CN113265369B - 一种快速提高短叶对齿藓原丝体生物量的液体培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速提高短叶对齿藓原丝体生物量的液体培养方法，包括如下步骤：取短叶对齿藓孢子，在固体Knop培养基上进行植物组织快繁培养后，将继代用的固体培养基上的无菌培养短叶对齿藓材料在24℃，12h光照，12h黑暗，光强3000lx的培养箱中培养1周后，取其材料，经机械打磨粉碎后移液枪接种于改良液体Knop培养瓶中，24℃，12h光照，12h黑暗，光强3000lx的培养箱中培养一个月，期间利用显微镜进行原丝体生长状态观测，并进行原丝体生物量测量统计。本发明能在短时间内获得大量的短叶对齿藓原丝体材料，极大的提高了后续作为转基因材料的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提高短叶对齿藓原丝体生物量的液体培养方法
背景技术
苔鲜是最古老的陆生植物之一，在进化地位上位于藻类之后、蕨类和种子植物之前，和维管植物属于单起源系统上的姐妹进化枝，具有极其重要的研究地位。全世界约有20000种，遍布除海洋外的地球上每个角落，甚至生长于荒漠、冻原及岩石上，耐旱、耐寒、适应力极强，是大自然的先锋与拓荒者。
短叶对齿藓(Didymodon tectorum)为丛藓科(Pottiaceae)，对齿藓属(Didymodon)植物。植株体较粗壮，黄绿色或稍带黄棕色，密集丛生，高1-1.5cm。该种属于东亚-北美分布种，分布中心为中国东部地区，多生长于土壤结皮层或岩面薄土上。内蒙古兴和-清水河黄土丘陵区分布在自治区南部，长城北侧，主体在兴和、凉城、和林格尔一线以南。地带性土壤栗褐土和栗钙土，已不多见，普遍为黄土母质露头。黄土丘陵区沟壑的峭壁和道路两侧的护坡上可见大面积黄土母质，由于其土壤肥力低、富含碳酸钙和地表土流失严重，因此草本植物很难形成稳定的群落。我们调查发现，由于苔藓植物特殊结构和强大的蓄水保土能力，短叶对齿藓在研究区沟壑峭壁和道路两侧的护坡上常形成大面积藓类结皮层，其盖度可达90％以上。而藓类结皮层可以有效地调节峭壁和道路两侧的地表径流，减少雨水对土壤的冲蚀和溅蚀，同时加快有机质的积累、微生物的侵入，使基质中养分的可利用性提高，当有机质达到足够厚度时，草本植物便可侵入定居。因此，根据当地土壤成分改良培养基条件，实现短叶对齿藓的实验室人工大量扩繁，在水土流失严重、生态系统脆弱的黄土丘陵区开展相关研究，对利用苔藓植物进行土壤修复和保持，促进区域生态环境保护和可持续发展具有重要意义。
对于研究植物抗逆性形成机制和进化意义也非常有价值。然而作为转基因材料的主要来源原丝体的生长状态和数量是限制转基因效率的主要因素，现有技术的繁殖效率较低，急需改良方法来增加繁殖效率。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种快速提高短叶对齿藓原丝体生物量的液体培养方法，利用液体培养基进行短叶对齿藓的组织培养繁殖，具有培养时间短、原丝体生物量高、成本低等优点。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种快速提高短叶对齿藓原丝体生物量的液体培养方法，包括如下步骤：取短叶对齿藓孢子，在固体Knop培养基上进行植物组织快繁培养后，将继代用的固体培养基上的无菌培养短叶对齿藓材料在24℃12h光照，12h黑暗，光强3000lx的培养箱中培养1周后，取其材料，经机械打磨粉碎后移液枪接种于改良液体Knop培养瓶中，24℃12h光照，12h黑暗，光强3000lx的培养箱中培养一个月，期间利用显微镜进行原丝体生长状态观测，并进行原丝体生物量测量统计。
进一步地，每升改良液体Knop培养基中含有以下组分：蔗糖8g；硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O2.5g；硝酸钾KNO30.625g；磷酸二氢钾KH2PO40.625g；硫酸镁MgSO4·7H2O0.625g；硫酸锌ZnSO4·7H2O0.007g；硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.031g；6-BA 0.4-0.6mg；IBA 0.5-1.0mg，pH为7.0。
进一步地，每升改良液体Knop培养基中含有0.5mg的6-BA和1.0mg的IBA。
进一步地，所述改良液体Knop培养基不加琼脂和明胶。
进一步地，具体包括如下步骤：
完成短叶对齿藓孢蒴的清洗、消毒处理；具体的，在显微镜下挑选出含有饱满孢蒴的短叶对齿藓，用蒸馏水清洗孢蒴，并用1％NaClO和75％C2H5OH消毒，消毒完毕后用大量无菌水进行冲洗。
将配好的培养基和镊子、剪刀、移液枪等装到灭菌袋中进行高温高压蒸汽灭菌，一次性无菌培养皿，酒精灯，封口膜，记号笔等喷施75％酒精后放入超净工作台，紫外灭菌3min，使用固体Knop培养基于12h光照12h黑暗对其孢子进行固体Knop培养基培养，待其萌发后转入液体改良Knop培养基进行120r/min摇床培养，其他条件不变，培养30天后的原丝体用作实验材料。
本发明的方法能在短时间内获得大量的短叶对齿藓原丝体材料，且与原有Knop培养基相比，本发明的生物量增加了约10倍，极大的提高了后续作为转基因材料的应用潜力。
附图说明
图1为Knop培养基改良前后原丝体鲜重生长曲线；
图2为Knop培养基改良前后2种液体培养瓶中原丝体生长状态比较；
图3为改良后液体原丝体完整生长过程；
图中：A.孢子萌发第2天；B.孢子萌发第3天；C.孢子萌发第5天；D.原丝体发育第8天；E.原丝体发育第13天；F.原丝体发育第18天；G-I.原丝体发育第21天；J.原丝体发育第26天；K.原丝体发育第30天；L.原丝体发育第35天。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
1.材料和方法
1.1研究材料：
本发明使用材料为短叶对齿藓，经过多代植物组织培养保存在实验室培养箱中。
1.2研究方法：
1.2.1实验设计：将生长30天的短叶对齿藓原丝体材料，接种于改良液体knop培养基进行生长状态观测，最终确定原丝体生长状态最佳的营养离子浓度。
1.2.2原丝体组织培养快繁技术：
改良后液体培养基配置：采用改良Knop基础培养基作为背景培养基，改良后的液体培养基配方为：蔗糖8g/L、硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O2.5g/L、硝酸钾KNO3 0.625g/L、磷酸二氢钾KH2PO4 0.625g/L、硫酸镁MgSO4·7H2Q0.625g/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O7mg/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O31mg/L。调节pH至7.0，总体积定容至1L，分装到5个350ml可高温高压灭菌的塑料组培瓶，每瓶200ml培养液，121℃灭菌20min。
组织培养快速扩繁方法：在显微镜下挑选出含有饱满孢蒴的短叶对齿藓，用蒸馏水清洗孢蒴，并用1％NaClO和75％C2H5OH消毒，消毒完毕后用大量无菌水进行冲洗，备用；将配好的培养基和镊子、剪刀、移液枪等装到灭菌袋中进行高温高压蒸汽灭菌，一次性无菌培养皿，酒精灯，封口膜，记号笔等喷施75％酒精后放入超净工作台，紫外灭菌30min，取短叶对齿藓孢子，在固体Knop培养基上进行植物组织快繁培养后，将继代用的固体培养基上的无菌培养短叶对齿藓材料在24℃，12h光照，12h黑暗，光强3000lx的培养箱中培养1周后，取其材料，经机械打磨粉碎后移液枪接种于改良液体Knop培养瓶中，24℃，12h光照，12h黑暗，光强3000lx的培养箱中培养一个月，每2周更换一次新鲜培养液，期间利用采用光学显微镜(显微镜，仪器型号：Leica DM5500B)进行不同放大倍数下的原丝体生长状态观测，并进行原丝体生物量测量统计。
短叶对齿藓原丝体鲜重测量方法：将液体培养瓶中的原丝体材料离心，取沉淀进行称重测量。
改良前固体培养基配置：蔗糖15g/L、琼脂8g/L、硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O1g/L、硝酸钾KNO30.25g/L、磷酸二氢钾KH2PO40.25g/L、硫酸镁MgSO4·7H2O0.25g/L、硫酸锌ZnSO4·7H2O3mg/L、硫酸亚铁FeSO4·7H2O12.5mg/L调节pH至7.0，总体积定容至1L。
改良前组织培养扩繁方法：在超净工作台中，按上述设置的消毒方法分别对孢蒴进行消毒，随后用无菌水冲洗3-5次，将孢蒴轻轻捣碎后加入一定量的无菌水，制成一定浓度的孢子悬浮液(当将短叶对齿鲜的孢子涂布在直径为60mm的培养平板中时，每个孢蒴用50uL的无菌水稀释即可得到合适浓度的短叶对齿鲜的孢子悬浮液)。将每种方法消毒的孢蒴制备成的孢子悬浮液均匀的涂布到Knop培养基中，每组5个重复。封口膜将培养皿口封好，做好时间和消毒方法的标记，放在光照培养箱中培养。
结果与分析
短叶对齿藓原丝体在10mM Ca(NO3)2，0.115mM ZnSO4·7H2O浓度下，可以达到原丝体的最大鲜重生长，并在培养20天后依旧维持原丝体旺盛生长状态。
与原有Knop培养基相比，本发明的生物量增加了约10倍，极大的提高了后续作为转基因材料的应用潜力。本发明方法的使用能在短时间内获得大量的短叶对齿藓原丝体材料。
短叶对齿藓是单倍体占优势的植物，其再生能力极强，消毒后的植株经机械粉碎后接种于改良后液体Knop培养基可进行大量繁殖。新生植物组织为短叶对齿藓的原丝体阶段，原丝体在液体培养基中，不断地进行细胞分枝和细胞延长从而增加生物量。而大量繁殖获得的短叶对齿藓原丝体，一方面可进行原生质体的制备，实现基因转化。另一方面，为配子体植株的培育缩短了时间。分枝越多和生物量越大是制备原生质体的最佳条件。我们利用显微观测的方式进行不同时期短叶对齿藓原丝体生长状态观测，依据同一视野下新生细胞数目判断植物材料的活力及原丝体的生长状态，发现改良前的液体Knop培养基生长缓慢，主枝延伸，基本上不新生分枝。图2为原丝体接种3周后2种液体培养瓶中原丝体生长状态比较，可见：A-C改良前原丝体细胞个体较大近圆形，叶绿体形态饱满呈椭圆形数量较无褐化现象产生；D-I.改良后原丝体细胞出现了不同程度的褐化；D.褐化发生在原丝体细胞与细胞间隙；E.褐化发生在原丝体细胞两端；F.原丝体中间细胞；G-I.细胞被褐化物质包围致死。
相同鲜重的原丝体材料接种到改良前后的两种培养基后，发现同等外界条件培养2周后的改良前培养物外观呈现深绿色，改良后的培养物外观鲜绿。而继代3周后，原丝体的生长状态显著不同。改良前培养物外观呈现棕褐色，改良后的培养物外观墨绿。对其培养物进行进一步的显微观察和鲜重称量发现：培养一周后，此时2种液体培养基中原丝体鲜重差异并不大。到第二周，改良前的培养基中原丝体生长速率较快、代谢旺盛，最先达到对数生长期(图1)，第三、第四周生长速率较之前逐步降低，此时的原丝体细胞出现了不同程度的褐化，褐化现象发生在细胞与细胞间隙(图2：D)，原丝体细胞两端(图2：F)、原丝体中间细胞(图2：E)，直至被褐化物质包围致死(图2：G-I)。第四周之后鲜重含量明显减少，大量原丝体死亡。而改良后的培养基从第二周之后原丝体鲜重开始持续上升，生长速率较快一直持续到第四周(图1)，此时的原丝体细胞个体较大细胞近圆形，叶绿体形态饱满椭圆形数量较多，且并无褐化产生(图2：A-C)，直到第五周原丝体鲜重的增长速率才开始减缓，第六周之后鲜重含量缓慢降低。改良后的培养基可以维持五周的时间不更换新鲜培养液且生长状态良好，而改良前的培养基易褐化两周需要更换一次。同样培养35天后改良后培养基中的原丝体鲜重含量较之前增长10倍左右。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
Claims (3)
1.一种快速提高短叶对齿藓原丝体生物量的液体培养方法，其特征在于：包括如下步骤：取短叶对齿藓孢子，在固体Knop培养基上进行植物组织快繁培养后，将继代用的固体培养基上的无菌培养短叶对齿藓材料在24 ℃，12 h光照，12 h黑暗，光强3000 lx 的培养箱中培养1周后，取其材料，经机械打磨粉碎后移液枪接种于改良液体Knop培养瓶中，24 ℃，12 h光照，12 h黑暗，光强3000 lx的培养箱中培养一个月，期间利用显微镜进行原丝体生长状态观测，并进行原丝体生物量测量统计；每升改良液体Knop培养基中含有以下组分:蔗糖8g；Ca(NO3)2·4H2O 2.5g；KNO3 0.625g；KH2PO4 0.625g；MgSO4·7H2O 0.625g；ZnSO4·7H2O 0.007g；FeSO4·7H2O 0.031g；6-BA 0.5mg；IBA 1.0mg，pH为7.0。
2.如权利要求1所述的一种快速提高短叶对齿藓原丝体生物量的液体培养方法，其特征在于：所述改良液体Knop培养基不加琼脂和明胶。
3.如权利要求1所述的一种快速提高短叶对齿藓原丝体生物量的液体培养方法，其特征在于：首先需完成短叶对齿藓孢子体的清洗、消毒处理；在显微镜下挑选出含有饱满孢子体的短叶对齿藓，用蒸馏水清洗孢蒴，并用1% NaClO和75% C2H5OH消毒，消毒完毕后用大量无菌水进行冲洗。
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| 刘贤德等.祁连山植物多样性研究.中国科学技术出版社,2006,(第1版),45. * |
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