JPH07506250A - 細胞物質培養のための可変容積反応器型装置および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞物質培養のための可変容積反応器型装置および方法 本発明は液状培養媒質の存在において固体粒子の形の生体細胞物質を培養する装 置に関するものである。この場合、「生体細胞物質の固体粒子」とは、全部また は一部生体細胞物質から成り、他の部分は適当なら基質または固体化物質などの 中性物質から成る粒子を意味するものとする。これは例えば、植物の根または不 活性基質上に被覆された分離細胞など、植物の細胞クラスターまたは植物組織の 一部とする事ができる。前記細胞は一般に微細であるので、本発明の装置は実際 上、液状媒質の中ての細胞培養装置を成し、この場合、前記粒子が細胞を含む。

この装置は、前記液体によって完全に充填され前記固体粒子を液体と接触状態に 保持するケーシングを含む。従ってこの装置は、ケーシングに前記液体を供給し また排出する手段と、前記固体粒子を保留し液体から分離して固体粒子をケーシ ング中の特定区域に保持する手段と、オプションとして液体をケーシングの外部 に循環させ処理する手段とを含む。本発明の他の主旨は、粒子と液体との反応を 生じる方法、特にこのような装置を使用して細胞を液状媒質の中で培養する方法 にある。

この型の反応器は国際特願ｗｏ第８６．０５２０２号に記載されている。しかし この特願に記載の装置は可変容積を有していなかった。この場合、胚を正確に発 育させるには細胞をその一定の体積密度で培養し、場合によっては培養ケーシン グの容積を増大する事によりこの細胞の体積密度を低下させる事が望ましい事が 明がである。

またこれは、部分的には胚の熟成段階中に、熟成に対して促進的または抑止的作 用を有する化合物を抽出する事によって実施される。

さらに前記特願に記載の反応器は、固体粒子または細胞を流動床状態に保持する ためその循環区域の近くに、液体媒質を循環させる螺旋部材（２８）を備える。

しかしこの装置は、粒子または細胞を損傷しまたは有害な影響を与えるおそれが ある。特に、例えばシステムの擾乱または機能不全の場合に、これらの粒子また は細胞が流動床から脱出する危険性がある。

本発明の主旨は、培養の展開中に細胞の一定体積密度において生体細胞物質を培 養する事によって、先行技術の反応器の問題点を解決するにある。

そのため、本発明は、 一複数の壁体によって画成されたケーシング（５）から成る培養チャンバであっ て、前記壁体の少なくとも１つの壁体０）が可動であって、ケーシングが可変容 量をＨするようにした培養チャンバと、−前記ケーシング（５）に液体を供給し 、排出Ｉ５また循環させる手段（３ａ、３　ｂ）と、−生体細胞物質の固体粒子 を保留しまた液状培養媒質から分離してケーシング（５）の中に保持する手段（ ｌａ、６）とを含み、 固体粒子を液状培養媒質と接触させ、前記培養媒質に対する前記生体細胞物質の 体積密度を実質的に一定に保持する事のできる固体粒子状の生体細胞物質の培養 装置において、 前記培養チャンバ中の培養媒質の体積を変動させるため、特に培養の生育中に培 養媒質の体積を増大させまた生体細胞物質の体積を増大させるため、前記ケーシ ングの前記の少なくとも１つの可動壁体（１）から成る手段を含む事を特徴とす る装置を提供する。

本発明の実施態様において、前記ケーシングが少なくとも部分的にシリンダを画 成し、前記ケーシングの前記可動壁体がシリンダの可動底部から成る。

また、前記ケーシングが少なくとも部分的にシリンダを画成し、前記シリンダが ピストンと漏れ防止的に相互作用し、前記ピストンが前記シリンダの中を移動し て、その位置に対応してケーシングの容積を変動させ、前記ピストンの底部がケ ーシングの可動壁体を成す。

また好ましくは、前記ケーシングは円筒形カラムから成り、前記液体を供給し排 出する手段が前記カラムの各端部に配置され、これらの端部の一方が前記シリン ダと前記ピストンから成り、前記ピストンか前記カラムの一端においてケーシン グの液体を供給しまたは排出する手段を含み、他方の液体供給／排出手段が前記 カラムの他方の端部に配置されている。

本発明の特に有用な実施態様において、粒子を保留し液体から分離する前記手段 は２つのスクリーンから成り、これらのスクリーンのメツシュは固体粒子を通過 させず、またこれらの手段がケーシングの他の壁体と共に、液体と固体粒子との 接触区域を画成する。

望ましくは、スクリーンのメツシュは当業者には明かなように下記パラメータの いずれか１つまたは複数に対応して選定される。すなイっち、粒子の粒径および 液状媒質に対する粒子密度、およびこの媒質の所望の速度。従って、本発明のこ の実施態様においては、粒子を流動床状態に保持する事かできる。例えば、粒子 が植物細胞クラスターである場合、メツシュは近似的に３０ミクロンとする事か できる。

本発明による固体粒子の粒径は広い範囲内から選定される。この範囲は一般的に １μｍ乃至５ｃｍである。

２０μｍ以上の粒子、すなわち２０μｍのメッシュによって保留される粒子の場 合、スクリーンは例えばフレーム中に固定された特にステンレス鋼の織布、また は焼結ステンレス鋼などの焼結物質のディスクとする事ができる。

２０μｍ以下の粒径の粒子の場合、スクリーンとして粒径より小さい孔を有する ろ過膜を使用する事が好ましい。

本発明によれば、スクリーンまたは膜のメツシュまたは孔の粒径は一般に０．５ μｍから数ｍｍ、例えば５ｍｍの範囲内にある。

本発明の実施態様によれば、前記可動壁体は特にピストン底部から成り、液体か ら固体粒子を保留して分離する手段は特に前記の型のスクリーン手段を含む。

好ましくは本発明による装置においては、前記ケーシングは円筒形カラムから成 り、前記カラムは円筒形壁体と前記シリンダの底部を成す両端壁とを有し、前記 端壁はそれぞれスクリーンを含み、これらのスクリーンが液体媒質をケーシング の中に入らせて循環させまた排出するが粒子をケーシング中に保留し、またこれ らのスクリーンの少なくとも一方が可動である。

本発明の装置の他の好ましい実施態様においては、前記ケーシングはその壁体の 中に開閉可能の開口を含み、前記開口は前記液状媒質をケーシング中に導入しま たは排出し、あるいはケーシング中に固体粒子を含む媒質を部分的にまたは完全 に導入する事ができる。もし適当なら、前記開口は、ケーシングの容積が最大限 の場合にのみケーシング内部と連通ずる。このようにして、小型のケーシングの 中において培養または反応プロセスを実施する際に前記開口において乱流の生じ るおそれがない。

一般に、本発明による装置はケーシング外部において液体を循環させ処理する手 段を含み、前記手段は管と、可変流路型の、好ましくは逆転型の液状媒質ポンプ と、オプションとししての液状媒質タンクを成す容器と、それぞれ前記ケーシン グおよび前記容器の人口および出口に配置された遮断弁とを含む。

さらに詳しくは、前記容器は、例えば溶解ガスの温度、ｐＨまたは濃度を７１Ｆ ＋定するセンサーなど、液状媒質の組成を制御し、変更しまた／あるいは均質化 する各種手段と、新鮮な媒質または液状、溶解状および／またはガス状の媒質成 分などの各種物質または組成物を媒質から抽出しまたは添加するための手段とを 含む。

本発明の他の実施態様によれば、好ましくは遮断弁を備えた追加管を含み、前記 追加管は液状媒質を循環させるループを成し、前記ループはケーシングと前記ポ ンプとを含むが、媒質タンクとしての前記容器を遮断する。

本発明の他の好ましい実施態様によれば、さらに前記装置は、前記タンクを成す 前記容器において、媒質の少なくとも一部を交互にまたは連続的に抽出し、特に 媒質の中に最初から含有されていた物質と前記粒子との保温中に反応によって生 成された物質とを抽出し、この抽出された媒質を処理し、オプションとして前記 処理後に処理された物質を装置の中に、特に容器（１０）の中に循環させる手段 を含む。

特に、前記手段は、適当なりロマトグラフィー基質を含有し直列または並列に配 置された１つまたは複数の抽出カラムを含む。

例えば細胞または細胞クラスターから成る粒子が懸濁状態にある時、液状媒質の 循環手段によってこれらの粒子を撹拌する事ができる。この場合、粒子が反応器 の特定区域の中に集合されて液体の中を移動しなくなる事を防止するため、容器 の中にデッドスペースを生じるような容器形状を避けなければならない。

本発明の他のアスペクトにおいては、固体粒子状の生体細胞物質を培養する際に 培養チャンバ中において培養媒質に対する前記生体細胞物質の体積密度を実質的 に一定に保持するように成された方法において、前記生体細胞物質の体積の増大 中に、培養チャンバの容積を増大させる事によって培養チャンバの中の培養媒質 の体積を増大させる事を特徴とする方法が提供される。

本発明の他の実施態様においては、本発明の方法は、前記固体粒子が本発明によ る装置によって前記液状媒質と接触させられる段階と、前記ケーシングを液状培 養媒質によって完全に充填する段階と、培養中に前記可動壁体を移動させて前記 ケーシングの容積を増大させまた培養媒質を供給する事により、前記固体粒子の 体積密度を任意に制御する段階とを含む。

本発明の他の望ましい実施態様によれば、ケーシングの中に培養媒質を循環させ る事により、前記固体粒子を前記液状媒質の中において特に流動床状態で少なく とも間欠的に懸濁させる。

さらに本発明の他の実施態様によれば、特にケーシング中の懸濁粒子をよく撹拌 しまたよく分布させるため、また必要なら前記粒子保留手段、特にスクリーンを 洗浄するため、オプションとして循環方向を規則的にまたは不規則的に逆転させ ながら液状媒質を連続的または間欠的にケーシング中を循環させる。

前述のように、本発明の装置がケーシングの外部に媒質を抽出する手段と、新鮮 な媒質を添加する手段とを含む場合、反応中に液状媒質を部分的にまたは全部更 新する事ができる。

本発明によれば、反応の全パラメータ（媒質の温度、０２含有量、ＣＯ２含有量 、媒質の化合物含有量の変動など）の測定が反応中にケーシング外部において実 施される。

本発明の方法の他のフィーチャによれば、最初から液状媒質の中に含存されてい たにせよあるいは反応中に生成したにせよ液状媒質中の物質を前記手段によって 反応中に連続的または間欠的に抽出し、このようにして媒質の一部を抽出し処理 しまた／あるいは循環させる事ができる。

本発明の他の実施態様によれば、前記固体粒子は全部または部分的に生体細胞物 質から成り、部分的に生体細胞物質から成る場合には、残部は基質、または前記 の生体細胞物質を固定するため、特に封入するために当業者によって使用される 物質から成る。

前記不活性物質、特に前記生体細胞物質を固定するために使用される物質は、例 えばポリアクリルアミドなどのポリマー基質、カラゲナン・ゲルまたはアルギン 酸カルシウム・ゲルなとのイオノトロピック中ゲル、マイクロスポンジ状のコラ ーゲンなどの高分子量タンパク質、または好ましくは多孔性ビーズ状のガラスか ら成る事ができる。

前記生体細胞物質は、真核細胞または原核細胞などの細胞、特にバクテリア、カ ビ、イースト、ミドリムシ属またはミクロ藻類などの微生物、植物細胞、動物細 胞、ｒ　Ｔ　Ｉ　Ｌ　Ｊ　（Ｔｕｍｏｒ　Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ　Ｌｙｍｐ ｈｏｃｙｔｅｓ）　などの分化または未分化細胞クラスター、植物胚、または根 、塊茎または器官形成小節などの植物器官、あるいはミクロ胎芽またはプロトコ ルム、特にラン・プロトコルムなどのプラントレッドから成る事ができる。

特に、本発明の方法の実施に際して、浮動型の微生物を使用する事ができる。し かし分離された細胞または微生物、特にイーストまたはバクテリアなど非常に小 さい粒径の要素から成る場合、業界公知の適当な方法により、例えば前記の不活 性物質による包蔵によって前記要素を不動化する事が好ましい。

本発明による培養方法は、胚形成細胞クラスター、前胚形成細胞集団、または前 肢、あるいはいわゆる球状、魚雷型または子葉段階の胚などのすでに形成された 胚の培養によって、特にブドウまたはバラの植物体肢の生産に対して応用される 。

前記のような生体細胞物質、特に細胞、細胞クラスター、植物胚、植物器官また はプラントレフトの培養に応用される場合の本発明の利点は、液体媒質を直接に 培養チャンバの中で通気する必要のない事である。実際上、酸素カートリッジな どの通気手段は、培養チャンバ外部で循環する培養媒質の処理手段と合体させる 事ができる。

特にｒＴ　Ｉ　ＬＪについて述べれば、その製造中に、培養７０後に、ベレット 状粒子の得られる段階がある。従って量産の場合には、この「ペレット」段階に おいてＴＩＬを本発明の装置の中に導入する事ができる。この場合の培養媒質が 非常に高価であるので、特にタンクを分離した時に装置を非常に小量の媒質をも って操作できる事は非常に有利である。

本発明による装置および方法は、分子を含有する液状媒質の中において培養され る動物性または植物性細胞または微生物による前記分子の変換に応用する事がで きる。

本発明の方法によりタンパク質、フラボノイドなどのポリフェノール、サポニン 、テルペン、アルカロイド、ステロール、レチノイドまたはビタミンなどの分子 の生産を実施する事ができる。

以下、本発明を図面に示す実施例について詳細に説明するが本発明はこれに限定 されるものではない。

第１図は本発明による装置の全体ダイヤグラム、第２図は液状媒質から物質を抽 出し分離する事のできる抽出手段の実施態様を示すダイヤグラム、第３図は本発 明による反応器のケーシングを示す縦断面図である。

非限定的に特に細胞培養に適した装置を第１図乃至第３図に示す。第１図の装置 の中には下記部品が示されている。

１−ケーシングの可動壁体、 １ａ−粒子を保留するため可動壁体の中に合体されたスクリーン、 ２−スクリーンを洗滌するためのポンプ用管および遮断弁、 ３ａ−作動容積を調整するため、ピストンの中にケーシングの液体を供給しまた 排出する手段、３ｂ−ピストンの下端に液体を供給しまた排出する手段、 ４−円筒形力ラム、 ５−変動容積型ケーシング、 ６−粒子を保留するスクリーン、 ７−遮断弁、 ８−可変流および／または可逆流循環ポンプ、９−媒質抽出管、 １〇−液体媒質タンクを成す容器、 １１−媒質の戻し管、 １２−遮断弁、 １３−特に細胞をケーシングの中に導入するための開閉自在開口、 〕４−滅菌フィルタ、 １５−酸素添加カートリッジ、 １６　ａ−新しい媒質またはｏ２、ｃｏ２、Ｎ２などの各種ガスの泡立て導入口 、 １６ｂ−媒質のホモジナイザー、 １７．１８ａ、１８ｂ−遮断弁、 １９ａ、ｂ、１．９−１．１．９−２．１９−３−ケーシング外部の回路管、 ２１−容積調整用ピストン。

第１図において、可変容積ケーシング５を成す円筒形カラム４はその両端におい て円錐形に終わってる。ケーシング５の可動壁体１はピストン２１の底部から成 る。

ピストンはＯリングシール２３によって円筒形カラム４の内側面と密封的に相互 作用する（第３図）。ピストンはカラム４の上端において液体を供給／排出する ための手段３ａを含む。カラム４の下端においては、手段３ｂか液体の供給、／ 排出を可能とする。粒子はケーシング５の中に３０μメツシユのスクリーンによ って保持され、スクリーンの一方（１ａ）はピストン２１の底部の中に包囲され 、他方のスクリーン（６）はカラムの底部に配置されている。

第１図と第３図の実施例において、ケーシング５がその最大容積を占める位置に ピストンが存在する時、ケーシング５は開口１３と連通し、これにより液体をケ ーシングの中に導入しまたは排出し、あるいは粒子をケーシングの中に導入する 事ができる。

ケーシング５の外部に液体を循環させ処理する手段は、第１図に図示のように管 （１９ａ、１９ｂ、１９−１゜１９−２．１９−３）と、液体流量を変動させま た／あるいは流れ方向を逆転させる可変流嬬動ポンプ８とを含む。第１゜図にお いて、液体がケーシング５の中を上から下に循環する時、この液体は管（３ｂ、 １９ａ、１９−１．１９−ｂ、３ａ）を通って循環し、弁１−８　ａと１８ｂが 閉鎖されまた弁７．１７．１−２が開放されている。

液体か逆方向に循環する際に、液体は枝管１９−３および１９−２を通ってタン ク１０の中を循環する。この場合には、弁１８ａ、１．８ｂを開き、弁１７を閉 じる必要がある。

タンク１．０の液体媒質から物質を排出し、抽出し、分離する通常手段を第２図 に図示する。

２５−媒質から化合物を抽出するための抽出管、２６−無菌化フィルタ、 ２７−可変流循環ポンプ、 ２８−三方弁、 ２９−クロマトグラフィー基質カラム、３０−三方弁、 ３１−可変流循環ポンプ ３２−無菌化フィルタ、 ３３−化合物抽出後の媒質戻しライン。

第２図において、クロマトグラフィー基質カラムの代わりに、相異なる化合物の 抽出を可能とするように、直列または並列に配備された複数のカラムを使用する 事ができる。

特に細胞、細胞クラスター、胚または根を培養するに適した反応器のケーシング の実施態様を示す第３図には、下記部品が示されている。

２〇−円筒形力ラムのフタ、 ２１−ピストン本体、 ２２−ピストンと一体を成す円筒形フード、２３−０リングシール、 ２４−シートガスケット。

第３図において、前記フタ２０は着脱自在であって、ピストンの除去後に必要な らば根などの固体粒子を除去する事ができる。

また第３図において、円筒形カラム４の底部はスクリーン６に当接するように配 置され、このスクリーン６そのものはシートガスケット２４に対して漏れ防止的 に当接する。

下記において植物胚の生産の再生プロセスを説明するが、本発明による装置およ び方法は下記の３段階を含む。

−胚形成細胞、胚形成細胞クラスター、前胚形成細胞集団、球状段階における前 肢および／または胚の拡散段階、 〜胚形成細胞クラスター、前胚形成細胞集団、または前肢の胚への発育、および このようにして形成された胚の熟成段階、 一胚の発芽を植物に導入するための胚処理段階。

簡単化のため、本明細書およびクレームにおいて、用語「熟成」は胚形成細胞ク ラスター、前胚形成細胞集団、または前肢の胚への発育と、このようにして形成 された胚の熟成とを含むものとし、これらの２プロセスは培養条件および／また は考察される植物スビーシズに依存して継起しまたは多少とも同時的に生じる。

１）培養媒質によるケーシングの充填 前述のように熟成は８０ｍ１の培養媒質の中で開始される。ピストンをこの容積 に対応する高さまで上昇させる。管２と１３を閉じる。

抽出管９と管１９ａに接続された螺動ポンプ８によって、タンク１０からカラム 底部の管３ｂを通してケーシングに媒質を充填させる事ができる。ケーシングが 充填された時、媒質は管３ａと次の管１９ｂとを通してケーシングの上端から出 る。管］、　９　ｂと管１１とを接続する事により、媒質タンク１０まで回路が 接続され、ケーシングに媒質が充填され、回路全体を２０分間、１２０”Ｃでオ ートクレーブする。タンクは、業界公知のムラシゲ／スクーグ型の媒質を約１リ ットル収容し、成長ホルモンを含まない。

２）クラスグーの形の細胞の導入 オートラリーブ後に、無菌処理のため装置をフードの流れの中に配置する。管２ と１３を開き、ピストンをできるたけ上昇させる。媒質ミリリットルあたり８０ マイクロリツトルのクラスターの形の細胞を管１３を通して導入し、１ミリリツ トルの無菌媒質によって洗浄を実施する。空気を排除するようにピストンをでき るたけ下降させる。次に管２と１３を閉鎖する。次にポンプ８を作動してカラム ４の中で液体を循環させると、微細クラスター（２００μｍ乃至５００μｍ）を ８０ｍ１（７）培養媒質の中に懸濁させる効果を生しる。望ましくは、大流量期 間と小流量期間またはゼロ流量期間とを交互にする事によってポンプ８をｉｔＪ 変流条件で作動させると、懸濁クラスターを撹拌状態に保持する効果を生じる。

他の実施態様として、最小限量の媒質を導入するため、管１９ａを管１９ｂに管 １９−１を通して直接に接続し、循環を閉回路中において実施する事ができる。

このようにして一般にある種の成長ファクタのプラス効果が良好な結果を生じる 。さらにこの場合、ポンプを前記のような可変条件で作動させるのみならず、逆 方向に作動させる事によってクラスターの撹拌をさらに改良する事が可能であり また望ましい。

３）体肢の培養 ４日間の培養後に、ピストンを数センチメートル上昇させる事によって、培養の 体積を増大させる。これを１２日間継続し、培養体積を毎日約３０ｍ１増大させ て４５０乃至５００ｍ１　（チャ：／バの最大容積）の最終体積を達成する。ま た胚の培養中に二、三回、カラムとタンクを空にする事によって媒質を完全に更 新しタンク１０の中に管１６ａから新しい培養媒質を補給する事もてきる。これ は下記のように回路を空にし停止させる事によって実施される。

４）体肢の培養の停止 管２を開いた後に、カラム中に収容された媒質がポンプ８によってタンクに向か ってポンプ輸送される。チャンバ５から媒質か排除され、胚はカラム４の底部の フィルタ６（スクリーン）上に堆積される。カラム４（第３図）を無菌的にネジ 戻し持ち上げる。フィルタ６と、発育して根と子葉を有する胚とが回収される。

そこで、これらを１つづつ適当な基質上に植え付ける事ができる。

比較分析： １）第１段階二細胞クラスターの拡散。

従来の培養システムにおいては、培養は２５０ｍ１エーレンマイヤーフラスコの 中において、８０ｍ１媒質中にｍｌあたり２０μｌの密度で実施される。１５日 後に密度は８０マイクロリットル／ｍｌとなった。この密度において、細胞の壊 死が生じていなければ、４エーレンマイヤーフラスコの中への分割が必要である 。この操作は手作業であって、微生物汚染が顕著である。

可動ピストンを使用する本発明の装置のプロセスの故に、外生〆り染のおそれな く、自動的に培養媒質を添加する事により媒質ｍｌあたり２０μｌの細胞クラス ター密度を生じる事ができ、これは工業生産にとって本質的利点を成す。

２）第２段階二細胞クラスタ一段階から心臓形の胚段階までの熟成と移行。

従来のシステムにおいては、出発密度は１乃至２μｌ細胞／ｍｌであって、１５ 日の培養後に４０μｌ細胞／ｍｌに達する（８０ｍｌの媒質を収容する２５０ｍ １エーレンマイヤーフラスコ中において）。１５０の熟成中に、細胞の胚への発 育が阻止されなければ、１乃至２μｍ細胞／　ｍ　Ｉの密度に保持する必要があ る。工業生産においては、頻繁な追加媒質の手作業供給は実施できない。

さらに細胞は媒質中にタンパク質型またはその他の型の阻害物質を放出する可能 性があり、この阻害物質をエーレンマイヤーフラスコから除去する事が問題にな る。

本発明の方法および装置は、前述のように細胞クラスターの体積密度を保持する 事が可能であり、さらに循環回路の培養チャンバ５の外部に適当なろ過システム （１５乃至３３）を配備する事により阻害型の分子を定期的にまたは連続的に除 去する事ができる。

３）第３段階：心臓型段階から、根および２つの子葉を有する胚段階への移行。

胚の正確な発育を生じるためには、この段階において培養媒質を他の媒質と交換 する必要があり、この操作は漸進的に実施されなければならない。エーレンマイ ヤーフラスコの中において、この操作は技術的に問題がある。

この場合にも本発明の方法および装置の利点は明かである。さらに熟成および培 養媒質の処理のために、本発明の方法は胚および細胞クラスターを損傷する事な く、各種パラメータ、すなわち０２．ＣＯ２，Ｎ２、温度、撹拌速度、ｐＨ１お よび培養媒質の組成を制御し測定する事ができる。

国＠鴎審輔委 、　＋＋ｊｌ＋　ＰＣＴ／ＦＲ９３１００４３７フロントページの続き （７２）発明者　メイベツク、アラン フランス国りルブボワ、リュ、ド、プシン、２０テール （７２）発明者　ピエリー、ギ フランス国トウールーズ、アブニュ、カミーユーピュジョル、５３ （７２）発明者　ラボ−、ジャン−ノニルフランス国トウールーズ、アレ、デ、 トモアゼル、８０

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．−複数の壁体によって画成されたケーシング（５）から成る培養チャンバで あって、前記壁体の少なくとも１つの壁体（１）が可動であって、ケーシングが 可変容量を有するようにした培養チャンバと、−前記ケーシング（５）に液体を 供給し、排出しまた循環させる手段（３ａ，３ｂ）と、−生体細胞物質の固体粒 子を保留しまた液状培養媒質から分離してケーシング（５）の中に保持する手段 （１ａ，６）とを含み、 固体粒子を液状培養媒質と接触させ、前記培養媒質に対する前記生体細胞物質の 体積密度を実質的に一定に保持する事のできる固体粒子状の生体細胞物質の培養 装置において、 前記培養チャンバ中の培養媒質の体積を変動させるため、特に培養の生育中に培 養媒質の体積を増大させまた生体細胞物質の体積を増大させるため、前記ケーシ ングの前記の少なくとも１つの可動壁体（１）から成る手段を含む事を特徴とす る装置。
2. ２．前記ケーシング（５）が少なくとも部分的にシリンダを画成し、前記ケーシ ングの前記可動壁体（１）がシリンダの可動底部から成る事を特徴とする請求項 １に記載の装置。
3. ３．前記ケーシング（５）が少なくとも部分的にシリンダ（４）を画成し、前記 シリンダ（４）がピストン（２１）と漏れ防止的に相互作用し、前記ピストン（ ２１）が前記シリンダ（４）の中を移動して、その位置に対応してケーシング（ ５）の容積を変動させ、前記ピストン（２１）の底部がケーシング（５）の可動 壁体（１）を成す事を特徴とする請求項１または３のいずれかに記載の装置。
4. ４．前記ケーシング（５）は円筒形カラム（４）から成り、前記液体を供給し排 出する手段が前記カラム（４）の各端部に配置され、これらの端部の一方が前記 シリンダと前記ピストンから成り、前記ピストンが前記カラム（４）の一端にお いてケーシングの液体を供給しまたは排出する手段（３ａ）を含み、他方の液体 供給／排出手段（３ｂ）が前記カラム（４）の他方の端部に配置されている事を 特徴とする請求項３に記載の装置。
5. ５．前記可動壁体（１）、特にピストン（２１）の底部が、固体粒子を保留し液 体から分離するための手段（１ａ）を含む事を特徴とする請求項１乃至４のいず れかに記載の装置。
6. ６．前記ケーシングは円筒形カラムから成り、前記カラムは円筒形壁体と前記シ リンダの底部を成す両端壁とを有し、前記端壁はそれぞれスクリーン（１ａ，６ ）を含み、これらのスクリーンが液体媒質をケーシングの中に人らせて循環させ また排出するが粒子をケーシング中に保留し、またこれらのスクリーンの少なく とも一方が可動である事を特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の装置。
7. ７．前記ケーシングはその壁体の中に開閉可能の開口（１３）を含み、前記開口 は前記媒質をケーシング中に部分的にまたは完全に導入しまたは排出し、あるい はケーシング中に固体粒子を導入する事ができる事を特徴とする請求項１乃至６ のいずれかに記載の装置。
8. ８．前記開口（１３）は、ケーシングの容積が最大限の場合にのみ、ケーシング 内部と連通する事を特徴とする請求項７に記載の装置。
9. ９．前記装置はケーシング外部において液体を循環させ処理する手段を含み、前 記手段は管（１９−２，１９−ａ，１９−ｂ，１９−３）と、可変流路型の、好 ましくは逆転型の液状媒質ポンプ（８）と、オプションとししての液状媒質タン クを成す容器（１０）と、それぞれ前記ケーシングおよび前記容器（１０）の入 口および出口に配置された遮断弁（７，１２，１８ａ，１８ｂ）とを含む事を特 徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の装置。
10. １０．前記容器（１０）は、例えば溶解ガスの温度、ｐＨまたは濃度を測定する センサーなど、液状媒質の組成を制御し、変更しまた／あるいは均質化する各種 手段（１６ｂ）と、新鮮な媒質または液状、溶解状および／またはガス状の媒質 成分などの各種物質または組成物を媒質から抽出しまたは添加するための手段（ １６ａ）とを含む事を特徴とする請求項９に記載の装置。
11. １１．好ましくは遮断弁（１７）を備えた追加管（１９−１）を含み、前記追加 管は液状媒質を循環させるループを成し、前記ループはケーシング（５）と前記 ポンプ（８）とを含むが、媒質タンクとしての前記容器（１０）を遮断する事を 特徴とする請求項９または１０のいずれかに記載の装置。
12. １２．さらに前記装置は、前記タンクを成す前記容器（１０）において、媒質の 少なくとも一部を交互にまたは連続的に抽出し、特に媒質の中に最初から含有さ れていた物質と前記粒子との保温中に反応によって生成された物質とを抽出し、 この抽出された媒質を処理し、オプションとして前記処理後に処理された物質を 装置の中に、特に容器（１０）の中に循環させる手段（２５乃至３３）を含む事 を特徴とする請求項１乃至１１に記載の装置。
13. １３．前記手段（２５乃至３３）は、適当なクロマトグラフィー基質を含有し直 列または並列に配置された１つまたは複数の抽出カラムを含む事を特徴とする請 求項１２に記載の装置。
14. １４．固体粒子状の生体細胞物質を培養する際に培養チャンバ中において培養媒 質に対する前記生体細胞物質の体積密度を実質的に一定に保持するように成され た方法において、前記生体細胞物質の体積の増大中に、培養チャンバの容積を増 大させる事によって培養チャンバの中の培養媒質の体積を増大させる事を特徴と する方法。
15. １５．前記固体粒子が請求項１乃至１３のいずれかに記載の装置によって前記液 状媒質と接触させられる段階と、前記ケーシング（５）を液状培養媒質によって 完全に充填する段階と、培養中に前記可動壁体（２１）を移動させて前記ケーシ ングの容積を増大させまた培養媒質を供給する事により、前記固体粒子の体積密 度を任意に制御する段階とを含む事を特徴とするを請求項１４に記載の方法。
16. １６．ケーシング（５）の中に培養媒質を循環させる事により、前記固体粒子を 前記液状媒質の中において特に流動床状態で少なくとも間欠的に懸濁させる事を 特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
17. １７．特にケーシング（５）中の懸濁粒子をよく撹拌しまたよく分布させるため 、また必要なら前記粒子保留手段（１ａ，６）、特にスクリーンを洗浄するため 、オプションとして循環方向を規則的にまたは不規則的に逆転させながら液状媒 質を連続的または間欠的にケーシング（５）中を循環させる事を特徴とする請求 項１４乃至１６のいずれかに記載の方法。
18. １８．液状媒質を抽出しまた新鮮な媒質を添加する前記手段（１６ａ）によって 、液状媒質を反応中に部分的にまたは完全に更新する事を特赦とする請求項１４ 乃至１７のいずれかに記載の方法。
19. １９．最初から液状媒質の中に含有されていたにせよあるいは反応中に生成した にせよ液状媒質中の物質を前記手段（２５乃至３３）によって反応中に連続的ま たは間欠的に抽出し、このようにして媒質の一部を抽出し処理しまた／あるいは 循環させるように成された事を特徴とする請求項１４乃至１８のいずれかに記載 の方法。
20. ２０．前記固体粒子は全部または部分的に生体細胞物質から成り、部分的に生体 細胞物質から成る場合には、残部は基質、または前記の生体細胞物質を固定する ため、特に封入するために使用される物質から成る事を特徴とする請求項１４乃 至１９のいずれかに記載の方法。
21. ２１．前記生体細胞物質は、真核細胞または原核細胞などの細胞、特にバクテリ ア、カビ、イースト、ミドリムシ属またはミクロ藻類などの微生物、植物細胞、 動物細胞、「ＴＩＬ」（Ｔｕｍｏｒ　Ｉｎｆｉｉｌｒａｔｉｎｇ　Ｌｙｍｐｈｏ ｃｙｔｅｓ）などの分化または未分化細胞クラスター、植物胚、または根、塊茎 または器官形成小節などの植物器官、あるいはミクロ胎芽またはプロトコルム、 特にラン・プロトコルムなどのプラントレットから成る事を特徴とする請求項１ ４乃至２０のいずれかに記載の方法。
22. ２２．分子を含有する液状媒質の中において培養される動物性または植物性細胞 または微生物による前記分子の変換に応用される事を特徴とする請求項１４乃至 ２０のいずれかに記載の方法。
23. ２３．タンパク質、ポリフェノール、サポニン、テルベン、アルカロイド、ステ ロール、レチノイドまたはビタミンなどの分子の生産に応用される事を特徴とす る請求項２２に記載の方法。
24. ２４．胚形成細胞クラスター、前胚形成細胞集団、または前胚、あるいはいわゆ る球状、魚雷型または子葉段階の胚などのすでに形成された胚の培養によって、 特にブドウまたはバラの植物体胚の生産に対して応用される事を特徴とする請求 項１４乃至２０のいずれかに記載の方法。