CN112322621A - 杜仲DIR1基因MeJA响应启动子及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了杜仲DIR1基因MeJA响应启动子及其用途，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该启动子中含有MeJA响应元件，将其遗传转化三星烟草后，可以调控三星烟草中GUS报告基因的表达，本发明的启动子无组织特异性，可以启动GUS基因在三星烟草芽、根、茎、叶中的表达，且染色程度无明显差异。研究该启动子调控模式有助于杜仲响应胁迫的研究，也在更高效表达DIR1蛋白和研究木质素合成调控中有重要用途。

Description

杜仲DIR1基因MeJA响应启动子及其用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及杜仲DIR1基因启动子及其用途。

背景技术

启动子是起始转录、RNA聚合酶特异性识别和结合的特定DNA序列，是基因转录调控水平的核心，能控制和调节基因表达的模式、部位和强度。真核生物启动子分为核心启动子区和上游序列区两个区域，核心启动区含有转录起始位点和TATA-box等顺式作用元件；上游序列区含有不同的调控表达元件，对基因转录的效率、特异性和活性起关键作用，确保基因转录的有效性和精确性。根据转录模式的不同，启动子可分为组成型、组织特异型和诱导型。了解启动子的元件构成及其功能，对于研究基因的时空表达和转录调控至关重要，此外，因对外源基因表达水平的调控作用，启动子成为基因工程表达载体的重要元件之一。

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是多年生的杜仲科落叶乔木，是我国具有的独特的第三纪孑遗植物，具备极高的药用和经济价值。DIR蛋白在植物天然产物生物合成中起重要作用，DIR蛋白可以通过提供木质素在细胞壁沉积过程中特定顺序的单木质素亚单位来指导木脂素和木质素的合成。DIR通过改变木质素单体的组合和连接来影响木质素的酸度，从而减少由干旱或水引起的细胞损伤，帮助植物提高抗逆性。因此DIR1具有重要的研究价值。相关研究表明，DIR1编码基因对木脂素类松脂醇双糖苷的生物合成起关键作用(王维东.杜仲Dirigent编码基因克隆及表达分析[D].贵州大学,2017.)。对于DIR1的基因调控元件的研究未有报道。启动子对基因表达起到重要调控作用，研究其调控模式有助于更高效地利用DIR1蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种DIR1基因的MeJA响应元件启动子，可以高效启动Dirigent1基因的表达。

为实现上述目的，本发明还涉及一种重组表达载体，所述载体为本发明的启动子与pCAMBIA1391z Vector质粒经重组所得。

本发明还涉及一种重组细胞，所述细胞含有上述启动子或重组载体。

优选地，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组根癌症农杆菌细胞。

进一步的，本发明还涉及一种转基因植物，所述转基因植物转化有本发明的启动子或重组载体或感染本发明的重组细胞。

进一步的，本发明还涉及一种外植体，所述外植体转化有本发明的启动子或重组载体或感染有本发明的重组细胞。

为实现上述目的，本发明的技术路线如下：

(1)以杜仲DNA为模板，使用2条特异性引物对进行扩增，克隆得到DIR1启动子，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)将其插入pCAMBIA1391z Vector质粒中，GUS基因连接于下游。

(3)将其通过根癌农杆菌介导的方法对目标植物进行遗传转化。

(4)利用转化后的愈伤组织和抗性芽培育相应植株；

(5)对步骤(4)得到的转基因植株的不同组织器官进行GUS染色观察。

所述2条特异性引物分别含有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的序列，所述引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和保护碱基。

在所述植株中，杜仲DIR1基因启动子能够驱动重组质粒中的GUS基因表达。

所述目的植物为烟草，更优选为三星烟草。

本发明对杜仲DIR1基因的上游调控序列进行了克隆，得到其启动子基本元件的完整序列。本发明对其进行了生物信息学分析，通过构建植物表达载体，连接缺失启动子片段启动GUS报告基因表达，用其重组细胞遗传转化三星烟草，从而验证启动子的活性。对杜仲DIR1基因的表达模式进行了分析，为研究DIR1基因的表达调控模式奠定基础。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明提供了一种来源于杜仲DIR1基因的启动子，所述启动子对DIR1基因的表达起到了重要调控作用，该启动子中含有MeJA响应元件；

(2)本发明首次分离了杜仲DIR1基因的上游启动子序列，该启动子序列可以驱动GUS基因在烟草中表达；

(3)本发明所提供的启动子序列可以在所述植物根、茎、叶中驱动GUS基因大量表达，是一种高效能表达的外源启动子，可应用于基因遗传转化和转基因植株培育中；

(4)本发明所提供的启动子序列位于杜仲DIR1基因上游，在农业领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为表达载体pCAMBIA1391Z-EuDIR1p::GUS的构建示意图。

图2为DIR1基因5’端调控区顺式作用元件示意图。

图3为以杜仲叶片DNA为模板的DIR1启动子克隆后的电泳图。

其中，M：DL2000bp Marker；1：DIR1基因启动子。

图4为植物表达载体pCAMBIA1391Z-EuDIR1p::GUS构建后的酶切电泳图。

其中，M：DL2000bp Marker；1、2、3、4：EuDIR1p-1酶切及产物1495bp。

图5为烟草转化过程，其中a：共培阶段，b：筛选培养阶段，c：生根培养阶段，d：形成外植体。

图6为抗性幼苗叶片GUS组织化学染色。

其中，WT：野生型；EuDIR1p-1：pCAMBIA1391z-EuDIR1p-1::GUS。

图7为MeJA处理下转基因烟草中GUS基因表达量时间依赖性变化柱形图。

图8为MeJA处理下杜仲幼苗中EuDIR1基因表达量时间依赖性变化柱形图。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。

下述所用生物材料均为市售，本申请人实验室有保存，可以对外公开发放。

实施例1、启动子片段的克隆

使用CTAB法提取杜仲基因组DNA。根据启动子序列，使用Primer Primer 5和Oligo7设计2条特异性引物，加限制性酶切位点和保护碱基。以上述提取的杜仲基因组为模板，使用高保真聚合酶，进行扩增。扩增体系和程序如表1和表2所示。

表1基因启动子扩增的体系

表2 PCR扩增程序

其中，2条特异性引物分别为：

上游引物EuDIR1p-F：ACGCGTCGACACAGGGCTTCTATATCTATGACA，其中下划线代表SalⅠ酶切位点，酶切位点前为保护碱基。

下游引物EuDIR1p-F：CCGGAATTCAATGAGAGAAAATGGGCTTG，其中下划线代表EcoRⅠ酶切位点，酶切位点前为保护碱基。

将PCR扩增产物于1.2％琼脂糖凝胶中分离,得到大小为1495bp的条带，使用OMEGA琼脂糖DNA回收试剂盒(目录号D2500-01)进行纯化回收。电泳图如图3所示。

实施例2、pClone007-DIR1p重组载体的构建。

将上述得到的PCR扩增产物与T/A克隆(pClone007 Versatile Simple Vector)质粒，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆测序。

其中，T/A克隆的连接条件如表3所示。

表3 T/A克隆的连接条件

将上述体系轻轻混匀后，于室温(22-30℃)连接1-5min即可。得到pClone007-DIR1p重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌。

从-80℃冰箱中取出制备好的50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，置于冰上解冻；加入10μL连接产物于50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞悬浮液中，轻轻地混匀，冰上放置30min；42℃恒温水浴锅中孵育60s，然后迅速冰浴2min；加400-450μL SOC液体培养基于离心管中，先37℃活化10min，然后在37℃、180rpm摇床培养45min；在超净工作台中于菌液中加入14μLIPTG、80μL X-Gal,取200μL菌液涂布于含100mg/LAmp的LB固体培养基上；于37℃恒温培养箱里倒置培养12-16h。获得含有pClone007-DIR1p克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-DIR1p。深圳华大基因科技有限公司对pClone007-DIR1p克隆载体中的进行测序，测序结果如SEQ ID NO:1所示。

测序结果表明，获得的pClone007-DIR1p克隆载体中启动子序列正确。

实施例3、DIR1基因启动子序列的鉴定和分析

利用植物顺式作用元件数据库PlantCARE进行相关预测,发现该启动子含有参与干旱应答影响的MYB元件、参与茉莉酸甲酯相应的CGTCA-motif、参与植物逆境应答响应的Myb元件、参与厌氧调控的元件O2-site以及大量的TATA-box和CAAT-box等等，就目前克隆到的长度尚未发现组织特异性启动子的元件。分析结果如图2及表4所示。

表4 DIR1基因5’端调控区顺式作用元件

实施例4、pCAMBIA1391Z-EuDIR1p::GUS重组载体的构建

将上述构建获得的pClone007-DIR1p菌株挑取单菌落进行摇菌，37℃摇菌过夜，用碱裂解法提取质粒，然后用Sal I和EcoR I限制性内切酶进行双酶切，酶切产物用OMEGA回收试剂盒回收启动子DIR1p片段。

将上述得到的回收产物与pCAMBIA1391Z Vector质粒进行连接，连接条件如表5所示：

表5连接条件

16℃连接过夜，得到pCAMBIA1391Z-EuDIRlp::GUS重组载体。将经过上述连接后的产物按实施例2中方法转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序。深圳华大基因科技有限公司对PCAMBIA13917-EuDRID1p::GUS克隆载体中目的基因进行测序，测序结果如SEQ IDNO:1所示。构建示意图如图1所示。

测序结果表明，获得的pCAMBIA1391Z-EuDIR1p::GUS重组载体中启动子序列正确。将此重组表达载体转入农杆菌内，转化方法如下。

从-80℃冰箱中取农杆菌感受态细胞，放冰上融化后分别加入2μg重组质粒pCAMBIA1391Z-EuDIR1p::GUS,轻弹混匀，冰上放置30min。用液氮速冻5min，然后快速37C水浴5min；加入1mL YEP培养基，28℃，200rpm/min，培养3-4h；培养后的菌液于5000rpm，4℃，离心1min，弃上清液，保留菌体，用200μL YEP液体培养基重悬菌体，将重悬液涂布在含100mg/L Kan和100mg/L Rif的YEP培养皿上，28℃倒置培养2-3d。待培养皿上长出农杆菌菌落后，将单菌落挑取入含3mL YEP液体培养基(含100mg/L Kan和100mg/L Rif)的15mL离心管中，并在180rpm/min 28℃的摇床中摇过夜；提取质粒用Sal I和EcoR I限制性内切酶进行双酶切验证。条带为1495bp左右的即为重组根癌农杆菌LBA4404-EuDIR1p细胞。如图4所示。

实施例5、重组根癌农杆菌介导转化三星烟草

通过农杆菌介导的叶盘法将pCAMBIA1391Z-EuDIR1p::GUS转化入三星烟草中，转化过程如下：

(1)配制共培培养基，配方为：MS(4.43g/L)，蔗糖(30g/L)，琼脂糖(7g/L)，6-BA(1.0mg/L)，NAA(0.1mg/L)，pH5.8～6.0。挑取农杆菌阳性单菌落摇至菌液菌液OD₆₀₀值为0.4～0.6，离心后加入等体积重悬液将菌体重悬，重悬液配方为：MS(4.43g/L)，蔗糖(30g/L)，琼脂糖(7g/L)，AS(4mg/L)，pH5.2。将野生型三星烟草无菌苗叶片边缘和叶脉切去，切割为1cm²左右的方块于重悬菌液中浸染8-10分钟后用无菌吸水纸将菌液吸干，最后将其于共培培养基上叶面朝下暗培2-3天，如图5中a所示。

(2)配制筛选培养基：MS(4.43g/L)，蔗糖(30g/L)，琼脂糖(7g/L)，6-BA(1.0mg/L)，NAA(0.l mg/L)，Hyg(20mg/L)，Tim(150mg/L)，pH5.8～6.0。暗培后将叶片转移至筛选培养基上叶面朝上培养至愈伤组织长出抗性芽，如图5中b所示。

(3)配制1/2MS生根培养基培养基：MS(2.22g/L)，蔗糖(30g/L)，琼脂糖(6g/L)，NAA(0.2mg/L)，Hyg(20mg/L)，Tim(100mg/L)，pH5.8～6.0。将抗性芽切下，转移至生根培养基培养至根系发达，如图5中c所示。

(4)将稳定的抗性苗移入土壤中，便于后续实验，如图5中d所示。

实施例6、三星烟草抗性芽、根、茎、叶中的GUS基因表达验证

将PCAMBIA1391Z-EuDIR1p::GUS转化的三星烟草进行染色。将转化的三星烟草抗性芽、根、茎、叶于适量的GUS染色液中，37℃过夜。之后将组织浸泡于75％酒精中至组织绿色褪去，利用体视镜进行拍照，结果如图6所示。含有重组载体pCAMBIA1391Z-EuDIR1p::GUS的根癌农杆菌介导转化的三星烟草组织染色后变蓝色。野生型三星烟草组织染色后不变蓝。图6为含有重组载体pCAMBIA13912-EuDIR1p::GUS的根癌农杆菌介导转化的三星烟草幼芽、根、茎、叶，组织染色后均变蓝色。结果表明，本发明的启动子可以启动GUS基因在三星烟草芽、根、茎、叶中的表达，且染色程度无明显差异，表明EuDIR1启动子在三星烟草中可能无组织特异性。

实施例7、EuDIR1基因启动子对MeJA的响应

为了分析EuDIR1基因启动子中的顺式作用元件的功能，将经过PCR和GUS染色鉴定的转基因烟草扩大繁殖培养后，选取长势相同的不同株系转基因烟草作为实验材料，处理时，利用100μmol/L的茉莉酸甲酯(MeJA)充分喷施转基因烟草至叶面上液体滴落，用纯净水处理同一批转基因烟草作为对照，处理0h采集一批样品，之后分别在处理3、6、12、24以及48h采集样品，采集样品液氮速冻，保存于-80℃冰箱，提取RNA反转录成cDNA，通过qRT-PCR检测转基因烟草中GUS基因的表达情况。

其中，PCR选择特异性引物鉴定转基因烟草植株，以野生型烟草作为阴性对照，以构建的植物表达载体pCAMBIA1391Z-pEuDIR1-4::GUS大肠杆菌质粒作为阳性对照。反应体系为：Ex Taq Mix 5μL，上下游引物各0.2μL(10μM)，cDNA 1μL，ddH2O 3.6μL。反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性1min，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃终延伸5min，4℃保存。上下游引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:3所示。

其中，Real-Time PCR分析以β-actin基因作为内参基因，PCR反应体系为：SYBRPremix Ex Taq酶5.0μL，上下游引物各0.2μL，cDNA 1.0μL，ddH2O 3.6μL，终体系为10.0μL。反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性1min，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环。β-actin内参基因上下游荧光引物如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，EuDIR1基因荧光引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

导出数据后，利用ΔΔCT法对GUS基因的相对表达量进行统计分析。

荧光定量结果表明，100μmol/L MeJA可以极显著上调转基因烟草中GUS基因的表达，但表现为时间依赖性。如图7所示。将MeJA处理0h的基因表达量设为基线水平，在3h时极显著上调了GUS基因的表达，为0h的5.065倍，之后逐渐恢复，在48h时，表现为抑制GUS基因表达，基因相对表达量是处理0h的0.357倍。与处理前相比，基因表达量在3-24h显著上调，在48h时显著下降。表明在转基因烟草的这段启动子里含有的CGTCA-motif响应元件，调控方式受到外源MeJA激活的作用，参与了正调控促进启动子的表达，能增强启动子的驱动作用，且伴随激素挥发成时间依赖性调控基因表达量变化。

实施例八、EuDIR1基因的表达模式分析

选取长势相同的杜仲幼苗，移栽于50±1g的土壤中，灌溉处理前使用土壤水分检测仪检测土壤湿度为4.8±0.2％，用配制的100μmol/L茉莉酸甲酯溶液喷施处理植株，相同量的蒸馏水处理作为对照。于0、3、6、12、24小时采样，并在-80℃下储存以测定基因表达，使用康为试剂盒提取杜仲RNA，反转为cDNA后进行实时荧光定量分析。

导出数据后，利用ΔΔCT法对EuDIR1基因的相对表达量进行统计分析。

其中，Real-Time PCR分析以Euactin基因为对照，反应程序为：PCR反应体系为：SYBR Premix Ex Taq酶5.0μl，上下游引物各0.2μl，cDNA 1.0μl，ddH2O 3.6μl，终体系为10.0μl。反应程序为95℃预变性3min；95℃变性1min，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环。Euactin内参基因上下游荧光引物如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，EuDIR1基因荧光引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

荧光定量结果表明，100μmol/L MeJA可以极显著上调杜仲幼苗中EuDIR1基因的表达量，但表现为时间依赖性。如图8所示。将MeJA处理0h的基因表达量设为基线水平，处理3h时，EuDIR1的表达量与0h相比增加了7.56倍，然后其表达量逐渐下降，在12小时左右恢复到基线水平。在达到基线水平后，它又显示出上升趋势，并且与0h相比，EuDIR1的表达量在24小时仍然上调非常显著。这与转基因烟草中的看到的趋势基本一致。说明EuDIR1启动子中存在的MeJA响应元件可以在外源MeJA的存在下呈时间依赖性调控基因表达。

引物列表如下：

SEQ ID NO:2 ACGCGTCGACACAGGGCTTCTATATCTATGACA，

SEQ ID NO:3 CCGGAATTCAATGAGAGAAAATGGGCTTG，

SEQ ID NO:4 ACGCGTCGACGCCCCTAATGAAAATGTGAGT，

SEQ ID NO:5 GATCTTGCTGGTCGTGATCT，

SEQ ID NO:6 ACTTCCGGACATCTGAACCT，

SEQ ID NO:7 TGCGACTTCTGCTATTGTAGG，

SEQ ID NO:8 AGGTTGTTGTCCAGGGTTATG，

SEQ ID NO:9 GTGTTATGGTTGGGATGGG，

SEQ ID NO:10 TGCTGACTATGCCGTGTTC。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

序列表

<110> 贵州大学

<120> 杜仲DIR1基因MeJA响应启动子及其用途

<141> 2020-11-10

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1495

<212> DNA

<213> 杜仲(Eucommia ulmoides)

<400> 1

acagggcttc tatatctatg acaagaagga gatattcacg tcatggttgg ccttctcatt 60

tgtattcaac tcgactcgcc ataagggtac cattaacttc gccggagccg atccgatcat 120

gaataaaacc agggatatct ctgtgattgg aggtaccggc gactttttta tggcccgggg 180

aatcgctact ctctccaccg atgctttcga aggggaagtt tacttcagac ttcgcgtgga 240

tatcaagttt tacgagtgct ggtaaaaagt taaaggactg tttggcgcat tttttggagt 300

tttaaatatc ggttttgaga attttgaaaa atgtctacca aacaatcttt agtagttaat 360

atccacactt tttttttttt ttttttggtt ggattttgag caagttttgt agcccacttt 420

gcttgatttt gattgacttg gaccaatcaa tttttatttt tattttttct gtataagaag 480

attcaaaagt ggatgccatg atctataaat ttgtctcttt catgtttggt ggatttttta 540

aacaagtaat attcaacata tttggaactt gatgaaataa aaatctaata cccgtgtaat 600

tttcagttta tacagataat ttgattacga aagagtgatg agaaatatgt aatcatcgac 660

ttacgcggat gatttgacta caaaaaaata atagactcat aaccttggct ctaatatact 720

atgatagaag gatctaactt aaaagcatat agttttaggt ggagtaattt atttgactta 780

tatagtgatt tgagaactct taaaagattg atgtgggaca agaatttaac aaccaccctt 840

aagtgcgatc ctcagtttgc acagatgatt taactacgag agaatagtga gaaatgtgta 900

actcttagtt tacacatata tatgatttga tttcgagaaa atgagaggcc tataatcttg 960

gttctgatac catgttagga agatccaagt ttaaaattat atggcttcaa gtagagtaac 1020

tgttttgact taaaaaccct attgcttatt atcatgatta tcaaaaattg gataatcatc 1080

aaacaagtac ttaaaaaccc tattccttat tatcatgatt atcaacaatt ggataatcat 1140

gaagtcaaaa catctatttt tcttggatct aaatgtaaaa aaggaaaaaa aaataaaaaa 1200

tggggggcta atttaatttt tcttaaacaa ttttttttta aataaaaatt aatcaaataa 1260

actatttatt aaaaactcat taagccccta atgaaaatgt gagttgaagc catgaactca 1320

ttaatcaaac aagatttaaa gcaacttgga tttaacatat taaaaaatca ttaacatata 1380

taaatataat taattagatc atccaaatct tcactctctc ctatataatc aaggctgaag 1440

aaaaccaatt cccaaacacc tcaaatttgg tctctcaagc ccattttctc tcatt 1495

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgcgtcgac acagggcttc tatatctatg aca 33

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggaattca atgagagaaa atgggcttg 29

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgcgtcgac gcccctaatg aaaatgtgag t 31

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatcttgctg gtcgtgatct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acttccggac atctgaacct 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcgacttct gctattgtag g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggttgttgt ccagggttat g 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgttatggt tgggatggg 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgctgactat gccgtgttc 19

Claims (8)

1.杜仲DIR1基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种重组表达载体，包含权利要求1所述的启动子。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，由权利要求1所述的启动子与原始载体pCAMBIA1391z Vector经重组得到。

4.一种重组细胞，含有权利要求1的启动子或权利要求2或3的重组载体。

5.根据权利要求4所述的一种重组细胞，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组根瘤农杆菌细胞。

6.权利要求1所述的杜仲DIR1基因启动子的克隆方法，其特征在于，所述启动子的克隆方法包括：以杜仲幼嫩叶片为材料，利用CTAB法提取DNA，设计特异引物对扩增杜仲DIR1基因启动子。

7.根据权利要求6所述的克隆方法，所述特异引物对的核苷酸序列如下：

上游引物EuDIR1p-F：ACGCGTCGACACAGGGCTTCTATATCTATGACA，

下游引物EuDIR1p-F：CCGGAATTCAATGAGAGAAAATGGGCTTG。

8.权利要求1所述的杜仲DIR1基因启动子在高效启动杜仲DIR1基因表达中的应用。

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