CN104131046B - 一种微藻固定化培养的产油方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微藻固定化培养的产油方法，所述方法包括如下步骤：(1)将微藻细胞接种在固定化载体上，采用全营养培养基进行培养；(2)检测微藻细胞浓度，并将其与预设微藻细胞浓度进行比较；(3)当所述实际微藻细胞浓度≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为缺氮培养基，进行诱导产油培养；(4)诱导产油培养结束后，收集产油微藻细胞层。本发明将微藻细胞接种在固定化载体上，采用全营养培养基进行培养，使藻体快速积累生物量，通过检测细胞浓度，并将其与预设细胞浓度进行比较，确定培养基调整的时机，进行诱导产油培养，实现油脂积累。在诱导产油培养结束后，收集油脂含量符合需求的产油微藻细胞层，实现了微藻固定化培养的产油。
Description
技术领域
本发明涉及一种微藻固定化培养的产油方法，属于微藻培养技术领域。
背景技术
微藻利用二氧化碳和水通过光合作用固定二氧化碳，将太阳能转化为生物质能。在对数生长期或最佳生长条件下，固定的二氧化碳用于藻细胞的生长和繁殖，此阶段的藻细胞内主要含有蛋白质和糖类，油脂含量非常低；而在环境存在单一或众多的物理或化学刺激的不利条件下，藻细胞会积累大量的油脂，以抵御不利条件。
微藻细胞在固定化的条件下生长，摒弃了大量水体的液体环境，使整个培养过程的环境更容易控制，提高了培养效率，降低了培养成本，从而使藻细胞更能充分的利用光能，提高了藻细胞对光能的利用率。而传统的液体微藻产油方法，不能直接应用于微藻固定化产油。因为微藻在固定化的情况下，细胞高度密集使得细胞与培养液间接触变少，细胞也无法随水流运动来交换藻细胞的照光频率，从而在固定化的条件下，很难实现全部细胞集体进行油脂诱导。
在已有微藻固定化培养的现有技术中，还未公开有微藻固定化培养下的产油方法。
发明内容
针对已有技术的问题，本发明的目的在于提供一种微藻固定化培养的产油方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将微藻细胞接种在固定化载体上，采用全营养培养基进行培养；
(2)检测微藻细胞浓度，并将其与预设微藻细胞浓度进行比较；
(3)当所述实际微藻细胞浓度≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为缺氮培养基进行，诱导产油培养；
(4)诱导产油培养结束后，收集产油微藻细胞层。
本发明首先将微藻细胞接种在固定化载体上，采用全营养培养基进行培养，进行细胞的繁殖过程，使藻体快速积累生物量，通过检测微藻细胞浓度，并将其与预设微藻细胞浓度进行比较，确定培养基调整的时机，将全营养培养基调整为缺氮培养基进行诱导产油培养，进行油脂积累的过程。在诱导产油培养结束后，收集油脂含量符合需求的产油微藻细胞层，实现了微藻固定化培养的产油，填补了已有技术的空白。
以下作为本发明优选的技术方案，但不作为本发明提供的技术方案的限制，通过以下技术方案，可以更好的达到和实现本发明的技术目的和有益效果。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(3)中，所述将所述全营养培养基调整为缺氮培养基具体包括：
根据所述实际细胞浓度，调整所述全营养培养基中的氮浓度，得到与所述实际细胞浓度相应的缺氮培养基。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，所述预设微藻细胞浓度为30～250g/m2的任意值。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(3)具体包括：
当所述实际微藻细胞浓度为30～50g/m2，且≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为氮的浓度为0.05～0.2g/L的缺氮培养基，进行诱导产油培养；
当所述实际微藻细胞浓度为50～100g/m2，且≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为氮的浓度为0.2～0.5g/L的缺氮培养基，进行诱导产油培养；
当所述实际微藻细胞浓度为100～200g/m2，且≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为氮的浓度为0.5～1g/L的缺氮培养基，进行诱导产油培养；
当所述实际微藻细胞浓度为200g/m2以上，且≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为氮的浓度为1～1.5g/L的缺氮培养基，进行诱导产油培养。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(4)具体包括：诱导产油培养结束后，确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层，并分离上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层，收集产油微藻细胞层。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，所述确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层具体包括：检测微藻细胞的颜色，确定颜色为黄色或者橙色的微藻细胞层为产油微藻细胞层。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，所述确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层具体包括：检测微藻细胞的叶绿素荧光值，确定叶绿素荧光值为初始诱导产油培养时微藻细胞叶绿素荧光值的一半以下的微藻细胞层为产油微藻细胞层。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，所述确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层具体包括：检测微藻细胞的光合放氧量，确定光合放氧量为初始诱导产油培养时微藻细胞光合放氧量的一倍及以上的微藻细胞层为产油微藻细胞层。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，所述确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层具体包括：检测微藻细胞的油脂含量，确定油脂含量≥20％的微藻细胞层为产油微藻细胞层。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，步骤(4)后还包括，采用全营养培养基继续培养所述再生长微藻细胞层，重复步骤(2)～(4)。
优选地，在本发明提供的技术方案的基础上，诱导产油培养的天数为2～10天。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首先将微藻细胞接种在固定化载体上，采用全营养培养基进行培养，进行细胞的繁殖过程，使藻体快速积累生物量，通过检测微藻细胞浓度，并将其与预设微藻细胞浓度进行比较，确定培养基调整的时机，将全营养培养基调整为缺氮培养基进行诱导产油培养，进行油脂积累的过程。在诱导产油培养结束后，收集油脂含量符合需求的产油微藻细胞层，实现了微藻固定化培养的产油，弥补了已有技术的空白。
附图说明
图1是本发明的微藻固定化培养的产油方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
在本发明的一种典型的实施方式中，一种微藻固定化培养的产油方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将微藻细胞接种在固定化载体上，采用全营养培养基进行培养；
(2)检测微藻细胞浓度，并将其与预设微藻细胞浓度进行比较；
(3)当所述实际微藻细胞浓度≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为缺氮培养基，进行诱导产油培养；
(4)诱导产油培养结束后，收集产油微藻细胞层。
本发明首先将微藻细胞接种在固定化载体上，采用全营养培养基进行培养，进行细胞的繁殖过程，使藻体快速积累生物量，通过检测微藻细胞浓度，并将其与预设微藻细胞浓度进行比较，确定培养基调整的时机，将全营养培养基调整为缺氮培养基进行诱导产油培养，进行油脂积累的过程。在诱导产油培养结束后，收集油脂含量符合需求的产油微藻细胞层，实现了微藻固定化培养的产油。
优选地，步骤(3)中，所述将所述全营养培养基调整为缺氮培养基具体包括：
根据所述实际细胞浓度，调整所述全营养培养基中的氮浓度，得到与所述实际细胞浓度相应的缺氮培养基。
本发明明确了在固定化条件下，通过调整培养基中的氮浓度达到生产油脂的目的。根据不同的微藻细胞浓度调整培养基中氮的浓度，当所述实际微藻细胞浓度为30～50g/m2，且≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为氮的浓度为0.05～0.2g/L(例如0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.1g/L、0.11g/L、0.12g/L、0.13g/L、0.14g/L、0.15g/L、0.16g/L、0.17g/L、0.18g/L或0.19g/L)的缺氮培养基，进行诱导产油培养；
当所述实际微藻细胞浓度为50～100g/m2，且≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为氮的浓度为0.2～0.5g/L(例如0.22g/L、0.24g/L、0.26g/L、0.28g/L、0.3g/L、0.32g/L、0.34g/L、0.36g/L、0.38g/L、0.4g/L、0.42g/L、0.44g/L、0.46g/L或0.48g/)的缺氮培养基，进行诱导产油培养；
当所述实际微藻细胞浓度为100～200g/m2，且≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为氮的浓度为0.5～1g/L(例如0.54g/L、0.58g/L、0.62g/L、0.66g/L、0.7g/L、0.74g/L、0.78g/L、0.82g/L、0.86g/L、0.9g/L、0.94g/L或0.98g/L)的缺氮培养基，进行诱导产油培养；
当所述实际微藻细胞浓度为200g/m2以上，且≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为氮的浓度为1～1.5g/L(例如1.04g/L、1.08g/L、1.12g/L、1.16g/L、1.2g/L、1.24g/L、1.28g/L、1.32g/L、1.36g/L、1.4g/L、1.44g/L或1.48g/L)的缺氮培养基，进行诱导产油培养。
其中，所述预设微藻细胞浓度为30～250g/m2的任意值。根据不同的微藻细胞浓度调整培养基中氮的浓度，选择与其匹配的培养基中的氮的浓度，以达到高效生产油脂的目的。
优选地，步骤(4)具体包括：诱导产油培养结束后，确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层，并分离上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层，收集产油微藻细胞层。
本发明利用微藻细胞在固定化的条件下，将固定化的微藻细胞划分为两层，其中靠近载体层为再生长微藻细胞层(即为下层细胞)，远离载体层为产油微藻细胞层(即为上层细胞)，并通过结合微藻积累油脂的机理，形成了一种固定化培养条件下微藻产油方法，弥补了已有技术的技术空白。
靠近载体层的下层细胞在固定化条件下，藻细胞高度密集，且缺氮培养基和无光环境，保障了下层藻体拥有较高的活性。本发明采用上述技术方案，既保证了下层再生长微藻细胞层的活性，又使上层产油微藻细胞层积累了油脂，所以在微藻固定化的情况下可以实现微藻油脂积累。
所述确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层具体包括：检测微藻细胞的颜色，确定颜色为黄色或者橙色的微藻细胞层为产油微藻细胞层。
此外，叶绿素荧光值和光合放氧量(速率)均可反映微藻的光合效率，叶绿素荧光值的高低及光合放氧量(速率)的多少(快慢)可反映出光合效率的强弱，而光合效率的强弱可反映出微藻生长情况。微藻细胞的光合效率强说明其生长状态良好，而光合效率弱说明其生长状态较差。本发明通过调整全营养培养基为缺氮培养基，见光的微藻细胞由于积累油脂其代谢途径发生转移，走向油脂合成的方向，而限制了其生长代谢的途径，也即微藻细胞的生长速率减弱，反映在微藻细胞的光合效率上也是减弱的，此时可通过叶绿素荧光值或光合放氧等手段进行检测分析。
本发明在微藻固定化条件下，通过检测固定化微藻细胞的生理生化指标及生长情况(如叶绿素荧光、光合放氧量和油脂含量等)，将固定化微藻细胞分为两层。其中靠近载体层为再生长微藻细胞层，用于微藻细胞的再培养增殖；远离载体层为产油微藻细胞层，用于微藻细胞的生产油脂，以使整个过程可持续进行，更好的收获固定化的产油微藻细胞和培养固定化的再生长微藻细胞。
在本发明中，所述确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层具体包括：检测微藻细胞的叶绿素荧光值，确定叶绿素荧光值为初始诱导产油培养时微藻细胞叶绿素荧光值的一半以下的微藻细胞层为产油微藻细胞层。
所述叶绿素荧光值例如为初始接种时微藻细胞叶绿素荧光值的2/5、1/4、1/8、1/5、1/16或0等。
在本发明中，所述确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层具体包括：检测微藻细胞的光合放氧量，确定光合放氧量为初始诱导产油培养时微藻细胞光合放氧量的一倍及以上的微藻细胞层为产油微藻细胞层。
所述确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层具体包括：检测微藻细胞的油脂含量，确定油脂含量≥20％的微藻细胞层为产油微藻细胞层。
所述油脂含量例如为22％、28％、30％、35％、40％、42％、46％、48％、52％、55％、56％、58％、62％、65％、68％、71％或74％。
在本发明中，步骤(4)后还包括，采用全营养培养基继续培养所述再生长微藻细胞层，重复步骤(2)～(4)。靠近载体层的下层细胞在固定化条件下，藻细胞高度密集，且缺氮培养基和无光环境，保障了下层藻体拥有较高的活性。当上层产油微藻细胞层收获后，下层细胞重新接收光照，恢复生长活性，此时将缺氮培养基改为全营养培养基继续培养，然后又可通过上述方法进行诱导产油和再培养，实现了整个过程的可持续性。
在本发明中，可选择诱导产油培养的天数为2～10天，例如3天、4天、5天、6天、7天、8天或9天。
本发明一种典型的微藻固定化培养的产油方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将微藻细胞接种在固定化载体上，采用全营养培养基进行培养；
(2)检测微藻细胞浓度，并将其与预设微藻细胞浓度进行比较；
(3)当所述实际微藻细胞浓度≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为缺氮培养基，进行诱导产油培养，所述所述预设微藻细胞浓度为30～250g/m2的任意值；
(4)诱导产油培养结束后，确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层，并分离上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层，收集产油微藻细胞层；
其中，所述确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层具体包括：检测微藻细胞的叶绿素荧光值，确定叶绿素荧光值为初始接种时微藻细胞叶绿素荧光值的一半以下的微藻细胞层为产油微藻细胞层。
本发明一种典型的微藻固定化培养的产油方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将微藻细胞接种在固定化载体上，采用全营养培养基进行培养；
(2)检测微藻细胞浓度，并将其与预设微藻细胞浓度进行比较；
(3)当所述实际微藻细胞浓度≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为缺氮培养基，进行诱导产油培养，所述所述预设微藻细胞浓度为30～250g/m2的任意值；
(4)诱导产油培养结束后，确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层，并分离上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层，收集产油微藻细胞层；
其中，所述确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层具体包括：检测微藻细胞的光合放氧量，确定光合放氧量为初始接种时微藻细胞光合放氧量的一倍及以上的微藻细胞层为产油微藻细胞层。
本发明一种典型的微藻固定化培养的产油方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将微藻细胞接种在固定化载体上，采用全营养培养基进行培养；
(2)检测微藻细胞浓度，并将其与预设微藻细胞浓度进行比较；
(3)当所述实际微藻细胞浓度≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为缺氮培养基，进行诱导产油培养，所述所述预设微藻细胞浓度为30～250g/m2的任意值；
(4)诱导产油培养结束后，确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层，并分离上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层，收集产油微藻细胞层；
其中，所述确定上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层具体包括：检测微藻细胞的油脂含量，确定油脂含量≥20％的微藻细胞层为产油微藻细胞层。
具体实施例1
将栅藻藻种均匀涂抹于固定化载体上，采用全营养培养基(BG11液体培养基)补充水分及营养，培养液内通入含1％CO2的压缩空气。实验时室外中午光强为1500μmol/m2/s，早晚光强约为300μmol/m2/s，白天的平均光强为500μmol/m2/s，平均温度25℃。连续培养7天，此时细胞浓度达到110g/m2，期间检测生长载体上各层细胞的叶绿素荧光值(Fv/Fm)平均稳定在0.6左右。然后将BG11培养基中的硝酸钠浓度改为0.5g/L，诱导产油培养5天，在诱导产油培养过程中，继续取样检测生长载体上的微藻细胞的叶绿素荧光值，其中越靠近载体层叶绿素荧光值越高，远离载体层叶绿素荧光值较低，在诱导产油培养第5天时，将叶绿素荧光值(Fv/Fm)低于0.3的微藻细胞层(Fv/Fm值低于0.3认为是产油微藻细胞层，≥0.3可认为再生长微藻细胞层)收获，经真空冷冻干燥，检测油脂含量达到35％(采用Inna，2005测定方法)。而Fv/Fm值高于0.3的再生长微藻细胞层，重新采用全营养培养基(BG11液体培养基)继续培养，可重复进行上述过程。
具体实施例2
将栅藻藻种均匀涂抹于固定化生长载体上，采用全营养培养基(BG11液体培养基)补充水分及营养，培养液内通入含2％CO2的压缩空气。实验时室外中午光强为1500μmol/m2/s，早晚光强约为300μmol/m2/s，白天的平均光强为500μmol/m2/s，平均温度25℃。连续培养4天，此时细胞浓度达到60g/m2，期间检测生长载体藻细胞的光合放氧情况。然后将BG11培养基中的硝酸钠浓度改为0.3g/L，诱导产油培养5天，在诱导产油培养过程中，取样检测生长载体细胞上的放氧情况，第5天时收获产油微藻细胞层细胞(将几乎检测不到放氧的且靠近载体的细胞层归为再生长微藻细胞层，将检测到大量氧气且远离载体层归为产油微藻细胞层)，经真空冷冻干燥，检测油脂含量达到40％(采用Inna，2005测定方法)。而保留再生长层细胞，重新采用全营养培养基(BG11液体培养基)继续培养，可重复进行上述过程。
具体实施例3
将小球藻藻种均匀涂抹于固定化生长载体上，采用全营养培养基(BG11液体培养基)补充水分及营养，培养液内通入含2.5％CO2的压缩空气。实验时室外中午光强为1500μmol/m2/s，早晚光强约为300μmol/m2/s，白天的平均光强为500μmol/m2/s，平均温度25℃。连续培养4天，此时细胞浓度达到66g/m2，期间检测生长载体上各层细胞的叶绿素荧光值(Fv/Fm)平均稳定在0.6左右。然后将BG11培养基中的硝酸钠浓度改为0.4g/L，诱导产油培养4天，在诱导产油培养过程中，取样检测生长载体上的叶绿素荧光值，其中越靠近载体层叶绿素荧光值越高，远离载体层叶绿素荧光值较低。在诱导产油培养第5天时将叶绿素荧光值(Fv/Fm)低于0.2的微藻细胞层(Fv/Fm值低于0.2认为是产油微藻细胞层，高于0.2可认为再生长微藻细胞层)收获，经真空冷冻干燥，检测油脂含量达到38％(采用Inna，2005测定方法)。而Fv/Fm值高于0.2的再生长微藻细胞层，重新采用全营养培养基(BG11液体培养基)继续培养，可重复进行上述过程。
具体实施例4
将小球藻藻种均匀涂抹于固定化生长载体上，采用全营养培养基(BG11液体培养基)补充水分及营养，培养液内通入含3％CO2的压缩空气。实验时室外中午光强为1500μmol/m2/s，早晚光强约为300μmol/m2/s，白天的平均光强为500μmol/m2/s，平均温度25℃。连续培养3天，此时细胞浓度达到50g/m2，期间利用尼罗红染色方法快速检测生长载体藻细胞油脂含量。然后将BG11培养基中的硝酸钠浓度改为0.2g/L，进行诱导产油培养，在诱导产油培养过程中，继续取样检测生长载体细胞上的油脂含量，第5天时，将油脂含量达到20％及以上的产油微藻细胞层收获，而保留油脂含量小于20％的再生长层微藻细胞层，重新采用全营养培养基(BG11液体培养基)继续培养，可重复进行上述过程。
具体实施例5
将绿球藻藻种均匀涂抹于固定化载体上，采用全营养培养基(BG11液体培养基)补充水分及营养，培养液内通入含1％CO2的压缩空气。实验时室外中午光强为1500μmol/m2/s，早晚光强约为300μmol/m2/s，白天的平均光强为500μmol/m2/s，平均温度28℃。连续培养2天，此时细胞浓度达到30g/m2，期间检测生长载体上各层细胞的叶绿素荧光值(Fv/Fm)平均稳定在0.6左右。然后将BG11培养基中的硝酸钠浓度改为0.05g/L，诱导产油培养2天，在诱导产油培养过程中，继续取样检测生长载体上的微藻细胞的叶绿素荧光值，其中越靠近载体层叶绿素荧光值越高，远离载体层叶绿素荧光值较低，在诱导产油培养第2天时，将叶绿素荧光值(Fv/Fm)低于0.3的微藻细胞层(Fv/Fm值低于0.3认为是产油微藻细胞层，≥0.3可认为再生长微藻细胞层)收获，经真空冷冻干燥，检测油脂含量达到50％(采用Inna，2005测定方法)。而Fv/Fm值高于0.3的再生长微藻细胞层，重新采用全营养培养基(BG11液体培养基)继续培养，可重复进行上述过程。
具体实施例6
将绿球藻藻种均匀涂抹于固定化载体上，采用全营养培养基(BG11液体培养基)补充水分及营养，培养液内通入含2％CO2的压缩空气。实验时室外中午光强为1500μmol/m2/s，早晚光强约为300μmol/m2/s，白天的平均光强为500μmol/m2/s，平均温度28℃。连续培养10天，此时细胞浓度达到200g/m2，期间检测生长载体上各层细胞的叶绿素荧光值(Fv/Fm)平均稳定在0.6左右。然后将BG11培养基中的硝酸钠浓度改为1g/L，诱导产油培养10天，在诱导产油培养过程中，继续取样检测生长载体上的微藻细胞的叶绿素荧光值，其中越靠近载体层叶绿素荧光值越高，远离载体层叶绿素荧光值较低，在诱导产油培养第10天时，将叶绿素荧光值(Fv/Fm)低于0.3的微藻细胞层(Fv/Fm值低于0.3认为是产油微藻细胞层，≥0.3可认为再生长微藻细胞层)收获，经真空冷冻干燥，检测油脂含量达到55％(采用Inna，2005测定方法)。而Fv/Fm值高于0.3的再生长微藻细胞层，重新采用全营养培养基(BG11液体培养基)继续培养，可重复进行上述过程。
具体实施例7
将栅藻藻种均匀涂抹于固定化生长载体上，采用全营养培养基(BG11液体培养基)补充水分及营养，培养液内通入含2％CO2的压缩空气。实验时室外中午光强为1500μmol/m2/s，早晚光强约为300μmol/m2/s，白天的平均光强为500μmol/m2/s，平均温度28℃。连续培养15天，此时细胞浓度达到250g/m2，期间利用尼罗红染色方法快速检测生长载体藻细胞油脂含量。保持BG11培养基中的硝酸钠浓度1.5g/L不变，继续进行诱导产油培养，在诱导产油培养过程中，继续取样检测生长载体细胞上的油脂含量，第25天时，将油脂含量达到30％及以上的产油微藻细胞层收获，而保留油脂含量小于30％的再生长层微藻细胞层。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (4)
1.一种微藻固定化培养的产油方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将微藻细胞接种在固定化载体上，采用全营养培养基进行培养；
(2)检测实际微藻细胞浓度，并将其与预设微藻细胞浓度进行比较；
(3)当所述实际微藻细胞浓度为30～50g/m2，且≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为氮的浓度为0.05～0.2g/L的缺氮培养基，进行诱导产油培养；
当所述实际微藻细胞浓度为50～100g/m2，且≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为氮的浓度为0.2～0.5g/L的缺氮培养基，进行诱导产油培养；
当所述实际微藻细胞浓度为100～200g/m2，且≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为氮的浓度为0.5～1g/L的缺氮培养基，进行诱导产油培养；
当所述实际微藻细胞浓度为200g/m2以上，且≥所述预设微藻细胞浓度时，将所述全营养培养基调整为氮的浓度为1～1.5g/L的缺氮培养基，进行诱导产油培养；
(4)诱导产油培养结束后，通过检测固定化微藻细胞的生理生化指标及生长情况，将固定化微藻细胞分为两层，所述生理生化指标为微藻细胞的颜色、叶绿素荧光值、光合放氧量或油脂含量中的任意一种，确定远离载体层为上层产油微藻细胞层和靠近载体层为下层再生长微藻细胞层，并分离上层产油微藻细胞层和下层再生长微藻细胞层，收集产油微藻细胞层；
所述生理生化指标为微藻细胞的颜色时，检测微藻细胞的颜色，确定颜色为黄色或者橙色的微藻细胞层为产油微藻细胞层；
所述生理生化指标为叶绿素荧光值时，检测微藻细胞的叶绿素荧光值，确定叶绿素荧光值为初始诱导产油培养时微藻细胞叶绿素荧光值的一半以下的微藻细胞层为产油微藻细胞层；
所述生理生化指标为光合放氧量时，检测微藻细胞的光合放氧量，确定光合放氧量为初始诱导产油培养时微藻细胞光合放氧量的一倍及以上的微藻细胞层为产油微藻细胞层；
所述生理生化指标为油脂含量时，检测微藻细胞的油脂含量，确定油脂含量≥20％的微藻细胞层为产油微藻细胞层；
步骤(4)后还包括，采用全营养培养基继续培养所述再生长微藻细胞层，重复步骤(2)～(4)。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述将所述全营养培养基调整为缺氮培养基具体包括：
根据所述实际细胞浓度，调整所述全营养培养基中的氮浓度，得到与所述实际细胞浓度相应的缺氮培养基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预设微藻细胞浓度为30～250g/m2的任意值。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，诱导产油培养的天数为2～10天。
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