CN117466992A - 一种纤连蛋白突变体及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纤连蛋白突变体及其制备和应用。所述纤连蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的纤连蛋白突变体由大肠杆菌等微生物发酵得到，不仅能实现高效可溶性表达避免复杂低效的复性操作，而且能保持促进细胞粘附、细胞迁移、细胞增殖与伤口愈合等高活性。而且本发明的纤连蛋白突变体分子量小，热稳定性高，发酵成本低、快速高效，不受来源限制，具有非常好的产业价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域。更具体地，涉及一种纤连蛋白突变体及其制备和应用。
背景技术
纤连蛋白（Fibronectin，FN），是一种存在于血液和细胞外基质中的高分子量糖蛋白，可与整合素跨膜受体蛋白结合细胞外基质（ECM），包括胶原蛋白、纤维蛋白原或纤维蛋白、糖胺聚糖、蛋白多糖等，使细胞外基质形成网络，还可结合细胞表面，使细胞粘附于细胞外基质上，从而在细胞粘附、生长、迁移和分化中发挥重要作用，对于伤口愈合和胚胎发育等过程至关重要。FN对于伤口愈合（炎症、增殖和重塑）过程中的组织形成与排列而言是不可或缺的，能介导多重组织伤口的愈合，包括皮肤、牙周组织、骨骼、心脏瓣膜、角膜、舌头和周围神经突的生长。如血浆来源的FN主要作用于伤口愈合的初始阶段，帮助形成凝块并组装细胞-ECM基质，且由血小板通过增加血小板结合位点的表达来帮助介导组装成纤维状基质；细胞来源的FN通过局部表达的FN组装来调节组织重塑的后期阶段；FN通过调节基质金属蛋白酶的表达来影响慢性伤口中的ECM重塑等。此外，FN还可用于护肤、治疗脊柱疾病、治疗烧伤等。
目前，FN的制备方法主要有两种：（1）以人血或动物血为原料进行提取，但从人体中提取的纤连蛋白数量极为有限，从动物中提取的纤连蛋白又可能存在病原体与免疫原风险，导致FN的应用领域受到极大的限制；（2）将重组DNA通过微生物（如大肠杆菌等）发酵获得重组FN，该方法获得的蛋白纯度、相对安全性与来源的可再生性均较高。因此，第（2）种方法成为目前学者们制备FN的首要选择，其中，大肠杆菌的发酵成本低、快速高效，使其成为了生产纤连蛋白的良好宿主细胞，但在以大肠杆菌发酵获得重组FN的过程中，纤连蛋白通常会以不溶于水的包涵体的方式表达出来，丧失了原有的生物活性，必须通过有效的复性操作才能得到有活性的纤连蛋白（李明才 冯作化 李东 张桂梅. 三结构域重组FN多肽表达质粒的构建及其表达产物性质的初步鉴定[J]. 生物工程学报, 2000, 16(4)474-477）。但是，复性操作会使纤连蛋白的活性减弱，制备成本显著上升，还增加了下游纯化的复杂性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种纤连蛋白突变体，由大肠杆菌等微生物发酵得到，能实现高效可溶性表达避免复杂低效的复性操作，且能保持高活性。
本发明的第一目的是提供一种纤连蛋白突变体。
本发明的第二目的是提供上述纤连蛋白突变体的编码基因。
本发明的第三目的是提供一种重组表达载体。
本发明的第四目的是提供表达上述纤连蛋白突变体的重组工程菌。
本发明的第五目的是提供上述编码基因、上述重组表达载体或上述重组工程菌在制备上述纤连蛋白突变体中的应用。
本发明的第六目的是提供上述纤连蛋白突变体在制备化妆品或医学用组合物中的应用。
本发明的第七目的是提供上述纤连蛋白突变体的制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种纤连蛋白突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1所示氨基酸序列：
QTAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDK。
本发明的纤连蛋白突变体由大肠杆菌等微生物发酵得到，不仅能实现高效可溶性表达避免复杂低效的复性操作，而且能保持促进细胞粘附、细胞迁移、细胞增殖与伤口愈合等高活性。
根据实际需要，所述纤连蛋白突变体的氨基酸序列还可包括融合蛋白标签切除蛋白酶序列、分泌信号肽序列、蛋白纯化标签序列（如HIS标签序列、GST标签序列、MBP标签序列、SUMO标签序列或NusA标签序列）中的一种或几种。
本发明还提供了上述纤连蛋白突变体的编码基因。
以本领域最常用的大肠杆菌密码子偏好性优化得到的核苷酸序列与毕赤酵母密码子偏好性优化得到的核苷酸序列为例，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQID NO:3所示。SEQ ID NO:2为根据大肠杆菌密码子偏好性优化得到的核苷酸序列，SEQ IDNO:3为根据毕赤酵母密码子偏好性优化得到的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列：
ATGCAAACAGCTGTACCACCACCGACCGACTTGCGCTTCACGAACATTGGTCCGGATACCATGCGTGTTACTTGGGCTCCGCCTCCGTCGATCGACTTGACCAATTTTCTGGTTCGTTACAGTCCGGTTAAGAACGAAGAAGATGTCGCGGAACTGAGCATCTCTCCGTCCGACAATGCGGTCGTGCTGACCAACCTCTTACCGGGTACAGAATATGTTGTGTCCGTGTCCTCTGTTTACGAGCAGCACGAGAGCACCCCGCTGAGAGGCCGTCAGAAAACTGTCTCCGACGTACCGCGTGACTTGGAAGTTGTGGCCGCAACCCCAACGAGCCTGCTGATTTCTTGGGATGCACCGGCGGTGACCGTGCGCTACTACCGTATCACCTATGGTGAGACGGGCGGTAATAGCCCGGTTCAAGAGTTCACCGTGCCGGGCAGCAAGAGCACCGCTACCATTAGCGGTCTGAAACCGGGCGTTGATTATACCATCACCGTGTATGCCGTGACGGGCCGTGGTGATAGCCCGGCGAGCAGCAAGCCGATTTCCATCAACTACCGCACCGAGATCGACAAATAA。
SEQ ID NO:3所示核苷酸序列：
ATGCAAACTGCCGTGCCACCGCCAACGGACTTGAGGTTCACGAACATTGGGCCAGACACCATGAGGGTCACATGGGCGCCTCCCCCGTCTATCGACCTAACAAATTTCTTAGTGAGATACAGCCCTGTTAAAAACGAAGAGGATGTCGCAGAACTTTCAATATCACCCTCCGACAACGCGGTAGTTTTGACCAATTTACTTCCAGGGACGGAGTATGTAGTAAGTGTGTCATCGGTGTATGAACAACATGAAAGCACACCTCTGCGCGGACGGCAGAAAACAGTCTCCGATGTCCCCAGAGATCTAGAGGTTGTGGCTGCCACGCCCACCTCTCTCCTGATTAGTTGGGATGCCCCGGCAGTTACTGTTCGGTATTACCGAATAACTTACGGAGAAACGGGTGGAAATTCCCCTGTACAGGAGTTTACTGTCCCGGGTTCAAAGTCGACAGCTACAATCTCGGGTCTCAAACCCGGCGTAGATTACACCATAACGGTGTACGCGGTCACTGGGCGTGGCGATAGCCCGGCATCTAGTAAGCCTATCAGCATTAATTATCGTACCGAGATAGACAAGTGA。
优选地，所述编码基因的核苷酸序列还包含启动子序列，如T7启动子序列或AOX1启动子序列等。
根据实际需要，所述编码基因的核苷酸序列还包括编码融合蛋白标签切除蛋白酶的核苷酸序列、编码分泌信号肽的核苷酸序列、编码蛋白纯化标签（如HIS标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签、NusA标签等）的核苷酸序列中的一种或几种。
本发明还提供了一种重组表达载体，含有上述编码基因。
优选地，所述重组表达载体为pET-26b、pET-32a、pET-9a、pPIC9K或pPICZα A。
本发明还提供了一种表达上述纤连蛋白突变体的重组工程菌。
优选地，所述重组工程菌含有上述重组表达载体。
进一步优选地，所述重组表达载体为pET-26b、pET-32a、pET-9a、pPIC9K或pPICZαA。
优选地，所述重组工程菌为含有上述重组表达载体的大肠杆菌或毕赤酵母。
进一步优选地，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
进一步优选地，所述毕赤酵母为GS115、X33或KM71中的一种或几种。
本发明的纤连蛋白突变体由大肠杆菌等微生物发酵得到，不仅能实现高效可溶性表达避免复杂低效的复性操作，而且能保持促进细胞粘附、细胞迁移、细胞增殖与伤口愈合等高活性。因此，上述编码基因、上述重组表达载体或上述重组工程菌在制备上述纤连蛋白突变体中的应用，以及上述纤连蛋白突变体在制备化妆品或医学用组合物中的应用，均应在本发明的保护范围之内。
此外，本发明还提供了上述纤连蛋白突变体的制备方法，即利用上述重组工程菌表达所述纤连蛋白突变体。
作为一种优选地可实施方案，所述制备方法为：利用SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列构建纤连蛋白重组质粒，经转化、诱导表达即得。
本发明具有以下有益效果：
1. 本发明提供了一种纤连蛋白突变体，由大肠杆菌等微生物发酵得到，不仅能实现高效可溶性表达避免复杂低效的复性操作，而且能保持促进细胞粘附、细胞迁移、细胞增殖与伤口愈合等高活性。
2. 本发明的纤连蛋白突变体分子量小（21kDa），热稳定性高，而且发酵成本低、快速高效，不受来源限制，具有非常好的产业价值。
附图说明
图1为细胞裂解上清液的电泳图。
图2为本发明纤连蛋白突变体的电泳图。
图3为市售重组人类纤连蛋白1～4的电泳图。其中，图3中的A为市售重组人类纤连蛋白1上样量2、4、6 μL时的电泳图，图3中的B为市售重组人类纤连蛋白2上样量2、4、6 μL时的电泳图，图3中的C为市售重组人类纤连蛋白3上样量2、4、6 μL时的电泳图，图3中的D为市售重组人类纤连蛋白4上样量2、4、6 μL时的电泳图。
图4为PBS、天然纤连蛋白、本发明纤连蛋白突变体的细胞划痕实验结果图。其中，图4中的A为PBS的细胞划痕实验结果图，图4中的B为天然纤连蛋白的细胞划痕实验结果图，图4中的C为本发明纤连蛋白突变体的细胞划痕实验结果图。
图5为市售重组人类纤连蛋白1～4的细胞划痕实验结果图。其中，图5中的A为市售重组人类纤连蛋白1的细胞划痕实验结果图，图5中的B为市售重组人类纤连蛋白2的细胞划痕实验结果图，图5中的C为市售重组人类纤连蛋白3的细胞划痕实验结果图，图5中的D为市售重组人类纤连蛋白4的细胞划痕实验结果图。
图6为细胞粘附实验结果图。其中，图6中的A为PBS的细胞粘附实验结果图，图6中的B为天然纤连蛋白的细胞粘附实验结果图，图6中的C为本发明纤连蛋白突变体的细胞粘附实验结果图，图6中的D为市售重组人类纤连蛋白1的细胞粘附实验结果图，图6中的E为市售重组人类纤连蛋白2的细胞粘附实验结果图，图6中的F为市售重组人类纤连蛋白3的细胞粘附实验结果图，图6中的G为市售重组人类纤连蛋白4的细胞粘附实验结果图。
图7为MTT法实验结果图。
图8为纤连蛋白突变体的热稳定性测试结果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 纤连蛋白突变体的设计
天然纤连蛋白由两个亚基组成，两个亚基之间由二硫键连接，每个亚基含有数个结构域，每个结构域包括三种重复的模块、2个选择性剪接位点（EIIIA和EIIIB）与1个可变区（V）。其中，三种重复的模块为：I型重复位点（纤连蛋白I）12个、II型重复位点（纤连蛋白II）2个、III型重复位点（纤连蛋白III）15～17个。
现有研究通常使用纤连蛋白III 8～10结构域，但我们在实际应用中发现，该蛋白片段的稳定性不佳。为提高纤连蛋白的稳定性，我们尝试了多种不同的设计，最终确定删去纤连蛋白III 8～10结构域中的纤连蛋白III 9片段，即只保留纤连蛋白III 8区域与纤连蛋白III 10区域，能得到稳定性最佳且活性最好的纤连蛋白突变体（氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示：QTAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDK）。
实施例2 纤连蛋白突变体的表达与纯化
一、纤连蛋白突变体的表达载体构建与转化
（1）编码基因的核苷酸序列设计
根据密码子偏好性设计了氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的纤连蛋白突变体的编码基因核苷酸序列，即SEQ ID NO:2所示的根据大肠杆菌偏好密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列：
ATGCAAACAGCTGTACCACCACCGACCGACTTGCGCTTCACGAACATTGGTCCGGATACCATGCGTGTTACTTGGGCTCCGCCTCCGTCGATCGACTTGACCAATTTTCTGGTTCGTTACAGTCCGGTTAAGAACGAAGAAGATGTCGCGGAACTGAGCATCTCTCCGTCCGACAATGCGGTCGTGCTGACCAACCTCTTACCGGGTACAGAATATGTTGTGTCCGTGTCCTCTGTTTACGAGCAGCACGAGAGCACCCCGCTGAGAGGCCGTCAGAAAACTGTCTCCGACGTACCGCGTGACTTGGAAGTTGTGGCCGCAACCCCAACGAGCCTGCTGATTTCTTGGGATGCACCGGCGGTGACCGTGCGCTACTACCGTATCACCTATGGTGAGACGGGCGGTAATAGCCCGGTTCAAGAGTTCACCGTGCCGGGCAGCAAGAGCACCGCTACCATTAGCGGTCTGAAACCGGGCGTTGATTATACCATCACCGTGTATGCCGTGACGGGCCGTGGTGATAGCCCGGCGAGCAGCAAGCCGATTTCCATCAACTACCGCACCGAGATCGACAAATAA。
（2）构建纤连蛋白重组质粒
通过DNA合成SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，并克隆入pET-26b蛋白表达载体，得到纤连蛋白重组质粒。
（3）纤连蛋白重组质粒转化
取1 μL纤连蛋白重组质粒转化到100 μL BL21(DE3)感受态细胞中，在冰上静置30min，再在42 ℃水浴中热击90 s，立即冰上静置2 min，然后加入1 mL LB液体培养基，在摇床中37 ℃、250 rpm震荡复苏培养1 h。取100 μL复苏培养的菌液涂布于含卡那霉素（50mg/L）的LB固体培养基上，待吸收完全后倒置，37 ℃培养箱中培养16 h。挑选白色阳性单菌落，接种于10 mL含卡那霉素（50 mg/L）的LB液体培养基中，于37 ℃、250 rpm摇床中震荡培养16 h，得到阳性重组菌液。
取1 mL阳性重组菌液，接种于100 mL含卡那霉素（50 mg/L）的TB液体培养液中，于37 ℃、250 rpm摇床中震荡培养5 h后，每隔2 h用紫外分光光度计测定其OD600，当菌液OD600至0.5时，加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L进行诱导表达16 h，再在离心机中于6000g、4 ℃条件下离心10 min，取沉淀即得菌体。
二、纤连蛋白突变体的诱导表达（细胞裂解上清液制备）
将前述菌体接入装有400 mL TB培养基（酵母粉24 g/L、胰蛋白胨20 g/L、甘油4.8g/L、卡那霉素50 mg/L、10×磷酸盐缓冲液（0.17M KH2PO4+0.72M K2HPO4））的2 L三角瓶中，回旋式摇床转速250 rpm、温度32℃的条件下培养16 h后，再转移到发酵培养基（酵母粉25g/L、蛋白胨15 g/L、KH2PO413.3 g/L、(NH4)2HPO48 g/L、卡那霉素50 mg/L）中，置于5 L全自动发酵罐（BioFlo 320，Eppendorf）内，于温度32 ℃、溶氧20%的条件下进行培养，每隔2 h用紫外分光光度计测定其OD600，当菌液OD600至120时，降温至28 ℃后，加入0.4M IPTG进行诱导表达16 h，再在离心机中于20000 g、4 ℃条件下离心60 min，获得诱导后的菌体。
将诱导后的菌体用20 mM含0.1M NaCl（pH 8.0）的磷酸钠缓冲液重悬，在高压均质机中以800 Bar的压力进行细胞破碎后，再在离心机中于20000 g、4 ℃条件下离心45 min，取上清液，即为纤连蛋白突变体的细胞裂解上清液。
将细胞裂解上清液进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示。使用Image Lab图像分析软件进行分析可得，纤连蛋白突变体占细胞裂解上清液总蛋白质的37.7%，表明本发明的纤连蛋白突变体能在胞内高效可溶性表达。
三、纤连蛋白突变体的纯化
用水将纤连蛋白突变体的细胞裂解上清液稀释至电导率1 ms/cm后进行层析色谱纯化。首先使用阳离子柱（SP Sepharose FF）行流穿（这个过程中的部分非目标蛋白会被吸附到填料），所得目标蛋白流穿液再用阴离子柱（Q Sepharose FF）进行吸附洗杂和高盐度洗脱（20 mM磷酸钠缓冲液，含300 mM氯化钠，pH 7.0）后得到洗脱液，即为高纯度目标蛋白；最后将高纯度目标蛋白使用切向流过滤法（使用5 KD滤膜）进行缓冲液交换（20 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0），得到纤连蛋白突变体。
四、纤连蛋白突变体的SDS-PAGE检测
将3 μL、6 μL纤连蛋白突变体分别进行SDS-PAGE电泳，结果如图2所示，表明纯化终产物纤连蛋白突变体的纯度大于99%。
实施例3 纤连蛋白突变体促进细胞迁移与伤口愈合的活性
我们从市场上购买了四种市售的重组人类纤连蛋白1～4作为对比进行测试。
市售重组人类纤连蛋白1～4的SDS-PAGE电泳图如图3所示，其中，图3中的A为市售重组人类纤连蛋白1上样量2、4、6 μL时的电泳图，图3中的B为市售重组人类纤连蛋白2上样量2、4、6 μL时的电泳图，图3中的C为市售重组人类纤连蛋白3上样量2、4、6 μL时的电泳图，图3中的D为市售重组人类纤连蛋白4上样量2、4、6 μL时的电泳图。与本发明纤连蛋白突变体的SDS-PAGE电泳图结果对比可知，市售重组人类纤连蛋白1～4的纯度较差。
以永生化的小鼠成纤维细胞NIH3T3为实验对象，通过细胞划痕实验测试样品促进细胞迁移与伤口愈合的活性，实验分组：
空白组样品：PBS，
处理组样品：25 μg/mL本发明纤连蛋白突变体溶液（溶剂为PBS），
对照组样品：25 μg/mL天然纤连蛋白（Sigma F1056，人血来源）溶液（溶剂为PBS）、25 μg/mL市售重组人类纤连蛋白1～4溶液（溶剂为PBS）。
细胞划痕实验具体方法如下：
分别将1 mL各样品溶液覆盖6孔板，4 ℃放置16 h后，弃去溶液，每孔分别加入2mL含7.5×105个NIH3T3细胞的DMEM培养基（含10%血清），5%CO2、37 ℃培养箱中孵育24 h形成单层贴壁细胞后，用划痕棒在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，更换新鲜培养基去除漂浮的细胞及碎片后，在显微镜下观察并拍摄每组细胞的状态（作为起始状态），继续孵育24 h后再次拍摄每组细胞的状态（作为最终状态），并用Image J软件计算划痕面积的变化情况以反映出伤口愈合情況，结果如图4～5和表1所示。其中，图4中的A为PBS的细胞划痕实验结果图，图4中的B为天然纤连蛋白的细胞划痕实验结果图，图4中的C为本发明纤连蛋白突变体的细胞划痕实验结果图，图5中的A为市售重组人类纤连蛋白1的细胞划痕实验结果图，图5中的B为市售重组人类纤连蛋白2的细胞划痕实验结果图，图5中的C为市售重组人类纤连蛋白3的细胞划痕实验结果图，图5中的D为市售重组人类纤连蛋白4的细胞划痕实验结果图。
表1 划痕面积的变化情况
可见，本发明纤连蛋白突变体在细胞划痕实验中的表现显著优于PBS、现有成熟产品-市售重组人类纤连蛋白1～4，且与天然纤连蛋白的表现相当，表明本发明的纤连蛋白突变体具有优异的促进细胞迁移与伤口愈合的活性。
实施例4 纤连蛋白突变体促进细胞粘附的活性
以永生化的小鼠成纤维细胞NIH3T3为实验对象，通过细胞粘附实验测试样品促进细胞粘附的活性，实验分组：
空白组样品：PBS，
处理组样品：25 μg/mL本发明纤连蛋白突变体溶液（溶剂为PBS），
对照组样品：25 μg/mL天然纤连蛋白（Sigma F1056，人血来源）溶液（溶剂为PBS）、25 μg/mL市售重组人类纤连蛋白1～4溶液（溶剂为PBS）。
细胞粘附实验具体方法如下：
分别将0.5 mL各样品溶液覆盖12孔板，4 ℃放置16 h后，弃去溶液，每孔分别加入1 mL含5×104个NIH3T3细胞的DMEM培养基（含0.5%血清），5%CO2、37 ℃培养箱中孵育4 h后，于100倍镜显微镜下观察并拍摄每组细胞，并用Image J软件计算细胞的平均面积以反映出细胞的粘附与伸展情况，实验结果如图6和表2所示。其中，图6中的A为PBS的细胞粘附实验结果图，图6中的B为天然纤连蛋白的细胞粘附实验结果图，图6中的C为本发明纤连蛋白突变体的细胞粘附实验结果图，图6中的D为市售重组人类纤连蛋白1的细胞粘附实验结果图，图6中的E为市售重组人类纤连蛋白2的细胞粘附实验结果图，图6中的F为市售重组人类纤连蛋白3的细胞粘附实验结果图，图6中的G为市售重组人类纤连蛋白4的细胞粘附实验结果图。
表2 孵育4 h后的细胞平均面积
可见，本发明纤连蛋白突变体在细胞粘附实验中的表现显著优于PBS、现有成熟产品-市售重组人类纤连蛋白1～4，甚至优于天然纤连蛋白，表明本发明的纤连蛋白突变体具有优异的促进细胞粘附的活性。
实施例5 纤连蛋白突变体促进细胞增殖的活性
以永生化的人表皮细胞HaCat为实验对象，通过MTT实验测试样品促进细胞存活与生长的活性，实验分组：
空白组样品：PBS，
处理组样品：1.25 ng/mL本发明纤连蛋白突变体溶液（溶剂为PBS），
对照组样品：20 ng/mL天然纤连蛋白（Sigma F1056，人血来源）溶液（溶剂为PBS）、1.25 ng/mL市售重组人类纤连蛋白1～4溶液（溶剂为PBS）。
MTT实验具体方法如下：
分别将100 μL各样品溶液覆盖96孔板，4 ℃放置16 h后，弃去溶液，每孔分别加入0.1 mL含6×103个HaCat细胞的DMEM培养基（含0.5%血清），5%CO2、37 ℃培养箱中孵育96 h后，每孔再分别加入MTT溶液至终浓度0.5 mg/mL，继续孵育3 h后终止培养并移除培养上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）使结晶物充分溶解，在分光光度计570 nm波长处测定各孔的光吸收值，按公式“相对细胞生长（%）=样品的光吸收值/对照组的光吸收值×100”计算得到各组样品的相对细胞生长。
结果如图7所示，可见，本发明纤连蛋白突变体在MTT实验中的表现显著优于PBS、现有成熟产品-市售重组人类纤连蛋白1～4与天然纤连蛋白，具有轻度促进细胞增殖的活性。
实施例6纤连蛋白突变体的热稳定性
将本发明纤连蛋白突变体加入到20 mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）中，使其终浓度为1mg/mL，并取0.2 mL转移至PCR离心管中，分别置于温度设定为4 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃的PCR热循环仪内孵育3 h，孵育结束后取出PCR离心管，观察并拍摄纤连蛋白突变体的沉淀情况后，进行如实施例4所示的细胞粘附实验。
结果如图8所示，可见，4 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃下孵育3 h后的纤连蛋白突变体溶液均可保持澄清，且其促进细胞粘附的活性也均未受到明显影响，表明本发明的纤连蛋白突变体具有较高的热稳定性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一种纤连蛋白突变体，其特征在于，所述纤连蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.权利要求1所述纤连蛋白突变体的编码基因。
3. 根据权利要求2所述编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2或3所述编码基因。
5.一种表达权利要求1所述纤连蛋白突变体的重组工程菌。
6.根据权利要求5所述重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌含有权利要求4所述重组表达载体。
7.根据权利要求5所述重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为含有权利要求4所述重组表达载体的大肠杆菌或毕赤酵母。
8.权利要求2或3所述编码基因、权利要求4所述重组表达载体或权利要求5～7任一所述重组工程菌在制备权利要求1所述纤连蛋白突变体中的应用。
9.权利要求1所述纤连蛋白突变体在制备化妆品或医学用组合物中的应用。
10.权利要求1所述纤连蛋白突变体的制备方法，其特征在于，利用权利要求5～7任一所述重组工程菌表达所述纤连蛋白突变体。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130337038A1 (en) * | 2010-12-14 | 2013-12-19 | University Of Rochester | Chimeric fibronectin matrix mimetics and uses thereof |
| CN110511280A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-29 | 华南理工大学 | 一种透皮重组纤连蛋白及其应用 |
| US20210254018A1 (en) * | 2016-07-29 | 2021-08-19 | Takara Bio Inc. | Fibronectin fragment to be used for stem cell production |
| CN116640204A (zh) * | 2023-04-14 | 2023-08-25 | 深圳柏垠生物科技有限公司 | 耐热纤连蛋白及其制备方法用途、核酸、表达载体及菌株 |
| CN117064821A (zh) * | 2023-10-16 | 2023-11-17 | 宝萃生物科技有限公司 | 一种控油和/或祛痘组合物及其制备和应用 |
Patent Citations (5)
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