CN114957436A - 重组ninj2蛋白、编码该蛋白的基因、制备方法及药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组NINI2蛋白、编码该蛋白的基因、制备方法及药物组合物，重组NINI2蛋白的氨基酸序列为：(1)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或(2)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达出具有与序列SEQ ID No：2表达的蛋白质或多肽具有同等活性或相同生物学功能的蛋白质或多肽的氨基酸序列。本发明的重组NINJ2蛋白能通过阻断肝星状细胞活化通路，减少肝脏细胞外基质和胶原纤维沉积，最终来抑制肝脏纤维化的发生发展过程。

Description

重组NINJ2蛋白、编码该蛋白的基因、制备方法及药物组合物
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种重组NINJ2蛋白、编码该蛋白的基因、制备方法及药物组合物。
背景技术
肝纤维化是由多种慢性致病因素所致肝损伤或炎症后，肝组织修复过程中细胞外基质(ECM)过度沉积所致的病理过程与结果，是对导致肝损伤的肝脏产生的异常伤口愈合反应。由于产生的纤维瘢痕的存在，肝脏的结构被破坏，导致肝细胞丢失和肝脏正常功能的松弛，最终导致肝功能衰竭。肝纤维化是一个严重的健康问题。如果不治疗，会导致晚期肝硬化和肝细胞癌(HCC)。
肝纤维化是由于各种因素引起的慢性肝损伤的反应，如饮酒、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、病毒性肝炎(HBV)和丙型肝炎(HCV)、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和淤胆性肝病。往往我们认为肝脏纤维化是不可逆的。因此，如何有效控制肝脏纤维化的发生，成为了临床干预的基础。探明肝脏纤维化疾病分发病机理及寻找有效的干预方法，具有重要的临床及研究意义。
在肝纤维化的发生机制中，肝星状细胞(HSCs)活化是导致肝纤维化的中心事件。生长因子信号在肝星状细胞活化中起重要作用，主要通过血小板衍生生长因子(PDGF)信号传导。在肝纤维化时，HSC表面的PDGF受体以β受体为主，与PDGF-BB具有较强的亲和力，认为PDGF-BB以及PDGF-β在肝纤维化过程中的作用尤为突出。靶向降低或消除致病细胞因子PDGF-BB有助于治疗肝脏的纤维化。在纤维化疾病的发病过程中，血小板衍生生长因子(PDGF)在刺激肌成纤维细胞的复制、存活和迁移中起着重要作用。肝细胞通过释放多种细胞因子和生长因子，对HSC施加旁分泌刺激化合物，参与启动和维持HSC的激活。PDGFBB在这些表型反应,特别是星状细胞的增殖和趋化中起主要作用。
NINJ2基因相关研究极少，仅有的功能研究发现NINJ2可介导细胞之间的黏附，调控炎症通路。大型人群研究显示NINJ2可能还调控肥胖等相关表型。目前使用NINJ2蛋白对肝脏纤维化的治疗目前尚无报道。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了重组NINJ2蛋白、编码该蛋白的基因、制备方法及药物组合物，其目的在于重组NINJ2蛋白能通过阻断肝星状细胞活化通路，减少肝脏细胞外基质和胶原纤维沉积，最终来抑制肝脏纤维化的发生发展过程。本发明的重组NINJ2蛋白能制备用于预防或治疗肝脏纤维化或肝脏纤维化导致的代谢综合症的药物。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种重组NINI2蛋白，所述重组NINI2蛋白的氨基酸序列为：
(1)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或
(2)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达出具有与序列SEQ ID No：2表达的蛋白质或多肽具有同等活性或相同生物学功能的蛋白质或多肽的氨基酸序列。
进一步地，所述重组NINI2蛋白的氨基酸序列包括：与序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列同源性在80％-100％的编码具有相同生物学功能的蛋白质或多肽的氨基酸序列。
进一步地，所述重组NINI2蛋白在制备用于治疗或预防肝脏纤维化疾病或肝脏纤维化疾病导致的代谢综合症的药物中的用途；
按照本发明的另一方面，提供一种编码重组NINJ2蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1-3任一项所述的重组NINI2蛋白；
进一步地，其特征在于，所述核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
按照本发明的另一方面，提供一种重组NINJ2蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组NINJ2蛋白的制备方法包括：
S100：将NINJ2基因与His标签序列连接后，插入到原核表达载体pet28a的多克隆酶切位点处，构建含有NINJ2基因的重组质粒pet28a-NINJ2；
S200：将S100所述的重组质粒转染进入大肠杆菌BL21，并通过卡那霉素抗性筛选，得到具有抗生素抗性的阳性细胞克隆；
S300：将S200中得到的阳性细胞克隆扩增培养后，分离纯化后得到所述重组NINJ2蛋白；
进一步地，使用SEQ ID NO：3所示的正向引物和SEQ ID NO：4所示的反向引物,应用PCR方法从人的cDNA中克隆得到NINJ2基因。
进一步地，S300所述的阳性细胞克隆扩增培养包括IPTG诱导蛋白表达；
按照本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂以及权利要求1-3任一项所述的重组NINI2蛋白；
进一步地，所述药物组合物为注射液。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，本发明提供一种重组NINJ2蛋白、编码该蛋白的基因、制备方法及药物组合物，重组NINJ2蛋白能通过阻断肝星状细胞活化通路，减少肝脏细胞外基质和胶原纤维沉积，最终来抑制肝脏纤维化的发生发展过程。本发明的重组NINJ2蛋白能制备用于预防或治疗肝脏纤维化或肝脏纤维化导致的代谢综合症的药物。
附图说明
图1为本发明实施例生理盐水对照组及NINJ2治疗组肝脏纤维化小鼠的肝脏纤维化天狼星红胶原纤维染色结果图；
图2为本发明实施例生理盐水对照组及NINJ2治疗组肝脏纤维化小鼠的肝脏纤维化α-SMA免疫荧光染色结果图；
图3为本发明实施例生理盐水对照组及NINJ2治疗组肝脏纤维化小鼠的肝功能参数的丙氨酸转氨酶(ALT)指标图；
图4为本发明实施例生理盐水对照组及NINJ2治疗组肝脏纤维化小鼠的肝功能参数的天冬氨酸转氨酶(AST)指标图；
图5为本发明实施例生理盐水对照组及NINJ2治疗组肝脏纤维化小鼠的肝脏苏木素伊红(hematoxylin and eosin，H&E)图；
图6为本发明实施例重组NINJ2蛋白抑制肝脏纤维化机制图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：编码重组NINJ2蛋白的核苷酸序列
本发明实施例提供的一种编码重组NINJ2蛋白的核苷酸序列，其核酸序列为：
(1)由SEQ ID No.1所示的核酸序列；或
(2)与序列SEQ ID No.1限定的核酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的核酸序列；或
(3)SEQ ID No.1所示的核酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸密码子具有同等活性的由(1)衍生的序列。
SEQ ID NO:1
cccatcaacctgaaccattacgccaccaagaagagcgtggcggagagcatgctggacgtggccctgttcatgtccaacgccatgcggctgaaggcggtgctggagcagggaccatcctctcactactacaccaccctg
实施例2：体外纯化的重组NINJ2蛋白
本发明实施例提供一种重组NINJ2蛋白，重组NINJ2蛋白具有抑制肝脏纤维化的效果。
重组NINJ2蛋白的氨基酸序列为：
(1)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；或
(2)与序列SEQ ID NO：2限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同生物学功能蛋白质或多肽的氨基酸序列；或
(3)SEQ ID NO：2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达产物具有与序列SEQ ID No：2表达的蛋白或多肽具有同等生物学活性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2
Pro Ile Asn Leu Asn His Tyr Ala Thr Lys Lys Ser Val Ala Glu Ser MetLeu Asp Val
Ala Leu Phe Met Ser Asn Ala Met Arg Leu Lys Ala Val Leu Glu Gln GlyPro Ser Ser
His Tyr Tyr Thr Thr Leu
实施例3：构建含有NINJ2基因的重组质粒
本发明实施例提供了一种构建含有NINJ2基因的重组质粒的方法，包括以下步骤：
步骤一NINJ2蛋白基因的克隆：使用SEQ ID NO：3所示的正向引物和SEQ ID NO：4所示的反向引物,应用PCR方法从人的cDNA中克隆得到NINJ2基因。
步骤二 含有NINJ2基因的重组质粒的构建：将人源NINJ2基因与His标签序列连接，并插入到表达载体pet28a的多克隆酶切位点处，得到pet28a-NINJ2质粒，即为所述重组质粒。
SEQ ID NO:3
cccatcaacctgaaccattacg
SEQ ID NO:4
cagggtggtgtagtagtgaga
实施例4：重组NINJ2蛋白的制备方法
本发明实施例还提供一种重组NINJ2蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将人源NINJ2基因与His标签序列连接后，插入到原核表达载体pet28a的多克隆酶切位点处，构建含有NINJ2基因的重组质粒pet28a-NINJ2；
(2)将步骤(1)所述的重组质粒转染进入大肠杆菌BL21，并通过卡那霉素抗性筛选，得到具有抗生素抗性的阳性细胞克隆；
将表达菌株在20ml卡那霉素抗性的LB培养基中过夜培养。第二天，将这20ml培养基加入到1L卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃摇床培养2.5小时。
(3)将步骤(2)中得到的阳性细胞克隆扩增培养后，分离纯化后得到所述的抑制肝脏纤维化的重组NINJ2蛋白。
加入1mM的IPTG诱导蛋白表达。IPTG是一种高度稳定的乳糖类似物，它可以抑制lac阻遏蛋白，诱导β-半乳糖苷酶的合成。这种酶能促进乳糖的利用。IPTG能用来诱导被lac操纵子调控的目的基因的表达。加入IPTG诱导后，大肠杆菌在培养基中继续生长5.5小时。再离心培养基，4000rpm，4℃，10mins。如果不立即分离蛋白，则把大肠杆菌沉淀储存在-20℃。
纯化重组蛋白采用的是QIA expressionist高水平表达和六联组氨酸标记蛋白纯化手册(Qiagen)。
配制6ml缓冲液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM imidazole,0.05％Tween-20,pH8.0)，加入蛋白酶抑制剂混合物(6μg/ml chymostatin,1μg/ml E64,2μg/ml aprotinin,0.5μg/ml phosphoramidon,1μg/ml pepstatin A,5μg/ml leupeptin,5μg/ml antipain,0.1mM benzamidine(Sigma))。将缓冲液加入到1L培养基离心后的大肠杆菌沉淀中，重悬菌体，在悬浮液中加入1mg/ml溶菌酶(Invitrogen)，冰浴30分钟。利用超声波破碎仪的超声探头破碎悬浮液。功率300W，每次超声时间10s，间隙时间10s，进行6次。将破碎后的产物转入EP管中，离心(12000rpm，4℃，50min)。吸取上清液，保存在冰上。Ni-NTA琼脂糖珠用来从上清液中纯化带his-tag标签的蛋白。Ni-NTA金属螯合亲和层析对带有六联组氨酸标签的生物分子有非常高的亲和力。Ni-NTA珠子用5ml的PBS洗两次，将上清液加入到珠子中(每份珠子加1ml上清液)，混合液在4℃摇床孵育过夜。第二天，离心弃去上清液。珠子用缓冲液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM imidazole,0.05％Tween-20,pH8.0)洗三次，减少非特异性结合蛋白。6X-his tag标记蛋白用1ml洗脱液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,250mMimidazole,0.05％Tween-20,pH 8.0)洗脱。洗脱下来的蛋白透析两次，在4℃1X PBS中用Spectra/Por dialysis tubing(Spectrum Laboratories,Inc.,USA)进行透析。透析后将纯化的蛋白质分装保存在-80℃，即为本发明提供的重组NINJ2蛋白。
实施例5：重组NINJ2蛋白同源蛋白的制备方法
本发明实施例还提供一种重组NINJ2蛋白同源蛋白的制备方法，对含有重组NINJ2蛋白的氨基酸序列有80％-100％同源性的蛋白质(通过NINJ2蛋白序列截短或者突变获得的同源性蛋白)制备。包括以下步骤:
以真核表达的pcDNA3.1-NINJ2为模板，PCR扩增出NINJ2基因的全长和各个截短片段，所获得的各截短片段经双酶切后克隆至pet28a蛋白表达质粒中，将构建的NINJ2全长以及各截短质粒转化入大肠杆菌BL21中,采用IPTG诱导NINJ2基因截短融合蛋白表达,采用Western blotting法鉴定NINJ2基因截短融合蛋白的表达。其它步骤同实施例3。
实施例6：重组NINJ2蛋白在制备预防或治疗肝脏纤维化或肝脏纤维化导致的代谢综合症药物中的应用
一、实验过程
本发明采用C57BL/6小鼠给予胆碱蛋氨酸缺乏饲料(MCD)建立非酒精性脂肪肝动物模型，通过小鼠尾静脉注射重组NINJ2蛋白的方式验证其有效性：
1.1试验分组
将C57BL/6小鼠分为4组，每组小鼠12只：普通喂食给安慰剂组(STD+Saline)、普通喂食给重组NINJ2蛋白组(STD+NINJ2)、饮食诱导模型给安慰剂组(MCD+Saline)、饮食诱导模型给重组NINJ2蛋白组(MCD+NINJ2)；(STD为普通饲料喂食，MCD为胆碱蛋氨酸缺乏饲料，Saline为生理盐水。)
将实验小鼠随机分组，进行普通饲料喂食(STD)和胆碱蛋氨酸缺乏饲料(MCD)喂食。喂食1周后，通过小鼠尾静脉注射重组NINJ2蛋白或者相同剂量的Saline作为对照，每隔一天注射一次，持续2周。重组NINJ2蛋白给药剂量为0.2mg/kg。
动物处死取材：左手捉持小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg,IP)对小鼠进行麻醉，待小鼠无法自主翻身时。左手食指与拇指固定小鼠头部，剪掉小鼠眼眶周围多余的胡须和毛发。紧捏小鼠头部使小鼠眼球凸出，用镊子快速摘除小鼠眼球，让血垂直滴入准备好1.5ml EP管中。取血结束后将小鼠腹部朝上进行四肢固定，用镊子提起小鼠腹部皮肤，从近生殖器端下剪刀开口，沿腹中线向前剖至横膈膜，然后向两侧肋骨做横切，暴露腹腔和横膈膜。找到肝门静脉和下腔静脉，剪开下腔静脉，从肝门静脉入针用生理盐水进行灌流，灌流结束后用镊子夹起肝脏，剪断肝脏与腹腔连接处，取出完整肝脏。
二、实验结果
2.1对于小鼠的体重指标影响
对小鼠体重检测发现：MCD饲料饮食会引起小鼠体重下降，本实验中饮食诱导模型给重组NINJ2蛋白组小鼠体重自介入多肽治疗起，体重较对照组无持续下降趋势，说明重组NINJ2蛋白可能会对肝脏纤维化有抑制作用，具体情况需进行肝脏相应指标检测。
2.2对于小鼠肝脏纤维化的影响
(a)实验过程：
取小鼠新鲜肝脏使用4％的多聚甲醛过夜固定，固定后的组织用乙醇进行梯度脱水，然后先进行石蜡包埋，包埋后的石蜡组织在切片机上进行切片，保持每张厚度为10-12μm，用于后续免疫荧光和免疫组化染色。
1.免疫荧光染色
1.1石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。
1.2抗原修复：将切片浸泡在柠檬酸钠抗原修复液(pH＝6.0)中，95-100℃加热约30分钟，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
1.3画圈血清封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，甩干PBS，滴加BSA，封闭30min。(一抗是山羊来源用10％驴血清封闭，一抗其它来源的用3％BSA封闭)
1.4加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)
1.5加二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
1.6DAPI复染细胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
1.7淬灭组织自发荧光：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。
1.8封片：切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
1.9镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。
2.天狼星红染色
2.1切片入天狼猩红染液中染色8min，两缸或三缸无水乙醇脱水；
2.2脱水封片：切片再放入干净的二甲苯透明5min，中性树胶封片。
2.3显微镜镜检，图像采集分析。
(b)结果分析：如图1和图2所示：对比用重组NINJ2蛋白治疗的肝脏纤维化小鼠及使用对照Saline治疗的肝脏纤维化小鼠肝脏，重组NINJ2蛋白能显著抑制肝脏炎症的发生和发展。肝脏内弥漫性细胞外基质(特别是胶原)过度沉积是导致肝脏纤维化的主要原因，由于胶原纤维的沉积，α-平滑肌肌动蛋白表达量会显著升高。由于胶原呈碱性，与酸性染料天狼星红起强烈反应，它可以使胶原纤维产生明显的双折光现象，使胶原纤维呈现红色。从图1和图2中可以看出，用重组NINJ2蛋白治疗过的肝脏纤维化小鼠肝脏天狼星红染色看出胶原纤维(图1)和纤维化标志物蛋白α-SMA(图2)比使用对照Saline治疗的小鼠肝脏纤维化要少得多。
2.3对于小鼠肝功能指标的影响
(a)实验过程：
小鼠肝生化功能指标检测：全血标本于室温放置2小时后，用4°离心机3000转/分离心15min，取小鼠血清用于后续上机。采用双试剂法将R1，R2分别应用于全自动化生化分析仪，在全自动生化仪上设置好相应参数。将小鼠血清样本做好标记上样，全自动生化仪自动测定。
小鼠肝脏苏木素伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色：
1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min、二甲苯Ⅱ15min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、85％酒精5min、75％酒精5min、蒸馏水洗。
2.苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。
3.伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。
4.脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min、无水乙醇II 5min、无水乙醇Ⅲ5min、二甲苯Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片。
5.显微镜镜检，图像采集分析。
(b)结果分析：此外，本发明实施例中，相比对照Saline治疗组的小鼠，重组NINJ2蛋白治疗的肝脏纤维化小鼠肝功能有明显好转，如图3和图4所示，其肝功能指标：血清中ALT(图3)、AST(图4)浓度相比对照组显著升高并且具有统计学意义(P<0.01)。ALT指丙氨酸氨基转移酶，AST指天门冬氨酸氨基转移酶，是评价肝脏受损程度的指标。当肝脏发生了炎症、坏死、中毒等损害，ALT就会从肝细胞释放入血，当肝细胞严重损伤、危及线粒体时，AST也会进入血中。绝大多数情况下ALT和AST升高程度与肝细胞受损程度相一致，是目前最常用的肝功能检测指标。肝纤维化的小鼠在NINJ2重组蛋白的治疗下，血清中ALT、AST浓度降低，说明肝脏受损程度得到恢复，肝功能好转。图5的苏木素伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色显示，给予重组NINJ2蛋白治疗的肝纤维化小鼠的肝脏，与Saline安慰剂治疗的纤维化小鼠肝脏相比，炎性细胞浸润明显下降，肝细胞损伤性气球样变和脂滴明显减少。说明重组NINJ2蛋白能显著抑制肝细胞受损导致的肝纤维化(图5)，可用于治疗的肝脏纤维化。
综上所述，本发明的重组NINJ2蛋白能抑制小鼠肝脏纤维化。因此，本发明的重组NINJ2蛋白能制备抗肝脏纤维化药物，用于非酒精性脂肪肝或肝脏纤维化疾病的治疗。
基于以上实施例，作为一种可选的实施例，本发明提供的重组NINJ2蛋白能通过阻断肝星状细胞活化通路，减少肝脏细胞外基质和胶原纤维沉积，抑制肝脏纤维化的发展。
具体而言，如图6所示，NINJ2蛋白与IGF1R蛋白相互作用，通过调控PDGFBB基因的转录因子EGR1，调控PDGFBB蛋白的合成。本发明所述的重组NINJ2蛋白可使肝细胞NINJ2蛋白失去功能，无法与IGF1R蛋白相互作用发挥正常功能，从而抑制下游PDGFBB蛋白的合成，使肝细胞PDGFBB分泌量减少，阻断通过旁分泌化合物PDGFBB蛋白途径激活的HSC通路，减少肝脏细胞外基质和胶原纤维沉积，最终来抑制肝脏纤维化的发生发展过程。
基于以上实施例，作为一种可选的实施例，本发明所述的重组NINJ2蛋白可用于制作治疗或预防肝脏纤维化或肝脏纤维化导致的代谢综合症的药物。
基于以上实施例，作为一种可选的实施例，本发明所述的重组NINJ2蛋白可与任一种或几种医学上可接受的药物赋形剂结合制作治疗或预防肝脏纤维化或肝脏纤维化导致的代谢综合症的药物组合物。
优选的，所述药物组合物为注射剂。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0003655120610000131
Figure BDA0003655120610000141
序列表
<110> 华中科技大学
<120> 重组NINJ2蛋白、编码该蛋白的基因、制备方法及药物组合物
<141> 2022-05-20
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 138
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cccatcaacc tgaaccatta cgccaccaag aagagcgtgg cggagagcat gctggacgtg 60
gccctgttca tgtccaacgc catgcggctg aaggcggtgc tggagcaggg accatcctct 120
cactactaca ccaccctg 138
<210> 2
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Pro Ile Asn Leu Asn His Tyr Ala Thr Lys Lys Ser Val Ala Glu Ser
1 5 10 15
Met Leu Asp Val Ala Leu Phe Met Ser Asn Ala Met Arg Leu Lys Ala
20 25 30
Val Leu Glu Gln Gly Pro Ser Ser His Tyr Tyr Thr Thr Leu
35 40 45
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cccatcaacc tgaaccatta cg 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cagggtggtg tagtagtgag a 21

Claims (10)

1.一种重组NINI2蛋白，其特征在于，所述重组NINI2蛋白的氨基酸序列为：
(1)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或
(2)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，表达出具有与序列SEQ ID No：2表达的蛋白质或多肽具有同等活性或相同生物学功能的蛋白质或多肽的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的重组NINI2蛋白，其特征在于，所述重组NINI2蛋白的氨基酸序列包括：与序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列同源性在80％-100％的编码具有相同生物学功能的蛋白质或多肽的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的重组NINI2蛋白，其特征在于，所述重组NINI2蛋白用于制备治疗或预防肝脏纤维化疾病或肝脏纤维化疾病导致的代谢综合症的药物。
4.一种编码重组NINJ2蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1-3任一项所述的重组NINI2蛋白。
5.如权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列的核苷酸序列包括：SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
6.一种重组NINJ2蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组NINJ2蛋白的制备方法包括：
S100：将NINJ2基因与His标签序列连接后，插入到原核表达载体pet28a的多克隆酶切位点处，构建含有NINJ2基因的重组质粒pet28a-NINJ2；
S200：将S100所述的重组质粒转染进入大肠杆菌BL21，并通过卡那霉素抗性筛选，得到具有抗生素抗性的阳性细胞克隆；
S300：将S200中得到的阳性细胞克隆扩增培养后，分离纯化后得到所述重组NINJ2蛋白。
7.根据权利要求6所述的一种重组NINJ2蛋白的制备方法，其特征在于，S100所述的NINJ2基因的获取包括：使用SEQ ID NO：3所示的正向引物和SEQ ID NO：4所示的反向引物,应用PCR方法从人的cDNA中克隆得到NINJ2基因。
8.如权利要求6所述的重组NINJ2蛋白的制备方法，其特征在于，S300所述的阳性细胞克隆扩增培养包括IPTG诱导蛋白表达。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂以及权利要求1-3任一项所述的重组NINI2蛋白。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为注射液。
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