadores (100 pmole de cada), lójx 1 de mistura de dRTP (1^B5 mM em dATP, dGIP, dCTP e dTTP), 10Jpl de 10 x tampão de reacção (Tris-HCl, 100 mM, pH 8,3, KC1, 500 mM, MgCl2 15 mM e 0,1 % de gelatina), l/il (5 unidades) de "AmpliTaq DRA po-limsrase" e 53 de agua, num tubo de eppendorf e cobriu-se com 80/Jul de óleo mineral (Perkin-Elmer Cetus). Os tubos foram transferidos para um termociclador de ADR (TRIO-Thermo-block, Biometra) e mantidos durante 1 minuto a temperatura de 9*+°C antes de terem sido efectuados 35 ciclos de fusão do ADR (1 mlnutosà temperatura de 9^°C), com recosimento dos ini? ciadores (1 minuto a temperatura de 50°C) e dilatação dos iniciadores (3 minutos & temperatura de 72°C). Decorridos mais 2 minutos à temperatura de 72°c deixou-se arrefecer as mistu k8

ras reaccionais até h temperatura ambiente e extraiu-se com cloroformio. Precipitou-se o ADN presente na fase aquosa < com etanol e submeteu-se a electroforese em gel de poliacril-amida a 6 % ^Sambrook et al., 1989J7· Apds coloração do ADN com brometo de etídio, isolou-se os fragmentos I, II e III £ ver a Figura 8; estes fragmentos foram obtidos a partir das reacções I, II e III, respectivamente J a partir do gel e procedeu-se à sua purificação </~Sambrook et al., 1989_7.

Preparação dos fragmentos de ADN que codificam

Glu3l-5bcNT e Asn31-!^32-^!.

Os fragmentos I, II e III foram fosforilados enzi-maticamente antes de terem sido ligados uns aos outros os fragmentos I e III e os fragmentos II e III em duas reacções paralelas £Sambrook et al.^ 1989J7. Apds inactivação a qyeri^ te de ligase e digestão com as enzimas da restrição EcoRi e HindIII submeteu-se o ADN a electroforese em gel de poliacril amida a 6 %. Após a coloração do ADN com brometo de etídio, isolou-se os fragmentos A e B de EcoRI-HindIII Z"ver a Figura hj a partir do gel e depois purificou-se £s.ã.J.

Preparação dos plasmídeos que codificam Glu3^-F<^NT e Asn31-Thr32-WI.

Em experiências separadas inseriu-se os fragmentos A e B de EcoRI-HindIII de acordo com métodos normalizados kTSambrook et al., 1989-7 no plasmídeo pDS56/RBSII, Sphl--Fò4NTSer29 aberto com EcoRI-HindIII originando os plasmídeos PDS56/RBSII, Sphl-Bc^NTGlu31 e PDS56/RBSII, Sphl-Âsn31Ihr32, respectivamente. Preparou-se 0 ADN do

plasmídeo [Birnboim et al., 1979] e confirmou-se a identidade da região codificadora para as FtyNT-muteínas por sequen ciação do ADN de cordão duplo [Sambrook et al., 1989].

Produção de Glu31-F«>CNT e Asn31-Thr32-Fô£NT

Os plasmídeos pDS56/RBSII, Sphl-FO^NTGlu31 e pDS56/RBSII, Sphl-FC£NTAsn31Thr32 foram transformados em célu las E. coli M15 contendo já o plasmídeo pREP4, através de métodos normalizados [s.a.]. As células transformadas desenvolveram-se ã temperatura de 37°C em meio LB [s.a.] contendo ampicilina com a concentração de 100 mg/1 e canamicina com a concentração de 25 mg/1. Ao atingir-se uma densidade õptica compreendida entre cerca de 0,7 e 1,0 medida a 600 nm adicionou-se IPTG até à concentração final de 2 mM. Decorridas mais 2,5 a 5 horas à temperatura de 37°C efectuou-se a colheita das células por centrifugação.

Exemplo 8

Ligação diferencial ao R-FNT-p75 humano recombinan- te e ao R-FNT-p55 humano recombinante 1. Utilizou-se suspensões de 10 ml de células de E. coli transformadas e induzidas expressando os FQ^NT humano recombinan te, Ser29-F<^NT, Trp32-FO(,NT, G1u31-FOCNT, e Asn31-Thr32-F«XNT [incluiu-se como controlo células de E. coli expressando a di-hi drofolato redutase recombinante (DHFR)] que foram centrifugadas a 4000 rpm durante 10 minutos e depois preparou-se nova suspensão em 0,9 ml de tampão de lise (Tris-HCl 10 mM, ph 8,0, EDTA, 5 mM, PMSF, 2 mM, benzamidina 10 mM, aprotinina na concentração de 200 unida-des/ml e lizosima na concentração de 0,1 mg/ml). Após 20 minu- c tos de incubação è temperatura ambiente adicionou-se 50jil de MgCl^ 1 M, 20Jil de ENasel na concentração de 5 mg/ml, 50 Jil de Na Cl 5 N e 50/&- de NP-i+0 a 10 % e incubou-se ainda a mistura à temperatura ambiente durante 15 minutos. Utilizan do 0,5 ml do lisado clarificado por centrifugação a 130Q0 rpm durante 5 minutos, submeteu-se a precipitação com sulfato de amónio (fracção 30 % - ?0 %). Dissolveu-sé 0 granulado de sulfato de amónio a 70 % em 0,2 ml de PBS e analisou-se pelo método SDS-PAGE para confirmar a presença de proteínas recombinantes.

Para 0 ensaio de ligação diferencial cobriu-se placas de microtitulação com R-FNT-P75 humano recombinante-IgG ^*3 hu mano e R-FNT-p55-proteínas de fusão de IgG^“3 humano (pedidos de patente de invenção europeia 3Ps. !+175ó3 e ^22339) dissolvido em PBS na concentração de 0,3Jàg/ml e 0,1 jig/ml, respectivamente, (100yil/csvidade, durante a noite e a tempe ratura de ^°C). Após o bloqueamento com tampão de bloqueio (Tris 50 mM, a pH 7,k, NaCl 1^0 mM, EDTA 5 mM, 0,02 % de NaN^, 1 % de leite em pó desnatado) procedeu-se a lavagem' da placa de 12 cr microtitulação com PBS e incubou-se com humano na concentração de 5 ng/ml (marcado pelo mótodo iodogeneo para uma actividade específica de aproximadamsnte 30 jxOi/jxg^ conforme descrito antes) na presença de soluções diferentes de lisado de coli parcialmente purificado por precipitação com sulfato de amónio. 0 volume foi de lOO^jil/eavidade e cada diluição foi testada em duplicado. Após decorridas 3 horas à temperatura ambiente lavou-se as cavidades muito bem com PBS e 51

procedeu-se à contagem num contador , Os resultados estão representados na Figura 6 em que os círculos fechados se re«. ferem à ligação ao R-FNT-p55-IgG^3 humano e os círculos abertos se referem a ligação ao R-FNT-p75-IgG^3 humano. 2. A determinação da ligação de Ser^-Trp-^-Fo(RT, Gly^-K*NT, Tyr^-P^NT e Tyr^-FotNT foi efectuada conforme descrito no parágrafo 1, com a dnica excepção de se ter uti lizado muteínas purificadas por cromatografia de /permuta iónica em MONO-Q. Os resultados estio indicados na Figura 7 na qual os círculos abertos e fechados têm os significados definidos para a Figura 6 e, ^/ig/ml indica a quantidade de mu teína purificada/ml.

Rei-

Claims (17)

1. R Ε I V I ndicações 1,- Processo para a preparação de uma mutelna do Factor de Necrose Tumoral humano ou de um seu sal farmacêutica mente aceitávelt possuindo essa mutelna uma sequência do FNT modificada por supressão, Inserção e/ou substituição de um ou .vários amínoãcidos de tal modo que a mutelna apresente uma diferença significativa entre as suas afinidades de ligação ao Receptor do Factor de Necrose Tumoral humano p75 e ao Receptor do Factor de Necrose Tumoral humano p55, caracterízado pelo facto de se cultivar células hospedeiras transformadas com um vector de expressão que incorpora uma sequência de &DN que codifica essa mutelna num meio adequado e de se isolar essa mu-

   teína a partir da cultura sobrenadante ou a partir das próprias células hospedeiras e, eventualmente, de se converter essa mu-teína em um. seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. 2.- Processo de acordo coma reivindicação 1, carac terizado pelo facto de a sequência de aminoácidos do Factor de Necrose Tumoral humano ser 1 10 VAL ARG SER SER SER ARG THR PRO SER AS? LYS PRO VAL ALA HIS 20 30 VAL VAL ALA ASN PRO GLN ALA GLU GLY GLN LEU GLN TR? LEU ASN 40 - ARG ARG ALA ASN ALA LEU LEU ALA ASN GLY VAL GLU LEU ARG AS? 50 60 ASN GLN LEU VAL VAL PRO SER GLU GLY LEU TYR LEU ILE TYR SER 70 GLN VAL LEU PHE LYS GLY GLN GLY CYS PRO SER THR ais VAL LEU 80 90 LEU i nR KIS THR X -Lj£i SER ARG ILE ALA VAL SER TYR GLN THR LYS 100 VAL ASN LEU LEU SER ALA ILE LYS SER PRO CYS GLN ARG GLU * l-iv 110 120 FRO GLU GLY ALA GLU ALA LYS PRO TRF TYR GLU PRO ILE TYR LEU 130 GLY GLY VAL PHE GLN LEU GLU LYS GLY ASP ARG LEU SER ala GLU 140 150 ILE ASN AEG PR.0 ASP TYR LEU AS? PKE -Λ Λ Jt-j *rt GLU SER GLY GLN VAL 157 7YP- ?HE GLY i ij Ci ILE ALA. LEU,
3. 3.- Processo de acordo com. a reivindicação 2, carac térizado pelo facto de a referida sequência de aminoácidos ser modificada por substituição de um ou vários, de preferência de um ou ' dois aminoácidos por outros aminoácidos, de preferên cia os aminoácidos que ocorrem naturalmente.
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 2, carac térizado pelo facto de a referida sequência de aminoácidos ser modificada na posição 29 em conformidade com a reivindicação 3.
5. 5. - Processo de acordo com a reivindicação 4, carac térizado pelo facto de o referido aminoácido que ocorre natural mente ser a serina.
6. 6. - Processo de acordo coma reivindicação 4, carac térizado pelo facto de o referido aminoácido que ocorre natural mente, ser a glicina.
7. 7. - Processo de acordo coma reivindicação 4, carac térizado pelo facto de o referido aminoácido que ocorre natural mente ser a tirosina.
8. 8.- Processo térizado pelo facto de a de acordo com a reivindicação 2, carac referida sequência de aminoácidos ser

   modificada na posição 32 em conformidade com a reivindicação 3.
9. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, carac terizado pelo facto de o referido aminoãcido que ocorre natural mente ser o triptofano.
10. 10, - Processo de acordo com a reivindicação 8, carácter ina do pelo facto de o referido aminoãcido que ocorre natu ralmente. ser a tirosina.
11. 11. - Processo de acordo com a reivindicação 2 , ca-racterizado pelo facto de a referida sequência de aminoãcidos ser modificada na posição 31 em conformidade com a reivindicação 3 .
12. 12,- Processo de acorda coma reivindicação 11, ca-racterizado pelo facto de o referido aminoãcido que ocorre natu ralmente. ser o- ácido glutâmico, 13,— Processo de acordo com a reivindicação 2, carácter iza do pelo facto de a referida sequência de aminoãcidos ser modificada nas posições 29 e 32 em conformidade com a rei víndicação 3. 56
13. 14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, ca racterizado pelo facto de o referido aminoãcido que ocorre naturalmente na posição 29 ser a serina, a glicina ou a tirosina, de preferência a serina e na posição 32 a tirosina ou o tripto-fano, de preferência o triptofano.
14. 15. - Processo de acordo com a reivindicação 2, ca-racterímado pelo facto de a referida sequência de aminoãcidos ser modificada nas posições 31 e 32. IS,- Processo de acordo com. a reivindicação 15, ca racterimado pelo facto de o referido aminoãcido que ocorre naturalmente na posição 31- ser o- ácido glutãmico ou a asparagina, de preferência a asparagina e na posição 32 ser a tirosina, o triptofano ou a treonina, de preferência a treonína. II.- Processo para a preparação de um análogo por supressão,· substituição e/ou adição de uma muteína obtida por um processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 4-16 ou de um seu sal farmaceuticam.en.te aceitável em que as posições 29 e/ou 32 ou a posição' 31 ou as posições 31 e 32 da refe rida muteína não são modificadas, possuindo esse análogo uma diferença significativa entre a sua afinidade de ligação ao Receptor do Factor de Necrose Tumoral humano p75 e ao Receptor

    do Factor de Necrose Tumoral humano p55, caracterizado pelo facto de se cultivar células hospedeiras transformadas com um vector de expressão que incorpora uma sequência de ADN que co difica esse análogo, num meio adequado, e de se isolar esse análogo a partir da culturá sobrenadante ou a partir das próprias células hospedeiras e, eventualmente, de se converter e:s se análogo em. um. seu sal farmaceuticamente aceitável.
15. 18.- Processo de acordo com. uma qualquer das reivin dicações anteriores, caracterizado pelo facto de as células hos pedeiras serem, células hospedeiras procariõticas ou eucarióti-cas inferiores. 19. — Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de as células hospedeiras procarióticas serem células de E.coli,
16. 20. - Processo de acordo com. uma qualquer das rei-. vindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o vector de expressão ser um. vector da família pDS.
17. 21. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se misturar um composto, quando preparado por um processo de acordo com uma qual quer das reivindicações anteriores, e eventualmente outras subs tâncias farmaceuticamente activas, com um veiculo não tóxico, inerte, terapeuticamente compatível, e de se converter a mistura resultante em uma forma de aplicação galénica. Lisboa, 20 de Novembro de 1991 ^ffente Oficial da Proríedad^ Imiti? \A S.<P