CN106222172A - 一种烟草gcn2启动子及其应用 - Google Patents

一种烟草gcn2启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种烟草GCN2启动子，其核苷酸序列为：（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或（2）与（1）限定的核苷酸序列中至少具有90%同源性的核苷酸序列。本发明还涉及烟草GCN2启动子在启动目的基因表达中的应用，以及应用方法。可以驱动GUS基因的表达，可以作为烟草生物反应器外源基因所用的表达元件；同时该序列位于烟草GCN2的上游，在烟草中可以启动GCN2基因的表达，其序列中存在的植物激素等响应元件可以用来调控GCN2基因的表达，进而调控烟草的蛋白合成；本发明有助于促进人们对烟草响应胁迫的研究，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

一种烟草GCN2启动子及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种烟草GCN2启动子及其应用。
背景技术
植物基因工程中有关启动子的研究已成为近年来的热点研究之一。启动子通过调控基因的表达，可以使外源目的基因在受体中表达，进而提高作物对不同逆境胁迫的应答，进而提高作物的品质和质量。 同时启动子还可以作为植物生物反应器中表达外源基因的重要控制元件，为植物生物反应器的研究做出巨大贡献。烟草作为一种模式生物，其遗传转化较容易，广泛应用于植物分子生物学和生物技术的研究。因此，研究和利用烟草启动子对于研究植物对各种逆境胁迫的响应以及植物的抗逆基因工程都有重要的意义，在植物基础研究以及利用生物技术进行品质改良等方面也有广阔的应用前景。
植物对各种生物和非生物胁迫的耐受将决定作物的产量和质量，而胁迫和代谢信号之间的相互作用决定了植物对于胁迫的应答效率。蛋白激酶GCN2 (general controlnon- derepressible 2)在胁迫和氮/氨基酸信号之间起到重要的连接作用，该酶参与了蛋白合成的调节(Hey等，2010)。GCN2可以使真核翻译起始因子eIF2的α亚基发生磷酸化，从而应答氨基酸的缺乏和各种胁迫(Halford等，2004)。
在植物中，GCN2 是由单个基因编码的，并且是唯一的eIF2α激酶。另外，序列分析表明高等植物中只存在一个GCN2类似的eIF2α激酶(Zhang等，2003；Lageix等，2008；Zhang等，2008；Hey等，2010)，而在动物中则存在四种eIF2α 激酶（PKR、PERK、HRI和GCN2）来分别应答不同的胁迫。这表明植物与动物不同，植物中仅存在一种eIF2α激酶，它在植物的生长发育中起到重要作用。
目前研究发现植物中GCN2介导的eIF2α磷酸化可以被UV辐射、冷胁迫、嘌呤缺乏和损伤等胁迫所激活(Lageix等，2008；Zhang等，2008)。除此之外，植物信号物质如MMS(甲磺酸甲酯)、MeJA（甲基茉莉酸酯）、ACC(1 -氨基环丙烷-1羧酸)或水杨酸等处理植物后，GCN2也可以被激活，并且磷酸化真核翻译起始因子eIF2α(Lageix等，2008；Zhang等，2008)。
启动子位于基因的上游，其序列上的DNA调控序列（顺式作用因子）与转录因子（反式作用因子）的结合调控着基因的转录水平，进而决定了编码基因的时空表达以及表达强度。因此，烟草GCN2启动子的分离和鉴定对于烟草应答各种逆境胁迫研究以及烟草作为生物反应器表达外源基因的研究具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以启动GCN2基因的表达，其序列中存在的植物激素等响应元件可以用来调控GCN2基因表达的烟草GCN2启动子。
为达到以上目的，本发明通过以下技术方案实现：
设计一种烟草GCN2启动子，其核苷酸序列为：
（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或
（2）与（1）限定的核苷酸序列中至少具有90%同源性的核苷酸序列。
本发明的第二个目的是提供一种用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体的启动子是核苷酸序列为SEQ ID NO.1的启动子，可以是外源目的基因在烟草中表达。
上述烟草GCN2启动子可在启动目的基因表达中的应用，所述目的基因优选为GUS基因。
上述烟草GCN2启动子启动GUS 基因表达的方法，包括以下步骤：
（1）将上述烟草GCN2启动子插入pCAMBIA-NPT-GUS载体的中并且替换该载体中已有的35S启动子，得到重组质粒；
（2）将所得重组质粒通过农杆菌介导的方法导入出发植物并进行培育，在所述出发植物中由所述GCN2启动子启动所述重组质粒中的GUS基因表达。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为烟草，更优选为烟草K326。
本发明进一步提供了一种在植物中表达外源基因的方法，采用上述重组表达载体，将外源目的基因导入该载体，转化植物，获得的转化植物可以表达外源基因。
本发明烟草启动子的分离和鉴定，能够为烟草生物反应器的研发提供实验和技术支撑。采用该启动子，利用烟草作为生物反应器，表达外源药用蛋白，可以应用于医学等领域。
本发明具有以下积极有益的技术效果：
1.本发明首次分离了烟草GCN2基因的上游启动子序列，提供的启动子序列可以驱动GUS基因在烟草中表达，并且序列分析该启动子存在着水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)等植物激素响应位点。
2.本发明所提供的序列可以驱动GUS基因的表达，能作为烟草生物反应器外源基因所用的表达元件；同时该序列位于烟草GCN2的上游，在烟草中可以启动GCN2基因的表达，其序列中存在的植物激素等响应元件可以用来调控GCN2基因的表达，进而调控烟草的蛋白合成。
3.本发明有助于促进人们对烟草响应胁迫的研究，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1：本发明烟草GCN2启动子的PCR扩增电泳图。
图2: 本发明的重组表达载体pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Pro:GUS转化农杆菌后质粒提取电泳图。
图3：本发明的重组表达载体pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Pro:GUS转化农杆菌后质粒PCR鉴定电泳图。
图4：本发明农杆菌介导的pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Pro:GUS载体侵染烟草K326遗传转化图；其中左上为阴性对照，右上为阳性对照，左下为转GCN2启动子阳性分化苗，右下为转GCN2启动子阳性分化苗的生根图。
图5：烟草GCN2启动子转化烟草叶片后的GUS染色图。其中左图阴性对照为未转基因的烟草K326染色图；中图阳性对照为含有35S启动子的pCAMBIA-NPT-GUS转基因烟草染色图；右图为pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Pro:GUS转化烟草后染色图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法或检测方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料或试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
实施例1烟草NtGCN2启动子基因的分离，包括以下步骤：
（1）烟草基因组DNA 的制备
取种植于温室两个月的烟草，取其嫩叶，采用CTAB法提取基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后与-20℃进行保存。
（2）NtGCN2 启动子的克隆和序列分析
以烟草基因组DNA为模板，采用GCN2上游引物 (AAAAGATACTAAGCATTGACG)和下游引物(CCTGAGATTTGCCCGAATGGAGG)进行PCR扩增。PCR 反应条件为：94℃预变性4 min，94℃变性1min，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，共35个循环，4℃保存。
将PCR 产物连接到pCAMBIA-NPT-GUS载体，克隆并进行质粒PCR 检测（质粒命名为pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Pro:GUS），并测序获得长度为1318 bp的GCN2启动子，其序列为SEQID NO：1。然后使用PLACE 软件（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）对启动子序列中的顺式作用元件进行预测分析，发现该启动子含有真核生物启动子的基本保守元件TATA-box和CAAT-box，还含有损伤诱导、MeJA、SA等植物激素应答元件以及AE-box、G-Box等元件，在烟草生产调控当中具有广泛的应用价值。
实施例2 植物表达载体的构建，包括以下步骤：
将pCAMBIA-NPT-GUS载体用EcoRI/HindIII 酶切后，回收大片段待用。
将实施例1中的NtGCN2-Pro的PCR产物进行纯化和回收，并将该目的片段连接至酶切后的pCAMBIA-NPT-GUS中。在10 μl体系中，把目的片段与载体片段用ClonExpressTMⅡ酶进行重组反应，通过PCR方法来确定阳性重组子，见图1。从而使本发明的启动子与GUS基因融合，得到表达GUS基因的植物重组表达载体pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Pro:GUS。
实施例3 烟草启动子活性的鉴定，包括以下步骤：
（1）农杆菌介导的植物转化
将在实施例2中构建的表达GUS基因的植物重组表达载体pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Pro:GUS转化农杆菌EHA105，将转化后农杆菌进行培养，并提取质粒进行PCR鉴定，见图3，进而确定质粒转入了农杆菌中。
取烟草种子，利用酒精和次氯酸钠消毒后播种到MS培养基上，等烟草幼苗长至5-8片叶的时候，剪取烟草叶片，放入上述转化了质粒的农杆菌菌液中进行侵染。具体操作为：将上述农杆菌在28℃培养箱中培养，当OD600=0.8，加入20 mg/L的AS（乙酰丁香酮），将剪取的烟草叶片放入农杆菌菌液中侵染8 min，侵染后的叶片吸干多余菌液后放置在培养基进行培养和筛选。
（2）转基因植株GUS 表达活性分析
GUS 缓冲液：由溶剂和溶质组成。溶剂为pH 7.0、50 mmol/L磷酸氢钠缓冲液。溶质及其浓度：10 mmol/L EDTA、0.1%Triton X-100(体积比)、2 mmol/L铁氢化钾和2 mmol/L亚铁氢化钾；4℃下保存备用。GUS染色液：用N，N-二甲基甲酰胺溶解X-Gluc粉剂，配成20 mmol/L的溶液，于-20℃下保存备用。
取转基因烟草T0代叶片进行GUS组织化学染色。待转基因烟草叶片长至6片左右时（见图4），取一片叶进行GUS组织化学染色，试验结果见图5。
图5结果表明，GUS活性强的显示出很深的蓝色，无蓝色表示GUS活性较低。其中阴性对照未染出颜色，阳性对照染出蓝色表明GUS染液能够正常染色，而右图染出蓝色表明烟草GCN2启动子能够驱动GUS基因表达，进而使其在GUS染液中呈现蓝色。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南农业大学
<120> 一种烟草GCN2启动子及其应用
<130> /
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaaagatact aagcattgac gagttacctc taaaccatca tcatcatctc caacttcaat 60
gctataagga tatagatgaa gtttggttga caagtcgagt ttggaaacca tcttttcaga 120
aacgatattt atgtgactcc cacaatcaat gatcaacgaa caaacttttc cataggaggt 180
acatctagtg tggaaaagag atttatgttg tctcatttct taatcttctt gaacccaacg 240
accttttctt gcttgcatat taggttcacc acctgctgct ctgataccaa attgatgtga 300
ttcttcgagt taacaaagaa ccaaccgacc aggatcaaga tcttgaaacg aaaacgtagt 360
ttgtggaccg gtttcaagaa acaacgtatc tcaagtttta ggactcagaa tctcatgatt 420
caaaaacgag gtgaaagatg acgatctgaa ctacaagaaa gactagttac tcattcaaaa 480
caagtaaata ttgatgctgc accagttcaa tgaaagttat gattctatga tatcaaaaga 540
acgaatttag atcaagaaac gtattcttga aagatcaaga actaaacaag tttctaaagt 600
caccacttgg aatttactat atctttataa caattcaatt tgtaagtgat tttaaggata 660
cgcggattga tttgatacaa aatgataact tgagttagat tgaacaaata aagatatagt 720
aaattcaaac cacgtgagga ggatgattcc agtcttagtg aaatattcac cctcgatctg 780
ggctcacaat ggccagtact gatgaacaag aaaaagagct atgaataaga ttgaaaataa 840
tagtgtattg ctttgggatg cgtgttataa tgtgtttaat gaatagttag acccttttat 900
atagtacgag aatcctattt taggtacaat tatgtaaaag ttaaaaaata ttctgtttaa 960
ctgattgctc gttctccatc gatacgtgcc gacattcatg tcgtgatatc cgaccgttct 1020
attacggcct tgtgttggtg gtgcttggtt gcgtgacaac gctctccaaa atcttttgga 1080
tgtgaaccga tcccggatta tgagcccaat attctcgagg gaggcgtcat gcccgactct 1140
aacttagtga gaccttgcct cgatttaggt acctatcatc atgtctcgag ctttgtttac 1200
cggctgggtg gagcccgatt ttacccttat acaaagctaa agcgttaaag gaaaagaaga 1260
tagaaggacc acgatcgaac tgctcaattg ttggcctcca ttcgggcaaa tctcagg 1317
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaaagatact aagcattgac g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctgagattt gcccgaatgg agg 23

Claims (8)

1. 一种烟草GCN2启动子，其核苷酸序列为：
（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或
（2）与（1）限定的核苷酸序列中至少具有90%同源性的核苷酸序列。
2.一种用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体具有权利要求1所述的烟草GCN2启动子序列。
3.权利要求1所述烟草GCN2启动子在启动目的基因表达中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述目的基因为GUS 基因。
5.权利要求1所述烟草GCN2启动子启动GUS基因表达的方法，包括以下步骤：
（1）将权利要求1所述烟草GCN2启动子插入pCAMBIA-NPT- GUS载体的多克隆位点，得到重组质粒；
（2）将所得重组质粒通过农杆菌介导的方法导入出发植物并进行培育，在所述出发植物中由所述烟草GCN2启动子启动所述重组质粒中的GUS基因表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述出发植物为烟草。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述出发植物品种为烟草K326。
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