CN106119185A

CN106119185A - 一种小立碗藓原生质体的制备方法

Info

Publication number: CN106119185A
Application number: CN201610771350.7A
Authority: CN
Inventors: 杨红; 李萍; 刘莉; 鲁元学; 章成君; 关艳龙
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2016-11-16

Abstract

本发明公开了一种苔藓‑小立碗藓的原生质体的制备方法，包含下述步骤：原生质体的原材料‑原丝体与无菌超纯水机械打磨粉碎后，转移到10皿BCD培养基，控制pH值4.5，23℃，80μmol photons m^‑2s^‑1光强，16小时长日照下，培养5天后重复该过程一次，5天后显微镜检查细胞生长状况，收集20皿原丝体；新鲜配制20ml浓度0.7％溶解于8％甘露醇的崩溃酶，室温黑暗下溶解所收集的原丝体20分钟，1000rpm离心5分钟收集细胞，经过三次8％甘露醇洗涤后溶解于5ml甘露醇，显微计数一共约有9.6X10⁶个；转移到再生培养基培养3天后显微观察发现再生效率约为99％。与现有技术相比得到的再生原生质体增加了一倍。

Description

一种小立碗藓原生质体的制备方法

所属领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小立碗藓原生质体的制备方法。

背景技术

苔藓是一类由水生向陆生过渡的高等植物类群，具有独特的进化地位，全世界约有21200种，遍布除海洋外的地球上每个角落，甚至生长于荒漠、冻原及岩石上，耐旱、耐寒、耐贫瘠，适应力极强，是大自然的先锋与拓荒者(Kidron,2014；曹同等，2014)。

小立碗藓是葫芦藓目(Funariales)葫芦藓科(Funariaceae)小立碗藓属(Physcomitrium)的藓类。以小立碗藓为对象开展的基因组学和分子生物学研究发现，为适应陆地生活，小立碗藓获得耐干旱基因、耐高温基因、感光基因、紫外修复基因等陆地胁迫响应基因(Rabara et al.,2013；Rensing et al.,2008)。此外，还具有易培养、生活周期短、基因组与外源基因具有极高的同源重组率、生活史中单倍体的配子体阶段占优势、基因敲除后突变表型易于观察等独特的研究优势(Schaefer and1997)。而且由于其抗逆能力极强，能经历长期脱水而迅速恢复再生，对于研究植物抗逆性形成机制和进化意义非常有价值(Hiss et al.,2014)。然而作为转基因材料的主要来源原生质体的数量和质量是限制转基因效率的主要因素，现有技术中原生质体的制备效率和再生效率较低，急需改良从而提高转基因效率。

发明内容

本发明旨在提供一种高质量的苔藓原生质体制备方法，包括培养原丝体材料和细胞壁酶解、纯化及细胞再生的技术。本发明公开的一种原生质体制备的方法，在保障数量的前提下保证了再生效率，为基因功能研究打下了基础。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

小立碗藓原生质体的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：取小立碗藓孢子，经过两代植物组织快繁培养后，将小立碗藓原丝体与无菌超纯水混合后匀浆仪打磨粉碎得匀浆，匀浆转移到BCD培养基中，控制pH值6.5和4.5两个参数，在23℃，16h光照，8h黑暗，光强80μmol photons m-2s^-1的培养箱中连续继代培养5天，收集原丝体，采用崩溃酶酶解细胞壁20-30分钟后纯化所得原生质体，显微检查细胞生长状况，进行显微观测计数、测量和统计，然后转移到再生培养基培养3天后显微观测统计再生效率。

如1所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其中所述BCD培养基配方为:MgSO₄.7H₂O1μM，KH₂PO₄ 18.4μM，KNO₃ 10μM，FeSO₄.7H2O 45μM；CuSO₄.5H₂O0.22μM，H₃BO₃ 10μM，CoCl₂.6H₂O 0.23μM，Na₂MoO₄.2H₂O 0.1μM，ZnSO₄.7H₂O 0.19μM，MnCl₂.4H₂O 2μM，KI 0.17μM，酒石酸铵5mM，琼脂0.8％，121℃，20min灭菌。

如1所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其中酶解细胞壁的时间为20分钟。

如所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其中再生培养基配方为BCD培养基添加0.5％葡萄糖和10mMCaCl₂以及0.1％酒石酸铵。

如所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其中BCD培养基调整pH至4.5。

如所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其中所述的小立碗藓原生质体观测是采用光学显微镜及带荧光通道的显微镜进行不同放大倍数下的原生质体形态数量观测，并拍照记录。

如所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其中所述的小立碗藓原生质体测量和统计是从两个pH值下生长所得所有照片中随机挑选每个时间点不少于10个显微照片，使用图片软件ImageJ测量生物量，统计分枝数，用student’s t-test统计分析。

如所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其中所述的小立碗藓原生质体显微观测统计再生效率是统计pH4.5、酶解20分钟和pH6.5、酶解30分钟两种条件下所得原生质体转移到再生培养基上3天后的再生数量。

本发明的小立碗藓原丝体在pH4.5培养连续两次5天后，酶解20分钟，可以达到最高产量的原生质体。本发明通过培养材料的显微观测和计数进行原生质数量的测量和再生效率的判断及记录。本发明的使用可以最适条件的促进小立碗藓原生质体的制备及再生。与现有技术相比得到的再生原生质体增加了一倍，极大的提高了转基因效率。

附图说明：

图1为本发明小立碗藓在不同pH值培养和酶解时间下原生质体情况(标尺＝100μm)，小立碗藓原生质体在15分钟、20分钟、25分钟、30分钟各个酶解时间段的显微镜照片，为显微镜观测目镜16倍前提下，物镜放大倍数10倍自然光下的形态数量展示；

图2为本发明小立碗藓在不同pH值培养和酶解时间下原生质体数量，各时间梯度下的原生质体数量统计；

图3为本发明小立碗藓在不同pH值培养和酶解时间下原生质体再生情况(标尺＝100μm)，为pH4.5，20分钟和pH6.5，30分钟两种条件下所得原生质体再生的显微照片，为显微镜观测目镜16倍前提下，物镜放大倍数10倍自然光下的形态数量展示；

图4为本发明小立碗藓在不同pH值培养和酶解时间下原生质体再生效率即数量的比较和统计。

具体实施方式

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

1.材料和方法：

1.1研究材料：

本发明使用材料为小立碗藓(Physcomitrella patens)GD2004种，经过多代植物组织快繁培养保存于试验室的培养箱中。

1.2研究方法：

1.2.1实验设计：将生长5天的小立碗藓原丝体3g与15ml无菌超纯水混合后机械匀浆仪打磨粉碎，转移到10皿BCD培养基中，控制pH值6.5和4.5两个参数，分别在23℃，80μmolphotons m^-2s^-1光强，16小时长日照下，培养5天后重复该过程一次，5天后显微镜检查细胞生长状况，收集20皿原丝体。采用崩溃酶酶解细胞壁15到30分钟后纯化所得原生质体，进行显微计数，转移到再生培养基培养3天后显微观察再生效率。

1.2.2原丝体培养技术：利用匀浆仪进行植物材料的机械打磨，将植物匀浆接种于培养基上，置于23℃，16h光照，8h黑暗，光强80μmol photons m^-2s^-1的培养箱，本发明使用匀浆仪为：IKA(ULTRA TURRAX Tube Drive)，采用10s/次，3次/材料打磨参数进行材料打磨与继代快繁。

1.2.3培养基设置：本发明利用BCD基础培养基作为背景培养基，该培养基配方为：MgSO₄.7H₂O 1μM，KH₂PO₄ 18.4μM，KNO₃ 10μM，FeSO₄.7H2O 45μM；CuSO₄.5H₂O0.22μM，H₃BO₃ 10μM，CoCl₂.6H₂O 0.23μM，Na₂MoO₄.2H₂O 0.1μM，ZnSO₄.7H₂O 0.19μM，MnCl₂.4H₂O 2μM，KI 0.17μM，酒石酸铵5mM，琼脂0.8％，121℃，20min灭菌。在该培养基基础上添加0.5％葡萄糖和10mM CaCl₂以及0.1％酒石酸铵作为再生培养基。

1.2.4小立碗藓原生质体观测：采用光学显微镜及带荧光通道的显微镜进行不同放大倍数下的原生质体形态数量观测，并拍照记录。本发明使用显微镜为中国科学院昆明植物研究所生物技术平台荧光显微镜，仪器型号：Leica DM5500B。

1.2.5小立碗藓原生质体测量和统计：随机挑选两个pH值每个时间点不少于10个显微照片，使用图片软件ImageJ测量生物量，统计分枝数，用student’s t-test统计分析。

2.结果与分析

2.1不同pH值培养和酶解时间下原生质体情况

本发明利用显微观测的方式进行小立碗藓原生质体在15分钟、20分钟、25分钟、30分钟各个酶解时间段的显微镜照片，为显微镜观测目镜16倍前提下，物镜放大倍数10倍自然光下的形态数量展示。依据同一视野下新生细胞分支判断植物材料的活力及原丝体的生长状态，发现pH4.5培养所得材料在15分钟酶解时还有部分细胞壁未能解离，而20分钟时基本上全部形成单细胞，25分钟后细胞破碎；pH 6.5培养所得材料在15分钟酶解时还有大部分呈现丝状，说明细胞壁仍完好，而25分钟时一部分形成单细胞，一部分仍然丝状，而一部分单细胞已经开始破碎，30分钟后得到大部分单细胞(图1，黑色箭头显示完整细胞，灰色箭头显示破碎细胞)。标尺＝100μm。

2.2不同pH值培养和酶解时间下原生质体数量

计数不同pH值培养和酶解时间下原生质体数量，发现pH4.5产生的原丝体在20分钟酶解时间下得到最多的完整细胞，显微计数一共约有9.6X10⁶个，其次是pH6.5产生的原丝体在30分钟酶解时间下得到约6.8X10⁶个。同一酶解时间下数据进行统计分析，星号显示t-test检测在p<0.01水平上的显著性差异；数据表示为平均值±标准误，n≧10。

2.3不同pH值培养和酶解时间下原生质体再生

将pH4.5培养的原丝体酶解20分钟和pH6.5培养的原丝体酶解30分钟两种条件下所得原生质体转移到再生培养基上7天后显示前者大部分再生成功，而后者仅仅一部分再生成功，有活力的细胞具有完整的叶绿体，可以在荧光显微镜下检测到强烈的叶绿素自发荧光(图3，白色箭头显示再生细胞发出的叶绿素荧光)。标尺＝100μm。

2.4不同pH值培养和酶解时间下原生质体再生效率

统计pH4.5培养的原丝体酶解20分钟和pH6.5培养的原丝体酶解30分钟两种条件下所得原生质体转移到再生培养基上3天后的再生数量，显示再生效率分别为约为82％和46％。星号显示t-test检测在p<0.01水平上的显著性差异；数据表示为平均值±标准误，n≧10。

Claims

1.小立碗藓原生质体的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：取小立碗藓孢子，经过两代植物组织快繁培养后，将小立碗藓原丝体与无菌超纯水混合后匀浆仪打磨粉碎得匀浆，匀浆转移到BCD培养基中，控制pH值6.5和4.5两个参数，在23℃，16h光照，8h黑暗，光强80μmol photons m-2s^-1的培养箱中连续继代培养5天，收集原丝体，采用崩溃酶酶解细胞壁20-30分钟后纯化所得原生质体，显微检查细胞生长状况，进行显微观测计数、测量和统计，然后转移到再生培养基培养3天后显微观测统计再生效率。

2.如权利要求1所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其特征在于所述BCD培养基配方为:MgSO₄.7H₂O 1μM，KH₂PO₄ 18.4μM，KNO₃ 10μM，FeSO₄.7H2O 45μM；CuSO₄.5H₂O 0.22μM，H₃BO₃ 10μM，CoCl₂.6H₂O 0.23μM，Na₂MoO₄.2H₂O 0.1μM，ZnSO₄.7H₂O 0.19μM，MnCl₂.4H₂O 2μM，KI 0.17μM，酒石酸铵5mM，琼脂0.8％，121℃，20min灭菌。

3.如权利要求1所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其特征在于酶解细胞壁的时间为20分钟。

4.如权利要求1所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其特征在于所述的再生培养基配方为BCD培养基添加0.5％葡萄糖和10mMCaCl₂以及0.1％酒石酸铵。

5.如权利要求1所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其特征在于所述的BCD培养基调整pH至4.5。

6.如权利要求1所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其特征在于所述的小立碗藓原生质体观测是采用光学显微镜及带荧光通道的显微镜进行不同放大倍数下的原生质体形态数量观测，并拍照记录。

7.如权利要求1所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其特征在于所述的小立碗藓原生质体测量和统计是从两个pH值下生长所得所有照片中随机挑选每个时间点不少于10个显微照片，使用图片软件ImageJ测量生物量，统计分枝数，用student’s t-test统计分析。

8.如权利要求1所述的小立碗藓原生质体的制备方法，其特征在于所述的小立碗藓原生质体显微观测统计再生效率是统计pH4.5、酶解20分钟和pH6.5、酶解30分钟两种条件下所得原生质体转移到再生培养基上3天后的再生数量。