CN101911873B - 甲基磺酸乙酯在制备作物化学杀雄剂及育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及甲基磺酸乙酯在制备作物化学杀雄剂及育种中的应用，特别是甲基磺酸乙酯在制备大白菜用化学杀雄剂及育种中的应用，属于植物育种技术领域。该作物化学杀雄剂，组分如下，均为体积百分含量：甲基磺酸乙酯原液：0.7～0.9％，磷酸钠缓冲液：余量，pH 5.6～6.0。本发明利用浓度为0.7％～0.9％的甲基磺酸乙酯原液进行杀雄，为育种领域提供了一种新的杀雄剂。利用该杀雄剂处理，大大缩短了处理时间，减少了育种的工作量并且可大幅提高杀雄率。

Description

甲基磺酸乙酯在制备作物化学杀雄剂及育种中的应用

技术领域

本发明涉及甲基磺酸乙酯在制备作物化学杀雄剂及育种中的应用，特别是甲基磺酸乙酯在制备大白菜用化学杀雄剂及育种中的应用，属于植物育种技术领域。

背景技术

甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate)，简称EMS，一种重要的致癌物之一。生物学上常常用来创建突变体库，拓宽亲本资源，创新育种方法。但是，使用EMS必须注意防护，防止诱导癌症。EMS诱发的突变主要通过两个步骤来完成，首先鸟嘌呤的06位置被烷基化，成为一个带正电荷的季铵基团，从而发生两种遗传效应：一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，代替胞嘧啶，发生转换型的突变；二是由于鸟嘌呤的N27烷基活化，糖苷键断裂造成脱嘌而后在DNA复制过程中，烷基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基替换，即G:C变为A:T。当然，化学诱变存在着染色体结构和数量方面的诱导变异，但这种单一碱基对改变而形成的点突变仍是化学诱变的主要形式。

中国专利文件公开号CN1961648A(申请号200610118687.4)公开了一种采用甲基磺酸乙酯诱变木本植物的方法，尤指一种采用愈伤组织胚性细胞来进行甲基磺酸乙酯诱变获得木本植物变异体的方法。该发明以木本植物愈伤组织胚性细胞为诱变对象，包括外植体的选择及处理、脱分化培养、再分化培养、诱变处理和筛选，其中，所述的外植体为木本植物组培苗，取切成1～2mm的茎段接种于培养基中，经过脱分化培养、再分化培养后，对其愈伤组织胚性细胞采用甲基磺酸乙酯进行诱变处理。

杂种优势利用是提高农作物产量、增强农作物抗性的重要手段之一。杂种优势利用是依赖纯系一代杂交种来实现的。利用化学杀雄剂制种是解决制种母本去雄问题的有效方法之一，它是选用某种化学药剂，在植株生长发育的一定时期喷洒于母本，直接杀伤或抑制雄性器官，造成生理不育，但不损害雌性配子的形成，以达到去雄的目的。化学杀雄剂的种类很多，比较有效的主要有2，3-二氯异丁酸钠(Fw450)，三碘苯甲酸(TIBA)，2-氯乙基磷酸(乙烯利)，二氯异丙醚，r-苯醋酸，二氯乙酸，二氯丙酸，三氯丙酸，d-丙酸，赤霉素，核酸钠，2，4-D，萘乙酸(NAA)，顺丁烯二酸联胺(MH)，4-氟苯酚羟其乙酸钠盐以及雌性酮类物质数十种。但是，迄今为止，尚未见将甲基磺酸乙酯作为化学杀雄剂的做法。

大白菜是十字花科芸薹属蔬菜，属异花授粉作物。杂种优势利用在大白菜新品种选育中占有绝对的优势地位。大白菜花器小、繁殖系数低，人工授粉只能用于早期组合选配，大量的生产用种需要通过自然杂交的方法来实现。目前，大白菜纯系杂交一代种子的生产主要有3条途径：利用自交系、自交不亲和系以及雄性不育系。虽然大白菜存在自交系内的迟配性，可以直接用纯合自交系制种或双亲之一为自交系制种，但是，系间自交授粉程度的差异、个体间开花习性的差异、植株高度和花粉量的差异以及环境气候的影响为自交系内自交创造了条件，最后导致自交系制种杂交率相当低。因此，利用自交系大面积制种存在风险。虽然利用雄性不育系生产大白菜一代杂交种被认为是最有前途的方法，但是可以大面积推广的大白菜雄性不育系制种技术尚未出现。目前人们仍然普遍利用大白菜自交不亲和性来大面积生产一代杂交种。虽然自交不亲和性在大白菜中广泛存在，易于获得自交不亲和系，正反交杂交种子都可以使用且制种产量高。但是，自交不亲和系的自身繁殖系数低，主要靠人工蕾期授粉，多代自交易出现生活力衰退，亲本种子成本太高，同时由于大多数自交不亲和系的亲和指数大于0，杂种纯度有时遇到花期不遇等某些原因的影响也难以保证。因此，利用自交不亲和系生产大白菜一代杂交种也不是最理想的方法。所以，人们需要根据大白菜的开花结实特性以及现阶段其它作物一代杂种生产技术的特点，探索出更有效的杂交制种新方法。

虽然利用上述化学杀雄法大面积生产一代杂交种在油菜等作物上得到了广泛应用，但是该施用方法却存在着许多缺陷，比如作业时间长，需要贯穿整个开花期，田间作业面积大，喷施不彻底会导致杀雄率低，同时也存在或多或少的环境污染。这是化学杀雄法尚未在大白菜等许多十字花科蔬菜一代杂交种生产中得以使用的主要原因。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供甲基磺酸乙酯在制备化学杀雄剂及育种中的应用。

术语解释

自交系(纯系)：由某个优良单株连续自交多代，经过选择而产生的基因型相对纯合的后代群体。异花授粉作物在人工选择、控制下连锁自花授粉产生的后代，如大白菜经过3～5代自交系选择，就可选出生长整齐、性状优良的自交系，用于杂交作亲本。

本发明技术方案如下：

甲基磺酸乙酯在制备作物化学杀雄剂及育种中的应用。

所述作物为十字花科蔬菜作物；优选的，所述十字花科蔬菜作物选自萝卜属、芸薹属作物；进一步优选的，所述芸薹属蔬菜作物为大白菜、小白菜、甘蓝、椰菜、椰菜花、芥蓝、青花菜、球茎甘蓝；特别优选的，所述作物为大白菜。

一种作物化学杀雄剂，组分如下，均为体积百分含量：

甲基磺酸乙酯原液：0.7～0.9％，磷酸钠缓冲液：余量，pH 5.6～6.0；

将上述甲基磺酸乙酯原液和磷酸钠缓冲液混合即得，其中：甲基磺酸乙酯原液中甲基磺酸乙酯浓度为1.206g/ml；磷酸钠缓冲液由浓度为1M的Na₂HPO₄溶液6～8ml与浓度为1M的NaH₂PO₄溶液92～94ml加水定容到1000ml制得。

优选的，所述的甲基磺酸乙酯原液体积百分含量为0.8％。

优选的，所述1M的Na₂HPO₄溶液为7.9ml，1M的NaH₂PO₄溶液为92.1ml。

优选的，所述的pH 5.8。

一种利用上述作物化学杀雄剂育种的方法，步骤如下：

(1)将种子在22～28℃的水中预吸胀4～6小时，得预处理种子；

(2)将步骤(1)制得的预处理种子浸泡于化学杀雄剂中15～20小时，然后用去离子水漂洗2～5次，得杀雄种子；

(3)将杀雄种子按正常种植方式种植，待开花期，人工授粉，即得正常F1代杂交种。

所述种子为十字花科蔬菜作物种子；优选的，所述十字花科蔬菜作物种子选自萝卜属、芸薹属作物种子；最优的，所述芸薹属蔬菜作物种子为大白菜种子、小白菜种子、甘蓝种子、椰菜种子、椰菜花种子、芥蓝种子、青花菜种子、球茎甘蓝种子。

本发明有益效果如下：

1、利用浓度为0.7％～0.9％的甲基磺酸乙酯原液进行杀雄，为育种领域提供了一种新的杀雄剂。

2、本发明的杀雄是通过对种子进行处理，改变了传统杀雄剂喷施于开花期十字花科蔬菜作物的施用方式，大大缩短了处理时间，减少了制种的工作量。

3、由于本发明的杀雄作用途径为直接针对十字花科蔬菜作物种子，不同于传统杀雄剂作用于雄性花粉，因此可大幅提高杀雄率。经本发明处理后的作物，母本雄蕊败育率≥95％，并且其他性状保持不变，实现一代杂交种纯度能达到99％以上，可以实现大面积生产高纯度(≥99％)大白菜一代杂交种的目的。

4、本发明由于杀雄剂直接作用于种子，因此不会污染田间土壤，不会对环境造成污染。

附图说明

图1.未处理的大白菜自交系Z55种子产生的植株，自交结实率70％以上。

图2.0.2％EMS原液配制的溶剂处理大白菜自交系Z55种子产生的植株，结实率为40％。

图3.0.4％EMS原液配制的溶剂处理大白菜自交系Z55种子产生的植株，结实率为20％。

图4.0.8％EMS原液配制的溶剂处理大白菜自交系Z55种子产生的植株，结实率低于5％。

图5.将大白菜自交系Z61-2的花粉授给Z55的展开花的柱头，果荚逐渐膨大，最后获得正常F1代杂交种，结实率100％。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中的大白菜自交系种子Z55、小白菜自交系种子济Z-1由山东省农业科学院蔬菜研究所分子育种室购得，大白菜自交系种子Z55也可将购自北京金诺阳光种子有限公司的小白菜种子金贝贝经4代自交纯化制得，小白菜自交系种子济Z-1也可将购自上海甲丰种业有限公司的小白菜种子抗热605经3代自交纯化制得，甲基磺酸乙酯(EMS)购自SIGMA公司，大白菜自交系Z61-2花粉由山东省农业科学院蔬菜研究所分子育种室购得，其他试剂均为普通市售产品。

实施例1

一种作物化学杀雄剂，组分如下，均为体积百分百分数：

甲基磺酸乙酯原液：0.8％，磷酸钠缓冲液：99.2％，pH 5.8；

所述的甲基磺酸乙酯原液中甲基磺酸乙酯浓度为1.206g/ml，由甲基磺酸乙酯按比例与水配制即可；

所述的磷酸钠缓冲液由浓度为1M的Na₂HPO₄溶液7.9ml与浓度为1M的NaH₂PO₄溶液92.1ml加水定容到1000ml配制而成。

将上述甲基磺酸乙酯原液和磷酸钠缓冲液混合均匀即得。

实施例2

本实施例的实验地为山东省农业科学院蔬菜研究所试验场(地址：济南市桑园路南侧)。

一种利用实施例1中的作物化学杀雄剂育种的方法，步骤如下：

(1)12月20日，将大白菜自交系Z55种子在22～28℃水中预吸胀4～6小时，得预处理种子；

(2)将步骤(1)制得的预处理种子浸泡于实施例1制得的化学杀雄剂中，然后置入摇床上，摇动15小时，床转速为100rpm，然后用去离子水漂洗4次，每次15分钟，得杀雄种子；同时，由甲基磺酸乙酯原液和磷酸钠缓冲液配制甲基磺酸乙酯原液体积百分含量为0.2％的溶液和甲基磺酸乙酯原液体积百分含量为0.4％的溶液，分别分组处理步骤(1)制得的预处理种子作为对照实验，得对照组2(EMS原液体积百分含量0.2％)和对照组3(EMS原液体积百分含量0.4％)，未做任何处理的大白菜自交系Z55种子作为对照组1。磷酸钠缓冲液配制参见实施例1。

(3)将杀雄种子植于含营养土的育苗盘上育苗，将处理后的对照组1～3的Z55种子植于含营养土的育苗盘上育苗，幼苗出土前要盖地膜保湿，出土后掀掉地膜，及时喷水保持湿润。此阶段在冬暖大棚中进行。

(4)第二年3月7日～3月15日，将经过低温春化的幼苗移栽到纱网棚内。在后期生产管理上，按常规方法及时施肥、浇水、喷药(防治病虫害)。开花结实期，在自然环境下自然授粉结实，测算结实率：

经测算，经0.8％甲基磺酸乙酯原液配制的杀雄剂处理的自交系Z55种子产生的植株，结实率为4％(如图4所示)；对照组1结实率75％(如图1所示)，对照组2结实率40％(如图2所示)，对照组3结实率20％(如图3所示)。

实施例3

选取实施例2步骤(4)中纱网棚中3棵用0.8％甲基磺酸乙酯原液配制的杀雄剂处理后的植株，选取花药败育的展开花朵，用其它自交系Z61-2花粉给其人工授粉。授粉后，果荚逐渐膨大，最后获得正常F1代杂交种，结实率100％。这表明，利用上述化学杀雄技术产生的花药败育的植株，可以接受其它大白菜花粉，产生饱满的杂交种子。因此，可以利用该化学杀雄剂，结合大白菜纯系内的迟配性以及纯系亲本材料的自交不亲和性，显著提高杂交制种纯度(≥99％)，最后实现大面积生产高纯度大白菜一代杂交种的目的。

实施例4

如实施例2所述的育种方法，不同之处在于：

实验样本为小白菜自交系种子济Z-1。

经测算，经0.8％甲基磺酸乙酯药剂处理的济Z-1种子产生的植株，结实率为8％；对照组1结实率78％，对照组2结实率为48％，对照组3结实率为26％。

Claims (10)

1.甲基磺酸乙酯在制备十字花科蔬菜作物化学杀雄剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述十字花科蔬菜作物为萝卜属蔬菜作物、芸薹属蔬菜作物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述芸薹属蔬菜作物为大白菜、小白菜、甘蓝、椰菜、椰菜花、芥蓝、青花菜、球茎甘蓝。

4.一种权利要求1所述的十字花科蔬菜作物化学杀雄剂，组分如下，均为体积百分含量：

甲基磺酸乙酯原液: 0.7～0.9%，磷酸钠缓冲液：余量，pH 5.6～6.0；

将上述甲基磺酸乙酯原液和磷酸钠缓冲液混合即得，其中：甲基磺酸乙酯原液中甲基磺酸乙酯浓度为1.206g/ml；磷酸钠缓冲液由浓度为1M 的Na₂HPO₄溶液6～8ml与浓度为1M 的 NaH₂PO₄溶液92～94ml加水定容到1000ml制得。

5.如权利要求4所述的作物化学杀雄剂，其特征在于，所述的甲基磺酸乙酯原液体积百分含量为0.8%。

6.如权利要求4所述的作物化学杀雄剂，其特征在于，所述1M 的Na₂HPO₄溶液为7.9ml，1M 的NaH₂PO₄溶液为92.1ml。

7.如权利要求4所述的作物化学杀雄剂，其特征在于，所述的pH 5.8。

8.一种利用权利要求4所述十字花科蔬菜作物化学杀雄剂育种的方法，步骤如下：

（1）将种子在22～28℃的水中预吸胀4～6小时，得预处理种子；

（2）将步骤（1）制得的预处理种子浸泡于化学杀雄剂中15～20小时，然后用去离子水漂洗2～5次，得杀雄种子；

（3）将杀雄种子按正常种植方式种植，待开花期，人工授粉，即得正常F1代杂交种。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子为萝卜属、芸薹属作物种子。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述芸薹属蔬菜作物种子为大白菜种子、小白菜种子、甘蓝种子、椰菜种子、椰菜花种子、芥蓝种子、青花菜种子、球茎甘蓝种子。

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