JPS62500701A - バイオトランスフォ−メ−ション反応に関する改良 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 バイオトランスフォーメーション反応に関する改良本発明はバイオトランスフォ ーメーション反応、並びにかかるトランスフォーメーションにおいて使用する生 物学的物質の固定に関する。

植物および動物細胞培養物を高価値低量製品の産生においての使用に対する関心 が高まっている。例は植物細胞培養物からの医薬品（例えば、アルカロイド、ビ タミンおよび抗癌剤）、フレーバー、香料、顔料、ホルモン、酵素および遺伝子 工学物質である。さらに、例は動物細胞培養物からの単クローン抗体、ワクチン 、酵素、ホルモン詔よびインターフェロンである。

植物および動物細胞は脆弱で、剪断に対する耐久性が低い、それらは相互に接触 した状態でいることを好む。細胞−細胞間の接触は２次代謝産物の形成を改良で きるという最近の証拠がある。これらの低剪断環境および細胞−細胞間接触の要 件を提供する１つの方法に固定化がある。

種々の技術が生物学的物質を支持体上に固定するのに用いられている。すなわち 、例えば、英国特許出願Ａ−２００６１８１号は生物集団の存在下、容器中の液 体中で攪拌され、生物集団のいくらかが支持体上に固定化される、実質的な内部 空隙率を有する支持体の使用を記載している。

さらに詳しくは、小さな網状フオーム粒子を、自由に＠濁した微生物を担持する バルク液中、散布空気を用いて動かす。しかし、この方法には２つの不利がある 。第１に、微生物を担持する液体成分がフオーム粒子とほとんど同じ速さで動き 、その結果、微生物とフオーム粒子間の相対速度値がほとんど零となる。従って 、起こる全ての固定化は微生物とフオーム粒子とのランダムな、制御されない衝 突による偶然によるものである。第２の不利は散布した気泡の該フオーム粒子中 への捕獲に起因するものであり、それによりフオーム粒子が液体表面まで浮上し てしまう。これが起こると、混合状態が破壊され、効果的な固定化が起こらない Ｏ 生物学的物質を支持体上に固定化するもう１つの方法においては、支持物質（例 えば、網状プラスチックフオームの小さい立方体）を単に、生物集団を含有する 液体中に導入するものである。生物集団の一部は支持体上に移り、そこに固定化 された状態となる。しかし、ここでも、糸が数週間放置された後でさえ固定化さ れた物質の割合は大きくない。

前記の方法により達成される比較的低い固定化度は、固定化された物質で行なわ れるバイオトランスフォーメーション反応が所望の産生物の満足する収率を与え ないかも知れないという不利を有する。加えて、低い細胞−細胞間接触度は、固 定化された物質がバイオトランスフォーメーション反応の経済的実施のために十 分に長い期間にわたって活性を残存させないということを意味するかも知れない 。

本発明の目的は前記の不利を除去するかまたは軽減することにある。

本発明の第１の態様によれば、 （ａｌ　液状媒体中の生きているもしくは生化学的に活性な細胞および／または 組織および／またはプレ固定化された生物触媒より成る粒子より成る生物学的物 質の懸濁液を、該生物学的物質を濾過できる液体浸透性部材に通して該液状媒体 から該生物学的物質を戸数することにより生物学的物質を固定し、（該部材は一 体物またはその成分が相互に実質的に固定した立体関係に維持されている複合体 である）； （ｂｌ　該部材上に支持された該生物学的物質を液体および／または気体の培地 と接触させてバイオトランスフォーメーション反応を実行して生成物および／ま たはバイオマスを形成し；および ｆｃ）　該生成物の回収および／または該バイオマスの収集をする： より成るバイオトランスフォーメーションを行う方法が提供される。

本発明の第２の態様によれば、液状媒体中の生化学的に活性な細胞および／また は組織および／またはその懸濁液からプレ固定化された生物触媒より成る粒子の 形態である生物学的物質固定用装置が提供され、該装置は容器、生物学的物質を 戸数できる該容器内の液体浸透性部材（該部材は一体物またはその成分が相互に 実質的に一定に固定された関係に維持されている複合体である）および該装置の 使用時に、容器中に保持される液体と支持部材間の相対速度を、液体中の懸濁液 中の生物学的物質がそこから戸取されかつ支持部材上に保持されるように定める 手段より成る。

前記の方法および装置の重要な特徴は該漏逸を行う液体浸透性部材である。この 部材は一体の構造体であってもよく、または液体浸透性であるかおよび／または 液体浸透性ユニットとして配置されるかのいずれかであって、例えば、液体浸透 フレーム構造により相互に実質的に固定された関係に維持された複数の単位成分 より成る複合体であってもよい。複合体の生物学的物質の戸数を効果的にさせる のは該複合体の成分部品を実質的に固定した立体関係で維持することにある。

本発明の方法において、生物学的物質は、懸濁している液体を十分に大きな相対 速度で液体浸透性部材を通すことにより懸濁液から洲過される。生物学的物質は 固定により該部材上に捕獲され（該部材に関して固定化されたと言えるように） 、次いで後にさらに詳しく説明する如く、バイオトランスフォーメーション反応 に用いることができる。

本発明で用いる固定技術は、先行技術の固定化技術とは、この後者の技術におい ては固定化物質用の支持体が自由に液体中をランダムに移動し、これに対して本 発明の技術においては液体浸透性支持体部材が容器内で静止しているかあるいは 該部材に予め定めた運動を提供するローターなどの上に設置される点で区別され る。

生物触媒に関して本明細書中で用いる「プレ固定化された」なる語は前節に記載 した洲過による固定と区別されるべきである。プレ固定化された生物触媒は、例 えば、ヨーロッパ特許出願Ａ−２２４３４号に記載された方法によって生物触媒 を粒子状物質（例えば、ポリマー・ゲル・ビーズまたはイオン交換樹脂）の中あ るいは上に固定化することによって製造される。これらの粒子の懸濁液は本発明 の方法で用い、固定によって液体浸透性部材上に保持できる。

本発明の固定工程は生物学的物質のバルク液体からの速い洲過速度のために通常 の固定化技術よりも非常に速いものである。このため汚染の危険が減少され、か つ生物学的物質の損傷がほとんど無い。発明者らの実験のいくつかにおいて、全 物理的捕獲は１０分も要さなかった。

急速な固定に加え、本発明の方法によって達成される比較的高い固定度は物質の 「安寧」に役立ち、その結果核物質が支持体上で特定の「濃度」まで成長するの に必要な時間が短くなる。さらに、固定された物質の活性は他の固定化技術で得 られるものより長い。これは支持体上に固定化された生物学的物質の量がより多 く、これにより該物質の成長に必須の物質の輸送を容易にすることによる。小さ な網状フオーム粒子がバルク液体中を動く前記した方法に対する本発明のさらに 利点は、この前者の技術においては、リアクターの最大３０　ｖｏ１％だけがフ オーム粒子で占められうるということである。３０％より多いフオーム粒子量は 該粒子の循環の損失をきたす。リアクターのさらに多いｖｏｌパーセントを、本 発明の方法を用いることにより支持体によって占めることができる。

液体浸透性部材は好ましくは（生物学的物質に対して）非毒性、非腐食性、滅菌 適性、および所望により可燃性の物質よりなる。好ましい部材はその中に生物学 的物質を固定によって保持できる複数の相互連絡した孔を提供する実質的な内部 空隙率を有するプラスチック（例えば、ポリウレタン）フオーム材料の一体物（ 例えばシート）の形態である。しかし、該液体浸透性部材は種々の他の構造とす ることができる。例えば、該部材は１次元もしくは２次元材料または３次元構造 の網目より成ってよい。１次元材料は複数の孔で網目構造の輪郭を決めるべく配 置された適当な材料の真直なまたはカールしたラス、ファイバー、ストランドま たは糸とすることができる。２次元構造体は平担な、波打った、またはカールし たスクリーン、シート、プレートなどとすることができる。３次元構造はランダ ムなまたは一様なサイズおよび幾何学の空隙の連続的な、相互に連絡した網目を 有するように製造することができる。かかる１、２または３次元支持物質を製造 するのに適した材料はステンレス鋼、ガラス、ガラスファイバー、炭素繊維、セ ラミック、合成および天然ポリマー、セルロース、綿、リンネル、ウール、木材 または他の天然または合成材料である。

液体浸透性部材は懸濁液中で静止して保持してもあ合は１次いで、懸濁した物学 的物質を担持する流体を、△ 適当なかき混ぜ機、ポンプまたはエアリフト技術を用０て支持媒体を通過させて 流動させることができる。

支持媒体を機械的に動かす場合は支持媒体の動きが十分す混合および流動を与え るので、該流体をかき混ぜる必要はない。しかし、流体のかき混ぜと支持媒体の 機械的動きを同時に使用することも可能である。生物学的物質と支持媒体間の適 当な相対速度が容易に得られかつ制御できる。この様に、生物学的物質は支持媒 体により流体から効果的に戸数され、かつ物理的に支持媒体中あるいは支持媒体 間に捕獲される。この固定工程は粒子状物質の沖過と同様と考えられる。

物理的捕獲工程は未だ捕獲されていない残りの生物学的物質を含有する液状媒体 を、満足できる濃度の捕獲が得られるまで循環させることによって継続される。

２次元支持媒体中の孔のサイズ、３次元支持媒体中の孔のサイズおよび１次元支 持体間のスペースは生物学的物質のサイズ分布により、生物学的物質の大部分が 物理的に捕獲されるように決定できる。支持媒体を一緒に充填して均一にもしく はランダムに変化する孔サイズを有する構造をつくり出す必要があるかも知れな い。

固定用に利用可能な孔サイズ、または構造体内もしくは構造体間のスペースをサ イズ分布および捕獲されるべき生物学的物質の量により選択すれば、次いで、当 初自由に懸濁していた生物学的物質のほとんど全部がいずれの無駄な接種材料な しに固定化できる。これにより固定化後に非常に清澄なバルク液体が得られ、こ れは他の固定化方法においては容易に達成できないものである。

清澄なバルク液体のために、今や、要すれば内部もしくは外部光源またはガラス ファイバー材料を用いて生物学的物質を照明することが可能である。

清澄なバルク液体を有することにより多くの他の有利な可能性に到達できる。該 装置において、自由に懸尚させた生物学的物質でのパイプおよび開口の詰まりは ない。これより、固定された物質で行なわれるバイオトランスフォーメーション 反応の生成物は該装置から連続的に排出でき、新しいバッチを充填でき、あるい は液状媒体を、該装置を通して連続的に流動させることができる。混合および、 要すれば、エアレーションは清澄なバルク液体中でより容易にかつ効果的に実現 できる。

この最後の点は重要である。何故なら、支持媒体は静止しているかまたは流体機 構から独立して機械的に動かしているかのいずれかであるから、該支持媒体の動 きについての流体力学効果によって制限されることなくかき混ぜおよびエアレー ションの程度を選択できるからである。

発明者らは、他の固定化技術と比較して、発明者らの装置において利用可能なり アクタ−・スペースをよりよく使用出来るようにする。

支持媒体はその外部表面から内部へ通じる広い領域を必ずしも有する必要がない 。それらは生物学的物質の捕獲後、ポリマー、ゲルまたは半透膜のような適当な 物質で被覆して生物学的物質の内部への成長を制限し、また外部からの汚染を除 くこともできる。しかし、これらの被覆物質は、系中で見出されるある種の化学 化合物に対する浸透性を必要とする。

物理的捕獲自体は支持媒体中および／または間への生物学的物質を固定するのに 十分な強さでよい。別法として、支持媒体と生物学約物質問の静電力、電磁場、 および各種の架橋もしくは結合物質を利用して該物理的捕獲を補強できる。

物理的捕獲の後（しかし、バイオトランスフォーメーション反応の前）に、生物 学的物質のより強い定着を生じさせるように、液体浸透性部材上で生物学的物質 が成長するのを促進してもよい。

別法として、要すれば、ホルモン、ビタミン、リンもしくは窒素源の除去または 成長抑制酵素もしくは他の化合物の添加のような化学的、生化学的および生理学 的方法を用いて捕獲された生物学的物質のその後の成長を防止し、もしくは低下 させてもよい。

要すれば、適当な時期以後は支持媒体をリアクターから取り出すことができ、生 物学的物質の全部もしくは一部を取り除き、次いで該支持媒体をリアクター容器 中に戻すことができる。

本発明の方法で用いる生物学的物質は、例えば、植物細胞、動物細胞、組織培養 物、細胞小器官、微生物および他の生物由来物質であってよい。これらの生物学 的物質はそれらの性質により、粒子状または菌糸状の形態であってよい。それら 以外の場合、それらは固定化のために粒子の如く扱える様にそれらを適当な物質 内もしくは上に固定化できる。

生物学的物質の懸濁液は、例えば、植物物質、カルス培養物または懸濁液培養物 の均質化によって調製して本発明での用途として十分に「微細な」懸濁液を製造 したものでよい。適当ないずれの均質化方法、例えば英国特許出願第８５１９１ ８０号に記載されている方法を用いることができる。

生物学的物質は生きている、成長している、または成長の静止期あるいは死んで いるものであってもよい。

それにもかかわらず、方法的見地からは、全ての場合において、生物学的物質は 活性状態の形態となる。

一旦生物学的物質が液体浸透性部材上に固定されたならばそれはバイオトランス フォーメーション反応の実施（例えば、二次代謝産物の生産）に使用できるが、 もちろん、正確な反応の性質はその生物学的物質に依存する。通常、栄養物、前 駆物質、誘導質および／または他の反応体を生物学的物質に供給する必要がある 。

これらは液体、気体もしくは固体の形態、または細胞、小器官もしくはウィルス 、プラスミド、−抗原、酵素、補因子などのような他の生物学的物質の形態で生 物学的物質に供給できる。照明もまた該工程に必要であるかも知れない。

バイオトランスフォーメーション反応は特定の化学的もしくは生物学的生成物、 例えば、新しい細胞、抗体、核酸などの産生用に行う反応であってよい。該生成 物は生物学的物質がその中で培養され（かつ生成物がそこから回収される）培地 中で生物学的物質により放出または排出される。別法として、生成物は生物学的 物質によって保持され、生成物をそこから回収のために収穫する必要がありうる 。

本発明は、また、栄養培地として生物学的物質に供給された（廃水または下水処 理におけるように）望ましくない生成物の分解を含むバイオトランスフォーメー ション反応にも適用できる。

本発明が適用できるバイオトランスフォーメーション反応の例には： （１）細胞内の細胞内酵素トランスフォーメーション；細胞に供給された前駆体 からの生合成；および細胞に供給された単純な基質からの複合物質または化合物 の新規合成による化合物および／または生物学的物質の生成 （２）プレ固定化された生物触媒と一緒に共固定化された細胞による化合物およ び／または生物学的物質の生成。これらの生物触媒は、例えば、支持体上に共固 定化された（生きている、死んでいるまたは休止している）細胞内酵素であって よい。別法として、生物触媒はついで、細胞と共に固定によって支持体上に捕獲 される粒子状物質（例えば、ポリマー・ゲル・ビーズもしくはイオン交換樹脂ビ ーズ、塩化物、炭酸塩またはリン酸塩）内もしくは上にプレ固定化された酵素も しくは補因子であってよい。

（３）バイオマスの生成、例えば、植物細胞または動物細胞の増殖 植物細胞に適用される（１）および（２）の例には、医薬品（例えば、アルカロ イド、ビタミンおよび抗癌剤）、フレーバー、香料、顔料、植物ホルモン、酵素 、および遺伝子工学物質の産生がある。動物細胞に適用される（１）および（２ ）の具体的な例には、遺伝物質および蛋白質、例えば、単クローン抗体、ワクチ ン、酵素、ホルモン、およびインターフェロンの産生がある。

細胞内酵素トランスフォーメーションの具体的な例は酸化、ヒドロキシ化、（脱 ）メチル化、グリコジル化、エステル化、エポキシ化および異性化のような反応 を包含する。バイオトランスフォーメーションで用いる化学的に変化しうる基質 （反応体）はステロイド、テルペノイド、およびアルカロイドを包含するが、該 基質は必ずしもトランスフォーメーションに用いる植物種にとって内生である必 要はない。

これにより新規化合物の産生例ついての可能性が開かれる。

植物細胞を用いるバイオトランスフォーメーションの例、 （ａｔニコチアナ・タバクム（Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　）による リナロールのＣ＝Ｃ結合のアリル位のヒドロキシ化。

（ｂ）リンスヘルマムψエリスロリゾン（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍｅｒｙｔｈ ｒｏｒｈｉｚｏｎ　） ペリラ・フルテセンス・パル・クリスバ（ｐｅｒｉｌｌａｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ 　ｖａｒ、ｃｒｉｓｐａ　）ガルデニア・ジャスミノイデス（Ｃａｒｄｅｎｉａ ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ　） マロトウスージャポニクス（Ｍａｌｌｏｔｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　）カサラ ンサス・ロゼウス（Ｃａｔｈａｒａｍｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ　）ダトウラ・イ ／クシア（Ｄａｔｕｒａ　１ｎｎｏｘｉａ　）によるフェノール性化合物のグリ コジル化。

（ｃ）ジギタリス・ラナタ（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ　１ａｎａｔａ　）によるジギ トキシンからジゴキシンへのヒドロキシ化。

（ｄ）カサランサス−ローゼ７　ｘ　（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓｒｏｓｅｎｓ 　）　によるカテナミンのアジマリチン（異性体）への変換のための二重結合の 還元。

ｔｅｌダウカス・カロータ（Ｄａｕｃｕｓ　ｃａｒｏｔａ　）　によるジギトキ シゲニンまたはシトキシゲニンの５−βヒドロキシシトキシゲニンへのヒドロキ シ化。

支持体上での固定によって生物学的物質によって捕獲された酵素を用いて行なう ことのできるバイオトランスフォーメーションの反応の例 と−緒に共補獲できる。

（ｇｌ−次基質が植物細胞内に侵入できない場合、固定によって植物細胞と一緒 に酵素上に共補獲されることにより処理され、次いで該植物細胞に侵入できる二 次状態の基質に変化できる。

（ｈｌ−次基質が直物細胞によって用いることができない場合、固定により植物 細胞と一緒に共補獲された酵素によって、植物細胞によって用いることができる 二次基質に変換できる。

本発明がそれに対しで著しい重要性を有する（３）の具体的な例は、複数の苗、 すなわち次いで通常の方法で生育できる小植物を生産するための固定化された未 分化細胞（例えばカルス）の培養である。該細胞には、事実、分化および苗条成 長を誘導する特別な培地が供給される。これは、いわゆる「植物のミクロ増殖を 介してのマス増殖」である。該技術は通常の農学的栽培方法よりも有利な点を有 する。何故なら、ウィルスおよび他の病気がなく、遺伝的に同様であって、高収 穫をあげる植物が産生できるからである。その結果、ある種の１つの性のみが所 望の産物を産生じつるので、特定の性の植物が排他的に産生されうる。遺伝子操 作によって産生された植物にとって新しい種を産生ずるのは可能である。

本発明の方法を実施するのに種々の構造のりアクタ−を用いることができる。

支持媒体はバッフルのようにリアクター容器中に静止させて保持でき、かつバル ク液体はかき混ぜ機、ポンプ、または空気／気体の上昇作用によってこれらの上 をおよびこれらを通って流動させることができる。

支持媒体は、また、水平もしくは傾斜した覆付きダクト中で、垂直もしくは傾斜 したバッフルの形態で用いることができ、バルク液体は重力散気する気体／空気 によって与えられる気体／空気の上昇の作用によりバッフルの上およびバッフル を通過して流動し、バッフル間の各小室中のかき混ぜ機あるいはポンプを用いる 液体循環により、バッフル間の小室を占める液体中に入ることができる。

支持媒体は蒸留塔中のトレイのようなりアクタ−容器中に水平に置くことができ 、かつ液体は重力およびポンプ循環によってこの上およびこれを通過して流動で きる。各「トレイ」間のスペースは液体で全体的にまたは部分的に満たすことが できる。この配置は湿式篩装置についても同様に考えることができる。栄養物も しくは産生物を添加もしくは除去するための、または溶解ガスを供給するための サイド・アームがあってもよい。

本発明の好ましいユニットは重ねて配置されたスクリーン、トレイなどの形態で ある複数の液体浸透性部材より成り、ある１つの部材の沖過可能である生物学的 物質の平均サイズがすぐ上方の部材により沖過されつるサイズより小さくなるよ うにしである。異なるサイズの生物学的物質より成る忍濁液の、ユニットの頂部 から底部までを通過する沖過により、該物質は固定によって異なるサイズ範囲に 分別されて部材上に保持され、最も大きい生物学的物質は最上段の部材上に保持 され、最も小さいものは最下段の部材上に保持される。生物学的物質の各分別物 は、次いで、その特定のサイズの分別物に最適の条件下で培養することができる 。

支持媒体は各層間にスペースあるいはもう１つ他の物質を入れたロール状シート とすることができ、次いで円筒状のりアクタ−容器中にカートリッジ状に設置す ることができる。ポンプを用いることによってノクルり液体はこれらの支持体を 通過し、およびその上を流動してよい。栄養物の供給および産生物の取り出しは 層間のスペースを占めるバルク流体を通じて行うことができる。

支持媒体はりアクタ−容器中に垂直または水平に設置された同心円筒状殻の形態 で用いることができる。

支持媒体は、また、パドルのように回転する心棒に取り付けることができ、該全 体は１４）レフ液体中に完全にまたは部分的に浸漬して、リアクター容器中に垂 直または水平に設置できる。

リアクターは過剰成長のために支持媒体からはみ出てくるバイオマスを切取るた めの適当な切断装置を含有してよい。この切断装置の設計およびその操作は個々 のりアクタ−の形状に応じて変化させることができる。切断装置のいくつかの例 は本発明の個々のりアクタ−の説明に関する該当する部分に示す。

支持媒体から切取られる生物学的物質の集合体のサイズが大き過ぎて出口を通過 できない場合は、次いで、好ましくはりアクタ−の底部に設置された高剪断装置 を用いてそのサイズを減少できる。

藻類、植物細胞などのような生物学的物質に照明が必要な場合、これは光源を適 当な位置、例えば、かき混ぜ機または容器壁に固定することにより実現できる。

バルク液体が清澄になるので、必要な照明の伝達が可能となる。光源をいずれか の液体と接触させねばならない場合、次いで、それを防水性とすることができる 。

光源は、また、リアクター容器の外部に位置させることができ、それはりアクタ −のガラス窓を通過して光を伝えることができる。別法として、支持媒体はガラ スファイバーから製造でき、分校ガラスファイバー構造の主コアに供給された光 源を用いて該ガラスファイバーの切断端を照明するのに用いることができる。

添付の図面を参照し、実施例のみの目的で本発明をさらに詳しく説明する。添付 の図面中、第１図は本発明の方法で用いることのできる完全なりアク７−・シス テムの概略図である：第２図は本発明の方法を実施するためのりアクタ−の−具 体例の概略側面図である： 第３図は第２図に示したりアクタ−の頂部平面図である； 第４図は第３図のりアクタ−で用いる切断装置を示す； 第５図は第３図と同様であるが、支持媒体の変形例を示す： 第６図は第４図と同様であるが、第５図のりアクタ−で用いる変形切断装置を示 す； 第７図はりアクタ−のもう１つの具体例の概略側面図である； 第８図は第７図に示したりアクタ−の頂部平面図である； 第９図はりアクタ−のもう１つの具体例の概略図である； 第１０図は第９図に示したりアクタ−の端面図である； 第１１図はりアクタ−のもう１つの具体例の図である： 第１２図は第１１図に示したりアクタ−の端面図である； 第１３図は本発明の植物増殖装置の第１の具体例の側面図である： 第１４図は第１３図に示した増殖装置の端面図である； 第１５図は植物増殖装置の第２の具体例の側面図である； 第１６図は第１５図に示した増殖装置の端面図である： 第１７図は植物増殖装置の第３の具体例の側面図である； 第１８図は第１７図に示した増殖装置の概略平面図である： 第１９図は植物増殖装置の第４の具体例の側面図である； 第２０図および第２１図は実験結果（後に示す）を表わすグラフである： 第２２図は実験２（後に示す）で用いる実験リアクターの概略図である。

ファーメンタ−はよく知られているので、本明細書の記載は他の備品、滞留タン ク、滅菌器などのようなユニット、およびファーメンタ−の設計および操作の分 野のいずれの当業者にとってもよく知られた機器使用および設計の詳細を含まず 、本発明の装置の部品を形成するもしくは直接に本発明の装置と共働する要素に 対して特に向ける。

第１図を参照し、ここには本発明の方法を実施する完全なシステムの概略図が示 されている。

第１図に示されるシステムは、後記する如く種々の配置とすることのできるリア クター（１）、生物学的物質の集合体のサイズを減少させる装置（２）、湿式師 塔（３）、生成物分離ユニット（４）、およびエアレーション容器（５）を包含 する。

操作において、リアクター（１）を運転するには、まず分離ファーメンタ−（６ ）で培養できる接種物を調製する必要がある。要すれば、固定の前に、接種物中 の生物学的物質の集合体のサイズは、適当な装置（２）を用いて捕獲用に減少さ せることができ、適当なサイズの分別物を湿式篩基（３）を通して集めることが できる。

固定の間に気泡が支持媒体中に捕獲されるのを防止するために、分離エアレーシ ョン容器（５）を通して栄養物溶液を継続的に循環させることにより栄養物溶液 のエアレーションを実現できる。

生成物濃度が増加して反応または生物学的活性の抑制がはじまったら、次いで、 生成物分離ユニット（４）を通して液体を継続的に循環させることにより生成物 を取り出すことができる。

生物学的物質が固定により保持されるにつれて、培養ブロスは漸次より清澄とな り、与えられた孔サイズでは捕獲され得ない生物学的物質の非常に大きな集合体 および／または過剰の生物学的物質のみが栄養物溶液中に残存する。この除外さ れたまたは過剰の生物学的物質は取り除くことができ、次いでサイズ減少装置を 通した後、要すれば、もう１つのリアタフタ−または接種物ファーメンタ−自体 用の接種物として再び利用できる。

つぎに、図面の第２図を参照して、例示されたりアクタ−容器（７）は垂直に保 持された支持媒体（８）のバッフル状シートを包含することがわかる。このリア クター容器（７）は、また、２枚刃のインペラ（９，１０）を有し、１つ（９） は該容器の底部に、もう１つＱｌは液面αυ下にある。第２図の頂部平面図であ る第３図で明らかな如く、ポリマー・フオームのシート（８）は長方形の断面と することができ、周囲にスペースをとった状態で配置される。空気散布器Ｏ２は 気泡がフオーム・シート間の小室内を上昇し、かくして混合を補助するように配 置される。リアクターは、また、フオーム・シートからはみ出す過剰成長を制御 するための特別な切断装置０３）を包含する。第４図の頂面図に示す如く、基本 的には、該切断装置はそれらが上方および下方に移動するとき該切断装置０３） がフオーム・シートの表面上の過剰成長した植物細胞を切取るような幾つかの刃 （１３ａ）より成ってよい。

第５図は第２図と同様な図であるが、楔形の断面をした支持媒体（８ａ）の使用 を示すものである。第６図は第４図と同様であるが、変形例の切取り装置（１３ ｂ）を示すものである。

もう１つの好ましいりアクタ−の形状において、第７図および第８図の平面図に 示す如く、支持媒体Ｉはリアクター容器（１５１中に垂直に保持された、静止し た同心円筒状殻の形態で用いることができる。この具体例において、リアクター 容器＋１５ｉは図に示された如く特別の回転装置（１６１を包含する。インペラ （１つのシャフトに取り付けられた幾つかの刃より成るこの特別の回転装置（１ ■はかき混ぜ機および切断装置の両方として作動して支持媒体Ｉからはみ出す過 剰成長を制御する。

第９図および第１０図に示した変形例のりアクタ−において、同心円筒状殻（１ ４ａ）の形態である支持媒体は水平軸のまわりを回転できるように支持されてい る。支持媒体（１４ａ）　の組立体は液面（Ｌ）下に一部浸漬され、幾つかの同 心状の固定刃より成る切断装置（１！Ｊと一体化したりアクタ−容器（ｌ→中の 水平軸のまわりを回転する。支持媒体（１４ａ、　）の組立体が回転するとき、 切断装置（１！Ｊは支持媒体（１４ａ）　の外部表面上の過剰成長した植物細胞 を切取る。

第１１図および第１２図に示したりアクタ−の具体例において、支持媒体■は支 持媒体のあるものをバルク液体中に浸漬せしめる回転可能な水平心棒の上に固定 されている。

第９〜１２図の具体例では支持媒体を移動させて間欠的に空気と接触させるが、 これは生物学的物質が酸素を必要とする場合に重要である。

第１３図および第１４図は本発明の植物増殖装置の第１の具体例を例示する。増 殖機はその中に２個の液体浸透性支持部材＠が設置される容器■より成り、該部 材はモーター器によって駆動されるシャフト１２４１上に１８０°　離して据付 けられている。容器■は２個の上方液体流入口（支）、２個の下方液体流出口（ イ）、気体流入口■および気体流出口のを包含する。使用する場合、容器のを植 物細胞の懸濁液で実質的に満たし、モーターａを作動させて支持部材を容器器に 関して回転させて、それにより植物細胞を戸数し、それらをこれらの部材上に捕 獲する。この操作の最後に支持部材器を第１４図に例示した水平位置に持ってゆ く。容器の内の液体は、次いで、流出口−を通って排出され、分化および苗条形 成を誘導する特別の培地で第１４図の線■近くのレベルまで置換することができ る。次いで、細胞を公知の条件下で培養して「苗」（すなわち、小さな植物）を 生産でき、接菌は土壌中での生育などのために増殖機から収穫することができる 。

増殖機のｆｉ２の具体例を第１５図および第１６図に示す。この増殖機は円筒状 容器０１１より成り、その中に液体浸透性支持物質■が容器の直径面を横切って 固定されている。容器■は台■上に回転可能な状態で据付けられ、モーター（至 ）によって回転することができる。

該容器は液体流入口（ト）、液体流出口■、気体流入口−。

および気体流出口■を包含する。

植物増殖機のこの具体例の操作において、植物細胞の懸濁液は容器（３１１中に 導入され、次いでモーター■によって回転される。支持部材■は容器（３１＋と 共に回転し、植物細胞を懸濁液から戸数する。一旦この固定操作が完了すると、 植物細胞は第１３図および第１４図に示した増殖機について示した方法で培養で きる。

第１７図および第１８図に示した植物増殖機は容器■より成り、その中に、垂直 に配置された複数の液体浸透性支持部材００が設けられている。上方および下方 ブレード０Ｄおよびモーター（６）より成るかき混ぜ機の配置体も設けられてい る。

第１８図の平面図かられかるように、容器（至）は円形の断面である。支持部材 ＣＩは、各々、同一サイズの、容器（至）と同じ直径である円の大きいセグメン トである。

かくして、各部材顛の端面と容器（至）の壁の間にはスペース（４３が存在する 。スペース（ハ）が第１８図にはっきり示したように、ずらした相互関係となる ように、支持部材６［Ｉは角度的にずらした相互関係にある。

固定を行うには、植物細胞の懸濁液を容器缶に導入し、モーター（ａを作動させ て懸濁液を攪拌し、かくして生物学的物質の部材■上への戸数を行う。この固定 化操作の間、懸濁液中に残存する生物学的物質は開口（４濠を通過することがで き、これにより生物学的物質が支持体（４（１１間に等しく分配されることが保 証される。

第１９図に示した増殖機は第１７図および第１８図に示しｈもの（角度的にずら したセグメント支持部材を包含する）と同様であり、類似の部品が同一の参照番 号で示されている。しかし、この増殖機はさらに、部材（４■上にスプレィする ように配置された複数のスプレィ・ヘッド（４９を包含する給液システム（伯、 容器■のよ 内耳コミ球（４■を包含する照明システムより成る。

植物細胞の固定および分化と成長を促進する培地の供給後、「苗」は照明（ａ並 びにスプレィ・ヘッド（４５）によって部材（４■上に散布された液体の助けに より培養するこさができる。

以下の実験を参照し、実施例のみの目的で本発明の方法をさらに詳しく説明する 。

静的支持媒体と動的粒子伏媒体間の物理的捕獲の効率における差異を確立するた めに以下の実験を行った。

実験１：フオーム粒子と植物細胞集合体間の相対速度液体中を動く２つの粒子状 物質問の相対速度は同一液体中におけるそれらの個々の終末自由沈降速度の差に 反映させることができる。終末自由沈降速度は種々のサイズのフオーム粒子およ び細胞集合体を水中に落下させ、ある距離を沈降するのに要する時間を測定する ことによって測定した。結果を第２０図および第２１図に示す。

これらの図によると、自由落下速度はフオーム粒子のサイズ、および細胞集合体 のサイズに従って変化する。本実験で用いたフオーム粒子はインチ当たり３０個 の細孔を有するものであった。これは０．８　ｔａｘの平均孔サイズとなる。発 明者らの以前の実験結果ではサイ：’：　カ１．５　ｍまでの細胞集合体は３０ ｐｐｉのフオーム・マトリックス中に捕獲できることが示している。フオーム粒 子についての平均終末速度は２．５０１７秒を採用できる（第２０図）。細胞集 合体についての終末速度はサイズに依存して０．５〜３．２　ｃｍ　７秒で変化 する（第２１図）。しかし、注目する細胞集合体（すなわち、０．５１〜１．、 ５　ｍｍ　）の平均終末速度は約０．５　Ｑｌ　７秒である。従って、リアクタ ー中でフオーム粒子と細胞集合体が一緒に攪拌されると、それらの間の相対速度 は（２，５−０，５）　＝　２．０口／秒となる。

終末自由沈降速度がＯ１５ｃｍ　７秒以下である場合、粒子は液体の循環パター ンに従う傾向にある〔ダブリュ−・エル・マツケープおよびジエイ・シー・スミ ス（Ｗ、　Ｌ、　ＭａｃＣａｂｅ　ａｎｄ　Ｊ、Ｃ０Ｓｍ１ｔｈ　）　、　（１ ９６７）、ユニット・オペレーションズ・オブ・ケミカル・エンジニアリング（ Ｕｎｉｔ　０ｐｅｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉ ｎｇ　）、２６７頁、マグローヒ／ｌ／　（ＭｃＧｒａｗ＋　Ｈｉｌｌ　）　〕 。イインテでかき混ぜた液体中の平均速度はインペラ先端速度の０．７から０． １まで変化する〔ダブりニー・エル・マツケープおよびジエイ・シー・スミｘ　 （Ｗ、Ｌ、　ＭｃＣａｂｅ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｃ，Ｓｍ１ｔｈ　）、（１９６７） 、ユニット・オペレーションズ・イン・ケミカル・エンジニアリング（Ｕｎｉｔ 　０ｐｅｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　） 、２５２頁、マグローヒ／Ｌ／　（ＭｃＧｒａｗ−ｌ−ｌ１１１　）　）。従っ て、かき混ぜた容器中において、０゜５Ｃ１１／秒の平均終末沈降速度を有する １、　５　ｗｍまでのサイズ範囲の植物細胞集合体はインペラの先端速度のα７ 〜０．１の速度を有することになる。バッフル・リアクターの場合における如く フオーム・マトリックスが静止して保持されると、細胞集合体とフオーム・マト リックス間の相対速度はインペラの先端速度の０．７〜０．１となる。これより 、かかるリアクターにおいて、相対速度は単にインペラの速さを変化させること によって所望する値で制御できる。例として、インペラの先端速度が以下の実験 ２の場合の如く約３６０１／秒である場合、フオーム・マトリックスと細胞集合 体間の平均相対速度はバッフル・リアクターにおいて２５〜３、６　ｃｍ　７秒 である。この値は２．０　Ｃ１ｌ　７秒である動的フオーム粒子と細胞集合体間 の平均相対速度よりかなり大きい。

実験２：バッフル・リアクターと循環式フオーム粒子・リアクター間の物理的捕 獲の比較 本実験において、（第２２図に示した如（）同一の容器とインペラを、まずバッ フルのように静止して保持したフオーム・シートに、次いで循環フオーム粒子に 用いる。インペラの速さおよび位置、液体の体積、細胞集合体の初期量およびサ イズ、フオーム・マトリックスの合計体積および実験の継続時間は両実験につい て同一に保つ。フオーム・マトリックスが容器中で動くか否かとは別に、ただ１ つの他の差異はフオーム・マトリックスの外部表面積である。

容器およびインペラ（第２０図） 合計液体体積：１０００α３ 液面の高さ：１３Ｑ！ 容器の直径；１０１ インペラの巾：２．５Ｃ１１ インペラの長さニア、６ＣＩ 容器の底からインペラまでの距離：０．５ＣＩ＋インペラの速さ：　９０　ｒＰ ｍ。

バッフル・リアクター： フオーム・マトリックスの合計体積＝　１８７．５　ａｍ”フオーム・マトリッ クスの合計外部表面積＝３８７．５．２ 各フオーム・バッフルの大きさ＝　２．５　ｘ　２．ＯＸ　７．５Ｃ１１フオー ム・バッフルの数＝５ 自由懸濁細胞集合体の初期量−７３０η（乾燥重量）３０分後の捕獲量＝２８５ ■（乾燥重量）捕獲パーセント＝（２８５／７３０）１００＝３９％フオーム・ マトリックスと細胞集合体間の平均相対速度＝２５〜３．６　ｃｍ　７秒 循環式フオーム粒子・リアクター： フオーム・マトリックスの合計体積＝１９ＯＬ３３フオーム・マトリックスの合 計外部表面積＝　１１４０フオーム粒子の大きさ＝ｉＸＩＸ１国 フオーム粒子数＝１９０ 自由懸濁細胞集合体の初期量＝７３０■（乾燥重量）３０分後の捕獲量＝１３η （乾燥重量）捕獲パーセント＝　（１３／７３０）１００　＝　１．８Ｘフオー ム・マトリックスと細胞集合体間の平均相対速度＝　２．０　ＣＩ　／秒以下 この結果は、循環フオーム粒子は非常に大きな外部表面積が細胞集合体の接触と 浸入に対して利用可能であるという有利な事実にもかかわらず、同一時間内の合 計捕獲量はバッフル・リアクターにおいて達成できるものよりかなり小さいこと を示している。バッフル・リアクターにおけるこの増加した捕獲効率はフオーム ・マトリックスと細胞集合体間の相文丁速度が循環式フオーム粒子・リアクター におけるよりもより大きいことに起因する。

つぎの、固定によって捕獲された培養物の活性および生成物の生成速度について のデータも本発明の詳細な説明するものである。

■、活性の比較 （ａｌ固定によるフオーム・シート中への捕獲（本発明）完全な増殖もしくは生 産培地のいずれかを用いて栄養培地を４週間ごとに交換した場合、２４ケ月にわ たって活性であった。

（１５ケ月後、培地は交換しなかったが、細胞は２４ケ月の最後においてもまだ 活性であった）（ｂｌ懸濁培養（２５０−フラスコ中）新たな栄養物を添加しな いで゛２ケ月まで活性であった。

（ｅｌ固定化培養（２５０ｒｎｌフラスコ中）新たな栄養物を添加しないで４ケ 月まで活性であった。

（ｄｌフオーム粒子における固定化 完全な増殖培地を用いて栄養培地を４週間ごとに交換した場合は６ケ月にわたっ て活性であったが、それを生産培地に変更した場合は活性は４０％まで急激に低 下し、結局、固定化の開始から６ケ月後に全ての細胞は死滅した。

■、カブサイシンの生成の比較 ａ）本発明の方法を用いて固定によりフオーム・シー　ト（３ｘ　８　Ｘ　Ｉ　 Ｃ１ｌ　）中に捕獲した細胞：カブサイシン濃度は２５μｇ／培地−であり、合 計リアクター作動体積は７００．ｎｌであった（植物細胞の合計量は１７５ｇ湿 潤＠量であった）。従って、生成量は１００μｇ／湿潤細胞重Ｎｇであった。

ｂ）フオーム粒子（Ｉ　Ｘ　Ｌ　Ｘ　１　ｃｓ　）中に固定化した細胞：カブサ イシン濃度は１μｇＡ音地−以下であり、合計リアクター作動体積は５０００− であった（植物細胞の合計量は５００ｇ湿潤重量であった）。従って、生成量は カブサイシン１０μｇ／湿潤細胞重量ｇであった。

以下の実施例は本発明の植物の「ミクロ増殖」への適用を説明するものである。

ミクロ増殖機を用いるカプシカム・フルテセンス（Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ｆｒｅｔ ｅｓｃｅｎｓ　）　の組織培養物からの植物再生 カプシカム・フルステセンス（チリ・ペラパー）の茎外植体から出発したカルス または懸濁液の培養物を英国特許出願下８５　１９１８０号に記載された方法に よってホモジネートし、次いで、シエンクおよびヒルデブランド（５ｃｈｅｎｋ 　ａｎｄ　Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ　）　（Ｓ　Ｈ）培地を含む第１５図に示し たりアクタ−中に無菌的に導入した。支持物質を水平に保持する場合は液体がそ れを完全に覆った。

細胞を支持物質中に戸数する目的でリアクターをその水平軸のまわりに回転した 。細胞が完全に構造体を充填するまでこれを継続した。次いで、該培地を完全に 排出°し、該支持構造体が水平に保持した場合に液体培地が丁度支持構造体の底 部表面に触れるレベルまでリアクターを分化誘導培地で満たした。この新しい培 地はムラシゲおよびスクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ）　（ ＭＳ　）の基礎培地であった。該ＭＳ培地にはインドール酢酸（Ｉ　ｍ？　／　 ｌ　）とベンジルアデニン（２η／ｌ）を補足した。前記の方法で処理した植物 細胞より、分化誘導培地の添加６週間後に菌条芽および根付き芽が、および１０ 週間後には十分に生育した植物が得られる。

国際調査報告 ｌ１ＩＩ−一−＾・−ｍｌｍｌｌａ、ＰＣＴ／ＧＢ　８５１００５０８

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）液状媒体中の生きているもしくは生化学的に活性な細胞および／また は組織および／またはプレ固定化された生物触媒より成る粒子より成る生物学的 物質の懸濁液を、該生物学的物質をろ過できる液体浸透性部材を通過させて該液 状媒体から該生物学的物質をろ取することにより生物学的物質を固定し（該部材 は一体物であるかまたはその成分が相互に実質的に固定した立体関係に維持され ている複合体である）；（ｂ）該部材上に支持された該生物学的物質を液体およ び／または気体の培地と接触させてバイオトランスフオーメーシヨン反応を実行 して生成物および／またはバイオマスを形成させ；および （ｃ）該生成物の回収および／または該バイオマスの収集をする ことを特徴とするバイオトランスフオーメーシヨンを行う方法。
2. ２．該生物学的物質が植物細胞より成る前記第１項の方法。
3. ３．該生物学的物質が動物細胞より成る前記第１項の方法。
4. ４．該生物学的物質が小器官より成る前記第１項の方法。
5. ５．該生物学的物質が植物組織より成る前記第１項の方法。
6. ６．該生物学的物質が動物組織より成る前記第１項の方法。
7. ７．該生物学的物質が微生物より成る前記第１項の方法。
8. ８．該生物学的物質がポリマーゲル・ビーズ中もしくは上、イオン交換樹脂上、 または無機塩上の生物触媒より成る前記第１項の方法。
9. ９．該バイオトランスフオーメーシヨン反応を行つて二次代謝産物を生成する前 記第１項の方法。
10. １０．該生物学的物質の懸濁液の細胞および／または組織および／または粒子が 異なるサイズであつて、重ねて配置されかつ該液体浸透性部材のある１つ がろ 取できる生物学的物質の平均サイズがそのすぐ上の部材によつてろ取される平均 サイズより小さくなるように配置されたスクリーン、トレイなどの形態である複 数の該液体浸透性部材を通過させて該懸濁液をろ取する前記第１項の方法。
11. １１．該液体浸透性部材がプラスチツク・フオーム物質より成る前記第１項の方 法。
12. １２．該液体浸透性部材が該部材内に露出端を有する光フアイバーの網目より成 り、かつバイオトランスフオーメーシヨン反応中に光が該光フアイバーに沿つて 伝達される前記第１項の方法。
13. １３．容器、生物学的物質をろ取できる容器内の液体浸透性部材（該部材は一体 物であるかまたはその成分が相互に実質的に一定に固定された関係に維持された 複合体である）、および装置の使用時に、容器中に保持された液体と支持部材間 の相対速度を、液体中の懸濁液中の生物学的物質がそこからろ取され次いで支持 部材上に保持されるように確立する手段より成ることを特徴とする、液体媒体中 のその懸濁液から生化学的に活性な細胞および／または組織および／または部分 的に固定化された生物触媒より成る粒子の形態である生物学的物質固定用装置。
14. １４．該支持部材が容器内に相対的に固定され、かつ該装置の使用において、容 器内に含有される液体を液体浸透性部材を通過して動かし、ろ取を行うための手 段を設けた前記第１３項の装置。
15. １５．該液体浸透性部材が容器内で移動可能であつて、該装置の使用において、 支持部材を容器中に含有される液体中を移動させて該ろ取を行うための駆動手段 と連結させた前記第１３項の装置。
16. １６．過剰の生物学的物質を支持部材から切取るための手段を配設した前記第１ ３項〜第１５項のいずれか１つの装置。
17. １７．容器、重ねて配置されかつ生物学的物質をろ取できるスクリーン、トレイ などの形態である複数の液体浸透性部材より成り、該部材は各々一体物であるか またはその成分が相互に実質的に立体的に固定された関係に維持された複合体で あつて、該複合体は該部材のある１つのろ取できる生物学的物質の平均サイズが そのすぐ上の部材によつてろ取されるサイズより小さくなるように配置された液 体媒体中のその懸濁液から生化学的に活性な細胞および／もしくは組織および／ または部分的に固定化された生物触媒より成る粒子の形態である生物学的物質の 固定用装置。
18. １８．生物学的物質が生きているもしくは生化学的に活性な細胞および／または 組織および／またはプレ固定化された生物触媒より成る粒子より成り、支持体が 液状媒体中のその懸濁液から該生物学的物質をろ取できる液体浸透性部材であつ て、該部材は一体物であるかまたはその成分が相互に実質的に一定に固定された 関係で維持される複合体であり、およびリアクター・システムが液状媒体中の該 生物学的物質の懸濁液を該支持体に通過させてろ取することによつて製造された ものである、 支持体上にコロニー化された生物学的物質より成ることを特徴とする生化学的リ アクター・システム。
19. １９．該生物学的物質が植物細胞より成る前記第１８項のリアクター・システム 。
20. ２０．該生物学的物質が動物細胞より成る前記第１８項のリアクター・システム 。
21. ２１．該生物学的物質が小器官より成る前記第１８項のリアクター・システム。
22. ２２．該生物学的物質が植物組織より成る前記第１８項のリアクター・システム 。
23. ２３．該生物学的物質が動物組織より成る前記第１８項のリアクター・システム 。
24. ２４．該生物学的物質が微生物より成る前記第１８項のリアクター・システム。
25. ２５．該生物学的物質がポリマーゲル・ビーズ内もしくは上、イオン交換樹脂上 、または無機塩上の生物触媒から成る前記第１項の方法。
26. ２６．該支持体がその支持体内に露出端を有する光フアイバーの編目より成り、 かつ該システムに光源からの光を該支持体内に伝達するように配置された光源が 供給された前記第１８項のリアクター・システム。
27. ２７．前記第１８項のリアクター・システムを液体および／または気体の培地と 接触させて生成物および／またはバイオマスを形成することを特徴とするバイオ トランスフオーメーシヨン反応を行う方法。
28. ２８．反応を行つて二次代謝産物を産生する前記第２７頂の方法。
29. ２９．容器、植物細胞を液状媒体中のその懸濁液からろ取できる該容器内の液体 浸透性支持部材（該支持部材は一体物であるかまたはその成分が相互に実質的に 一定に固定された関係で維持される複合体である）、および増殖器の使用におい て容器中に保持される液体と支持部材間の相対速度を液体中の懸濁液中の植物細 胞がそこからろ取されて支持部材上に保持されるように定めるための手段から成 ることを特徴とする植物増殖装置。
30. ３０．該支持部材が中にあるかまたは実質的に水平な配置で位置させることが可 能であつて、該容器が水平に配置された支持部材の下に液体流出口を有して植物 の増殖に適したレベルまで液体を容器から排出させる前記第２９項の植物増殖装 置。