CN100477906C - 采用甲基磺酸乙酯诱变木本植物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种采用甲基磺酸乙酯诱变木本植物的方法，尤指一种采用愈伤组织胚性细胞来进行甲基磺酸乙酯诱变获得木本植物变异体的方法。本发明以木本植物愈伤组织胚性细胞为诱变对象，包括外植体的选择及处理、脱分化培养、再分化培养、诱变处理和筛选，其中，所述的外植体为木本植物组培苗，取切成1～2mm的茎段接种于培养基中，经过脱分化培养、再分化培养后，对其愈伤组织胚性细胞采用甲基磺酸乙酯进行诱变处理。本发明在植物细胞的全能性表达中获得变异体，一次诱变处理的细胞可以千万计，诱导基因突变的细胞再生成突变的植株，形成大量供选择的变异体，极大地提高处理的诱变率，处理个体为单个细胞，体积小数目多，处理时所需药品少，大大降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用甲基磺酸乙酯(以下简称EMS)诱变木本植物的方法，尤其是一种采用愈伤组织胚性细胞来进行EMS诱变获得木本植物变异体的方法。
背景技术
EMS是一种应用很好的诱变剂。
期刊《中草药》2004 Vol.35No.11P.1293-1296公开了一种EMS诱变的长春花细胞系突变研究，其研究表明：用不同浓度的EMS处理长春花愈伤组织与对照相比，不仅生长快，并且吲哚总碱含量高，变异种是所期望的比较理想的细胞系。
期刊《玉米科学》2003Vol.11 No.3P.74-75，84公开了一种EMS对玉米自交系诱变效应的研究，其研究表明：在M1代引起了较大的生理损伤和生物学效应，M2代质量性状未发生明显变异，但株高、穗位高、茎周长和穗长、叶片长等数量形状出现了较高的突变频率。
可见，EMS这种诱变剂的诱变效应可用两高一广来评价，即：效率高、频率高和范围广。
与其它诱变剂相比，EMS诱变后产生的突变频率高，且多为显性突变体，易于突变体的筛选。此外它可以产生范围较广的突变类型，如转换、颠换等。
现在应用比较多的是用EMS处理植物种子、花粉、幼苗，生长点等，这些一般只限于农业应用，进行诱变的主要是农作物等草本植物。而对于木本植物，比如杨树来说，如果也采取这些方法获得变异体，在实际操作中便会遇到许多困难，因为它们个体大，生长周期长，而且受诱变率低的限制，必须处理众多的个体才能获得目的数量的变异体，这在实际操作中除用胚性细胞来处理之外是很难实现的。
发明内容
本发明目的在于提供一种采用EMS诱变木本植物的方法，以木本植物愈伤组织胚性细胞为诱变对象，从而解决EMS诱变木本植物个体大不易处理的困难，降低诱变所需成本。
为达上述目的，本发明提供了一种采用EMS诱变木本植物的方法，以木本植物愈伤组织胚性细胞为诱变对象，包括外植体的选择及处理、脱分化培养、再分化培养、诱变处理和筛选，其中，所述的外植体为木本植物组培苗，取切成1～2mm的茎段接种于培养基中，经过脱分化培养、再分化培养后，采用EMS进行诱变处理。
所述的诱变处理方法是将木本植物愈伤组织胚性细胞浸泡于EMS处理液中培养。
采用EMS诱变木本植物的方法，选取杨树愈伤组织胚性细胞作为诱变对象，包括下述步骤：
第一步：选取杨树组培苗为外植体；
第二步：将选取的外植体切成1～2mm的茎段；
第三步：将茎段接种在脱分化培养基MS+2，4-D 0-1.0mg/ml+KT0-0.5mg/ml+NAA 0-1.0mg/ml+ZT 0-0.5mg/ml上脱分化72～96小时；
第四步：脱分化处理好的组织接种在再分化培养基MS+6-BA0-1.0mg/ml+KT 0-0.5mg/ml+IAA 0-1.0mg/ml+ZT 0-0.5mg/ml上再分化，经过72～96小时，达到诱导胚性细胞大量发生时间段；
第五步：在胚性细胞发生率最高的时间段，进行诱变处理：将胚性愈伤组织浸泡于含有体积浓度(V/V)1～8‰EMS的液体分化培养基中恒温振荡培养2～96小时，完成诱变处理过程；
其中，EMS的体积浓度(V/V)为1‰，2‰，3‰，4‰，5‰，6‰，7‰，8‰中的一种。
第六步：洗净EMS处理残留液，放于筛选培养基中进行筛选，获得杨树变异体所用胚性细胞，以获得杨树突变体。
本发明的优点是：
1、将木本植物愈伤组织胚性细胞以EMS处理后，通过组织培养方法获得变异的再生植株，从而方便开发新品种。
2、诱导调控木本植物发生胚性细胞并以EMS处理，在植物细胞的全能性表达中获得变异体；
3、一次诱变处理的细胞可以达到以千万计，诱导基因突变的细胞再生成突变的植株，就形成大量可供选择具有新的遗传基因型的变异体；
4、用EMS处理木本植物愈伤组织胚性细胞，极大地提高了处理的诱变率，处理的个体为单个细胞，体积小，数目多，处理时所需药品少，大大降低了成本。
具体实施方式
一种采用EMS诱变木本植物的方法，以木本植物愈伤组织胚性细胞为诱变对象，包括外植体的选择及处理、脱分化培养、再分化培养、诱变处理和筛选，其中，所述的外植体为木本植物组培苗，取切成1～2mm的茎段接种于培养基中，经过脱分化培养、再分化培养后，采用EMS进行诱变处理。
所述的诱变处理方法是将木本植物愈伤组织胚性细胞浸泡于EMS处理液中培养。
采用EMS诱变木本植物的方法，选取杨树愈伤组织胚性细胞作为诱变对象，包括下述步骤：
第一步：欧美杨黑杨派光兆1#杨(Populus×euramericanaclGuangzhao No1.)，经多代组织培养，选出优良株系的组培苗作为外植体；
第二步：将选取的外植体切成1～2mm的茎段；
第三步：将茎段接种在脱分化培养基MS+2，4-D 0.5mg/ml+KT 0.2mg/ml上，培养温度为室温25±2℃，光照14小时/天，脱分化72～96小时；
第四步：脱分化处理好的组织接种在分化培养基MS+6-BA0.2mg/ml+KT 0.2mg/ml+IAA 0.1mg/ml上，室温下培养，光照14小时/天，再分化72～96小时，达到诱导胚性细胞大量发生时段；
第五步：在胚性细胞发生率最高的时间段，进行诱变处理：将胚性愈伤组织浸泡于含有体积浓度5‰EMS的液体分化培养基MS+6-BA 0.2mg/ml+KT 0.2mg/ml+IAA 0.1mg/ml中，25℃下恒温振荡培养36小时，完成透变处理过程；
第六步：洗净处理液，放于筛选培养基中进行筛选，以获得杨树变异体。
Claims (1)
1、一种采用甲基磺酸乙酯诱变木本植物的方法，以木本植物愈伤组织胚性细胞为诱变对象，包括外植体的选择及处理、脱分化培养、再分化培养、诱变处理和筛选，其特征在于：所述的外植体为木本植物组培苗，切成1～2mm的茎段接种于培养基中，经过脱分化培养、再分化培养后，以其愈伤组织胚性细胞为对象，采用甲基磺酸乙酯进行诱变处理，其中，包括下述步骤：
第一步：选取杨树组培苗为外植体；
第二步：将选取的外植体切成1～2mm的茎段；
第三步：将茎段接种在脱分化培养基MS+2，4-D 0.5-1.0mg/ml+KT0.2-0.5mg/ml+NAA 0-1.0mg/ml+ZT 0-0.5mg/ml上脱分化72～96小时；
第四步：脱分化处理好的组织接种在分化培养基MS+6-BA0.2-1.0mg/ml+KT 0.2-0.5mg/ml+IAA 0.1-1.0mg/ml+ZT0-0.5mg/ml上再分化，经过72～96小时，达到诱导胚性细胞大量发生时间段；
第五步：在胚性细胞大量发生时间段，进行诱变处理：将胚性愈伤组织浸泡于含有体积浓度1～8‰甲基磺酸乙酯的液体分化培养基中恒温振荡培养36～96小时，完成诱变处理过程；
第六步：洗净甲基磺酸乙酯处理残留液，放于筛选培养基中进行筛选，以获得杨树变异体。
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