CN111944736A - 一种小立碗藓原生质体及其制备方法 - Google Patents

一种小立碗藓原生质体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小立碗藓原生质体的制备方法，该方法包括以下步骤：S1.取小立碗藓茎叶体或原丝体，打成匀浆后放入BCDAT培养基中16h光照‑8h黑暗交替培养；S2.将混合酶溶解于6％～10％的甘露醇溶液中，涡旋混匀后离心，取上清过滤，得到混合酶溶液；S3.取步骤S1得到的原丝体放入步骤S2配制的混合酶溶液中混合均匀，酶解，过滤，离心去上清并用6％～10％的甘露醇溶液重悬，重复2～3次，得到的悬浮液即为小立碗藓原生质体；其中，步骤S2所述混合酶为纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶中的任意两种或三种。该方法制备得到的原生质体的质量高、活性好，在保障原生质体的数量的前提下保证了再生效率，且制备方法简单、成本低，具有广泛的应用前景。

Description

一种小立碗藓原生质体及其制备方法
技术领域
本发明属于原生质体制备技术领域。更具体地，涉及一种小立碗藓原生质体及其制备方法。
背景技术
小立碗藓(Physcomitrella patens,Pp)是由水生到陆生的先锋植物，属于葫芦藓目(Funariales)、葫芦藓科(Funariaceae)、小立碗藓属(Physcomitrium)。小立碗藓极易耐受干旱、高温、紫外等非生物胁迫，同源重组率高，再生能力强，生活周期短，生活史中以单倍体的配子体阶段占优势，基因组已测序。小立碗藓可以液体悬浮培养，用于半连续式光合自养生物反应器大规模培养，用来生产疫苗、人血清白蛋白等药物，具有非常高的基础研究及应用价值，是合成生物学理想的模式生物。
无论是基础研究还是生产应用，大多都是从制备小立碗藓原生质体开始。目前，制备小立碗藓原生质体需要用到崩溃酶；例如，公开号为CN106119185A的现有专利公开了一种小立碗藓原生质体的制备方法，将小立碗藓孢子经植物组织快繁培养得到原丝体，粉碎后在BCD培养基中培养，崩溃酶酶解，即得原生质体。该方法促进了小立碗藓原生质体的制备及再生，提高了原生质体的数量、质量和转基因效率；且崩溃酶是一种从真菌-担子菌中提纯出来的复合酶，内含昆布多糖酶、木聚糖酶和纤维素酶，消极细胞壁的能力强，非常适合于制备小立碗藓的原生质体。但是，由于崩溃酶的原材料短缺，导致崩溃酶停产，从而影响到了国内外研究者从事小立碗藓的研究。
因此，亟需提供另外一种成本低、效率高、无需用到崩溃酶既能制备得到高质量小立碗藓原生质体的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有小立碗藓原生质体制备方法的上述缺陷和不足，提供一种小立碗藓原生质体及其制备方法。
本发明的目的是提供一种小立碗藓原生质体的制备方法。
本发明另一目的是提供所述方法制备得到的小立碗藓原生质体。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种小立碗藓原生质体的制备方法，包括以下步骤：
S1.取小立碗藓茎叶体或原丝体，打成匀浆后放入BCDAT培养基中16h光照-8h黑暗交替培养；
S2.将混合酶溶解于6％～10％的甘露醇溶液中，涡旋混匀后离心，取上清过滤，得到混合酶溶液；
S3.取步骤S1得到的原丝体放入步骤S2配制的混合酶溶液中混合均匀，酶解，过滤，离心去上清并用6％～10％的甘露醇溶液重悬，重复2～3次，得到的悬浮液即为小立碗藓原生质体；
其中，步骤S2所述混合酶为纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶中的任意两种种或三种。
优选地，步骤S2所述混合酶为纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。
更优选地，所述纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的质量比为0.15～19：0.5～15：1。
更进一步优选地，所述纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的质量比为5～15：4～10：1。
再进一步优选地，所述纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的质量比为10：7：1。
优选地，步骤S1所述培养的时间为4～7d。
更优选地，步骤S1所述培养的时间为5d。
优选地，步骤S1所述光照的温度为22℃～25℃。
更优选地，步骤S1所述光照的温度为25℃。
优选地，步骤S1所述光照的强度为25～80μmol·m-2s-1。
更优选地，步骤S1所述光照的强度为30μmol·m-2s-1。
优选地，步骤S2所述混合酶溶液的终浓度为0.8％～1.5％。
更优选地，步骤S2所述混合酶溶液的终浓度为0.8％。
优选地，步骤S3所述酶解的温度为25℃～40℃。
当酶解的温度过高(＞30℃)时，则小立碗藓的细胞活性下降，制备出的小立碗藓原生质体碎片过多，并且影响后续实验操作；当酶解的温度过低(＜25℃)时，则纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的活性受到抑制，制备小立碗藓原生质体的效率下降。
更优选地，步骤S3所述酶解的温度为25℃～30℃。
更进一步优选地，步骤S3所述酶解的温度为25℃。
优选地，步骤S3所述酶解的时间为30～40min。
当酶解的时间过高(＞40min)时，则会对小立碗藓的细胞造成伤害，降低原生质体的细胞活性，并产生过多碎片，影响后续实验操作；当酶解的时间过低(＜30min)时，则酶解效果不够，制备出的小立碗藓原生质体量较少。
更优选地，步骤S3所述酶解的时间为30～35min。
更进一步优选地，步骤S3所述酶解的时间为30min。
优选地，步骤S3所述离心的条件为170～190×g离心2～6min或40～60×g离心8～12min。
更优选地，步骤S3所述离心的条件为180×g离心4min或50×g离心10min。
优选地，步骤S2所述过滤的方法为：用0.2～0.24um的滤菌膜过滤。
更优选地，步骤S2所述过滤的方法为：用0.22um的滤菌膜过滤。
优选地，步骤S2所述甘露醇溶液的浓度为8％。
优选地，步骤S2所述涡旋混匀后离心的条件为：0℃～4℃涡旋28～32min，2400～2600×g离心4～6min。
更优选地，步骤S2所述涡旋混匀后离心的条件为：2℃涡旋30min，2500×g离心5min。
优选地，步骤S3所述过滤的方法为：用80/150孔的细胞筛进行过滤。
优选地，步骤S3所述甘露醇溶液的浓度为8％。
优选地，步骤S1所述BCDAT培养基的配方为：1mM MgSO4·7H2O，1.84mM KH2PO4，10mM KNO3，45μM FeSO4·7H2O，0.22μM CuSO4·5H2O，10μM H3BO3，0.23μM CoCl2·6H2O，0.1μM Na2MoO4·2H2O，0.19μM ZnSO4·7H2O，2μM MnCl2·4H2O，0.17μM KI，1mM CaCl2·2H2O，5mM酒石酸胺，0.5％葡萄糖(w/v)，0.8％琼脂(w/v)。
另外，所述方法制备得到的小立碗藓原生质体，也应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种小立碗藓原生质体的制备方法，该方法无需用到崩溃酶，采用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的组合酶成功制备得到了小立碗藓原生质体，该小立碗藓原生质体的质量高、活性好，且利用2g小立碗藓原丝体即能够制备得到高达3×106～9×106个原生质体细胞，在保障了原生质体的数量的前提下保证了再生效率，为小立碗藓原生质体的基因功能研究打下了基础。
另外，本发明中用到的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的生产量足，易购买，价格便宜；因此，本发明方法是一种更经济高效提取小立碗藓原生质体的方法，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是对比例1～3制备得到的小立碗藓原生质体的细胞个数。
图2是酶解的温度对制备得到的小立碗藓原生质体的细胞个数的影响结果。
图3是酶解的时间对制备得到的小立碗藓原生质体的细胞个数的影响结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1小立碗藓原生质体的制备
一种小立碗藓原生质体的制备方法，包括以下步骤：
S1.取小立碗藓原丝体，加入等体积无菌水经匀浆器打成匀浆后，转到铺有玻璃纸的BCDAT培养基中，吸出水分至匀浆保持在玻璃纸上不流动但保持湿润状态，在光照温度为25℃、光照强度为30μmol·m-2s-1条件下，16h光照-8h黑暗交替培养5d；
S2.将纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶溶解于8％的甘露醇溶液中，2℃涡旋30min混匀后2500×g离心5min，取上清用0.22um的滤菌膜过滤，得到终浓度为1.2％的混合酶溶液；
S3.取2g步骤S1得到的原丝体放入步骤S2配制的混合酶溶液中混合均匀，25℃酶解30min，用80/150目的细胞筛进行过滤，180×g离心4min，去上清并用8％的甘露醇溶液重悬，重复2次，得到的悬浮液即为小立碗藓原生质体。
其中，步骤S2所述纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的质量比为10：7：1。
实施例2小立碗藓原生质体的制备
一种小立碗藓原生质体的制备方法，包括以下步骤：
S1.取小立碗藓茎叶体，加入等体积无菌水经匀浆器打成匀浆后，转到铺有玻璃纸的BCDAT培养基中，吸出水分至匀浆保持在玻璃纸上不流动但保持湿润状态，在光照温度为25℃、光照强度为25μmol·m-2s-1条件下，16h光照-8h黑暗交替培养4d；
S2.将纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶溶解于10％的甘露醇溶液中，4℃涡旋32min混匀后2600×g离心6min，取上清用0.24um的滤菌膜过滤，得到终浓度为1.5％的混合酶溶液；
S3.取2g步骤S1得到的原丝体放入步骤S2配制的混合酶溶液中混合均匀，30℃酶解35min，用80/150孔的细胞筛进行过滤，170×g离心2min，去上清并用6％的甘露醇溶液重悬，重复2次，得到的悬浮液即为小立碗藓原生质体。
其中，步骤S2所述纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的质量比为5：10：1。
实施例3小立碗藓原生质体的制备
一种小立碗藓原生质体的制备方法，包括以下步骤：
S1.取小立碗藓原丝体，加入等体积无菌水经匀浆器打成匀浆后，转到铺有玻璃纸的BCDAT培养基中，吸出水分至匀浆保持在玻璃纸上不流动但保持湿润状态，在光照温度为22℃、光照强度为80μmol·m-2s-1条件下，16h光照-8h黑暗交替培养7d；
S2.将纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶溶解于6％的甘露醇溶液中，0℃涡旋28min混匀后2400×g离心4min，取上清用0.2um的滤菌膜过滤，得到终浓度为0.8％的混合酶溶液；
S3.取2g步骤S1得到的原丝体放入步骤S2配制的混合酶溶液中混合均匀，40℃酶解40min，用80/150孔的细胞筛进行过滤，190×g离心6min，去上清并用10％的甘露醇溶液重悬，重复3次，得到的悬浮液即为小立碗藓原生质体。
其中，步骤S2所述纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的质量比为15：4：1。
实施例4小立碗藓原生质体的制备
一种小立碗藓原生质体的制备方法，包括以下步骤：
S1.取小立碗藓原丝体，加入等体积无菌水经匀浆器打成匀浆后，转到铺有玻璃纸的BCDAT培养基中，吸出水分至匀浆保持在玻璃纸上不流动但保持湿润状态，在光照温度为23℃、光照强度为50μmol·m-2s-1条件下，16h光照-8h黑暗交替培养7d；
S2.将纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶溶解于8％的甘露醇溶液中，2℃涡旋32min混匀后2500×g离心6min，取上清用0.22um的滤菌膜过滤，得到终浓度为1.5％的混合酶溶液；
S3.取2g步骤S1得到的原丝体放入步骤S2配制的混合酶溶液中混合均匀，30℃酶解40min，用80/150孔的细胞筛进行过滤，0×g离心8min，去上清并用8％的甘露醇溶液重悬，重复3次，得到的悬浮液即为小立碗藓原生质体。
其中，步骤S2所述纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的质量比为19：0.5：1。
实施例5小立碗藓原生质体的制备
一种小立碗藓原生质体的制备方法，包括以下步骤：
S1.取小立碗藓原丝体，加入等体积无菌水经匀浆器打成匀浆后，转到铺有玻璃纸的BCDAT培养基中，吸出水分至匀浆保持在玻璃纸上不流动但保持湿润状态，在光照温度为24℃、光照强度为60μmol·m-2s-1条件下，16h光照-8h黑暗交替培养4d；
S2.将纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶溶解于10％的甘露醇溶液中，4℃涡旋28min混匀后2400×g离心5min，取上清用0.24um的滤菌膜过滤，得到终浓度为0.8％的混合酶溶液；
S3.取2g步骤S1得到的原丝体放入步骤S2配制的混合酶溶液中混合均匀，25℃酶解40min，用80/150孔的细胞筛进行过滤，60×g离心12min，去上清并用10％的甘露醇溶液重悬，重复2次，得到的悬浮液即为小立碗藓原生质体。
其中，步骤S2所述纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的质量比为0.15：15：1。
对比例1
除了步骤S2中只加入纤维素酶(不加入半纤维素酶和果胶酶)，其余的制备方法均与实施例1相同。
对比例2
除了步骤S2中只加入半纤维素酶(不加入纤维素酶和果胶酶)，其余的制备方法均与实施例1相同。
对比例3
除了步骤S2中只加入果胶酶(不加入纤维素酶和半纤维素酶)，其余的制备方法均与实施例1相同。
应用例1
1、实验方法
对以上实施例1～5和对比例1～3制备得到的小立碗藓原生质体的细胞个数进行统计。
2、实验结果
实施例1～5制备得到的小立碗藓原生质体的细胞个数为3×106～9×106；而对比例1～3制备得到的小立碗藓原生质体的细胞个数如图1所示，可以看出，当只加入纤维素酶时，细胞个数为1×106～2.3×106，当只加入半纤维素酶时，细胞个数为3×105～5.7×105，当只加入果胶酶时，细胞个数为6×104～4.5×105。比较实施例1～5和对比例1～3的原生质体细胞个数可知，本发明应用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的组合酶进行小立碗藓原生质体的制备，显著的增加了小立碗藓原生质体的数量和再生效率。
应用例2酶解的温度对制备得到的小立碗藓原生质体的细胞个数的影响
1、实验方法
选用步骤S3的温浴温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃，其余的制备方法均与实施例1相同，制备得到小立碗藓原生质体，探究酶解的温度对制备得到的小立碗藓原生质体的细胞个数的影响。
2、实验结果
酶解的温度对制备得到的小立碗藓原生质体的细胞个数的影响结果如图2所示，可以看出，虽然酶解的温度为30℃～37℃时的制备效率更高，但是会导致细胞活性降低，细胞碎片增多，不利于后续实验的进行；而当酶解的温度为25℃～30℃时，小立碗藓原生质体的细胞个数均高于3×106，制备效率均很高，且由于小立碗藓的最适生长温度是22～25℃，这个温度范围内有利于保持原生质体的活性；因此，选择制备小立碗藓原生质体的最适酶解温度为25℃。
应用例3酶解的时间对制备得到的小立碗藓原生质体的细胞个数的影响
1、实验方法
选用步骤S3的温浴时间分别为15min、20min、30min、45min、60min，其余的制备方法均与实施例1相同，制备得到小立碗藓原生质体，探究酶解的时间对制备得到的小立碗藓原生质体的细胞个数的影响。
2、实验结果
酶解的时间对制备得到的小立碗藓原生质体的细胞个数的影响结果如图3所示，可以看出，当酶解的时间为30～40min时，小立碗藓原生质体的细胞个数均高于3×106；而当酶解时间为15～30min时，酶解效果不够，制备出的小立碗藓原生质体量较少；当酶解时间为40～60min时，对小立碗藓的细胞造成伤害，降低原生质体的细胞活性，并产生过多碎片，影响后续实验操作；因此，选择酶解的时间为30～40min。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小立碗藓原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取小立碗藓茎叶体或原丝体，打成匀浆后放入BCDAT培养基中16h光照-8h黑暗交替培养；
S2.将混合酶溶解于6％～10％的甘露醇溶液中，涡旋混匀后离心，取上清过滤，得到混合酶溶液；
S3.取步骤S1得到的原丝体放入步骤S2配制的混合酶溶液中混合均匀，酶解，过滤，离心去上清并用6％～10％的甘露醇溶液重悬，重复2～3次，得到的悬浮液即为小立碗藓原生质体；
其中，步骤S2所述混合酶为纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶中的任意两种种或三种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述混合酶为纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的质量比为0.15～19：0.5～15：1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述培养的时间为4～7d。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述光照的温度为22℃～25℃；步骤S1所述光照的强度为25～80μmol·m-2s-1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述混合酶溶液的终浓度为0.8％～1.5％。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述酶解的温度为25℃～40℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述酶解的时间为30～40min。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述离心的条件为170～190×g离心2～6min或40～60×g离心8～12min。
10.权利要求1～9任一所述方法制备得到的小立碗藓原生质体。
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